JP2010037292A - Method for treating fibrotic lesion combining adipose-derived stem cell and basic fibroblast growth factor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脂肪由来幹細胞に関する新たな利用法に関する。より詳細には、本発明は、線維性病変の新たな治療に関する。本発明はまた、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などのサイトカインの新たな生産方法に関する。本発明はさらに、脂肪由来幹細胞（脂肪由来幹／間質細胞とも呼ばれる、ＡＳＣ）の新たな増殖刺激剤に関する。 The present invention relates to a new utilization method for adipose-derived stem cells. More particularly, the present invention relates to a new treatment for fibrotic lesions. The present invention also relates to a new method for producing cytokines such as hepatocyte growth factor (HGF). The present invention further relates to a novel growth stimulating agent for adipose-derived stem cells (ASC, also called adipose-derived stem / stromal cells).
脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）は、組織特異的な前駆細胞として機能するだけでなく、多能性であり、そして、特定の状況下で、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような血管新生性増殖因子を分泌する。しかし、この分泌の生物学的な役割と調節機構とは、十分に研究されていない。 Adipose-derived stem / stromal cells (ASC) not only function as tissue-specific progenitor cells, but are also pluripotent and, under certain circumstances, blood vessels such as hepatocyte growth factor (HGF) Secretes neoplastic growth factor. However, the biological role and regulatory mechanism of this secretion has not been fully studied.
脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）は、組織特異的な前駆細胞として機能し、種々の系統の細胞へと分化し得（非特許文献１）、そして、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような多くの強力な増殖因子およびサイトカインを分泌し得る（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。分泌された因子のパラクリン作用は、ＡＳＣを用いて処置された虚血性の後肢の血管分布の改善を説明する（非特許文献２；非特許文献４）；しかし、ＡＳＣの内皮細胞への分化は、血管分布の改善にも寄与し得る（非特許文献５；非特許文献６）。血管新生と組織修復を促進するためにＡＳＣを使用することは、可能性ある治療戦略としての興味を獲得し[非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、そして、ＡＳＣにより媒介される骨・脂肪の再生および血管新生の促進に関する臨床治験が進行中である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。 Adipose-derived stem / stromal cells (ASC) function as tissue-specific progenitor cells, can differentiate into cells of various lineages (Non-Patent Document 1), and vascular endothelial growth factor (VEGF) and liver Many powerful growth factors and cytokines such as cell growth factor (HGF) can be secreted (Non-patent document 2; Non-patent document 3; Non-patent document 4). The paracrine action of the secreted factor explains the improvement of vascular distribution in ischemic hindlimbs treated with ASC (Non-Patent Document 2; Non-Patent Document 4); however, the differentiation of ASC into endothelial cells is It can also contribute to the improvement of blood vessel distribution (Non-Patent Document 5; Non-Patent Document 6). Using ASC to promote angiogenesis and tissue repair has gained interest as a potential therapeutic strategy [Non-Patent Document 7; Non-Patent Document 8; Non-Patent Document 9] and is mediated by ASC. Clinical trials related to bone and fat regeneration and promotion of angiogenesis are ongoing (Non-patent Document 10; Non-patent Document 11; Non-patent Document 12).
ＡＳＣは、強力な増殖因子とサイトカインを分泌するだけでなく、その分泌した増殖因子やサイトカインからも影響を受ける。線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）は、ＡＳＣの増殖を刺激し、そして、その自己再生の維持に寄与する（非特許文献１３）。ＦＧＦ−２は、ＡＳＣの脂肪生成性（非特許文献１４）、および、軟骨形成性（非特許文献１５）の分化を促進するが、骨形成性の分化は阻害することが示されている（非特許文献１６）。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、ＡＳＣの増殖および移動を誘導する（非特許文献１７）。ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびインシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含有する培養培地は、ＡＳＣの増殖を顕著に加速し、そして、その多能性を保存した（非特許文献１８）。このことは、ＡＳＣ増殖に対するこれらの増殖因子の間での相乗作用を示唆する。 ASC not only secretes powerful growth factors and cytokines, but is also affected by the secreted growth factors and cytokines. Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) stimulates the proliferation of ASC and contributes to the maintenance of its self-renewal (Non-patent Document 13). FGF-2 has been shown to promote ASC adipogenic (Non-Patent Document 14) and chondrogenic (Non-Patent Document 15) differentiation but inhibit osteogenic differentiation ( Non-patent document 16). Platelet-derived growth factor (PDGF) induces ASC proliferation and migration (Non-patent Document 17). Culture media containing VEGF, FGF-2, epidermal growth factor (EGF) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) significantly accelerated ASC growth and preserved its pluripotency ( Non-patent document 18). This suggests a synergistic effect between these growth factors on ASC proliferation.
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、増殖因子による細胞調節の多くの面に関与する、重要なシグナル伝達系の酵素である（非特許文献１９）。ＭＡＰＫの中でも、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）は、ＦＧＦ−２により媒介されるＡＳＣの自己再生に部分的に関与し（非特許文献１３）、そして、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、ＰＤＧＦにより誘導されるＡＳＣの増殖および移動において重要な役割を果たす（非特許文献１７）ことが報告されている。また、ＡＳＣが、ｐ３８ ＭＡＰＫ依存性の機構により、腫瘍壊死因子αに応答して、ＶＥＧＦ、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を産生することを示す研究もある（非特許文献２０）。 Mitogen-activated protein kinase (MAPK) is an important signal transduction enzyme involved in many aspects of cell regulation by growth factors (Non-patent Document 19). Among MAPKs, extracellular signal-regulated kinase (ERK) is partly involved in FGF-2 mediated self-renewal of ASC (Non-patent Document 13) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) Has been reported to play an important role in the proliferation and migration of ASC induced by PDGF (Non-patent Document 17). There is also a study showing that ASC produces VEGF, HGF and IGF-1 in response to tumor necrosis factor α by a p38 MAPK-dependent mechanism (Non-patent Document 20).
本研究において、本発明者らは、ＡＳＣに対する、障害関連増殖因子の影響を評価した。損傷およびその後の創傷治癒の過程で、種々の増殖因子および炎症性サイトカインが、細胞の再生活性を調節する。本発明者らは、以前に、脂肪吸引手術後の創傷流体を解析し、そして、それに続く増殖因子の発現を報告した：ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、創傷治癒の早期段階において放出され、一方で、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、後期段階において発現された（非特許文献２１）。増殖因子の投与は、熱傷に対してのＦＧＦ−２（非特許文献２２、および心筋梗塞に対してのＨＧＦ（非特許文献２３）などのように、損傷を受けた組織の再生を促進することが報告されている。しかし、おそらく、脂肪組織障害の良好なモデルが存在しないために、脂肪組織における損傷および修復の過程と、ＡＳＣの潜在的な役割について焦点を当てた研究はほとんどない。そして、これらの文献は、（１）術後ドレーンを解析したのみであり各ＧＦ量変化のメカニズムやパラクライン的な作用についてはなし（２）ＡＳＣの遺伝子発現等についてはデータなし（３）ＡＳＣがＨＧＦを分泌するとは結論していないなどの欠点が存在する。 In this study, we evaluated the effects of disorder-related growth factors on ASC. In the process of injury and subsequent wound healing, various growth factors and inflammatory cytokines regulate cell regenerative activity. We have previously analyzed wound fluid after liposuction surgery and reported subsequent growth factor expression: FGF-2 and PDGF are released in the early stages of wound healing, while , VEGF and HGF were expressed in the late stage (Non-patent Document 21). Growth factor administration promotes regeneration of damaged tissue, such as FGF-2 for burns (Non-patent Document 22 and HGF for myocardial infarction (Non-patent Document 23)). However, few studies have focused on the process of damage and repair in adipose tissue and the potential role of ASC, probably because there is no good model for adipose tissue injury. These literatures are (1) only analysis of postoperative drains, no mechanism of GF amount change and paracrine action, (2) no data on gene expression of ASC, etc. (3) ASC is HGF There are drawbacks, such as not conclude that it secretes.
上記のように、皮膚（ケロイドや肥厚性瘢痕），肝臓（肝硬変），肺（肺線維症），心臓（心筋梗塞後）など，身体の様々な部位において線維性病変は起こりうるが，線維性病変に対する効果的な治療法は存在しないのが現状であった。抗線維化作用のある物質としては肝細胞増殖因子（以下HGF）が知られていたが，血中半減期が非常に短く，これを持続的・効果的に生体に投与する方法は実用化されていなかった。また，脂肪由来幹細胞を用いた治療自体は，脂肪注入術と組み合わせた方法が組織増大を目的に行われているが，線維性病変に対する治療としては行われていなかった。
これまで治療が困難であった各種の線維性病変に対して，病変部の改善（線維化の縮小、消失）を図ることを本発明の課題とする。 An object of the present invention is to improve the lesion (reduction or disappearance of fibrosis) for various fibrous lesions that have been difficult to treat.
上記課題は、脂肪由来幹細胞と特定のサイトカイン（たとえば、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下ＦＧＦ−２ともいう））を組み合わせた方法を用い，病変部の改善（線維化の縮小、消失）を図ることにより解決された。 The above problem is to improve the lesion (reduction or disappearance of fibrosis) using a method that combines adipose-derived stem cells and specific cytokines (for example, basic fibroblast growth factor (hereinafter also referred to as FGF-2)). It was solved by planning.
詳細には、本発明者らは、損傷を受けた組織から放出された因子によって刺激されたＡＳＣが、おそらくは、再生関連増殖因子を分泌することによって、または、脂肪細胞、内皮細胞もしくは他の細胞型へと分化することによって、脂肪組織の修復過程において重要な役割を果たすと仮定した。本発明者らは、インビトロにおけるヒトおよびマウスのＡＳＣに対する、損傷関連因子の影響および機構を検討した。さらに、本発明者らは、再生過程の間のＡＳＣの役割を説明するために、脂肪組織に対する虚血再灌流障害の最初のマウスモデルを用いて、細胞レベルおよび分子レベルにおける損傷関連増殖因子の発現を評価した。 In particular, the inventors have shown that ASCs stimulated by factors released from damaged tissues, possibly by secreting regeneration-related growth factors, or by adipocytes, endothelial cells or other cells It was hypothesized that by playing into a type, it played an important role in the repair process of adipose tissue. We examined the effects and mechanisms of damage-related factors on human and mouse ASCs in vitro. In addition, we have used the first mouse model of ischemia-reperfusion injury to adipose tissue to explain the role of ASC during the regeneration process, using damage-related growth factors at the cellular and molecular levels. Expression was assessed.
その結果、本発明により、線維性病変が顕著に治癒することが明らかになった。 As a result, it has been clarified that the fibrous lesion is significantly healed by the present invention.
本発明者らの研究により，脂肪由来幹細胞を培養する際にＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインを添加すると，増殖が促進されるのみならず，ＨＧＦの分泌が促進されることが判明した。この作用は、とくにＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインの刺激を長期的に投与した場合に特に顕著に見られた。また，マウス脂肪組織の創傷モデルを用いた実験により，通常の創傷治癒過程でもＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインによって脂肪由来幹細胞からのＨＧＦ分泌が亢進しており，これが治癒過程での線維化を抑制しているということが明らかになった。 Our research has shown that addition of specific cytokines such as FGF-2 and PDGF not only promotes proliferation but also secretes HGF when culturing adipose-derived stem cells. . This effect was particularly noticeable when long-term administration of specific cytokines such as FGF-2 and PDGF was performed. In addition, experiments using a mouse adipose tissue wound model showed that HGF secretion from adipose-derived stem cells was enhanced by specific cytokines such as FGF-2 and PDGF in the normal wound healing process. It became clear that it was restrained.
したがって，本発明では、線維性病変に対する以下のような治療法が可能であることになる。 Therefore, in the present invention, the following treatment method for the fibrotic lesion is possible.
患者から採取した脂肪組織をコラゲナーゼで分解し，遠心処理を行うことにより，脂肪由来幹細胞を抽出する。この細胞をＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインとともに線維性病変部に投与し，脂肪由来幹細胞からのＨＧＦ分泌を亢進させ，ＨＧＦの線維化抑制作用による病変部の改善を図る。 Adipose-derived stem cells are extracted by degrading adipose tissue collected from patients with collagenase and centrifuging. This cell is administered to a fibrotic lesion together with specific cytokines such as FGF-2 and PDGF to enhance HGF secretion from adipose-derived stem cells, and to improve the lesion by an action of suppressing fibrosis of HGF.
別の実施形態では、本発明では、創傷時に発現が見られる代表的な増殖因子（ＶＥＧＦ，ＦＧＦ−２，ＨＧＦ，ＰＤＧＦ）によるＡＳＣの細胞増殖および自らの増殖因子分泌に対する影響を調べた。さらに、影響を持つ増殖因子のシグナル伝達系を同定するための阻害実験を行った。また、脂肪組織の創傷（虚血再潅流障害）モデル（マウス）を確立し、創傷治癒過程における増殖因子の発現および組織内の変化を検討した。 In another embodiment, the present invention examined the effects of typical growth factors (VEGF, FGF-2, HGF, PDGF) that are expressed upon wounding on ASC cell growth and their own growth factor secretion. Furthermore, inhibition experiments were conducted to identify the signal transduction system of growth factors that had an effect. We also established a fat tissue wound (ischemic reperfusion injury) model (mouse) and examined the expression of growth factors and changes in the tissue during the wound healing process.
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは濃度依存的にＡＳＣの増殖を促進した。また、ＦＧＦ−２により、ＡＳＣからのＨＧＦ分泌がｍＲＮＡおよび蛋白レベルで著明に促進された。このＦＧＦ−２による細胞増殖およびＨＧＦ分泌の促進は、ＪＮＫ阻害剤によって最も抑制された。虚血再潅流障害脂肪組織においては、直後からＦＧＦ−２の蛋白発現が見られ、引き続きＨＧＦのｍＲＮＡおよび蛋白発現が上昇した。また、このＨＧＦの発現はＪＮＫ阻害剤によって抑制され、さらにその抑制により治癒後の線維化が増すことが示された。 FGF-2 and PDGF promoted ASC proliferation in a concentration-dependent manner. In addition, FGF-2 markedly promoted HGF secretion from ASC at the mRNA and protein levels. This promotion of cell proliferation and HGF secretion by FGF-2 was most suppressed by the JNK inhibitor. In the ischemia-reperfusion injury adipose tissue, FGF-2 protein expression was observed immediately after, and HGF mRNA and protein expression subsequently increased. In addition, it was shown that the expression of HGF was suppressed by a JNK inhibitor, and further, fibrosis after healing was increased by the suppression.
ＡＳＣは、創傷時に周囲の細胞外マトリックスから大量に放出されるＦＧＦ−２に刺激を受け、主にＪＮＫの経路を介して細胞増殖およびＨＧＦ分泌を促進し、創傷治癒過程における血管新生、線維化抑制において重要な役割を果たしていることが示唆された。 ASC is stimulated by FGF-2 released in large quantities from the surrounding extracellular matrix at the time of wounding, and promotes cell proliferation and HGF secretion mainly via the JNK pathway, and angiogenesis and fibrosis in the wound healing process It was suggested that it plays an important role in suppression.
本発明は、線維化抑制作用のあるＨＧＦを生体に持続的・効果的に投与する手段として脂肪由来幹細胞を用いること，特に，ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインによる刺激を加えてＨＧＦ分泌を促進させた状態で投与すること、およびＦＧＦ−２、ＰＤＧＦなどの特定のサイトカインの徐放製剤とともに脂肪由来幹細胞を投与することを意図する。 The present invention uses adipose-derived stem cells as a means to continuously and effectively administer HGF having a fibrosis-suppressing action to a living body, and in particular, HGF secretion by adding stimulation by specific cytokines such as FGF-2 and PDGF. Is intended to be administered in a state that promotes and adipose-derived stem cells are administered together with sustained release formulations of specific cytokines such as FGF-2, PDGF.
したがって、本発明は、以下を提供する。 Accordingly, the present invention provides the following.
１つの局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤を提供する。 In one aspect, the present invention provides a therapeutic agent comprising a fat-derived stem cell (ASC) and at least one factor selected from the group consisting of fibroblast growth factor (FGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) or Prophylactic agents are provided.
１つの実施形態において、本発明の治療剤または予防剤は、線維性病変を処置または予防するためのものである。 In one embodiment, the therapeutic or prophylactic agent of the present invention is for treating or preventing fibrotic lesions.
１つの実施形態において、この線維性病変は、慢性炎症時のものである。 In one embodiment, the fibrotic lesion is during chronic inflammation.
好ましい実施形態では、本発明において用いられるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。 In a preferred embodiment, the FGF used in the present invention is basic fibroblast growth factor (FGF-2).
別の局面では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。 In another aspect, a method for producing hepatocyte growth factor (HGF) comprising culturing adipose-derived stem cells (ASC) in the presence of fibroblast growth factor (FGF) is provided.
この生産方法において好ましい実施形態では、本発明において用いられるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。 In a preferred embodiment in this production method, the FGF used in the present invention is basic fibroblast growth factor (FGF-2).
別の局面では、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。 In another aspect, the present invention provides an adipose-derived stem cell (ASC) growth stimulator comprising fibroblast growth factor (FGF).
さらに別の局面では、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a hepatocyte growth factor (HGF) production stimulator for adipose-derived stem cells (ASC), comprising fibroblast growth factor (FGF).
なおさらなる別の局面では、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。 In yet another aspect, the present invention relates to a disease or a disease using at least one factor selected from the group consisting of adipose-derived stem cells (ASC) and fibroblast growth factor (FGF) and platelet-derived growth factor (PDGF). A method of treating or preventing a disorder is provided.
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。 In all these aspects, it is understood that each embodiment described herein can be applied in other aspects, as long as applicable.
ＨＧＦには線維化抑制作用があることは以前から知られている。ＦＧＦ−２によってＨＧＦ分泌が促進された脂肪由来幹細胞を投与することにより，線維性病変部でＨＧＦが持続的，効果的に作用することが期待される。 It has been known for a long time that HGF has an action of suppressing fibrosis. By administering adipose-derived stem cells whose HGF secretion is promoted by FGF-2, it is expected that HGF will act continuously and effectively in the fibrotic lesion.
以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with respect to the present invention. Throughout this specification, singular forms (eg, “a”, “an”, “the” in English, corresponding articles in other languages, adjectives, etc.) It should be understood that it also includes the plural concept. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(Definition of terms)
Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.
用語「細胞」は、当該分野におけるその最も広義の意味で本明細書において使用され、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有し、そして細胞のような生物体を外界から隔離する膜構造に包まれる、多細胞生物の組織の構成単位をいう。本発明の方法において、任意の細胞が対象として使用され得る。本発明で使用される細胞の数は、光学顕微鏡により計数することができる。光学顕微鏡を使用して計数する場合は、核の数が計数される。組織を組織切片スライスとし、次いでヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色し、細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を識別する。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であってもよい。細胞の供給源の例としては、単一の細胞培養物；正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織；あるいは正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるが、それらに限定されない。このような供給源自体が、細胞として使用され得る。 The term “cell” is used herein in its broadest sense in the art, has self-renewability inside, has genetic information and its expression mechanism, and removes an organism such as a cell from the outside world. A structural unit of tissue of a multicellular organism that is enveloped in an isolated membrane structure. In the method of the present invention, any cell can be used as a subject. The number of cells used in the present invention can be counted with an optical microscope. When counting using an optical microscope, the number of nuclei is counted. The tissue is made into tissue section slices and then hematoxylin-eosin (HE) stained to identify extracellular matrix (eg, elastin or collagen) and cell-derived nuclei. This tissue section can be examined with an optical microscope, and the number of nuclei per specific area (for example, 200 μm × 200 μm) can be estimated and counted. The cell used herein may be a naturally occurring cell or an artificially modified cell (for example, a fused cell, a genetically modified cell, etc.). Examples of cell sources include a single cell culture; a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue; or a cell mixture such as cells from a normally grown cell line. However, it is not limited to them. Such a source itself can be used as a cell.
本明細書において使用される脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）およびそれに対応する物質は、生物が脂肪細胞またはそれに対応する細胞を有しさえすれば、任意の生物（例えば、哺乳動物など）、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）に由来し得る。１つの実施形態において、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。 As used herein, a fat cell (adipocyte) and its corresponding substance can be any organism (eg, a mammal, etc.), as long as the organism has an adipocyte or a corresponding cell. Preferably, mammals (e.g., single pores, marsupials, rodents, wings, wings, carnivores, carnivores, long noses, odd-hoofed animals, even-hoofed animals, rodents, Scales, sea cattle, cetaceans, primates, rodents, rabbits, etc.). In one embodiment, cells from primates (eg, chimpanzees, Japanese monkeys, humans) are used. Most preferably, human-derived cells are used, but the invention is not so limited.
本明細書において使用される場合、「幹細胞」とは、単分化能性、多能性、または全能性を有する、分化細胞の前駆体（または前駆細胞）をいう。幹細胞は、特定の刺激に応答して分化され得る。代表的に、幹細胞は、損傷された組織を再生することができる。本明細書で使用される幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、あるいは他の前駆細胞であり得るが、これらに限定されない。上述の能力を有している限り、幹細胞は、人工的に作製した細胞（例えば、融合細胞、再プログラム化された細胞など）であってもよい。胚性幹細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、相対的に限定されたレベルの分化能を有する。組織幹細胞は、組織中に存在し、未分化な細胞内構造を有する。組織幹細胞は、より高い核／細胞質比を有し、そしてわずかな細胞内オルガネラを有する。ほとんどの組織幹細胞は、多能性を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合、脂肪由来幹細胞も使用され得る。 As used herein, “stem cell” refers to a precursor (or progenitor cell) of a differentiated cell having unipotency, pluripotency, or totipotency. Stem cells can be differentiated in response to specific stimuli. Typically, stem cells can regenerate damaged tissue. Stem cells as used herein can be, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, tissue stem cells (also referred to as tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), or other progenitor cells. Not. As long as it has the above-mentioned ability, the stem cell may be an artificially produced cell (for example, a fused cell, a reprogrammed cell, etc.). Embryonic stem cells are pluripotent stem cells derived from early embryos. Tissue stem cells, unlike embryonic stem cells, have a relatively limited level of differentiation potential. Tissue stem cells are present in tissues and have an undifferentiated intracellular structure. Tissue stem cells have a higher nucleus / cytoplasm ratio and a few intracellular organelles. Most tissue stem cells are pluripotent, have a slow cell cycle, and maintain proliferative ability over the life of the individual. As used herein, adipose-derived stem cells can also be used.
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。 When classified according to the site of origin, tissue stem cells are classified into, for example, the skin system, digestive system, myeloid system, and nervous system. Examples of skin tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells. Examples of digestive tissue stem cells include pancreatic (common) stem cells and liver stem cells. Examples of myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. Examples of nervous system tissue stem cells include neural stem cells and retinal stem cells.
本明細書において使用される場合、「前駆細胞」とは、子孫にあたる細胞が特定の分化形質を発現することが明らかな場合、分化形質を発現していない未分化な親細胞をいい、多能性未分化細胞だけでなく単分化能性未分化細胞も含む。例えば、子孫にあたる細胞が、血管内皮細胞である場合、その前駆細胞を血管内皮前駆細胞という。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。しかし、幹細胞の分化により得られる前駆細胞は、その幹細胞から見ると「分化細胞」に対応するということができる。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」または「ＬＡＦ」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。 As used herein, a “progenitor cell” refers to an undifferentiated parent cell that does not express a differentiation trait when it is clear that a cell that is a progeny expresses a specific differentiation trait. It includes not only sex undifferentiated cells but also unipotent undifferentiated cells. For example, when a cell serving as a progeny is a vascular endothelial cell, the progenitor cell is referred to as a vascular endothelial progenitor cell. As used herein, the term “stem cell” includes progenitor cells. However, it can be said that progenitor cells obtained by differentiation of stem cells correspond to “differentiated cells” when viewed from the stem cells. The term “PLA (aspiration fat-derived cells)” refers to progenitor cells obtained from the fat portion (aspiration fat) of a lipoaspirate. Progenitor cells derived from the liquid portion of lipoaspirate can be referred to as “aspirate cells” or “LAF”. Adipose-derived progenitor cells include PLA (aspirated fat-derived cells) and aspirate cells.
いわゆる吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）（脂肪吸引物の脂肪部分）から単離された細胞は、回収した起源にちなんでＰＬＡ（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）細胞と呼ばれている（例えば、Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２００２；１３：４２７９−４２９５）。そこで、本明細書中でも同様に、脂肪吸引物の脂肪部分から単離した細胞を、ＰＬＡ細胞という。また、本明細書中、脂肪吸引物の液体部分から単離された細胞を、ＬＡＦ（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ ａｓｐｉｒａｔｅ ｆｌｕｉｄ：脂肪吸引物液）細胞という。 Cells isolated from so-called lipoaspirates (the fat part of the lipoaspirate) are called PLA (processed lipoaspirate) cells after the recovered origin (eg Zuk et al. Mol Biol Cell 2002). ; 13: 4279-4295). Therefore, in the present specification, the cells isolated from the fat portion of the lipoaspirate are also referred to as PLA cells. Moreover, in this specification, the cell isolated from the liquid part of the lipoaspirate is referred to as a LAF (Liporation Aspirate Fluid) cell.
本明細書において使用される場合、用語「脂肪由来前駆細胞」、「脂肪由来幹細胞」および「脂肪由来幹／間質細胞」は、交換可能に使用される用語であり、本明細書では、「ASC」と省略され、脂肪吸引より得られた、幹細胞および前駆細胞をいう。ここでいう前駆細胞は、この脂肪吸引により得られた、末梢血由来の幹細胞または血管間質細胞（脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ））のようなものである。脂肪由来前駆細胞は、脂肪組織または脂肪吸引法により得られた任意の多能性前駆細胞または単分化能性前駆細胞の集団を意味する。この細胞としては、脂肪由来血管間質細胞（＝脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、脂肪由来間質細胞）、脂肪由来幹細胞、脂肪幹細胞、内皮前駆細胞、造血性幹細胞などが挙げられる。このような幹細胞を単離するためのいくつかの技術が、例えば、Ｎａｋａｔｓｕｊｉら「幹細胞研究プロトコール［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ／Ｃｌｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ］」、Ｙｏｄｏｓｈａ（２００１）；ＷＯ００／５３７９５；ＷＯ０３／０２２９８８；ＷＯ０１／６２９０１に記載されるように知られている。これらの文献は、その関連部分において、参考として本明細書中に援用される。本明細書中において使用される場合、ASCとは、これらの公知な単離方法により得られた脂肪組織由来幹細胞を含む、全ての脂肪組織由来幹細胞をいう。本明細書中で使用される場合、「前駆細胞」は、多能性未分化細胞だけでなく、単分化能性未分化細胞も含む。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、前駆細胞を含む。用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）」は、脂肪吸引物の脂肪部分（吸引脂肪）から得られる前駆細胞をいう。脂肪吸引物の液体部分に由来する前駆細胞は、「吸引物細胞」ということができる。脂肪由来前駆細胞は、ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞）および吸引物細胞を含む。 As used herein, the terms “adipose-derived progenitor cells”, “adipose-derived stem cells”, and “adipose-derived stem / stromal cells” are terms used interchangeably and are used herein as “ It is abbreviated as “ASC” and refers to stem cells and progenitor cells obtained by liposuction. The progenitor cells referred to here are the peripheral blood-derived stem cells or vascular stromal cells (preadipocytes) obtained by this liposuction. An adipose-derived progenitor cell means any pluripotent progenitor cell or population of unipotent progenitor cells obtained by adipose tissue or liposuction. Examples of the cells include adipose-derived vascular stromal cells (= preadipocytes, adipose-derived stromal cells), adipose-derived stem cells, adipose stem cells, endothelial progenitor cells, hematopoietic stem cells, and the like. Several techniques for isolating such stem cells are described, for example, by Nakatsuji et al., “Stem Cell / Clone Research Protocol”, Yodosha (2001); WO 00/52995; WO 03/022988; WO 01/62901 Known as described in These documents are incorporated herein by reference in their relevant parts. As used herein, ASC refers to all adipose tissue-derived stem cells including adipose tissue-derived stem cells obtained by these known isolation methods. As used herein, “progenitor cells” include unipotent undifferentiated cells as well as pluripotent undifferentiated cells. As used herein, the term “stem cell” includes progenitor cells. The term “PLA (aspiration fat-derived cells)” refers to progenitor cells obtained from the fat portion (aspiration fat) of a lipoaspirate. Progenitor cells derived from the liquid portion of the lipoaspirate are referred to as “aspirate cells”. Adipose-derived progenitor cells include PLA (aspirated fat-derived cells) and aspirate cells.
語句「脂肪吸引由来物質」とは、脂肪吸引が行われた際に生成する任意の物質をいう。代表的に、このような脂肪吸引由来物質は、脂肪組織および脂肪吸引物を含む。 The phrase “substance derived from liposuction” refers to any substance that is produced when liposuction is performed. Typically, such liposuction-derived materials include adipose tissue and lipoaspirate.
語句「脂肪吸引物」とは、脂肪吸引が行われる際に生成する液体をいう。このような脂肪吸引物は、以下：（１）脂肪吸引時に一緒に吸引された液体（例えば、トゥメセント液および血液を含む）または、（２）吸引脂肪を溶液（例えば、生理食塩水）で洗浄する際に生じた廃液、をいう。 The phrase “lipoaspirate” refers to a liquid that is produced when liposuction is performed. Such lipoaspirates are as follows: (1) liquid aspirated together during liposuction (eg, containing tumecent fluid and blood) or (2) washing aspirated fat with a solution (eg, saline) This refers to the waste liquid generated during the process.
本明細書において使用される場合、用語「脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）」とは、組織間に位置されるか、あるいは、疎性結合組織または毛細血管周辺の一群として脂肪組織を形成し、そして大量の脂質を含む細胞をいう。脂肪細胞（Ｆａｔ Ｃｅｌｌ）としては、黄色脂肪細胞（ｙｅｌｌｏｗ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）または褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）が挙げられる。これらの細胞は、本明細書中において等価に使用され得る。細胞内の脂肪は、スダンＩＩＩ（Ｓｕｄａｎ ＩＩＩ）または四酸化オスミウムを用いて容易に検出され得る。 As used herein, the term “adipocyte” is positioned between tissues or forms adipose tissue as a group of loose connective tissue or capillaries and Refers to cells containing lipids. As fat cells (Fat Cell), yellow adipocytes or brown adipocytes are exemplified. These cells can be used equivalently herein. Intracellular fat can be easily detected using Sudan III or osmium tetroxide.
本明細書において「線維芽細胞増殖因子」または「繊維芽細胞増殖因子」（ＦＧＦ）とは、中胚葉と神経外胚葉から発生した幅広い細胞の増殖を促進する因子のファミリーであり、具体的には、ＦＧＦ−１ （酸性ＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）、ｉｎｔ−２（ＦＧＦ−３）、ｈｓｔ−１（ＦＧＦ−４）、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ−２（ＦＧＦ−６）、ＫＧＦ （ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ−７）、ＦＧＦ−８（ＡＩＧＦ；ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−９（ＧＡＦ；Ｇｌｉａ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）などの２０種類以上の分子が含まれる。なお、後述する実施例では、これらＦＧＦのなかでも、ＦＧＦ−２を用いているが、これに限定されるものではなく、他のＦＧＦも適宜用いることができる。なお、ＦＧＦの濃度等は、当業者であれば適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、特に、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。 As used herein, “fibroblast growth factor” or “fibroblast growth factor” (FGF) is a family of factors that promote the growth of a wide range of cells generated from mesoderm and neuroectoderm. Are FGF-1 (acidic FGF), FGF-2 (basic FGF), int-2 (FGF-3), hst-1 (FGF-4), FGF-5, hst-2 (FGF-6), More than 20 types of molecules such as KGF (Keratinocyte Growth Factor, FGF-7), FGF-8 (AIGF), and FGF-9 (GAF; Glia-Activating Factor) are included. In the examples described later, FGF-2 is used among these FGFs, but the present invention is not limited to this, and other FGFs can be used as appropriate. The concentration of FGF and the like can be appropriately set by those skilled in the art and are not particularly limited, but are particularly preferably 0.1 ng / ml to 10 ng / ml.
本明細書において「塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）」または「塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）」とは、代表的にアクセッション番号NM_002006（ヒト）で示される配列を有するものをいう。 In the present specification, “basic fibroblast growth factor (FGF-2)” or “basic fibroblast growth factor (FGF-2)” is typically a sequence represented by the accession number NM_002006 (human). The thing which has.
本明細書において「血小板由来増殖因子」（ＰＤＧＦ）とは、血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす哺乳動物血小板由来増殖因子を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、ＰＤＧＦ−Ｂ及びＰＤＧＦ−Ａを含むＰＤＧＦの様々なサブタイプを包含する。さらに、ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、コグネイトＰＤＧＦ受容体を通して血管新生又は血管新生過程を刺激するように働く、ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−ＤなどのＰＤＧＦ関連血管新生因子を指す。特に、「ＰＤＧＦ」という用語は、（ｉ）ＰＤＧＦＲ−Ｂ又はＰＤＧＦＲ−ＡなどのＰＤＧＦ受容体に結合する；（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化する；及び（ｉｉｉ）これによって血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす、増殖因子のクラスの成員を意味する。ここで使用する、「ＰＤＧＦ」という用語は、一般に、応答性細胞型上の血小板由来増殖因子細胞表面受容体（すなわちＰＤＧＦＲ）の結合及び活性化を通してＤＮＡ合成及び有糸***誘発を誘導する増殖因子のクラスの成員を指す。ＰＤＧＦは、例えば：定方向細胞遊走（走化性）及び細胞活性化；ホスホリパーゼ活性化；ホスファチジルイノシトール代謝回転及びプロスタグランジン代謝の上昇；応答性細胞によるコラーゲン及びコラゲナーゼ合成の刺激；マトリックス合成、サイトカイン産生及びリポタンパク質取込みを含む細胞代謝活性の変調；間接的に、ＰＤＧＦ受容体を持たない細胞における増殖応答の誘導；及び強力な血管収縮剤作用を含む、特異的生物作用を生じさせる。「ＰＤＧＦ」という用語は、「ＰＤＧＦ」ポリペプチド及びこの対応する「ＰＤＧＦ」コード遺伝子又は核酸の両方を包含することが意図されている。 As used herein, “platelet-derived growth factor” (PDGF) means a mammalian platelet-derived growth factor that affects angiogenesis or angiogenesis processes. As used herein, the term “PDGF” encompasses various subtypes of PDGF, including PDGF-B and PDGF-A. Furthermore, as used herein, the term “PDGF” refers to PDGF-related angiogenic factors, such as PDGF-C and PDGF-D, that act to stimulate angiogenesis or angiogenic processes through cognate PDGF receptors. In particular, the term “PDGF” (i) binds to a PDGF receptor such as PDGFR-B or PDGFR-A; (ii) activates tyrosine kinase activity associated with the VEGF receptor; and (iii) Means a member of the growth factor class that influences angiogenesis or the angiogenic process. As used herein, the term “PDGF” generally refers to a growth factor that induces DNA synthesis and mitogenesis through the binding and activation of platelet-derived growth factor cell surface receptors (ie, PDGFR) on responsive cell types. Refers to members of the class. PDGF, for example: directed cell migration (chemotaxis) and cell activation; phospholipase activation; phosphatidylinositol turnover and increased prostaglandin metabolism; stimulation of collagen and collagenase synthesis by responsive cells; matrix synthesis, cytokines Modulation of cellular metabolic activities, including production and lipoprotein uptake; indirectly induces proliferative responses in cells that do not have PDGF receptors; and produces specific biological effects, including potent vasoconstrictor effects. The term “PDGF” is intended to encompass both “PDGF” polypeptides and their corresponding “PDGF” encoding genes or nucleic acids.
本明細書において「肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）」とは、劇症肝炎患者の血清から見出されたサイトカインで、分子量が約10万のタンパク質であり、その生理作用は非常に広く、肝硬変やアルコール肝炎の治療、糖尿病に起因する虚血性疾患の治療などにも用いられている。ここで使用する、「ＨＧＦ」という用語は、様々なサブタイプを包含する。代表的にアクセッション番号NM_010427（ヒト）で示される配列を有するものをいう
本明細書において使用される「増殖刺激剤」とは、細胞の増殖を正の方向に加速する任意の因子（たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子など）をいう。標的が脂肪由来幹細胞であれば、脂肪由来幹細胞増殖刺激剤という。
In the present specification, “hepatocyte growth factor (HGF)” is a cytokine found in the serum of a patient with fulminant hepatitis, a protein having a molecular weight of about 100,000, and has a very wide range of physiological effects. It is also used to treat alcoholic hepatitis and ischemic diseases caused by diabetes. As used herein, the term “HGF” encompasses various subtypes. A “growth stimulating agent” as used herein refers to an agent having a sequence represented by the accession number NM_010427 (human) as a representative (eg, any factor that accelerates cell proliferation in the positive direction (for example, Protein, peptide, nucleic acid, small molecule, etc.). If the target is an adipose-derived stem cell, it is called an adipose-derived stem cell proliferation stimulator.
以上に記載したサイトカイン類は、必要に応じて、GenBankなどから遺伝子の情報（アクセッション番号）を入手して、生産し、またはプローブなどの調製を行うことができる。そのようなアクセッション番号の例としては、上記のほか、実施例において引用したものを挙げることができる。 The cytokines described above can be produced by obtaining gene information (accession number) from GenBank or the like, or preparing probes or the like as necessary. In addition to the above, examples of such accession numbers include those cited in the embodiments.
本明細書において使用される「生産刺激剤」とは、任意の生産物の生産を正の方向に加速する任意の因子（たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子など）をいう。標的が肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）であれば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤という。 As used herein, “production stimulant” refers to any factor (eg, protein, peptide, nucleic acid, small molecule, etc.) that positively accelerates the production of any product. If the target is hepatocyte growth factor (HGF), it is called a hepatocyte growth factor (HGF) production stimulator.
本明細書において、細胞を培養する際に用いることができる培地は、通常の細胞培養用の培地を用いることができ、その具体的な組成等は限定されるものではない。例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）やＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地に、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものを用いることができる。この際、必要に応じて、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合してもよい。なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。さらに、本発明において、培地中にトランスフェリン、インスリン、セレン酸、及びリノール酸からなる群より選択される１種又は２種以上の添加剤を添加することにより、培地中の血清濃度が低い場合でも、通常の血清の使用量と同等若しくはそれ以上の増殖効果を得ることができる。 In the present specification, as a medium that can be used for culturing cells, a normal cell culture medium can be used, and the specific composition and the like are not limited. For example, MEM (Minimum Essential Medium) or DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) medium mixed with FBS (Fetal Bovine Serum) and antibiotics at a predetermined blending ratio Can be used. At this time, if necessary, growth factors such as cytokines, concentrated platelets, BMP, TGF-β, IGF, PDGF, VEGF, HGF, and a substance that contributes to the growth are mixed. May be. Moreover, you may mix hormone agents, such as estrogen, and nutrients, such as a vitamin. Human serum may be used instead of fetal bovine serum. In addition to penicillin antibiotics, any antibiotics such as cephem, macrolide, tetracycline, fosfomycin, aminoglycoside, and new quinolone can be employed as the antibiotic. Furthermore, in the present invention, even when the serum concentration in the medium is low by adding one or more additives selected from the group consisting of transferrin, insulin, selenate, and linoleic acid to the medium. Thus, a proliferation effect equivalent to or higher than that of normal serum can be obtained.
本明細書において「線維性病変」または「繊維性病変」とは、線維が変性する任意の病変を言う。代表的には、線維性病変としては、慢性関節リウマチ、肺線維症、肝硬変、腎硬化症、心筋梗塞、皮膚筋炎、SLE（全身性エリテマトーデス）、シェーグレン症候群、強皮症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自己免疫性肝炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化、ASO（閉塞性動脈硬化症）、バージャー病などをあげることができるが、これに限定されない。 As used herein, “fibrotic lesion” or “fibrotic lesion” refers to any lesion in which fibers degenerate. Typical fibrotic lesions include rheumatoid arthritis, pulmonary fibrosis, cirrhosis, nephrosclerosis, myocardial infarction, dermatomyositis, SLE (systemic lupus erythematosus), Sjogren's syndrome, scleroderma, hypertrophic scar, keloid , Autoimmune hepatitis, necrotizing fasciitis, arteriosclerosis, ASO (obstructive arteriosclerosis), Buerger's disease, and the like.
本明細書において使用される虚血還流は、線維化形成のモデルでありうる。そして、このような虚血還流の実験は、本明細書中実施例において例証されている。 As used herein, ischemic reflux can be a model of fibrosis formation. Such ischemic reflux experiments are illustrated in the Examples herein.
本明細書において使用される「慢性炎症」とは、あらゆる臓器、組織でおこりうる慢性の炎症一般を指し、たとえば、阻血、感染（微生物）、自己免疫反応（これは非常に多く範囲も広い）、アレルギー、膠原病、リウマチ、毒性物質への暴露（アスベスト、ヒ素、異物など）、毒性物質への暴露（アスベスト、ヒ素など）、動脈硬化などで起こる炎症であり、広く予防、処置が期待されるものである。 As used herein, “chronic inflammation” refers to chronic inflammation that can occur in any organ or tissue in general, such as ischemia, infection (microorganisms), autoimmune reactions (this is a very large and wide range). Inflammation caused by allergy, collagen disease, rheumatism, exposure to toxic substances (asbestos, arsenic, foreign substances, etc.), exposure to toxic substances (asbestos, arsenic, etc.), arteriosclerosis, etc. Is.
本明細書において使用される場合、「診断、予防、処置または予後のために有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技術を用いて種々のパラメータを参酌することにより、当業者により決定され得る。 As used herein, “an amount effective for diagnosis, prevention, treatment or prognosis” is recognized as being medically effective in diagnosis, prevention, treatment (or therapy) or prognosis, respectively. The amount of the degree. Such amounts can be determined by one skilled in the art by taking into account various parameters using techniques well known in the art.
本発明が医薬として使用される場合、その医薬は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。当該分野において公知な任意の薬学的に受容可能なキャリアが、本発明の医薬において使用され得る。 When the present invention is used as a medicament, the medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. Any pharmaceutically acceptable carrier known in the art can be used in the medicament of the present invention.
薬学的に受容可能なキャリアまたは適切な処方材料としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、および／または薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明の細胞および他の活性成分を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般に使用される他の物質を補充することが可能である。 Pharmaceutically acceptable carriers or suitable formulation materials include antioxidants, preservatives, colorants, flavoring agents, diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffering agents, delivery vehicles , And / or pharmaceutical adjuvants. Typically, the medicament of the present invention is administered in the form of a composition comprising the cells of the present invention and other active ingredients together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents. . For example, a suitable vehicle can be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which can be supplemented with other substances commonly used in compositions for parenteral delivery. is there.
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくはレシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして好ましくは、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるが、これらに限定されない。 Acceptable carriers, excipients or stabilizers used herein are preferably non-toxic to the recipient and are preferably inert at the dosages and concentrations used, And preferably phosphate, citrate, or other organic acids; ascorbic acid, α-tocopherol; low molecular weight polypeptides; proteins (eg, serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymers (eg, polyvinyl Pyrrolidone); amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose, or dextrin); chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg, EDTA) Mannitol or sorbit Le); salt-forming counterions (such as sodium); and / or non-ionic surface-active agents (e.g., Tween, Pluronic (pluronic) or polyethylene glycol (PEG)) but the like, but not limited to.
適切なキャリアの例としては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤が、所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらはさらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。 Examples of suitable carriers include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin. Preferably, the product is formulated as a lyophilizer using a suitable excipient (eg, sucrose). Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired. Other exemplary compositions include a pH 7.0-8.5 Tris buffer or a pH 4.0-5.5 acetate buffer, which may further include sorbitol or a suitable replacement thereof.
本発明の医薬組成物の一般的な調製法を以下に記載する。動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物なども、公知の技術により製造することができる。 A general method for preparing the pharmaceutical composition of the present invention is described below. Animal drug compositions, quasi drugs, marine drug compositions, food compositions, cosmetic compositions, and the like can also be produced by known techniques.
本発明の細胞などは、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと配合され、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊インヒビター、吸収促進剤、吸収剤、保湿剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物も、必要に応じて使用され得る。本発明の組成物は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合され得る。非経口の投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、経皮投与などが挙げられるが、これらに限定されない。全身投与される場合、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当該技術の範囲内である。 The cells of the present invention can be blended with a pharmaceutically acceptable carrier as necessary and administered parenterally as liquid preparations such as injections, suspensions, solutions and sprays. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients, lubricants, binders, disintegrants, disintegration inhibitors, absorption enhancers, absorbents, humectants, solvents, solubilizers, suspending agents, etc. Examples include tonicity agents, buffering agents, and soothing agents. Formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used as needed. The composition of the present invention can be mixed with a substance other than the polynucleotide, polypeptide and the like of the present invention. Examples of parenteral routes of administration include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, mucosal, rectal, vaginal, topical and transdermal. . When administered systemically, the medicament used in the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable aqueous solution free of pyrogens. The preparation of such pharmaceutically acceptable compositions is within the skill of the art by considering pH, isotonicity, stability, and the like.
本発明の医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤をさらに含み得る。 The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a colorant, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetener and the like, as well as other agents.
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者により容易に決定され得る。頻度の例としては、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）が挙げられる。好ましくは、投与は、経過を見ながら１週間〜１ヶ月に１回施される。投薬量は、処置される部位が必要とする量を見積もることによって、確定され得る。 The amount of the composition used in the treatment method of the present invention takes into consideration the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, sex, medical history, cell morphology or type, etc. Can be readily determined by those skilled in the art. The frequency with which the treatment method of the present invention is applied to the subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, treatment course, etc. In view of this, it can be easily determined by one skilled in the art. Examples of the frequency include daily to once every several months (for example, once a week to once a month). Preferably, the administration is performed once a week to once a month while observing the course. The dosage can be determined by estimating the amount that the site to be treated will require.
本明細書において使用される場合、用語「指示書」は、医薬を投与する方法または診断のための方法などを、医師、患者など投与を行う人または投与される人、診断する人（例えば、医師、患者など）または診断される人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与するための適切な方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供される。この指示書は、これに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供される電子媒体（例えば、ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。 As used herein, the term “instruction” refers to a method of administering a medicament or a method for diagnosis, such as a physician, patient, etc. (Doctors, patients, etc.) or those who are diagnosed. This instruction describes a word indicating an appropriate method for administering the diagnostic agent, medicine and the like of the present invention. This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc. in the US) in which the present invention is implemented, and is approved by the regulatory authority It is clearly stated that it has been received. The instruction is a so-called package insert and is usually provided on a paper medium. This instruction is not limited to this, and may be provided in the form of, for example, an electronic medium (for example, an electronic medium provided on the Internet (for example, a website), e-mail).
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用可能なアッセイもしくは機器を使用する標準的な臨床検査の結果または意図される処置に関連する疾患（例えば、創傷など）に特徴的な臨床症状の消滅あるいは美容状態の回復（例えば、外見の回復など）によって支持され得る。治療は、疾患（例えば、創傷）の再発または美容状態の損傷により再開され得る。 Judgment of termination of therapy according to the methods of the invention is characteristic of the results of standard laboratory tests using commercially available assays or instruments or diseases associated with the intended treatment (eg, wounds, etc.). It can be supported by disappearance of clinical symptoms or recovery of a cosmetic state (eg, recovery of appearance). Treatment can be resumed by a recurrence of the disease (eg, a wound) or a cosmetic condition injury.
本発明はまた、１つ以上の医薬組成物を満たした１つ以上の容器を備える医薬品パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属され得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。このキットは、注射用デバイスを備え得る。 The present invention also provides a pharmaceutical package or kit comprising one or more containers filled with one or more pharmaceutical compositions. A notification in the form of government agencies regulating the manufacture, use or sale of a medicinal product or biological product may optionally be attached to such containers, which may be manufactured, used or sold for human administration. Represents approval by government agencies. The kit can include an injectable device.
（脂肪由来幹細胞）
脂肪由来幹細胞または脂肪由来前駆細胞は、脂肪吸引物の液体部分（脂肪吸引液）から、例えば以下のように調製することができる。処理方法（１）脂肪組織と等量の０．０７５％コラゲナーゼを加え３７℃で３０分酵素処理する（２）処理後に８００Ｇ×１０分遠心する（３）上層を除去し、沈殿した細胞にＰＢＳを加え、１００μｍポアフィルターを通す（４）フィルターを通った細胞を回収する。（より詳細な条件は、文献Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ ７：２１１−２２８（２００１）、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０８：６４−７６（２００６）などに記載されており、これらを参酌して当業者は脂肪由来幹細胞または脂肪由来前駆細胞を調製することができる。）
脂肪吸引方法は、当業者に周知である技術を用いて、実施することができる。脂肪吸引方法に用いられる装置としては、ケイセイ脱脂吸引機サルポンプＳＡＬ ７６−Ａ（ケイセイ医科工業（株）、東京都文京区本郷３−１９−６）が挙げられるが、これらに限定されない。例えばヒトの場合、０．０００１％アドレナリン入り生理食塩水などの液体を、予定吸引脂肪量の等量から２倍量、脂肪組織内に注入し、その後、内径２〜３ｍｍのカニューレ（金属製吸引管）を用いて、−２５０〜９００ｍｍＨｇ程度の陰圧で吸引することによって行う。
(Adipose-derived stem cells)
Adipose-derived stem cells or adipose-derived progenitor cells can be prepared from a liquid portion (lipoaspirate) of a lipoaspirate, for example, as follows. Treatment method (1) Add 0.075% collagenase in an amount equal to that of adipose tissue and perform enzyme treatment at 37 ° C. for 30 minutes (2) After treatment, centrifuge at 800 G × 10 minutes (3) Remove the upper layer and add PBS to the precipitated cells And pass through a 100 μm pore filter (4) Collect the cells that passed through the filter. (More detailed conditions are described in documents Zuk et al. Tissue Eng 7: 211-228 (2001), Yoshimura et al. J Cellular Physiol 208: 64-76 (2006), etc.) Those skilled in the art can prepare adipose-derived stem cells or adipose-derived progenitor cells.)
The liposuction method can be performed using techniques well known to those skilled in the art. Examples of the apparatus used for the liposuction method include, but are not limited to, Keisei Degreasing Suction Machine Monkey Pump SAL 76-A (Keisei Medical Industry Co., Ltd., 3-19-6 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo). For example, in the case of humans, a liquid such as 0.0001% adrenaline-containing physiological saline is injected into the adipose tissue in an amount equal to or twice the expected amount of aspirated fat, and then a cannula having a 2 to 3 mm inner diameter (metal suction) Tube) and sucking at a negative pressure of about −250 to 900 mmHg.
吸引した脂肪細胞を洗浄するために使用される液体として通常は、生理食塩水が用いられる。しかし、生理食塩水以外にも、単離すべき幹細胞に悪影響を与えない液体であれば、任意の液体が使用可能である。具体的には、例えば、リンゲル液、および哺乳動物培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、およびＭＣＤＢ１５３など）のような、任意の等張液が、本発明において使用可能である。 Usually, physiological saline is used as a liquid used for washing aspirated fat cells. However, any liquid other than physiological saline can be used as long as it does not adversely affect the stem cells to be isolated. Specifically, any isotonic solution can be used in the present invention, such as, for example, Ringer's solution and mammalian culture media (eg, DMEM, MEM, M199, MCDB153, etc.).
脂肪吸引物から幹細胞を調製する場合、必要に応じて、脂肪吸引物にコラゲナーゼなどの酵素処理を行なうことが可能である。しかし、脂肪吸引物中に含まれるコラーゲンの量は、脂肪組織と比較して相対的に少ないため、幹細胞調製の原料として脂肪吸引物を用いる場合、コラゲナーゼ処理に必要とされる時間、および／または酵素処理に必要とされる酵素量が、脂肪組織の場合よりも、相対的に低い。 When stem cells are prepared from a lipoaspirate, it is possible to perform an enzyme treatment such as collagenase on the lipoaspirate when necessary. However, since the amount of collagen contained in the lipoaspirate is relatively small compared to that of the adipose tissue, when using the lipoaspirate as a raw material for stem cell preparation, the time required for collagenase treatment, and / or The amount of enzyme required for enzyme treatment is relatively lower than in the case of adipose tissue.
脂肪吸引物を遠心分離して細胞画分を得る工程においては、細胞画分と、その他の成分（例えば、血漿、手術時に注入した生理食塩水、麻酔薬、止血薬、破壊された脂肪細胞から漏出した脂質成分）とを分離する任意の条件を用いることができる。例えば、４００〜８００×ｇでの５〜１５分程度の遠心分離を用いることが可能である。 In the process of obtaining the cell fraction by centrifuging the lipoaspirate, the cell fraction and other components (for example, plasma, physiological saline injected at the time of surgery, anesthetics, hemostatics, and destroyed adipocytes are used. Any conditions for separating the leaked lipid component) can be used. For example, centrifugation at 400 to 800 × g for about 5 to 15 minutes can be used.
比重による遠心分離により細胞を単離する工程においては、例えば単離された細胞画分を、密度勾配遠心分離にかけることができる。任意の密度勾配遠心分離のために使用可能な媒体が、この媒体として使用され得る。好ましい媒体は、１．０７６〜１．０７８ｇ／ｍｌの比重を有し得る。さらに、好ましい媒体のｐＨは、４．５と７．５との間である。媒体中の好ましいエンドトキシンレベルは、０．１２ＥＵ／ｍｌ以下である。代表的な媒体としては、スクロース、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンとの共重合物）、およびパーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）が挙げられる。フィコールは、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ファルマシアバイオテク株式会社、東京）、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、東京）などの名称で市販されている。パーコールは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社、東京）という名称で市販されている。 In the step of isolating cells by centrifugation by specific gravity, for example, the isolated cell fraction can be subjected to density gradient centrifugation. Any medium that can be used for density gradient centrifugation can be used as this medium. Preferred media may have a specific gravity of 1.076 to 1.078 g / ml. Furthermore, the preferred medium pH is between 4.5 and 7.5. Preferred endotoxin levels in the medium are 0.12 EU / ml or less. Exemplary media include sucrose, ficoll (a copolymer of sucrose and epichlorohydrin), and percoll (a colloidal silica product with a polyvinylpyrrolidone coating). Ficoll is commercially available under the names of, for example, Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia Biotech Co., Ltd., Tokyo) and Histopaque-1077 (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd., Tokyo). Percoll is marketed under the name Percoll (Sigma Aldrich Japan, Tokyo).
比重による遠心分離の条件は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを媒体として用いる場合、４００×ｇ、３０〜４０分が用いられ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を媒体として用いる場合、３７０ｃｇ、約３０分が用いられる。リンフォプレップを媒体として用いる場合、条件としては８００×ｇ、約２０分または１１００×ｇ、約１０分が挙げられるが、これらに限定されない。 Centrifugation by specific gravity is 400 × g for 30 to 40 minutes when Ficoll-Paque PLUS is used as a medium, and 370 cg for about 30 minutes when Histopaque-1077 is used as a medium. When using lymphoprep as a medium, conditions include, but are not limited to, 800 × g, about 20 minutes or 1100 × g, about 10 minutes.
比重による遠心分離が用いられるときに、最も多い細胞は、通常赤血球細胞であり、赤色の細胞層として確認することができる。幹細胞は、赤血球よりも比重が軽いため、幹細胞を分離する場合には、赤血球よりも軽い細胞層を収集する。好ましくは、比重１．０５０〜１．０７５の範囲の細胞層を収集する。 When centrifugation by specific gravity is used, the most abundant cells are usually red blood cells, which can be confirmed as a red cell layer. Stem cells have a lighter specific gravity than red blood cells, and therefore, when stem cells are separated, a cell layer lighter than red blood cells is collected. Preferably, a cell layer with a specific gravity in the range of 1.050 to 1.075 is collected.
おおまかな細胞の比重は、パーコール、レディグラッドのような密度勾配遠心分離媒体を塩化ナトリウム溶液やスクロース溶液で調製し、収集した細胞と共にデンシティーマーカービーズ（ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｒｋｅｒ ｂｅａｄｓ）を加えて遠心し、ビーズによって分けられた５〜１０層のうち、どの層に細胞があるかを確認することで、試験され得る。 The density of rough cells is determined by preparing density gradient centrifugation media such as Percoll and Ladygrad in sodium chloride solution and sucrose solution, adding density marker beads together with the collected cells, and centrifuging the beads. It is possible to test by confirming which layer has the cell among 5 to 10 layers divided by.
さらに、層に分離した細胞の回収は、例えば、ピペットを用いて行なうことができる。 Furthermore, collection | recovery of the cell isolate | separated into the layer can be performed using a pipette, for example.
比重による遠心分離においては、セルセパレーター（例えば、血液成分分離装置ＡＳＴＥＣ２０４、（株）アムコ）を使用することが可能である。 In centrifugation by specific gravity, it is possible to use a cell separator (for example, blood component separator ASTEC 204, Amco Co., Ltd.).
細胞が脂肪組織から分離される条件は、細胞が脂肪組織から分離され、かつ細胞の単離を促進する条件であり得る。このような条件としては、例えば、Ｗａｋｏより入手可能なコラゲナーゼ（細胞分散のためのコラゲナーゼ、０３２−１０５３４）を添加するような、細胞外マトリクスの分解が挙げられるが、これに限定されない。このようなコラゲナーゼは、濃度０．０７５％にてＰＢＳ中に溶解し、この溶液を３７℃まで温めて脂肪と等量を添加する。そのサンプルを３７℃にて８０ｒｐｍで３０分間攪拌するために、アジテーターが使用される。 The conditions under which the cells are separated from the adipose tissue can be conditions under which the cells are separated from the adipose tissue and facilitate cell isolation. Examples of such conditions include, but are not limited to, degradation of the extracellular matrix such as adding collagenase (collagenase for cell dispersion, 032-10534) available from Wako. Such collagenase is dissolved in PBS at a concentration of 0.075% and the solution is warmed to 37 ° C. and added in an amount equal to fat. An agitator is used to stir the sample at 37 ° C. and 80 rpm for 30 minutes.
好ましくは、本発明の方法は、高度の幹細胞純度を達成するために、血球細胞を除去する工程をさらに包含する。しかし、このような血球細胞は、続いてディッシュ上で培養し、この細胞集団を継代し、８０％を超える（好ましくは、９０％を超える）幹細胞を生じさせることにより除去され得る。このような血球細胞は、血球細胞を分解する成分を添加する工程を包含する血球除去工程により、除去され得る。 Preferably, the method of the present invention further comprises the step of removing blood cells to achieve a high degree of stem cell purity. However, such blood cells can be removed by subsequent culturing on a dish and passage of this cell population to produce more than 80% (preferably more than 90%) stem cells. Such blood cells can be removed by a blood cell removal step including a step of adding a component that degrades blood cells.
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態が説明される。以下の実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。本明細書中を参酌して、本発明の範囲を逸脱することなく、変更および修正を行い得ることが、当業者に明らかに理解される。
(Description of Preferred Embodiment)
In the following, preferred embodiments of the present invention will be described. The following embodiments are provided for a better understanding of the present invention, and the scope of the present invention should not be limited to the following description. It will be apparent to those skilled in the art that changes and modifications can be made without departing from the scope of the invention in light of the present specification.
本発明者らは、ヒトおよびマウスの脂肪由来幹細胞／間質細胞（ＡＳＣ）に対する障害関連増殖因子の作用を分析し、ＦＧＦ−２が、ＪＮＫシグナル伝達経路を介してＡＳＣによるＨＧＦ分泌を誘導すること、そして、アップレギュレートされたＨＧＦの産生が、損傷を受けた脂肪組織における線維化を防ぐ助けとなることを見出した。 We analyzed the effects of injury-related growth factors on human and mouse adipose-derived stem / stromal cells (ASC) and FGF-2 induces HGF secretion by ASC via the JNK signaling pathway. It has also been found that the production of up-regulated HGF helps prevent fibrosis in damaged adipose tissue.
本発明者らの結果は、損傷後の脂肪組織修復においてＡＳＣが主要な増殖細胞集団として重要な役割を果たすことを示した。ＦＧＦ−２−ＪＮＫ−ＨＧＦ機構を通じて、ＡＳＣは、損傷後に、線維化を防ぎ、脂肪組織の体積を維持し、そして、脂肪組織の機能を向上する助けとなる。 Our results have shown that ASC plays an important role as a major proliferating cell population in post-injury adipose tissue repair. Through the FGF-2-JNK-HGF mechanism, ASC helps prevent fibrosis, maintain adipose tissue volume, and improve adipose tissue function after injury.
本発明者らは、脂肪の損傷および修復についての新規動物モデルを開発および使用した。この動物モデルは、脂肪細胞および毛細管の再構築を伴う脂肪組織の損傷および再生の再現性のある結果を提供し、この全ては、２週間以内に完了した。 We have developed and used a novel animal model for fat damage and repair. This animal model provided reproducible results of adipose tissue damage and regeneration with remodeling of adipocytes and capillaries, all of which were completed within 2 weeks.
本研究の結果は、損傷応答におけるＡＳＣについての新しい役割を明らかにし、そして、ＡＳＣの治療上の可能性に新しい見通しを提供した。ＡＳＣを用いた細胞治療は、特に、ＦＧＦ−２で前処理をするか、または、ＦＧＦ−２と組み合わせたとき、組織の修復を加速し、線維化を減らし、そして、ＨＧＦの作用によって急性または慢性の炎症により損ねられた臓器の機能を改善し、同様に、自家脂肪移植片の活着を改善する。 The results of this study revealed a new role for ASC in injury response and provided a new perspective on the therapeutic potential of ASC. Cell therapy with ASC, especially when pretreated with FGF-2 or in combination with FGF-2, accelerates tissue repair, reduces fibrosis, and is acutely affected by the action of HGF. Improves organ function impaired by chronic inflammation, as well as improves autologous fat graft survival.
好ましい実施形態では、本発明者らは、脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの役割に焦点を当て、そして、損傷に関連する増殖因子の中でも、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）が、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増殖とＨＧＦ分泌を強く促進したことを見出した。脂肪組織の虚血再潅流障害のマウスモデルにおいて、壊死性およびアポトーシス性の変化に続く再生性の変化が２週間にわたり見られた。損傷を受けた脂肪組織によるＦＧＦ−２の短時間の放出の後、ＨＧＦのアップレギュレーションが続いた。脂肪組織の再構築過程の間に、ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞は、ＣＤ３４＋であり、そして、ＡＳＣではないかと疑われた。ＪＮＫシグナル伝達の阻害は、ＡＳＣの増殖と移動を阻害し、そして、再構築過程の進行を妨げた。さらに、ＦＧＦ−２またはＪＮＫシグナル伝達の阻害は、損傷後のＨＧＦのアップレギュレーションを妨げ、そして、損傷を受けた脂肪組織における線維化の増加をもたらした。線維化の増加はまた、ＨＧＦに対する中和抗体の投与の後にも起こった。 In a preferred embodiment, we focus on the role of ASC in the process of adipose tissue injury and repair, and among the growth factors associated with injury, fibroblast growth factor-2 (FGF-2) ) Strongly promoted ASC proliferation and HGF secretion via the c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway. In a mouse model of adipose tissue ischemia-reperfusion injury, regenerative changes following necrotic and apoptotic changes were seen over 2 weeks. Short-term release of FGF-2 by damaged adipose tissue was followed by upregulation of HGF. During the adipose tissue remodeling process, the BrdU positive proliferating cells were CD34 + and suspected to be ASC. Inhibition of JNK signaling inhibited ASC proliferation and migration and prevented the remodeling process from proceeding. Furthermore, inhibition of FGF-2 or JNK signaling prevented HGF upregulation after injury and resulted in increased fibrosis in damaged adipose tissue. Increased fibrosis also occurred after administration of neutralizing antibodies against HGF.
したがって、結論として、損傷を受けた組織から放出されるＦＧＦ−２は、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣを刺激して増殖させ、そしてＨＧＦを分泌するように機能し、損傷後の脂肪組織の再生と線維化抑制に寄与する。本研究は、損傷に対する応答におけるＡＳＣについての機能的な役割を明らかにし、そして、ＡＳＣの治療的な可能性に、新しい見通しを提供することができる。 Thus, in conclusion, FGF-2 released from damaged tissue functions to stimulate ASC to proliferate and secrete HGF via the JNK signaling pathway, post-injury adipose tissue Contributes to the regeneration and suppression of fibrosis. This study reveals a functional role for ASC in response to injury and can provide new perspectives on the therapeutic potential of ASC.
（治療剤および予防剤）
１つの局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤を提供する。
(Therapeutic and preventive agents)
In one aspect, the present invention provides a therapeutic agent comprising a fat-derived stem cell (ASC) and at least one factor selected from the group consisting of fibroblast growth factor (FGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) or Prophylactic agents are provided.
本発明の治療剤または予防剤は、従来の技術に比べて、以下の点で顕著な効果を奏する。理論に束縛されることを望まないが、たとえば、本発明の治療剤または予防剤は、従来のものに比べて、線維性病変を効率的に治療する、より効果的に線維化を予防する、より効果的に血管新生を促進する、より効果的に組織の再生・正常なターンオーバーを促進するなどの効果を奏する。また、本発明において細胞を用いることにより、持続的かつ安全なＨＧＦの分泌（投与）が実現できるという利点もある。 The therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention has remarkable effects in the following points as compared with the conventional techniques. Although not wishing to be bound by theory, for example, the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention efficiently treats fibrotic lesions, more effectively prevents fibrosis, compared to the conventional ones, It has effects such as promoting angiogenesis more effectively, and promoting tissue regeneration and normal turnover more effectively. In addition, by using cells in the present invention, there is an advantage that continuous and safe secretion (administration) of HGF can be realized.
特に、本発明の脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子とを含む治療剤または予防剤は、線維性病変を処置または予防するために使用されることが本発明において実証された。 In particular, a therapeutic or prophylactic agent comprising the fat-derived stem cells (ASC) of the present invention and at least one factor selected from the group consisting of fibroblast growth factor (FGF) and platelet-derived growth factor (PDGF), It has been demonstrated in the present invention that it is used to treat or prevent fibrotic lesions.
ここで、本発明によって治療または予防されうる「線維性病変」としては、たとえば、性関節リウマチ、肺線維症、肝硬変、腎硬化症、心筋梗塞、皮膚筋炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、シェーグレン症候群、強皮症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自己免疫性肝炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化、ＡＳＯ（閉塞性動脈硬化症）、バージャー病などを挙げることができるが、これらに限定されない。線維性の病変の改善が所望される任意の疾患が本発明の対象であるというべきである。 Here, the “fibrotic lesion” that can be treated or prevented by the present invention includes, for example, rheumatoid arthritis, pulmonary fibrosis, cirrhosis, nephrosclerosis, myocardial infarction, dermatomyositis, SLE (systemic lupus erythematosus), Sjogren's syndrome , Scleroderma, hypertrophic scar, keloid, autoimmune hepatitis, necrotizing fasciitis, arteriosclerosis, ASO (obstructive arteriosclerosis), Buerger's disease, and the like. Any disease where improvement of fibrotic lesions is desired should be the subject of the present invention.
１つの実施形態では、特に、本発明が標的とする線維性病変は、慢性炎症時のものである。慢性炎症時のものの処置については、従来有効な処置法が提供されているとはいいがたく、よりよい治療・予防剤の提供が望まれていた。そこで、本発明の治療剤または予防剤は、従来の技術に比べて、以下の点で顕著な効果を奏する。理論に束縛されることを望まないが、形質転換されていない細胞が分泌するものであるため副作用が小さいと考えられることから、慢性炎症が従来に増して抑制されることが期待される。 In one embodiment, in particular, the fibrotic lesion targeted by the present invention is during chronic inflammation. Regarding the treatment of chronic inflammation, it is difficult to say that an effective treatment method has been conventionally provided, and it has been desired to provide a better therapeutic / prophylactic agent. Therefore, the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention has remarkable effects in the following points as compared with the conventional techniques. Although not wishing to be bound by theory, it is expected that chronic inflammation will be suppressed more than ever since it is considered that side effects are small because it is secreted by untransformed cells.
好ましい実施形態では、本発明において使用されるＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）である。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦ−２が好ましい理由としては、たとえば、ＦＧＦ−２はすでに医薬品として承認されており、その安全性についての情報が十分であること（科研製薬から販売されているものを使用することができる。）、また、徐放化製剤の治験も行われており、将来的に使用が容易になることが予想されること、形質転換されていない自己の細胞を使うことにより、その安全性が高いと思われること、他の因子の分泌など付随した利益が期待できることなど、種々の有利な点が存在する。 In a preferred embodiment, the FGF used in the present invention is basic fibroblast growth factor (FGF-2). Without wishing to be bound by theory, FGF-2 is preferred because, for example, FGF-2 has already been approved as a pharmaceutical product and sufficient information on its safety is available (sold by Kaken Pharmaceutical). In addition, controlled-release preparations are also being studied and expected to be easier to use in the future. Untransformed self cells There are various advantages, such as being considered to be safe by using, and expecting accompanying benefits such as secretion of other factors.
（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を提供する。この生産方法では、驚くべきことに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養することによって、予想外にＨＧＦの生産が促進された。また、従来の文献（たとえば、非特許文献１７、２１など）でも、術後ドレーンを解析したのみであり各ＧＦ量変化のメカニズムやパラクライン的な作用については記載はなく、ＡＳＣの遺伝子発現等についてはデータがなく、ＡＳＣがＨＧＦを分泌することはなんら記載も示唆もしていない。したがって、本発明のＨＧＦ生産刺激剤としての効果は、予想外であったといえる。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦ−２がＨＧＦ生産を促進することが予想外であった理由は、以下のとおりである：従来技術で想定されていたものより、本発明のものはその分泌能が非常に高く、その分泌能がｂＦＧＦを継続的に投与した場合に特に飛躍的に高い分泌能が見られることは通常他の因子や細胞においても稀にしか見られないことから、従来のＨＧＦ生産技術から飛躍的な効果が期待される。また、本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
(Method for producing hepatocyte growth factor (HGF))
In another aspect, the present invention provides a method for producing hepatocyte growth factor (HGF), comprising culturing adipose-derived stem cells (ASC) in the presence of fibroblast growth factor (FGF). In this production method, surprisingly, production of HGF was unexpectedly promoted by culturing adipose-derived stem cells (ASC) in the presence of fibroblast growth factor (FGF). Further, even in the conventional literature (for example, non-patent literature 17, 21, etc.), only the postoperative drain was analyzed, and there is no description about the mechanism of each GF amount change and paracrine action, and the gene expression of ASC, etc. There is no data on and there is no description or suggestion that ASC secretes HGF. Therefore, it can be said that the effect of the present invention as an HGF production stimulator was unexpected. While not wishing to be bound by theory, the reason why FGF-2 was unexpectedly promoted HGF production is as follows: from the present invention rather than what was assumed in the prior art The secretory ability is very high, and when the secretory ability is continuously administered, the drastically high secretory ability is usually seen only in other factors and cells. A dramatic effect is expected from the conventional HGF production technology. Further, in this aspect of the present invention, the FGF and ASC used can be in any form described in the present specification as appropriate by using known / well-known techniques as appropriate. Understood.
（脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤を提供する。
(Adipose-derived stem cell (ASC) growth stimulant)
In another aspect, the present invention provides an adipose-derived stem cell (ASC) growth stimulator comprising fibroblast growth factor (FGF).
本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。 In this aspect of the present invention, it is understood that the FGF, ASC, and the like to be used can use any form described in the present specification as appropriate by using known and well-known techniques as appropriate. The
（脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤）
別の局面において、本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激剤を提供する。理論に束縛されることを望まないが、ＦＧＦが脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）に対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）生産刺激することが予想外であった理由は、以下のとおりである：ＨＧＦが分泌されることは予想外ではないが、その分泌能が非常に高く、その分泌能がｂＦＧＦを継続的に投与した場合に特に飛躍的に高い分泌能が見られることは通常他の因子や細胞においても稀にしか見られないことである。本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
(Hepatocyte growth factor (HGF) production stimulator for adipose-derived stem cells (ASC))
In another aspect, the present invention provides a hepatocyte growth factor (HGF) production stimulator for adipose-derived stem cells (ASC), comprising fibroblast growth factor (FGF). Without wishing to be bound by theory, the reason why FGF unexpectedly stimulated hepatocyte growth factor (HGF) production on adipose-derived stem cells (ASC) is as follows: HGF is secreted Although it is not unexpected, the secretory ability is very high, and the secretory ability is particularly high when bFGF is continuously administered. It can only be seen rarely. In this aspect of the present invention, it is understood that the FGF, ASC, and the like to be used can use any form described in the present specification as appropriate by using known and well-known techniques as appropriate. The
（脂肪由来幹細胞を用いる疾患または障害を治療または予防する方法）
別の局面において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を用いる疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。また、本発明のこの局面において、使用されるＦＧＦおよびＡＳＣなどは、必要に応じて、適宜公知・周知技術を用いることによって、本明細書において記載される任意の形態を使用することができることが理解される。
(Method of treating or preventing diseases or disorders using adipose-derived stem cells)
In another aspect, the present invention provides a disease or disorder using adipose-derived stem cells (ASC) and at least one factor selected from the group consisting of fibroblast growth factor (FGF) and platelet-derived growth factor (PDGF). Provide a method of treating or preventing. Further, in this aspect of the present invention, the FGF and ASC used can be in any form described in the present specification as appropriate by using known / well-known techniques as appropriate. Understood.
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。 The present invention will be described below based on examples, but the following examples are provided for illustrative purposes only. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the above-described embodiment and the following examples, but is limited only by the appended claims.
以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａ等から得ることができる。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．８６−２３，１９８５，改訂）に遵って、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、事前に同意（インフォームドコンセント）を得た上で実験を行った。 The reagents used in the examples shown below can be obtained from Wako Pure Chemicals, Sigma, etc. unless otherwise specified. Animal breeding, National Society for Medical Research have created "Principles of Laboratory Animal Care" and the Institute of Laboratory Animal Resource is created, National Institute of Health has published "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NIH Publication , No. 86-23, 1985, revised) in accordance with the spirit of animal welfare. In the case of targeting humans, the experiment was conducted after obtaining prior consent (informed consent).
（実施例１：脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの効果）
本実施例では、脂肪組織の損傷および修復の過程におけるＡＳＣの効果を実証した。
Example 1: Effect of ASC in the course of adipose tissue damage and repair
In this example, the effect of ASC in the process of adipose tissue damage and repair was demonstrated.
（材料および方法）
細胞の単離および培養
腹部または大腿部の脂肪吸引を受けた健康な女性ドナーからインフォームドコンセントを得た後に、倫理調査委員会により承認されたプロトコールを用いて、脂肪吸引術による吸引物をこれらのドナーから得た。ＡＳＣを、以前に記載されたようにして、吸引された脂肪から単離した（Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. 「Characterization offreshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portionsof liposuction aspirates」J Cell Physiol 2006; 208: 64-76）。簡単に述べると、吸引された脂肪を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして、シェーカー上で、０．０７５％コラゲナーゼを含むＰＢＳ中、３７℃にて３０分間、消化した。遠心分離（８００×ｇ、１０分間）により、ペレットから成熟脂肪細胞と結合組織を分離した。細胞ペレットを再懸濁し、１００μｍメッシュを通してろ過し、そして、５×１０５の有核細胞／１０ｃｍシャーレの密度で播種し、そして、加湿空気中５％ ＣＯ２の雰囲気において、３７℃で培養した。培養培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）であった。始原細胞を７日間培養し、そして、「パッセージ０」として規定した。培地は、３日毎に交換した。細胞を、トリプシン処理により毎週継代した。パッセージ１〜３のヒトＡＳＣを実験に使用した。マウスＡＳＣを分離するために、６週齢の雄性ＩＣＲマウスの鼠径部の脂肪パッドから脂肪組織を得た。この脂肪組織を、２〜３ｍｍ角に細かく切り、そして、上記のように処理した。パッセージ１〜３のマウスＡＳＣを実験に使用した。ヒト真皮線維芽細胞（ｈＤＦ）を、別々のドナーからの皮膚サンプルの外植片から得た；パッセージ３〜５のｈＤＦを実験に使用した。パッセージ２で凍結された、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＢＭ−ＭＳＣ）を、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した；パッセージ３〜５のｈＢＭ−ＭＳＣを実験に使用した。
(Materials and methods)
Cell Isolation and Culture After obtaining informed consent from a healthy female donor who received liposuction of the abdomen or thigh, use a protocol approved by the Ethics Committee to remove the aspirate from liposuction. Obtained from these donors. ASC was isolated from aspirated fat as previously described (Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. “Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction. aspirates "J Cell Physiol 2006; 208: 64-76). Briefly, aspirated fat was washed with phosphate buffered saline (PBS) and digested for 30 minutes at 37 ° C. in PBS containing 0.075% collagenase on a shaker. . Mature adipocytes and connective tissue were separated from the pellets by centrifugation (800 × g, 10 minutes). The cell pellet was resuspended, filtered through a 100 μm mesh, seeded at a density of 5 × 10 5 nucleated cells / 10 cm dish and cultured at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 in humidified air. . The culture medium was Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS). Progenitor cells were cultured for 7 days and defined as “Passage 0”. The medium was changed every 3 days. Cells were passaged weekly by trypsinization. Passage 1-3 human ASCs were used in the experiments. To isolate mouse ASC, adipose tissue was obtained from the fat pad in the groin area of 6 week old male ICR mice. The adipose tissue was cut into 2-3 mm squares and processed as described above. Passage 1-3 mouse ASCs were used in the experiments. Human dermal fibroblasts (hDF) were obtained from explants of skin samples from separate donors; passages 3-5 of hDF were used in the experiments. Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hBM-MSC), frozen in passage 2, were purchased from Cambrex (Walkersville, MD); passages 3-5 hBM-MSC were used in the experiments.
増殖アッセイ
ヒトＡＳＣを２×１０４細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。障害関連増殖因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦおよびＰＤＧＦ；全て、和光純薬製）の各々を、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌの濃度でコントロール培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ）に加えた。細胞カウンター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒＴＭ，Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、培地中で３日後、６日後および９日後に、細胞数をカウントした。他の細胞型について、１０ｃｍシャーレに２×１０５細胞を播種し、そして、７日後に細胞数をカウントした。
Proliferation assay Human ASCs were seeded in 6-well plates at 2 × 10 4 cells / well. Each of the disorder-related growth factors (VEGF, FGF-2, HGF and PDGF; all manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the control medium (DMEM + 10% FBS) at concentrations of 0.1 ng / ml, 1 ng / ml and 10 ng / ml. added. Cell counts were counted after 3 days, 6 days and 9 days in the medium using a cell counter (NucleoCounter ™ , Chemometec, Allerod, Denmark). For other cell types, 2 × 10 5 cells were seeded in a 10 cm dish and the cell count was counted after 7 days.
フローサイトメトリー
１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に７日間培養したヒトＡＳＣを、フローサイトメトリーを用いて、表面マーカー発現について調べた。以下の蛍光色素結合化モノクローナル抗体を使用した：抗ＣＤ３１−ＰＥ、抗ＣＤ３４−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗Ｆｌｋ−１−ＰＥおよび抗Ｔｉｅ−２−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。細胞を、各抗体と共に３０分間インキュベートし、次いで、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ゲートは、問題とされる抗体と無関係の抗体との組み合わせを用いた染色に基づき、無関係の抗体を用いた場合に細胞の０．１％以下が陽性となるように設定した。
Flow cytometry Human ASCs cultured with 10 ng / ml VEGF, FGF-2, HGF or PDGF for 7 days were examined for surface marker expression using flow cytometry. The following fluorochrome-conjugated monoclonal antibodies were used: anti-CD31-PE, anti-CD34-PE (BD Biosciences, San Diego, Calif.), Anti-Flk-1-PE and anti-Tie-2-PE (R & D Systems, Minneapolis, MN). Cells were incubated with each antibody for 30 minutes and then analyzed using the LSR II flow cytometry system (BD Biosciences). The gate was set based on staining using a combination of the antibody in question and an irrelevant antibody such that 0.1% or less of the cells were positive when an irrelevant antibody was used.
定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
本発明者らは、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＨＧＦまたはＰＤＧＦと共に培養したヒトＡＳＣからＲＮＡを単離した。他の細胞型については、ＲＮＡを、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ってか、または伴わずに培養した細胞から単離した。ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２μｇの総ＲＮＡを単離し、その後、逆転写反応を行った。本発明者らは、ＡＢＩ ７７００配列検出システム、ＴａｑＭａｎＴＭ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと、以下の予め設計されたプライマーおよびフルオレセイン標識プローブとを用いて、ｃＤＮＡを４０サイクル増幅した：ヒトＶＥＧＦ（Ｈｓ００９０００５４＿ｍ１）；ＦＧＦ−２（Ｈｓ００２６６６４５＿ｍ１）；ＨＧＦ（Ｈｓ００３００１５９＿ｍ１）；ＰＤＧＦ（Ｈｓ００２３４０４２＿ｍ１）；ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）；マウスＶＥＧＦ（Ｍｍ００４３７３０４＿ｍ１）；ＦＧＦ−２（Ｍｍ００４３３２８７＿ｍ１）；ＨＧＦ（Ｍｍ０１１３５１８２＿ｍ１）；およびＧＡＰＤＨ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１；全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）製）。本発明者らは、ＧＡＰＤＨを内部参照遺伝子として用いて、相対的ＣＴ法により発現レベルを算出した。
Quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction We isolated RNA from human ASCs cultured with 10 ng / ml VEGF, FGF-2, HGF or PDGF. For other cell types, RNA was isolated from cells cultured with or without FGF-2 (10 ng / ml). 2 μg of total RNA was isolated using RNeasy ™ Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), followed by reverse transcription reaction. We amplified 40 cycles of cDNA using the ABI 7700 sequence detection system, TaqMan ™ Universal PCR Master Mix, and the following pre-designed primers and fluorescein labeled probe: human VEGF (Hs00900054_m1); FGF HGF (Hs00300159_m1); PDGF (Hs00234042_m1); GAPDH (Hs99999905_m1); mouse VEGF (Mm00437304_m1); FGF-2 (Mm00433287_m1); Biosystems (Foster ity, CA), Ltd.). The present inventors calculated the expression level by relative CT method using GAPDH as an internal reference gene.
酵素結合免疫吸着定量法による、ＨＧＦタンパク質の定量
ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴ってか、または伴わずに７２時間培養したヒトＡＳＣの馴化培地を、ヒトＨＧＦ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）についてのＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。データは、収穫の時点での１０６細胞あたりの分泌された因子として表した。
Quantification of HGF protein by enzyme-linked immunosorbent assay The conditioned medium of human ASC cultured with or without FGF-2 (10 ng / ml) for 72 hours was used for human HGF (Quantikine ™, R & D Systems). Analysis was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an ELISA kit. Data were expressed as secreted factors per 10 6 cells at the time of harvest.
ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の阻害
３つのシグナル伝達経路の各々について１つの選択的なインヒビター（ＥＲＫインヒビターであるＵ０１２６、ｐ３８タンパク質インヒビターであるＳＢ２０２１９０、およびＪＮＫインヒビターであるＳＰ６００１２５；全て、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製）を１０μＭの濃度で、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に加え、そして、増殖アッセイおよびリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、増殖および遺伝子発現に対する作用を調べた。
Inhibition of the MAP kinase signaling pathway One selective inhibitor for each of the three signaling pathways (U0126, an ERK inhibitor, SB202190, a p38 protein inhibitor, and SP600125, a JNK inhibitor; all Calbiochem (La Jolla, CA) )) At a concentration of 10 μM with FGF-2 (10 ng / ml) and examined for effects on proliferation and gene expression by proliferation assay and real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).
ＪＮＫ活性アッセイ
細胞ベースのＥＬＩＳＡキット（ＣＡＳＥＴＭ Ｋｉｔ，ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を製品説明書に従って使用して、ｃ−Ｊｕｎリン酸化の程度によりＪＮＫの活性を測定した。簡単に述べると、ヒトＡＳＣを、１ウェルあたり２×１０４細胞の濃度で９６ウェルプレートに播種し、そして、一晩静着させた。次いで、細胞を無血清培地中で２４時間養分を絶った。細胞をビヒクル（０．１％ ＤＭＳＯ）、Ｕ０１２６、ＳＢ２０２１９０またはＳＰ６００１２５と共に１５分間前処理した後、これらを、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）に１５分間曝露した。抗ホスホ−ｃ−Ｊｕｎ（セリン７３）抗体および抗汎Ｃ−Ｊｕｎ抗体を用いて、活性化された（リン酸化された）ｃ−Ｊｕｎタンパク質と、総ｃ−Ｊｕｎタンパク質の量を測定した。
JNK activity assay JNK activity was measured by the degree of c-Jun phosphorylation using a cell-based ELISA kit (CASE ™ Kit, SuperArray, Frederick, MD) according to product instructions. Briefly, human ASCs were seeded in 96 well plates at a concentration of 2 × 10 4 cells per well and allowed to settle overnight. The cells were then discontinued for 24 hours in serum-free medium. Cells were pretreated with vehicle (0.1% DMSO), U0126, SB202190 or SP600125 for 15 minutes before they were exposed to FGF-2 (10 ng / ml) for 15 minutes. The amount of activated (phosphorylated) c-Jun protein and total c-Jun protein was measured using anti-phospho-c-Jun (serine 73) antibody and anti-pan C-Jun antibody.
脂肪組織に対する虚血再潅流障害についてのマウスモデル
動物の世話は、施設のガイドラインに従った。６週齢のＩＣＲマウスを、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて麻酔し、そして、鼠径部領域に２ｃｍの切開をつくった。インタクトな大腿動脈から延びる栄養大動脈と共に、鼠径部皮下の脂肪パッドを持ち上げた。脂肪パッドから皮膚まで延びる細い交通枝を、電気凝固した。大動脈を、血管マイクロクリップで３時間にわたり締め付け、次いで、解放して再潅流させた。虚血再潅流障害後、種々の時間間隔（１日目、３日目、７日目および１４日目）で脂肪組織サンプルを採取し、そして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび組織学（ヘマトキシリン−エオジン染色、Ａｚａｎ染色など；以下を参照のこと）により調べた。擬似手術を行った動物（虚血再潅流なし）からの脂肪サンプルをコントロールサンプルとして使用した。
Mouse model for ischemia-reperfusion injury to adipose tissue Care of the animals followed institutional guidelines. Six week old ICR mice were anesthetized with pentobarbital (50 mg / kg body weight) and a 2 cm incision was made in the groin area. The groin subcutaneous fat pad was lifted along with the nutritional aorta extending from the intact femoral artery. Thin traffic branches extending from the fat pad to the skin were electrocoagulated. The aorta was clamped with vascular microclips for 3 hours and then released and reperfused. Adipose tissue samples were taken at various time intervals (Day 1, Day 3, Day 7 and Day 14) after ischemia-reperfusion injury, and real-time RT-PCR and histology (hematoxylin-eosin staining) , Azan staining, etc .; see below). A fat sample from a sham-operated animal (no ischemia reperfusion) was used as a control sample.
インビボ阻害アッセイ
０．５μｌ／ｈの速度で液体を放出する浸透性ポンプ（Ｍｏｄｅｌ １００７Ｄ，ＡＬＺＥＴ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を用いて、約７日間にわたり、インヒビター溶液を注入した。１００μｌのＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５；１０μＭ）、ヤギ抗ＦＧＦ−２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５０μｇ／ｍｌ）、ヤギ抗マウスＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５０μｇ／ｍｌ）を含むポンプ、または、コントロールのＰＢＳを含むポンプを再潅流時に皮下に移植した。
In Vivo Inhibition Assay Inhibitor solution was infused over a period of about 7 days using an osmotic pump (Model 1007D, ALZET, Cupertino, CA) that released liquid at a rate of 0.5 μl / h. Pump containing 100 μl JNK inhibitor (SP600125; 10 μM), goat anti-FGF-2 antibody (R & D Systems; 50 μg / ml), goat anti-mouse HGF antibody (R & D Systems; 50 μg / ml), or pump containing control PBS Were implanted subcutaneously during reperfusion.
アポトーシスおよび増殖の組織学的検出
脂肪組織における虚血再潅流障害後のアポトーシスを検出するために、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼにより媒介されるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を行った。増殖細胞を検出するために、組織を採取する６時間前および３時間前に、１ｍｇの５−ブロモ−２−デキシウリジン（ＢｒｄＵ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内投与した。ＢｒｄＵ Ｉｎ−Ｓｉｔｕ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＢｒｄＵ陽性細胞を検出した。切片１枚あたり３つの無作為に選択した視野を用いて、ＴＵＮＥＬまたはＢｒｄＵ陽性細胞の数を、倍率２００×でカウントした。
Histological detection of apoptosis and proliferation Mediated by terminal deoxyribonucleotidyl transferase using In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) to detect apoptosis after ischemia-reperfusion injury in adipose tissue DUTP nick end labeling (TUNEL) staining was performed. To detect proliferating cells, 1 mg of 5-bromo-2-dexuridine (BrdU; BD Biosciences) was administered intraperitoneally 6 hours and 3 hours before tissue collection. BrdU positive cells were detected using a BrdU In-Situ Detection Kit (BD Biosciences). Using 3 randomly selected fields per section, the number of TUNEL or BrdU positive cells was counted at 200 × magnification.
免疫組織化学
採取した脂肪組織サンプルを、亜鉛固定し（Ｚｉｎｃ Ｆｉｘａｔｉｖｅ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、そして、パラフィン包埋した。本発明者らは、６μｍ厚の切片を調製し、そして、以下の一次抗体を用いて免疫染色を行った：ヤギ抗ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗マウスＣＤ６８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ヤギ抗マウスＣＤ３４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ラット抗マウスＣＤ３１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびビオチン化マウス抗ＢｒｄＵ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた可視化のために、各一次抗体に適切なペルキシダーゼを結合した二次抗体（ニチレイ生化学Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、または、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。二重蛍光染色のために、以下の二次抗体または試薬を使用した：Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８を結合したウサギ抗ラットＩｇＧ、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８または５６８を結合したロバ抗ヤギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ５６８を結合したストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
Immunohistochemistry Collected adipose tissue samples were zinc fixed (Zinc Fixative, BD Biosciences) and embedded in paraffin. We prepared 6 μm thick sections and immunostained with the following primary antibodies: goat anti-FGF-2 (R & D Systems), goat anti-mouse HGF (R & D Systems), goat anti Mouse CD68 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), goat anti-mouse CD34 (Santa Cruz Biotechnology), rat anti-mouse CD31 (BD Biosciences), and biotinylated mouse anti-BrdU (BD Biosciences). For visualization with diaminobenzidine (DAB), a secondary antibody (Nichirei Biochemicals Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) or a streptavidin-peroxidase complex (BD Biosciences) conjugated with the appropriate peroxidase to each primary antibody. )It was used. For double staining, using the following secondary antibody or reagent: Alexa Fluor TM 488 Bound rabbit anti-rat IgG, donkey anti-goat IgG conjugated to Alexa Fluor TM 488 or 568 and Alexa Fluor TM 568, Streptavidin conjugated with (Molecular Probes, Eugene, OR).
生存組織の画像化
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの手順を用いて、生存脂肪組織の可視化を行った（Nishimura S., Manabe I., NagasakiM. et al. 「Adipogenesis in obesity requires close interplay betweendifferentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes 2007; 56:1517-1526）。簡単に述べると、脂肪組織を３ｍｍ角に細かく切り、そして、以下の試薬とともに３０分間インキュベートした：脂肪細胞を染色するためのＢＯＤＩＰＹＴＭ ５５８／５６８またはＢＯＤＩＰＹＴＭ−ＦＬ（両方とも、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）、内皮細胞を染色するためのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８を結合したイソレクチンｉｓｏｌｅｃｔｉｎ ＧＳ−ＩＢ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、全核を染色するためのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（同仁堂Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）、または、壊死細胞の核を染色するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。次いで、サンプルを洗浄し、そして、共焦点顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を用いて直接観察した。
Imaging of Surviving Tissue Visible adipose tissue was visualized using the procedure of Nishimura et al. (Nishimura S., Manabe I., NagasakiM. Et al. “Adipogenesis in obesity requires close interplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels "Diabetes 2007; 56: 1517-1526). Briefly, adipose tissue was minced into 3 mm squares and incubated for 30 minutes with the following reagents: BODIPY ™ 558/568 or BODIPY ™ -FL for staining adipocytes (both from Molecular Probes) Isolectin GS-IB4 (Molecular Probes) coupled with Alexa Fluor ™ 488 for staining endothelial cells, Hoechst 33342 (Dojindo, Kumamoto, Japan) for staining whole nuclei, or nuclei of necrotic cells Propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for staining. Samples were then washed and viewed directly using a confocal microscope system (Leica TCS SP2).
統計的解析
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。２群間の比較は、Ｗｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。多群間の比較は、複数比較のための補正を行って、分散解析により行った。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。
Statistical analysis The results were expressed as mean ± standard error of the mean (SEM). Comparison between the two groups was performed using Welch's t-test. Comparison between multiple groups was performed by analysis of variance with correction for multiple comparisons. A value of p <0.05 was considered significant.
（結果）
ヒトＡＳＣ増殖に対する障害関連増殖因子の作用
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、濃度依存的にヒトＡＳＣの増殖を促進し、一方で、ＶＥＧＦおよびＨＧＦは、ＡＳＣの増殖を促進しなかった（図１Ａ）。形態学的には、ＦＧＦ−２と共に培養したＡＳＣは、他の増殖因子と共に培養したＡＳＣよりも小さかった（図１Ｂ）。
(result)
Effect of injury-related growth factors on human ASC proliferation FGF-2 and PDGF promoted human ASC proliferation in a concentration-dependent manner, whereas VEGF and HGF did not promote ASC proliferation (FIG. 1A). Morphologically, ASCs cultured with FGF-2 were smaller than ASCs cultured with other growth factors (FIG. 1B).
ヒトＡＳＣに対する障害関連増殖因子の表現型による作用
フローサイトメトリーは、あらゆる障害関連増殖因子による内皮表面マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１およびＴｉｅ−２）の発現において有意な差は示さず、少なくともいかなる細胞外マトリックスもなしで培養した場合に、単一の因子の補充だけでは、ヒトＡＳＣの内皮性の分化を誘導するには不十分であることが示唆された（図１Ｃ）。
Phenotypic effects of disorder-related growth factors on human ASC Flow cytometry does not show a significant difference in the expression of endothelial surface markers (CD31, CD34, Flk-1 and Tie-2) by any disorder-related growth factor, at least When cultured without any extracellular matrix, single factor supplementation was suggested to be insufficient to induce endothelial differentiation of human ASC (FIG. 1C).
ヒトＡＳＣによる発現に対する障害関連増殖因子の相互作用
ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦは、ヒトＡＳＣによるその自己転写体の発現を有意にダウンレギュレートし、そして、ＦＧＦ−２はまた、ＰＤＧＦ ｍＲＮＡ発現も有意に抑制した（図２Ａ）。より興味深いことに、ＦＧＦ−２は、ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現において顕著な増加を促進した。経時的な評価により、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは二相性であり、６時間で最初のピークに達し、そして２４時間後に顕著な増加が始まることが明らかとなった（図２Ｂ）。培養培地のＥＬＩＳＡにより、ＦＧＦ−２により刺激されたヒトＡＳＣによるＨＧＦタンパク質の分泌は、３日目に有意に増加したことが実証された（図２Ｃ）。
Interaction of disorder-related growth factors with expression by human ASC FGF-2 and PDGF significantly down-regulate the expression of its self-transcript by human ASC, and FGF-2 also significantly reduces PDGF mRNA expression. Suppressed (FIG. 2A). More interestingly, FGF-2 promoted a significant increase in HGF mRNA expression. Evaluation over time revealed that the up-regulation of HGF mRNA was biphasic, reaching its first peak at 6 hours and beginning a marked increase after 24 hours (FIG. 2B). Culture medium ELISA demonstrated that secretion of HGF protein by human ASC stimulated by FGF-2 was significantly increased on day 3 (FIG. 2C).
ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２誘導性作用の細胞内シグナル伝達経路
ヒトＡＳＣに対するＦＧＦ−２の増殖促進作用は、ＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５）により有意に阻害されたが、ＥＲＫインヒビター（Ｕ０１２６）またはｐ３８インヒビター（ＳＢ２０２１９０）では阻害されなかった（図３Ａ）。ＦＧＦ−２によるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションもまた、ＪＮＫインヒビターによって有意に阻害された（図３Ｂ）。ＥＲＫインヒビターおよびｐ３８インヒビターの投与は、ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現レベルをわずかに減少したが、この変化は、統計的に有意ではなく、ＪＮＫと他のシグナル伝達経路との間の混線が示唆された。ＦＧＦ−２処理により増加されたＪＮＫシグナル伝達経路の典型的な核エフェクターであるｃ−Ｊｕｎのリン酸化と、ｃ−Ｊｕｎリン酸化のＦＧＦ−２誘導性のアップレギュレーションとは、ＪＮＫインヒビターを用いた前処理により完全に防止された（図３Ｃ）。これらの結果は、ＦＧＦ−２が、ＪＮＫシグナル伝達経路を通じて、増殖とＨＧＦ ｍＲＮＡ発現とを優先的に促進することを示す。
Intracellular signaling pathway of FGF-2 inducible action on human ASC The growth promoting action of FGF-2 on human ASC was significantly inhibited by JNK inhibitor (SP600125), but ERK inhibitor (U0126) or p38 inhibitor (SB202190) ) Was not inhibited (FIG. 3A). Upregulation of HGF mRNA by FGF-2 was also significantly inhibited by JNK inhibitors (FIG. 3B). Administration of ERK inhibitor and p38 inhibitor slightly reduced the expression level of HGF mRNA, but this change was not statistically significant, suggesting a cross-talk between JNK and other signaling pathways. Phosphorylation of c-Jun, a typical nuclear effector of the JNK signaling pathway increased by FGF-2 treatment, and FGF-2-induced up-regulation of c-Jun phosphorylation using JNK inhibitors It was completely prevented by the pretreatment (FIG. 3C). These results indicate that FGF-2 preferentially promotes proliferation and HGF mRNA expression through the JNK signaling pathway.
ヒトＡＳＣおよび他の細胞型におけるＦＧＦ−２誘導性作用
細胞増殖は、研究に用いた４つ全ての細胞型（ヒトＡＳＣ、ヒトＤＦ、ヒトＢＭ−ＭＳＣおよびマウスＡＳＣ）により促進されたが、基礎的な増殖能力は、細胞型間で異なった。ＦＧＦ−２により増進された細胞増殖は、検討した全ての細胞型においてＪＮＫインヒビター（ＳＰ６００１２５）によって有意に阻害された（図３Ｄ）。ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現もまた、全ての細胞型において、ＦＧＦ−２により促進され、そして、ＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣを除いて、ＪＮＫインヒビターにより有意に阻害された（図３Ｅ）。これらのことから、ＦＧＦ−２によるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ヒトＢＭ−ＭＳＣにおいてはＪＮＫ以外のシグナル伝達経路により媒介されることが示唆された。
FGF-2 induced effects in human ASC and other cell types Cell proliferation was promoted by all four cell types used in the study (human ASC, human DF, human BM-MSC and mouse ASC), but basal Proliferative capacity varied between cell types. Cell proliferation enhanced by FGF-2 was significantly inhibited by JNK inhibitor (SP600125) in all cell types studied (FIG. 3D). HGF mRNA expression was also promoted by FGF-2 in all cell types, and upregulation of HGF mRNA was significantly inhibited by JNK inhibitors with the exception of human BM-MSC (FIG. 3E). These facts suggested that the up-regulation of HGF mRNA by FGF-2 is mediated by signal transduction pathways other than JNK in human BM-MSC.
マウスの鼠径部脂肪組織における虚血再潅流障害およびその後の修復
マウス鼠径部の脂肪パッドは、一貫して、解剖学的に異常のない栄養大動脈および大静脈を有し、このことにより、再現性のある虚血再潅流障害実験が可能となった（図４Ａ）。組織学的には、早くも１日目には血球の間質浸潤が観察され、そして、この間質浸潤は３日目に最も顕著であった。小さなサイズの脂肪細胞が１日目に現れ、そして、３日目には数が増えていた。このことから、脂肪分解または脂肪生成は、脂肪組織の全体にわたって起こることが示唆された。７日目には、浸潤性の赤血球が消失し、そして、いくつかの脂肪細胞はサイズが大きくなる一方で、相当数の有核細胞は、脂肪細胞間の間隙空間に残ったままであった（図４Ｂ）。ＢｒｄＵ陽性の増殖細胞数は、１日目から増加し、そして、３日目にピークを迎えたが（図４Ｃ）、ＴＵＮＥＬ陽性の脂肪細胞は、１日目に有意に高い頻度（有核細胞の６〜９％）で観察され、そして、その後減少した（図４Ｄ）。さらに、ＰＩ陽性の壊死細胞の増加が３日目に観察され、そして、これらの細胞の中には、レクチン陽性のものもあった。これらのことから、毛細管内皮細胞の中には、壊死を起こしているものもあり、そして、毛細管の再構築が進行中であったことが示唆された（図４Ｅ）。これらの結果は、脂肪組織が再潅流直後に損傷を受け、アポトーシスおよび壊死が脂肪変質過程に関与し、そして、その後に、再生上の変化が生じることを示唆する。
Ischemic reperfusion injury and subsequent repair in mouse groin adipose tissue The mouse groin fat pad has consistently anatomically normal trophic aorta and vena cava, which is reproducible. Ischemic reperfusion injury experiment (Fig. 4A). Histologically, stromal infiltration of blood cells was observed as early as day 1 and this stromal infiltration was most prominent on day 3. Small size adipocytes appeared on day 1 and increased in number on day 3. This suggested that lipolysis or adipogenesis occurred throughout the adipose tissue. On day 7, infiltrating erythrocytes disappeared and some adipocytes increased in size while a significant number of nucleated cells remained in the interstitial spaces between the adipocytes ( FIG. 4B). The number of BrdU positive proliferating cells increased from day 1 and peaked on day 3 (FIG. 4C), but TUNEL positive adipocytes were significantly more frequent on day 1 (nucleated cells). 6-9%) and decreased thereafter (FIG. 4D). In addition, an increase in PI-positive necrotic cells was observed on day 3, and some of these cells were lectin-positive. These facts suggested that some of the capillary endothelial cells were necrotic, and that capillary remodeling was in progress (FIG. 4E). These results suggest that adipose tissue is damaged immediately after reperfusion, apoptosis and necrosis are involved in the fat alteration process, and then regenerative changes occur.
ＦＧＦ−２タンパク質は、早くも１日目には免疫組織化学により間質組織において検出され、その検出ピークは３日目であったが、そう多くないＦＧＦ−２が、７日目に発現されていた（図５Ａ）。一方、そう多くないＨＧＦタンパク質が１日目に検出されたが、ＨＧＦの発現は、３日目から、少なくとも７日目までに上昇した（図５Ｂ）。興味深いことに、ＦＧＦ−２ ｍＲＮＡは、損傷直後から第一週目を通じてダウンレギュレートされており、ＦＧＦ−２は、ＡＳＣのような生存細胞により産生されるのではなく、細胞外マトリックスまたは瀕死の細胞のような損傷を受けた脂肪組織の貯蔵庫から放出されることが示唆された。放出されたＦＧＦ−２は、ヒトＡＳＣにおいてインビトロで観察されるように、損傷を受けた脂肪組織においてＡＳＣによるＦＧＦ−２ ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートし得る。対照的に、組織におけるＨＧＦ ｍＲＮＡの発現は、３日目に有意に上昇したが、１日目と７日目には上昇しておらず（図５Ｃ）、ＨＧＦ ｍＲＮＡの遅れたアップレギュレーションと、ＨＧＦの分泌とは、おそらく、先行するＦＧＦ−２タンパク質の放出により誘導されるということが示唆された。 FGF-2 protein was detected in stromal tissue as early as day 1 by immunohistochemistry, and its detection peak was on day 3, but not so much FGF-2 was expressed on day 7. (FIG. 5A). On the other hand, not so much HGF protein was detected on day 1, but HGF expression increased from day 3 to at least day 7 (FIG. 5B). Interestingly, FGF-2 mRNA is down-regulated throughout the first week immediately after injury, and FGF-2 is not produced by living cells such as ASC, but in extracellular matrix or dying. It was suggested that it was released from a reservoir of damaged adipose tissue such as cells. Released FGF-2 can down-regulate FGF-2 mRNA expression by ASC in damaged adipose tissue as observed in vitro in human ASC. In contrast, HGF mRNA expression in tissues was significantly elevated on day 3 but not on days 1 and 7 (FIG. 5C), with delayed upregulation of HGF mRNA, It was suggested that the secretion of HGF is probably induced by the release of the preceding FGF-2 protein.
損傷を受けた脂肪組織の修復過程における細胞の事象
損傷を受ける前、ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞（ＡＳＣとみなす）は、インタクトな脂肪組織の全体にわたって見られ、成熟な脂肪細胞の間に位置し、そして、特に、血管周辺で豊富であった（図６Ａ）。ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞の数は、明らかにＣＤ３１＋内皮細胞（ＣＤ３４について、陰性、または、かすかに陽性であった）の数よりもかなり多かった。損傷後３日で検出されることが多かったＢｒｄＵ陽性増殖細胞の大部分はまた、ＣＤ３４についても陽性であり（図６Ｂ上段）、そして、ＣＤ３４＋細胞の多くは、レクチン陰性であり（図６Ｂ下段）、ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣが、修復過程において実質的な役割を担うことが示唆された。生存組織の画像化により、間隙空間と小さなサイズの脂肪細胞の増加、レクチン陽性の円形細胞を含む有核細胞数の増加（図６Ｃ）、そして、特に小さなサイズの脂肪細胞の周囲での毛細管（図８Ａ）が明らかとなった。７日目には、大きなサイズの脂肪細胞はＪＮＫインヒビターで処理したサンプルにおいては観察されず、一方で、未処理のモデルにおいては大きなサイズの脂肪組織が観察された（図６Ｃ）。さらに、ＰＩ陽性の核は、１日目と３日目に観察されることが多く、そして、このうちの少数のものが、脂肪細胞において観察された。このことから、毛細管の内皮細胞（図４Ｄ）だけでなく、脂肪細胞（図６Ｄ）もまた、壊死を起こしていたことが示唆される。７日目には、ＰＩ陽性の核が依然としてＪＮＫで処置したサンプルにおいては観察されたが、未処理のモデルにおいてはほとんど検出されなかった（図６Ｄ）。ＪＮＫインヒビターはまた、３日目と７日目に、ＣＤ３４＋／レクチン−のＡＳＣの増殖および移動を抑制した（図６Ｅ）。これらの結果は、脂肪細胞および毛細管を伴う脂肪組織の再構築が、損傷後の第一週の間に進行中であり、そして、組織修復過程は、ＪＮＫインヒビターでの処置により損ねられたことを示唆する。ＣＤ６８＋細胞は、浸潤性のマクロファージとして、インタクトな脂肪組織においてほとんど検出されなかった（図８Ｂ）。しかし、浸潤したマクロファージは、損傷後の小さなサイズの脂肪細胞様の細胞の周囲に凝集したのが観察され、これは、食作用を示唆するものである。ＣＤ６８＋細胞のこの凝集は、損傷後３日目に最も多く観察された。
Cellular events in the repair process of damaged adipose tissue Before being damaged, CD34 + / CD31− cells (considered ASC) are found throughout intact adipose tissue and are located between mature adipocytes, And it was especially abundant around blood vessels (FIG. 6A). The number of CD34 + / CD31− cells was clearly much higher than the number of CD31 + endothelial cells (negative or faintly positive for CD34). The majority of BrdU positive proliferating cells that were often detected 3 days after injury were also positive for CD34 (FIG. 6B top) and many of the CD34 + cells were lectin negative (bottom of FIG. 6B). ), CD34 + / lectin- ASCs have been suggested to play a substantial role in the repair process. By virtue tissue imaging, an increase in interstitial space and small sized adipocytes, an increase in the number of nucleated cells including lectin-positive round cells (FIG. 6C), and capillaries (especially around small sized adipocytes) ( FIG. 8A) became clear. On day 7, large size adipocytes were not observed in the samples treated with JNK inhibitor, while large size adipose tissue was observed in the untreated model (FIG. 6C). Furthermore, PI-positive nuclei were often observed on days 1 and 3, and a few of these were observed in adipocytes. This suggests that not only capillary endothelial cells (FIG. 4D) but also adipocytes (FIG. 6D) were necrotic. On day 7, PI-positive nuclei were still observed in samples treated with JNK, but were hardly detected in the untreated model (FIG. 6D). The JNK inhibitor also inhibited CD34 + / lectin- ASC proliferation and migration on days 3 and 7 (FIG. 6E). These results show that adipose tissue remodeling with adipocytes and capillaries is ongoing during the first week after injury and that the tissue repair process has been impaired by treatment with JNK inhibitors. Suggest. CD68 + cells were hardly detected in intact adipose tissue as infiltrating macrophages (FIG. 8B). However, infiltrated macrophages were observed to aggregate around small size adipocyte-like cells after injury, suggesting phagocytosis. This aggregation of CD68 + cells was most frequently observed 3 days after injury.
虚血再潅流障害後のＨＧＦ発現および線維化に対するシグナル阻害の影響
ＪＮＫインヒビター、または、ＦＧＦ−２に対する中和抗体の投与は、３日目に、損傷を受けた脂肪組織におけるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを完全に妨げ（図７Ａ）、そして、７日目には、ＨＧＦの分泌を抑制した（図７Ｂ）。２週間目の線維性領域の組織学的測量は、脂肪組織に対する再潅流障害は、線維性領域の有意な増加（１０％から２３％への増加）をもたらしたことを明らかにした。さらに、ＪＮＫまたはＦＧＦ−２シグナル伝達の阻害は、ビヒクルのみの投与と比べて、線維性領域のさらに有意な増加をもたらした。有意に増加した線維化はまた、抗ＨＧＦ抗体で処置した群においても観察された（図７Ｃ）。これらの結果は、損傷を受けた脂肪組織において見られる線維化が、脂肪組織の修復過程においてＨＧＦにより抑制されたことを示し、そして、主にＡＳＣからのＨＧＦの分泌が、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＦＧＦ−２により誘導されたことが示唆された。
Effect of signal inhibition on HGF expression and fibrosis after ischemia-reperfusion injury Administration of neutralizing antibodies to JNK inhibitor or FGF-2 on day 3 upregulates HGF mRNA in damaged adipose tissue Was completely prevented (FIG. 7A), and on day 7, HGF secretion was suppressed (FIG. 7B). Histological survey of the fibrotic area at 2 weeks revealed that reperfusion injury to adipose tissue resulted in a significant increase (from 10% to 23%) in the fibrotic area. Furthermore, inhibition of JNK or FGF-2 signaling resulted in a more significant increase in the fibrotic region compared to administration of vehicle alone. Significantly increased fibrosis was also observed in the group treated with anti-HGF antibody (FIG. 7C). These results indicate that the fibrosis seen in damaged adipose tissue was suppressed by HGF during the repair process of adipose tissue, and the secretion of HGF mainly from ASC is associated with the JNK signaling pathway. It was suggested that it was induced by FGF-2.
（考察）
ヒト脂肪組織に対して機械的に損傷を加えた後、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βおよびＰＤＧＦがまず、創傷治癒の早い段階で分泌される。その後、上記増殖因子が低下するにつれ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌が、損傷後の第一週の間に次第に増加する（Aiba-Kojima E., Tsuno N.H., Inoue K. et al. 「Characterization ofwound drainage fluids as a source of soluble factors associated with woundhealing: Comparison with platelet-rich plasma and potential use in cell culture」WoundRepair Regen 2007; 15: 511-520）。本発明者らの結果から、これらの障害関連増殖因子の中でも、ＦＧＦ−２が主にＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増殖と、ＡＳＣによるＨＧＦの分泌とを促進したことが示唆された。ＦＧＦ−２は、血管新生（MontesanoR., Vassalli JD., Baird A. et al. 「Basic fibroblast growth factor inducesangiogenesis in vitro」Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 7297-7301）と、細胞増殖（NissenN.N., Polverini P.J., Gamelli R.L. et al. 「Basic fibroblast growth factormediates angiogenic activity in early surgical wounds」Surgery 1996; 119:457-465）の重要な内因性刺激因子であり、創傷治癒の早い時期に放出されることが知られる（Cordon-Cardo C., Vlodavsky I.,Haimovitz-Friedman A. et al. 「Expression of basic fibroblast growth factor innormal human tissues」Lab Invest 1990; 63: 832-840；Schulze-Osthoff K., Risau W.,Vollmer E. et al. 「In situ detection of basic fibroblast growth factor by highlyspecific antibodies」Am J Pathol 1990; 137: 85-92）。細胞のＦＧＦ−２は、種々の細胞型（例えば、線維芽細胞（TakimiyaM., Saigusa K., Aoki Y. 「Immunohistochemical study of basic fibroblast growthfactor and vascular endothelial growth factor expression for age determinationof cutaneous wound」Am J Forensic Med Pathol 2002; 23: 264-267）および内皮細胞（MuthukrishnanL., Warder E., McNeil P.L. 「Basic fibroblast growth factor is efficientlyreleased from a cytolsolic storage site through plasma membrane disruptions ofendothelial cells」J Cell Physiol 1991; 148: 1-16））が溶解する間に創傷の周囲で放出され、一方で、細胞外マトリックス内に束縛されたＦＧＦ−２は、種々の創傷プロテアーゼの作用により解放される（BashkinP., Doctrow S., Klagsburn M. et al. 「Basic fibroblast growth factor binds tosubendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase andheparin-like molecules」Biochemistry 1989; 28: 1737-1743；Ishai-Michaeli R.,Eldor A., Vlodavsky I. 「Heparanase activity expressed by platelets,neutrophils, and lymphoma cells releases active fibroblast growth factor fromextracellular matrix」Cell Regul 1990; 1: 833-842）。ＪＮＫシグナル伝達は、本研究において明らかにされたように、ＦＧＦ誘導性のＡＳＣ増殖においてのみ関与するのではなく、ヒトＡＳＣのＰＤＧＦ誘導性の増殖および移動にも関与する（KangY.J., Jeon E.S., Song H.Y. et al. 「Role of c-Jun N-terminal kinase in thePDGFinduced proliferation and migration of human adipose tissue-derivedmesenchymal stem cells」J Cell Biochem 2005; 95: 1135-1145）。それゆえ、本研究に使用したＪＮＫインヒビターは、ＡＳＣに対するＦＧＦ−２およびＰＤＧＦの両方の生物学的な作用を阻害するようである。ＰＤＧＦは、ＡＳＣの増殖を促進したが、ＡＳＣによるＨＧＦの発現に対しては有意な作用を示さなかった。他の研究者が報告するように、ＦＧＦ−２およびＥＧＦの両方が、ＡＳＣによるＨＧＦの分泌を促進した（KilroyG.E., Foster S.J., Wu X. et al. 「Cytokine profile of human adipose-derived stemcells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors」JCell Physiol 2007; 212: 702-709）；それゆえ、ＪＮＫはまた、ＡＳＣによるＥＧＦ誘導性のＨＧＦの分泌に関与し得る。
(Discussion)
After mechanical damage to human adipose tissue, FGF-2, EGF, transforming growth factor (TGF) -β and PDGF are first secreted early in wound healing. Subsequently, as the growth factor decreases, VEGF and HGF secretion gradually increase during the first week after injury (Aiba-Kojima E., Tsuno NH, Inoue K. et al. “Characterization of wound drainage fluids as a source of soluble factors associated with woundhealing: Comparison with platelet-rich plasma and potential use in cell culture ”Wound Repair Regen 2007; 15: 511-520). Our results suggest that, among these disorder-related growth factors, FGF-2 promoted ASC proliferation and HSC secretion by ASC mainly via the JNK signaling pathway. . FGF-2 is angiogenic (Montesano R., Vassalli JD., Baird A. et al. “Basic fibroblast growth factor inducesangiogenesis in vitro” Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 7297-7301) and cell proliferation (NissenN. N., Polverini PJ, Gamelli RL et al. “Basic fibroblast growth factor mediates angiogenic activity in early surgical wounds” Surgery 1996; 119: 457-465) and released early in wound healing (Cordon-Cardo C., Vlodavsky I., Haimovitz-Friedman A. et al. “Expression of basic fibroblast growth factor in normal human tissues” Lab Invest 1990; 63: 832-840; Schulze-Osthoff K. , Risau W., Vollmer E. et al. “In situ detection of basic fibroblast growth factor by highly specific antibodies” Am J Pathol 1990; 137: 85-92). Cellular FGF-2 is expressed in various cell types (for example, fibroblasts (Takimiya M., Saigusa K., Aoki Y. “Immunohistochemical study of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor expression for age determination of cutaneous wound”), Am J Forensic. Med Pathol 2002; 23: 264-267) and endothelial cells (Muthukrishnan L., Warder E., McNeil PL "Basic fibroblast growth factor is efficiently released from a cytolsolic storage site through plasma membrane disruptions of endothelial cells" J Cell Physiol 1991; 148: 1 -16)) is released around the wound while it dissolves, while FGF-2 bound in the extracellular matrix is released by the action of various wound proteases (BashkinP., Doctrow S., Klagsburn M. et al. “Basic fibroblast growth factor binds to subendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase and heparin-like molecules” Biochemistry 1989; 28: 1737-1743; Ishai-Michaeli R., Eldor A., Vlodavsky I. “Heparanase activity expressed by platelets, neutrophils, and lymphoma cells releases active fibroblast growth factor from extracellular matrix” Cell Regul 1990; 1: 833-842). JNK signaling is not only involved in FGF-induced ASC proliferation, as revealed in this study, but is also involved in PDGF-induced proliferation and migration of human ASC (KangY.J., Jeon ES, Song HY et al. “Role of c-Jun N-terminal kinase in the PDGF induced proliferation and migration of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells” J Cell Biochem 2005; 95: 1135-1145). Therefore, the JNK inhibitor used in this study appears to inhibit the biological effects of both FGF-2 and PDGF on ASC. PDGF promoted ASC proliferation, but did not have a significant effect on the expression of HGF by ASC. As reported by other investigators, both FGF-2 and EGF promoted the secretion of HGF by ASC (Kilroy G.E., Foster SJ, Wu X. et al. “Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors "JCell Physiol 2007; 212: 702-709); therefore, JNK may also be involved in EGF-induced HGF secretion by ASCs.
本発明者らがＡＳＣについて観察したＦＧＦ−２により増強された細胞増殖とＨＧＦの産生とが、ＢＭ−ＭＳＣおよびＤＦのような他の間葉系細胞型においても観察されたが、ヒトＢＭ−ＭＳＣにおけるＨＧＦ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＪＮＫ以外のシグナルにより媒介されたことは興味深い。ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦのアップレギュレーションは、平滑筋細胞（Onimaru M., Yonemitsu Y., Tanii M. et al. 「Fibroblast growthfactor-2 gene transfer can stimulate hepatocyte growth factor expressionirrespective of hypoxia-mediated downregulation in ischemic limbs」Circ Res2002; 91: 923-930）、肺組織に由来する線維芽細胞様細胞（Roletto F., Galvani A.P., Cristiani C. etal. 「Basic fibroblast growth factor stimulates hepatocyte growth factor/scatterfactor secretion by human mesenchymal cells」J Cell Physiol 1996; 166: 105-111）および骨芽細胞（BlanquaertF., Delany A.M., Canalis E. 「Fibroblast growth factor-2 induces hepatocytesgrowth factor/scatter factor expression in osteoblasts」Endocrinology 1999; 140:1069-1074）;のような他の細胞型において観察された；しかしながら、細胞内シグナル伝達機構は、十分には研究されていない。インターロイキン−１（MatsumotoK., Okazaki H., Nakamura T. 「Up-regulation of hepatocyte growth factor geneexpression by interleukin-1 in human skin fibroblasts」Biochem Biophys ResCommun 1992; 188: 235-243）、インターフェロン−γ（Takami Y., Motoki T., Yamamoto I. et al. 「Synergisticinduction of hepatocyte growth factor in human skin fibroblasts by theinflammatory cytokines interleukin-1 and interferon-gamma」Biochem Biophys ResCommun 2005; 327: 212-217）およびアスコルビン酸（Wu Y.L., Gohda E., Iwao M. et al. 「Stimulationof hepatocyte growth factor production by ascorbic acid and its stable2-glucoside」Growth Horm IGF Res 1998; 8: 421-428）のような他の因子もまた、ＨＧＦの産生を刺激することが報告されている。ＨＧＦは、血管新生および創傷治癒の重要なメディエーターであり、そしてその発現は、種々の細胞および組織において多数の因子によって調節されているようである。 The FGF-2 enhanced cell proliferation and HGF production we observed for ASC was also observed in other mesenchymal cell types such as BM-MSC and DF, but human BM- Interestingly, the upregulation of HGF mRNA in MSC was mediated by signals other than JNK. FGF-2-induced upregulation of HGF has been described in smooth muscle cells (Onimaru M., Yonemitsu Y., Tanii M. et al. “Fibroblast growth factor-2 gene transfer can stimulate hepatocyte growth factor expressionirrespective of hypoxia-mediated downregulation in ischemic. "limbs" Circ Res2002; 91: 923-930), fibroblast-like cells derived from lung tissue (Roletto F., Galvani AP, Cristiani C. etal. "Basic fibroblast growth factor stimulates hepatocyte growth factor / scatterfactor secretion by human mesenchymal cells "J Cell Physiol 1996; 166: 105-111) and osteoblasts (BlanquaertF., Delany AM, Canalis E." Fibroblast growth factor-2 induces hepatocytes growth factor / scatter factor expression in osteoblasts "Endocrinology 1999; 140: 1069- 1074) ;; however, intracellular signaling mechanisms have not been fully studied. Interleukin-1 (MatsumotoK., Okazaki H., Nakamura T. “Up-regulation of hepatocyte growth factor gene expression by interleukin-1 in human skin fibroblasts” Biochem Biophys ResCommun 1992; 188: 235-243), interferon-γ (Takami Y., Motoki T., Yamamoto I. et al. “Synergisticinduction of hepatocyte growth factor in human skin fibroblasts by the inflammatory cytokines interleukin-1 and interferon-gamma” Biochem Biophys ResCommun 2005; 327: 212-217) and ascorbic acid (Wu Other factors such as YL, Gohda E., Iwao M. et al. “Stimulation of hepatocyte growth factor production by ascorbic acid and its stable 2-glucoside” Growth Horm IGF Res 1998; 8: 421-428) It has been reported to stimulate production. HGF is an important mediator of angiogenesis and wound healing, and its expression appears to be regulated by a number of factors in various cells and tissues.
脂肪組織における損傷および修復の過程は、おそらくは、標準的な動物モデルが存在しないことが原因で、十分には研究されていない。損傷を受けた脂肪組織において、損傷後の早い段階での壊死性およびアポトーシス性の変化とその後の浮腫および出血、ならびに、食作用、細胞の浸潤および増殖のような炎症性および再生性の変化が、第一週を通じて観察された。壊死性の変化は、毛細管の内皮細胞および脂肪細胞において見られ、脂肪組織の再構築と、その修復過程とが、ＪＮＫインヒビターにより損ねられることが示唆された。ＨＧＦが分泌された後、この組織から束縛されていたかまたは他の形態にあったＦＧＦ−２が放出された；ＨＧＦのアップレギュレーションは、主に、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＦＧＦ−２により刺激されたＡＳＣから導かれるようである。というのも、ＡＳＣは、脂肪組織に由来する間質の血管画分内の間葉系細胞の半分より多くを構成することが知られているからである（Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. 「Characterization offreshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portionsof liposuction aspirates」J Cell Physiol 2006; 208: 64-76）。この研究において使用した虚血再潅流モデルは、脂肪組織の損傷および再生の再現性のある結果を提供し、損傷および再生は全て、２週間以内に完了した。 The process of damage and repair in adipose tissue has not been well studied, probably due to the absence of standard animal models. In damaged adipose tissue, early necrotic and apoptotic changes following injury and subsequent edema and hemorrhage, and inflammatory and regenerative changes such as phagocytosis, cell infiltration and proliferation Observed throughout the first week. Necrotic changes were found in capillary endothelial cells and adipocytes, suggesting that adipose tissue remodeling and its repair process are impaired by JNK inhibitors. After HGF was secreted, FGF-2, which was either constrained or in other forms, was released from this tissue; upregulation of HGF was primarily driven by FGF-2 via the JNK signaling pathway. It seems to be derived from stimulated ASC. This is because ASC is known to constitute more than half of the mesenchymal cells in the stromal vascular fraction derived from adipose tissue (Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. “Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates” J Cell Physiol 2006; 208: 64-76). The ischemia reperfusion model used in this study provided reproducible results of adipose tissue damage and regeneration, all of which were completed within 2 weeks.
脂肪組織において、ＡＳＣであることが示唆されたＣＤ３４＋／ＣＤ３１−細胞は、損傷前は、脂肪細胞（毛細管に密接に関連するもの）と周囲の血管壁（特に、外膜において）との間に多く見られた。血管内皮細胞へと分化して、毛細管の新芽を形成する能力を有するＣＤ３４＋血管壁内在前駆細胞は、以前に報告されており（Zengin E., Chalajour F., Gehling U.M. et al. 「Vascular wall residentprogenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis」Development 2006;133:1543-1551）、そしてこの集団は、ＡＳＣを構成する一部分である可能性がある。一方で、血管周皮細胞の特徴を有するＡＳＣの血管周皮亜集団もまた特徴付けられている（TraktuevD., Merfeld-Clauss S., Li J. et al. 「A population of multipotent CD34-positiveadipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside ina periendothelial location, and stabilize endothelial networks」Circ Res 2008;102: 77-85）。ＡＳＣは、異種性の亜集団を構成し得、そして、インビボにおけるＡＳＣの特徴および機能を解明する際の複雑さを説明し得る。以前に示唆されたように、脂肪生成と血管新生との間には密接な関係性が存在し、それゆえ、最初は脂肪細胞の前駆体細胞とみなされていたＡＳＣは、脂肪生成と血管新生の前駆体として機能し得（非特許文献５）、そして、肥満（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526）、脂肪組織のターンオーバー、および損傷後の脂肪組織の修復のような種々の状況において、脂肪細胞と血球と血管との間の相互関係を管理し得る。組織再生の間、コントロールと比べてより多くのＣＤ３４＋／ＣＤ３１−のＡＳＣが、脂肪細胞の間に見られ、３日目に見られたＢｒｄＵ陽性の増殖細胞の多くは、ＣＤ３４＋／レクチン−であった。これらのことから、ＡＳＣが増殖し、そして、脂肪生成および血管新生のような修復過程に関与していることが示唆された。ＡＳＣの増殖および移動は、ＪＮＫインヒビターの処置により強く阻害され、その結果、組織修復が遅延され、かつ損ねられ、同時に、線維化が増加した。マクロファージは、脂肪組織における炎症と肥満とに関与することが知られる（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526）。この研究においては、ＣＤ６８＋のマクロファージはコントロールにおいてはほとんど検出されなかったが、３日目には多数観察されたものの、その数はASCよりもかなり少ないレベルであった。損傷を受けた脂肪組織におけるマクロファージの役割は、明らかにすべきままであるが、マクロファージは、食作用および／または血管新生に関与する可能性がある（NishimuraS., Manabe I., Nagasaki M. et al. 「Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels」Diabetes2007; 56: 1517-1526]。 In adipose tissue, CD34 + / CD31− cells, which have been suggested to be ASC, are between the adipocytes (those closely associated with capillaries) and the surrounding vessel wall (especially in the outer membrane) before injury Many were seen. CD34 + vascular wall resident progenitor cells that have the ability to differentiate into vascular endothelial cells and form capillary shoots have been reported previously (Zengin E., Chalajour F., Gehling UM et al. “Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis "Development 2006; 133: 1543-1551), and this population may be part of the ASC. On the other hand, ASC vascular pericyte subpopulations with characteristics of vascular pericytes have also been characterized (Traktuev D., Merfeld-Clauss S., Li J. et al. “A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks "Circ Res 2008; 102: 77-85). ASCs can constitute heterogeneous subpopulations and explain the complexity in elucidating the features and functions of ASCs in vivo. As previously suggested, there is a close relationship between adipogenesis and angiogenesis, and therefore ASC, initially considered adipocyte precursor cells, is adipogenic and angiogenic. (Nishimura S., Manabe I., Nagasaki M. et al. “Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels” Diabetes2007; 56: 1517-1526), in various situations such as adipose tissue turnover and post-injury adipose tissue repair, the interaction between adipocytes, blood cells and blood vessels can be managed. During tissue regeneration, more CD34 + / CD31− ASCs were found among the adipocytes compared to controls, and many of the BrdU positive proliferating cells seen on day 3 were CD34 + / lectin−. It was. These suggested that ASCs proliferate and are involved in repair processes such as adipogenesis and angiogenesis. ASC proliferation and migration were strongly inhibited by treatment with JNK inhibitors, resulting in delayed and impaired tissue repair and at the same time increased fibrosis. Macrophages are known to be involved in inflammation and obesity in adipose tissue (Nishimura S., Manabe I., Nagasaki M. et al. “Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels” Diabetes2007; 56: 1517-1526). In this study, CD68 + macrophages were rarely detected in the controls, although many were observed on day 3 but at a much lower number than ASC. The role of macrophages in damaged adipose tissue remains to be clarified, but macrophages may be involved in phagocytosis and / or angiogenesis (Nishimura S., Manabe I., Nagasaki M. et al "Adipogenesis in obesity requires closeinterplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels" Diabetes 2007; 56: 1517-1526].
ＨＧＦは、心臓（NakamuraT., Mizuno S., Matsumoto K. et al. 「Myocardial protection fromischemia/reperfusion injury by endogeneous and exogenous HGF」J Clin Invest2000; 106: 1511-1519）、肝臓（Ueki T., Kaneda Y., Tsutsui H. et al. 「Hepatocytegrowth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats」Nat Med 1999; 5: 226-230]および腎臓（LiuY. 「Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential andmechanisms of action」Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16）を含む種々の臓器において抗線維形成作用を有することが報告されている。最近の研究では、ＨＧＦが、種々の機構によりＳｍａｄシグナル伝達を中断することにより、ＴＧＦ−βの線維化促進作用に拮抗することが明らかとなった（LiuY. 「Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential andmechanisms of action」Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16；Conway K.,Price P., Harding K.G. et al. 「The molecular and clinical impact of hepatocytegrowth factor, its receptor, activators, and inhibitors in wound healing」WoundRepair Regen 2006; 14: 2-10）。本研究において、ＦＧＦ−２のシグナル伝達を阻害することにより、ＡＳＣによるＨＧＦの産生が抑制され、そして、ＨＧＦを阻害することにより、損傷を受けた脂肪組織における線維化が増加した。さらに、ＪＮＫインヒビターまたは抗ＦＧＦ−２抗体を投与することもまた、損傷後の重篤な線維化をもたらし、これは、線維化のＦＧＦ−２誘導性の防止が、少なくとも部分的に、ＡＳＣに由来するＨＧＦにより媒介されること、そして、ＨＧＦは、線維化を防止し、そして、損傷後に脂肪の体積を維持することにおいて重要な因子であることを意味する。ＦＧＦ−２は、線維芽細胞および内皮細胞に対するその直接的な作用により創傷治癒を促進することが知られる（BikfalviA., Klein S., Pintucci G. et al. 「Biological roles of fibroblast growthfactor-2」Endocr Rev 1997; 18: 26-45）。しかしながら、本研究は、ＦＧＦ−２はまた、ＡＳＣおよび／またはＤＦからＨＧＦを誘導することにより、組織修復を促進し、かつ、線維化を防止することもできることが明らかとなった。脂肪組織は、多くの臓器内またはその周辺に存在するので、ＦＧＦ−２誘導性のＡＳＣからのＨＧＦの分泌は、心筋梗塞、肝炎および腎炎のような臓器損傷の後の修復過程において重要である可能性がある。 HGF is expressed in the heart (Nakamura T., Mizuno S., Matsumoto K. et al. “Myocardial protection from ischemia / reperfusion injury by endogeneous and exogenous HGF” J Clin Invest2000; 106: 1511-1519), liver (Ueki T., Kaneda Y ., Tsutsui H. et al. “Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats” Nat Med 1999; 5: 226-230] and kidney (LiuY. “Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential and mechanisms of action” Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16) have been reported to have anti-fibrogenic effects in various organs, and recent studies have shown that HGF disrupts Smad signaling by various mechanisms. , It became clear that it antagonizes the fibrosis promoting action of TGF-β (LiuY. “Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: Therapeutic potential and mechanisms of action” Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: 7-16; Conway K ., Price P., Harding KG et “The molecular and clinical impact of hepatocyte growth factor, its receptor, activators, and inhibitors in wound healing” WoundRepair Regen 2006; 14: 2-10) In this study, by inhibiting FGF-2 signaling, Inhibition of HGF by ASC and inhibition of HGF resulted in increased fibrosis in damaged adipose tissue, and administration of JNK inhibitor or anti-FGF-2 antibody also occurred after injury Severe fibrosis, which is that FGF-2-induced prevention of fibrosis is mediated, at least in part, by HGF derived from ASC, and HGF prevents fibrosis And it is an important factor in maintaining fat volume after injury. FGF-2 is known to promote wound healing by its direct action on fibroblasts and endothelial cells (Bikfalvi A., Klein S., Pintucci G. et al. “Biological roles of fibroblast growthfactor-2” Endocr Rev 1997; 18: 26-45). However, this study revealed that FGF-2 can also promote tissue repair and prevent fibrosis by inducing HGF from ASC and / or DF. Since adipose tissue is present in and around many organs, FGF-2 induced ASC secretion from ASC is important in the repair process after organ damage such as myocardial infarction, hepatitis and nephritis there is a possibility.
本研究の結果は、ＡＳＣの治療的な可能性に新しい見通しを提供する。ＡＳＣを用いた細胞治療は、特に、ＦＧＦ−２で前処置されたか、またはＦＧＦ−２と併用したとき、組織修復を加速し、線維化を減らし、そして、ＨＧＦの作用を通じて、急性または慢性の炎症により損傷を受けた臓器の機能を改善する可能性がある。ＡＳＣにより分泌されたＨＧＦは、自家脂肪移植術において重要な役割を担う可能性があり（非特許文献９；非特許文献１２）；脂肪移植片の生存を促進し、そして、瘢痕の形成を防止することが示唆されている。ＨＧＦは抗線維形成性であるだけでなく、血管新生性でもあること（Conway K., Price P., Harding KG. et al. 「The molecular and clinicalimpact of hepatocyte growth factor, its receptor, activators, and inhibitors inwound healing」Wound Repair Regen 200; 14: 2-10）、そして、ＡＳＣによるＨＧＦ産生が、虚血の肢の改善に寄与するようであること（CaiL., Johnstone B.H., Cook TG. et al. 「Suppression of hepatocyte growth factorproduction impairs the ability of adipose-derived stem cells to promoteischemic tissue revascularization」Stem Cells. 2007; 25: 3234-3243）を考慮すると、ＦＧＦ−２誘導性のＨＧＦの分泌はまた、毛細管の総量が改善しているが、損傷を受けた脂肪組織における血管密度が有意に増大していなかった場合でさえも、組織修復の間に血管新生を促進することができた（図９）。ＡＳＣにおいて、ＶＥＧＦの分泌は、虚血により誘導されるようである（RehmanJ., Traktuev D., Li J. et al. 「Secretion of angiogenic and antiapoptoticfactors by human adipose stromal cells」Circulation 2004; 109: 1292-1298）。本発明者らが本研究において使用したモデルは、虚血モデルではなく、損傷モデルであり、ＶＥＧＦの発現は、損傷後すぐにダウンレギュレートされた（データ示さず）。脂肪組織における血管新生を研究し、そして、血管新生を増進するための治療戦略を確立するために、脂肪組織における慢性的な虚血の特定のモデルを用いる研究が必要とされる。 The results of this study provide a new perspective on the therapeutic potential of ASC. Cell therapy using ASC accelerates tissue repair, reduces fibrosis, and, through the action of HGF, especially when pretreated with FGF-2 or in combination with FGF-2. May improve the function of organs damaged by inflammation. HGF secreted by ASC may play an important role in autologous fat transplantation (Non-patent document 9; Non-patent document 12); promotes fat graft survival and prevents scar formation It has been suggested that HGF is not only anti-fibrogenic but also angiogenic (Conway K., Price P., Harding KG. Et al. “The molecular and clinical impact of hepatocyte growth factor, its receptor, activators, and inhibitors. inwound healing "Wound Repair Regen 200; 14: 2-10) and that AGF production by ASC seems to contribute to the improvement of ischemic limbs (CaiL., Johnstone BH, Cook TG. et al." Considering Suppression of hepatocyte growth factor production impairs the ability of adipose-derived stem cells to promoteischemic tissue revascularization ”Stem Cells. 2007; 25: 3234-3243), FGF-2-induced HGF secretion also increases the total amount of capillaries. Although improved, angiogenesis could be promoted during tissue repair even when the vessel density in the damaged adipose tissue was not significantly increased (FIG. 9). In ASC, VEGF secretion appears to be induced by ischemia (Rehman J., Traktuev D., Li J. et al. “Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells” Circulation 2004; 109: 1292- 1298). The model we used in this study was an injury model, not an ischemia model, and VEGF expression was down-regulated immediately after injury (data not shown). In order to study angiogenesis in adipose tissue and establish therapeutic strategies to enhance angiogenesis, studies using specific models of chronic ischemia in adipose tissue are required.
（結論）
ＦＧＦ−２は、ＪＮＫシグナル伝達経路を介して、ＡＳＣの増幅とＡＳＣによるＨＧＦの分泌を促進する。損傷を受けた脂肪組織において、損傷を受けた組織から放出されたＦＧＦ−２により刺激されたＡＳＣは、脂肪修復過程において、主要な増殖細胞集団であることが示唆される。このＪＮＫ媒介性のシグナルは、線維化の防止、そして、損傷後の脂肪体積の維持において重要な役割を担う。本研究はまた、損傷応答におけるＡＳＣについての新しい役割を明らかにし、そして、将来的にASCを治療に利用するための戦略に見通しを提供する。
(Conclusion)
FGF-2 promotes ASC amplification and ASC secretion of HGF via the JNK signaling pathway. In damaged adipose tissue, ASC stimulated by FGF-2 released from damaged tissue is suggested to be a major proliferating cell population in the fat repair process. This JNK-mediated signal plays an important role in preventing fibrosis and maintaining fat volume after injury. This study also reveals a new role for ASC in injury response and provides a perspective on strategies for future use of ASC for treatment.
（実施例２：肝硬変での治療実験）
本実施例では、肝硬変モデルマウスを用いて、ＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤を投与したときの、線維化の改善を観察する。
(Example 2: Treatment experiment in cirrhosis)
In this example, improvement in fibrosis is observed using a cirrhosis model mouse when ASC and a bFGF sustained-release agent are administered.
ここで、肝硬変モデルマウスとしては、四塩化炭素連続投与モデルを用いる。0.5mg/kgの四塩化炭素を週２回、４週間連続投与し肝硬変を誘発させる。 Here, a carbon tetrachloride continuous administration model is used as a cirrhosis model mouse. Cirrhosis is induced by administering 0.5 mg / kg carbon tetrachloride twice a week for 4 consecutive weeks.
また、ＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤は、以下のように調製する。 ASC and bFGF sustained-release agent are prepared as follows.
ＡＳＣ処理方法
（１）脂肪組織と等量の０．０７５％コラゲナーゼ（和光純薬等から入手可能。）を加え３７℃で３０分酵素処理する。
ASC treatment method (1) Add 0.075% collagenase (available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in an amount equal to that of adipose tissue and perform enzyme treatment at 37 ° C. for 30 minutes.
（２）処理後に８００Ｇ×１０分遠心する。 (2) Centrifuge at 800 G × 10 minutes after treatment.
（３）上層を除去し、沈殿した細胞にリン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、１００μｍポアフィルター（Millipore等から入手可能。）を通す。 (3) Remove the upper layer, add phosphorylated buffered saline (PBS) to the precipitated cells, and pass through a 100 μm pore filter (available from Millipore et al.).
（４）フィルターを通った細胞を回収する。 (4) Collect the cells that have passed through the filter.
ｂＦＧＦ徐放剤の調製法
（１）ゼラチン溶液をウォーターバス内で攪拌して、マイクロスフィアを作成して、冷却し乾燥させる。
Preparation Method of bFGF Sustained Release Agent (1) A gelatin solution is stirred in a water bath to create a microsphere, cooled and dried.
（２）グルタルアルデヒド（和光純薬等から入手可能。）処理により、ゼラチンスフィアを架橋する。 (2) Gelatin spheres are cross-linked by treatment with glutaraldehyde (available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
（３）ｂFGF溶液を含浸させ、ｂＦＧＦ徐放剤とする。 (3) Impregnate with bFGF solution to obtain bFGF sustained release agent.
上記のように調製したＡＳＣとｂＦＧＦ徐放剤を上記肝硬変モデルマウスに投与し、線維化の改善状況を観察する。ここでは、線維化の改善が期待される。 ASC and bFGF sustained-release agent prepared as described above are administered to the cirrhosis model mouse, and the improvement of fibrosis is observed. Here, improvement of fibrosis is expected.
（実施例３：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産）
本実施例では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下で脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を培養する工程を包含する、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の生産方法を実証する。
(Example 3: Production of hepatocyte growth factor (HGF))
In this example, a method for producing hepatocyte growth factor (HGF) including the step of culturing adipose-derived stem cells (ASC) in the presence of fibroblast growth factor (FGF) is demonstrated.
実施例２に記載のように調製したＡＳＣをｂＦＧＦ添加培地にて培養し、１週間おきに培地を継続的に回収して、ＨＧＦタンパクを回収、精製する。 ASC prepared as described in Example 2 is cultured in a bFGF-added medium, and the medium is continuously collected every other week to collect and purify the HGF protein.
ＨＧＦタンパク質の回収および精製は、以下のとおりである。 The recovery and purification of HGF protein is as follows.
（１）ＨＧＦに対する抗体カラムを常法により作製する。 (1) An antibody column against HGF is prepared by a conventional method.
（２）回収した培地を抗体カラムに通し、常法により吸着させる。 (2) The collected medium is passed through an antibody column and adsorbed by a conventional method.
（３）抗体カラムから吸着したＨＧＦを常法により溶出させ回収する。 (3) HGF adsorbed from the antibody column is eluted and recovered by a conventional method.
このようにして調製したＨＧＦの収量等を測定し、本発明の調製法による効果を確認することができる。 The effect of the preparation method of the present invention can be confirmed by measuring the yield of HGF thus prepared.
（実施例４：脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤および複合剤としての効果）
本実施例では、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖刺激剤の効果を確認する。
実施例２において記載されるように調製したＡＳＣをｂＦＧＦ添加培地にて培養する。
(Example 4: Effect as an adipose-derived stem cell (ASC) proliferation stimulator and complex agent)
In this example, the effect of an adipose-derived stem cell (ASC) growth stimulator is confirmed.
ASC prepared as described in Example 2 is cultured in medium supplemented with bFGF.
ＡＳＣの増殖を、ｂＦＧＦ添加のないコントロールサンプルと比較して、増殖刺激効果を確認する。 The growth stimulatory effect is confirmed by comparing the proliferation of ASC with a control sample without bFGF addition.
このようにして調製したＡＳＣをｂＦＧＦ徐放剤とともに体内に投与する。 The ASC thus prepared is administered into the body together with the bFGF sustained release agent.
投与された被検体の体内を調べることにより、移植したＡＳＣが増殖し、さらには脂肪新生および血管新生が亢進していることがわかる。 By examining the body of the administered subject, it can be seen that the transplanted ASC proliferates and that adipogenesis and angiogenesis are promoted.
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, this invention should not be limited and limited to this embodiment. It is understood that the scope of the present invention should be construed only by the claims. It is understood that those skilled in the art can implement an equivalent range based on the description of the present invention and the common general technical knowledge from the description of specific preferred embodiments of the present invention. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.
脂肪由来幹細胞を用いた細胞治療は，すでに実用化（臨床応用）されている。また，FGF-2は既に医薬品として製品化され，熱傷や皮膚潰瘍の治療薬として用いられている。今後はFGF-2を徐放する製剤も商品化される可能性がある。脂肪由来幹細胞とFGF-2はともにこれまでの実績から，生体に対する安全性は高いと考えられる。このような状況から，今回の細胞治療も実用化のめどは立っている。線維化は、局所もしくは全身において慢性炎症を伴うあらゆる疾患に共通しており、本発明はまた、局所投与だけでなく、全身投与も可能であるため、広い範囲での臨床治療に役立つ可能性がある。 Cell therapy using adipose-derived stem cells has already been put into practical use (clinical application). FGF-2 has already been commercialized as a medicine and is used as a treatment for burns and skin ulcers. In the future, preparations for sustained release of FGF-2 may be commercialized. Both adipose-derived stem cells and FGF-2 are considered to be highly safe for living organisms based on past results. Under such circumstances, the prospect of this cell therapy also practically stands. Fibrosis is common to all diseases with chronic inflammation locally or systemically, and the present invention can also be systemically administered as well as locally administered, and thus may be useful for a wide range of clinical treatments. is there.
Claims (8)
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012056913A (en) * | 2010-09-11 | 2012-03-22 | Kanazawa Univ | Hepatitis therapeutic agent containing adipose tissue-originated interstitial cell group |
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2008
- 2008-08-06 JP JP2008203653A patent/JP2010037292A/en not_active Withdrawn
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