JP2010035448A - Modified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase with improved substrate specificity - Google Patents

Modified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase with improved substrate specificity Download PDF

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Yutaka Kawaminami
裕 川南
Masao Kitabayashi
北林  雅夫
Yoshiaki Nishiya
西矢  芳昭
Tadashi Yoshimoto
忠 芳本
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an enzyme available for more advantageous blood glucose-measuring reagents compared with well-known enzymes for blood glucose sensor in practical aspect. <P>SOLUTION: Disclosed is a modified flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH), wherein the FADGDH has more improved substrate specificity and/or stability than that of wild-type FADGDH and is preferably derived from eukaryotes, more preferably derived from filamentous fungus, and furthermore preferably derived from Aspergillus. For example, a modified FADGDH derived from Aspergillus has a primary structure in which at least one amino acid is substituted, deleted, inserted or added. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法及び該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体のグルコース測定試薬への種々の適用に関する。   The present invention relates to a flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant with improved substrate specificity, a gene encoding the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant, a method for producing the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant, and the flavin adenine dependency The present invention relates to various applications of a modified glucose dehydrogenase variant to a glucose measurement reagent.

血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ(EC 1.1.3.4)が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に40年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してD−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。   Blood glucose self-measurement is important for diabetics to grasp their normal blood glucose level and use it for treatment. An enzyme using glucose as a substrate is used for a sensor used for blood glucose self-measurement. An example of such an enzyme is glucose oxidase (EC 1.1.3.4). Glucose oxidase has been used as an enzyme for blood glucose sensors for a long time because it has the advantage of high specificity for glucose and excellent thermal stability, and its first announcement dates back to about 40 years ago. . In a blood glucose sensor using glucose oxidase, measurement is performed by passing electrons generated in the process of oxidizing glucose and converting it to D-glucono-δ-lactone to the electrode through a mediator. There is a problem that dissolved oxygen affects the measured value because the protons generated in the above are easily passed to oxygen.

このような問題を回避するために、例えばNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.47)あるいはピロロキノリンキノン(本書ではピロロキノリンキノンをPQQとも記載する。)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(EC1.1.5.2(旧EC1.1.99.17)が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(本書ではNAD(P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼをNADGDHとも記載する。)は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のPQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ(本書ではPQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをPQQGDHとも記載する。)は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
Biochim Biophys Acta. 1967 ;139 (2):265−76 Biochim Biophys Acta. 1967 ;139 (2):277−93 Biochim Biophys Acta. 1967 ;146 (2):317−27 Biochim Biophys Acta. 1967 ;146 (2):328−35
In order to avoid such problems, for example, NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) or pyrroloquinoline quinone (herein, pyrroloquinoline quinone is also referred to as PQQ) -dependent glucose dehydrogenase. (EC 1.1.5.2 (formerly EC 1.1.9.17) has been used as an enzyme for blood glucose sensors. These are advantageous in that they are not affected by dissolved oxygen, but the former NAD (P ) -Dependent glucose dehydrogenase (NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase is also referred to as NADGDH in this document) is not stable and requires the addition of a coenzyme, while the latter PQQ-dependent glucose dehydrogenase ( In this book, PQQ-dependent glucose dehydrogenase is also described as PQQGDH ) Has poor substrate specificity and has the disadvantage of impairing the accuracy of measured values because it also acts on sugars other than glucose such as maltose and lactose.
Biochim Biophys Acta. 1967; 139 (2): 265-76 Biochim Biophys Acta. 1967; 139 (2): 277-93. Biochim Biophys Acta. 1967; 146 (2): 317-27 Biochim Biophys Acta. 1967; 146 (2): 328-35.

本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。   An object of the present invention is to provide an enzyme that can be used as a reagent for measuring blood glucose level, which is more practically advantageous than the above-mentioned known enzymes for blood glucose sensor.

特許文献1にはアスペルギルス属由来フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(本書ではフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをFADGDHとも記載する。)が開示されている。本酵素は熱安定性に優れかつ溶存酸素の受けない点で優位であるが、キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の10%程度あるため、キシロース負荷試験を受けている人の血液を測定する場合、測定値の正確性を損ねてしまう可能性がある。
WO2004/058958
Patent Document 1 discloses flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase derived from the genus Aspergillus (herein, flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase is also referred to as FADGDH). This enzyme is superior in that it has excellent heat stability and does not receive dissolved oxygen. However, since it has an action on xylose that is about 10% of the action on glucose, it measures the blood of people undergoing a xylose tolerance test. In some cases, the accuracy of the measured value may be impaired.
WO2004 / 058958

そこで我々は、アスペルギルス・オリゼ株由来のFADGDHのアミノ酸配列を適宜改変することにより、キシロースに作用性を低下させ、かつ十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的にさらに検討を重ねた。   Therefore, we have appropriately modified the amino acid sequence of FADGDH derived from the Aspergillus oryzae strain to reduce the activity on xylose and have sufficient thermal stability, which is more practically advantageous for measuring blood glucose level. Further studies have been made for the purpose of providing an enzyme that can be used in the field.

他方、特許文献2には、アスペルギルス・テレウス属野生株を液体培養または小麦フスマ培養することによりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを得たこと、および、アスペルギルス・テレウス属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、組換え大腸菌、組換えカビ(アスペルギルス・オリゼ)、組換え酵母(Candida属)でそれぞれ発現させ得られた酵素を精製したことが記載されている。
また、特許文献2には、それらの酵素の性質試験、および、センサーに適用したときの特性比較についていくつかの事例が開示されている。
WO 2006/101239
On the other hand, in Patent Document 2, flavin-binding glucose dehydrogenase was obtained by liquid culture or wheat bran culture of Aspergillus terreus wild strain, and flavin-binding glucose dehydrogenase derived from Aspergillus terreus is encoded. It describes that the enzymes obtained by expressing the genes in recombinant Escherichia coli, recombinant mold (Aspergillus oryzae), and recombinant yeast (genus Candida) were purified.
Patent Document 2 discloses several examples of property tests of these enzymes and comparison of characteristics when applied to sensors.
WO 2006/101239

しかし、特許文献2には、産業上の要請の重要な要件の1つである大量生産に最も適していると思われた大腸菌で発現させた酵素について、極めて重要な要件である温度安定性の記載がなかった。そこで本願発明者は、酵素の安定供給という観点から、該酵素のアミノ酸配を改変することに加えて、該酵素を遺伝子組み換えにより生産することをも視野に含めて先行技術を再検討した。
その結果、意外にも、最も大量生産に適していると思われた大腸菌で発現させて取得したFADGDH組換え体(rFADGDH)は、熱安定性が野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて大きく劣る場合があることが判明した。
例えば、発明者らが後述の方法によりアスペルギルス・オリゼから取得したaFADGDHは、50℃・15分処理において約77%の活性を維持していたが、大腸菌で発現させて取得したFADGDH組換え体(raFADGDH)の熱安定性は、50℃・15分処理において約13%程度であった。また、アスペルギルス・テレウスFADGDH組換え体(rtFADGDH)の熱安定性も、50℃・15分処理において約28%程度であった。(特許文献1では、アスペルギルス・テレウスBP−08578を培養して取得した酵素の熱安定性は、50℃・15分処理において89%と開示されている。)
特許文献2にその構造や製造方法が記載されている酵素についても、同様に、大腸菌で発現させて取得した酵素は、熱安定性が、野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて劣る可能性が高いと考えられた。
However, Patent Document 2 discloses a temperature stability which is a very important requirement for an enzyme expressed in Escherichia coli which seems to be most suitable for mass production, which is one of the important requirements of the industry. There was no description. In view of the stable supply of the enzyme, the inventor of the present application reviewed the prior art with a view to producing the enzyme by genetic recombination in addition to modifying the amino acid arrangement of the enzyme.
As a result, the FADGDH recombinant (rFADGDH) obtained by expression in Escherichia coli, which seems to be most suitable for mass production, is an enzyme obtained by culturing and purifying from a wild strain. It was found that there are cases where it is greatly inferior to
For example, aFADGDH obtained from Aspergillus oryzae by the inventors by the method described below maintained about 77% activity in a treatment at 50 ° C. for 15 minutes, but the FADGDH recombinant obtained by expression in E. coli ( raFADGDH) had a thermal stability of about 13% after treatment at 50 ° C. for 15 minutes. The thermal stability of Aspergillus tereus FADGDH recombinant (rtFADGDH) was about 28% after treatment at 50 ° C. for 15 minutes. (In Patent Document 1, the thermal stability of an enzyme obtained by culturing Aspergillus terreus BP-08578 is disclosed as 89% in a treatment at 50 ° C. for 15 minutes.)
Similarly, for the enzyme whose structure and production method are described in Patent Document 2, the enzyme obtained by expression in Escherichia coli is more stable than the enzyme obtained by culturing and purifying from a wild strain. It was thought that there was a high possibility of being inferior.

そこで我々は、アスペルギルス・オリゼ株由来のFADGDHのアミノ酸配列を適宜改変することにより、キシロースに作用性を低下させ、さらに、大腸菌で発現させた場合にも十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的にさらに検討を重ねた。
その結果、上述のような公知の血糖センサ用酵素の基質特異性ならびに安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することができた。
Therefore, we have modified the amino acid sequence of FADGDH derived from the Aspergillus oryzae strain as appropriate to reduce its activity on xylose, and also have sufficient thermal stability when expressed in E. coli, making it more practical. Further studies have been made for the purpose of providing an enzyme that can be used as an advantageous reagent for measuring blood glucose level.
As a result, it was possible to provide an enzyme that can be used as a reagent for measuring blood glucose level, which is more practically advantageous, by overcoming the drawbacks related to substrate specificity and stability of the known enzyme for blood glucose sensor as described above. .

すなわち本発明は、改変することにより基質特異性、及び/または、安定性が向上した改変型FADGDHである。好ましくは真核生物由来であり、更に好ましくは糸状菌由来であり、更に好ましくはAspergillus属菌由来である。
(1)本発明は、野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(FADGDH)よりも基質特異性が向上した改変型FADGDHであって、配列番号2のアミノ酸配列における53位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する改変型FADGDHである。
(2)本発明は、アミノ酸置換を、配列番号2における、G53H、G53N、G53K、G53M、G53T、G53V及びG53Cからなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置に有する、上記(1)に記載の改変型FADGDHであることができる。
(3)本発明は、さらに、配列番号2のアミノ酸配列における163位、167位および551位からなる群のうちいずれか1つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、上記(1)に記載の改変型FADGDHであることができる。
(4)本発明は、配列番号2のアミノ酸配列における(G53H+S167P)、(G53N+S167P)、(G53H+S167P)および(G53N+G163R+V551C)からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、上記(3)に記載の改変型FADGDHであることができる。
(5)本発明は、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の改変型FADGDHをコードする遺伝子であり、さらに、該遺伝子を含むベクターであり、さらに、該ベクターで形質転換された形質転換体であり、さらに、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型FADGDHの製造方法であることができる。
(6)本発明は、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の改変型FADGDHを含むグルコースアッセイキットであり、また、グルコースセンサーであることができる。
(7)本発明は、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の改変型FADGDHを含むグルコース測定方法であることができる。
(8)本発明の(1)に記載の改変型FADGDHは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(FADGDH)よりも五炭糖類に対する作用性が低下している。五炭糖としてはキシロースが例示できる。本発明の(1)に記載の改変型FADGDHは、野生型のFADGDHよりもキシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の5.0%以下である。なお、キシロースに対する作用性とは、グルコースを基質とした場合とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比%(グルコースを1とする)を意味する。
(10)本発明の(1)に記載の改変型FADGDHは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(FADGDH)よりも熱安定性が向上していることが好ましい。本発明の(1)に記載の改変型FADGDHは、50℃、15分間の熱処理後の活性残存率が20%以上であり、好ましくは40%以上であり、更に好ましくは70%以上である。このような安定性を維持することができれば、製剤時に加熱乾燥することが可能となる。
(11)本発明の(1)に記載の改変型FADGDHは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(FADGDH)よりもpH安定性が向上していることが好ましい。本発明の(1)に記載の改変型FADGDHは、pH4.5〜pH7.0において、25℃、16時間処理後の残存活性が80%以上であるか、または、pH4.5〜pH6.5において、25℃、16時間処理後の残存活性が80%以上、好ましくは90%以上である。
That is, the present invention is a modified FADGDH whose substrate specificity and / or stability is improved by modification. It is preferably derived from a eukaryote, more preferably derived from a filamentous fungus, and more preferably derived from an Aspergillus genus.
(1) The present invention is a modified FADGDH having improved substrate specificity over flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH) derived from wild-type Aspergillus oryzae, which is in position 53 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Or a modified FADGDH having an amino acid substitution at an equivalent position.
(2) The present invention has the amino acid substitution at any one of the group consisting of G53H, G53N, G53K, G53M, G53T, G53V and G53C in SEQ ID NO: 2 or a position equivalent thereto (1) The modified FADGDH described in 1. can be used.
(3) The present invention further includes an amino acid substitution at any one or more positions in the group consisting of positions 163, 167, and 551 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or an equivalent position thereof, The modified FADGDH described in (1) can be used.
(4) The present invention has an amino acid substitution in any one of the group consisting of (G53H + S167P), (G53N + S167P), (G53H + S167P) and (G53N + G163R + V551C) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or an equivalent position thereof, The modified FADGDH described in (3) can be used.
(5) The present invention is a gene encoding the modified FADGDH according to any one of (1) to (4) above, and a vector containing the gene, and further transformed with the vector A method for producing a modified FADGDH, which is a transformant and further comprises culturing the transformant.
(6) The present invention is a glucose assay kit including the modified FADGDH described in any of (1) to (4) above, and can be a glucose sensor.
(7) The present invention can be a glucose measurement method including the modified FADGDH described in any of (1) to (4) above.
(8) The modified FADGDH described in (1) of the present invention is less active against pentose than the wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH). An example of the pentose is xylose. The modified FADGDH described in (1) of the present invention has an action on xylose of 5.0% or less of the action on glucose as compared with the wild-type FADGDH. In addition, the effect | action with respect to xylose means the relative ratio% (glucose is set to 1) of the reaction rate when glucose is used as a substrate and xylose is used as a substrate.
(10) It is preferable that the modified FADGDH described in (1) of the present invention has improved thermal stability compared to wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH). In the modified FADGDH described in (1) of the present invention, the residual activity rate after heat treatment at 50 ° C. for 15 minutes is 20% or more, preferably 40% or more, more preferably 70% or more. If such stability can be maintained, it is possible to heat and dry during formulation.
(11) The modified FADGDH described in (1) of the present invention preferably has improved pH stability over the wild-type flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FADGDH). The modified FADGDH according to (1) of the present invention has a residual activity of 80% or more after treatment at 25 ° C. for 16 hours at pH 4.5 to pH 7.0, or pH 4.5 to pH 6.5. The residual activity after treatment at 25 ° C. for 16 hours is 80% or more, preferably 90% or more.

これまで、FADGDHの熱安定性を向上する方策に関する報告としては特許文献3があり、その中で遺伝子レベルでのFADGLD改変手段を用いた検討が報告されている。
しかしながら、FADGDHの基質特異性を向上する方策として遺伝子レベルでの改変は行われていなかった。
WO2008/059777
So far, there is Patent Document 3 as a report on a measure for improving the thermal stability of FADGDH, and studies using FADGLD modification means at the gene level have been reported therein.
However, no modification at the gene level has been performed as a measure for improving the substrate specificity of FADGDH.
WO2008 / 059777

本発明によるFADGDHの基質特異性の向上は測定精度の向上を可能とする。   Improvement of the substrate specificity of FADGDH according to the present invention enables improvement of measurement accuracy.

以下に、本発明の詳細を説明する。   Details of the present invention will be described below.

本発明の一実施形態は、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの5位の窒素原子から半径12オングストローム以内の距離にあるアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体である。(以下、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをFADGDHとも記載する。)   One embodiment of the present invention deletes, substitutes or adds an amino acid within a distance of 12 angstroms in radius from the nitrogen atom at the 5-position of flavin adenine dinucleotide in the amino acid sequence of flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase before modification. By doing so, it is a flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant with improved substrate specificity compared to that before the alteration. (Hereinafter, flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase is also referred to as FADGDH.)

本発明において、改変前のFADGDHは、特に限定されるものではないが、自然界に存在する種々の公知のFADGDHが挙げられる。具体的には、アスペルギルス属、ペニシリウム属由来のものなどが挙げられ、好ましくはアスペルギルス・オリゼ由来のFADGDH、さらに好ましくは配列番号2で示したアスペルギルス・オリゼ由来のFADGDHが挙げられる。配列番号2のFADGDHは特許文献1の方法により取得することが可能である。
特開2007−289148
In the present invention, FADGDH before modification is not particularly limited, and examples thereof include various known FADGDH existing in nature. Specific examples include those derived from the genus Aspergillus and Penicillium, preferably FADGDH derived from Aspergillus oryzae, more preferably FADGDH derived from Aspergillus oryzae represented by SEQ ID NO: 2. FADGDH of SEQ ID NO: 2 can be obtained by the method of Patent Document 1.
JP2007-289148

本発明における、ラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの結晶構造解析結果を図1に示す。 FIG. 1 shows the crystal structure analysis result of rabin adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase in the present invention.

本発明における、ラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの結晶構造解析結果はdiscovery Studio visualizer 2.0(DS visualizer)(Accelrys社)を用いて可視化することができる。 The crystal structure analysis result of rabin adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase in the present invention can be visualized using discovery Studio visualizer 2.0 (DS visualizer) (Accelrys).

本発明における、ラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの結晶構造解析の活性中心の結果を図2に示す。 FIG. 2 shows the result of the active center in the crystal structure analysis of rabin adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase in the present invention.

本発明において、フラビンアデニンジヌクレオチドの5位の窒素から12オングストローム以内の距離にあるアミノ酸とは、改変前のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの活性中心近傍に位置するアミノ酸のことを指す。
活性中心とはdiscovery Studio visualizer 2.0(DS visualizer)(Accelrys社)を用いて、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの立体構造により定義される部位である。フラビンアデニンジヌクレオチドからの距離も同ソフトを用いることで定義できる。
配列番号2のアミノ酸配列を有するFADGDHの立体構造を例示する。これによれば、フラビンアデニンジヌクレオチドの5位の窒素は活性中心に位置する。フラビンアデニンジヌクレオチドの5位の窒素から12オングストローム以内の距離にあるアミノ酸は、基質の出入り口を構成するアミノ酸と定義することができる。基質の出入り口を構成するアミノ酸を、改変前のアミノ酸よりも分子量の大きなアミノ酸に置換することで、基質に対する立体的な障害が起こり、グルコースよりも小さな分子が活性中心に侵入することを制限されることから、この部位を標的として置換を行うことで基質特異性が向上すると考えられる。
このことから、活性中心近傍に位置し、基質の出入り口と考えられる部位を構成するアミノ酸を標的として欠失、置換もしくは付加することが熱安定性を向上させるのに効果的であると考えられる。
活性中心近傍に位置し、基質の出入り口と考えられる部位を構成するアミノ酸とは具体的には53位のアミノ酸を示す。
In the present invention, the amino acid within a distance of 12 angstroms from the nitrogen at the 5-position of flavin adenine dinucleotide refers to an amino acid located near the active center of the flavin adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase before modification.
The active center is a site defined by the three-dimensional structure of a flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase using discovery Studio visualizer 2.0 (DS visualizer) (Accelrys). The distance from flavin adenine dinucleotide can also be defined using the same software.
The three-dimensional structure of FADGDH which has an amino acid sequence of sequence number 2 is illustrated. According to this, the nitrogen at the 5-position of flavin adenine dinucleotide is located at the active center. An amino acid within a distance of 12 angstroms from the nitrogen at position 5 of the flavin adenine dinucleotide can be defined as an amino acid that constitutes the substrate entrance / exit. Substitution of the amino acid that constitutes the entrance / exit of the substrate with an amino acid having a molecular weight larger than that of the amino acid before modification causes a steric hindrance to the substrate and restricts molecules smaller than glucose from entering the active center. Therefore, it is considered that the substrate specificity is improved by performing substitution with this site as a target.
From this, it is considered effective to improve thermal stability by deleting, substituting or adding amino acids that are located in the vicinity of the active center and that constitute the site considered to be the entrance / exit of the substrate.
The amino acid that is located in the vicinity of the active center and that constitutes the site considered to be the entrance / exit of the substrate specifically indicates the 53rd amino acid.

本発明の一実施形態は、改変前のFADGDHのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの5位の窒素原子から半径12オングストローム以内の距離にあるアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して基質特異性が向上したFADGDH改変体であって、改変前のFADGDHのアミノ酸配列の少なくとも1個のアミノ酸が、改変前と比較して、他のアミノ酸に置換していることを特徴とするFADGDH改変体である。   One embodiment of the present invention is modified by deleting, substituting or adding an amino acid within a distance of 12 angstroms radius from the nitrogen atom at the 5-position of flavin adenine dinucleotide in the FADGDH amino acid sequence before modification. A FADGDH variant with improved substrate specificity compared to the previous one, wherein at least one amino acid of the amino acid sequence of FADGDH before the modification is substituted with another amino acid as compared with the previous one It is a characteristic FADGDH variant.

上記で示される本発明のFADGDH改変体は、配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列と50%以上の相同性を有するものであっても良い。配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するものが、さらに好ましい。
また、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するものであっても良い。
The FADGDH variant of the present invention shown above may have 50% or more homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Those having 80% or more homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing are more preferable.
Further, the amino acid sequence of the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase before modification may have the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.

本発明のFADGDHは、配列番号2に記載されたアミノ酸配列を有するFADGDHにおいて、少なくとも1つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有するFADGDH改変体であり、例えば、配列番号2において、53位、または、それらと同等の位置、すなわち他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上したFADGDH改変体である。   The FADGDH of the present invention is a FADGDH variant having a primary structure in which at least one amino acid is substituted, deleted, inserted or added in the FADGDH having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, for example, SEQ ID NO: 2 A modified FADGDH having an amino acid substitution at position 53, or an equivalent position thereof, that is, an equivalent position as described above in another species.

より詳細には、53位及びまたはそれらと同等の位置からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸は、改変前のアミノ酸と比較して分子量が大きいアミノ酸に置換することで、基質特異性を向上することが可能である。
具体的には53位のグリシンがヒスチジン、アスパラギン、リジン、メチオニン、スレオニン、バリン及びシステインに置換したことで、基質の出入り口を狭くしたことにより基質特異性が向上したFADGDH改変体。
More specifically, at least one amino acid selected from the group consisting of position 53 and / or an equivalent position thereof is substituted with an amino acid having a higher molecular weight than the amino acid before modification, thereby improving substrate specificity. It is possible.
Specifically, a FADGDH variant in which substrate specificity is improved by substituting the entrance and exit of the substrate by replacing glycine at position 53 with histidine, asparagine, lysine, methionine, threonine, valine and cysteine.

本発明のFADGDH改変体は、好ましくは、配列番号2のアミノ酸配列における上記で示されるいずれかの位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。
本発明において「配列番号2のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号2のアミノ酸配列と、配列番号2と高い相同性(好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上)のアミノ酸配列を有する他のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼとを、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
The FADGDH variant of the present invention is preferably obtained by amino acid substitution at any position shown above in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
In the present invention, the “position equivalent to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2” means an amino acid sequence having high homology (preferably 50% or more, more preferably 80% or more) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. When the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase derived from other Aspergillus oryzae having the above is aligned in the homology analysis, it means the same position in the alignment.

あるいは、本発明のFADGDH改変体は、好ましくは配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の53位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がG53H、G53N、G53K、G53M、G53T、G53V及びG53Cのいずれかに置換されているFADGDH改変体が例示できる。   Alternatively, the FADGDH variant of the present invention preferably has an amino acid substitution at position 53 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing or an equivalent position thereof as G53H, G53N, G53K, G53M, G53T, G53V and G53C. A FADGDH variant substituted with any one can be exemplified.

あるいは、本発明のFADGDH改変体は、好ましくは配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の53位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換が(G53H+S167P)、(G53N+S167P)、(G53H+S167P)および(G53N+G163R+V551C)及び(K120E+S167P+K369R)からなる群のうちいずれか1つのアミノ酸置換を有するFADGDH改変体が例示できる。   Alternatively, the FADGDH variant of the present invention preferably has (G53H + S167P), (G53N + S167P), (G53H + S167P), (G53N + G163R + V551C) amino acid substitution at position 53 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or an equivalent position thereof. ) And (K120E + S167P + K369R), FADGDH variants having any one amino acid substitution can be exemplified.

本願発明のFADGDH改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号2で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のFADGDHを改変したFADGDH改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するDNAの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するDNAが作成される。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の利用が挙げられる。
The FADGDH variant of the present invention can be prepared by various known means.
Hereinafter, a method for producing a FADGDH variant obtained by modifying FADGDH derived from wild-type Aspergillus oryzae represented by SEQ ID NO: 2 will be exemplified. Although a manufacturing method is not specifically limited, It can manufacture in the procedure as shown below.
As a method for modifying the amino acid sequence constituting flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase, a commonly performed technique for modifying genetic information is used. That is, DNA having genetic information of a modified protein is created by converting a specific base of DNA having genetic information of the protein, or by inserting or deleting a specific base. As a specific method for converting a base sequence in DNA, for example, a commercially available kit (Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech, EXOIII / Mung Bean Deletion Kit; manufactured by Stratagene, Quick Change Site Directed; Alternatively, the polymerase chain reaction (PCR) can be used.

作製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するDNAは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5・、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル(例えばコンピテントハイJM109;東洋紡績製)を用いても良い。   The prepared DNA having the genetic information of the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant is transferred to a host microorganism in a state of being linked to a plasmid, and becomes a transformant that produces the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant. As the plasmid at this time, for example, Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, and the like can be used. As a method for transferring the recombinant vector to the host microorganism, for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to Escherichia coli, a method of transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed. A poration method may be used. Furthermore, a commercially available competent cell (for example, competent high JM109; manufactured by Toyobo) may be used.

なお、これらの過程で得られた、FADGDH改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
配列番号1で示される塩基配列は、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列を示す。また、
配列番号1で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も適用できる。
In addition, the gene encoding the FADGDH variant, the vector containing the gene, and the transformant transformed with the vector obtained in these processes are also included as embodiments of the present invention.
The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 represents the entire sequence of the base sequence encoding the protein having glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae identified by the present inventor. Also,
A base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity is also applicable.

配列番号41で示される塩基配列は、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列にゲノム情報よりシグナルペプチドと推測される塩基配列を付加した配列を示す。また、
配列番号41で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も適用できる。
The base sequence shown in SEQ ID NO: 41 is added to the entire base sequence encoding the protein having glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae identified by the present inventor and added as a signal peptide from genomic information. Sequence is shown. Also,
A base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 under stringent conditions and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity is also applicable.

配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列とは、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列を示す。また、
配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も本発明に適用できる。
The base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 indicates the entire sequence of the base sequence encoding the protein having glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae identified by the present inventors. Also,
A nucleotide sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having glucose dehydrogenase activity can also be applied to the present invention. .

配列番号42で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列とは、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列にゲノム情報よりシグナルペプチドと推測される塩基配列を付加した配列を示す。また、
配列番号42で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も本発明に適用できる。
The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 is the signal peptide identified from the genome information in the entire sequence of the nucleotide sequence encoding the protein having glucose dehydrogenase activity derived from Aspergillus oryzae identified by the present inventors. The sequence to which the base sequence is added is shown. Also,
A nucleotide sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added (inserted) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 and encoding a protein having glucose dehydrogenase activity can also be applied to the present invention. .

本発明の塩基配列は本グルコースデヒドロゲナーゼの発現を向上させるように、コドンユーセージ(Codon usage)を変えたものを含まれる。   The nucleotide sequence of the present invention includes those obtained by changing the codon usage so as to improve the expression of the present glucose dehydrogenase.

こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は6〜48時間程度である。培地pHは菌が発育し買い変体朴質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはpH6.0〜9.0程度である。   The microorganism, which is a transformant thus obtained, can stably produce a large amount of a flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant by culturing in a nutrient medium. The culture form of the host microorganism, which is a transformant, may be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host. Usually, the culture is performed in liquid culture, but industrially, aeration and agitation culture is performed. Is advantageous. As a nutrient source of the medium, those commonly used for culturing microorganisms are widely used. Any carbon compound that can be assimilated may be used as the carbon source. For example, glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, pyruvic acid and the like are used. Any nitrogen compound that can be used may be used for reducing nitrogen, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzed monster, soybean cake alkaline decomposition product, and the like. In addition, phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary. The temperature of the medium can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce a flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant, but in the case of Escherichia coli, it is preferably about 20 to 42 ° C. Although the culture temperature varies slightly depending on the conditions, the culture may be terminated at an appropriate time in consideration of the time when the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours. The medium pH can be appropriately changed within the range in which the bacterium grows and produces a brilliant, but is particularly preferably about pH 6.0 to 9.0.

培養物中のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を可溶化し、水溶液として分離採取する。   Although the culture solution containing the microbial cells producing the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant in the culture can be collected and used as it is, in general, when the modified protein is present in the culture solution, filtration is performed. It is used after separating the flavin adenine-dependent modified glucose dehydrogenase-containing solution and the microbial cells by centrifugation or the like. When the modified protein is present in the microbial cell, the microbial cell is collected from the obtained culture by a technique such as filtration or centrifugation, and then the microbial cell is destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme, If necessary, a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant is added to solubilize the modified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase, and it is separated and collected as an aqueous solution.

このようにして得られたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を得ることができる。   The thus-obtained flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant-containing solution is subjected to, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment such as ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., or a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol. And precipitation by fractional precipitation with acetone or the like. Further, heating processing and east power point processing are also effective generation means. A purified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant can be obtained by gel filtration using an adsorbent or a gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, or affinity chromatography.

グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコースアッセイキット(本発明で「グルコース測定用試薬」と「グルコースアッセイキット」は同義である。)、を特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
Glucose Assay Kit The present invention is also characterized by a glucose assay kit comprising the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to the present invention (in the present invention, “glucose measuring reagent” and “glucose assay kit” are synonymous). To do. The glucose assay kit of the present invention comprises a flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay. Typically, the kit includes the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant of the present invention, as well as buffers necessary for the assay, mediators, a glucose standard solution for creating a calibration curve, and directions for use. The flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to the invention can be provided in various forms, for example as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.

グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
Glucose Sensor The present invention also features a glucose sensor that uses a flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to the present invention. As the electrode, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode. Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or ferrocene or a derivative thereof. It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode together with a representative electron mediator, or a combination thereof may be used. Typically, the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を固定化した電極を用い、対極(例えば白金電極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。   The glucose concentration can be measured as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used. As the working electrode, an electrode on which the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.

本発明において、FAD依存型GDHの活性測定は以下の条件で行う。
[試験例]
<試薬>
50mM PIPES緩衝液pH6.5(0.1%TritonX−100を含む)
163mM PMS溶液
6.8mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
1M D−グルコース溶液
上記PIPES緩衝液15.6ml、DCPIP溶液0.2ml、D―グルコース溶液4mlを混合して反応試薬とする。
In the present invention, the activity of FAD-dependent GDH is measured under the following conditions.
[Test example]
<Reagent>
50 mM PIPES buffer pH 6.5 (including 0.1% Triton X-100)
163 mM PMS solution 6.8 mM 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP) solution 1M D-glucose solution 15.6 ml of the above PIPES buffer solution, 0.2 ml of DCPIP solution, and 4 ml of D-glucose solution are used as reaction reagents. .

<測定条件>
反応試薬3mlを37℃で5分間予備加温する。GDH溶液0.1mlを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってGDH活性を求める。ここでGDH活性における1単位(U)とは、濃度200mMのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量として定義している。

活性(U/ml)=
{−(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.0×希釈倍率}/{16.3×0.1×1.0}

なお、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(ml)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm/マイクロモル)、0.1は酵素溶液の液量(ml)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。
<Measurement conditions>
Pre-warm 3 ml of reaction reagent at 37 ° C. for 5 minutes. After adding 0.1 ml of GDH solution and mixing gently, the absorbance change at 600 nm was recorded for 5 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control, and the absorbance change per minute (ΔOD TEST) ). In the blind test, a change in absorbance per minute (ΔOD BLANK ) is similarly measured by adding a solvent that dissolves GDH to the reagent mixture instead of the GDH solution. From these values, the GDH activity is determined according to the following formula. Here, 1 unit (U) in GDH activity is defined as the amount of enzyme that reduces 1 micromole of DCPIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose.

Activity (U / ml) =
{− (ΔOD TEST −ΔOD BLANK ) × 3.0 × dilution ratio} / {16.3 × 0.1 × 1.0}

In the formula, 3.0 is the amount of the reaction reagent + enzyme solution (ml), 16.3 is the molar molecular extinction coefficient (cm 2 / micromole) under the conditions for this activity measurement, and 0.1 is the solution of the enzyme solution. Amount (ml), 1.0 indicates the optical path length (cm) of the cell.

実施例1:グルコース測定系を用いた改変型FADGDH熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のFADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、改変型FADGDHを約2U/mlになるように酵素希釈液(50mM リン酸カリウム緩衝液(pH5.5)、0.1% TritonX−100)にて溶解したものを50ml用意した。この酵素溶液を1.0mlとしたものを2本用意した。コントロールには、夫々の改変型FADGDH(各種化合物の代わりに蒸留水0.1mlを添加したものを2本用意した。
2本のうち、1本は4℃で保存し、もう1本は、50℃、15分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのFADGDH活性を測定した。各々、4℃で保存したものの酵素活性を100として、50℃、15分間処理後の活性値を比較して活性残存率(%)として算出した。
Example 1: Examination of modified FADGDH thermal stability using glucose measurement system The examination was carried out in accordance with the method for measuring FADGDH activity in the test example described above.
First, 50 ml of a modified FADGDH dissolved in an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer (pH 5.5), 0.1% Triton X-100) so as to be about 2 U / ml was prepared. Two pieces of this enzyme solution in 1.0 ml were prepared. For the control, two modified FADGDHs (in which 0.1 ml of distilled water was added instead of various compounds) were prepared.
Of the two, one was stored at 4 ° C and the other was treated at 50 ° C for 15 minutes. After treatment, the FADGDH activity of each sample was measured. Each was stored at 4 ° C., and the activity value after treatment at 50 ° C. for 15 minutes was compared with the enzyme activity as 100, and the residual activity rate (%) was calculated.

実施例2:FADGDH遺伝子への変異導入
野生型FADGDHをコードする遺伝子(配列番号1)を含む組み換えプラスミドpAOGDH−S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・;TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン(50・g/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl;pH7.3)を摂取し、30℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として53番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号11の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
Example 2: Mutation introduction into FADGDH gene
After transforming a commercially available E. coli competent cell (E. coli DH5; manufactured by TOYOBO) with a recombinant plasmid pAOGDH-S2 containing a gene encoding wild-type FADGDH (SEQ ID NO: 1), the transformant was treated with ampicillin (50 Intake liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl; pH 7.3) containing g / ml (Nacalai Tesque) and culture overnight at 30 ° C. with shaking. Plasmids were prepared from the bacterial cells obtained in the usual manner. QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE) based on the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 11 designed to replace the 53rd glycine with a plurality of types of amino acids using the plasmid as a template The modified FADGDH mutant plasmid having the ability to produce glucose dehydrogenase was prepared according to the protocol, and the plasmid was prepared in the same manner as described above.

実施例3:改変型FADGDHを含む粗酵素液の調整
実施例2で調整したプラスミドpAOGDH−S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・;TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天;pH7.3)に塗布した後、30℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調整した。
Example 3: Preparation of crude enzyme solution containing modified FADGDH The plasmid pAOGDH-S2 prepared in Example 2 was used to transform a commercially available E. coli competent cell (E. coli DH5; manufactured by TOYOBO). Thereafter, the transformant was applied to an agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar; pH 7.3) containing ampicillin, and then overnight at 30 ° C. The colony obtained by shaking culture was further taken into an LB liquid medium containing ampicillin (100 μg / ml) and cultured overnight at 30 ° C. with shaking. Bacteria obtained by centrifugation were collected from a part of the culture solution, and the crude enzyme solution was prepared by crushing the cells with glass beads in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0).

実施例4:基質特異性が向上した変異体のスクリーニング
実施例3の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、7種の基質特異性が向上した変異体を取得した。これら7種の改変体をコードするプラスミドをpAOGDH−M1、pAOGDH−M2、pAOGDH−M3、pAOGDH−M4、pAOGDH−M5、pAOGDH−M6、pAOGDH−M7と命名した。
Example 4: Screening of mutants with improved substrate specificity Using the crude enzyme solution of Example 3, the activity was measured using glucose and xylose as substrates by the activity measuring method described above. Mutants with improved substrate specificity were obtained. Plasmids encoding these seven variants were designated as pAOGDH-M1, pAOGDH-M2, pAOGDH-M3, pAOGDH-M4, pAOGDH-M5, pAOGDH-M6, and pAOGDH-M7.

pAOGDH−M1、pAOGDH−M2、pAOGDH−M3、pAOGDH−M4、pAOGDH−M5、pAOGDH−M6、pAOGDH−M7の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin−Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH−M1で配列番号2記載の53番目のグリシンがシステイン、pAOGDH−M2で配列番号2記載の53番目のグリシンがヒスチジン、pAOGDH−M3で配列番号2記載の53番目のグリシンがリジン、pAOGDH−M4で配列番号2記載の53番目のグリシンがメチオニン、pAOGDH−M5で配列番号2記載の53番目のグリシンがアスパラギン、pAOGDH−M6で配列番号2記載の53番目のグリシンがスレオニン、pAOGDH−M7で配列番号2記載の53番目のグリシンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表1に示す。 pAOGDH-M1, pAOGDH-M2, pAOGDH-M3, pAOGDH-M4, pAOGDH-M5, pAOGDH-M6, pAOGDH-M7 DNA sequencer (ABI PRISMTMlerMelE 3mDNAerP As a result of determining the base sequence of the gene encoding dehydrogenase, the 53rd glycine described in SEQ ID NO: 2 is cysteine in pAOGDH-M1, the 53rd glycine described in SEQ ID NO: 2 is histidine in pAOGDH-M2, and the sequence is histidine in pAOGDH-M3. The 53rd glycine described in No. 2 is lysine, the pAOGDH-M4 is 53th glycine described in SEQ ID NO: 2 is the methionine, the pAOGDH-M5 is the 53rd glycine described in SEQ ID NO: 2. Asparagine, 53 th glycine of SEQ ID NO 2 described pAOGDH-M6 threonine, 53 th glycine of SEQ ID NO 2 described pAOGDH-M7 that was confirmed to have been replaced by valine. The results are shown in Table 1.

実施例5:基質特異性、及び/または、熱安定性が向上した変異体の作製
実施例4で調整したプラスミドpAOGDH−M2を鋳型として、164番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号12の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、pAOGDH−M5を鋳型として、164番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号12の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、pAOGDH−M2を鋳型として、163番目のグリシンをアルギニンに置換するよう設計した配列番号13の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、さらに551番目のバリンをシステインに置換するよう設計した配列番号14の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチドをもとに実施例2の方法と同様に変異操作を行い、基質特異性、及び/または、熱安定性に優れた改変型FADGDHを作製し上記の方法と同様にプラスミドを調整した。変異箇所を同定するため実施例4の方法と同様にDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin−Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH−M8で配列番号2記載の53番目のグリシンがヒスチジンに、167番目のセリンがプロリンに、pAOGDH−M9で配列番号2記載の53番目のグリシンがアスパラギンに、167番目のセリンがプロリンに、pAOGDH−M10で配列番号2記載の53番目のグリシンがアスパラギンに、163番目のグリシンがアルギニンに、551番目のバリンがシステインに置換していることが確認された。実施例4と同様の活性測定法により、グルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、pAOGDH−M8、pAOGDH−M9、pAOGDH−M10は基質特異性が向上していることが確認された。熱安定性を測定するため実施例3の方法と同様に、pAOGDH−M8、pAOGDH−M9、pAOGDH−M10の粗酵素液を調整し、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、pAOGDH−M8、pAOGDH−M9、pAOGDH−M10は熱安定性が向上していることが確認された。結果を表2に示す。
Example 5: Production of mutant with improved substrate specificity and / or thermal stability Using plasmid pAOGDH-M2 prepared in Example 4 as a template, serine at position 164 is replaced with proline. The designed synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 12 and its complementary synthetic oligonucleotide, complementary to the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 12 designed to replace the 164th serine with proline using pAOGDH-M5 as a template New synthetic oligonucleotide, pAOGDH-M2 as a template, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 designed to replace 163rd glycine with arginine, the complementary synthetic oligonucleotide, and the 551th valine with cysteine Synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 14 designed to A modified FADGDH having excellent substrate specificity and / or thermal stability is prepared by performing a mutation operation in the same manner as in the method of Example 2 on the basis of leotide and a synthetic oligonucleotide complementary thereto. The plasmid was prepared in the same manner as above. In order to identify the mutation site, the nucleotide sequence of the gene encoding glucose dehydrogenase was determined with a DNA sequencer (ABI PRISMTM 3700 DNA Analyzer; manufactured by Perkin-Elmer) in the same manner as in Example 4. As a result, pAOGDH-M8 described SEQ ID NO: 2 The 53rd glycine in histidine, the 167th serine in proline, pAOGDH-M9 described in SEQ ID NO: 2 as 53rd glycine in asparagine, the 167th serine in proline, and pAOGDH-M10 as described in SEQ ID NO: 2 It was confirmed that the 53rd glycine was replaced with asparagine, the 163rd glycine was replaced with arginine, and the 551st valine was replaced with cysteine. When activity was measured using glucose and xylose as substrates by the same activity measurement method as in Example 4, it was confirmed that pAOGDH-M8, pAOGDH-M9, and pAOGDH-M10 had improved substrate specificity. In order to measure thermal stability, the crude enzyme solutions of pAOGDH-M8, pAOGDH-M9, and pAOGDH-M10 were prepared in the same manner as in Example 3, and glucose dehydrogenase activity was measured by the activity measurement method described above. The crude enzyme solution was heat treated at 50 ° C. for 15 minutes, and then glucose dehydrogenase activity was measured. It was confirmed that pAOGDH-M8, pAOGDH-M9, and pAOGDH-M10 have improved thermal stability. The results are shown in Table 2.

実施例5:改変型FADGDHの取得
改変型FADGDH生産菌として、pAOGDH−M8、pAOGDH−M9、pAOGDH−M10で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・;TOYOBO社製)を形質転換した。得られた形質転換体を10L容ジャーファーメンターを用いて、TB培地に培養温度25℃で24時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、50mMのリン酸バッファー(pH6.5)に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を50mMのリン酸バッファー(pH6.5)に再溶解させた。そしてG−25セファロースカラムによるゲルろ過、Octyl−セファロースカラムおよびPhenyl−セファロースカラムによる疎水クロマト(溶出条件は共に25%飽和〜0%の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出)を実施し、さらにG−25セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型FADGDHサンプルとした。表3に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
Example 5: Obtaining modified FADGDH As modified FADGDH producing bacteria, Escherichia coli competent cells (E. coli DH5; manufactured by TOYOBO) commercially available as pAOGDH-M8, pAOGDH-M9, and pAOGDH-M10 were used. Transformed. The obtained transformant was cultured in a TB medium at a culture temperature of 25 ° C. for 24 hours using a 10 L jar fermenter. The cultured cells were collected by centrifugation, suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5), treated with nucleic acid, and centrifuged to obtain a supernatant. A saturated amount of ammonium sulfate was dissolved therein to precipitate the target protein, and the precipitate collected by centrifugation was redissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5). Then, gel filtration using a G-25 Sepharose column, hydrophobic chromatography using an Octyl-Sepharose column and a Phenyl-Sepharose column (both elution conditions were extracted with a 25% saturated to 0% ammonium sulfate concentration gradient), and Ammonium sulfate was removed by gel filtration using a G-25 Sepharose column to obtain a modified FADGDH sample. As shown in Table 3, it was confirmed that the thermal stability of the purified sample was also improved.

実施例6:pH安定性
実施例5で得た精製標品についてpH安定性を知るために、pH3.5〜8.5の範囲の緩衝液(pH3.5〜6.3:0.1M 酢酸バッファー、pH6.3〜7.3、0.1M PIPESバッファー、pH7.3〜8.5:0.1M トリス塩酸バッファー、pH6.0〜7.7:0.1M リン酸バッファー)を調製し、これらを用いて各GDHを酵素濃度1U/mlとなるよう希釈した。希釈液を25℃で16時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図3に示す。図3に示すようにpH安定域の幅が広がっていることが確認された。
Example 6: pH stability To know the pH stability of the purified preparation obtained in Example 5, a buffer solution in the range of pH 3.5 to 8.5 (pH 3.5 to 6.3: 0.1 M acetic acid). Buffer, pH 6.3 to 7.3, 0.1 M PIPES buffer, pH 7.3 to 8.5: 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 6.0 to 7.7: 0.1 M phosphate buffer) Using these, each GDH was diluted to an enzyme concentration of 1 U / ml. The diluted solution was incubated at 25 ° C. for 16 hours to compare the activity before and after the incubation. A graph showing the activity remaining rate after incubation with respect to the activity before incubation is shown in FIG. As shown in FIG. 3, it was confirmed that the width of the pH stable region was widened.

本発明によるFADGDHの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。   The improved stability of FADGDH according to the present invention reduces the heat inactivation of the enzyme during preparation of a glucose measurement reagent, glucose assay kit, and glucose sensor, thereby enabling a reduction in the amount of the enzyme used and improvement in measurement accuracy. It contributes greatly to industries such as related fields.

フラビンアデニンジムクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶構造解析(全体図)Crystal structure analysis of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (overall view) フラビンアデニンジムクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶構造解析(活性中心)Crystal structure analysis of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (active center) WT(野生型)、改変型FADGDH精製標品のpH安定性を示す。pH3.5〜6.3:酢酸バッファー、pH6.3〜7.3、PIPESバッファー、pH7.3〜8.8:トリス塩酸バッファー、pH6.0〜7.7:リン酸バッファーをそれぞれ用いた。The pH stability of WT (wild type) and modified FADGDH purified preparations is shown. pH 3.5 to 6.3: acetate buffer, pH 6.3 to 7.3, PIPES buffer, pH 7.3 to 8.8: Tris-HCl buffer, pH 6.0 to 7.7: phosphate buffer were used, respectively.

Claims (14)

改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの5位の窒素原子から半径12オングストローム以内の距離にあるアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。 Compared to the amino acid sequence of flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase before modification by deleting, substituting or adding an amino acid within a radius of 12 angstroms from the nitrogen atom at position 5 of flavin adenine dinucleotide. And a modified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase with improved substrate specificity. 改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の少なくとも1個のアミノ酸が、改変前と比較して、他のアミノ酸に置換していることを特徴とする請求項1記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。 The flavin adenine-dependent glucose according to claim 1, wherein at least one amino acid in the amino acid sequence of the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase before modification is substituted with another amino acid as compared with that before modification. Dehydrogenase variant. 改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の少なくとも1個のアミノ酸が、改変前と比較して、分子量の大きなアミノ酸に置換していることを特徴とする請求項1記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。 2. The flavin adenine-dependent amino acid sequence according to claim 1, wherein at least one amino acid in the amino acid sequence of the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase before modification is substituted with an amino acid having a higher molecular weight than before modification. Modified glucose dehydrogenase. 改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項1記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。 The modified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase according to claim 1, wherein the amino acid sequence of the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase before modification has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. 配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の53位またはそれと同等の位置からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。 5. The amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein at least one amino acid selected from the group consisting of position 53 or a position equivalent thereto is substituted with another amino acid. The flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to any one of the above. 配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の53位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がG53C、G53H、G53K、G53M、G53N、G53T及びG53Vからなる群のうちいずれか1つのアミノ酸置換を有する請求項1〜4のいずれか1項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。 The amino acid substitution at position 53 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing or a position equivalent thereto has any one amino acid substitution selected from the group consisting of G53C, G53H, G53K, G53M, G53N, G53T and G53V The flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to any one of claims 1 to 4. 配列表の配列番号2のアミノ酸配列における(G53H+S167P)、(G53N+S167P)、(G53H+S167P)および(G53N+G163R+V551C)からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の改変型フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。 It has an amino acid substitution at any position in the group consisting of (G53H + S167P), (G53N + S167P), (G53H + S167P) and (G53N + G163R + V551C) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an equivalent position thereof. The modified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to any one of the above. 請求項1〜7のいずれか1項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子。 A gene encoding the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant described in any one of claims 1 to 7. 請求項1〜7のいずれか1項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子を含むベクター。 A vector comprising a gene encoding the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant described in any one of claims 1 to 7. 請求項9に記載のベクターで形質転換された形質転換体。 A transformant transformed with the vector according to claim 9. 請求項10に記載の形質転換体を培養し、該培養物からフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法。 A method for producing a modified flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase, comprising culturing the transformant according to claim 10 and collecting flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase from the culture. 請求項1〜7項のいずれか1項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコース測定用試薬。 A reagent for measuring glucose comprising the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to any one of claims 1 to 7. 請求項1〜7項のいずれか1項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコースセンサ。 A glucose sensor comprising the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant according to any one of claims 1 to 7. 請求項1〜7項のいずれか1項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を用いるグルコース測定方法。 A glucose measurement method using the flavin adenine-dependent glucose dehydrogenase variant described in any one of claims 1 to 7.
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011217731A (en) * 2010-03-26 2011-11-04 Toyobo Co Ltd Modified flavine-adenine-dinucleotide dependent glucose dehydrogenase
JP2012029677A (en) * 2010-07-08 2012-02-16 Toyobo Co Ltd Method for modifying substrate specificity of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
JP2012191882A (en) * 2011-03-16 2012-10-11 Toyobo Co Ltd Method for improving stability of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
WO2013065770A1 (en) * 2011-11-02 2013-05-10 キッコーマン株式会社 Flavin-bound glucose dehydrogenase having improved substrate specificity
JPWO2012169512A1 (en) * 2011-06-07 2015-02-23 キッコーマン株式会社 Flavin-binding glucose dehydrogenase, method for producing flavin-binding glucose dehydrogenase, and method for measuring glucose using the same
WO2015099112A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-02 キッコーマン株式会社 Flavin-binding glucose dehydrogenase exhibiting improved heat stability
US9238802B2 (en) 2010-12-01 2016-01-19 Kikkoman Corporation E. coli transformant, method for producing flavin-bound glucose dehydrogenase using the same, and mutant flavin-bound glucose dehydrogenases
US9469844B2 (en) 2010-12-02 2016-10-18 Kikkoman Corporation Flavin-bound glucose dehydrogenases, a method for producing a flavin-bound glucose dehydrogenase, and yeast transformant used for the same
EP3112461A4 (en) * 2014-02-28 2017-08-09 Kikkoman Corporation Flavin-binding glucose dehydrogenase having improved specific activity
CN108251389A (en) * 2017-08-18 2018-07-06 青岛蔚蓝生物集团有限公司 The glucose oxidase mutant that a kind of heat resistance improves

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011217731A (en) * 2010-03-26 2011-11-04 Toyobo Co Ltd Modified flavine-adenine-dinucleotide dependent glucose dehydrogenase
JP2012029677A (en) * 2010-07-08 2012-02-16 Toyobo Co Ltd Method for modifying substrate specificity of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
US9238802B2 (en) 2010-12-01 2016-01-19 Kikkoman Corporation E. coli transformant, method for producing flavin-bound glucose dehydrogenase using the same, and mutant flavin-bound glucose dehydrogenases
US9469844B2 (en) 2010-12-02 2016-10-18 Kikkoman Corporation Flavin-bound glucose dehydrogenases, a method for producing a flavin-bound glucose dehydrogenase, and yeast transformant used for the same
JP2012191882A (en) * 2011-03-16 2012-10-11 Toyobo Co Ltd Method for improving stability of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase
US9074239B2 (en) 2011-06-07 2015-07-07 Kikkoman Corporation Flavin-binding glucose dehydrogenase, method for producing flavin-binding glucose dehydrogenase, and glucose measurement method
JPWO2012169512A1 (en) * 2011-06-07 2015-02-23 キッコーマン株式会社 Flavin-binding glucose dehydrogenase, method for producing flavin-binding glucose dehydrogenase, and method for measuring glucose using the same
WO2013065770A1 (en) * 2011-11-02 2013-05-10 キッコーマン株式会社 Flavin-bound glucose dehydrogenase having improved substrate specificity
JPWO2013065770A1 (en) * 2011-11-02 2015-04-02 キッコーマン株式会社 Flavin-binding glucose dehydrogenase with improved substrate specificity
US9493814B2 (en) 2011-11-02 2016-11-15 Kikkoman Corporation Flavin-binding glucose dehydrogenase having improved substrate specificity
WO2015099112A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-02 キッコーマン株式会社 Flavin-binding glucose dehydrogenase exhibiting improved heat stability
JPWO2015099112A1 (en) * 2013-12-27 2017-03-23 キッコーマン株式会社 Flavin-binding glucose dehydrogenase with improved thermostability
EP3112461A4 (en) * 2014-02-28 2017-08-09 Kikkoman Corporation Flavin-binding glucose dehydrogenase having improved specific activity
CN108251389A (en) * 2017-08-18 2018-07-06 青岛蔚蓝生物集团有限公司 The glucose oxidase mutant that a kind of heat resistance improves

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