JP2010030955A - Antimutagenic agent, production process and usage therefore - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a composition in the form capable of developing an antimutagenic agent containing an ingredient which can strongly inhibit mutagenic properties due to mutagenic substances, and capable of using the antimutagenic agent industrially effectively. <P>SOLUTION: The antimutagenic agent contains, as an effective ingredient, an ampholyte-containing fraction obtained through ion exchange chromatofocusing of a soluble material separated from a hot water-extract of Agaricus blazei Murrill with hydrous ethanol, the ampholyte-containing fraction having more preferably a molecular weight in a range of 120-280, or a fraction containing saccharides and an acidic substance. Foods and beverages, feedstuffs and medicines each containing the antimutagenic agent are also provided. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、特定の抗変異原性成分を含有してなる抗変異原性剤、その製造方法並びに利用に関する。   The present invention relates to an antimutagenic agent comprising a specific antimutagenic component, a method for producing the same, and use thereof.

生物の遺伝子や染色体に変異を生じさせ、生体の細胞や組織の異常、癌などの疾病をもたらす因子を変異原、変異原物質、変異原性物質あるいは遺伝毒性物質といい、その変異又は遺伝毒性の性質や作用を変異原性という。日常生活環境の中には数多くの変異原が存在し、例えば、自然界には放射線、紫外線、活性酸素等があり、化学物質としてダイオキシンやフタル酸エステル類等があり、又、食品原料の加工や調理、食品の摂取、喫煙等によって生じるニトロソ化合物、ベンツピレン、トリプトファン分解物等が知られている。   Factors that cause mutations in the genes and chromosomes of living organisms and cause abnormalities in cells and tissues in the body, diseases such as cancer are called mutagens, mutagens, mutagens, or genotoxic substances. The nature and action of is called mutagenicity. There are many mutagens in the daily living environment, for example, there are radiation, ultraviolet rays, active oxygen, etc. in nature, and there are dioxins and phthalates as chemical substances. Nitroso compounds, benzpyrene, tryptophan degradation products, and the like generated by cooking, food intake, smoking and the like are known.

一方、このような変異原物質の変異原性の発現を抑制ないしは防止する作用のある物質や成分の開発は従来から検討されており、日常的に摂取する食品や食材の中にそのような有用成分が含まれていることも公知である。野菜や果物のビタミンＣ、β−カロテン、クエルセチン等が一例であり、又、食用キノコ類に代表される担子菌類にも変異原性抑制効果のある成分が存在するといわれている。すなわち、アガリクス・ブラジー子実体から抽出した遊離不飽和脂肪酸がベンゾ〔ａ〕ピレンに対して抗変異原性作用を有すること（特許文献１）、霊芝等の食用担子菌類又はその抽出物と補助物質との組み合せがＴｒｐ−Ｐ２（３−アミノ−１−メチル−５Ｈ−ピリド〔４，３−ｂ〕インドール）に対して抗変異原性を有すること（特許文献２）、又、カワリハラタケの子実体の熱水抽出物を透析した外液をクロマトグラフィー分画して得られる画分が発癌物質であるウレタン（カルバミン酸エチル）、ＮＮＫ〔（４−Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン〕の変異原性を抑制し、ＡＯＭ（アゾキシメタン）による腫瘍を抑制すること（特許文献３）等が提案されている。   On the other hand, the development of substances and components that have the action of suppressing or preventing the mutagenicity of such mutagens has been studied in the past, and such useful substances are used in foods and foods that are consumed daily. It is also known that ingredients are included. Vitamin C, β-carotene, quercetin, and the like of vegetables and fruits are examples, and basidiomycetes represented by edible mushrooms are said to contain components having a mutagenicity-inhibiting effect. That is, free unsaturated fatty acid extracted from the fruiting body of Agaricus brazi has an antimutagenic action on benzo [a] pyrene (Patent Document 1), edible basidiomycetes such as Ganoderma lucidum or its extract and supplement The combination with a substance has antimutagenicity against Trp-P2 (3-amino-1-methyl-5H-pyrido [4,3-b] indole) (Patent Document 2), and The fraction obtained by chromatographic fractionation of the external liquid obtained by dialyzing the hot water extract of the substance is a carcinogen such as urethane (ethyl carbamate), NNK [(4-N-methyl-N-nitrosamino) -1 It has been proposed to suppress the mutagenicity of-(3-pyridyl) -1-butanone] and suppress tumors caused by AOM (azoxymethane) (Patent Document 3).

アガリクス茸はハラタケ科のキノコの一種であり、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）に属し、代表的な例としてアガリクス ブラゼイ ムリル（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ）、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）等がある。アガリクス ブラゼイ ムリルはブラジル原産の茸で、カワリハラタケ、ヒメマツタケ等ともよばれ、近年、我国でも人工栽培されるようになり、栄養補助食品等の原料として利用されて食用に供されている。その含有成分である多糖体（β−グルカン）や多糖蛋白複合体は抗腫瘍増殖抑制、免疫増強、血糖値低減等の作用を有することが知られている。マッシュルームはツクリタケ、シャンピニオン等の別名をもち、一般の食材として利用されており、その抽出物は活性酸素消去能を有するといわれている。
特開平６−９０７７３号公報 特開平８−２６６２４６号公報 再公表ＷＯ２００４／００４７４８号公報 Agaricus mushroom is a kind of agaric mushroom, belongs to the genus Agaricus, and typical examples include Agaricus blazei Murrill, mushroom (Agaricus bisporus) and the like. Agaricus blazei murril is a potato native to Brazil, also known as Kawariharatake, Himematsutake, etc., and has recently been artificially cultivated in Japan, and is used as a food supplement for food. It is known that polysaccharides (β-glucan) and polysaccharide protein complexes, which are contained components, have actions such as antitumor growth inhibition, immune enhancement, and blood glucose level reduction. Mushrooms have other names such as tsutsutake mushrooms and champignons and are used as general foods, and the extract is said to have an active oxygen scavenging ability.
Japanese Unexamined Patent Publication No. 6-90773 JP-A-8-266246 Republished WO2004 / 004748

前述の変異原性抑制作用を有するものは、一般的に、ある特定の変異原物質に対してその変異原性を抑制する効果を奏するが、他種の変異原物質については所望の効果を発現しないことが多く、変異原物質の変異原性を阻害する作用機序も普遍的に解明されているとはいえず、抗変異原物質の変異原性抑制効果の汎用性を予測することは困難であるとされていた。又、野菜、果物、キノコ類等の食品原料に抗変異原性を示す有用成分が存在することは知られていても、該原料に含有される変異原性抑制成分は通常極微量であり、該成分が特定されている知見は少なく、しかも天産物であるがゆえに産地や収穫時期による前記有用成分のばらつきが大きく、抽出物や精製物に加工処理する場合でも製造コストが高くなる等、前記有用成分は必ずしも産業的に有効活用されていなかったのが実情である。   Those having the above-mentioned mutagenicity-inhibiting action generally have the effect of suppressing the mutagenicity of a specific mutagen, but exhibit the desired effect for other types of mutagens. In many cases, the mechanism of action that inhibits the mutagenicity of mutagens has not been universally elucidated, and it is difficult to predict the versatility of antimutagenic mutagenicity-inhibiting effects. It was supposed to be. In addition, even though it is known that useful ingredients showing antimutagenicity are present in food materials such as vegetables, fruits, mushrooms, etc., the mutagenicity suppressing component contained in the raw materials is usually extremely small, There is little knowledge that the component is specified, and because it is a natural product, there is a large variation in the useful component depending on the production area and harvest time, and the manufacturing cost increases even when processed into an extract or purified product. The fact is that useful components have not necessarily been effectively utilized industrially.

かかる現状に鑑み、本発明者らは、とりわけ飲食物に関連する変異原物質による変異原性を顕著に抑制ないし防止することができる変異原性抑制剤を開発し、これを産業上有効に活用できる態様の組成物を提供することを課題とした。   In view of the current situation, the present inventors have developed a mutagenic inhibitor that can remarkably suppress or prevent mutagenicity caused by mutagens particularly related to food and drink, and effectively utilize this industrially. It was made into the subject to provide the composition of the aspect which can be performed.

上記課題を達成するために、本発明者らは、アガリクス茸に含まれる抗変異原性成分について鋭意検討を重ねた結果、アガリクス茸を特定の方法で処理することによって顕著な変異原性抑制効果を奏する成分が得られることを知見し、又、これを飲食品、飼料、医薬品等の産業分野において有効利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。   In order to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have made extensive studies on the anti-mutagenic component contained in Agaricus moth, and as a result, treated with Agaricus moth in a specific manner, has a remarkable mutagenicity suppressing effect. It has been found that a component exhibiting the above can be obtained, and it has been found that it can be effectively used in industrial fields such as foods, drinks, feeds, pharmaceuticals, etc., and the present invention has been completed.

すなわち、本発明の課題は、（ａ）アガリクス茸を熱水で抽出する第１工程、（ｂ）第１工程で得られる熱水抽出物を含水率が１０〜６０質量％の含水エタノールで抽出する第２工程、（ｃ）第２工程で得られる含水エタノール可溶物をイオン交換クロマトグラフィーで分画する第３工程、及び、（ｄ）第３工程で分取した両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を採取する第４工程を経て得られる、両性電解質、又は、糖類及び酸性物質を有効成分とする抗変異原性剤を提供することによって達成される。   That is, the object of the present invention is to extract (a) the first step of extracting agaricus koji with hot water, (b) extracting the hot water extract obtained in the first step with water-containing ethanol having a water content of 10 to 60% by mass. The second step, (c) the third step of fractionating the water-soluble ethanol-soluble material obtained in the second step by ion exchange chromatography, and (d) the amphoteric electrolyte-containing fraction fractionated in the third step, Alternatively, it is achieved by providing an amphoteric electrolyte obtained through the fourth step of collecting a saccharide and acidic substance-containing fraction, or an antimutagenic agent containing saccharide and acidic substance as active ingredients.

ここで、前記第２工程における含水エタノールの含水率は２０〜４０質量％であることが望ましい。又、前記第４工程における両性電解質含有画分の主成分は分子量が１２０から２８０の範囲に属するものであることが望ましい。さらには、前記抗変異原性剤が対象とする変異原物質はＮ−ニトロソジメチルアミン（以下、ＮＤＭＡと略記する）又はＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＭＮＮＧと略記する）であることが望ましい。   Here, the water content of the water-containing ethanol in the second step is preferably 20 to 40% by mass. The main component of the amphoteric electrolyte-containing fraction in the fourth step preferably has a molecular weight in the range of 120 to 280. Further, the mutagen targeted by the anti-mutagenic agent is N-nitrosodimethylamine (hereinafter abbreviated as NDMA) or N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (hereinafter abbreviated as MNNG). It is desirable that

また、本発明によれば、上記課題を達成するために、次の（ａ）〜（ｄ）に示す工程、すなわち、（ａ）アガリクス茸を熱水で抽出する第１工程、（ｂ）第１工程で得られる熱水抽出物を含水率が１０〜６０質量％の含水エタノールで抽出する第２工程、（ｃ）第２工程で得られる含水エタノール可溶物をイオン交換クロマトグラフィーで分画する第３工程、次いで（ｄ）第３工程で分取した両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を採取する第４工程を経て得られる両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を有効成分として含有させて製造することを特徴とする抗変異原性剤の製造方法が提供される。   Moreover, according to this invention, in order to achieve the said subject, the process shown to following (a)-(d), ie, (a) 1st process of extracting Agaricus soup with hot water, (b) 1st The second step of extracting the hot water extract obtained in one step with water-containing ethanol having a water content of 10 to 60% by mass, (c) fractionation of the water-soluble ethanol soluble product obtained in the second step by ion exchange chromatography Step (3), and then (d) the amphoteric electrolyte-containing fraction collected in the third step, or the amphoteric electrolyte-containing fraction or saccharide obtained through the fourth step of collecting the saccharide and acidic substance-containing fraction. And a method for producing an antimutagenic agent, comprising producing an acidic substance-containing fraction as an active ingredient.

この製造方法においては、前記第２工程における含水エタノールの含水率は２０〜４０質量％であることが望ましく、前記第４工程における両性電解質画分の主成分は分子量が１２０から２８０の範囲に属するものであることが望ましく、又、前記抗変異原性剤が対象とする変異原物質はＮＤＭＡ又はＭＮＮＧであることが望ましい。   In this production method, the water content of the water-containing ethanol in the second step is preferably 20 to 40% by mass, and the main component of the amphoteric electrolyte fraction in the fourth step belongs to a molecular weight range of 120 to 280. It is desirable that the mutagen targeted by the antimutagenic agent is NDMA or MNNG.

更に、本発明によれば、前記の抗変異原性剤を含有してなることを特徴とする飲食品、飼料又は医薬品が提供される。   Furthermore, according to this invention, the food-drinks, feed, or pharmaceutical characterized by including the said antimutagenic agent are provided.

本発明により、従来から飲食に供されているアガリクス茸を原料として、これに含まれる両性電解質を含有する画分、より好適には分子量が１２０から２８０の範囲に属するもの、さらに望ましくは分子量が１２３及び／又は１３７、２４２、又は、２６０であり、最も望ましくは分子量が２６０の成分、又は、糖類及び酸性物質を含有する画分を有効成分として含む抗変異原性剤が提供される。この抗変異原性剤は、その有効成分が前記両性電解質含有画分であるとき、とりわけ、畜肉類や魚介類の焼き焦げ部分に含まれ、継続的に多量摂取すれば肝臓や腎臓の発癌イニシエーターとして作用するＮＤＭＡの変異原性を顕著に抑制する効果を奏する。又、有効成分が前記糖類及び酸性物質含有画分であるとき、とりわけ、ＮＤＭＡと同じくニトロソ化合物の一種であり、胃癌や大腸癌を誘発する発癌物質であることが知られているＭＮＮＧの変異原性を阻害する作用を有する。このため、本発明の抗変異原性剤は、飲食品、飼料、医薬品等の分野において、これをそのままの形態又は従来の各種製品に含有せしめた形態にして、とくにＮＤＭＡあるいはＭＮＮＧによって誘発される変異原性の抑制や染色体異常、身体器官の異常、発癌等を予防するために有効利用することができる。   According to the present invention, a fraction containing an amphoteric electrolyte contained in agaricus koji that has been conventionally used for food and drink, more preferably a fraction having a molecular weight in the range of 120 to 280, more preferably a molecular weight. 123 and / or 137, 242, or 260, and most preferably, an antimutagenic agent comprising a component having a molecular weight of 260 or a fraction containing a saccharide and an acidic substance as an active ingredient is provided. When the active ingredient is the amphoteric electrolyte-containing fraction, this antimutagenic agent is contained especially in the burned portions of livestock meat and seafood, and carcinogenic initiation of the liver and kidneys if continuously ingested in large quantities. It has the effect of remarkably suppressing the mutagenicity of NDMA acting as an agent. In addition, when the active ingredient is the above-mentioned fraction containing saccharides and acidic substances, MNNG mutagen, which is a kind of nitroso compound as well as NDMA, and is known to be a carcinogen that induces gastric cancer and colon cancer. Has the effect of inhibiting sex. Therefore, the antimutagenic agent of the present invention is induced by NDMA or MNNG, particularly in the fields of foods and drinks, feeds, pharmaceuticals, etc., in the form as it is or contained in various conventional products. It can be effectively used to prevent mutagenicity, chromosomal abnormalities, body organ abnormalities, carcinogenesis, and the like.

以下に本発明を詳細に説明する。先ず、本発明の抗変異原性剤は、次に示す工程（ａ）〜（ｄ）を経て採取される両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を有効成分として含むことに特徴がある。
（ａ）アガリクス茸を熱水で抽出する第１工程
（ｂ）第１工程で得られる熱水抽出物を含水率が１０〜６０質量％の含水エタノールで抽出する第２工程
（ｃ）第２工程で得られる含水エタノール可溶物をイオン交換クロマトグラフィーで分画する第３工程
（ｄ）第３工程で分取した両性電解質を含有する画分、又は、糖類及び酸性物質を含有する画分を採取する第４工程 The present invention is described in detail below. First, the antimutagenic agent of the present invention contains an amphoteric electrolyte-containing fraction collected through the following steps (a) to (d), or a saccharide and acidic substance-containing fraction as an active ingredient. There are features.
(A) First step of extracting Agaricus koji with hot water (b) Second step of extracting the hot water extract obtained in the first step with hydrous ethanol having a water content of 10 to 60% by mass (c) Second Fraction containing the amphoteric electrolyte fractionated in the third step (d) third step, or fraction containing saccharides and acidic substances, fractionating the aqueous ethanol-soluble material obtained in the step by ion exchange chromatography The fourth step to collect

第１工程において、アガリクス茸はアガリクス ブラゼイ ムリルやマッシュルーム等のアガリクス属に属する担子菌の子実体あるいは菌糸体を用いることができるが、アガリクス ブラゼイ ムリルの子実体がより好適である。   In the first step, the fruit body of a basidiomycete belonging to the genus Agaricus such as Agaricus brazeimuril or mushroom or mycelium can be used as the Agaricus spp., But the fruit body of Agaricus brazeimril is more preferred.

第１工程では、アガリクス茸を熱水抽出して熱水抽出物を製造する。より詳細には、アガリクス茸の子実体の生又は乾燥物を適宜に凍結破砕、裁断、衝撃破壊、酵素による細胞壁分解等の処理に供して破砕、細断、粉砕あるいは細胞壁部分分解し、この質量に対して１〜５０倍容量、より好ましくは２〜２０倍容量の水を加えて約４０℃以上、望ましくは８０〜９５℃に加熱し、又は、同温の熱水を加えて、常圧下若しくは常圧に０．１〜５気圧を加圧した状態で、より好ましくは常圧に０．５〜３気圧を加圧した状態で、適宜に撹拌しながら、約１０分〜２４時間、より好ましくは３０分〜５時間抽出処理する。このとき、前記条件の加圧下で処理を行えば抽出物の収量が増え、又、中性ないしｐＨ９程度までの水を用いることにより本発明の所望の効果の高い抽出物を得ることが可能となる。かかる抽出処理後、残渣を濾別して抽出液を得る。尚、この抽出残渣に水を加えて同様に処理して二次抽出液を得ることもでき、該操作を数回程度繰り返してもよい。得られた抽出液を併せて、必要に応じて中和処理し、濃縮、噴霧乾燥あるいは凍結乾燥等の処理を施して本発明に係る熱水抽出物を得ることができる。   In the first step, agaricus koji is extracted with hot water to produce a hot water extract. In more detail, the raw or dried product of the fruit body of Agaricus persimmon is appropriately subjected to freezing crushing, cutting, impact breaking, enzymatic cell wall degradation, etc., and crushing, chopping, crushing or cell wall partial degradation, and this mass 1 to 50 times the volume of water, more preferably 2 to 20 times the volume of water and about 40 ° C. or higher, preferably 80 to 95 ° C., or hot water of the same temperature is added to Alternatively, in a state where 0.1 to 5 atmospheres is pressurized to normal pressure, more preferably in a state where 0.5 to 3 atmospheres is pressurized to normal pressure, with appropriate stirring, about 10 minutes to 24 hours, Preferably, extraction is performed for 30 minutes to 5 hours. At this time, if the treatment is performed under pressure under the above conditions, the yield of the extract is increased, and it is possible to obtain an extract having a high desired effect of the present invention by using water from neutral to pH 9 or so. Become. After such extraction treatment, the residue is filtered to obtain an extract. In addition, a secondary extract can be obtained by adding water to the extraction residue and treating in the same manner, and the operation may be repeated several times. The obtained extract is combined, neutralized as necessary, and subjected to treatment such as concentration, spray drying, or freeze drying to obtain the hot water extract according to the present invention.

第２工程では、前記熱水抽出物に含水率が１０〜６０質量％の含水エタノールを加えて抽出処理し、該含水エタノールに可溶の成分を分取する。すなわち、前記熱水抽出物の質量に対して前記含水率の含水エタノール、より好適には含水率が２０〜４０質量％、更に望ましくは２５〜３５質量％、最も望ましくは含水率が３０質量％の含水エタノールを２〜１０倍容量添加し、常圧下、常温〜沸点以下の温度で１０分〜１２時間、適宜に撹拌して、生じた沈殿物をフィルター濾過、遠心分離等の処理に供して除き、可溶分を採取し、脱溶媒して本発明に係る含水エタノール可溶物を得る。   In the second step, water-containing ethanol having a water content of 10 to 60% by mass is added to the hot water extract for extraction treatment, and components soluble in the water-containing ethanol are collected. That is, water-containing ethanol having the water content with respect to the mass of the hot water extract, more preferably the water content is 20 to 40% by weight, more preferably 25 to 35% by weight, and most preferably the water content is 30% by weight. 2-10 times the volume of water-containing ethanol is added, and the mixture is stirred appropriately at normal temperature to a temperature below the boiling point for 10 minutes to 12 hours, and the resulting precipitate is subjected to processing such as filter filtration and centrifugation. The soluble component is collected, and the solvent is removed to obtain the water-soluble ethanol-soluble material according to the present invention.

第３工程では、前工程で得られる含水エタノール可溶物をイオン交換クロマトグラフィーに供して分画する。このイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いて成分を分画することをいい、前記イオン交換樹脂を充填したカラムに原料を供し、溶媒を通液して分画成分を順次溶出させ分取する態様が好適である。この際、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂は公知のものを用いることができ、それぞれを常法により予め活性化し、硝子製、ステンレス製等の適当なカラムに充填して使用する。
第４工程では、前記工程で分取した画分を溶媒除去、濃縮、凍結乾燥等を行なうことにより、両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を採取する。 In the third step, the water-containing ethanol-soluble material obtained in the previous step is subjected to ion exchange chromatography and fractionated. In this ion exchange chromatography, the components are fractionated using a cation exchange resin and an anion exchange resin. The raw material is supplied to a column packed with the ion exchange resin, and a solvent is passed through to separate the fraction components. A mode in which elution is carried out sequentially is preferred. At this time, known cation exchange resins and anion exchange resins can be used, and each of them is activated in advance by a conventional method, and is used after being packed in an appropriate column made of glass or stainless steel.
In the fourth step, the fraction collected in the above step is subjected to solvent removal, concentration, lyophilization and the like, thereby collecting an amphoteric electrolyte-containing fraction or a saccharide and acidic substance-containing fraction.

第３工程及び第４工程としては、例えば、次のような手段及び手順を採用することができる。すなわち、第２工程で得られる含水エタノール可溶物を０．１〜１０質量％濃度に溶解した水溶液とし、これを活性化済みの陽イオン交換樹脂カラムに供し、所定濃度（ｐＨ１〜３）の酸性溶媒で溶出する成分を集め、溶媒除去、凍結乾燥して糖類及び酸性物質画分として採取する。次いで、所定濃度の塩基性溶媒（ｐＨ１０〜１３）を用いて上記酸性溶媒で溶出しなかった非溶出成分を溶出させて集め、溶媒除去、濃縮、凍結乾燥して以下の陰イオン交換樹脂による分画のための試料とする。   As the third step and the fourth step, for example, the following means and procedures can be employed. That is, the aqueous ethanol-soluble material obtained in the second step is an aqueous solution in which the concentration is 0.1 to 10% by mass, which is applied to an activated cation exchange resin column, and has a predetermined concentration (pH 1 to 3). Ingredients that elute with an acidic solvent are collected, removed by solvent, and lyophilized, and collected as a saccharide and acidic substance fraction. Next, a non-eluting component that was not eluted with the above acidic solvent was eluted and collected using a basic solvent (pH 10 to 13) at a predetermined concentration, and the solvent was removed, concentrated, and lyophilized. A sample for painting.

次いで、当該試料を１０〜６０質量％濃度に溶解した水溶液を活性化済みの陰イオン交換樹脂を充填したカラムに供し、所定濃度（ｐＨ１０〜１３）の塩基性溶媒で溶出する成分を分取し、溶媒除去及び凍結乾燥して塩基性物質画分として採取する。この後、イオン交換水さらに所定濃度（ｐＨ１〜３）の酸性溶媒を用いて上記塩基性溶媒で溶出しなかった非溶出成分を溶出させて、同様に溶媒除去及び凍結乾燥して両性電解質画分として採取する。   Next, an aqueous solution in which the sample is dissolved at a concentration of 10 to 60% by mass is applied to a column filled with activated anion exchange resin, and components eluted with a basic solvent at a predetermined concentration (pH 10 to 13) are collected. Remove the solvent and freeze-dry to collect as a basic substance fraction. Thereafter, the non-eluting components that were not eluted with the basic solvent were eluted using ion-exchanged water and an acidic solvent having a predetermined concentration (pH 1 to 3), and the solvent was removed and freeze-dried in the same manner to obtain an amphoteric electrolyte fraction. Collect as

かかる手法によって得られる両性電解質含有画分は、糖類や脂質類を全く含まず、試験例２で後述するように、その主成分の分子量が１２０から２８０の範囲に属するものであって、より望ましくは分子量が１２３及び／又は１３７、２４２、又は、２６０であり、最も望ましくは分子量が２６０であり、とりわけＮＤＭＡによって誘発される変異原性を強く抑制する作用を発現する。又、糖類及び酸性物質含有画分は、とくにＭＮＮＧに対して抗変異原性作用を発現する。   The amphoteric electrolyte-containing fraction obtained by such a technique does not contain saccharides or lipids at all, and the molecular weight of the main component belongs to the range of 120 to 280 as described later in Test Example 2, and is more desirable. Has a molecular weight of 123 and / or 137, 242, or 260, and most preferably has a molecular weight of 260, and particularly exerts an action of strongly suppressing mutagenicity induced by NDMA. In addition, the saccharide and acidic substance-containing fraction expresses an antimutagenic action particularly on MNNG.

かくして得られる両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分は、これらをそのまま又は公知の安定剤、賦形剤、結合剤等の添加物質に混合、吸着、乳化、分散あるいは溶解して含有せしめて本発明の抗変異原性剤とすることができる。この添加物質は本発明の趣旨に反しないものであれば差し支えなく用いることができ、通常の飲食品、飼料、医薬品等に利用されるデンプン、化工デンプン、デキストリン、難消化性デキストリン、粉末セルロース、結晶セルロース、セルロース誘導体、多価アルコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、乳糖、アラビアガム、マンニトール、トレハロース、グルコース、ゼラチン、ステアリン酸カルシウム、微粒二酸化ケイ素、精製水、生理食塩水等を単独で又は組み合わせて使用することができる。本発明の抗変異原性剤における前記両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分の含有量は、該剤の利用面を考慮して約０．０１質量％以上であることが好ましい。   The amphoteric electrolyte-containing fraction or saccharide and acidic substance-containing fraction thus obtained is mixed, adsorbed, emulsified, dispersed or dissolved as it is or in a known additive such as a stabilizer, excipient or binder. And can be used as the antimutagenic agent of the present invention. As long as this additive does not violate the gist of the present invention, it can be used without any problem. Starch, modified starch, dextrin, indigestible dextrin, powdered cellulose, Crystalline cellulose, cellulose derivative, polyhydric alcohol fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, lactose, gum arabic, mannitol, trehalose, glucose, gelatin, calcium stearate, fine silicon dioxide, purified water, physiological saline, etc. alone or in combination Can be used. The content of the amphoteric electrolyte-containing fraction or the saccharide and acidic substance-containing fraction in the antimutagenic agent of the present invention is about 0.01% by mass or more in consideration of the usage of the agent. preferable.

本発明の抗変異原性剤は、これ自体を飲食品、医薬品、飼料その他産業分野の様々な形態の製品とすることができ、あるいは、かかる製品の配合原料の一部とする態様でも利用することができる。実用的な用途としては飲食品がよい。   The antimutagenic agent of the present invention can be used as a product in various forms in the field of food and drink, pharmaceuticals, feed and other industrial fields, or can be used in an aspect in which it is a part of the blended raw material of such a product. be able to. For practical applications, food and drink are good.

本発明の抗変異原性剤を適用し得る飲食品の態様はとくに限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、丸剤状、錠剤状、ソフトカプセル状、ハードカプセル状、ペースト状又は液体状の栄養補助食品、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品や、茶、果汁飲料、野菜ジュース、清涼飲料、発酵乳飲料等の飲料類及びこれらの粉末製品、パン、ケーキ、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、グミ等の菓子類、うどん、そば、スパゲッティ、マカロニ等の麺パスタ類、ジャム、スプレッド、ふりかけ、佃煮、みそ、醤油、ソース、トマトケチャップ、たれ、つゆ、だしのもと、マヨネーズ、ドレッシング等の調味料又は調味製品、ハム、ソーセージ等の畜肉魚肉製品等の一般加工飲食品、流動食や嚥下障害用食品の治療食品等を挙げることができる。とりわけ顆粒、タブレット、カプセル、ドリンク等の形状に加工して栄養機能食品、栄養補助食品、健康食品等として利用することは好適である。   The aspect of the food and drink to which the antimutagenic agent of the present invention can be applied is not particularly limited, and for example, powder, granule, pill, tablet, soft capsule, hard capsule, paste or liquid Shaped dietary supplements, foods for specified health use, functional nutritional foods, health foods, beverages such as tea, fruit juice drinks, vegetable juices, soft drinks, fermented milk drinks, and powdered products thereof, bread, cakes, cookies, candies , Confectionery such as gum, chocolate, gummy, noodle pasta such as udon, soba, spaghetti, macaroni, jam, spread, sprinkle, boiled, miso, soy sauce, sauce, tomato ketchup, sauce, soy sauce, dashi sauce, General processed foods and beverages such as mayonnaise, dressings and other seasonings or seasoning products, meat and fish products such as hams and sausages, therapeutic foods for liquid foods and foods for dysphagia It can be mentioned. In particular, it is suitable to process into shapes such as granules, tablets, capsules, drinks, etc. and use them as functional foods, nutritional supplements, health foods, and the like.

これらの飲食品を製造するには、本発明の抗変異原性剤と公知の原材料を用い、あるいは公知の原材料の一部を本発明の抗変異原性剤で置き換え、常法によって製造すればよい。
前記飲食品において、本発明の抗変異原性剤の配合比率は、該剤中の有効成分すなわち前記両性電解質含有画分、あるいは、糖類及び酸性物質含有画分の濃度、飲食品の種類や形態等の要因により一概に規定し難いが、前記両性電解質含有画分、又は、前記糖類及び酸性物質含有画分の含量として約０．０１質量％〜約９０質量％、より望ましくは約１質量％〜約５０質量％である。０．０１質量％を下回るような微量の場合は、本発明の所望の効果を発現させるために多量の飲食品を摂取しなければならず、９０質量％を上回る場合は、飲食品の風味を変性させることがあり、通常の加工飲食品の形態を作成することが困難になることがある。本発明に係る飲食品の摂取の目安は、成人の場合、前記両性電解質含有画分、又は、前記糖類及び酸性物質含有画分の１日あたり摂取量が約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、望ましくは約３０ｍｇ〜約５００ｍｇ、さらに望ましくは約５０ｍｇ〜約２００ｍｇとなるように、経口摂取あるいは経管投与するのがよい。 In order to produce these foods and drinks, the antimutagenic agent of the present invention and known raw materials are used, or a part of the known raw materials are replaced with the antimutagenic agent of the present invention and manufactured by a conventional method. Good.
In the food and drink, the mixing ratio of the antimutagenic agent of the present invention is the active ingredient in the agent, that is, the concentration of the amphoteric electrolyte-containing fraction, or the sugar and acidic substance-containing fraction, the type and form of the food and drink. Although it is difficult to define it generally due to factors such as the above, the content of the amphoteric electrolyte-containing fraction or the fraction containing the saccharide and acidic substance is about 0.01% by mass to about 90% by mass, more preferably about 1% by mass. To about 50% by weight. If the amount is less than 0.01% by mass, a large amount of food or drink must be ingested in order to achieve the desired effect of the present invention. It may be denatured and it may be difficult to create a normal processed food or drink form. The standard of intake of food and drink according to the present invention is, in the case of adults, the daily intake of the amphoteric electrolyte-containing fraction or the saccharide and acidic substance-containing fraction is about 10 mg to about 1,000 mg, preferably Ingestion or tube administration may be performed so that the dose is about 30 mg to about 500 mg, more desirably about 50 mg to about 200 mg.

本発明の抗変異原性剤を医薬品の態様で利用する場合は、前記の抗変異原性剤を薬学的に許容される担体とともに組み合わせることが好ましく、公知の賦形剤や添加剤を併用して常法により錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤等の製剤となし、経口投与、経管投与あるいは皮内投与するのがよい。この医薬品組成物における本発明の抗変異原性剤の含量は、その有効成分である前記両性電解質含有画分、又は、前記糖類及び酸性物質含有画分を基準として概ね０．００１〜５０質量％である。両性電解質含有画分を主たる成分とする場合は変異原物質としてＮＤＭＡを対象にし、又、糖類及び酸性物質含有画分を主たる成分とする場合は変異原物質としてＭＮＮＧを対象にし、それぞれの変異原物質により誘発される変異原性の抑制、遺伝子や染色体の損傷や異常の防止、該変異原性と関連する癌、その他の疾患の予防等のために適用することが望ましい。   When the antimutagenic agent of the present invention is used in the form of a pharmaceutical product, it is preferable to combine the antimutagenic agent with a pharmaceutically acceptable carrier, and use a known excipient or additive in combination. Therefore, tablets, pills, capsules, granules, powders, injections and the like can be prepared by conventional methods, and oral administration, tube administration or intradermal administration is preferred. The content of the antimutagenic agent of the present invention in this pharmaceutical composition is generally 0.001 to 50% by mass based on the amphoteric electrolyte-containing fraction which is the active ingredient, or the saccharide and acidic substance-containing fraction. It is. When the amphoteric electrolyte-containing fraction is the main component, NDMA is targeted as a mutagen, and when the saccharide and acidic substance-containing fraction is the main component, MNNG is targeted as a mutagen. It is desirable to apply for the suppression of mutagenicity induced by substances, the prevention of gene and chromosome damage and abnormalities, the prevention of cancer and other diseases associated with the mutagenicity.

次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。各例において、％、部及び比率はとくに明示しない限りいずれも質量基準である。尚、本発明の技術的範囲は以下の各例によって限定されるものではない。   Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples. In each example,%, part and ratio are based on mass unless otherwise specified. The technical scope of the present invention is not limited by the following examples.

〔製造例〕
撹拌機付ステンレス製耐圧釜（５０Ｌ容）に、アガリクス ブラゼイ ムリルの乾燥子実体を約１ｃｍ角以下のサイズに粗砕したもの１ｋｇを仕込み、水（ｐＨ８）１０Ｌを加え、適宜にかき混ぜながら、常圧下、９５℃で３時間抽出した後、残渣を濾別して抽出液を採取した。又、前記残渣に水（ｐＨ８）５Ｌを加えて同様に処理して抽出液を採取した。この両抽出液を合わせて減圧濃縮、凍結乾燥してアガリクス茸の熱水抽出物を得た。次に、この熱水抽出物に３倍量（容量／質量）の７０％エタノール（＝含水率３０質量％）を加え、３５℃に加温して１０分間撹拌後、沈殿物を濾別して上清を採取し、濃縮及び凍結乾燥して粉末状の含水エタノール可溶物（上清画分とする）２１５ｇを得た。 [Production example]
Into a stainless steel pressure vessel with a stirrer (50L capacity), add 1kg of Agaricus brazeimuril dried fruit body roughly crushed to a size of about 1cm square and add 10L of water (pH 8). After extraction under pressure at 95 ° C. for 3 hours, the residue was separated by filtration and an extract was collected. Further, 5 L of water (pH 8) was added to the residue and treated in the same manner to collect an extract. The two extracts were combined, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to obtain a hot water extract of Agaricus koji. Next, 3 times (volume / mass) of 70% ethanol (= water content 30 mass%) is added to the hot water extract, heated to 35 ° C. and stirred for 10 minutes, and then the precipitate is filtered off. The supernatant was collected, concentrated and freeze-dried to obtain 215 g of powdered water-soluble ethanol soluble material (referred to as a supernatant fraction).

次に、イオン交換クロマトグラフィーによる分画処理を分析レベルで行うために、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を以下に述べる方法で予め活性化した。すなわち、ガラス製円管（φ１０ｍｍ×１２ｃｍ）に強酸性陽イオン交換樹脂（ムロマチテクノス（株）製、ダウエックス５０ＷＸ４（Ｈ^＋型））を詰め、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、純水、２Ｎ塩酸、純水及び０．０１Ｎ塩酸を順次流して活性化陽イオン交換カラムを作成し、又、ガラス製円管（φ１０ｍｍ×１２ｃｍ）に強塩基性陰イオン交換樹脂（ムロマチテクノス（株）製、ダウエックス１Ｘ８（Ｃｌ⁻型））を詰め、５％アンモニア水、純水及び５％アンモニア水を順次流して活性化陰イオン交換カラムを作成した。 Next, in order to perform fractionation treatment by ion exchange chromatography at the analytical level, the cation exchange resin and the anion exchange resin were activated in advance by the method described below. That is, a strongly acidic cation exchange resin (Muromachi Technos Co., Ltd., Dowex 50WX4 (H ⁺ type)) is packed in a glass tube (φ10 mm × 12 cm), 2N aqueous sodium hydroxide solution, pure water, 2N hydrochloric acid, An activated cation exchange column was prepared by sequentially flowing pure water and 0.01N hydrochloric acid, and a strongly basic anion exchange resin (Muromachi Technos Co., Ltd., Dowex) was placed in a glass tube (φ10 mm × 12 cm). 1 × 8 (Cl ⁻ type)) was packed, and 5% ammonia water, pure water and 5% ammonia water were sequentially flowed to prepare an activated anion exchange column.

上記の含水エタノール可溶物（上清画分）の水溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬに２Ｎ塩酸２５μＬを加えて終濃度０．０１Ｎ塩酸水溶液とし、これを作成した活性化陽イオン交換カラムに供して、０．０１Ｎ塩酸５０ｍＬで溶出したものをフラクション１（糖類及び酸性物質含有画分）とした。同カラム中の残存物は純水５０ｍＬ、次いで５％アンモニア水７０ｍＬを用いて溶出させ、減圧濃縮、凍結乾燥した。この凍結乾燥物に純水１０ｍＬ及び２５％アンモニア水２．５ｍＬを添加して終濃度が５％アンモニア水溶液とし、これを作成した活性化陰イオン交換カラムに供して、５％アンモニア水で溶出したものをフラクション２（塩基性物質含有画分）とした。さらに同カラムに純水５０ｍＬ次いで０．０５Ｎ塩酸７０ｍＬを流して溶出したものをフラクション３（両性電解質含有画分）とし、この後に０．２Ｎ塩酸５０ｍＬを用いて溶出したものをフラクション４（その他成分含有画分）とした。各フラクションは常法により減圧濃縮及び凍結乾燥して粉末状固形物とした。収率はフラクション１：６２．４％、フラクション２：１２．８％、フラクション３：２２．３％、フラクション４：２．５％であった。   25 mL of 2N hydrochloric acid was added to 5 mL of the aqueous solution (100 mg / mL) of the above water-soluble ethanol soluble substance (supernatant fraction) to make a final concentration 0.01N hydrochloric acid aqueous solution, and this was applied to the activated cation exchange column. The fraction eluted with 50 mL of 0.01N hydrochloric acid was designated as fraction 1 (a fraction containing saccharides and acidic substances). The residue in the column was eluted with 50 mL of pure water and then with 70 mL of 5% aqueous ammonia, concentrated under reduced pressure, and lyophilized. To this freeze-dried product, 10 mL of pure water and 2.5 mL of 25% aqueous ammonia were added to make a final aqueous solution of 5% ammonia, which was applied to the activated anion exchange column thus prepared and eluted with 5% aqueous ammonia. This was designated as fraction 2 (basic substance-containing fraction). Further, 50 mL of pure water and then 70 mL of 0.05N hydrochloric acid were passed through the same column to elute the fraction 3 (amphoteric electrolyte-containing fraction), and the fraction eluted with 50 mL of 0.2N hydrochloric acid was fraction 4 (other components). Containing fraction). Each fraction was concentrated under reduced pressure and freeze-dried by a conventional method to obtain a powdery solid. The yield was fraction 1: 62.4%, fraction 2: 12.8%, fraction 3: 22.3%, fraction 4: 2.5%.

〔試験例１〕
前述のイオン交換カラム分画処理を１０倍スケールで同様に実施して分取した各フラクションの固形物（フラクション１〜４の固形物に相当するものをそれぞれ試料１〜４とする）について、それらの変異原性抑制作用を復帰突然変異試験法（エイムス試験法）を用いて試験評価した。すなわち、試料１〜４の各々を滅菌水に溶解し、その終濃度がアガリクス茸上清相当量（各試料の収率を勘案して上清画分に換算した量）で１、２、５又は１０ｍｇ／ｍＬとなるように各溶液を調製し、各々の０．１ｍＬを試験管に分注した。次いで、これに変異原物質としてＮＤＭＡをジメチルスルホン酸アミドに溶解した溶液を０．１ｍＬ、ＮＤＭＡが代謝活性化を必要とする変異原物質であるために薬物代謝酵素を含むＳ９ｍｉｘ（ラット肝臓Ｓ９、０．４ｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム水溶液、１．６５ｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム水溶液、１．０ｍｏｌ／Ｌグルコース−６−リン酸水溶液、０．１ｍｏｌ／Ｌ還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸水溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液の混合溶液。ｐＨ７．４）を０．５ｍＬ、及び、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ−１００株の培養液を０．１ｍＬそれぞれ添加して混合溶液を調製した。 [Test Example 1]
About the solids of each fraction (the samples corresponding to the solids of fractions 1 to 4 are sampled 1 to 4, respectively) obtained by performing the above-described ion exchange column fractionation in the same manner on a 10-fold scale. The mutagenicity-inhibiting action of was tested and evaluated using the reverse mutation test method (Ames test method). That is, each of the samples 1 to 4 is dissolved in sterilized water, and the final concentration is 1, 2, 5 in terms of the equivalent amount of Agaricus sputum supernatant (amount converted to the supernatant fraction in consideration of the yield of each sample). Or each solution was prepared so that it might become 10 mg / mL, and 0.1 mL of each was dispensed to the test tube. Next, 0.1 mL of a solution in which NDMA is dissolved in dimethylsulfonic acid amide as a mutagen is added, and S9mix (rat liver S9, which contains a drug metabolizing enzyme because NDMA is a mutagen that requires metabolic activation. 0.4 mol / L magnesium chloride aqueous solution, 1.65 mol / L potassium chloride aqueous solution, 1.0 mol / L glucose-6-phosphate aqueous solution, 0.1 mol / L reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate aqueous solution and 0.2 mol / L mixed solution of sodium phosphate buffer, 0.5 mL of pH 7.4) and 0.1 mL of culture solution of Salmonella typhimurium TA-100 strain were added to prepare a mixed solution.

前記混合溶液を３７℃にて２０分間振とうした後、軟寒天液２ｍＬを加え、エイムス・プレート（１ＬあたりＤ−グルコース２０ｇ、寒天１５ｇ、Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地１００ｍＬ、ヒスチジン０．６２ｍｇ及びビオチン０．９８ｍｇを含む）にまき、３７℃で４８時間インキュベートし、該プレート上に出現した復帰突然変異コロニー数を計測した。各試料による変異原物質の変異原性抑制率は、変異発生率（％）＝（変異原物質及び試料添加時の変異数−自然発生変異数）／（変異原物質添加時の変異数−自然発生変異数）×１００の計算式から求めた数値を比較することにより評価した。ここに、自然発生変異数とは試料のみを添加したときに発生する変異コロニー数である。これらの試験結果の一部を表１に示す。表１において、試料添加量は各試料の収率から換算して上清画分の添加量（２．０ｍｇ／ｐｌａｔｅ）に相当する量を用い、変異発生率の数値はＮＤＭＡが０．２ｍｍｏｌのみの場合（対照試験）を１００としたときの相対値である。又、同条件下で、試料３について、その添加量を変化させた場合の試験結果を表２に示す。   After shaking the mixed solution at 37 ° C. for 20 minutes, 2 mL of soft agar solution was added, and Ames plate (20 g of D-glucose, 15 g of agar, 100 mL of Vogel-Bonner medium, 0.62 mg of histidine and 0. 98 mg), and incubated at 37 ° C. for 48 hours, and the number of back-mutated colonies that appeared on the plate was counted. Mutagenicity suppression rate of mutagen by each sample is: Mutation rate (%) = (Number of mutations when mutagen and sample are added-Number of spontaneous mutations) / (Number of mutations when mutagen is added-Natural The number of mutations generated) was evaluated by comparing the numerical values obtained from the formula of 100. Here, the number of spontaneous mutations is the number of mutant colonies generated when only the sample is added. Some of these test results are shown in Table 1. In Table 1, the amount of sample added is equivalent to the added amount of the supernatant fraction (2.0 mg / plate) in terms of the yield of each sample, and the numerical value of mutation occurrence is only 0.2 mmol for NDMA. In this case, the relative value is 100 (control test). Table 2 shows the test results when the addition amount of sample 3 was changed under the same conditions.

表１のデータから、ＮＤＭＡによる変異発生率は試料３すなわち両性電解質含有画分を添加したときに顕著に抑制され、これ以外の分画試料では該効果が認められないことが確認された。又、表２から、試料３は濃度依存的にＮＤＭＡの変異活性を阻害することも確認した。   From the data in Table 1, it was confirmed that the mutation rate due to NDMA was remarkably suppressed when Sample 3, that is, the amphoteric electrolyte-containing fraction, was added, and the effect was not observed in other fraction samples. From Table 2, it was also confirmed that Sample 3 inhibited the NDMA mutation activity in a concentration-dependent manner.

〔試験例２〕
前記試料３の実質的な有効成分を解明するために、次の条件で高速液体クロマトグラフィーに供して分画処理を行った。装置：（株）日立ハイテクノロジーズ製Ｌ−７１００シリーズ、カラム：（株）ワイエムシイ製ＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅＣ１８（１０×２５０ｍｍ）、溶離液：０．５％ギ酸及び１０％メタノール、流速：２ｍＬ／ｍｉｎ、２５０ｎｍにおけるＵＶ検出。前記試料３を滅菌水で溶解した溶液２０μＬ（アガリクス茸上清相当量として５ｍｇ含有）をインジェクトして９種類のフラクション（Ｆｒ１〜Ｆｒ９）に分取して各々凍結乾燥後、各フラクションについて試験例１と同様に試験してＮＤＭＡ変異原性抑制作用を評価した。この結果を表３に示す。表３において、試料添加量は各試料の収率から換算して上清画分の添加量（５．０ｍｇ／ｐｌａｔｅ）に相当する量を用い、変異発生率の数値はＮＤＭＡが０．２ｍｍｏｌのみの場合（対照試験）を１００としたときの相対値である。 [Test Example 2]
In order to elucidate the substantial active ingredient of the sample 3, it was subjected to fractionation treatment by high performance liquid chromatography under the following conditions. Apparatus: L-7100 series manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation, column: Hydrosphere C18 manufactured by YMC Corporation, eluent: 0.5% formic acid and 10% methanol, flow rate: 2 mL / min, UV at 250 nm detection. 20 μL of a solution prepared by dissolving the sample 3 in sterilized water (containing 5 mg as an equivalent amount of Agaricus sputum supernatant) was injected, fractionated into nine fractions (Fr1 to Fr9), freeze-dried, and then tested for each fraction. The test was conducted in the same manner as in Example 1 to evaluate the NDMA mutagenicity inhibitory action. The results are shown in Table 3. In Table 3, the amount of sample added is the amount corresponding to the added amount of the supernatant fraction (5.0 mg / plate) in terms of the yield of each sample. In this case, the relative value is 100 (control test).

表３から、フラクション３（試料３のＨＰＬＣ分画物Ｆｒ３）を添加するとＮＤＭＡの変異原性を強く抑制することが明らかになり、該フラクション中に有効成分が含まれることが推測された。なお、このフラクション３はＨＰＬＣチャート上では２種類のピーク成分からなるものであった。   From Table 3, it was revealed that addition of fraction 3 (HPLC fraction Fr3 of sample 3) strongly suppressed the mutagenicity of NDMA, and it was assumed that the active ingredient was contained in the fraction. This fraction 3 consisted of two types of peak components on the HPLC chart.

そこで、前記の試料３のフラクション３について、溶離液を０．５％ギ酸及び５％メタノールにおきかえることを除いて同条件下で前記ＨＰＬＣ分画処理に供し、６種類のフラクション（ｆｒ１〜ｆｒ６）を分取した。各々を凍結乾燥した後、試験例１と同様に試験してＮＤＭＡ変異原性抑制作用を評価した結果、表４に示すように、第３番目に溶出したフラクション３（試料３の分画物Ｆｒ３のＨＰＬＣ分画物ｆｒ３）を添加した場合に最も強力な効果を発現した。なお、このフラクション３はＨＰＬＣチャート上では単一ピーク成分からなるものであった。   Therefore, the fraction 3 of the sample 3 was subjected to the HPLC fractionation under the same conditions except that the eluent was replaced with 0.5% formic acid and 5% methanol, and six types of fractions (fr1 to fr6) were used. Was sorted. After freeze-drying each, the test was conducted in the same manner as in Test Example 1 and the NDMA mutagenicity inhibitory action was evaluated. As shown in Table 4, the third eluted fraction 3 (fraction Fr3 of sample 3) When the HPLC fraction fr3) was added, the strongest effect was exhibited. This fraction 3 was composed of a single peak component on the HPLC chart.

前記の単一ピークからなる分画物（試料３の分画物Ｆｒ３のＨＰＬＣ分画物ｆｒ３）について、高速液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて分子量の解析を行い、ｍ／ｚ１２４及び１３８のイオンピークが検出された。
装置：（株）アプライドバイオシステムズ製ＡＰ１３０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、溶離液：１ｍＭギ酸アンモニウム／メタノール（２０／８０）、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法、ポジティブイオンモード。
この知見から、ＮＤＭＡの変異原性を抑制する活性成分は、分子量が１２０から２８０の範囲に属するものであって、より確実性が高いものの分子量は１２３及び／又は１３７、２４２、又は、２６０であり、最も確実性の高いものの分子量は２６０であることが明らかになった。 The molecular weight of the fraction consisting of the single peak (HPLC fraction fr3 of the fraction Fr3 of the sample 3) is analyzed using a high performance liquid chromatography / tandem mass spectrometer (LC / MS / MS). The ion peaks at m / z 124 and 138 were detected.
Apparatus: AP13000LC / MS / MS system manufactured by Applied Biosystems, eluent: 1 mM ammonium formate / methanol (20/80), flow rate: 0.2 mL / min, ionization method: electrospray ionization method, positive ion mode.
From this finding, the active ingredient that suppresses the mutagenicity of NDMA belongs to the range of molecular weight 120 to 280, and the molecular weight of the higher certainty is 123 and / or 137, 242, or 260. It was revealed that the molecular weight of the most reliable one was 260.

〔試験例３〕
前記製造例に記載した方法に基づき試験例１で分取した試料１〜４について、変異原物質をＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）とした場合の変異原性抑制作用を試験例１に記載の試験方法に準じて評価した。但し、該試験方法においては、ＭＮＮＧが代謝活性化を必要としない直接変異原であるため、Ｓ９ｍｉｘの添加を省いた。この結果の一部を表５に示す。表５において、試料添加量は各試料の収率から換算して上清画分の添加量（１．０ｍｇ／ｐｌａｔｅ）に相当する量を用い、変異発生率の数値はＭＮＮＧが５ｎｍｏｌのみの場合（対照試験）を１００としたときの相対値である。又、同条件下で、試料１について、その添加量を変化させた場合の試験結果を表６に示す。 [Test Example 3]
Inhibition of mutagenicity of Samples 1 to 4 collected in Test Example 1 based on the method described in the above Production Example when the mutagen is N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) The action was evaluated according to the test method described in Test Example 1. However, in this test method, since MNNG is a direct mutagen that does not require metabolic activation, the addition of S9mix was omitted. A part of the results is shown in Table 5. In Table 5, the amount of sample added is equivalent to the amount of supernatant fraction added (1.0 mg / plate) in terms of the yield of each sample. It is a relative value when (control test) is 100. Table 6 shows the test results when the addition amount of Sample 1 was changed under the same conditions.

表５及び表６のデータから、ＭＮＮＧの変異原性に対して試料１すなわち糖類及び酸性物質含有画分が濃度依存的に抑制作用を発現することが明らかになった。なお、試料３はＮＤＭＡの変異原性に対して抑制効果を示したが、ＭＮＮＧの変異原性に対してはほとんど有効性が認められなかった。   From the data in Tables 5 and 6, it was revealed that Sample 1, that is, the fraction containing saccharides and acidic substances, expresses an inhibitory effect on the mutagenicity of MNNG in a concentration-dependent manner. Sample 3 showed an inhibitory effect on the mutagenicity of NDMA, but almost no effect was observed on the mutagenicity of MNNG.

〔試作例１〕
製造例及び試験例１に記載の方法で調製したフラクション３（試料３）、すなわち、アガリクス茸を熱水抽出し、該抽出物を７０％エタノールで抽出して得た可溶物を、さらにイオン交換クロマトグラフィー分画した両性電解質含有画分（表１の試料３）：１５０部、ミツロウ：４０部、及び、食用植物油：６０部を約６０℃で混合して均質にした後、カプセル充填機に供し、常法により１粒あたり内容量が２５０ｍｇのゼラチン被覆ソフトカプセル型組成物を試作した。この組成物は経口摂取できる栄養補助食品、ペット用健康食品又は医薬品として利用でき、とりわけＮＤＭＡの摂取による変異原性の発現を防止したり、ＮＤＭＡにより誘発される癌の発生を予防するために適用することが望ましい。 [Prototype Example 1]
Fraction 3 (sample 3) prepared by the method described in Production Example and Test Example 1, that is, agaricus koji was extracted with hot water, and the extract was extracted with 70% ethanol. Exchange chromatography fractionated amphoteric electrolyte-containing fraction (sample 3 in Table 1): 150 parts, beeswax: 40 parts, and edible vegetable oil: 60 parts were mixed and homogenized at about 60 ° C., followed by a capsule filling machine Then, a gelatin-coated soft capsule type composition having an inner volume of 250 mg per grain was prepared by a conventional method. This composition can be used as a dietary supplement, pet health food or medicine that can be taken orally, and is especially applied to prevent the development of mutagenicity by ingestion of NDMA or to prevent the occurrence of cancer induced by NDMA. It is desirable to do.

〔試作例２〕
製造例及び試験例２に記載の方法で調製したフラクション３（試料３）のＨＰＬＣ分画物（Ｆｒ３）、すなわち、アガリクス茸の熱水抽出物の７０％エタノール可溶物をイオン交換クロマトグラフィー分画した両性電解質含有画分を、さらにＨＰＬＣ分画して得た分画物（表３のＦｒ３）：１００部、アスコルビン酸：３０部、澱粉：５０部、ステアリン酸カルシウム：３０部、及び、結晶セルロース：５０部を混合して均質にした後、直打式打錠機に供して直径７ｍｍ、高さ４ｍｍ、質量２００ｍｇ／個の素錠を作成し、次いでコーティング機に供してシェラック被膜を形成させて錠剤型経口用組成物を試作した。この組成物は、栄養補助食品、動物用健康食品又は医薬品として利用でき、とりわけＮＤＭＡの摂取による変異原性の発現を防止したり、ＮＤＭＡにより誘発される癌の発生を予防するために適用することが望ましい。 [Prototype Example 2]
The HPLC fraction (Fr3) of Fraction 3 (Sample 3) prepared by the method described in Production Example and Test Example 2, that is, the 70% ethanol soluble matter of the hot water extract of Agaricus sp. Fractions obtained by further HPLC fractionating the fraction containing amphoteric electrolytes (Fr3 in Table 3): 100 parts, ascorbic acid: 30 parts, starch: 50 parts, calcium stearate: 30 parts, and crystals Cellulose: 50 parts mixed and homogenized, then applied to a direct compression tablet machine to produce uncoated tablets with a diameter of 7 mm, a height of 4 mm, and a mass of 200 mg / piece, and then applied to a coating machine to form a shellac film Thus, a tablet-type oral composition was produced as a prototype. This composition can be used as a dietary supplement, a health food for animals, or a pharmaceutical, and is applied especially to prevent the development of mutagenicity due to the intake of NDMA or to prevent the occurrence of cancer induced by NDMA. Is desirable.

〔試作例３〕
製造例及び試験例１に記載の方法で調製したフラクション１（試料１）、すなわち、アガリクス茸を熱水抽出し、該抽出物を７０％エタノールで抽出して得た可溶物を、さらにイオン交換クロマトグラフィー分画した糖類及び酸性物質含有画分（表５の試料１）：１５０部、ミツロウ：４０部、及び、食用植物油：６０部を約６０℃で混合して均質にした後、カプセル充填機に供し、常法により１粒あたり内容量が２５０ｍｇのゼラチン被覆ソフトカプセル型組成物を試作した。この組成物は経口摂取できる栄養補助食品、ペット用健康食品又は医薬品として利用でき、とりわけＭＮＮＧの摂取による変異原性の発現を防止したり、ＭＮＮＧにより誘発される癌の発生を予防するために適用することが望ましい。 [Prototype Example 3]
Fraction 1 (sample 1) prepared by the method described in Production Example and Test Example 1, that is, agaricus koji was extracted with hot water, and the extract was extracted with 70% ethanol. Fractionated sugar and acidic substance-containing fraction (sample 1 in Table 5): 150 parts, beeswax: 40 parts, and edible vegetable oil: 60 parts were mixed at about 60 ° C. and homogenized. A gelatin-coated soft capsule composition having an inner volume of 250 mg per grain was prepared by a conventional method using a filling machine. This composition can be used as an orally ingestible dietary supplement, pet health food, or pharmaceutical, and is especially applied to prevent the occurrence of mutagenicity by ingestion of MNNG or to prevent the occurrence of cancer induced by MNNG. It is desirable to do.

〔試作例４〕
試作例２において、製造例及び試験例２に記載の方法で調製したフラクション３（試料３）のＨＰＬＣ分画物（Ｆｒ３）を、製造例及び試験例１に記載の方法で調製したフラクション１（試料１）、すなわち、アガリクス茸を熱水抽出し、該抽出物を７０％エタノールで抽出して得た可溶物を、さらにイオン交換クロマトグラフィー分画して得た糖類及び酸性物質含有画（表５の試料１）に置きかえること以外は同様に処理して、錠剤型経口用組成物を試作した。この組成物は、栄養補助食品、動物用健康食品又は医薬品として利用でき、とりわけＭＮＮＧの摂取による変異原性の発現を防止したり、ＭＮＮＧにより誘発される癌の発生を予防するために適用することが望ましい。 [Prototype Example 4]
In Prototype Example 2, the HPLC fraction (Fr3) of Fraction 3 (Sample 3) prepared by the method described in Production Example and Test Example 2 was used as fraction 1 (Fr3) prepared by the method described in Production Example and Test Example 1. Sample 1), that is, a soluble substance obtained by extracting agaricus koji with hot water and extracting the extract with 70% ethanol, and a fraction containing a saccharide and an acidic substance obtained by further ion-exchange chromatography fractionation ( A tablet-type oral composition was prepared in the same manner except that it was replaced with sample 1) in Table 5. This composition can be used as a dietary supplement, animal health food, or pharmaceutical, and is especially applied to prevent the occurrence of mutagenicity by ingesting MNNG or to prevent the occurrence of cancer induced by MNNG. Is desirable.

〔試作例５〕
豚ロース肉：１００部に対して、食塩：５％、リン酸ナトリウム：１．３％、ビタミンＣ：０．７％，香辛料及び化学調味料：０．７％、発色剤として亜硝酸ナトリウム：０．３％、及び、製造例及び試験例１に記載の方法で調製したフラクション３（試料３）、すなわち、アガリクス茸を熱水抽出し、該抽出物を７０％エタノールで抽出して得た可溶物を、さらにイオン交換クロマトグラフィー分画した両性電解質含有画分（表１の試料３）：３．５％を含む注射液：３０部を注入し、回転式マッサージ機を用いて７℃で２４時間マッサージした。この後、１１ｃｍのケーシングに充填し、６０℃で３０分間スモーキング処理、さらに７５℃で１２０分間蒸沸処理を施してハム様食品を試作した。このハム様食品の呈味性及び食感は市販のロースハムと比較して遜色のないものであった。 [Prototype Example 5]
Pork loin: 100 parts, salt: 5%, sodium phosphate: 1.3%, vitamin C: 0.7%, spices and chemical seasonings: 0.7%, sodium nitrite as color former: 0.3% and fraction 3 (sample 3) prepared by the method described in Production Example and Test Example 1, that is, Agaricus koji was extracted with hot water, and the extract was extracted with 70% ethanol. Amphoteric electrolyte-containing fraction obtained by further ion-exchange chromatography fractionation of the soluble matter (sample 3 in Table 1): 30% injection solution containing 30% was injected, and 7 ° C. using a rotary massage machine. I massaged for 24 hours. After that, it was filled into an 11 cm casing, subjected to smoking treatment at 60 ° C. for 30 minutes, and further subjected to boiling treatment at 75 ° C. for 120 minutes to produce a ham-like food. The taste and texture of this ham-like food were comparable to commercially available loin ham.

本発明の抗変異原性剤は、ＮＤＭＡやＭＮＮＧ等の特定の変異原物質の変異原性の発現を抑制する作用を有するため、前記変異原物質の摂取によって誘発される遺伝子の損傷、染色体の異常、又、これらによって生じる身体の異常や癌等の発生を予防するための飲食品、医薬品、飼料等に有効利用できる。   Since the antimutagenic agent of the present invention has an action of suppressing the mutagenic expression of a specific mutagen such as NDMA or MNNG, gene damage induced by ingestion of the mutagen, chromosomal It can be effectively used for foods and drinks, medicines, feeds, etc. for preventing abnormalities and the occurrence of abnormalities of the body or cancer caused by these abnormalities.

Claims (6)

次の（ａ）〜（ｄ）に示す工程を経て得られる両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を有効成分とする抗変異原性剤。
（ａ）アガリクス茸を熱水で抽出する第１工程、
（ｂ）第１工程で得られる熱水抽出物を含水率が１０〜６０質量％の含水エタノールで抽出する第２工程、
（ｃ）第２工程で得られる含水エタノール可溶物をイオン交換クロマトグラフィーで分画する第３工程、
（ｄ）第３工程で分取した両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を採取する第４工程。 The antimutagenic agent which uses as an active ingredient the amphoteric electrolyte containing fraction obtained through the process shown to the following (a)-(d), or a sugar and an acidic substance containing fraction.
(A) a first step of extracting Agaricus koji with hot water;
(B) a second step of extracting the hot water extract obtained in the first step with water-containing ethanol having a water content of 10 to 60% by mass;
(C) a third step of fractionating the water-soluble ethanol soluble material obtained in the second step by ion exchange chromatography;
(D) The 4th process which extract | collects the amphoteric electrolyte containing fraction fractionated at the 3rd process, or a saccharide | sugar and an acidic substance containing fraction. 前記第２工程における含水エタノールの含水率が２０〜４０質量％である請求項１に記載の抗変異原性剤。   The antimutagenic agent according to claim 1, wherein the water content of the water-containing ethanol in the second step is 20 to 40% by mass. 前記第４工程における両性電解質含有画分の主成分の分子量が１２０から２８０の範囲に属するものである請求項１又は請求項２に記載の抗変異原性剤。   The antimutagenic agent according to claim 1 or 2, wherein the molecular weight of the main component of the amphoteric electrolyte-containing fraction in the fourth step belongs to the range of 120 to 280. 前記両性電解質は、変異原物質としてＮ−ニトロソジメチルアミンを対象とし、前記糖類及び酸性物質は、変異原物質としてＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを対象とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗変異原性剤。   The ampholyte targets N-nitrosodimethylamine as a mutagen, and the saccharide and acidic substance target N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine as a mutagen. 4. The antimutagenic agent according to any one of 3. 次の（ａ）〜（ｄ）に示す工程を経て得られる両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を有効成分として含有させて製造することを特徴とする抗変異原性剤の製造方法。
（ａ）アガリクス茸を熱水で抽出する第１工程、
（ｂ）第１工程で得られる熱水抽出物を含水率が１０〜６０質量％の含水エタノールで抽出する第２工程、
（ｃ）第２工程で得られる含水エタノール可溶物をイオン交換クロマトグラフィーで分画する第３工程、
（ｄ）第３工程で分取した両性電解質含有画分、又は、糖類及び酸性物質含有画分を採取する第４工程。 An antimutagenic agent characterized by containing an amphoteric electrolyte-containing fraction obtained through the steps shown in the following (a) to (d), or containing a saccharide and an acidic substance-containing fraction as active ingredients Manufacturing method.
(A) a first step of extracting Agaricus koji with hot water;
(B) a second step of extracting the hot water extract obtained in the first step with water-containing ethanol having a water content of 10 to 60% by mass;
(C) a third step of fractionating the water-soluble ethanol soluble material obtained in the second step by ion exchange chromatography;
(D) The 4th process which extract | collects the amphoteric electrolyte containing fraction fractionated at the 3rd process, or a saccharide | sugar and an acidic substance containing fraction. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗変異原性剤、又は、請求項５に記載の製造方法により得られる抗変異原性剤を含有してなる飲食品、飼料又は医薬品。   A food, beverage, feed or pharmaceutical comprising the antimutagenic agent according to any one of claims 1 to 4 or the antimutagenic agent obtained by the production method according to claim 5.