JP2010011814A - Cultured cell observation chamber and use thereof - Google Patents

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Atsushi Miyawaki
敦史 宮脇
Tetsuji Hoshida
哲志 星田
Masahiko Hirano
雅彦 平野
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple and inexpensive chamber suitable for observing cultured cells with a microscope. <P>SOLUTION: Provided are a chamber for the observation of cultured cells with a microscope, comprising a gas-permeable light-transmitting carrier (2) having a space to hold air containing carbon dioxide at a concentration suitable for cell culture and enabling the introduction and holding of a culture liquid containing cells and a light-transmitting substrate (4) placed to enable close contact with the bottom of the carrier, and a method for observing cultured cells with a microscope by using the chamber. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、顕微鏡下で培養細胞を観察するためのチャンバーに関する。   The present invention relates to a chamber for observing cultured cells under a microscope.

本発明はまた、上記チャンバーを用いて顕微鏡下で培養細胞を観察するための方法に関する。   The present invention also relates to a method for observing cultured cells under a microscope using the chamber.

生物学の分野では、生きた細胞の光学顕微鏡による観察がよく行われている。例えば、発生学の分野では、初期胚でみられるダイナミックな細胞の移動や、器官形成の過程の観察が行われている。また、生理学の分野では、細胞が示す様々な生命現象のメカニズムを調べるために、細胞に物理的あるいは化学的な刺激を与え、それに対する応答を細胞レベルで計測するために顕微鏡による観察が行われる。特にこの分野では、細胞内の蛋白質の局在や活性、あるいはCa2+濃度など、細胞の活性の指標となる分子やイオンの動態を測定する蛍光試薬が多数開発されており、蛍光顕微鏡による測定が主流となっている。このような手法は、創薬の分野でも細胞に作用する薬剤の効果を調べるためにも用いられている。また最近では、先端的な再生医療の分野において、幹細胞の増殖や分化の過程を連続的にモニタするために顕微鏡観察が行われている。このように、顕微鏡による細胞の観察手法は、基礎研究のみならず、医療や産業の分野でも応用される重要な技術となっている。 In the field of biology, living cells are often observed with an optical microscope. For example, in the field of embryology, dynamic cell migration and organ formation processes observed in early embryos are being observed. In the field of physiology, in order to investigate the mechanisms of various biological phenomena exhibited by cells, physical or chemical stimuli are given to cells, and microscopic observation is performed to measure responses to them at the cellular level. . In particular, in this field, a number of fluorescent reagents have been developed to measure the dynamics of molecules and ions that serve as cellular activity indicators, such as intracellular protein localization and activity, or Ca 2+ concentration. Has become the mainstream. Such a technique is also used in the field of drug discovery to examine the effects of drugs that act on cells. Recently, in the field of advanced regenerative medicine, microscopic observation has been performed in order to continuously monitor the process of proliferation and differentiation of stem cells. As described above, the cell observation method using a microscope is an important technique applied not only to basic research but also to medical and industrial fields.

このような実験に試料として供される細胞は、その生育に適した環境のもと、プラスチックやガラスのフラスコやディッシュ、マルチウェルプレートなどの容器内で培養される。これらの容器内で細胞が浸される培養液には、グルコースやアミノ酸などの栄養分、血清成分、pHを調整するための成分などが含まれている。細胞の生育に適した環境は我々の生活環境と異なるため、その環境を設定する必要がある。通常使用される培養液は5%の二酸化炭素(CO2)を含む空気の下に置かれることで、そのpHが細胞の生育に適した7.4付近に維持される。そのため、多くの細胞は温度が37℃で、CO2濃度5%の空気で満たされたインキュベータ内で培養される。しかし通常、顕微鏡は大気圧下、室温の環境に置かれているため、細胞の観察を行う際には、ディッシュをインキュベータから出すことになるが、このような条件のもとでは細胞の活性は著しく低下してしまう。観察時においても細胞に正常な活性を維持させるためには、インキュベータ内の環境が顕微鏡の観察ステージ上でも維持される必要がある。現在、そのための装置がいくつか製品化され使用されている。 Cells used as samples for such experiments are cultured in containers such as plastic and glass flasks, dishes, and multiwell plates in an environment suitable for their growth. The culture solution in which cells are immersed in these containers contains nutrients such as glucose and amino acids, serum components, and components for adjusting pH. Since the environment suitable for cell growth is different from our living environment, it is necessary to set the environment. A commonly used culture solution is placed under air containing 5% carbon dioxide (CO 2 ) to maintain its pH at around 7.4, which is suitable for cell growth. Therefore, many cells are cultured in an incubator filled with air having a temperature of 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. However, since the microscope is usually placed in an environment of atmospheric pressure and room temperature, when observing the cells, the dish is taken out of the incubator. Under such conditions, the activity of the cells is It will drop significantly. In order for cells to maintain normal activity even during observation, the environment in the incubator needs to be maintained on the observation stage of the microscope. Currently, several devices for this purpose have been commercialized and used.

その1つの例は上に述べたようなインキュベータと顕微鏡を、1つのシステムとして組み合わせたものである(特許文献1)。インキュベータ内部は、ヒーターにより加温され、37℃など任意の温度に設定される。また、外部に置かれたボンベからCO2ガスを含む空気が供給され、内部のCO2が5%など任意の濃度に設定される。顕微鏡はインキュベータの下部に設置され、インキュベータに向かう対物レンズによりディッシュ内の細胞が観察される。この像はCCDなどの撮像装置によってとらえられ、プログラムの制御のもと細胞の像が画像として連続的に取得される。このようなシステムでは、インキュベータとして、通常の培養に使用されるものと同等のものがそのまま使われているため、細胞が正常に生育する環境下での長時間の観察が行える。しかし、システムとして高性能なインキュベータ、顕微鏡、撮像装置及びコンピュータを一式として含むため、かなりのコストを必要とする。またガスボンベを含めて、その設置にはかなりのスペースを要する。 One example is a combination of the above-described incubator and microscope as one system (Patent Document 1). The inside of the incubator is heated by a heater and set to an arbitrary temperature such as 37 ° C. Also, air containing CO 2 gas is supplied from a cylinder placed outside, and the internal CO 2 is set to an arbitrary concentration such as 5%. The microscope is installed at the bottom of the incubator, and the cells in the dish are observed by an objective lens that faces the incubator. This image is captured by an imaging device such as a CCD, and images of cells are continuously acquired as images under the control of a program. In such a system, an incubator equivalent to that used in normal culture is used as it is, so that observation can be performed for a long time in an environment where cells normally grow. However, since the system includes a high-performance incubator, a microscope, an imaging apparatus, and a computer, a considerable cost is required. In addition, a considerable amount of space is required for installation, including gas cylinders.

別の例として、細胞が培養されたディッシュを、顕微鏡のステージ上に載る程度の大きさの容器に入れて観察するものがある(特許文献2)。この装置は、小型のインキュベータといったもので、その容器内部がヒーターにより任意の温度に加温され、外部のボンベからガスを供給することにより、内部のCO2濃度を設定できる。容器の天面部および底面部は光を透過させる透明な部材でできているため、顕微鏡による観察を行うことができる。この装置では、顕微鏡や撮像装置が既存のものを使用でき、インキュベータとしてはかなりコンパクトなものになる。しかし、ヒーターやそのセンサーなどが装備されるため、まだそれなりのコストを要し、制御のためのコントローラやCO2ボンベを配置するためのスペースを顕微鏡の周辺に確保する必要がある。また、容器内に空気の密閉はできないため、任意の濃度のCO2ガスを含む空気を常に供給する必要があり、経済的とはいえない。 As another example, there is one in which a dish in which cells are cultured is placed in a container of a size that can be placed on a microscope stage (Patent Document 2). This apparatus is a small incubator. The inside of the container is heated to an arbitrary temperature by a heater, and the internal CO 2 concentration can be set by supplying gas from an external cylinder. Since the top surface portion and the bottom surface portion of the container are made of a transparent member that transmits light, observation with a microscope can be performed. In this apparatus, an existing microscope and imaging apparatus can be used, and the incubator becomes quite compact. However, since it is equipped with a heater and its sensors, it still requires a certain amount of cost, and it is necessary to secure a space around the microscope for the control controller and CO 2 cylinder. Moreover, since air cannot be sealed in the container, it is necessary to always supply air containing CO 2 gas of an arbitrary concentration, which is not economical.

さらに別の例として、CO2の供給をガスボンベからではなく、CO2を発生する薬剤を使って行うものがある(特許文献3)。薬剤は、具体的には、アスコルビン酸類/金属塩の組み合わせである。この装置では、インキュベータとなる容器に細胞が培養されたディッシュとCO2発生剤を入れ、これを密封する。容器内のCO2濃度は、容器の容積に合わせ薬剤の量を調整することで任意の値に設定できる。この容器の天面と底面は透明となっているため、これを顕微鏡のステージに置くことで細胞の観察が行える。この装置では、ディッシュは密閉された容器の底面に置かれるため、倒立型の顕微鏡を使用した場合、細胞は容器とディッシュの二重の底面を通して観察されることになる。このため、作動距離の長いレンズを使うことになるが、一般的にこのようなレンズは開口数が小さく、蛍光などの光量が少ない試料の観察や高解像度の観察が行えない可能性がある。 As another example, there is a method in which the supply of CO 2 is performed not using a gas cylinder but using a chemical that generates CO 2 (Patent Document 3). The drug is specifically an ascorbic acid / metal salt combination. In this apparatus, a dish in which cells are cultured and a CO 2 generating agent are placed in a container serving as an incubator and sealed. The CO 2 concentration in the container can be set to an arbitrary value by adjusting the amount of the medicine according to the volume of the container. Since the top and bottom surfaces of the container are transparent, cells can be observed by placing the container on a microscope stage. In this apparatus, the dish is placed on the bottom of a sealed container, so that when using an inverted microscope, the cells will be observed through the double bottom of the container and dish. For this reason, a lens having a long working distance is used. However, in general, such a lens has a small numerical aperture, and there is a possibility that observation of a sample with a small amount of light such as fluorescence or high-resolution observation cannot be performed.

特開2006-187205JP2006-187205 特開2004-141143JP2004-141143 特開2007-295826JP2007-295826

本発明は、顕微鏡ステージ上で培養細胞の活性を維持しながら細胞を顕微鏡観察することを可能にするチャンバーを提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a chamber that enables microscopic observation of cells while maintaining the activity of cultured cells on a microscope stage.

本発明は、以下の特徴を含む。   The present invention includes the following features.

本発明は、第1の態様において、顕微鏡下で培養細胞を観察するためのチャンバーであって、細胞培養に適した濃度の二酸化炭素を含む空気を保持することを可能とし、かつ、細胞を含む培養液を導入及び保持することを可能にするスペースを有する気体透過性及び光透過性の担体と、該担体の底部に密着可能に配置される光透過性の基板とを含んでなる、前記チャンバーを提供する。   The present invention, in the first aspect, is a chamber for observing cultured cells under a microscope, can hold air containing carbon dioxide at a concentration suitable for cell culture, and includes cells. The chamber comprising a gas permeable and light transmissive carrier having a space that allows introduction and holding of a culture solution, and a light transmissive substrate disposed in close contact with the bottom of the carrier. I will provide a.

本明細書で使用する「チャンバー」という用語は、少なくとも上記担体と上記基板とを含み、かつ、細胞の培養を可能にするスペースを有する、顕微鏡ステージに載せて培養細胞を観察するための室又はルーム(room)を指す。   As used herein, the term “chamber” refers to a chamber for observing cultured cells on a microscope stage, which includes at least the carrier and the substrate and has a space that allows cell culture. Refers to a room.

本発明の実施形態において、上記スペースは、上記担体と上記基板との接着領域に形成されることを特徴とする。   In an embodiment of the present invention, the space is formed in an adhesion region between the carrier and the substrate.

別の実施形態において、上記スペースは、溝の形状を有することを特徴とする。   In another embodiment, the space has a groove shape.

別の実施形態において、上記溝は、図2に示されるような、細胞の培養を可能にするスペースをさらに含むことを特徴とする。   In another embodiment, the groove further comprises a space allowing cell culture as shown in FIG.

別の実施形態において、本発明のチャンバーは、上記担体の周囲を覆うためのカバーをさらに含むことを特徴とする。   In another embodiment, the chamber of the present invention further includes a cover for covering the periphery of the carrier.

別の実施形態において、本発明のチャンバーは、上記担体の周囲に配置される少なくとも1つの水槽をさらに含むことを特徴とする。   In another embodiment, the chamber of the present invention further includes at least one water tank disposed around the carrier.

本発明はまた、上記定義の本発明のチャンバーを用いて顕微鏡下で培養細胞を観察するための方法であって、以下の(a)〜(f):
(a) 前記チャンバーを構成する部材を殺菌するステップ、
(b) 請求項1に定義された担体を、細胞培養に適した濃度の二酸化炭素を含む空気で飽和させるステップ、
(c) 担体を基板と接着させて形成されたスペースに、細胞を含む培養液を導入するステップ、
(d) 前記チャンバーを、顕微鏡の観察ステージに配置するステップ、
(e) 必要に応じて、前記チャンバーを所定の温度に保持するステップ、及び
(f) 前記細胞を観察するステップ、
からなるステップを含む、方法を提供する。 The present invention is also a method for observing cultured cells under a microscope using the chamber of the present invention as defined above, wherein the following (a) to (f):
(a) sterilizing members constituting the chamber;
(b) saturating the carrier as defined in claim 1 with air containing carbon dioxide at a concentration suitable for cell culture;
(c) introducing a culture solution containing cells into a space formed by adhering a carrier to a substrate;
(d) placing the chamber on an observation stage of a microscope;
(e) if necessary, maintaining the chamber at a predetermined temperature; and
(f) observing the cells;
A method is provided comprising the steps of:

本発明の好適実施形態において、上記方法は、ステップ(c)の後で、担体の周囲をカバーで覆うステップをさらに含む。   In a preferred embodiment of the invention, the method further comprises the step of covering the periphery of the carrier with a cover after step (c).

本発明のチャンバーを培養細胞の顕微鏡観察に使用することによって、インキュベータの外部でも細胞を、その成育に適した培養液のpHのもとに長時間維持することができる。これにより、顕微鏡のステージ上でも、細胞の生理的な活性を維持することができ、またこれを測定することができるようになる。従来の装置のように培養液のpHの調節に必要なCO2をボンベから与え続ける必要がない。またコントローラなどの装置類も不要である。これにより、チャンバーがコンパクト、軽量なものになり取り扱いが容易になる。また計測にかかるコストや実験室のスペースの大幅な削減を行うことができる。 By using the chamber of the present invention for microscopic observation of cultured cells, the cells can be maintained outside the incubator for a long time under the pH of a culture solution suitable for their growth. Thereby, even on the microscope stage, the physiological activity of the cells can be maintained, and this can be measured. There is no need to continuously supply CO 2 necessary for adjusting the pH of the culture solution from the cylinder as in the conventional apparatus. Also, devices such as a controller are unnecessary. This makes the chamber compact and lightweight and easy to handle. In addition, measurement costs and laboratory space can be greatly reduced.

本発明は、上記のとおり、培養細胞を顕微鏡観察するための、かつ、顕微鏡ステージ上で細胞の活性を維持するためのチャンバーを提供する。   As described above, the present invention provides a chamber for microscopic observation of cultured cells and for maintaining the activity of cells on a microscope stage.

本明細書で使用する「細胞の活性を維持する」とは、細胞本来の形態を維持しながら生存することを意味する。逆に、細胞の形態変化や死滅した状態は、細胞が不活性化したことを示す。細胞の活性、形態又は生存は、例えば図5及び図6に示されるように、顕微鏡観察によって判定できる。   As used herein, “maintaining the activity of a cell” means survival while maintaining the original form of the cell. Conversely, a change in cell shape or a dead state indicates that the cell has been inactivated. Cell activity, morphology or survival can be determined by microscopic observation, for example, as shown in FIGS.

本発明のチャンバーは、好適には、基板上に培養された細胞および培養液を、培養に適した空気、例えば5%濃度のCO2を含む空気で飽和させた担体で取り囲む形となっている。形態的には、従来の市販ガラスボトムディッシュやポリマーボトムディッシュで空気であった部分（すなわち、空間部分）が担体となっていることが特長である。本発明で使用される担体は、CO2や酸素などの気体を透過し易い材質からなる。従来の顕微鏡ステージ用のインキュベータでは、空気を長時間、容器内に留めることができないため、常に外部から5%CO2を含む空気を供給する必要があったが、本発明のチャンバーでは、担体から徐々に空気が放出されるため、培養液のpHを細胞の生育に適した7.4付近に長時間維持することができる。さらにこの担体を、大気との空気の交流を遮断するためのカバーで覆うことで、担体からの大気中への空気の漏出を抑えることができる。このため培養液のpHをより長時間維持することができる。 The chamber of the present invention is preferably configured to surround cells and culture medium cultured on a substrate with a carrier saturated with air suitable for culture, for example, air containing 5% CO 2 . . In terms of form, it is a feature that a portion (that is, a space portion) that is air in a conventional commercially available glass bottom dish or polymer bottom dish serves as a carrier. The carrier used in the present invention is made of a material that easily permeates gases such as CO 2 and oxygen. In conventional incubators for microscope stages, air cannot be kept in the container for a long time, so it was necessary to always supply air containing 5% CO 2 from the outside. Since air is gradually released, the pH of the culture solution can be maintained at around 7.4 suitable for cell growth for a long time. Furthermore, by covering this carrier with a cover for blocking the exchange of air with the atmosphere, leakage of air from the carrier into the atmosphere can be suppressed. For this reason, the pH of the culture solution can be maintained for a longer time.

培養液の温度は、既存の顕微鏡用の保温箱や、対物レンズヒーターを併用することで調整することができる。チャンバー内の培養液が少量の場合、長時間の観察ではこれが加温により乾燥しがちである。これを防ぐためにもカバーをかぶせて使用したほうが好ましい。   The temperature of the culture solution can be adjusted by using an existing microscope heat retention box or an objective lens heater. When the amount of the culture solution in the chamber is small, it tends to be dried by heating during long-term observation. In order to prevent this, it is preferable to use the cover.

また、チャンバー内の湿度を高めることで培養液をより長時間、乾燥から防ぐために、少量の水を担体とカバーの間に挟むこと、そのために、例えば担体の周辺に水槽を配置することが好ましい。水槽には、滅菌した水又は温水を入れることができる。   Further, in order to prevent the culture solution from drying for a longer time by increasing the humidity in the chamber, it is preferable to sandwich a small amount of water between the carrier and the cover, and for this purpose, for example, a water tank is disposed around the carrier. . The aquarium can contain sterilized water or warm water.

このような構成により、顕微鏡のステージ上で細胞を生育に適した環境のもとに長時間維持することができる。   With such a configuration, the cells can be maintained on the microscope stage for a long time in an environment suitable for growth.

顕微鏡は、特に限定されないが、例えば倒立型顕微鏡、蛍光顕微鏡、微分干渉顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡などを含む。   The microscope is not particularly limited, and includes, for example, an inverted microscope, a fluorescence microscope, a differential interference microscope, a confocal laser microscope, and the like.

細胞は、CO2含有空気の供給下での培養が必要である細胞のすべてが包含され、通常、動物細胞がそれに含まれる。動物細胞は、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞等の脊椎動物細胞、昆虫細胞等の無脊椎動物細胞などの初代培養細胞、継代細胞、株化細胞などを含み、特に、哺乳類細胞には、非限定的に、例えば腫瘍細胞、神経細胞、器官細胞、筋肉細胞、上皮細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、幹細胞（胚性幹(ES)細胞、誘導多能性幹(iPS)細胞、造血幹細胞、種々の体性幹細胞、等）などが含まれる。 Cells include all cells that need to be cultured under a supply of CO 2 -containing air, and usually include animal cells. Animal cells include mammalian cells, avian cells, vertebrate cells such as amphibian cells, primary cultured cells such as invertebrate cells such as insect cells, subculture cells, established cells, etc. Non-limiting examples include tumor cells, nerve cells, organ cells, muscle cells, epithelial cells, skin cells, fibroblasts, stem cells (embryonic stem (ES) cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, hematopoietic stem cells , Various somatic stem cells, etc.).

培養細胞は、その種類や目的に応じて適宜選択された培地及び培養条件で培養された細胞である。動物細胞の場合、培地は、例えばDMEM（ダルベッコMEM培地）、ハムF-12、RPMI1640、MEM、それらの任意に混合された培地などの基本培地を含む。   The cultured cells are cells cultured in a medium and culture conditions appropriately selected according to the type and purpose. In the case of animal cells, the medium includes a basal medium such as DMEM (Dulbecco MEM medium), Ham F-12, RPMI1640, MEM, or any mixture thereof.

以下に、このチャンバーについて、図面を参照しながら詳細を述べる。   The details of this chamber will be described below with reference to the drawings.

本発明の特長を示すチャンバーの構成を図１a及び図1bに示す。チャンバーは、細胞が培養される基板(4)、細胞と培養液を覆う担体(2)から構成される。また担体から大気への空気の漏出を防ぐために、これを覆うカバー(1)を加えてもよい。培養液の乾燥を防ぐために、担体の周辺に水槽(5)を配して、これを含めてカバー(1)で覆ってもよい。 The chamber configuration showing the features of the present invention is shown in FIGS. 1a and 1b. The chamber is composed of a substrate ( 4 ) on which cells are cultured, and a carrier ( 2 ) that covers the cells and the culture solution. In order to prevent leakage of air from the carrier to the atmosphere, a cover ( 1 ) covering this may be added. In order to prevent the culture medium from drying, a water bath ( 5 ) may be provided around the carrier and covered with a cover ( 1 ).

基板(4)としては、細胞の培養によく使われるカバーグラス、スライドグラス、またはポリスチレン、ポリプロピレンなどのプラスチックを使用できる。細胞の付着性を高めるため、ポリリジン、ポリエチレンイミン、コラーゲンなどの人工又は天然高分子で表面をコートしてもよい。細胞の顕微鏡観察では、倒立型の顕微鏡での蛍光観察がよく行われる。蛍光観察では開口数が大きい油浸用の対物レンズがよく使われるが、一般的にこのようなレンズは作動距離が約0.2mmと短い。したがって、基板としては厚みの少ないカバーグラスが最適である。厚みの少ないカバーガラスは紫外波長域の励起光の透過性が向上することや、自家蛍光が少なくなることからも有利である。 As the substrate ( 4 ), a cover glass, a slide glass, or a plastic such as polystyrene or polypropylene often used for cell culture can be used. In order to enhance the adhesion of cells, the surface may be coated with an artificial or natural polymer such as polylysine, polyethyleneimine or collagen. In microscopic observation of cells, fluorescence observation with an inverted microscope is often performed. In fluorescence observation, an oil immersion objective lens having a large numerical aperture is often used. In general, such a lens has a short working distance of about 0.2 mm. Therefore, a cover glass having a small thickness is optimal as the substrate. A cover glass having a small thickness is advantageous because it improves the transparency of excitation light in the ultraviolet wavelength region and reduces autofluorescence.

担体(2)の一面には細胞および培養液を保持するための溝(3)が彫られ、この面と基板(4)を接着させることで細胞を培養するスペース（溝(3)と細胞培養スペース(6)からなる）が形成される。担体(2)のサイズ及び形状は、非限定的に、好ましくは、直径30mm〜50mm、厚さ5mm〜25mmの円柱形である。また、溝(3)のサイズ及び形状は、非限定的に、好ましくは、幅0.5mm〜3mm、深さ0.3mm〜2mmであり、担体の直径（円形の場合）と同程度の長さを有する直線形である。溝(3)上の任意の位置に形成された細胞培養スペース(6)のサイズ及び形状は、非限定的に、好ましくは、直径2mm〜5mm、深さ0.3mm〜2mmの円形である。細胞培養スペース(6)の好ましい位置は、溝(3)の中央部である。 A groove ( 3 ) for holding cells and a culture solution is carved on one surface of the carrier ( 2 ), and a space for culturing cells (groove ( 3 ) and cell culture) by adhering this surface and the substrate ( 4 ) A space ( 6 ) is formed. The size and shape of the carrier (2) are preferably, but not limited to, a cylindrical shape having a diameter of 30 mm to 50 mm and a thickness of 5 mm to 25 mm. The size and shape of the groove ( 3 ) are preferably, but not limited to, 0.5 mm to 3 mm in width and 0.3 mm to 2 mm in depth, and have a length comparable to the diameter of the carrier (in the case of a circle). It has a linear shape. The size and shape of the cell culture space ( 6 ) formed at an arbitrary position on the groove ( 3 ) are preferably, but not limited to, a circle having a diameter of 2 mm to 5 mm and a depth of 0.3 mm to 2 mm. A preferred position of the cell culture space ( 6 ) is the central part of the groove ( 3 ).

担体(2)の材料としては、以下のような性質をもつものが適している。
・細胞培養スペースをつくるために、微細な加工が容易なこと。
・基板となるガラス等への接着性が高いこと。
・酸素やCO2などの気体の透過性が高いこと。
・顕微鏡観察のため可視域、近赤外の光に対して吸収が少ないこと。また自家蛍光が少ないこと。
・細胞など生体に対して無害であること。
・滅菌処理のため、高圧、高温、紫外線、エタノールに耐性があること。 As the material for the carrier ( 2 ), those having the following properties are suitable.
・ Small processing is easy to create a cell culture space.
-The adhesiveness to the glass etc. used as a substrate is high.
・ Permeability of gases such as oxygen and CO 2 is high.
・ Because of microscopic observation, there should be little absorption for visible and near infrared light. Also, there is little autofluorescence.
・ Harmless to living organisms such as cells.
-Resistant to high pressure, high temperature, ultraviolet rays, and ethanol for sterilization.

このような性質をもつ担体としては、例えばシリコーン樹脂の1つであるpoly(dimethylsiloxane)(PDMS)が使用できる。任意の形状に加工できるが、図2に示した例では、底面の直径が33mm、高さが9mmの円柱状のPDMSのブロックの1つの平面に幅1mm，深さ0.5mmの溝(3)が彫られている。その溝の中央部付近に多数の細胞が培養できるよう、直径3mmの円形のスペース（6）を設けた。この面を基板に接着させることで細胞培養スペースがつくられる。溝や細胞培養スペースは複数（例えば2つ又は3つ）存在してもよく、この場合、複数の細胞種の観察が可能になる。 As the carrier having such properties, for example, poly (dimethylsiloxane) (PDMS) which is one of silicone resins can be used. In the example shown in Fig. 2, a groove with a width of 1 mm and a depth of 0.5 mm is formed on one plane of a cylindrical PDMS block with a bottom diameter of 33 mm and a height of 9 mm in the example shown in Fig. 2 ( 3 ) Is carved. A circular space ( 6 ) with a diameter of 3 mm was provided so that many cells could be cultured near the center of the groove. A cell culture space is created by adhering this surface to the substrate. There may be a plurality of (for example, two or three) grooves and cell culture spaces. In this case, a plurality of cell types can be observed.

PDMSは、カバーグラスなど基板となる材料に接着性が高く、ガラスに対して軽く押しつけるだけで培養液が漏れない程度に強く接着させることができる。この溝(3)の一端から、浮遊状態の細胞を含む培養液をマイクロピペットやポンプを使って流し込むことで、チャンバー内に細胞を導入する。フォトリソグラフィーでは溝の切口を滑らかに作製できるため、途中に気泡が残ることなく培養液を流し込むことができる。この溝の形状および配置は、計測の目的に合わせて変更してもよい。例えば、互いに交わらない複数の溝を彫ることで、異なる種類の細胞や、同種類の細胞でも前処理の条件や培養液の成分を変えたものを同時に培養し、計測に用いることができる。また、PDMSは気体に対する透過性が高いために、細胞培養用のインキュベータ内に置いておくだけで、あらかじめその内部をインキュベータ内の組成の空気で満たすことができる。 PDMS has high adhesion to a substrate material such as a cover glass, and can be strongly adhered to a glass so that the culture solution does not leak by simply pressing it against the glass. Cells are introduced into the chamber by pouring a culture solution containing suspended cells from one end of the groove ( 3 ) using a micropipette or a pump. In photolithography, the groove cuts can be made smoothly, so that the culture solution can be poured without bubbles remaining on the way. The shape and arrangement of the grooves may be changed according to the purpose of measurement. For example, by carving a plurality of grooves that do not intersect with each other, different types of cells, or the same type of cells with different pretreatment conditions and culture medium components can be cultured at the same time and used for measurement. In addition, since PDMS is highly permeable to gas, it can be filled with air having a composition in the incubator in advance by simply placing it in an incubator for cell culture.

カバー(1)は、担体(2)全体を隙間がほとんどないように覆い、担体の底部は基板(4)に接することで、担体(2)と外界との間の空気の交流を遮断する。このため、担体(2)に含まれた空気は、培養液側のみに流れることになる。透過照明による顕微鏡観察を行うためには、材料としては無色透明のガラスやプラスチック（例えば、アクリル製）がよい。また外界との空気の交流を抑えるため、細胞に対して害がなく、取り外しが容易なシリコングリースなどの接着剤を使用して基板と接着させることが望ましい。カバー(1)と基板(4)をより強固に接着させるために、カバー(1)の上部にウェイトを載せてもよい。この場合、透過光による顕微鏡観察を行うために、ウェイトの中央部は光が通過できるよう、くりぬかれた構造のものがよい。ウェイトは、カバーと基板が密着して担体から放出される空気が外界に漏出しないように、カバーの上面に荷重がかかる程度の重さを有する材質のものであればいずれでもよい。材質としては、例えば金属、樹脂、ゴムなどが挙げられる。 The cover ( 1 ) covers the entire carrier ( 2 ) so that there is almost no gap, and the bottom of the carrier is in contact with the substrate ( 4 ), thereby blocking the exchange of air between the carrier ( 2 ) and the outside. For this reason, the air contained in the carrier ( 2 ) flows only to the culture solution side. In order to perform microscopic observation by transmitted illumination, the material is preferably colorless and transparent glass or plastic (for example, made of acrylic). In order to suppress the exchange of air with the outside world, it is desirable to adhere to the substrate using an adhesive such as silicon grease which is harmless to cells and can be easily removed. In order to more firmly bond the cover ( 1 ) and the substrate ( 4 ), a weight may be placed on the upper part of the cover ( 1 ). In this case, in order to perform microscopic observation with transmitted light, the central portion of the weight should have a hollow structure so that light can pass through. Any weight may be used as long as the weight of the cover is such that a load is applied to the upper surface of the cover so that the air released from the carrier does not leak to the outside due to the close contact between the cover and the substrate. Examples of the material include metal, resin, and rubber.

水槽(5)は、チャンバー内の湿度の保持のために、場合により培養液の保温のために、担体の周辺に存在しうる（図1b）。水槽(5)は、担体(2)と一体成形してもよいし、或いは、担体(2)と分離して担体の周囲に対称的に配置してもよい。水槽(5)の個数は、特に制限されないが、操作のし易さを考慮すると、1又は2個が好ましい。水槽の材質は、成形加工の容易なプラスチック、樹脂、ゴムなどが好ましい。 A water bath ( 5 ) may be present around the carrier to maintain humidity in the chamber and possibly to keep the culture medium warm (FIG. 1b). Aquarium (5) may be formed integrally with the carrier (2), or carrier (2) and may be symmetrically disposed around the carrier was separated. The number of water tanks ( 5 ) is not particularly limited, but is preferably 1 or 2 in view of ease of operation. The material of the water tank is preferably plastic, resin, rubber or the like that can be easily molded.

本発明のチャンバーの好ましい形態は、担体(2)、水槽(5)、基板(4)及びカバー(1)から構成される。チャンバーの組み立ては、担体(2)の周囲に水槽(5)を配置し、基板(4)と接着し、これによって細胞培養スペース(6)を形成し、最後にカバー(1)を被せることによって行うことができる。実際に使用する時には、約8時間かけてCO2を含む空気で飽和した担体(2)と基板(4)とを接着させて形成された上記細胞培養スペース(6)の一端からマイクロピペットで細胞培養液を導入したのち、カバー(1)を被せ、顕微鏡ステージに載せて観察を行う。 A preferred embodiment of the chamber of the present invention comprises a carrier ( 2 ), a water tank ( 5 ), a substrate ( 4 ), and a cover ( 1 ). The assembly of the chamber is done by placing a water bath ( 5 ) around the carrier ( 2 ), adhering to the substrate ( 4 ), thereby forming a cell culture space ( 6 ), and finally covering the cover ( 1 ) It can be carried out. When actually used, cells are collected with a micropipette from one end of the cell culture space ( 6 ) formed by adhering the substrate ( 4 ) and the carrier ( 2 ) saturated with CO 2 containing air over about 8 hours. After introducing the culture solution, cover the cover ( 1 ) and place it on the microscope stage for observation.

本発明のチャンバーに導入された細胞は、市販されている一般的な顕微鏡で、透過光や蛍光、発光などによる観察が可能である。冷却CCDカメラなどのイメージング機器を顕微鏡に接続することで、細胞の動態を連続的に記録し解析することができる。複数の細胞培養スペースを、観察視野内に同時に入るように配置することで、これらを同時に観察することができる。また、顕微鏡に電動のXYステージを取り付け、これを駆動しながらイメージングを行うことで、1つの視野に入らなかった複数の細胞培養スペースでも、連続的に観察を行うことができる。   The cells introduced into the chamber of the present invention can be observed with transmitted light, fluorescence, luminescence, etc. with a commercially available general microscope. By connecting an imaging device such as a cooled CCD camera to a microscope, cell dynamics can be continuously recorded and analyzed. By arranging a plurality of cell culture spaces so as to enter the observation field at the same time, these can be observed simultaneously. In addition, by attaching an electric XY stage to a microscope and performing imaging while driving the microscope, continuous observation can be performed even in a plurality of cell culture spaces that have not entered one field of view.

したがって、本発明はさらに、上記定義のチャンバーを用いて顕微鏡下で培養細胞を観察するための方法を提供する。この方法は、以下のステップ:
(a)チャンバーを構成する部材を殺菌するステップ、
(b)担体(2)を、細胞培養に適した濃度のCO2を含む空気で飽和させるステップ、
(c)担体(2)を基板(4)と接着させて形成されたスペースに、細胞を含む培養液を導入するステップ、
(d)チャンバーを、顕微鏡の観察ステージに配置するステップ、
(e)必要に応じて、チャンバーを所定の温度に保持するステップ、及び
(f)細胞を観察するステップ、
を含むことができる。 Accordingly, the present invention further provides a method for observing cultured cells under a microscope using a chamber as defined above. This method involves the following steps:
(a) sterilizing members constituting the chamber;
(b) saturating the carrier ( 2 ) with air containing a concentration of CO 2 suitable for cell culture;
(c) introducing a culture solution containing cells into a space formed by adhering the carrier ( 2 ) to the substrate ( 4 ),
(d) placing the chamber on the observation stage of the microscope;
(e) if necessary, maintaining the chamber at a predetermined temperature; and
(f) observing the cells;
Can be included.

ステップ(a)では、チャンバーを構成する部材、すなわち担体(2)及び基板(4)、追加部材としてのカバー(1)及び水槽(5)、が殺菌される。殺菌手段は、例えばオートクレーブ殺菌、煮沸殺菌、紫外線殺菌などのいずれでもよく、当業界で一般的に使用される手段が望ましい。 In step (a), the members constituting the chamber, that is, the carrier ( 2 ) and the substrate ( 4 ), the cover ( 1 ) and the water tank ( 5 ) as additional members are sterilized. The sterilization means may be any of autoclave sterilization, boiling sterilization, ultraviolet sterilization, etc., and means generally used in the art are desirable.

ステップ(b)では、担体(2)を、細胞培養に適した濃度のCO2を含む空気（通常、5% CO2を含む空気）と約8時間以上接触させて、担体(2)を該空気で飽和させる。 In step (b), the carrier ( 2 ) is brought into contact with air containing CO 2 at a concentration suitable for cell culture (usually, air containing 5% CO 2 ) for about 8 hours or longer, and the carrier ( 2 ) is brought into contact with the carrier ( 2 ). Saturate with air.

ステップ(c)では、担体(2)と基板(4)を接着させてスペースを形成する。このスペースは、担体(2)の底面に形成された溝(3)であり、好ましくはその中央部付近に細胞を培養する空間部(6)が存在する。該スペースの一端に導入された細胞を含む培養液は、空間部に滞留する。もし水槽(5)が存在する場合には、担体(2)の周囲に水槽(5)を配置し、これらはこの状態で基板(4)に接着される。 In step (c), the carrier ( 2 ) and the substrate ( 4 ) are bonded to form a space. This space is a groove ( 3 ) formed on the bottom surface of the carrier ( 2 ), and preferably there is a space ( 6 ) for culturing cells near the center. The culture solution containing the cells introduced into one end of the space stays in the space. If the water tank ( 5 ) exists, the water tank ( 5 ) is arranged around the carrier ( 2 ), and these are bonded to the substrate ( 4 ) in this state.

担体(2)及び水槽(5)の周囲に、備え付けのカバー(1)を被せ、担体(2)から放出される空気が外界にもれ出ないように、例えばカバー(1)の上部にウェイトをかける。しかし、観察に必要とされる時間以上にCO2が維持できるほど、担体(2)の体積をより大きくするときには、カバー(1)は必ずしも必要ではない（実施例4、図7参照）。 Cover the surrounding of the carrier ( 2 ) and water tank ( 5 ) with a cover ( 1 ) provided so that air discharged from the carrier ( 2 ) does not escape to the outside, for example, a weight on the top of the cover ( 1 ) multiply. However, the cover ( 1 ) is not necessarily required when the volume of the carrier ( 2 ) is increased so that CO 2 can be maintained for more than the time required for observation (see Example 4, FIG. 7).

ステップ(d)では、チャンバーを顕微鏡の観察ステージに配置する。このとき、顕微鏡用の保温箱や、対物レンズヒーターを併用して、チャンバーを所定の温度に保持してもよい（ステップ(e)）。   In step (d), the chamber is placed on the observation stage of the microscope. At this time, the chamber may be maintained at a predetermined temperature by using a heat retention box for a microscope and an objective lens heater together (step (e)).

最後に、ステップ(f)では、チャンバー内の培養細胞を顕微鏡で観察する。   Finally, in step (f), the cultured cells in the chamber are observed with a microscope.

本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。   The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples.

実施例1 担体への空気の充填
チャンバーへの細胞の導入は、担体にその生育条件に適した組成の空気を十分に充填させてから行うほうがよい。そこで、担体が置かれた環境の空気によって飽和されるまでの時間を測定した。 Example 1 Filling of carrier with air It is better to introduce cells into the chamber after sufficiently filling the carrier with air having a composition suitable for the growth conditions. Therefore, the time until saturation with the air in the environment where the carrier was placed was measured.

担体(2)として図2に示した円柱形のPDMSのブロックを使用した。この担体(2)と、基板(4)としてのカバーグラス(40×50mm，厚さ0.12〜0.17mm)をオートクレーブ(120℃，20分)で滅菌した。その後、担体(2)の溝(3)が作られた面とカバーグラス(4)を押しつけることで両者を接着させた。細胞培養スペース(6)を有する溝(3)に培養液を入れ、これを5%のCO2を含む空気で満たされたインキュベータ内に一定の時間置くことで、その空気を担体(2)および培養液に取り込ませた。 The cylindrical PDMS block shown in FIG. 2 was used as the carrier ( 2 ). The carrier ( 2 ) and a cover glass (40 × 50 mm, thickness 0.12 to 0.17 mm) as a substrate ( 4 ) were sterilized by an autoclave (120 ° C., 20 minutes). Thereafter, the surface of the carrier ( 2 ) on which the groove ( 3 ) was formed and the cover glass ( 4 ) were pressed to bond them together. The culture solution is placed in a groove ( 3 ) having a cell culture space ( 6 ) and placed in an incubator filled with air containing 5% CO 2 for a certain period of time so that the air is transferred to the carrier ( 2 ) and It was made to take in to a culture solution.

この空気を取り込んだ培養液は大気よりも高濃度のCO2を含むため、大気下に置かれたものよりもpHが低くなる。そこで、インキュベータ内にある時間置かれたときの培養液のpHの低下を測定することで、担体(2)が5%のCO2の空気で満たされる時間を測定した。培養液としてDulbecco’s modified eagle medium (DMEM)を使用し、これに蛍光性のpH指示薬である2’,7’-Bis(carboxyethyl)-4 又は 5-carboxyfluorescein (BCECF)を1μMの濃度になるように加えた。この指示薬はpHの変化にともない励起スペクトルが変化する特性をもち、溶液のpHが高くなるにつれ490nmの励起で測定される蛍光の強度が増加する。また440nmの励起では、pHが変化しても蛍光強度がほとんど変化しない。そこで440nm励起での蛍光をリファレンスとして、この2つの励起波長による蛍光を測定し、そのレシオ(490nm/440nm)の変化をpHの変化として測定した。 Since the culture solution that has taken in the air contains CO 2 having a higher concentration than the atmosphere, the pH is lower than that in the atmosphere. Therefore, the time during which the carrier ( 2 ) was filled with 5% CO 2 air was measured by measuring the decrease in pH of the culture solution when placed in the incubator for a certain period of time. Use Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) as the culture medium, and add 2 ', 7'-Bis (carboxyethyl) -4 or 5-carboxyfluorescein (BCECF), which is a fluorescent pH indicator, to a concentration of 1 μM. added. This indicator has the property that the excitation spectrum changes as the pH changes. As the pH of the solution increases, the intensity of fluorescence measured by excitation at 490 nm increases. Also, with excitation at 440 nm, the fluorescence intensity hardly changes even when the pH changes. Therefore, fluorescence at these two excitation wavelengths was measured using fluorescence at 440 nm excitation as a reference, and the change in the ratio (490 nm / 440 nm) was measured as the change in pH.

測定は倒立型蛍光顕微鏡(IX70，オリンパス)を用いて行った。励起光をそれぞれ半値幅20nmの440nm，490nmのバンドパスフィルタを通して交互に照射し、それぞれの蛍光を515-560nmのバンドパスフィルタを通して検出した。対物レンズは20倍、開口数0.75のものを使用した。蛍光像は3板式の冷却CCDカラーカメラ(ORCA-3CCD，浜松ホトニクス)によりデジタル画像として取得した。取得された画像から、ダークノイズ分の輝度を減算した後、BCECFの蛍光の大部分が取得されるGreenチャンネルの全画素(336×256画素)の平均の輝度をもとめ、490nm/440nmのレシオを計算した。演算は画像解析装置AQUACOSMOS(浜松ホトニクス)により行った。   The measurement was performed using an inverted fluorescence microscope (IX70, Olympus). Excitation light was alternately irradiated through bandpass filters of 440 nm and 490 nm each having a half width of 20 nm, and each fluorescence was detected through a bandpass filter of 515-560 nm. An objective lens having a magnification of 20 times and a numerical aperture of 0.75 was used. The fluorescence image was acquired as a digital image with a three-plate cooled CCD color camera (ORCA-3CCD, Hamamatsu Photonics). After subtracting the luminance of dark noise from the acquired image, obtain the average luminance of all the pixels (336 × 256 pixels) of the Green channel where most of the BCECF fluorescence is acquired, and calculate the ratio of 490 nm / 440 nm Calculated. The calculation was performed with the image analysis device AQUACOSMOS (Hamamatsu Photonics).

結果を図3に示す。担体をインキュベータに置いてから、1時間後からチャンバー内の培養液のpHの低下が観察され、8時間後に蛍光のレシオが安定した。したがって、使用した担体では8時間で全体がインキュベータ内の空気で満たされることがわかった。pHメータで測定された、大気下に置かれた培養液のpHは8.4であり、インキュベータ内の空気で飽和させた培養液のpHは7.5であった。したがって、この実験の開始時のBCECFの蛍光のレシオ4.24および、8時間後のレシオ3.55はpHとしてはこれらの値に相当する。   The results are shown in Figure 3. A drop in pH of the culture medium in the chamber was observed after 1 hour after placing the carrier in the incubator, and the fluorescence ratio stabilized after 8 hours. Therefore, it was found that the entire carrier was filled with air in the incubator in 8 hours. The pH of the culture medium placed in the atmosphere measured with a pH meter was 8.4, and the pH of the culture liquid saturated with air in the incubator was 7.5. Therefore, the BCECF fluorescence ratio of 4.24 at the start of this experiment and the ratio of 3.55 after 8 hours correspond to these values as pH.

実施例2 培養液のpHが維持される時間
インキュベータ内の空気で満たされた担体(2)をもつチャンバーで、どの程度培養液のpHが維持されるか測定した。担体(2)として実施例1と同じ、図2に示したPDMSのブロックを使用し、これをカバーグラス(4)に接着させることでチャンバーを作製した(PDMSチャンバー)。細胞培養スペースに、1μMのBCECFを含むDMEMを入れたものを2式用意し、これらを5%CO2のインキュベータ内に8時間以上置くことで、担体およびDMEMをその空気で飽和させた。また、通常の細胞観察に用いられる条件である、35mmφのガラスボトムチャンバー（自家製。Corning社のプラスチック製ディッシュの底の中央部に14mmφの孔を開け、松浪硝子社の22mmφの丸形カバーグラスを貼り付けたもの）にDMEMを1ml入れたものを対照として、これに1μMのBCECFを加えたものを2式用意し、同様にインキュベータ内に置いた。その後、1つのPDMSチャンバーには、厚さ2mmのアクリル製のカバー(1)をかぶせ、基板(4)との間をシリコングリースにより封じた。さらにカバー(1)の上に330gのステンレスのウェイトを置くことで、基板(4)との接着を強固なものにした。もう1つのPDMSチャンバーは、カバーをかぶせない状態で測定に使用した。ガラスボトムチャンバーは、通常使用するようにふたをかぶせたものと、ふたをはずしたものの2通りで測定に使用した。測定のための装置および方法は実施例1と同じである。 Example 2 Time for Maintaining pH of Culture Solution It was measured how much the pH of the culture solution was maintained in a chamber having a carrier ( 2 ) filled with air in an incubator. The same PDMS block shown in FIG. 2 as in Example 1 was used as the carrier ( 2 ), and this was adhered to the cover glass ( 4 ) to prepare a chamber (PDMS chamber). Two sets of DMEM containing 1 μM BCECF were prepared in the cell culture space, and these were placed in a 5% CO 2 incubator for 8 hours or more to saturate the carrier and DMEM with the air. In addition, a 35mmφ glass bottom chamber (homemade. A 14mmφ hole is drilled in the center of the bottom of a Corning plastic dish, and a 22mmφ round cover glass from Matsunami Glass Co., Ltd. As a control, 1 ml of DMEM was added to the pasted one) and two sets of 1 μM BCECF were prepared and placed in an incubator in the same manner. Thereafter, an acrylic cover ( 1 ) having a thickness of 2 mm was put on one PDMS chamber, and the space between the substrate ( 4 ) was sealed with silicon grease. Furthermore, a 330 g stainless steel weight was placed on the cover ( 1 ) to strengthen the adhesion to the substrate ( 4 ). The other PDMS chamber was used for the measurement without a cover. The glass bottom chamber was used for measurement in two ways: one with a lid for normal use and one with the lid removed. The apparatus and method for measurement are the same as in Example 1.

CO2インキュベータから出してからのDMEMのpHの変化を経時的に測定した。結果を図４に示す。ガラスボトムチャンバーでは2式とも、測定開始後から急速なpHの増加が見られ、20分後には大気下のDMEMのpHの値に戻された。ガラスボトムチャンバーでは、インキュベータから出すことで培養液内のCO2の放出が急速に起こり、培養液のアルカリ化が起きていると思われる。また、ふたをはずしたものでは培養液の乾燥も急速で、120分後にはほとんどの液が消失した。 The change in pH of DMEM after removal from the CO 2 incubator was measured over time. The results are shown in FIG. In the two types of glass bottom chambers, a rapid increase in pH was observed after the start of measurement, and after 20 minutes, the pH value of DMEM in the atmosphere was restored. In the glass bottom chamber, it is considered that CO 2 in the culture broth is rapidly released from the incubator and the culture broth is alkalized. In addition, with the lid removed, the culture broth dried rapidly, and most of the broth disappeared after 120 minutes.

一方、PDMSチャンバーを使用したもののうち、カバー(1)をかぶせなかったものでは、約100分後まではpHはほぼ一定に保たれたが、その後次第に上昇した。使用した形状のPDMSの担体では、大気に対して開放状態であっても、100分間は5%のCO2の環境を培養液に対して維持させるほどの空気を保持していたが、その後は徐々に外部の空気との交換によりCO2濃度が低下したものと考えられる。 On the other hand, in the case where the PDMS chamber was used and the cover ( 1 ) was not covered, the pH was kept almost constant until about 100 minutes later, but then gradually increased. In the PDMS carrier of the shape used, even though it was open to the atmosphere, it maintained enough air to maintain a 5% CO 2 environment for the culture solution for 100 minutes. It is thought that the CO 2 concentration was gradually lowered by the exchange with the outside air.

PDMSチャンバーで、カバー(1)により担体(2)を封じたものは、計測を行った24時間後にもpHの増加がほとんど見られなかった。このことは、5%CO2で飽和された担体(2)をカバー(1)で封じることで、長時間安定して培養液のpHが維持できることを示している。しかし、担体(2)をカバー(1)で封じた場合でも外界との空気の交流を完全に遮断することは困難である。したがって、担体内に保持させた空気は徐々に大気下の空気と入れ替わる。チャンバーがインキュベータ内の空気を保持できる時間は担体の容積に依存する。したがって、より長時間の計測を行うためには、より容積の大きい担体を使ったほうがよい。 In the PDMS chamber, the carrier ( 2 ) sealed with the cover ( 1 ) showed almost no increase in pH even 24 hours after the measurement. This indicates that the pH of the culture solution can be stably maintained for a long time by sealing the carrier ( 2 ) saturated with 5% CO 2 with the cover ( 1 ). However, even when the carrier ( 2 ) is sealed with the cover ( 1 ), it is difficult to completely block air exchange with the outside world. Therefore, the air held in the carrier is gradually replaced with air in the atmosphere. The time that the chamber can hold the air in the incubator depends on the volume of the carrier. Therefore, in order to perform measurement for a longer time, it is better to use a carrier having a larger volume.

実施例3 細胞の観察
PDMSチャンバーで実際に細胞がどの程度培養できるか観察した。試料として、蛍光蛋白質であるVenusを発現させたCos7細胞（Nagai,T., Nature Biotechnology, Vol.20, p.87-90, 2002）を使用した。担体として実施例1と同じ、図2に示したPDMSブロック(2)を使用し、これをカバーグラス(4)に接着させることでチャンバーを作製した。これをCO2インキュベータ内に8時間以上置き、5%CO2を含む空気を保持させた。浮遊状態の細胞を培養液(DMEM)とともにマイクロピペットで流し込むことでチャンバーの細胞培養スペースに導入した。チャンバーをさらに1日CO2インキュベータ内に置くことで細胞を基板に定着させた。このチャンバーを実施例2と同様にカバー(1)で封入しウェイトで固定した状態で、蛍光顕微鏡で観察を行った。顕微鏡、冷却CCD、画像解析装置は実施例1と同じものを使用した。励起光を半値幅20nmの490nmのバンドパスフィルタを通して照射し、蛍光を515-560nmのバンドパスフィルタを通して検出した。対物レンズは60倍、開口数1.40(油浸)のものを使用した。細胞の活性を維持するように、観察視野の培養液の温度を対物レンズヒーター(MATS-LH，東海ヒット)により、約37℃に加温した。加温による培養液の乾燥を抑えるため、担体(2)上面とカバー(1)の間に500μlの水をはさみこみ、チャンバー内の湿度を保持した。対照として同様にVenusを発現させたCos7細胞をガラスボトムチャンバーに培養したものでも観察を行った。 Example 3 Observation of cells
We observed how much cells could actually be cultured in the PDMS chamber. As a sample, Cos7 cells (Nagai, T., Nature Biotechnology, Vol. 20, p. 87-90, 2002) expressing Venus as a fluorescent protein were used. The same PDMS block ( 2 ) shown in FIG. 2 as that of Example 1 was used as a carrier, and this was adhered to a cover glass ( 4 ) to produce a chamber. This was placed in a CO 2 incubator for 8 hours or more to hold air containing 5% CO 2 . The suspended cells were introduced into the cell culture space of the chamber by pouring with a culture solution (DMEM) with a micropipette. Cells were fixed to the substrate by placing the chamber in a CO 2 incubator for an additional day. In the same manner as in Example 2, the chamber was sealed with a cover ( 1 ) and fixed with a weight, and observed with a fluorescence microscope. The same microscope, cooling CCD, and image analysis apparatus as in Example 1 were used. Excitation light was irradiated through a 490 nm bandpass filter with a half width of 20 nm, and fluorescence was detected through a 515-560 nm bandpass filter. An objective lens having a magnification of 60 and a numerical aperture of 1.40 (oil immersion) was used. In order to maintain the cell activity, the temperature of the culture solution in the observation field was heated to about 37 ° C. with an objective lens heater (MATS-LH, Tokai Hit). In order to suppress drying of the culture solution due to heating, 500 μl of water was sandwiched between the upper surface of the carrier ( 2 ) and the cover ( 1 ) to maintain the humidity in the chamber. As a control, Cos7 cells in which Venus was similarly expressed were also cultured in a glass bottom chamber.

発現されたVenusの蛍光は細胞全体で観察されたため、細胞全体の形態が明確に観察できた。そこで細胞の蛍光像のタイムラプスイメージングを行い、その形態の変化から細胞の活性を評価した。結果を図5、図6に示す。Cos7細胞は不定形の細胞形態を示すが、培養状態では基板(4)との接着面を広げたよく伸展した像が観察される。PDMSチャンバーに培養された細胞では、大きな移動は見られなかったが、よく伸展した状態を保ち、活発に細胞の周辺部を動かしている様子が観察された。観察を行った24時間後までの活性の維持が確認された。PDMSブロック(2)からの蛍光はほとんどなく背景光が低く保たれたため、クリアな細胞の蛍光像が取得できた。 Since the fluorescence of the expressed Venus was observed throughout the cells, the morphology of the whole cells could be clearly observed. Therefore, time-lapse imaging of the fluorescence image of the cell was performed, and the activity of the cell was evaluated from the change in its morphology. The results are shown in FIGS. Cos7 cells exhibit an irregular cell morphology, but a well-stretched image with a wide adhesive surface with the substrate ( 4 ) is observed in the cultured state. Although the cells cultured in the PDMS chamber did not show any significant migration, they were observed to remain well stretched and actively move around the cells. It was confirmed that the activity was maintained until 24 hours after the observation. There was almost no fluorescence from the PDMS block ( 2 ), and the background light was kept low, so a clear fluorescence image of the cells could be obtained.

一方、ガラスボトムチャンバーで培養された細胞は、培養液のアルカリ化が起きていると思われる1時間後には収縮による細胞の形態変化が観察された。その後、その形態で数時間は生存したが、やがてさらに収縮を起こし、9時間後には崩壊した。崩壊した細胞からはほとんどの蛍光蛋白質が流出したため、一部の残存した蛍光のみが観察された。これらの結果から、PDMSチャンバーによる培養液のpHの維持が、顕微鏡ステージ上での細胞の活性の維持に有効であることが示された。   On the other hand, in the cells cultured in the glass bottom chamber, a change in cell morphology due to contraction was observed 1 hour after the culture solution was considered to be alkalized. After that, it survived for several hours in that form, but eventually contracted further and collapsed after 9 hours. Since most of the fluorescent protein flowed out from the collapsed cells, only a part of the remaining fluorescence was observed. From these results, it was shown that maintaining the pH of the culture solution by the PDMS chamber is effective for maintaining the activity of the cells on the microscope stage.

実施例4 カバーがないチャンバーの形態
実施例2の培養液のpH維持の計測で示されたように、PDMSチャンバーでは、担体(2)にカバー(1)を被せないものでも、短時間ではあるが培養液のpHを維持する効果がある(図4，PDMS w/o Cover)。細胞の活性を評価する実験において、生理現象によっては数分から数十分程度で測定できるものも多い。このような短時間の測定系においては、必ずしもカバー(1)による担体(2)の封入は必要ない。したがって、計測に必要な時間、pHの維持が可能な形状の担体(2)を用いることで、カバー(1)がなくてもチャンバーとしての利用が可能となる。培養液のpHを維持できる時間は、担体の形状および容積に依存する。一例として、図２に示した33mmφ×9mmのPDMSブロック(2)と、これよりも大きい37mmφ×20mmのPDMSブロック(2)でDMEMのpHが維持される時間を実施例2と同様の計測を行うことで比較した。結果を図7に示す。33mmφ×9mmのものでは100分までpHが維持されるのに対し、37mmφ×20mmのものではpHが維持される時間が4時間まで延長された。この場合、チャンバーを封入により外界から遮断する必要がなくなるため、細胞培養スペース(6)へ薬剤を投与し、その応答を測定する実験も可能となる。細胞が活性を維持した状態での測定が行えるため、より正確な細胞の応答を得ることができる。 Example 4 Form of chamber without cover As shown in the measurement of pH maintenance of the culture solution of Example 2, in the PDMS chamber, even if the carrier ( 2 ) does not cover the cover ( 1 ), it is a short time Has the effect of maintaining the pH of the culture (Figure 4, PDMS w / o Cover). In experiments for evaluating the activity of cells, many physiological phenomena can be measured in minutes to tens of minutes. In such a short-time measurement system, it is not always necessary to enclose the carrier ( 2 ) with the cover ( 1 ). Therefore, by using the carrier ( 2 ) having a shape capable of maintaining the pH for the time required for measurement, it can be used as a chamber without the cover ( 1 ). The time during which the pH of the culture solution can be maintained depends on the shape and volume of the carrier. As an example, the time for maintaining the pH of DMEM in the PDMS block ( 2 ) of 33 mmφ × 9 mm shown in FIG. 2 and the PDMS block ( 2 ) of 37 mmφ × 20 mm larger than this is measured in the same way as in Example 2. It was compared by doing. The results are shown in FIG. In the case of 33 mmφ × 9 mm, the pH was maintained up to 100 minutes, while in the case of 37 mmφ × 20 mm, the time for maintaining the pH was extended to 4 hours. In this case, since it is not necessary to block the chamber from the outside by sealing, an experiment can be performed in which a drug is administered to the cell culture space ( 6 ) and the response is measured. Since the measurement can be performed in a state in which the cells maintain activity, a more accurate cell response can be obtained.

本発明のチャンバーは、顕微鏡ステージ上の培養細胞の活性を長時間維持したまま顕微鏡観察を可能にする非常にシンプルな構造のチャンバーであるため、大掛かりな装置を必要とせずに培養細胞の観察が可能となる。このため、このチャンバーは、培養細胞を扱い、顕微鏡観察が行われる、工学分野、農学分野、医学分野などの分野で利用可能である。   The chamber of the present invention is a chamber with a very simple structure that enables microscopic observation while maintaining the activity of the cultured cells on the microscope stage for a long time, so that cultured cells can be observed without requiring a large-scale apparatus. It becomes possible. For this reason, this chamber can be used in fields such as the engineering field, agricultural field, and medical field where cultured cells are handled and microscopic observation is performed.

本発明のチャンバーの構成を示す。図1aは、細胞を含む培養液を導入及び保持することを可能にするスペースを含む担体（2）と、該担体(2)と密着させて細胞培養可能なスペース（溝(3)と細胞培養スペース(6)からなる）を形成するための基板(4)と、該担体(2)を覆うためのカバー(1)とからなる、チャンバーの構成を示す。図1bは、担体(2)と、基板(4)と、カバー(1)と、水槽(5)とからなる、チャンバーの構成を示し、ここで、該水槽(5)は、培養液の乾燥を防ぎ、チャンバー内の湿度を保持するためのものであり、内部に水又は温水を入れることができる。水槽(5)は、担体(2)の周囲に2個配置されている。The structure of the chamber of this invention is shown. FIG. 1a shows a carrier ( 2 ) including a space that allows introduction and holding of a culture solution containing cells, and a space (groove ( 3 ) and cell culture in which the carrier ( 2 ) is brought into close contact with the carrier ( 2 ). The structure of a chamber comprising a substrate ( 4 ) for forming a space ( 6 ) and a cover ( 1 ) for covering the carrier ( 2 ) is shown. FIG.1b shows the configuration of a chamber consisting of a carrier ( 2 ), a substrate ( 4 ), a cover ( 1 ) and a water tank ( 5 ), where the water tank ( 5 ) is a dried culture medium. In order to prevent humidity and maintain the humidity in the chamber, water or hot water can be put inside. Two water tanks ( 5 ) are arranged around the carrier ( 2 ). 本発明のチャンバーを構成するPDMS担体(2)の加工例を示す投影図である。担体(2)は、直径33mm、高さ9mmの円柱形の形状を有し、担体(2)の底面に幅1mm、流路の高さ（深さ）500μm(0.5mm)の溝(3)が彫られており、その中央部にはさらに、細胞の培養が可能なように直径3mmの円形スペース(6)が彫られている。FIG. 5 is a projection view showing a processing example of a PDMS carrier ( 2 ) constituting the chamber of the present invention. The carrier ( 2 ) has a cylindrical shape with a diameter of 33 mm and a height of 9 mm. The groove ( 3 ) has a width of 1 mm on the bottom surface of the carrier ( 2 ) and a height (depth) of the flow path of 500 μm (0.5 mm). A circular space ( 6 ) with a diameter of 3 mm is further carved in the center so that cells can be cultured. 培地中の担体(2)（図2に示す構造）が5% CO2含有空気で飽和されるまでの時間(hr)を示す。培地としてDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）を使用し、pH指示薬であるBCECF(2’,7’-ビス（カルボキシエチル）−4-又は5-カルボキシフルオレセン)の励起スペクトル(490nm/440nm)の変化をpHの変化として測定した結果を示す。The time (hr) until the carrier ( 2 ) in the medium (structure shown in FIG. 2) is saturated with 5% CO 2 -containing air is shown. Using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) as the medium, the excitation spectrum (490nm / 440nm) of BCECF (2 ', 7'-bis (carboxyethyl) -4- or 5-carboxyfluorescene), a pH indicator The result of having measured a change as a change of pH is shown. PDMS細胞培養チャンバー（図2の担体）及び、対照としてのガラスボトム(G.B.)チャンバー（自家製。Corning社のプラスチック製ディッシュの底の中央部に14mmφの孔を開け、松浪硝子社の22mmφの丸形カバーグラスを貼り付けたもの）による培養液(DMEM)のpHの維持がカバー(Cover)の有無によって影響を受けることを示す図である。横軸は、培養時間(hr)を示し、縦軸は、BCECFレシオ(490nm/440nm)を示す。PDMS cell culture chamber (carrier in Fig. 2) and glass bottom (GB) chamber as a control (homemade. A 14mmφ hole was drilled in the center of the bottom of a Corning plastic dish and a 22mmφ round shape from Matsunami Glass Co., Ltd. It is a figure which shows that the maintenance of the pH of the culture solution (DMEM) by what attached the cover glass is influenced by the presence or absence of a cover (Cover). The horizontal axis represents the culture time (hr), and the vertical axis represents the BCECF ratio (490 nm / 440 nm). PDMS細胞培養チャンバー内のCos7細胞の蛍光顕微鏡で観察された経時的形態変化を示す図である。数字は、培養試験開始からの時間(hr)を表す。It is a figure which shows the time-dependent morphological change observed with the fluorescence microscope of Cos7 cell in a PDMS cell culture chamber. The numbers represent the time (hr) from the start of the culture test. ガラスボトムチャンバー（対照）内のCos7細胞の蛍光顕微鏡で観察された経時的形態変化を示す図である。数字は、培養試験開始からの時間(hr)を表す。It is a figure which shows the time-dependent morphological change observed with the fluorescence microscope of the Cos7 cell in a glass bottom chamber (control). The numbers represent the time (hr) from the start of the culture test. PDMS細胞培養チャンバー（カバーなし）による培養液(DMEM)のpHの維持に及ぼす担体の容積の影響を示す図である。It is a figure which shows the influence of the volume of a support | carrier on maintenance of the pH of the culture solution (DMEM) by a PDMS cell culture chamber (without a cover).

符号の説明Explanation of symbols

1 カバー
2 担体、PDMSブロック
3 溝
4 基板、カバーグラス
5 水槽
6 細胞培養スペース 1 Cover
2 Carrier, PDMS block
3 groove
4 Substrate, cover glass
5 aquarium
6 Cell culture space

Claims (8)

顕微鏡下で培養細胞を観察するためのチャンバーであって、細胞培養に適した濃度の二酸化炭素を含む空気を保持することを可能とし、かつ、細胞を含む培養液を導入及び保持することを可能にするスペースを有する気体透過性及び光透過性の担体と、該担体の底部に密着可能に配置される光透過性の基板とを含んでなる、前記チャンバー。   A chamber for observing cultured cells under a microscope, which can hold air containing carbon dioxide at a concentration suitable for cell culture, and can introduce and hold culture fluid containing cells The chamber comprising: a gas permeable and light transmissive carrier having a space to be formed; and a light transmissive substrate disposed in close contact with the bottom of the carrier. 前記スペースが、前記担体と前記基板との接着領域に形成される、請求項1に記載のチャンバー。   2. The chamber according to claim 1, wherein the space is formed in an adhesive region between the carrier and the substrate. 前記スペースが、溝の形状を有する、請求項1又は2に記載のチャンバー。   The chamber according to claim 1 or 2, wherein the space has a groove shape. 前記溝が、細胞の培養を可能にするスペースをさらに含む、請求項3に記載のチャンバー。   4. The chamber of claim 3, wherein the groove further comprises a space that allows cell culture. 前記担体の周囲を覆うためのカバーをさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のチャンバー。   The chamber according to any one of claims 1 to 4, further comprising a cover for covering the periphery of the carrier. 前記担体の周囲に配置される少なくとも1つの水槽をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のチャンバー。   The chamber according to any one of claims 1 to 5, further comprising at least one water tank arranged around the carrier. 請求項1〜6のいずれか1項に記載のチャンバーを用いて顕微鏡下で培養細胞を観察するための方法であって、以下の(a)〜(f):
(a) 前記チャンバーを構成する部材を殺菌するステップ、
(b) 請求項1に定義された担体を、細胞培養に適した濃度の二酸化炭素を含む空気で飽和させるステップ、
(c) 担体を基板と接着させて形成されたスペースに、細胞を含む培養液を導入するステップ、
(d) 前記チャンバーを、顕微鏡の観察ステージに配置するステップ、
(e) 必要に応じて、前記チャンバーを所定の温度に保持するステップ、及び
(f) 前記細胞を観察するステップ、
からなるステップを含む、前記方法。 A method for observing cultured cells under a microscope using the chamber according to any one of claims 1 to 6, comprising the following (a) to (f):
(a) sterilizing members constituting the chamber;
(b) saturating the carrier as defined in claim 1 with air containing carbon dioxide at a concentration suitable for cell culture;
(c) introducing a culture solution containing cells into a space formed by adhering a carrier to a substrate;
(d) placing the chamber on an observation stage of a microscope;
(e) if necessary, maintaining the chamber at a predetermined temperature; and
(f) observing the cells;
The method comprising the steps of: ステップ(c)の後で、担体の周囲をカバーで覆うステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。   The method according to claim 7, further comprising the step of covering the periphery of the carrier with a cover after step (c).
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