JP2010008082A - Multiphoton excitation measuring instrument - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an image having almost equal brightness without damaging a sample by the heating due to light pulse and depending on the position of an observation point in a multiphoton excitation measuring instrument. <P>SOLUTION: The multiphoton excitation measuring instrument includes observation point displacing means (7 and 42) and control means (81 and 83). The light pulse emitted from a short pulse light source (2) is condensed to the observation point of the sample (6), so that the fluorescence due to multiphoton excitation is detected as signal light by a detector (48). This signal light is imaged to be displayed on a monitor (82). The observation point displacing means (7 and 42) displace the observation point, and the control means (81 and 83) control the repeated frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source (2) according to the position of the observation point. The short pulse light source (2) is almost constant in average intensity of light to keep the repeated frequency of the light pulse regulated to regulate the intensity of the signal light to be detected. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、多光子吸収現象を用いて観察対象の測定を行う多光子励起測定装置に関するものである。   The present invention relates to a multiphoton excitation measurement apparatus that measures an observation target using a multiphoton absorption phenomenon.

近年、生命科学の先端研究分野等では、生体等の標本のより深部を観察したいという要請が高まっている。多光子吸収現象を用いた多光子励起測定装置の一例としての多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムは、組織透過性の高い長波長のレーザ光を使用するので、従来使用されている共焦点レーザ顕微鏡と比べて、生体標本の深部を観測するのに適している。   In recent years, in the advanced research field of life science and the like, there is an increasing demand for observing a deeper part of a specimen such as a living body. The multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system, which is an example of a multiphoton excitation measurement apparatus using the multiphoton absorption phenomenon, uses a long-wavelength laser beam with high tissue permeability, so that a confocal laser conventionally used Compared to a microscope, it is suitable for observing deep parts of biological specimens.

多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムにより試料の表層部から深層部まで異なる深さにおける画像データを取得するには、試料への入射光の光軸に垂直な平面であるＸＹ平面に対して入射光の集光点を走査しつつ、該試料からの反射光又は透過光を検出することによってＸＹ方向の２次元平面の画像データを取得し、上記入射光の集光点を光軸と平行な方向であるＺ軸方向に変化させて、試料から発生する信号光を観察する。   In order to acquire image data at different depths from the surface layer to the deep layer of the sample using a multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system, it is incident on the XY plane, which is a plane perpendicular to the optical axis of the incident light on the sample. By scanning the light condensing point and detecting reflected light or transmitted light from the sample, image data of a two-dimensional plane in the XY direction is acquired, and the condensing point of the incident light is parallel to the optical axis. The signal light generated from the sample is observed while changing in the direction of the Z axis.

ところで、上述のようにＺ軸方向に集光位置を変えた場合、励起光パルスは試料の表面から深部に至る際に散乱・吸収を受けるため、試料の表面と同一の多光子励起を行うことはできない。また、得られる画像も、表層部からの深さが深くなるに従い、試料から発する蛍光が散乱や吸収を受けるために輝度が低下してしまうという現象が生じる。そのため、集光位置の試料表層部からの深さに応じて、レーザ光の光強度を変化させることや、単位時間当たりに照射する光パルス数を変化させることによって、輝度を均一化する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。   By the way, when the condensing position is changed in the Z-axis direction as described above, the excitation light pulse is scattered and absorbed when it reaches the deep part from the surface of the sample, so that the same multiphoton excitation as the surface of the sample is performed. I can't. In addition, in the obtained image, as the depth from the surface layer portion becomes deeper, a phenomenon occurs in which luminance decreases because fluorescence emitted from the sample is scattered and absorbed. Therefore, there is a method to make the luminance uniform by changing the light intensity of the laser light or changing the number of light pulses irradiated per unit time according to the depth from the sample surface layer portion at the condensing position. It has been proposed (see, for example, Patent Document 1).

図１３は、特許文献１に記載された多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図を示している。この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１０１では、超短パルスレーザと音響光学素子（ＡＯＭ）とを備える光源装置１０２から出射した光パルスが、２次元走査機構１０３、ミラー１０４を経由して、対物レンズ１０５により試料１０７内の集光点に集光する。ここで、光源装置１０２の超短パルスレーザは、所定の繰返し周波数で光パルス列を発振する。   FIG. 13 shows a schematic configuration diagram of the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system described in Patent Document 1. As shown in FIG. In this multi-photon excitation laser scanning fluorescence microscope system 101, a light pulse emitted from a light source device 102 including an ultrashort pulse laser and an acoustooptic device (AOM) is transmitted through a two-dimensional scanning mechanism 103 and a mirror 104. The light is condensed at a condensing point in the sample 107 by the objective lens 105. Here, the ultrashort pulse laser of the light source device 102 oscillates an optical pulse train at a predetermined repetition rate.

また、ＡＯＭはこの光パルス列の一部の透過を抑止して単位時間当たりのパルス数を変化させる、あるいは、強度変調を行う機能を有する。さらに、２次元走査機構１０３は、試料内の集光点を入射する光パルスの光軸と垂直な２次元平面、すなわちＸＹ平面内で走査可能としている。対物レンズ１０５には、この対物レンズ１０５を試料１０７に対してＺ方向に変位させるためのＺ軸方向駆動部１０６が接続されている。   Further, the AOM has a function of suppressing the transmission of a part of the optical pulse train to change the number of pulses per unit time or performing intensity modulation. Further, the two-dimensional scanning mechanism 103 is capable of scanning in a two-dimensional plane perpendicular to the optical axis of the light pulse incident on the condensing point in the sample, that is, the XY plane. Connected to the objective lens 105 is a Z-axis direction driving unit 106 for displacing the objective lens 105 in the Z direction with respect to the sample 107.

さらに、この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１０１は、モニタ１１３が接続されたコンピュータ１０８を備えている。このコンピュータ１０８は、走査制御装置１１０を介してＺ軸方向駆動部１０６および２次元走査機構１０３を制御し、且つ、レーザ制御装置１０９、レーザパワーコントローラ１１１を介して光源装置１０２内のＡＯＭを制御することができる。   Furthermore, the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 101 includes a computer 108 to which a monitor 113 is connected. The computer 108 controls the Z-axis direction driving unit 106 and the two-dimensional scanning mechanism 103 via the scanning control device 110, and controls the AOM in the light source device 102 via the laser control device 109 and the laser power controller 111. can do.

このような構成により、この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１０１の使用者は、モニタ１１３の表示を参照しつつコンピュータ８を介して以下の操作を行う、すなわち、Ｚ軸方向駆動部１０６により対物レンズ１０５を移動させることにより、試料１０７内の光パルスの集光点を観測したい領域のうち最も深い位置に移動させる。そして、図示しない多光子励起により発生した蛍光の可視化装置により蛍光の輝度を確認し、この輝度が充分な強さとなるように、ＡＯＭによる強度変調度または単位時間当たりの照射光パルス数を調整する。次に、試料１０７の最表面に光パルスの集光点を移動させて、上記と同様に、強度変調度、または、照射光パルス数を調整して、多光子励起により発生した蛍光の輝度が、上記の、最も深い位置における輝度と同等の明るさとなるよう調整する。   With such a configuration, the user of the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 101 performs the following operation via the computer 8 while referring to the display on the monitor 113, that is, by the Z-axis direction driving unit 106. By moving the objective lens 105, the focal point of the light pulse in the sample 107 is moved to the deepest position in the region to be observed. Then, the luminance of the fluorescence is confirmed by a visualization device for fluorescence generated by multi-photon excitation (not shown), and the intensity modulation degree by AOM or the number of irradiation light pulses per unit time is adjusted so that the luminance is sufficiently strong. . Next, the focal point of the light pulse is moved to the outermost surface of the sample 107 and the intensity modulation degree or the number of irradiation light pulses is adjusted in the same manner as described above, so that the luminance of the fluorescence generated by the multiphoton excitation is increased. The brightness is adjusted to be equal to the brightness at the deepest position.

そしてこの調整結果は、レーザ制御装置１０９内のメモリ装置１１２に、試料１０７内の集光点のＺ軸方向の位置（以下、Ｚ軸位置とも呼ぶ）およびＡＯＭ設定値のテーブルとして記憶される。次に、使用者がＺ軸方向の観測したい最表面と最深部とその間の分割数を設定し測定をスタートさせると、設定した分割数に応じて分割された各Ｚ軸位置に応じて、Ｚ軸方向駆動部１０６が対物レンズ１０５を移動させる。これと略同時に、レーザ制御装置１０９は、メモリ装置１１２のテーブルを参照してＡＯＭの強度変調度あるいは照射パルス数を設定して観察を行う。これによって、輝度が均一で見やすい画像が得られるようになっている。   The adjustment result is stored in the memory device 112 in the laser control device 109 as a table of the position in the Z-axis direction of the focal point in the sample 107 (hereinafter also referred to as the Z-axis position) and the AOM set value. Next, when the user sets the outermost surface and the deepest portion to be observed in the Z-axis direction and the number of divisions between them and starts measurement, the Z-axis position is divided according to the set number of divisions. The axial drive unit 106 moves the objective lens 105. At substantially the same time, the laser control device 109 refers to the table in the memory device 112 and sets the AOM intensity modulation degree or the number of irradiation pulses for observation. This makes it possible to obtain an image with uniform luminance and easy to see.

特開２００７−２６３７３０号公報JP 2007-263730 A

しかしながら、上記特許文献１に記載された多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムでは、試料の深部を測定する場合、ＡＯＭを用いて超短パルスレーザの光パルス列の透過率を高める（変調度を低くする）か、あるいは、単位時間当たりの光パルス数を増加させるので、試料に照射されるレーザ光の平均光強度が増大する。このため、例えば、生細胞などの試料が過剰に過熱されて損傷してしまう虞がある。   However, in the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system described in Patent Document 1, when measuring the depth of a sample, the transmittance of the optical pulse train of the ultrashort pulse laser is increased using AOM (the modulation degree is lowered). Or the number of light pulses per unit time is increased, so that the average light intensity of the laser light applied to the sample increases. For this reason, there exists a possibility that samples, such as a living cell, may be overheated and damaged, for example.

なお、２次元走査機構１０３により、光を偏向して試料を２次元走査する場合には、対物レンズの光軸から離れるに従って、対物レンズの収差等の影響により集光点が大きくなり、蛍光の輝度の低下が生じることになるが、従来はこの点については、着目されていない。これを解決する手段として試料の外周部の光パルス列の透過率を高めるか単位時間当たりの光パルス数を増加させると、上記と同様の問題が発生する。   Note that when the sample is two-dimensionally scanned by deflecting light by the two-dimensional scanning mechanism 103, as the distance from the optical axis of the objective lens increases, the focal point increases due to the influence of aberrations of the objective lens. Although a decrease in luminance occurs, conventionally, this point has not been paid attention. If the transmittance of the optical pulse train on the outer periphery of the sample is increased or the number of optical pulses per unit time is increased as means for solving this problem, the same problem as described above occurs.

したがって、これらの点に着目してなされた本発明の目的は、光パルスによる加熱により試料を損傷することなく、観測点の位置に依存せず略等しい輝度の画像を得ることができる多光子励起測定装置を提供することにある。   Therefore, the purpose of the present invention, which has been focused on these points, is the multi-photon excitation that can obtain an image with substantially the same brightness without depending on the position of the observation point without damaging the sample by heating with the light pulse. It is to provide a measuring device.

上記目的を達成する請求項１に記載の多光子励起測定装置の発明は、高強度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、繰返し周波数が調整可能な光パルスを出射する短パルス光源と、前記短パルス光源から出射した光パルスを前記試料内の観測点に集光させて照射する照明光学系と、前記光パルスの照射により前記観測点から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、前記試料内の前記観測点の位置を変位させる観測点変位手段と、前記観測点変位手段による前記観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御する制御手段と、前記検出器により検出された前記信号光による信号を情報化して表示する表示手段とを備えたことを特徴とするものである。   The invention of the multiphoton excitation measurement device according to claim 1 that achieves the above object is a multiphoton excitation measurement device that measures a sample by using a multiphoton absorption phenomenon by a high-intensity light pulse, and has a repetition frequency of A short pulse light source that emits an adjustable light pulse, an illumination optical system that focuses and irradiates the light pulse emitted from the short pulse light source at an observation point in the sample, and the observation point by irradiation with the light pulse According to the position of the observation point by the observation point displacement means, the detector for detecting the signal light accompanying the multiphoton excitation generated from, the observation point displacement means for displacing the position of the observation point in the sample, Control means for controlling the repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source, and display means for converting and displaying the signal by the signal light detected by the detector. It is an butterfly.

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、出射する光パルスの強度の尖頭値を、前記繰返し周波数に応じて制御することを特徴とするものである。   According to a second aspect of the present invention, in the multiphoton excitation measurement apparatus according to the first aspect, the short pulse light source controls the peak value of the intensity of the emitted light pulse in accordance with the repetition frequency. It is a feature.

請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、平均光強度が略一定の光パルスを出射することを特徴とするものである。   According to a third aspect of the present invention, in the multiphoton excitation measurement apparatus according to the first or second aspect, the short pulse light source emits a light pulse having a substantially constant average light intensity. .

請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、パルス幅が略一定の光パルスを出射することを特徴とするものである。   The invention according to claim 4 is the multiphoton excitation measurement device according to any one of claims 1 to 3, wherein the short pulse light source emits an optical pulse having a substantially constant pulse width. To do.

請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記観測点変位手段は、前記照明光学系と前記試料とを前記照明光学系の光軸方向に相対的に変位させるように構成し、前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と平行な方向における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とするものである。   According to a fifth aspect of the present invention, in the multiphoton excitation measurement apparatus according to any one of the first to fourth aspects, the observation point displacing unit is configured to change the illumination optical system and the sample from the illumination optical system. The control unit is configured to relatively displace in the optical axis direction, and the control unit is configured to change the observation point from the short pulse light source according to the position of the observation point in a direction parallel to the optical axis of the illumination optical system. The repetition frequency of the emitted light pulse is controlled.

請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記観測点変位手段は、前記照明光学系の光軸に垂直な面内で、前記短パルス光源から出射した光パルスを２次元方向に偏向する２次元走査手段を有し、前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と垂直な面内における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とするものである。   The invention according to claim 6 is the multiphoton excitation measurement apparatus according to any one of claims 1 to 5, wherein the observation point displacement means is in a plane perpendicular to the optical axis of the illumination optical system. Two-dimensional scanning means for deflecting light pulses emitted from the short pulse light source in a two-dimensional direction, and the control means is an observation point in a plane perpendicular to the optical axis of the illumination optical system by the observation point displacement means. The repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source is controlled according to the position of the light source.

請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、光パルスを発生する光源と、該光源からの光パルスを増幅するファイバ増幅器とを有することを特徴とするものである。   The invention according to claim 7 is the multiphoton excitation measurement device according to any one of claims 1 to 6, wherein the short pulse light source includes a light source that generates a light pulse, and a light pulse from the light source. And a fiber amplifier for amplification.

請求項８に記載の発明は、前記短パルス光源は、請求項７に記載の多光子励起測定装置において、利得スイッチ半導体レーザを含んで構成されることを特徴とするものである。   The invention described in claim 8 is characterized in that the short-pulse light source is configured to include a gain-switched semiconductor laser in the multi-photon excitation measurement apparatus according to claim 7.

請求項９に記載の発明は、前記短パルス光源は、請求項７に記載の多光子励起測定装置において、能動モードロックファイバリングレーザを含んで構成されることを特徴とするものである。   The invention according to claim 9 is characterized in that the short pulse light source is configured to include an active mode-locked fiber ring laser in the multiphoton excitation measurement apparatus according to claim 7.

請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源と前記照明光学系との間に、非線形パルス圧縮手段を備えたことを特徴とするものである。   A tenth aspect of the present invention is the multiphoton excitation measurement device according to any one of the first to ninth aspects, further comprising a nonlinear pulse compression means between the short pulse light source and the illumination optical system. It is characterized by this.

本発明によれば、観測点変位手段により設定された観測点の位置に応じて、光パルスの繰り返し周波数を調節するようにしたので、平均光強度が略一定である場合には、光パルスによる加熱のため試料を損傷することなく、光パルスの強度の尖頭値を変化させて、観測点の位置に依存せず略等しい輝度の画像を得ることができる。   According to the present invention, since the repetition frequency of the light pulse is adjusted according to the position of the observation point set by the observation point displacement means, when the average light intensity is substantially constant, By changing the peak value of the intensity of the light pulse without damaging the sample due to heating, it is possible to obtain an image having substantially the same brightness regardless of the position of the observation point.

以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.

[第１実施の形態]
本発明による多光子励起測定装置の第一実施の形態を、図１〜図６を用いて詳細に説明する。なお、ここでは多光子励起測定装置として多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムを例として説明を行う。 [First embodiment]
A first embodiment of a multiphoton excitation measurement apparatus according to the present invention will be described in detail with reference to FIGS. Here, a multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system will be described as an example of the multiphoton excitation measurement apparatus.

図１は、本発明の第１実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１は、光パルスを出射してこの光パルスを空間伝播によりレーザ走査型顕微鏡４に供給する短パルス光源２、短パルス光源２から入射した光パルスにより試料６の多光子励起による蛍光の検出を行うレーザ走査型顕微鏡４、このレーザ走査型顕微鏡４に接続し、多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１全体の制御を行うとともに、レーザ走査型顕微鏡４からの信号を画像化するコンピュータ８１、画像化した上記信号等を表示するモニタ８２、コンピュータ８１に接続されてコンピュータ８１からの命令により短パルス光源２から出射する光パルスの繰り返し周波数を調節するレーザ制御装置８３、多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１の使用者が、コンピュータ８１に対して入力を行うためのインタフェース装置８４とから構成される。ここで、コンピュータ８１およびレーザ制御装置８３は、制御手段を構成し、また、コンピュータ８１とモニタ８２は表示手段を構成する。   FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system according to the first embodiment of the present invention. The multi-photon excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 includes a short pulse light source 2 that emits a light pulse and supplies the light pulse to the laser scanning microscope 4 by spatial propagation, and a sample by a light pulse incident from the short pulse light source 2. A laser scanning microscope 4 for detecting fluorescence by multiphoton excitation 6 is connected to the laser scanning microscope 4 to control the entire multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 and from the laser scanning microscope 4. A computer 81 for imaging the above signal, a monitor 82 for displaying the imaged signal and the like, a laser control connected to the computer 81 and adjusting the repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source 2 according to a command from the computer 81 The user of the apparatus 83 and the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 Composed of the interface device 84 for performing force. Here, the computer 81 and the laser control device 83 constitute control means, and the computer 81 and the monitor 82 constitute display means.

さらに、レーザ走査型顕微鏡４は、短パルス光源２から入射した光パルスを反射させるミラー４１、ミラー４１で反射された光を２次元走査させる２次元走査手段４２、２次元走査手段４２を出射した光パルスを集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ４３、中間像を結像した光パルスを略平行光にする結像レンズ４４、結像レンズ４４を出射した略平行光を試料６に集光させる対物レンズ４５、および、試料６を載置するステージ７を含んで構成する。ここで、２次元走査手段４２は、例えば互いに直交する２本の軸線回りに揺動する２枚のガルバノミラーを近接配置した、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成する。また、ステージ７は、試料６を載置するステージ上面を入射する光パルスの光軸方向（Ｚ軸方向）に変位させて対物レンズ４５との相対距離を変化させるための駆動機構を備える。以上の構成において、瞳投影レンズ４３、結像レンズ４４、および対物レンズ４５は、照明光学系を形成している。また、２次元走査手段４２およびステージ７は、観測点の位置を変位させる観測点変位手段である。   Further, the laser scanning microscope 4 emits a mirror 41 that reflects the light pulse incident from the short pulse light source 2, a two-dimensional scanning unit 42 that two-dimensionally scans the light reflected by the mirror 41, and a two-dimensional scanning unit 42. A pupil projection lens 43 for condensing the light pulses to form an intermediate image, an imaging lens 44 for converting the light pulses formed on the intermediate image into substantially parallel light, and substantially parallel light emitted from the imaging lens 44 as a sample 6 And an objective lens 45 that collects light and a stage 7 on which the sample 6 is placed. Here, the two-dimensional scanning means 42 is constituted by, for example, a so-called proximity galvanometer mirror in which two galvanometer mirrors swinging around two axes orthogonal to each other are arranged close to each other. The stage 7 includes a driving mechanism for changing the relative distance from the objective lens 45 by displacing the upper surface of the stage on which the sample 6 is placed in the optical axis direction (Z-axis direction) of the incident light pulse. In the above configuration, the pupil projection lens 43, the imaging lens 44, and the objective lens 45 form an illumination optical system. The two-dimensional scanning means 42 and the stage 7 are observation point displacement means for displacing the position of the observation point.

ここで試料６は、例えば、蛍光タンパクが発現した生細胞である。この試料に光パルスを集光すると、蛍光タンパクが多光子吸収により励起され、信号光である蛍光を発する。この多光子吸収過程は非線型過程であり、蛍光強度は、２光子励起の場合、励起光パルスの平均光強度の２乗に比例し、光パルスの時間幅と繰返し周波数に反比例する。   Here, the sample 6 is, for example, a living cell in which a fluorescent protein is expressed. When a light pulse is collected on this sample, the fluorescent protein is excited by multiphoton absorption and emits fluorescence as signal light. This multiphoton absorption process is a non-linear process, and in the case of two-photon excitation, the fluorescence intensity is proportional to the square of the average light intensity of the excitation light pulse and inversely proportional to the time width and repetition frequency of the light pulse.

また、レーザ走査顕微鏡４は、結像レンズ４４と対物レンズ４５との間に配置され、入射光パルスを透過させ、入射光パルスの光路と逆方向に伝播する蛍光を反射させて、入射光パルスと蛍光とを波長によって分離するダイクロイックミラー４６と、ダイクロイックミラー４６で反射した蛍光を集光させる集光レンズ４７と、この集光レンズ４７による集光点で蛍光を検出して電気信号に変換する検出器４８とを更に備える。ここで、ダイクロイックミラー４６は、入射光パルスおよび光パルスの試料６による反射光を透過させ、多光子励起により発生する蛍光を反射させる反射、透過特性を有する。   The laser scanning microscope 4 is disposed between the imaging lens 44 and the objective lens 45, transmits the incident light pulse, reflects the fluorescence propagating in the direction opposite to the optical path of the incident light pulse, and reflects the incident light pulse. And fluorescence are separated by wavelength, a condensing lens 47 that condenses the fluorescence reflected by the dichroic mirror 46, and the condensing point by the condensing lens 47 detects the fluorescence and converts it into an electrical signal. And a detector 48. Here, the dichroic mirror 46 has reflection and transmission characteristics that transmit incident light pulses and reflected light of the light pulse from the sample 6 and reflect fluorescence generated by multiphoton excitation.

さらに、レーザ走査顕微鏡４は、コンピュータ８１と接続された外部入出力装置４９を含んで構成される。この外部入出力装置４９は、２次元走査手段４２およびステージ７と電気的に接続されており、コンピュータ８１からの指令により２次元走査手段４２およびステージ７の動作を制御するとともに、検出器４８とも電気的に接続され、この検出器４８から出力された電気信号を蓄積し、および、コンピュータ８１に送信できるように構成されている。   Further, the laser scanning microscope 4 includes an external input / output device 49 connected to the computer 81. The external input / output device 49 is electrically connected to the two-dimensional scanning unit 42 and the stage 7, and controls the operation of the two-dimensional scanning unit 42 and the stage 7 according to a command from the computer 81, and is also connected to the detector 48. It is configured to be electrically connected so that an electrical signal output from the detector 48 can be accumulated and transmitted to the computer 81.

次に短パルス光源２の詳細について説明する。図２は、短パルス光源２の概略構成図である。短パルス光源２は、数百から数千ピコ秒幅の電気パルスを発生させる電気パルス発生器２１、この電気パルスにより流入する電流によって利得が瞬間的に発生消滅する、いわゆる利得スイッチ動作により短波長から長波長へと時間的にチャープした数十ピコ秒幅の光パルスを発生させる半導体レーザ２２、半導体レーザ２２から出射した光パルスを伝播させる、例えば、長さ約１ｋｍのシングルモード光ファイバ２３、シングルモード光ファイバ２３から出射した光パルスを数十ｍＷから数Ｗの平均光強度（平均出力）に増幅する二つのファイバ増幅器２４、２５を含んで構成する。   Next, details of the short pulse light source 2 will be described. FIG. 2 is a schematic configuration diagram of the short pulse light source 2. The short pulse light source 2 includes an electric pulse generator 21 that generates an electric pulse with a width of several hundreds to several thousand picoseconds, and a short wavelength by a so-called gain switch operation in which a gain is instantaneously generated and extinguished by a current flowing in by the electric pulse. A semiconductor laser 22 that generates an optical pulse with a width of several tens of picoseconds chirped in time from a long wavelength to a long wavelength, and an optical pulse emitted from the semiconductor laser 22 is propagated, for example, a single mode optical fiber 23 having a length of about 1 km, It comprises two fiber amplifiers 24 and 25 that amplify an optical pulse emitted from the single mode optical fiber 23 to an average light intensity (average output) of several tens of mW to several W.

電気パルス発生器２１はレーザ制御装置８３と電気的に接続されており、図１のコンピュータ８１からの指令を受けたレーザ制御装置８３からのパルス繰返し周波数（パルス間隔時間）の指令により、電気パルスの繰返し周波数が、１ＭＨｚから２００ＭＨｚ（パルス間隔に換算して５ｎｓから１μｓ）の範囲で、随時変更可能である。   The electric pulse generator 21 is electrically connected to the laser control device 83, and the electric pulse generator 21 receives an electric pulse in response to a command of a pulse repetition frequency (pulse interval time) from the laser control device 83 that has received a command from the computer 81 of FIG. Can be changed at any time within the range of 1 MHz to 200 MHz (in terms of pulse interval, 5 ns to 1 μs).

半導体レーザ２２はＶＣＳＥＬ（面発光レーザ）を使用し、また、光パルスの波長は試料６の多光子励起に適した波長であれば良く、可視から近赤外や赤外光までの波長が使用可能であるが、本実施の形態では近赤外の９８０ｎｍ帯を用いる。   The semiconductor laser 22 uses a VCSEL (surface emitting laser), and the wavelength of the light pulse only needs to be a wavelength suitable for the multiphoton excitation of the sample 6, and a wavelength from visible to near infrared or infrared light is used. Although it is possible, in this embodiment, the near infrared 980 nm band is used.

シングルモード光ファイバ２３は、正の群速度分散（ＧＶＤ）を有し、これによってこのシングルモード光ファイバ２３を伝播する光パルスの長波長側が短波長側より速く光ファイバを伝播してチャープが補正される。光パルスの時間幅とその波長の拡がり幅（光スペクトル幅）との積には、限界となる最小値であるトランスフォームリミット（ＴＬ）を有することが知られている。すなわち、より短い時間幅の光パルスを得るためにはより広い光スペクトル幅が必要となる。ＶＣＳＥＬの光スペクトル幅は１ｎｍ程度なので、ＴＬな光パルスの時間幅は３ｐｓから５ｐｓ程度となる。シングルモード光ファイバ２３は、光パルスを数ピコ秒幅のＴＬな光パルスに変換する。   The single-mode optical fiber 23 has a positive group velocity dispersion (GVD), whereby the long wavelength side of the optical pulse propagating through the single-mode optical fiber 23 propagates through the optical fiber faster than the short wavelength side, thereby correcting the chirp. Is done. It is known that the product of the time width of an optical pulse and the spread width (optical spectrum width) of the optical pulse has a transform limit (TL) that is a minimum value that is a limit. That is, in order to obtain a light pulse having a shorter time width, a wider optical spectrum width is required. Since the optical spectrum width of the VCSEL is about 1 nm, the time width of the TL light pulse is about 3 to 5 ps. The single mode optical fiber 23 converts an optical pulse into a TL optical pulse having a width of several picoseconds.

ファイバ増幅器２４、２５は、図示しない半導体レーザで励起されるＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバである。このファイバ増幅器２４、２５は飽和出力動作の状態となっており、すなわち、入射する光パルスの繰返し周波数によらず略一定の平均光強度（平均出力）の光パルスを出力する。   The fiber amplifiers 24 and 25 are single clad optical fibers doped with Yb pumped by a semiconductor laser (not shown). The fiber amplifiers 24 and 25 are in a saturated output operation state, that is, output optical pulses having a substantially constant average light intensity (average output) regardless of the repetition frequency of the incident optical pulses.

なお、短パルス光源２には、各光学素子の接続に適宜偏波保持光ファイバが使用され、偏波による動作の不安定を抑制する。また、反射光による半導体レーザ２２やファイバ増幅器２４、２５の損傷を防ぐための光アイソレータや、最適な光スペクトル波形を得るための光フィルタが挿入されている。   In the short pulse light source 2, a polarization-maintaining optical fiber is appropriately used for connecting each optical element, and the instability of operation due to polarization is suppressed. Further, an optical isolator for preventing damage to the semiconductor laser 22 and the fiber amplifiers 24 and 25 due to reflected light and an optical filter for obtaining an optimal optical spectrum waveform are inserted.

図３は、短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数と平均光強度、パルス幅、光パルスの強度の尖頭値であるピーク光強度の関係を示すグラフである。ファイバ増幅器２４、２５の特性により、平均光強度は繰返し周波数の変化に対して略一定である。また、パルス幅（光パルスの時間幅）も繰返し周波数の変化に対して略一定である。パルス幅および平均出力が一定であれば、先に説明したように、多光子励起による蛍光強度は、光パルスの時間幅に反比例する。したがって、繰返し周波数が下がると光パルス当たりのエネルギーは大きくなり、ピーク光強度が高くなることになる。すなわち、ピーク光強度は繰返し周波数に対して反比例の関係となる。   FIG. 3 is a graph showing the relationship between the repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source 2, the average light intensity, the pulse width, and the peak light intensity which is the peak value of the intensity of the light pulse. Due to the characteristics of the fiber amplifiers 24 and 25, the average light intensity is substantially constant with respect to changes in the repetition frequency. Further, the pulse width (time width of the optical pulse) is substantially constant with respect to the change of the repetition frequency. If the pulse width and the average output are constant, as described above, the fluorescence intensity by multiphoton excitation is inversely proportional to the time width of the light pulse. Therefore, when the repetition frequency decreases, the energy per light pulse increases and the peak light intensity increases. That is, the peak light intensity is inversely proportional to the repetition frequency.

図４は、短パルス光源２から出射する光パルスについて繰返し周波数に対するパルス波形の差異を説明するグラフである。図４において、横軸は時間であり縦軸は光強度である。グラフは、それぞれ繰返し周波数ｆｐがＡ、２Ａ、３Ａ、４Ａの場合の光パルス波形を示している。繰返し周波数（ｆｐ）が４Ａ、３Ａ、２Ａ、Ａと低くなるにつれて、各光パルスのピーク光強度は高くなる。すなわち、短パルス光源２は、光パルスの繰返し周波数を変更することで、平均照射エネルギー（平均光強度）を変えずに、ピーク光強度を変化させることができる。   FIG. 4 is a graph for explaining the difference in the pulse waveform with respect to the repetition frequency for the optical pulse emitted from the short pulse light source 2. In FIG. 4, the horizontal axis represents time and the vertical axis represents light intensity. The graph shows optical pulse waveforms when the repetition frequency fp is A, 2A, 3A, and 4A, respectively. As the repetition frequency (fp) decreases to 4A, 3A, 2A, and A, the peak light intensity of each light pulse increases. That is, the short pulse light source 2 can change the peak light intensity without changing the average irradiation energy (average light intensity) by changing the repetition frequency of the light pulse.

本実施の形態の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１は、観測点のＺ軸方向の位置変化に応じて光パルスの繰返し周波数を変化させることにより、試料６の複数のＺ軸位置で輝度が略均一となるようにして、ＸＹ平面の観測画像を得るようにしたものである。以下に、図１、図５、図６を用いてその動作を説明する。   The multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 of the present embodiment changes the luminance at a plurality of Z-axis positions of the sample 6 by changing the repetition frequency of the light pulse in accordance with the position change of the observation point in the Z-axis direction. Is made substantially uniform so that an observation image on the XY plane is obtained. The operation will be described below with reference to FIG. 1, FIG. 5, and FIG.

図５は、本実施の形態の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１を用いた、顕微鏡観測の手順を示すフローチャートである。この手順は、観測に先立ってＺ軸位置に応じた光パルスの繰返し周波数の情報設定を行うための設定段階（ステップＳ１〜Ｓ８）、および、この設定された情報に基づいて観測を行う観測段階（ステップＳ９〜Ｓ１５）を含む。   FIG. 5 is a flowchart showing a procedure for microscopic observation using the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 of the present embodiment. This procedure includes a setting stage (steps S1 to S8) for setting information on the repetition frequency of the optical pulse in accordance with the Z-axis position prior to observation, and an observation stage for performing observation based on the set information. (Steps S9 to S15).

まず、設定段階において、使用者は、図１の試料６をステージ７に載置して、ステージ７上面のＺ軸位置を調整して、光パルスの集光点が試料６の最表面に位置するようにする（ステップＳ１）。このＺ軸方向の調整は、使用者が、モニタ８２に表示される入力用画面を参照しつつ、例えばキーボードやマウス等のインタフェース装置８４を介して、数値情報あるいは微動指令をコンピュータ８１に入力すること等により行う。数値情報または微動指令の入力を受けたコンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入出力装置４９を介してステージ７の駆動機構を動作させて、ステージ７のＺ軸位置を調整する。   First, in the setting stage, the user places the sample 6 in FIG. 1 on the stage 7, adjusts the Z-axis position on the upper surface of the stage 7, and the focal point of the light pulse is positioned on the outermost surface of the sample 6. (Step S1). In the adjustment in the Z-axis direction, the user inputs numerical information or a fine movement command to the computer 81 via the interface device 84 such as a keyboard or a mouse while referring to the input screen displayed on the monitor 82. It is done by etc. Receiving the input of numerical information or fine movement command, the computer 81 adjusts the Z-axis position of the stage 7 by operating the drive mechanism of the stage 7 via the external input / output device 49 of the laser scanning microscope 4.

次に、使用者は、繰返し周波数の調整を以下の要領で行う（ステップＳ２）。まず、使用者は、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に２次元レーザ走査とモニタ８２への画像表示を指示する。この指示を受けたコンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入出力装置４９を介して、２次元走査手段４２を駆動させ、試料６の最表面であるＸＹ平面上でレーザ光の光パルスの集光点を走査させる。これによって、光パルスの集光点では、２光子吸収により励起された蛍光が発生する。この蛍光は対物レンズ４５を経てダイクロイックミラー４６で反射され、集光レンズ４７を透過して検知器４８で検出されて電気信号に変換され、外部入出力装置４９でデジタル数値化されてコンピュータ８１に送信される。コンピュータ８１では、集光点の現在のＸＹ平面での走査位置情報と検知器４８で検出された蛍光による電気信号とから所定の観察面の２次元画像を構成し、モニタ８２に表示する。   Next, the user adjusts the repetition frequency in the following manner (step S2). First, the user instructs the computer 81 via the interface device 84 to perform two-dimensional laser scanning and image display on the monitor 82. Upon receiving this instruction, the computer 81 drives the two-dimensional scanning means 42 via the external input / output device 49 of the laser scanning microscope 4, and generates an optical pulse of laser light on the XY plane which is the outermost surface of the sample 6. The condensing point is scanned. As a result, fluorescence excited by two-photon absorption is generated at the focal point of the light pulse. This fluorescence is reflected by the dichroic mirror 46 through the objective lens 45, transmitted through the condenser lens 47, detected by the detector 48, converted into an electric signal, converted into a digital value by the external input / output device 49, and converted into a computer 81. Sent. In the computer 81, a two-dimensional image of a predetermined observation surface is constructed from the scanning position information on the current XY plane of the focal point and the electrical signal by the fluorescence detected by the detector 48 and displayed on the monitor 82.

使用者は、最適な画像輝度となる繰返し周波数を探して設定するために、モニタ８２に表示される画像を見ながら、光パルスの繰返し周波数を順次変更する。この、繰返し周波数の変更は、上記と同様にインタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に数値情報あるいは微変動指令を入力することによって行う。コンピュータ８１は、入力された数値情報または微変動情報に応じて、レーザ制御装置８３に繰返し周波数の変更の命令を送信する。レーザ制御装置８３は、図２に示した短パルス光源２の電気パルス発生器２１を制御して、短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数を所望の繰返し周波数に変更する。   The user sequentially changes the repetition frequency of the light pulse while looking at the image displayed on the monitor 82 in order to find and set the repetition frequency at which the optimum image brightness is obtained. The repetition frequency is changed by inputting numerical information or a slight variation command to the computer 81 via the interface device 84 as described above. The computer 81 transmits a repetition frequency change command to the laser control device 83 in accordance with the input numerical information or slight variation information. The laser controller 83 controls the electric pulse generator 21 of the short pulse light source 2 shown in FIG. 2 to change the repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source 2 to a desired repetition frequency.

前述のように、短パルス光源２は、繰返し周波数によらず略一定の平均光強度の光パルスを出力する一方、ピーク光強度は繰返し周波数に対して反比例の関係にある。このため、繰返し周波数を下げるとピーク光強度が高くなり、試料６においてより多くの多光子励起による蛍光が発生する。このため、コンピュータ８１が処理してモニタ８２に表示する画像の輝度も高くなる。使用者は、このような繰返し周波数の変更による画像の輝度の変化を観察し、例えば画像のコントラストなどの点で、最適な画像が得られる繰返し周波数を見つけて設定する。   As described above, the short pulse light source 2 outputs a light pulse having a substantially constant average light intensity regardless of the repetition frequency, while the peak light intensity is in an inversely proportional relationship with the repetition frequency. For this reason, when the repetition frequency is lowered, the peak light intensity increases, and more fluorescence is generated in the sample 6 due to multiphoton excitation. For this reason, the brightness of the image processed by the computer 81 and displayed on the monitor 82 is also increased. The user observes the change in the luminance of the image due to such a change in the repetition frequency, and finds and sets the repetition frequency at which an optimum image is obtained in terms of the contrast of the image, for example.

使用者が最適な繰返し周波数を設定すると、コンピュータ８１は、この時のステージ７の位置を示すＺ軸位置情報と、繰返し周波数情報とをコンピュータ８１内のメモリに記憶する（ステップＳ３）。   When the user sets the optimum repetition frequency, the computer 81 stores the Z-axis position information indicating the position of the stage 7 at this time and the repetition frequency information in the memory in the computer 81 (step S3).

次に、使用者は、ステップＳ１と同様の操作によって、試料６の観察をしたい領域の最深部に光パルスの集光点が位置するようにステージ７を移動させる（ステップＳ４）。そして、ステップＳ２における最表面の場合と同様にして、ステップＳ２の場合と略等しい画像輝度が得られる最適な光パルスの繰返し周波数を設定する（ステップＳ５）。コンピュータ８１は、この時のＺ軸位置情報と繰返し周波数情報とをステップＳ３と同様に、コンピュータ８１のメモリに記憶する（ステップＳ６）。   Next, the user moves the stage 7 so that the focal point of the light pulse is located at the deepest part of the region where the sample 6 is to be observed by the same operation as in Step S1 (Step S4). Then, in the same manner as in the case of the outermost surface in step S2, an optimum optical pulse repetition frequency that can obtain image brightness substantially equal to that in step S2 is set (step S5). The computer 81 stores the Z-axis position information and the repetition frequency information at this time in the memory of the computer 81 as in step S3 (step S6).

一般に、試料６の最表面から深部へと多光子励起を行う観測面が移動すると、試料媒質での散乱や吸収により光強度が減衰する。また、多光子励起で試料６から発生した蛍光などの信号光も同様に減衰する。したがって、最深部における光パルスの繰返し周波数は、最表面の場合と比較してより低い設定値となる。   In general, when the observation surface that performs multiphoton excitation moves from the outermost surface of the sample 6 to the deep part, the light intensity is attenuated by scattering and absorption in the sample medium. Further, signal light such as fluorescence generated from the sample 6 by multiphoton excitation is similarly attenuated. Therefore, the repetition frequency of the light pulse at the deepest portion is a lower set value than that at the outermost surface.

次に、使用者は、観測するＺ軸の範囲とこのＺ軸の範囲でのＺ軸方向の分割数を、インタフェース装置８４に数値入力することによって、コンピュータ８１に設定する（ステップＳ７）。これらの値が入力されると、前述した最表面と最深部とにおける最適な繰返し周波数に基づき、コンピュータ８１は、観測する各Ｚ軸位置を示す数値と各Ｚ軸位置での繰り返し周波数とを含むテーブルを作成して、コンピュータ８１のメモリに格納する（ステップＳ８）。   Next, the user sets the computer 81 by numerically inputting the Z-axis range to be observed and the number of divisions in the Z-axis direction in the Z-axis range to the interface device 84 (step S7). When these values are input, the computer 81 includes a numerical value indicating each Z-axis position to be observed and a repetition frequency at each Z-axis position based on the optimum repetition frequency at the outermost surface and the deepest part. A table is created and stored in the memory of the computer 81 (step S8).

図６は、Ｚ軸位置と繰返し周波数との関係を示すテーブルの作成方法を説明するグラフである。図６において、上述したステップＳ３およびステップＳ６で記憶した最表面および最深部についてのＺ軸位置と繰返し周波数とのデータをプロットすると、グラフ上の２点のデータとなる。試料６の特性等に応じて、線形近似、対数近似、累乗近似、または、指数近似などにより、この２点を通る近似式を導出し、この近似式に当てはめて各Ｚ軸位置に対する繰返し周波数を求め、この繰返し周波数をＺ軸位置情報とともに格納したテーブルを生成する。   FIG. 6 is a graph for explaining a method of creating a table showing the relationship between the Z-axis position and the repetition frequency. In FIG. 6, when the data of the Z-axis position and the repetition frequency for the outermost surface and the deepest portion stored in Steps S3 and S6 described above are plotted, data of two points on the graph is obtained. Depending on the characteristics of the sample 6, etc., an approximate expression passing through these two points is derived by linear approximation, logarithmic approximation, exponential approximation, exponential approximation, etc., and the repetition frequency for each Z-axis position is applied to this approximate expression. A table in which the repetition frequency is stored together with the Z-axis position information is generated.

次に、本実施の形態の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１を用いた顕微鏡観測の観測段階（ステップＳ９〜Ｓ１５）について説明する。   Next, the observation stage (steps S9 to S15) of microscope observation using the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 of the present embodiment will be described.

使用者が観測開始の指令を、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に入力すると（ステップＳ９）、図１に示すコンピュータ８１は観測中であることをモニタ８２に表示するとともに、前述の繰返し周波数をＺ軸位置情報とともに格納したテーブルの先頭から、例えば最表面のＺ軸位置とこのＺ軸位置に対応する繰返し周波数とを読み出す。その後、コンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入出力装置４９にステージ７の設定位置として読み出したＺ軸位置を指示し、外部入出力装置４９はステージ７の駆動装置を制御してステージ７をこのＺ軸位置に移動させる（ステップＳ１０）。   When the user inputs an instruction to start observation to the computer 81 via the interface device 84 (step S9), the computer 81 shown in FIG. 1 displays on the monitor 82 that the observation is being performed, and the above-described repetition frequency is set. For example, the topmost Z-axis position and the repetition frequency corresponding to this Z-axis position are read from the head of the table stored together with the Z-axis position information. Thereafter, the computer 81 instructs the external input / output device 49 of the laser scanning microscope 4 to read the Z-axis position as the set position of the stage 7, and the external input / output device 49 controls the drive device of the stage 7 to control the stage 7. Is moved to the Z-axis position (step S10).

移動が完了すると、ステージ７は完了信号を外部入出力４９に出力する。外部入出力装置４９は、これを受け取ると完了信号をコンピュータ８１に出力する。コンピュータ８１はこの完了信号を受け取ると、ステージ７のＺ軸位置に対応する繰返し周波数をレーザ制御装置８３に出力する。レーザ制御装置８３は、コンピュータ８１から入力された繰返し周波数に従い短パルス光源２が動作するように信号パルスを短パルス光源２に出力する。これにより、短パルス光源２は指示された繰返し周波数で光パルスを発振する（ステップＳ１１）。   When the movement is completed, the stage 7 outputs a completion signal to the external input / output 49. Upon receiving this, the external input / output device 49 outputs a completion signal to the computer 81. When the computer 81 receives this completion signal, it outputs a repetition frequency corresponding to the Z-axis position of the stage 7 to the laser controller 83. The laser control device 83 outputs a signal pulse to the short pulse light source 2 so that the short pulse light source 2 operates according to the repetition frequency input from the computer 81. Thereby, the short pulse light source 2 oscillates an optical pulse with the instructed repetition frequency (step S11).

コンピュータ８１がレーザ制御装置８３へ繰返し周波数を出力した時点から、実際に短パルス光源２が設定された繰返し周波数で動作するのに要する所定の時間が経過すると、コンピュータ８１は外部入出力装置４９に２次元走査手段４２の走査開始信号を出力する。外部入出力装置４９は、この信号を受け取ると２次元走査手段４２に走査開始信号を出力する。この２次元走査手段４２は走査開始信号を受け取ると走査を開始するとともに（ステップＳ１２）、試料上の集光点のＸＹ平面内における位置を示す走査位置情報を、外部入出力装置４９に出力する。また、外部入出力装置４９は、パルス光の集光点の２次元走査による多光子励起により発生した蛍光を検出して検出器４８が出力する検出信号を受け取るともにデジタル数値化し、２次元走査手段４２が出力する走査位置情報とともに、外部入出力装置４９内のメモリ上に設けたテーブルに格納する。（ステップＳ１３）。   When a predetermined time required for the short pulse light source 2 to actually operate at the set repetition frequency has elapsed since the computer 81 output the repetition frequency to the laser control device 83, the computer 81 sends the external input / output device 49 to the external input / output device 49. A scanning start signal of the two-dimensional scanning means 42 is output. When the external input / output device 49 receives this signal, it outputs a scanning start signal to the two-dimensional scanning means 42. When the two-dimensional scanning means 42 receives the scanning start signal, the two-dimensional scanning means 42 starts scanning (step S12), and outputs scanning position information indicating the position of the condensing point on the sample in the XY plane to the external input / output device 49. . The external input / output device 49 detects fluorescence generated by multi-photon excitation by two-dimensional scanning of the condensing point of the pulsed light, receives a detection signal output from the detector 48, digitizes it, and digitizes it. Along with the scanning position information output from the memory 42, the information is stored in a table provided on a memory in the external input / output device 49. (Step S13).

２次元走査手段４２は、所定の走査を完了すると（ステップＳ１４）完了信号を外部入出力装置４９に出力し、外部入出力装置４９はこの信号を受け取るとコンピュータ８１にこの完了信号を出力するとともに、走査位置情報と検出信号とのテーブルを出力する。コンピュータ８１は、走査位置と検出信号とのテーブルを記憶するとともに、これから観測画像を作成し、モニタ８２に表示させる（ステップＳ１５）。   When the predetermined scanning is completed (step S14), the two-dimensional scanning means 42 outputs a completion signal to the external input / output device 49. When the external input / output device 49 receives this signal, it outputs this completion signal to the computer 81. A table of scanning position information and detection signals is output. The computer 81 stores a table of scanning positions and detection signals, creates an observation image from the table, and displays it on the monitor 82 (step S15).

次に、コンピュータ８１は上述のステップＳ１０〜Ｓ１５の動作が完了すると、前述の繰返し周波数とＺ軸位置情報とを格納したテーブルから、次のＺ軸位置および繰返し周波数を読み出し、このＺ軸位置と繰返し周波数について、ステップＳ１０〜Ｓ１５の動作を行う。このようにして、順次のＺ軸位置に対する測定を行い、全てのＺ軸位置についての測定が完了すると、コンピュータ８１は測定を終了してモニタ８２にその旨を表示する（ステップＳ１６）。   Next, when the operations of steps S10 to S15 described above are completed, the computer 81 reads the next Z-axis position and repetition frequency from the table storing the above-described repetition frequency and Z-axis position information. For the repetition frequency, the operations in steps S10 to S15 are performed. In this way, the measurement is sequentially performed on the Z-axis positions, and when the measurement for all the Z-axis positions is completed, the computer 81 ends the measurement and displays that fact on the monitor 82 (step S16).

このとき、Ｚ軸位置の変化に対して、図６に示したようにＺ軸位置が試料６の表面から深部へ変化するにつれて、光パルスの繰返し周波数を低く設定するので、光パルスのピーク強度は高くなり、ピーク光強度の二乗に比例する多光子励起効率を高くすることができるので、試料内の散乱・吸収による多光子励起光パルスや試料からの蛍光など信号光の低下を補償することができる。   At this time, as the Z-axis position changes from the surface of the sample 6 to the deep part as shown in FIG. 6 with respect to the change of the Z-axis position, the repetition frequency of the optical pulse is set lower. Since the multiphoton excitation efficiency proportional to the square of the peak light intensity can be increased, compensation for signal light degradation such as multiphoton excitation light pulses and fluorescence from the sample due to scattering and absorption in the sample can be achieved. Can do.

以上説明したように、本実施の形態によれば、多光子励起による蛍光の顕微鏡観察において、平均光強度が略一定の短パルス光源２を用い、試料６のＺ軸位置に応じて短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数を変化させるようにしたので、試料の深部を観測する場合においても光パルスによる過熱により試料を損傷することなく、測定位置の深さに依存せず略等しい輝度の画像を得ることができる。このことは、特に生細胞などを試料とした時に加熱による損傷を低減できるので有利である。また、利得スイッチ半導体レーザに印加するピコ秒からナノ秒の時間幅の電気パルスの繰返し周波数を変更するだけで、短パルス光源の繰返し周波数を瞬時かつ安定に制御することができる。   As described above, according to the present embodiment, in the microscopic observation of fluorescence by multiphoton excitation, the short pulse light source 2 having a substantially constant average light intensity is used, and the short pulse light source according to the Z-axis position of the sample 6 is used. Since the repetition frequency of the light pulse emitted from 2 is changed, even when observing the deep part of the sample, the sample is not damaged by overheating due to the light pulse, and is almost the same brightness regardless of the depth of the measurement position. Images can be obtained. This is advantageous because damage caused by heating can be reduced particularly when a living cell or the like is used as a sample. Further, the repetition frequency of the short pulse light source can be instantaneously and stably controlled only by changing the repetition frequency of the electrical pulse having a time width of picoseconds to nanoseconds applied to the gain switch semiconductor laser.

［第２実施の形態］
本発明の第２実施の形態では、図１に示した構成の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、試料のＸＹ方向の２次元平面に対して集光点を走査した時、測定する画像の平面内輝度を均一化する。このため、本実施の形態は、使用者によるインタフェース装置８４への入力動作、これに基づくコンピュータ８１によるレーザ制御装置８３を介した短パルス光源２、外部入出力装置４９、並びに、この外部入出力装置４９を介したステージ７および２次走査装置４２の制御の点において第１実施の形態と異なっている。 [Second Embodiment]
In the second embodiment of the present invention, in the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 having the configuration shown in FIG. 1, measurement is performed when the focal point is scanned with respect to the two-dimensional plane in the XY direction of the sample. Uniform the in-plane brightness of the image. For this reason, in the present embodiment, the input operation to the interface device 84 by the user, the short pulse light source 2 via the laser control device 83 by the computer 81 based on this, the external input / output device 49, and this external input / output The second embodiment is different from the first embodiment in controlling the stage 7 and the secondary scanning device 42 via the device 49.

図７は、光軸からの距離と光パルスの最適な繰返し周波数との関係を説明するためのグラフである。まず、本実施の形態は、所定のＺ軸位置において、光軸と垂直なＸＹ平面を走査する際に、集光点の光軸からの距離に応じて短パルス光源２から出射される光パルスの繰返し周波数を変化させるように設定する。以下にこの繰返し周波数の設定方法について説明する。   FIG. 7 is a graph for explaining the relationship between the distance from the optical axis and the optimum repetition frequency of the optical pulse. First, in the present embodiment, when scanning an XY plane perpendicular to the optical axis at a predetermined Z-axis position, an optical pulse emitted from the short pulse light source 2 according to the distance from the optical axis of the focal point. Set to change the repetition frequency of. A method for setting the repetition frequency will be described below.

図１に示した多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１のように、２次元走査手段４２により入射光パルスを偏向して２次元走査する場合、一般に、ＸＹ平面のほぼ中央である光軸上と、それ以外の点では対物レンズ等の透過光学部品の影響で収差が発生し、集光点の大きさが光軸上の場合と比較して大きくなる。多光子励起により発生する蛍光の強度は、照射される光パルスの光強度の二乗に比例するので集光点が大きくなると、単位面積当たりの光強度が低下して蛍光強度が減少する。   When the incident light pulse is deflected and scanned two-dimensionally by the two-dimensional scanning means 42 as in the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 shown in FIG. 1, generally, on the optical axis which is substantially the center of the XY plane. At other points, aberration occurs due to the influence of transmission optical components such as an objective lens, and the size of the condensing point becomes larger than that on the optical axis. The intensity of the fluorescence generated by multiphoton excitation is proportional to the square of the light intensity of the irradiated light pulse. Therefore, when the focal point is increased, the light intensity per unit area is reduced and the fluorescence intensity is reduced.

最適な繰返し周波数を求めるに当たり、まず、使用者は、第１実施の形態で説明した方法により、ステージ７を所望のＺ軸位置に調節する。次に、使用者は、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に、光軸周辺の画像を表示させる命令を入力する。コンピュータ８１はこの命令を受けて、外部入力装置４９により２次元走査手段４２を制御して、光パルスの集光点をＸＹ平面上の光軸上位置の近傍領域のみを走査させる。これによって、当該領域の画像をモニタ８２に表示する。使用者はこの画像を見ながら光パルスの最適な繰返し周波数を設定する。２次元走査手段４２による集光点の走査から、当該領域をモニタへ表示するまでの各構成要素の動作、および、光パルスの最適な繰返し周波数の設定方法は、第１実施の形態と同様である。   In obtaining the optimum repetition frequency, first, the user adjusts the stage 7 to a desired Z-axis position by the method described in the first embodiment. Next, the user inputs a command for displaying an image around the optical axis to the computer 81 via the interface device 84. In response to this command, the computer 81 controls the two-dimensional scanning means 42 with the external input device 49 to scan only the region near the position on the optical axis on the XY plane for the focal point of the light pulse. As a result, the image of the area is displayed on the monitor 82. The user sets the optimum repetition frequency of the light pulse while viewing this image. The operation of each component from the scanning of the focal point by the two-dimensional scanning means 42 to the display of the region on the monitor, and the method for setting the optimum repetition frequency of the light pulse are the same as in the first embodiment. is there.

その後、使用者は、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に命令を入力して、光パルスの集光点をＸＹ平面上の最外周における所望の点の近傍領域のみを走査させ、当該領域の画像をモニタ８２に表示させ、上記と同様に光パルスの最適な繰返し周波数を設定する。   Thereafter, the user inputs a command to the computer 81 through the interface device 84, scans only the region near the desired point on the outermost periphery on the XY plane, and collects an image of the region. Is displayed on the monitor 82, and the optimum repetition frequency of the optical pulse is set in the same manner as described above.

次に、使用者は、観測するＸＹ平面の光軸からの距離による分割数を、インタフェース装置８４に数値入力することによって、コンピュータ８１に設定する。この値が入力されると、コンピュータ８１は、前述した中心軸および最外周における最適な繰返し周波数の２点のデータに基づき、試料６の特性等に応じて、線形近似や対数近似によってこの２点を通る近似式を導出し、この近似式に基づき、観測する各光軸からの距離を示す数値と各光軸からの距離に対応する繰り返し周波数とのテーブルを作成して、コンピュータ８１のメモリに格納する。   Next, the user sets the number of divisions according to the distance from the optical axis of the XY plane to be observed to the computer 81 by inputting a numerical value to the interface device 84. When this value is input, the computer 81 performs linear approximation or logarithmic approximation according to the characteristics of the sample 6 and the like based on the data of the optimum repetition frequency at the central axis and the outermost circumference described above. Based on this approximate expression, a table showing a numerical value indicating the distance from each optical axis to be observed and a repetition frequency corresponding to the distance from each optical axis is created and stored in the memory of the computer 81. Store.

次に図１を参照して、本実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１の動作について説明する。使用者が、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に観測開始の指令を入力すると、コンピュータ８１は観測中であることをモニタ８２に表示するとともに、外部入出力装置４９に２次元走査手段４２によるＸＹ平面内の集光点の設定位置を指示し、外部入出力装置４９は２次元走査手段４２にこの設定位置へ集光点を移動させる移動指令を出力する。   Next, the operation of the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 according to the present embodiment will be described with reference to FIG. When the user inputs an observation start command to the computer 81 via the interface device 84, the computer 81 displays on the monitor 82 that the observation is being performed, and the XY by the two-dimensional scanning means 42 is displayed on the external input / output device 49. The external input / output device 49 outputs a movement command for moving the focal point to the set position to the two-dimensional scanning unit 42 by instructing the set position of the focal point in the plane.

２次元走査手段４２は移動が完了すると完了信号を外部入出力４９に出力し、外部入出力装置４９はこれを受け取ると完了信号をコンピュータ８１に出力する。コンピュータ８１は、この完了信号を受信すると、２次元走査手段４２の設定位置に対応する短パルス光源２の繰返し周波数を上述のテーブルから読取り、これをレーザ制御装置８３に出力する。レーザ制御装置８３は、受け取った繰返し周波数で短パルス光源２が動作するよう信号パルスを短パルス光源２に出力する。これにより、短パルス光源２は指示された繰返し周波数で光パルスを発振する。   The two-dimensional scanning means 42 outputs a completion signal to the external input / output 49 when the movement is completed, and the external input / output device 49 outputs a completion signal to the computer 81 when receiving this. When the computer 81 receives this completion signal, it reads the repetition frequency of the short pulse light source 2 corresponding to the set position of the two-dimensional scanning means 42 from the above-mentioned table and outputs it to the laser controller 83. The laser control device 83 outputs a signal pulse to the short pulse light source 2 so that the short pulse light source 2 operates at the received repetition frequency. Thereby, the short pulse light source 2 oscillates an optical pulse at the instructed repetition frequency.

このコンピュータ８１からのレーザ制御装置８３への繰返し周波数が出力された時点から、実際に短パルス光源２が設定された繰返し周波数で動作するのに要する所定の時間が経過すると、コンピュータ８１は外部入出力装置４９に検出器４８の信号取得指令を出力する。外部入出力装置４９は、この信号を受け取ると検出器４８が出力する検出信号を受け取るとともにデジタル数値化し、２次元走査手段４２が出力するＸＹ平面内での走査位置情報とともに、走査位置および検出信号のテーブルに蓄積する。外部入出力装置４９は、所望の設定位置の走査が完了するとコンピュータ８１に完了信号を出力し、コンピュータ８１は次の２次元走査手段４２の設定位置の測定へと移る。以下コンピュータ８１は各測定位置について上記と同様に測定とデータの蓄積を行う。   When a predetermined time required for the short pulse light source 2 to actually operate at the set repetition frequency has elapsed from the time when the repetition frequency is output from the computer 81 to the laser controller 83, the computer 81 is externally input. A signal acquisition command for the detector 48 is output to the output device 49. When the external input / output device 49 receives this signal, the external input / output device 49 receives the detection signal output from the detector 48 and digitizes the detection signal. Accumulate in the table. When the scanning of the desired setting position is completed, the external input / output device 49 outputs a completion signal to the computer 81, and the computer 81 moves to the next measurement of the setting position of the two-dimensional scanning means 42. Thereafter, the computer 81 performs measurement and data accumulation in the same manner as described above for each measurement position.

ＸＹ平面内の全ての測定位置の走査を完了すると、コンピュータ８１は外部入出力装置４９に完了信号を出力し、外部入出力装置４９は、走査位置情報と検出信号のテーブルとをコンピュータ８１に出力する。コンピュータ８１は、走査位置情報と検出信号とのテーブルを記憶するとともに、これから観測画像を生成するとともに、この画像および完了した旨の表示をモニタ８２に表示する。   When the scanning of all the measurement positions in the XY plane is completed, the computer 81 outputs a completion signal to the external input / output device 49, and the external input / output device 49 outputs the scanning position information and the detection signal table to the computer 81. To do. The computer 81 stores a table of scanning position information and detection signals, generates an observation image from the table, and displays this image and a display indicating completion on the monitor 82.

以上説明したように、本実施の形態によれば、入射光パルスを偏向して試料を走査する多光子励起による蛍光の顕微鏡観察において、平均光強度が略一定の短パルス光源２を用い、集光点の走査による２次元平面内の観測時に、試料６の光軸からの距離に応じて短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数を変化させるようにしたので、試料の最外周を観測する場合においても、光パルスによる過熱により試料を損傷することなく、光学系の収差等による観測点の光量低下や集光点サイズの増大による、多光子励起の効率低下や試料からの蛍光の低下を補償し、測定位置の光軸からの距離に依存せず、観察する平面内で略等しい輝度の画像を得ることができる。このことは、第１実施の形態と同様に、生細胞を試料とするときに有利である。   As described above, according to the present embodiment, in the microscopic observation of fluorescence by multiphoton excitation that deflects the incident light pulse and scans the sample, the short pulse light source 2 having a substantially constant average light intensity is used. Since the repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source 2 is changed according to the distance from the optical axis of the sample 6 during observation in the two-dimensional plane by scanning the light spot, the outermost periphery of the sample is observed. In this case, the efficiency of multi-photon excitation and the fluorescence from the sample are reduced by reducing the amount of light at the observation point and increasing the focal point size due to aberrations of the optical system, etc., without damaging the sample due to overheating due to the light pulse. Thus, an image having substantially the same brightness in the plane to be observed can be obtained without depending on the distance from the optical axis of the measurement position. This is advantageous when a living cell is used as a sample as in the first embodiment.

［第３実施の形態］
本発明の第３実施の形態は、図１に示した構成の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、第１実施の形態と第２実施の形態とを組み合わせて、試料を３次元的に観測して画像化する際に、観測領域内である特定領域について強調した画像を得るものである。 [Third Embodiment]
The third embodiment of the present invention is a multi-photon excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 having the configuration shown in FIG. When the image is observed and imaged, an image in which a specific region within the observation region is emphasized is obtained.

このため、本実施の形態は、使用者によるインタフェース装置８４への入力動作、これに基づくコンピュータ８１によるレーザ制御装置８３を介した短パルス光源２、外部入出力装置４９、並びに、この外部入出力装置４９を介したステージ７および２次走査装置４２の制御の点において第１実施の形態および第２実施の形態と異なっている。   For this reason, in the present embodiment, the input operation to the interface device 84 by the user, the short pulse light source 2 via the laser control device 83 by the computer 81 based on this, the external input / output device 49, and this external input / output The second embodiment is different from the first embodiment in that the stage 7 and the secondary scanning device 42 are controlled via the device 49.

図８は、特定領域の設定方法を示す説明図である。本実施の形態では、三次元試料内の光軸と平行なＺ軸位置について少なくとも三点について、光軸と垂直なＸＹ軸平面についてレーザ走査による観測を行う。   FIG. 8 is an explanatory diagram showing a method for setting a specific area. In the present embodiment, observation by laser scanning is performed on at least three Z-axis positions parallel to the optical axis in the three-dimensional sample, and on an XY-axis plane perpendicular to the optical axis.

まず、使用者は、所定の３つのＺ軸位置、例えば、所望の観察範囲におけるＺ軸方向の最表面（Ｚ１）、最深部（Ｚ３）、および、Ｚ１とＺ３との中間（Ｚ２）のそれぞれについて、第１実施の形態および第２実施の形態に記載した設定段階の動作と同様にして、光軸からの距離に応じた最適な繰返し周波数を決定するとともに、モニタ画像を参照しながら、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に特定領域設定コマンドを用いて領域を設定する。これにより、コンピュータ８１は、この設定した特定領域をＺ軸位置とともに記憶する。   First, the user has three predetermined Z-axis positions, for example, the outermost surface (Z1) in the Z-axis direction in the desired observation range, the deepest part (Z3), and the middle (Z2) between Z1 and Z3. In the same manner as the operation of the setting stage described in the first embodiment and the second embodiment, an optimum repetition frequency according to the distance from the optical axis is determined and the interface is referred to while referring to the monitor image An area is set in the computer 81 via the device 84 using a specific area setting command. Thereby, the computer 81 stores the set specific area together with the Z-axis position.

次に、使用者は、所望の観察範囲におけるＺ軸方向の分割数を、インタフェース装置８４に数値入力することによって、コンピュータ８１に設定する。コンピュータ８１は、観測を行った最表面のＺ１から中間のＺ２を経て最深部のＺ３までの、Ｚ軸を設定された分割数により分割する。コンピュータ８１は、この分割した各Ｚ軸位置がＺ１とＺ２との間にあるときは、このＺ軸位置に対応するＸＹ平面上での特定領域を、Ｚ１およびＺ２の輪郭から内挿することによって設定し、また、Ｚ２とＺ３との間にあるときは、このＺ軸位置に対応するＸＹ平面上での特定領域を、Ｚ２およびＺ３の輪郭から内挿することによって設定する。   Next, the user sets the number of divisions in the Z-axis direction in the desired observation range in the computer 81 by inputting numerical values to the interface device 84. The computer 81 divides the Z axis from the observed topmost surface Z1 through the intermediate Z2 to the deepest Z3 by the set number of divisions. When each divided Z-axis position is between Z1 and Z2, the computer 81 interpolates a specific area on the XY plane corresponding to the Z-axis position from the contours of Z1 and Z2. When it is between Z2 and Z3, a specific region on the XY plane corresponding to the Z-axis position is set by interpolating from the contours of Z2 and Z3.

その後、コンピュータ８１は、特定領域外については、蛍光強度が低くなるように、例えば所定の１を超える係数を乗じることなどにより、繰返し周波数を高くした値を算出して、その値を当該測定位置の光パルスの繰返し周波数とする。図９の右側に示すグラフには、Ｚ１とＺ３とのＸＹ平面について、このようにして得られた光軸からの距離と光パルスの繰返し周波数との関係を示すグラフを表している。   Thereafter, the computer 81 calculates a value obtained by increasing the repetition frequency, for example, by multiplying a predetermined coefficient exceeding 1 so that the fluorescence intensity is reduced outside the specific region, and calculates the value as the measurement position. The repetition frequency of the optical pulse. The graph shown on the right side of FIG. 9 shows the relationship between the distance from the optical axis thus obtained and the repetition frequency of the optical pulse for the XY plane of Z1 and Z3.

コンピュータ８１は、これらの繰返し周波数を、Ｚ軸位置およびＸＹ平面内の位置情報とともに、コンピュータ８１内のメモリに設けられたテーブルに格納する。その後、使用者が、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に観測開始の指令を入力すると、コンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入力装置４９を介して２次元走査手段４２にＸＹ平面内での走査を開始させるとともに、順次Ｚ軸位置を前述の分割した各Ｚ軸位置に移動させて、観測を行う。このとき、コンピュータ８１は、Ｚ軸位置およびＸＹ平面内の位置情報に基づいて、各観測点に対応した光パルスの繰返し周波数を前述のテーブルから読み出し、第１実施の形態および第２実施の形態で説明したように、レーザ制御装置８３を介して短パルス光源２からこの繰り返し周波数の光パルスを出射させる。 The computer 81 stores these repetition frequencies together with the Z-axis position and position information in the XY plane in a table provided in a memory in the computer 81. Thereafter, when the user inputs an instruction to start observation to the computer 81 via the interface device 84, the computer 81 sends to the two-dimensional scanning means 42 via the external input device 49 of the laser scanning microscope 4 within the XY plane. Is started, and the Z-axis position is sequentially moved to each of the divided Z-axis positions to perform observation. At this time, the computer 81 reads the repetition frequency of the optical pulse corresponding to each observation point from the above-mentioned table based on the Z-axis position and the position information in the XY plane, and the first embodiment and the second embodiment. As described above, an optical pulse of this repetition frequency is emitted from the short pulse light source 2 via the laser control device 83.

その後、第１実施の形態で説明したのと同様の動作により、コンピュータ８１は、外部入力装置４９からの各観測点の位置情報および検出信号を記憶するとともに、これから観測画像を作成しモニタ８２に表示する。このとき、特定領域には繰返し周波数が特定領域外よりも低く、ピーク光強度の高い光パルスが照射されるため、特定領域外の領域より輝度の高い画像が得られる。   Thereafter, the computer 81 stores the position information and detection signals of each observation point from the external input device 49, and creates an observation image from this to the monitor 82 by the same operation as described in the first embodiment. indicate. At this time, since the specific region is irradiated with light pulses having a repetition frequency lower than that outside the specific region and high peak light intensity, an image having higher luminance than the region outside the specific region can be obtained.

以上説明したように、本実施の形態によれば、図１に示した構成の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、第１実施の形態と第２実施の形態とを組み合わせて、試料６を３次元的に観測して画像化する際に、試料６の特定領域の繰返し周波数を特定領域外の繰返し周波数よりも低くして、試料６に光パルスを照射したので、試料内の特に強調して観測したい領域のみ多光子励起強度を高めて、試料からの強い信号光を得ることが可能となり、信号光の検出器感度の制御や、観測後の信号処理を加えることなく、試料内の特定領域を強調することが可能となる。   As described above, according to the present embodiment, in the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 having the configuration shown in FIG. 1, the sample is combined with the first embodiment and the second embodiment. When the image of 6 is observed and imaged three-dimensionally, the repetition frequency of the specific region of the sample 6 is set lower than the repetition frequency outside the specific region and the sample 6 is irradiated with the light pulse. It is possible to increase the intensity of multiphoton excitation only in the region to be emphasized and to obtain a strong signal light from the sample, and without controlling the detector sensitivity of the signal light or performing signal processing after observation, It is possible to emphasize a specific area.

［第４実施の形態］
図１０は、本発明の第４実施の形態に係る多光子励起測定装置の概略構成図である。本実施の形態は、図１に示された第１〜第３実施形態における多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡４とを光ファイバを用いて着脱可能に接続したものであり、その他の部分は第１〜第３実施の形態における構成と同様であるので、異なる部分のみ説明を行う。 [Fourth embodiment]
FIG. 10 is a schematic configuration diagram of a multiphoton excitation measurement apparatus according to the fourth embodiment of the present invention. In this embodiment, in the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 in the first to third embodiments shown in FIG. 1, the short pulse light source 2 and the laser scanning microscope 4 are attached and detached using an optical fiber. Since the other parts are the same as those in the first to third embodiments, only different parts will be described.

このため、本実施の形態では、短パルス光源２には光パルスを出射させる光ファイバコネクタ３２を設け、レーザ走査型顕微鏡４にも光パルスを入射させる光ファイバコネクタ３３を設ける。さらに、光ファイバコネクタ３２と３３との間は、シングルモード光ファイバ３１で接続する。また、レーザ走査型顕微鏡４には、光ファイバコネクタ３３を出射した光パルスを略平行光にするコリメートレンズ５１が設けられる。シングルモード光ファイバ３１は光パルスの波長に対して損失が小さく、長さは１ｍから５ｍの範囲が望ましく、例えば本実施の形態では、長さを１．５ｍとする。   For this reason, in the present embodiment, the short pulse light source 2 is provided with an optical fiber connector 32 that emits an optical pulse, and the optical fiber connector 33 that makes the optical pulse incident on the laser scanning microscope 4 is also provided. Further, the optical fiber connectors 32 and 33 are connected by a single mode optical fiber 31. Further, the laser scanning microscope 4 is provided with a collimating lens 51 that makes the light pulse emitted from the optical fiber connector 33 substantially parallel light. The single mode optical fiber 31 has a small loss with respect to the wavelength of the optical pulse, and the length is preferably in the range of 1 m to 5 m. For example, in this embodiment, the length is 1.5 m.

以上のような構成によって、短パルス光源２から出射する光パルスは、シングルモード光ファイバ３１でレーザ走査型顕微鏡４に入射する。この様な構成によっても、第１〜第３実施の形態で示した多光子励起による蛍光顕微鏡観測が可能となる。   With the configuration as described above, the light pulse emitted from the short pulse light source 2 enters the laser scanning microscope 4 through the single mode optical fiber 31. Even with such a configuration, the fluorescence microscope observation by multiphoton excitation shown in the first to third embodiments can be performed.

以上説明したように、本実施の形態によれば、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡４とを、光ファイバを介して着脱可能に接続したので、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡４との光学的接続が容易となり、顕微鏡システムのレイアウトの自由度を高めることができる。   As described above, according to the present embodiment, since the short pulse light source 2 and the laser scanning microscope 4 are detachably connected via an optical fiber, the short pulse light source 2 and the laser scanning microscope 4 are connected to each other. Therefore, the optical connection of the microscope system can be facilitated, and the degree of freedom of the layout of the microscope system can be increased.

［第５実施の形態］
図１１は、本発明の第５実施の形態に係る多光子励起測定装置の概略構成図である。本実施の形態は、図１０に示した多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、シングルモード光ファイバ３１と協働して、光パルスの時間幅を圧縮する機構を設けたものである。 [Fifth Embodiment]
FIG. 11 is a schematic configuration diagram of a multiphoton excitation measurement apparatus according to the fifth embodiment of the present invention. In the present embodiment, in the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 shown in FIG. 10, a mechanism for compressing the time width of an optical pulse is provided in cooperation with the single mode optical fiber 31.

このため、本実施の形態では、レーザ走査型顕微鏡４に、負の分散補償装置５３と、コリメートレンズ５１を出射した光パルスを反射して上述の負の分散補償装置５３に入射させるミラー５２と、この負の分散補償装置５３から出射した光パルスをミラー４１へ入射させるミラー５４とをさらに設ける。   For this reason, in the present embodiment, the laser scanning microscope 4 has a negative dispersion compensator 53 and a mirror 52 that reflects the light pulse emitted from the collimator lens 51 and enters the negative dispersion compensator 53. Further, a mirror 54 for making the light pulse emitted from the negative dispersion compensator 53 incident on the mirror 41 is further provided.

負の分散補償装置５３は、２枚の回折格子５５、５６およびミラー５７を含み、ミラー５２で反射された光パルスを２枚の回折格子５５、５６で回折をさせて反射した後、ミラー５７でその光軸を紙面と垂直方向に折り返し、再び２枚の回折格子５５，５６で回折させ反射してミラー５４へ出射させる。このように、ミラー５７で反射させ、回折格子５５、５６を往復させることにより、光パルスは、入射時とほぼ同じ円形の空間分布で負の分散補償装置５３を出射することができる。   The negative dispersion compensator 53 includes two diffraction gratings 55 and 56 and a mirror 57. After the light pulse reflected by the mirror 52 is diffracted and reflected by the two diffraction gratings 55 and 56, the mirror 57 is reflected. Then, the optical axis is folded back in the direction perpendicular to the paper surface, and again diffracted by the two diffraction gratings 55 and 56 and reflected and emitted to the mirror 54. In this way, by reflecting the light with the mirror 57 and reciprocating the diffraction gratings 55 and 56, the light pulse can be emitted from the negative dispersion compensator 53 with the same circular spatial distribution as that at the time of incidence.

また、本実施の形態におけるシングルモード光ファイバ３１の長さは、例えば１５ｍである。   Moreover, the length of the single mode optical fiber 31 in this Embodiment is 15 m, for example.

図１１において、短パルス光源２からシングルモード光ファイバ３１に入射した光パルスは、シングルモード光ファイバ３１内で非線形光学現象である自己位相変調（ＳＰＭ）により光スペクトルが拡大し、同時に、正の群速度分散（ＧＶＤ）により長波長から短波長に時間的にチャープされた数十ピコ秒の光パルスとなる。   In FIG. 11, the light pulse incident on the single mode optical fiber 31 from the short pulse light source 2 has an optical spectrum expanded by self-phase modulation (SPM) that is a nonlinear optical phenomenon in the single mode optical fiber 31, and at the same time, positive An optical pulse of several tens of picoseconds chirped temporally from a long wavelength to a short wavelength by group velocity dispersion (GVD).

この光パルスはレーザ走査型顕微鏡４に入射し、コリメートレンズ５２で略平行光化された後、ミラー５２により反射される。その後、光パルスは負の分散補償装置５３に入射し、ここで負の群速度分散を受ける。シングルモード光ファイバ３１の正のＧＶＤで生じたチャープは、負の分散補償装置５３で逆のＧＶＤを受けチャープが補償される。また、シングルモード光ファイバ３１でのＳＰＭにより光スペクトルが拡大しているので、短パルス光源２から出力された数ピコ秒幅の光パルスは、数百フェムト秒の光パルスに圧縮される。   This light pulse is incident on the laser scanning microscope 4, converted into substantially parallel light by the collimator lens 52, and then reflected by the mirror 52. Thereafter, the light pulse enters the negative dispersion compensator 53, where it receives negative group velocity dispersion. The chirp generated by the positive GVD of the single mode optical fiber 31 is compensated for by receiving the reverse GVD by the negative dispersion compensator 53. Further, since the optical spectrum is expanded by SPM in the single mode optical fiber 31, the optical pulse having a width of several picoseconds output from the short pulse light source 2 is compressed into an optical pulse of several hundred femtoseconds.

時間幅が圧縮された光パルスは、負の分散補償装置５３を出射して、ミラー５４で反射され、ミラー４１に入射する。その後の光パルスの光路は、第１〜第４実施の形態と同様である。   The light pulse whose time width is compressed exits the negative dispersion compensator 53, is reflected by the mirror 54, and enters the mirror 41. The optical path of the subsequent light pulse is the same as in the first to fourth embodiments.

以上説明したように、本実施の形態によれば、シングルモード光ファイバと負の分散補償装置とを設けて光パルスを圧縮するようにしたので、第４実施の形態の効果に加え、数ピコ秒の光パルスを発振する短パルス光源２を使用しながら、非線形パルス圧縮によりこの短パルス光源２から出射する光パルスを圧縮することで、より高い効率の多光子励起が可能なよりピーク光強度の高いフェムト秒の光パルスを試料に照射することが可能となる。また、より安定な数ピコ秒の光パルスを発振する短パルス光源２を用いながら、高価で不安定なフェムト秒の光パルスを発振する短パルス光源を用いた場合と同様の効果を得ることができる。   As described above, according to the present embodiment, a single mode optical fiber and a negative dispersion compensator are provided to compress an optical pulse. Therefore, in addition to the effects of the fourth embodiment, a few pico By using a short pulse light source 2 that oscillates a light pulse of seconds and compressing a light pulse emitted from the short pulse light source 2 by nonlinear pulse compression, higher peak light intensity capable of higher-efficiency multiphoton excitation is achieved. It is possible to irradiate the sample with a high femtosecond light pulse. Further, it is possible to obtain the same effect as in the case of using a short pulse light source that oscillates an expensive and unstable femtosecond optical pulse while using the short pulse light source 2 that oscillates a more stable optical pulse of several picoseconds. it can.

［第６実施の形態］
本発明の第６実施の形態は、上述した、第１〜第５実施の形態における多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、短パルス光源２を、半導体レーザ２２を用いずに、能動モードロックファイバリングレーザ９を用いて構成したものである。 [Sixth Embodiment]
In the sixth embodiment of the present invention, the short pulse light source 2 is used in the active mode without using the semiconductor laser 22 in the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 1 in the first to fifth embodiments described above. The lock fiber ring laser 9 is used.

図１２は、第６実施の形態に係る短パルス光源２の概略構成図である。この短パルス光源２は、能動モードロックファイバリングレーザ９と、この能動モードロックファイバリングレーザ９から出射した光パルスを増幅するファイバ増幅器２４、２５とから構成する。ファイバ増幅器２４、２５は、図２を参照して第１実施の形態で説明した短パルス光源２の増幅器２４、２５と同様の特性を有する。   FIG. 12 is a schematic configuration diagram of a short pulse light source 2 according to the sixth embodiment. The short pulse light source 2 includes an active mode-locked fiber ring laser 9 and fiber amplifiers 24 and 25 that amplify optical pulses emitted from the active mode-locked fiber ring laser 9. The fiber amplifiers 24 and 25 have the same characteristics as the amplifiers 24 and 25 of the short pulse light source 2 described in the first embodiment with reference to FIG.

能動モードロックファイバリングレーザ９は、分岐カプラ９１、利得部９２、バンドパスフィルタ９３、アイソレータ９６および分散補償手段９７を含んで構成し、これら光学部品の間はシングルモード光ファイバ９４によりリング状に接続する。さらに、能動モードロックファイバリングレーザ９は、利得部９２に接続された信号発生器９５を備える。   The active mode-locked fiber ring laser 9 includes a branching coupler 91, a gain unit 92, a band pass filter 93, an isolator 96, and dispersion compensation means 97. These optical components are ring-shaped by a single mode optical fiber 94. Connecting. Further, the active mode-locked fiber ring laser 9 includes a signal generator 95 connected to the gain unit 92.

利得部９２は、希土類添加ファイバにより成る利得媒質とＬＮ（ＬｉＮｂＯ３）変調器より成る強度変調器とから構成する。ここで、希土類添加ファイバは、Ｙｂが添加されたシングルモード光ファイバである。この希土類添加ファイバには図示しないＷＤＭ（波長分割多重）カプラを接続し、このＷＤＭカプラの合波側には図示しない励起用光源である半導体レーザを光学的に接続する。ここでは半導体レーザは連続発振をする波長９１５ｎｍのレーザであり、この半導体レーザからの光がＷＤＭカプラによりＹｂ添加ファイバに吸収されることにより９８０ｎｍ帯の利得が発生するように構成する。 The gain unit 92 includes a gain medium made of a rare earth doped fiber and an intensity modulator made of an LN (LiNbO 3 ) modulator. Here, the rare earth doped fiber is a single mode optical fiber doped with Yb. A WDM (wavelength division multiplexing) coupler (not shown) is connected to the rare earth-doped fiber, and a semiconductor laser as a pumping light source (not shown) is optically connected to the multiplexing side of the WDM coupler. Here, the semiconductor laser is a laser having a wavelength of 915 nm that continuously oscillates, and the light from the semiconductor laser is absorbed by the Yb-doped fiber by the WDM coupler so that a gain in the 980 nm band is generated.

分岐カプラ９１は入射した光を設定した比率により分岐するものであり、シングルモード光ファイバ９４に分岐する比率を反射率と呼び、ファイバ増幅器２４への分岐比率を透過率と呼ぶ。   The branching coupler 91 branches incident light at a set ratio. The ratio of branching to the single mode optical fiber 94 is called reflectance, and the branching ratio to the fiber amplifier 24 is called transmittance.

分散補償手段９７は負の分散量を持ち、シングルモード光ファイバ９４および利得部９２の利得媒質が有する正の分散を相殺して、能動モードロックファイバリングレーザ９のリング部分全体としてゼロ分散状態となるようにして、波長により周回速度が異ならないようにする。   The dispersion compensation means 97 has a negative dispersion amount, cancels the positive dispersion of the gain medium of the single mode optical fiber 94 and the gain unit 92, and achieves a zero dispersion state as a whole of the ring portion of the active mode locked fiber ring laser 9. In this way, it is ensured that the circulation speed does not vary depending on the wavelength.

アイソレータ９６は一方向にのみ光を伝播させる。本実施の形態では、図１２において順時計方向、すなわち、分散補償手段９７からの光をバンドパスフィルタ９３の方向にのみ伝播させ、その逆方向の光は透過させない。   The isolator 96 propagates light only in one direction. In the present embodiment, the light from the forward compensation direction in FIG. 12, that is, the light from the dispersion compensating means 97 is propagated only in the direction of the bandpass filter 93, and the light in the opposite direction is not transmitted.

バンドパスフィルタ９３は特定の波長帯域にのみ透過特性を持つものであり、これにより広帯域な波長帯である自然放出光を透過させるとともに、これと異なる波長の光により発振が生じることを抑止する。   The bandpass filter 93 has a transmission characteristic only in a specific wavelength band, thereby allowing spontaneous emission light, which is a wide wavelength band, to pass therethrough and preventing oscillation from being generated by light having a different wavelength.

信号発生器９５は、利得部９２の強度変調器に接続されており、レーザ制御装置８３からの指令により、この利得部の時間的な透過特性を変調することができる。   The signal generator 95 is connected to the intensity modulator of the gain unit 92, and can modulate the temporal transmission characteristics of the gain unit in response to a command from the laser control device 83.

以上のような構成により、利得部９２から発した自然放出光は、シングルモード光ファイバ９４を介して分岐カプラ９１で一部がファイバ増幅器２４へ分岐し、残りの部分が分散補償手段９７、アイソレータ９６、バンドパスフィルタ９３の順に伝播し、再び利得部９２のＹｂ添加ファイバに到達し増幅される。利得部９２による利得が、分岐カプラ９１の透過率とその他損失の合計を上回ると、この自然放出光がこのリング状の経路の伝播過程を繰り返すことにより増幅され、レーザ発振する。   With the above configuration, spontaneous emission light emitted from the gain unit 92 is partly branched to the fiber amplifier 24 by the branch coupler 91 via the single mode optical fiber 94, and the remaining part is the dispersion compensation means 97, isolator. 96 and the band-pass filter 93 in this order, and again reaches the Yb-doped fiber of the gain unit 92 and is amplified. When the gain by the gain unit 92 exceeds the sum of the transmittance of the branch coupler 91 and other losses, the spontaneous emission light is amplified by repeating the propagation process of the ring-shaped path, and laser oscillation occurs.

ここで、利得部９２の利得発生の時間幅とタイミングが、利得発生時に自然放出光がシングルモード光ファイバ９４で接続されたリング状の経路を周回して、再び利得部９２に到達する時間間隔に一致するように、図示しない強度変調器に接続された信号発生器９５の信号発生周波数を設定することにより、モードロック状態が達成される。この場合、分岐カプラ９１からファイバ増幅器２４に出射するレーザ光は、信号発生器９５の信号発生周波数と同じ繰返し周波数を有するパルス光となる。   Here, the time width and timing of the gain generation of the gain section 92 are the time intervals at which the spontaneous emission light circulates in the ring-shaped path connected by the single mode optical fiber 94 at the time of gain generation and reaches the gain section 92 again. The mode lock state is achieved by setting the signal generation frequency of the signal generator 95 connected to the intensity modulator (not shown) so as to match the above. In this case, the laser light emitted from the branch coupler 91 to the fiber amplifier 24 becomes pulsed light having the same repetition frequency as the signal generation frequency of the signal generator 95.

さらに、上記リング状の経路の周回を繰り返すことによって、能動モードロックファイバリングレーザ９から発振するレーザ光の光パルスの時間幅を数ピコ秒の短パルス光とすることが可能となる。また、このモードロック状態は、シングルモード光ファイバ９４で接続されたリング状の経路内に１個の光パルスが存在する場合を基本状態とし、２個以上の光パルスが存在するようにもできる。これは、信号発生器９５の周波数を基本状態の整数倍に設定することにより可能となる。これによって、基本状態における光パルスの周波数の整数倍の値に、光パルスの繰返し周波数を調整することができる。   Further, by repeating the circulation of the ring-shaped path, the time width of the optical pulse of the laser light oscillated from the active mode-locked fiber ring laser 9 can be made short pulse light of several picoseconds. In addition, this mode-locked state is based on the case where one optical pulse exists in a ring-shaped path connected by the single mode optical fiber 94, and two or more optical pulses can exist. . This is made possible by setting the frequency of the signal generator 95 to an integer multiple of the basic state. Thus, the repetition frequency of the optical pulse can be adjusted to a value that is an integral multiple of the frequency of the optical pulse in the basic state.

このようにして、能動モードロックファイバリングレーザ９から出射した短パルス光は、２つのファイバ増幅器２４、２５で数十ｍＷから数Ｗの平均光強度（平均出力）に増幅され、短パルス光源２から出力される。このようにして出射された光パルスを用いることで、第１〜第５実施の形態に記載したと同様な観測を行うことができる。   In this way, the short pulse light emitted from the active mode-locked fiber ring laser 9 is amplified by the two fiber amplifiers 24 and 25 to an average light intensity (average output) of several tens of mW to several W, and the short pulse light source 2 Is output from. By using the light pulse emitted in this way, the same observation as described in the first to fifth embodiments can be performed.

以上説明したように、本実施の形態によれば、短パルス光源２に能動モードロックファイバリングレーザ９を用いたので、能動モードロックファイバリングレーザ９の強度変調器に印加する変調電気信号の繰返し時間間隔を変更するだけで、短パルス光源２の繰返し周波数を瞬時かつ安定に制御することが可能となる。   As described above, according to the present embodiment, since the active mode-locked fiber ring laser 9 is used for the short pulse light source 2, it is possible to repeat the modulation electric signal applied to the intensity modulator of the active mode-locked fiber ring laser 9. By simply changing the time interval, the repetition frequency of the short pulse light source 2 can be instantaneously and stably controlled.

以上，本発明の実施の形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこれらの実施の形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で幾多の変形または変更が可能である。   Although the embodiments of the present invention have been described in detail with reference to the drawings, the specific configuration is not limited to these embodiments, and various modifications or changes can be made without departing from the gist of the present invention. It can be changed.

例えば、多光子励起測定装置として多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムを例として説明を行ったが、多光子励起（非線形励起）を伴う他の顕微鏡システムにも適用が可能である。また、試料としては主として生細胞を対象として説明を行ったが、半導体材料など他の試料に対しても適用可能である。   For example, a multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system has been described as an example of the multiphoton excitation measurement apparatus, but the present invention can also be applied to other microscope systems with multiphoton excitation (nonlinear excitation). Further, the sample has been described mainly for living cells, but it can also be applied to other samples such as semiconductor materials.

図２を用いて第１実施の形態で説明した半導体レーザ２２は、面発光レーザ（ＶＣＳＥＬ）に限られず、量子井戸分布帰還型レーザダイオード（ＱＷＤＦＢＬＤ）や量子ドット分布帰還型レーザダイオード（ＱＤＤＦＢＬＤ）等が使用可能である。また、ファイバ増幅器２４、２５は、半導体レーザで励起されるＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバであるとしたが、これに限られない。ファイバ増幅器の増幅にはファイバレーザを用いても良く、被励起媒質はＮｄやＴｍやＥｒがドープされたシングルクラッドまたはダブルクラッド、断面に空孔がある光ファイバ等を用いても良い。   The semiconductor laser 22 described in the first embodiment with reference to FIG. 2 is not limited to a surface emitting laser (VCSEL), but a quantum well distributed feedback laser diode (QWDFBLD), a quantum dot distributed feedback laser diode (QDDFBLD), or the like. Can be used. Further, although the fiber amplifiers 24 and 25 are single clad optical fibers doped with Yb excited by a semiconductor laser, the present invention is not limited to this. A fiber laser may be used for amplification of the fiber amplifier, and a pumped medium may be a single clad or double clad doped with Nd, Tm or Er, an optical fiber having a hole in the cross section, or the like.

また、本発明の第１実施の形態では光軸に平行なＺ軸上のＺ軸位置について、最表面と最深部の２点のデータから近似を行ったが、３つ以上のＺ軸位置について測定を行い３点以上から近似を行っても良い。   Further, in the first embodiment of the present invention, the Z-axis position on the Z-axis parallel to the optical axis is approximated from the data of the two points of the outermost surface and the deepest part. You may measure and approximate from three or more points.

さらに、第２実施例においては、光軸上と最外周における２点のデータから近似を行ったが、３つ以上の光軸からの距離の位置で測定を行い３点以上から近似を行っても良い。また収差の場合、光学シミュレーションの結果と実際の結果は比較的一致するので、測定は光軸上の１点とし、光学シミュレーションによる近似式にこの測定結果を代入して用いる近似式としても良い。   Further, in the second embodiment, the approximation is performed from the data of two points on the optical axis and the outermost circumference, but the measurement is performed at the position of the distance from three or more optical axes, and the approximation is performed from three or more points. Also good. In the case of aberration, the result of the optical simulation and the actual result are relatively coincident, so that the measurement is performed at one point on the optical axis, and the approximate expression used by substituting the measurement result into the approximate expression by the optical simulation may be used.

第３実施の形態では、図８において特定領域を円で設定しているが、三角形、四角形または多角形であっても良い。また、測定するＺ軸位置を３点としたが、より多くの位置で測定をすることが望ましい。さらに、第３実施の形態では、特定領域の内外で繰り返し周波数を変更する例を示したが、照明光学系と平行なＺ方向および光軸と垂直なＸＹ面内の任意の組合せの座標に相当する観測点において、照明用光源と観察点とを結ぶ直線距離が遠いほど繰返し周波数を低くするような制御を行って、３次元的に一定の蛍光輝度を得るようにしても良い。   In the third embodiment, the specific region is set as a circle in FIG. 8, but it may be a triangle, a quadrangle, or a polygon. Moreover, although the Z-axis position to be measured is three points, it is desirable to measure at more positions. Furthermore, in the third embodiment, an example in which the frequency is repeatedly changed inside and outside the specific region has been shown, but it corresponds to coordinates in any combination in the XY plane perpendicular to the Z direction parallel to the illumination optical system and the optical axis. In such an observation point, the control may be performed such that the repetition frequency is lowered as the linear distance between the illumination light source and the observation point increases, so that a constant three-dimensional fluorescence luminance may be obtained.

さらに、第５実施の形態において、負の分散補償装置５３としては、回折格子対に代えてプリズム対、グリズム対などを使用することもできる。   Further, in the fifth embodiment, as the negative dispersion compensator 53, a prism pair, a grism pair, or the like can be used instead of the diffraction grating pair.

また、第６実施の形態において、利得部９２は、利得媒質である希土類添加ファイバと強度変調器との組合せのものを使用したが、これに限られない。例えば、利得媒質と変調手段を兼ねる半導体光増幅器を使用しても良い。   In the sixth embodiment, the gain unit 92 is a combination of a rare earth-doped fiber that is a gain medium and an intensity modulator, but is not limited thereto. For example, a semiconductor optical amplifier serving both as a gain medium and a modulation means may be used.

第１実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。It is a schematic block diagram of the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system which concerns on 1st Embodiment. 第１実施の形態に係る短パルス光源の概略構成図である。It is a schematic block diagram of the short pulse light source which concerns on 1st Embodiment. 短パルス光源から出射する光パルスの繰返し周波数と平均出力、パルス幅およびピーク光強度の関係を示すグラフである。It is a graph which shows the relationship between the repetition frequency of the optical pulse radiate | emitted from a short pulse light source, an average output, a pulse width, and peak light intensity. 短パルス光源から出射する光パルスの繰返し周波数に対するパルス波形のグラフである。It is a graph of the pulse waveform with respect to the repetition frequency of the light pulse radiate | emitted from a short pulse light source. 多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムを用いた顕微鏡観測の手順を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the procedure of the microscope observation using a multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system. Ｚ軸位置と繰返し周波数との関係を示すグラフである。It is a graph which shows the relationship between a Z-axis position and a repetition frequency. 光軸からの距離と繰返し周波数との関係を示すグラフである。It is a graph which shows the relationship between the distance from an optical axis, and a repetition frequency. 特定領域の設定方法を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the setting method of a specific area. 特定領域内外での繰返し周波数の設定方法を説明する説明図である。It is explanatory drawing explaining the setting method of the repetition frequency inside and outside a specific area | region. 第４実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。It is a schematic block diagram of the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system which concerns on 4th Embodiment. 第５実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。It is a schematic block diagram of the multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system which concerns on 5th Embodiment. 第６実施の形態に係る短パルス光源の概略構成図である。It is a schematic block diagram of the short pulse light source which concerns on 6th Embodiment. 従来例の光子励起型顕微鏡システムの概略構成図である。It is a schematic block diagram of the photon excitation type | mold microscope system of a prior art example.

符号の説明Explanation of symbols

１ 多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム
２ 短パルス光源
４ レーザ走査型顕微鏡
６ 試料
７ ステージ
９ 能動モードロックファイバリングレーザ
２１ 電気パルス発生器
２２ 半導体レーザ
２３ シングルモード光ファイバ
２４、２５ ファイバ増幅器
３１ シングルモード光ファイバ
３２、３３ 光ファイバコネクタ
４１ ミラー
４２ ２次元走査手段
４３ 瞳投影レンズ
４４ 結像レンズ
４５ 対物レンズ
４６ ダイクロイックミラー
４７ 集光レンズ
４８ 検出器
４９ 外部入出力装置
５１ コリメートレンズ
５２ ミラー
５３ 負の分散補償装置
５４ ミラー
５５、５６ 回折格子
５７ ミラー
８１ コンピュータ
８２ モニタ
８３ レーザ制御装置
８４ インタフェース装置
９１ 分岐カプラ
９２ 利得部
９３ バンドパスフィルタ
９４ シングルモード光ファイバ
９５ 信号発生器
９６ アイソレータ
９７ 分散補償手段
１０１ 多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム
１０２ 光源装置
１０３ ２次元走査機構
１０４ ミラー
１０５ 対物レンズ
１０６ Ｚ軸方向駆動部
１０７ 試料
１０８ コンピュータ
１０９ レーザ制御装置
１１０ 走査制御装置
１１１ レーザパワーコントローラ
１１２ メモリ装置
１１３ モニタ

DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Multiphoton excitation laser scanning fluorescence microscope system 2 Short pulse light source 4 Laser scanning microscope 6 Sample 7 Stage 9 Active mode lock fiber ring laser 21 Electric pulse generator 22 Semiconductor laser 23 Single mode optical fiber 24, 25 Fiber amplifier 31 Single Mode optical fibers 32 and 33 Optical fiber connector 41 Mirror 42 Two-dimensional scanning means 43 Pupil projection lens 44 Imaging lens 45 Objective lens 46 Dichroic mirror 47 Condensing lens 48 Detector 49 External input / output device 51 Collimating lens 52 Mirror 53 Negative Dispersion compensation device 54 Mirror 55, 56 Diffraction grating
57 Mirror 81 Computer 82 Monitor 83 Laser Control Device 84 Interface Device 91 Branch Coupler 92 Gain Unit 93 Band Pass Filter 94 Single Mode Optical Fiber 95 Signal Generator 96 Isolator 97 Dispersion Compensation Means 101 Multiphoton Excitation Laser Scanning Fluorescence Microscope System 102 Light Source Device 103 Two-dimensional scanning mechanism 104 Mirror 105 Objective lens 106 Z-axis direction drive unit 107 Sample 108 Computer 109 Laser control device 110 Scan control device 111 Laser power controller 112 Memory device 113 Monitor

Claims (10)

高強度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、
繰返し周波数が調整可能な光パルスを出射する短パルス光源と、
前記短パルス光源から出射した光パルスを前記試料内の観測点に集光させて照射する照明光学系と、
前記光パルスの照射により前記観測点から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、
前記試料内の前記観測点の位置を変位させる観測点変位手段と、
前記観測点変位手段による前記観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御する制御手段と、
前記検出器により検出された前記信号光による信号を情報化して表示する表示手段と
を備えたことを特徴とする多光子励起測定装置。 A multiphoton excitation measurement device that measures a sample using a multiphoton absorption phenomenon by a high-intensity light pulse,
A short pulse light source that emits a light pulse with adjustable repetition frequency;
An illumination optical system for condensing and irradiating a light pulse emitted from the short pulse light source at an observation point in the sample;
A detector for detecting signal light accompanying multiphoton excitation generated from the observation point by irradiation of the light pulse;
Observation point displacement means for displacing the position of the observation point in the sample;
Control means for controlling the repetition frequency of the optical pulse emitted from the short pulse light source according to the position of the observation point by the observation point displacement means;
A multi-photon excitation measurement apparatus comprising: a display unit configured to display the signal of the signal light detected by the detector as information. 前記短パルス光源は、出射する光パルスの強度の尖頭値を、前記繰返し周波数に応じて制御することを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。   The multi-photon excitation measurement apparatus according to claim 1, wherein the short pulse light source controls the peak value of the intensity of the emitted light pulse according to the repetition frequency. 前記短パルス光源は、平均光強度が略一定の光パルスを出射することを特徴とする請求項１または２に記載の多光子励起測定装置。   The multi-photon excitation measurement apparatus according to claim 1 or 2, wherein the short pulse light source emits a light pulse having a substantially constant average light intensity. 前記短パルス光源は、パルス幅が略一定の光パルスを出射することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。   The multi-photon excitation measurement apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein the short pulse light source emits an optical pulse having a substantially constant pulse width. 前記観測点変位手段は、前記照明光学系と前記試料とを前記照明光学系の光軸方向に相対的に変位させるように構成し、
前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と平行な方向における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。 The observation point displacing means is configured to relatively displace the illumination optical system and the sample in an optical axis direction of the illumination optical system,
The control means controls the repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source according to the position of the observation point in a direction parallel to the optical axis of the illumination optical system by the observation point displacement means. The multiphoton excitation measurement apparatus according to claim 1, wherein the multiphoton excitation measurement apparatus is characterized. 前記観測点変位手段は、前記照明光学系の光軸に垂直な面内で、前記短パルス光源から出射した光パルスを２次元方向に偏向する２次元走査手段を有し、
前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と垂直な面内における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。 The observation point displacing means has a two-dimensional scanning means for deflecting a light pulse emitted from the short pulse light source in a two-dimensional direction within a plane perpendicular to the optical axis of the illumination optical system,
The control means controls the repetition frequency of the light pulse emitted from the short pulse light source according to the position of the observation point in a plane perpendicular to the optical axis of the illumination optical system by the observation point displacement means. The multiphoton excitation measurement apparatus according to any one of claims 1 to 5. 前記短パルス光源は、光パルスを発生する光源と、該光源からの光パルスを増幅するファイバ増幅器とを有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。 The multi-photon excitation measurement according to any one of claims 1 to 6, wherein the short-pulse light source includes a light source that generates a light pulse and a fiber amplifier that amplifies the light pulse from the light source. apparatus. 前記光源は、利得スイッチ半導体レーザを含んで構成されることを特徴とする請求項７に記載の多光子励起測定装置。   The multi-photon excitation measurement apparatus according to claim 7, wherein the light source includes a gain switch semiconductor laser. 前記光源は、能動モードロックファイバリングレーザを含んで構成されることを特徴とする請求項７に記載の多光子励起測定装置。     The multi-photon excitation measurement apparatus according to claim 7, wherein the light source includes an active mode-locked fiber ring laser. 前記短パルス光源と前記照明光学系との間に、非線形パルス圧縮手段を備えたことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。   The multi-photon excitation measurement apparatus according to any one of claims 1 to 9, further comprising a nonlinear pulse compression unit between the short pulse light source and the illumination optical system.
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