JP2010007169A - Gold fine particle and method for producing the same, and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する有機物によって修飾したナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）と、その製造方法と、その集積方法、およびその用途に関する。 The present invention relates to a nanosized rod-shaped gold fine particle (gold nanorod) modified with an organic substance containing a part (A) compatible with a dispersion medium and a substrate peptide (B) that is degraded by a specific enzyme, and a method for producing the same And its integration method and its use.
本発明は、より具体的には、金ナノロッドへのリンカーである基質ペプチド部位が特定の酵素により分解されると、分散媒に相溶する部位が金ナノロッドから脱離して分散安定性が失われ、金ナノロッドが凝集することを利用した特定物質の検出方法と金ナノロッドの特定部位への集積方法などに関する。本発明の技術は、金ナノロッドが集積した部位のフォトサーマル治療やバイオイメージング、そして特定の酵素が存在する部位への薬物輸送方法として有用である。 More specifically, in the present invention, when the substrate peptide site that is a linker to the gold nanorod is decomposed by a specific enzyme, the site compatible with the dispersion medium is detached from the gold nanorod and the dispersion stability is lost. Further, the present invention relates to a method for detecting a specific substance utilizing aggregation of gold nanorods, a method for collecting gold nanorods at a specific site, and the like. The technique of the present invention is useful as a photothermal treatment or bioimaging of a site where gold nanorods are accumulated, and a method of transporting a drug to a site where a specific enzyme exists.
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：ＬＳＰＲ）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０ｎｍ程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。 When light is applied to metal fine particles dispersed in a solvent, a resonance absorption phenomenon called Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) occurs. The absorption wavelength is determined by the type and shape of the metal and the refractive index of the medium around the metal fine particles. For example, when spherical gold fine particles are dispersed in water, there is an absorption region around 530 nm, and if the shape of the gold fine particles is made into a rod shape (gold nanorod) with a short axis of about 10 nm, it is around 530 nm due to the short axis of the rod. In addition to absorption, it is known to have absorption on the long wavelength side caused by the long axis of the rod (Non-Patent Document 1).
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは形状の変化や凝集状態変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献２、３、４）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。 These metal fine particle dispersions can be stably dispersed in a solvent without aggregation of the metal fine particles by adsorbing or binding to the surface of the metal fine particles using a low molecular compound or a polymer compound as a protective agent. In particular, gold nanorods are unique gold fine particles whose spectroscopic properties change depending on changes in shape, changes in the state of aggregation, and the environment around the gold nanorods (Non-Patent Documents 2, 3, and 4). Potential as analytical material.
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第四級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４）。 Gold nanorods are rod-shaped nano-sized gold fine particles having an aspect ratio (major axis length / minor axis length) of more than 1, for example, quaternary ammonium salt hexadecyltrimethylammonium that is a cationic surfactant. Synthesized in water dissolved in bromide (CTAB), it is possible to synthesize gold ions in CTAB aqueous solution by chemical reduction, electroreduction, photoreduction, etc. The synthesized gold nanorods are stable in water by the protective action of CTAB (Patent Documents 1, 2, 3, 4).
近年、金ナノロッドにアビジン−ビオチン、抗原−抗体などの相互作用による目的物質への特異的な吸着反応を利用した研究が報告されている（非特許文献５）。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）ゲルで埋包された金ナノロッドは、ＬＳＰＲを利用した光熱変換により担持物質を放出可能であることが報告されている（非特許文献６）。また、酵素基質ペプチドの両端に脂質と水溶性高分子を結合した結合体を組み込んだコロイダルキャリアーに薬物を担持したドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が報告されている（特許文献５）。また、貴金属微粒子のＬＳＰＲをセンシング分野へ応用した開発が行われている（非特許文献７、８、特許文献６）。 In recent years, research utilizing a specific adsorption reaction to a target substance by interaction of avidin-biotin, antigen-antibody, etc. with gold nanorods has been reported (Non-patent Document 5). In addition, it has been reported that gold nanorods embedded with N-isopropylacrylamide (NIPAM) gel can release a support material by photothermal conversion using LSPR (Non-patent Document 6). In addition, a drug delivery system (DDS) in which a drug is supported on a colloidal carrier in which a conjugate of lipid and water-soluble polymer is incorporated at both ends of an enzyme substrate peptide has been reported (Patent Document 5). In addition, developments have been made in which LSPR of noble metal fine particles is applied to the sensing field (Non-patent Documents 7 and 8, Patent Document 6).
非特許文献５によると、金ナノロッドを重量平均分子量１４０００のＰＳＳで表面処理しておき、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とした抗体をＰＳＳ処理した金ナノロッドに吸着させており、抗体を介してがん細胞に金ナノロッドを取り込ませることによって、金ナノロッドの二光子発光によるがん細胞のイメージングが可能であることを報告している。 According to Non-Patent Document 5, a gold nanorod is surface-treated with PSS having a weight average molecular weight of 14,000, and an antibody targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) is adsorbed to the gold nanorod subjected to PSS treatment. It has been reported that cancer cells can be imaged by two-photon emission of gold nanorods by incorporating the gold nanorods into the cancer cells via the.
非特許文献６の方法によると、金ナノロッドをＮＩＰＡＭで埋包した微粒子に担持した物質の放出が報告されている。ＬＳＰＲに相当する光を照射された金ナノロッドは光熱変換機能により周囲のＮＩＰＡＭを加熱し、感熱性樹脂であるＮＩＰＡＭは温度が上昇すると下限臨界共溶温度を境に親水性から疎水性に変化し、ＮＩＰＡＭ中に担持された物質が水とともに放出されることを報告している。 According to the method of Non-Patent Document 6, release of a substance supported on fine particles in which gold nanorods are embedded with NIPAM has been reported. Gold nanorods irradiated with light equivalent to LSPR heat the surrounding NIPAM by the photothermal conversion function, and NIPAM, which is a heat-sensitive resin, changes from hydrophilic to hydrophobic at the lower critical eutectic temperature as the temperature rises. Report that the substances carried in NIPAM are released with water.
特許文献５によると、酵素基質ペプチドの両端に脂質と水溶性高分子を結合した結合体を組み込んだコロイダルキャリアーに薬物を担持しておき、疾患組織から特異的に分泌される酵素との特異的反応により酵素基質ペプチド部分が分解・切断されることで担持されている薬物が標的組織に放出されることを利用して、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を構築可能である。 According to Patent Document 5, a drug is carried on a colloidal carrier in which a conjugate of a lipid and a water-soluble polymer is incorporated at both ends of an enzyme substrate peptide, and the enzyme is specifically secreted from a diseased tissue. A drug delivery system (DDS) can be constructed by utilizing the fact that the drug carried on the enzyme substrate peptide portion is decomposed and cleaved by the reaction and released to the target tissue.
非特許文献７の方法によると、重量平均分子量５０００のチオール末端ポリエチレングリコールで被覆した金ナノロッドを、アミノプロピルトリエトキシシランで表面処理したガラス基板上に固定化し、メルカプトヘキサデカン酸とのカルボジイミド結合で捕捉物質となる抗体（rabbit IgG）を金ナノロッドに導入した分析用チップを作製しており、特異的に結合する抗体（goat antirabbit IgG）と、非特異的に結合する抗体（goat antimouse IgG）を接触させた場合における分析用チップの金ナノロッドによるＬＳＰＲの吸収スペクトルの変化を検出している。 According to the method of Non-Patent Document 7, gold nanorods coated with a thiol-terminated polyethylene glycol having a weight average molecular weight of 5000 are immobilized on a glass substrate surface-treated with aminopropyltriethoxysilane and captured by a carbodiimide bond with mercaptohexadecanoic acid. An analysis chip is prepared by introducing a substance antibody (rabbit IgG) into a gold nanorod, and an antibody that specifically binds (goat antirabbit IgG) and an antibody that binds nonspecifically (goat antimouse IgG) are contacted. In this case, a change in the absorption spectrum of LSPR by the gold nanorod of the analysis chip is detected.
非特許文献８の方法によると、メルカプトプロピルトリエトキシシランで表面処理したガラスに金ナノロッドを固定化し、その基板をポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）とポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）を交互に１０回ずつ、計２０層のポリマー層で被覆した基板にビオチンを捕捉物質として修飾した分析用チップを作製しており、検出対象の標的物質であるストレプトアビジンと結合して生じた金ナノロッドによるＬＳＰＲの吸収スペクトルの変化を検出している。 According to the method of Non-Patent Document 8, gold nanorods were immobilized on glass surface-treated with mercaptopropyltriethoxysilane, and the substrate was alternately subjected to polyallylamine hydrochloride (PAH) and polystyrene sulfonic acid (PSS) 10 times, An analytical chip is prepared by modifying biotin as a capture substance on a substrate coated with a total of 20 polymer layers, and the absorption spectrum of LSPR by gold nanorods generated by binding to the target substance to be detected is streptavidin. A change is detected.
特許文献６によると、金属微粒子（直径１０〜２０ｎｍの金微粒子）を任意の基板上に固定化したＬＳＰＲセンサーを検討しており、液体内に配置したＬＳＰＲセンサーに対して光を照射し、基板に固定された金属微粒子を透過した光の吸光度を測定することにより、基板に固定された金属微粒子近傍の媒質の屈折率を検出し、検出結果に応じてＬＳＰＲセンサーが配置された液体の屈折率を測定することが可能である。 According to Patent Document 6, an LSPR sensor in which metal fine particles (gold fine particles having a diameter of 10 to 20 nm) are immobilized on an arbitrary substrate is examined, and light is irradiated to the LSPR sensor disposed in a liquid to form a substrate. The refractive index of the medium in the vicinity of the metal fine particles fixed to the substrate is detected by measuring the absorbance of the light transmitted through the metal fine particles fixed to the substrate, and the refractive index of the liquid in which the LSPR sensor is arranged according to the detection result Can be measured.
非特許文献９の方法によると、ビオチン、またはアビジンで修飾されたデキストラン被覆酸化鉄微粒子に、マトリクスメタロプロテアーゼの基質ペプチドを結合させ、酸化鉄と結合している基質ペプチドにポリエチレングリコールを導入し立体的な反発力で、ビオチンとアビジンの結合による酸化鉄微粒子の集合を抑止している。この基質ペプチドは、マトリクスメタロプロテアーゼの酵素反応により分解されると、ポリエチレングリコールが酸化鉄微粒子から脱離し、ビオチンとアビジンの結合で酸化鉄微粒子が集合することを利用して、ＭＲＩの造影能の変化を検討している。 According to the method of Non-Patent Document 9, a matrix metalloprotease substrate peptide is bound to dextran-coated iron oxide fine particles modified with biotin or avidin, and polyethylene glycol is introduced into the substrate peptide bound to iron oxide. The repulsive force suppresses the assembly of iron oxide particles due to the binding of biotin and avidin. When this substrate peptide is decomposed by the enzyme reaction of matrix metalloprotease, polyethylene glycol is detached from the iron oxide fine particles, and the iron oxide fine particles are aggregated by the binding of biotin and avidin. We are considering changes.
特許文献１〜４などの方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆された状態で水中に分散しているが、特定部位で凝集・集積する機能は有していない。 Gold nanorods synthesized by methods such as Patent Documents 1 to 4 are dispersed in water in a state where they are coated with CTAB, but do not have a function of aggregating and accumulating at specific sites.
非特許文献５は、金ナノロッドをＰＳＳで表面処理後に抗体と結合させているが、金ナノロッドの二光子発光を測定するための処理方法であり、金ナノロッドのＬＳＰＲをセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。 In Non-Patent Document 5, gold nanorods are bound to antibodies after surface treatment with PSS. This is a processing method for measuring the two-photon emission of gold nanorods, and the LSPR of gold nanorods is applied to sensing technology and bioimaging. It was n’t.
非特許文献６の粒子は、ＮＩＰＡＭ中の担持物質を輸送・放出することは可能であるが、標的組織を認識して担持物質を放出する機能は有していない。 The particles of Non-Patent Document 6 can transport and release the support material in NIPAM, but do not have a function of recognizing the target tissue and releasing the support material.
非特許文献７は、検出対象物質の捕捉により生じる金ナノロッド周囲の屈折率の変化に伴う吸収スペクトルの変化を検出原理とする分析用チップと分析方法であるが、分析用チップの作製には２０回の高分子膜をコーティングする必要がある。また、分析用チップが標的物質を検出した場合の金ナノロッドによる吸収スペクトルの変化は最大吸収波長のシフト量が４nm未満であり検出感度は低い。非特許文献８も非特許文献７と同様に、検出対象物質の捕捉により生じる金ナノロッド周囲の屈折率の変化に伴う吸収スペクトルの変化を検出原理とする分析用チップと分析方法であるが、分析用チップの作製には煩雑な工程を必要とする。また、分析用チップが標的物質を検出した場合の金ナノロッドによる吸収スペクトルの変化は最大吸収波長のシフト量が１０nm未満であり検出感度は低い。 Non-Patent Document 7 describes an analysis chip and an analysis method based on a detection principle based on a change in absorption spectrum accompanying a change in refractive index around a gold nanorod caused by capturing a detection target substance. It is necessary to coat the polymer film once. Further, when the analysis chip detects the target substance, the change in the absorption spectrum by the gold nanorod has a shift amount of the maximum absorption wavelength of less than 4 nm, and the detection sensitivity is low. Similarly to Non-Patent Document 7, Non-Patent Document 8 is an analysis chip and analysis method based on the detection principle of a change in absorption spectrum accompanying a change in refractive index around a gold nanorod caused by capturing a detection target substance. A complicated process is required for the production of the chip. Further, when the analysis chip detects the target substance, the change in the absorption spectrum by the gold nanorod has a shift amount of the maximum absorption wavelength of less than 10 nm, and the detection sensitivity is low.
特許文献５は、標的組織に存在する酵素を認識して薬物を放出するＤＤＳは構築可能であるが、薬物を放出した後はコロイダルキャリアーが分解されてしまうため伝達物質としての機能しかなく、標的組織に残存してマーカーとなる機能はなかった。また、特定物質を認識して変化を起こすセンシング素子としての機能はなかった。 In Patent Document 5, a DDS that recognizes an enzyme present in a target tissue and releases a drug can be constructed. However, after the drug is released, the colloidal carrier is decomposed, so that it has only a function as a transmitter. There was no marker function remaining in the tissue. Moreover, there was no function as a sensing element that recognizes a specific substance and causes a change.
特許文献６の金微粒子は、球状金微粒子のＬＳＰＲを利用して、特定物質の吸着による微粒子近傍の媒質による屈折率の変化を吸光度で測定するセンシング技術に関するものであるが、金ナノロッドを使用したものではなく、測定に利用できる吸収波長域は球状金微粒子を使用しているため５３０ｎｍ付近と限られている。また、特許文献６の免疫センサー用デバイスは、高分子で被覆した金属薄膜の表面プラズモン共鳴を分析センサーに応用しているが、金属微粒子のＬＳＰＲの吸収波長を利用したものではない。 The gold fine particle of Patent Document 6 relates to a sensing technique that uses a LSPR of a spherical gold fine particle to measure a change in refractive index due to a medium in the vicinity of the fine particle due to adsorption of a specific substance, but uses a gold nanorod. However, the absorption wavelength region that can be used for measurement is limited to around 530 nm because spherical gold fine particles are used. Moreover, although the device for immunosensors of Patent Document 6 applies surface plasmon resonance of a metal thin film coated with a polymer to an analytical sensor, it does not use the absorption wavelength of LSPR of metal fine particles.
非特許文献９の酸化鉄微粒子は、特定の酵素による基質ペプチドの分解とビオチン−アビジンによる結合を利用して酸化鉄微粒子を集合（凝集）させており、その酵素量や酸化鉄濃度の関係で磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）のＴ２緩和時間を調整する技術であり、金属微粒子の凝集で生ずるＬＳＰＲの大きな吸収スペクトル変化をセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。 The iron oxide fine particles of Non-Patent Document 9 aggregate (aggregate) iron oxide fine particles by utilizing the decomposition of the substrate peptide by a specific enzyme and the binding by biotin-avidin, and depending on the amount of the enzyme and the iron oxide concentration. This is a technique for adjusting the T2 relaxation time of magnetic resonance imaging (MRI), and is not applied to a sensing technique or bioimaging with a large absorption spectrum change of LSPR caused by aggregation of metal fine particles.
本発明は従来の上記技術では知られていない金ナノロッドの新規技術を提供する。具体的には、基質ペプチドと分散媒に相溶する部位からなる有機物を吸着した金ナノロッドとその製造方法を提供するものであり、さらに金ナノロッドの凝集を利用した特定物質の検出と金ナノロッドの特定部位への集積方法、そして金ナノロッドを集積させた特定部位へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、及び薬物伝達システムを提供する。 The present invention provides a novel technique of gold nanorods that is not known in the prior art. Specifically, the present invention provides a gold nanorod adsorbing an organic substance composed of a site compatible with a substrate peptide and a dispersion medium, and a method for producing the gold nanorod. Furthermore, the detection of a specific substance using aggregation of the gold nanorod and the gold nanorod are provided. Provided are an integration method for a specific site, and a photothermal treatment, bioimaging, and drug delivery system for a specific site where gold nanorods are integrated.
本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子とその製造方法に関する。
〔１〕分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子。
〔２〕分散媒に相溶する部位(Ａ)の一方の末端が基質ペプチド(Ｂ)と反応する官能基を有し、基質ペプチド(Ｂ)の一方の末端が上記部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有し、基質ペプチド(Ｂ)の他方の末端が金ナノロッドに吸着するチオール基を有する有機物によって修飾されている上記[１]の金微粒子。
〔３〕部位(Ａ)が水溶性高分子である上記[１]または上記[２]の金微粒子。
〔４〕部位(Ａ)が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]の何れかに記載する金微粒子。
〔５〕基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼの基質ペプチドである上記[１]〜上記[４]の何れかに記載する金微粒子。
〔６〕基質ペプチド(Ｂ)が部位特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔７〕基質ぺプチド(Ｂ)が病巣特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔８〕基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)基質ペプチド、マトリクスメタロプロテアーゼ基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔９〕基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)または／およびマトリクスメタロプロテアーゼで分解されるトリプシン基質ペプチド、キモトリプシン基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔１０〕長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である上記[１]〜上記[９]の何れかに記載する金微粒子。
〔１１〕基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解され、部位(Ａ)がロッド形状の金微粒子から脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位で該金微粒子が凝集する上記[１]〜上記[１０]の何れかに記載する金微粒子。
〔１２〕分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成する工程、該有機物の基質ペプチド(Ｂ)をリンカーとしてロッド形状の金微粒子に吸着させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
〔１３〕両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコールと、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）基質ペプチドを、溶媒に溶解し、塩基を加えて攪拌し、反応させて、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成し、該有機物によって金ナノロッドを表面処理する表面修飾金微粒子の製造方法。
The present invention relates to gold fine particles having the following structure and a method for producing the same.
[1] Rod-shaped gold fine particles modified with an organic substance containing a part (A) that is compatible with a dispersion medium and a substrate peptide (B) that is decomposed by a specific enzyme, wherein the organic substance is a substrate peptide ( Gold fine particles, wherein the portion B) is adsorbed as a linker.
[2] One end of the site (A) compatible with the dispersion medium has a functional group that reacts with the substrate peptide (B), and one end of the substrate peptide (B) is a functional group of the site (A). The gold microparticle of [1] above, which has a primary amine that reacts with the organic peptide, and the other end of the substrate peptide (B) is modified with an organic substance having a thiol group adsorbed on the gold nanorod.
[3] The gold fine particle according to [1] or [2], wherein the site (A) is a water-soluble polymer.
[4] The gold fine particles according to any one of [1] to [3] above, wherein the site (A) is polyethylene glycol having a polymerization average molecular weight of 40000 or less.
[5] The gold microparticles according to any one of [1] to [4] above, wherein the substrate peptide (B) is a protease substrate peptide.
[6] The gold fine particle according to [5], which is a substrate peptide that is degraded by a protease in which the substrate peptide (B) is expressed in a site-specific manner.
[7] The gold fine particle according to the above [5], which is a substrate peptide that is degraded by a protease in which the substrate peptide (B) is expressed specifically in a lesion.
[8] The gold microparticle according to [5], wherein the substrate peptide (B) is a substrate peptide selected from urokinase plasminogen activator (uPA) substrate peptide and matrix metalloprotease substrate peptide.
[9] Described in [5] above, wherein the substrate peptide (B) is a substrate peptide selected from trypsin substrate peptide and chymotrypsin substrate peptide that are degraded by urokinase plasminogen activator (uPA) and / or matrix metalloproteinase. Gold fine particles.
[10] The long axis length is less than 400 nm, the aspect ratio is larger than 1, and the maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance is in the range of 700 to 2000 nm. Gold fine particles.
[11] The substrate peptide (B) is decomposed by a protease, the site (A) is detached from the rod-shaped gold microparticles, and the gold microparticles aggregate at a specific site where the protease is expressed. 10] The gold fine particles described in any one of [10].
[12] A step of reacting an organic substance containing the part (A) compatible with the dispersion medium with an organic substance containing the substrate peptide (B) to synthesize an organic substance containing the part (A) and the substrate peptide (B). A method for producing surface-modified gold fine particles, comprising a step of adsorbing the organic substrate peptide (B) to rod-shaped gold fine particles as a linker.
[13] Polyethylene glycol containing methoxy group and N-hydroxysuccinimide ester (NHS) at both ends and urokinase plasminogen activator (uPA) substrate peptide containing primary amine and thiol group are dissolved in a solvent, and a base is added. In addition, the surface modification is carried out by stirring, reacting, synthesizing an organic substance containing a part (A) that is compatible with the dispersion medium and a substrate peptide (B) that is decomposed by a specific enzyme, and treating the gold nanorods with the organic substance. A method for producing gold fine particles.
また、本発明は上記金微粒子を利用した集積方法、および該集積方法を利用した用途に関する。
〔１４〕上記[１１]に記載する凝集によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
〔１５〕部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物のロッド形状の金微粒子への吸着量によって、特定部位に該金微粒子が凝集する時間を調整する上記[１４]に記載する金微粒子の集積方法。
〔１６〕上記[１４]または上記[１５]に記載する金微粒子の凝集によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で特定物質を検出することを特徴とする特定物質の検出方法。
〔１７〕上記[１４]または上記[１５]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
〔１８〕上記[１４]または上記[１５]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
〔１９〕上記[１４]または上記[１５]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
The present invention also relates to an accumulation method using the above-mentioned gold fine particles and applications using the accumulation method.
[14] A method for accumulating gold fine particles, comprising collecting rod-shaped gold fine particles at a specific site by aggregation as described in [11] above.
[15] The gold fine particles according to [14], wherein the time for the gold fine particles to aggregate at a specific portion is adjusted by the amount of adsorption of the organic substance containing the portion (A) and the substrate peptide (B) to the rod-shaped gold fine particles. Integration method.
[16] A method for detecting a specific substance, wherein the specific substance is detected by a change in an absorption spectrum of localized surface plasmon resonance generated by aggregation of gold fine particles according to [14] or [15].
[17] A bioimaging characterized by observing an absorption spectrum of localized surface plasmon resonance generated by accumulation of gold fine particles according to [14] or [15].
[18] Irradiate 700 to 2000 nm of near-infrared rays to the gold fine particle accumulation site generated by the accumulation method described in [14] or [15] above, and generate cells around the accumulation site by photothermal conversion of the gold fine particle. Photothermal treatment characterized by killing with heat.
[19] Irradiate 700 to 2000 nm of near-infrared rays to the gold fine particle accumulation site generated by the accumulation method described in [14] or [15] above, and generate cells around the accumulation site by photothermal conversion of the gold fine particle. A drug delivery system (DDS) characterized in that the drug supported on the gold fine particles is released by the applied heat.
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位と基質ペプチドを含有する有機物によって修飾され、基質ペプチドがリンカーとして金ナノロッドに吸着した金微粒子であり、特定の酵素によって基質ペプチドが分解されると、分散媒への相溶する部位が金ナノロッドから脱離するため、金ナノロッドの凝集が発生し、特定の酵素が存在する部位へ金ナノロッドを集積することができる。 The gold microparticles of the present invention are gold microparticles that are modified with an organic substance containing a site compatible with a dispersion medium and a substrate peptide, and the substrate peptide is adsorbed on a gold nanorod as a linker, and the substrate peptide is decomposed by a specific enzyme. Then, since the site compatible with the dispersion medium is detached from the gold nanorod, the gold nanorod is aggregated, and the gold nanorod can be accumulated at the site where the specific enzyme exists.
また、本発明の金微粒子は、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲の金ナノロッドを用いているので、凝集・集積によってＬＳＰＲの分光特性が変化することを利用して、基質ペプチドに対して基質特異的な酵素を検出することができる。 In addition, since the gold fine particles of the present invention use gold nanorods having a maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance in the range of 700 to 2000 nm, utilizing the fact that the spectral characteristics of LSPR change due to aggregation and accumulation, An enzyme specific for the substrate peptide can be detected.
さらに、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッドを集積させた部位周辺組織へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、そしてドラックデリバリーシステムの構築が可能である。 Furthermore, since the gold nanorod has a photothermal conversion function, it is possible to construct a photothermal treatment, bioimaging, and a drug delivery system for a tissue around the site where the gold nanorod is integrated.
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on embodiments. The concentration% is mass% unless otherwise indicated.
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子である。 The gold fine particles of the present invention are rod-shaped gold fine particles modified with an organic substance containing a part (A) that is compatible with a dispersion medium and a substrate peptide (B) that is decomposed by a specific enzyme. Are adsorbed using the substrate peptide (B) site as a linker.
本発明の集積方法は、上記金ナノロッドを修飾している有機物の分解を利用したものであり、酵素により基質ペプチドが分解され、分散媒へ相溶する部位が金ナノロッドから脱離するため、金ナノロッドの凝集が発生し、特定の酵素が存在する部位へ金ナノロッドを集積することを利用したものである。 The accumulation method of the present invention utilizes the decomposition of the organic substance that modifies the gold nanorod, and the substrate peptide is decomposed by the enzyme, and the site compatible with the dispersion medium is detached from the gold nanorod. It utilizes the accumulation of gold nanorods at a site where a specific enzyme exists due to aggregation of the nanorods.
本発明の特定物質の検出方法は、上記金ナノロッドの集積方法を利用したものであり、金ナノロッドの凝集・集積によってＬＳＰＲの分光特性や散乱光強度が変化することを利用して、本発明の基質ペプチドに基質特異的な酵素を検出するものである。 The method for detecting a specific substance of the present invention utilizes the above-described gold nanorod accumulation method, and utilizes the fact that the spectroscopic characteristics and scattered light intensity of LSPR change due to the aggregation and accumulation of gold nanorods. It detects a substrate-specific enzyme in a substrate peptide.
本発明のフォトサーマル治療は、上記金ナノロッドがＬＰＳＲに相当する光を吸収して熱に変換する光熱変換機能を利用し、該金ナノロッドが集積している部位周辺の細胞（がん細胞など）を発生した熱で死滅させるものである。本発明のＤＤＳは、上記金ナノロッドに薬物を担持させて生体内に投与し、特定の酵素が存在する部位で金ナノロッドが集積するのを利用して特定部位に薬物を集中投与するシステムである。また、本発明のバイオイメージングは、上記金ナノロッドが集積している部位を金ナノロッドのＬＳＰＲを測定して画像化することによって確認するものである。なお、本発明における吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの凝集に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。 The photothermal treatment of the present invention uses a photothermal conversion function in which the gold nanorod absorbs light corresponding to LPSR and converts it into heat, and cells around the site where the gold nanorod is accumulated (such as cancer cells). Is killed by the heat generated. The DDS of the present invention is a system in which a drug is loaded on the gold nanorod and administered into the living body, and the drug is concentratedly administered to a specific site using the accumulation of the gold nanorod at the site where the specific enzyme is present. . Further, the bioimaging of the present invention is to confirm the site where the gold nanorods are accumulated by measuring the LSPR of the gold nanorods and imaging them. The change in the absorption spectrum in the present invention means a decrease in absorbance at the maximum absorption wavelength of LSPR or a change in the absorption spectrum shape accompanying the aggregation of gold nanorods.
〔修飾有機物〕
金ナノロッドに吸着させる有機物は、分散媒に相溶する部位(Ａ)、特定物質で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する。
[Modified organic matter]
The organic substance adsorbed on the gold nanorod contains a part (A) that is compatible with the dispersion medium and a substrate peptide (B) that is decomposed by a specific substance.
分散媒に相溶する部位(Ａ)としては水溶性高分子を用いることができる。また、基質ペプチド(Ｂ)としてはプロテアーゼの基質ペプチドを用いることができる。金ナノロッドとしては、長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲の金ナノロッドが使用できる。 A water-soluble polymer can be used as the site (A) compatible with the dispersion medium. As the substrate peptide (B), a protease substrate peptide can be used. As the gold nanorod, a gold nanorod having a major axis length of less than 400 nm, an aspect ratio larger than 1, and a maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance in the range of 700 to 2000 nm can be used.
金ナノロッドに吸着させる上記有機物において、部位(Ａ)の水溶性高分子としては、水と相溶して金ナノロッドを分散媒中で安定に分散させることができるような水溶性高分子であれば制限なく使用でき、例えば、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリアクリル酸などが挙げられる。以下では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の例について説明する。 In the organic substance adsorbed on the gold nanorod, the water-soluble polymer of the site (A) is a water-soluble polymer that is compatible with water and can stably disperse the gold nanorod in the dispersion medium. It can be used without limitation, and examples thereof include polyethylene glycol, cellulose, and polyacrylic acid. Hereinafter, an example of polyethylene glycol (PEG) will be described.
部位(Ａ)に使用するＰＥＧとしては、重量平均分子量４００００以下のＰＥＧを使用することができる。ＰＥＧの分子量は、好ましくは、１０００〜１００００であり、分子量が１０００より小さいと分散媒中での分散安定性が不足し、分子量が４００００より大きいと酵素による基質ペプチドの分解が起こりにくくなる。 As the PEG used for the site (A), a PEG having a weight average molecular weight of 40000 or less can be used. The molecular weight of PEG is preferably 1000 to 10,000. If the molecular weight is smaller than 1000, the dispersion stability in the dispersion medium is insufficient, and if the molecular weight is larger than 40000, the substrate peptide is hardly degraded by the enzyme.
本発明の部位(Ａ)に使用するＰＥＧの一方の末端は、基質ペプチド中の一級アミンと反応する官能基を有しており、官能基としては、一級アミンと反応するものであれば制限なく使用できる。特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を末端に有するものは、基質ペプチドの一級アミンと安定なアミド結合を形成できるので好ましい。また、ＰＥＧのもう一方の末端は金と吸着を起こさない化学構造であるメトキシ基が好ましい。以下、末端に、ＮＨＳとメトキシ基を有するＰＥＧ（ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、実施例１の式[１]に相当）を例に説明する。 One end of the PEG used for the site (A) of the present invention has a functional group that reacts with a primary amine in the substrate peptide, and the functional group is not limited as long as it reacts with a primary amine. Can be used. In particular, those having N-hydroxysuccinimide ester (NHS) at the terminal are preferable because they can form a stable amide bond with the primary amine of the substrate peptide. The other end of PEG is preferably a methoxy group that has a chemical structure that does not adsorb gold. Hereinafter, PEG having NHS and a methoxy group at the terminal (ME-PEG-NHS, corresponding to Formula [1] in Example 1) will be described as an example.
本発明の金ナノロッドに吸着させる有機物において、部位(Ｂ)に使用する基質ペプチドとしては、プロテアーゼの基質ペプチドを制限なく使用することができる。プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解する酵素であり、一般にセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼに大別される。 In the organic substance adsorbed on the gold nanorod of the present invention, a protease substrate peptide can be used without limitation as a substrate peptide used in the site (B). Proteases are enzymes that hydrolyze peptide bonds, and are generally divided into serine proteases, cysteine proteases, aspartic proteases, and metalloproteases.
本発明に使用するセリンプロテアーゼには、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン、エラスターゼ、スブチリシン、トロンビン、テルミターゼ、凝血因子Ｘａ、プラスミン、ケキシン、プロテイナーゼＫ、カテプシン、チマーゼ、アクロシン、スクテラリン、オルリジン、カテプシン、メトリジン、ククミシン、プロリルオリゴぺプチターゼ、ブラキウリン、カリクレイン、セレビシン、ヒポデルミンＣ、ベノムビン、サブチリシン、テルモミコリン、フリン、ミロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイム、ストレプトグラシン、トガビリン、フラビビリン、ラクトセピン、アセンビリン、セパシビリン、セバルモシン、シュードモナリシン、キサントモナリシン、フィサロリシン、ヘプシン、マトリプターゼなどが挙げられる。 Serine proteases used in the present invention include urokinase plasminogen activator (uPA), trypsin, chymotrypsin, subtilisin, elastase, subtilisin, thrombin, thermitase, clotting factor Xa, plasmin, kexin, proteinase K, cathepsin, tymase, acrosin , Scutellarin, orlidine, cathepsin, metridine, kukumycin, prolyl oligopeptidase, brachyurin, kallikrein, cerevicin, hypodermin C, benombin, subtilisin, thermomicolin, furin, miloblastine, semenogelase, granzyme, streptoglasin, togabilin, flavirin, pinavirin, flavirin, pin Cepacivirin, sebalmosine, pseudomonaricin, xantomonalisin, fisa Lysine, hepsin, and the like matriptase.
以下、基質ペプチドとして、セリンプロテアーゼの一種であるウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）の基質ペプチドを例に説明する。これはがん細胞で特異的に過剰発現している。また、このｕＰＡの基質ペプチド（ｕＰＡｓｕｂ）は、Ｆｍｏｃ固相合成法などによって合成することができる。 Hereinafter, the substrate peptide of urokinase plasminogen activator (uPA), which is a kind of serine protease, will be described as an example. This is specifically overexpressed in cancer cells. The uPA substrate peptide (uPAsub) can be synthesized by the Fmoc solid phase synthesis method or the like.
本発明の基質ペプチドの一方の末端は、部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有していればよい。基質ペプチドの他方の末端は、金ナノロッドに吸着するチオール基を有していればよい。チオール基は金と共有結合を形成するので、部位(Ａ)と部位(Ｂ)を含む有機物は部位(Ｂ)のチオール末端から優先的に金ナノロッドに吸着する。 One end of the substrate peptide of the present invention only needs to have a primary amine that reacts with the functional group at the site (A). The other end of the substrate peptide only needs to have a thiol group that adsorbs to the gold nanorods. Since the thiol group forms a covalent bond with gold, the organic substance containing the site (A) and the site (B) is preferentially adsorbed on the gold nanorod from the thiol end of the site (B).
以下、末端に、一級アミンとチオール基を有するｕＰＡｓｕｂ（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2、実施例１の式[２]に相当）を例に説明する。 Hereinafter, a uPAsub having a primary amine and a thiol group at the terminal (H-uPAsub-Cys-NH 2 , corresponding to the formula [2] in Example 1) will be described as an example.
〔修飾有機物の合成〕
分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成することができる。具体的には、例えば、両末端にメトキシ基とＮＨＳを含むポリエチレングリコール（ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）と、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター基質ペプチド（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）を、溶媒に溶解し、好ましくは塩基を加え、室温で攪拌すると、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＮＨＳは、Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の一級アミンとアミド結合を形成し、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ、実施例１の式[３]に相当）が得られる。
[Synthesis of modified organic compounds]
The organic substance containing the site (A) and the substrate peptide (B) can be synthesized by reacting the organic substance containing the site (A) compatible with the dispersion medium with the organic substance containing the substrate peptide (B). Specifically, for example, polyethylene glycol (ME-PEG-NHS) containing a methoxy group and NHS at both ends, and a urokinase plasminogen activator substrate peptide (H-uPAsub-Cys-NH containing a primary amine and a thiol group). 2 ) is dissolved in a solvent, preferably a base is added, and the NHS of ME-PEG-NHS forms an amide bond with the primary amine of H-uPAsub-Cys-NH 2 when stirred at room temperature. An organic substance (PEG-uPAsub-Cys, corresponding to Formula [3] in Example 1) containing a compatible site (A) and a substrate peptide (B) that is degraded by a specific enzyme is obtained.
合成に使用する溶媒としては、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2を溶解するものであれば際限なく使用でき、好ましくは、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用すればよい。また、塩基としては、反応を促進するものであればよく、好ましくは、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを使用すればよい。 As a solvent used for the synthesis, any solvent that can dissolve ME-PEG-NHS and H-uPAsub-Cys-NH 2 can be used without limitation, and N, N-dimethylformamide is preferably used. Moreover, as a base, what accelerates | stimulates a reaction should just be used, and what is necessary is just to use N, N- diisopropyl ethylamine.
〔金ナノロッド〕
本発明で使用する金ナノロッド（ＮＲｓ）は、長軸の長さが４００nm未満であって、アスペクト比が１より大きいロッド形状の金微粒子が好ましい。具体的には、ＬＳＰＲの最大吸収波長が波長７００〜２０００ｎｍの範囲内にあるアスペクト比の金ナノロッドが適当である。また金ナノロッドの長軸長さは２００ｎｍ以下がより好ましい。長軸長さがこより長いと、金ナノロッドが沈降しやすくなる傾向があり、分散媒中での分散安定性が失われる。
[Gold nanorods]
The gold nanorods (NRs) used in the present invention are preferably rod-shaped gold fine particles having a major axis length of less than 400 nm and an aspect ratio of greater than 1. Specifically, gold nanorods having an aspect ratio in which the maximum absorption wavelength of LSPR is in the range of 700 to 2000 nm are suitable. The major axis length of the gold nanorod is more preferably 200 nm or less. If the long axis length is longer than this, the gold nanorods tend to settle, and the dispersion stability in the dispersion medium is lost.
金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、ｎ＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。この金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
Gold nanorods can be synthesized by reducing gold ions in an aqueous solution in which a quaternary ammonium salt represented by the following formula [I] is dissolved. For example, by using n = 15 hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), gold nanorods with CTAB adsorbed on the surface can be obtained. This gold nanorod is stably dispersed in water with CTAB adsorbed.
CH 3 (CH 2 ) n N + (CH 3 ) 3 Br − (n is an integer of 1 to 15)… [I]
上記金ナノロッド水分散液は、水中に存在する余剰の界面活性剤ＣＴＡＢを除去して使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、ＣＴＡＢを含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰なＣＴＡＢを除去することができる。なお、ＣＴＡＢを過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。 The gold nanorod aqueous dispersion may be used after removing excess surfactant CTAB present in the water. Specifically, the gold nanorod aqueous dispersion is centrifuged to settle the gold nanorod on the bottom of the centrifuge tube, and the supernatant containing CTAB is removed. The precipitated gold nanorods are redispersed by adding water. Excess CTAB can be removed by repeating this operation 1-3 times. If CTAB is removed excessively, the gold nanorods aggregate and do not re-disperse in water.
〔表面処理〕
余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド水分散液と、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を混合して攪拌すると、部位(Ａ)−部位(Ｂ)−金ナノロッドの構成を有する修飾金ナノロッドが得られる。例えば、金ナノロッド水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを混合し、室温で１２時間攪拌すると、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓのチオール基が金ナノロッドに吸着し、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物が吸着したＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓが得られる。
〔surface treatment〕
When the gold nanorod aqueous dispersion from which excess CTAB has been removed, the organic substance containing the part (A) compatible with the dispersion medium and the substrate peptide (B) decomposed by a specific enzyme are mixed and stirred, the part (A) -A modified gold nanorod having the structure of the site (B)-gold nanorod is obtained. For example, when a gold nanorod aqueous dispersion and PEG-uPAsub-Cys are mixed and stirred at room temperature for 12 hours, the thiol group of PEG-uPAsub-Cys is adsorbed on the gold nanorod and is compatible with the dispersion medium (A) PEG-uPAsub-Cys-NRs adsorbed with an organic substance containing a substrate peptide (B) that is degraded by a specific enzyme is obtained.
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおいて、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量は調整可能であり、金ナノロッド水分散液に対するＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を調整すればよい。例えば、ＮＲｓ（金原子として）：ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ＝１０：１、１０：２、１０：５とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂの添加量を増やした場合、金ナノロッドへのＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量は増加する。 In PEG-uPAsub-Cys-NRs, the adsorption amount of PEG-uPAsub-Cys can be adjusted, and the amount of PEG-uPAsub-Cys added to the gold nanorod aqueous dispersion may be adjusted. For example, when the addition amount of NRs (as gold atom): PEG-uPAsub-Cys = 10: 1, 10: 2, 10: 5 and PEG-uPAsub is increased, the adsorption amount of PEG-uPAsub-Cys to the gold nanorods Will increase.
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおける部位(Ｂ)の基質ペプチドは、ｕＰＡの基質ペプチドであり、プロテアーゼにより分解される。例えば、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおいて、プロテアーゼによりｕＰＡｓｕｂが分解されると金ナノロッドからＰＥＧが脱離し、金ナノロッドの分散安定性が失われ、分散媒中で金ナノロッドの凝集が起こる。金ナノロッドの凝集は、金ナノロッドのＬＳＰＲの分光特性の変化や、金ナノロッド分散液の色の変化（赤色から紫色へ変化）によって確認することができる。 The substrate peptide at site (B) in PEG-uPAsub-Cys-NRs is a substrate peptide of uPA and is degraded by protease. For example, in PEG-uPAsub-Cys-NRs, when uPAsub is decomposed by a protease, PEG is detached from the gold nanorods, the dispersion stability of the gold nanorods is lost, and the gold nanorods aggregate in the dispersion medium. Aggregation of gold nanorods can be confirmed by a change in the LSPR spectral characteristics of the gold nanorods or a change in the color of the gold nanorod dispersion (change from red to purple).
〔金ナノロッドの集積〕
上記有機物によって修飾された金ナノロッドは、基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解されると、分散媒に相溶する部位(Ａ)が金ナノロッドから脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位に凝集する。この凝集を利用して金ナノロッドを特定部位に集積させることができる。この集積時間は上記有機物の吸着量によって調整することができる。
[Integration of gold nanorods]
In the gold nanorod modified with the organic substance, when the substrate peptide (B) is decomposed by the protease, the site (A) compatible with the dispersion medium is detached from the gold nanorod and aggregated at a specific site where the protease is expressed. To do. By utilizing this aggregation, gold nanorods can be accumulated at a specific site. This accumulation time can be adjusted by the amount of organic matter adsorbed.
また、基質ペプチドを分解する酵素の量は、金ナノロッドの凝集に関係する。例えば、ｕＰＡｓｕｂをトリプシンで分解する場合、ＰＥＧと金ナノロッドを切断するのに必要なトリプシンの量は、金が０.１mM含まれるＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓに対して、１nM以上であり、好ましくは、１０〜１０００nMである。トリプシンの量が１nMより少ないと、ｕＰＡｓｕｂの分解が不十分となり、金ナノロッドからＰＥＧが十分に脱離せず、金ナノロッドの凝集が不完全となる。 Also, the amount of enzyme that degrades the substrate peptide is related to the aggregation of gold nanorods. For example, when uPAsub is digested with trypsin, the amount of trypsin required for cleaving PEG and gold nanorods is 1 nM or more with respect to PEG-uPAsub-Cys-NRs containing 0.1 mM of gold, preferably Is 10 to 1000 nM. When the amount of trypsin is less than 1 nM, uPAsub is not sufficiently decomposed, PEG is not sufficiently detached from the gold nanorod, and the aggregation of the gold nanorod is incomplete.
一定量のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓに対するトリプシンの量が多くなると、ｕＰＡｓｕｂの分解速度が速くなり、金ナノロッドの凝集速度も速くなる。また、金ナノロッドへのＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量を調整することにより、一定量のトリプシンによるｕＰＡｓｕｂ分解時間、すなわち、金ナノロッドの凝集が生じるまでの時間を調整することができる。ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量が多いほど、ｕＰＡｓｕｂの分解時間が長くなるため、金ナノロッドの凝集が起こるまでの時間も長くなる。 When the amount of trypsin with respect to a certain amount of PEG-uPAsub-Cys-NRs increases, the degradation rate of uPAsub increases and the aggregation rate of gold nanorods also increases. Further, by adjusting the amount of PEG-uPAsub-Cys adsorbed on the gold nanorods, it is possible to adjust the uPAsub decomposition time by a certain amount of trypsin, that is, the time until aggregation of the gold nanorods occurs. The greater the amount of PEG-uPAsub-Cys adsorbed, the longer the decomposition time of uPAsub, and the longer the time until gold nanorods aggregate.
基質ペプチドの分解により凝集した金ナノロッドは、分解が起こった部位や溶液中で集積する。例えば、生体内の特定部位に存在する特定酵素により基質ペプチドが分解されると、特定酵素の存在する部位に金ナノロッドが集積する。 Gold nanorods aggregated by decomposition of the substrate peptide accumulate in the site where the decomposition occurred or in the solution. For example, when the substrate peptide is decomposed by a specific enzyme present at a specific site in the living body, gold nanorods accumulate at the site where the specific enzyme exists.
〔検出方法・治療方法等〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００ｎｍにＬＳＰＲの吸収ピークを有しており、分散状態から凝集状態へ変化するとＬＳＰＲの分光特性が変化するため、特定酵素の検出や、特定酵素の存在する部位を検出することが可能である。この検出方法としては、金ナノロッドの吸収スペクトルの形状変化、吸光度の変化、散乱光強度の変化が挙げられる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステム（特定酵素部位の画像処理化など）を構築することができる。
[Detection and treatment methods]
The gold nanorod used in the present invention has an LSPR absorption peak at 700 to 2000 nm, and the spectral characteristics of the LSPR change when the dispersion state changes to the aggregation state. It is possible to detect the part to be performed. Examples of this detection method include changes in the shape of the absorption spectrum of gold nanorods, changes in absorbance, and changes in scattered light intensity. In particular, near-infrared light with a wavelength of 800 nm to 1200 nm is less affected by water absorption (Near Infrared Window) and is a safe wavelength range for the living body. By irradiating near-infrared light from outside the living body, It is possible to measure changes in spectral characteristics due to the dispersion state and aggregation state of administered gold nanorods, and to construct near-infrared light analysis systems and bioimaging systems (such as image processing of specific enzyme sites) .
特定酵素の存在部位に集積させた金ナノロッドにＬＳＰＲに相当する光を照射すると、金ナノロッドの光熱変換機能により集積している部位周辺の温度が上昇する。特に、生体内で集積させた金ナノロッドに近赤外線を照射した場合、集積部位周辺の細胞（例えばがん細胞）を発生した熱で死滅させることが可能であり、金ナノロッド集積部位をフォトサーマル治療用のターゲットマーカーとして使用することができる。 When light corresponding to LSPR is irradiated to gold nanorods accumulated at a site where a specific enzyme is present, the temperature around the site where the gold nanorods are accumulated increases due to the photothermal conversion function of the gold nanorods. In particular, when near-infrared rays are irradiated to gold nanorods collected in vivo, it is possible to kill cells around the accumulation site (for example, cancer cells) with the generated heat, and photothermal treatment of the gold nanorod accumulation site Can be used as a target marker.
本発明の有機物で修飾した金ナノロッド（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ）に薬物を担持させて、生体内に投与した場合、特定酵素の存在する部位で特異的に集積するため、薬物を効率よく輸送・放出することが可能である。例えば、ｕＰＡはがん細胞で過剰発現しており、投与されたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓのｕＰＡｓｕｂは、がん細胞部位のｕＰＡにて分解されて、金ナノロッドが集積し薬物を集中投与可能となるため、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓを薬物担持キャリアーとするＤＤＳが構築可能である。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。 When a drug is loaded on a gold nanorod (PEG-uPAsub-Cys-NRs) modified with an organic substance of the present invention and administered into a living body, it accumulates specifically at a site where a specific enzyme is present. It can be transported and released. For example, uPA is overexpressed in cancer cells, and administered PEG-uPAsub-Cys-NRs uPAsub is decomposed by uPA at the cancer cell site, and gold nanorods accumulate, allowing drug administration to be concentrated Therefore, it is possible to construct a DDS using PEG-uPAsub-Cys-NRs as a drug-carrying carrier. In particular, gold is a biologically safe material and is useful as a carrier.
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例は、金ナノロッドの主に９００ｎｍ付近の波長域におけるＬＳＰＲの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２０００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. Moreover, a comparative example is shown. The following examples measure the absorption wavelength shift of LSPR mainly in the wavelength region near 900 nm of gold nanorods, but also in the wavelength region from 700 to 2000 nm by changing the aspect ratio of gold nanorods. A similar shift in absorption wavelength can be measured.
分光特性は日本分光株式会社製品のＶ−６７０で測定した。散乱光はMalverne社のZeta-sizer Nano-ZSで測定した。基質ペプチドを分解する酵素はプロテアーゼを制限なく使用できるが、実施例１〜７・比較例１〜３ではセリンプロテアーゼのひとつであるトリプシンを使用し、実施例８〜９ではセリンプロテアーゼのひとつであるｕＰＡを使用した。 Spectral characteristics were measured with JASCO Corporation V-670. The scattered light was measured by Malverne Zeta-sizer Nano-ZS. As the enzyme that degrades the substrate peptide, protease can be used without limitation. In Examples 1 to 7 and Comparative Examples 1 to 3, trypsin, which is one of serine proteases, is used, and in Examples 8 to 9, it is one of serine proteases. uPA was used.
〔ｕＰＡ基質ペプチドの合成〕
Ｆｍｏｃ固相合成法により、基質ペプチド（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）を合成した。Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2：Ｈ−ＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（分子量１３４６、Ｌ：ロイシン、Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン、Ｒ：アルギニン、Ａ：アラニン、Ｎ：アスパラギン、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｃｙｓ：システイン）。
[Synthesis of uPA substrate peptide]
A substrate peptide (H-uPAsub-Cys-NH 2 ) was synthesized by the Fmoc solid phase synthesis method. H-uPAsub-Cys-NH 2 : H-LGGSGRSANAILE-Cys-NH 2 ( molecular weight 1346, L: leucine, G: glycine, S: serine, R: arginine, A: Alanine, N: asparagine, I: isoleucine, E : Glutamic acid, Cys: cysteine).
〔金ナノロッド水分散液の調製〕
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドは水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド水分散液を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
[Preparation of gold nanorod aqueous dispersion]
Gold nanorod aqueous dispersion synthesized in 400 mM CTAB aqueous solution is placed in a centrifuge tube and centrifuged at 14000 (× g) relative centrifugal acceleration (centrifugal acceleration divided by the Earth's gravitational acceleration) for 10 minutes. Nanorods were allowed to settle to the bottom of the centrifuge tube. The supernatant liquid was put into another centrifuge tube, and the settled gold nanorods were redispersed with water. The supernatant in another centrifuge tube was centrifuged again at 14,000 (× g) for 10 minutes to settle the gold nanorods, and the supernatant was removed to remove excess CTAB. The settled gold nanorods were redispersed with water and combined with the previous redispersion liquid to obtain a gold nanorod water dispersion liquid. The gold atom concentration in the gold nanorod aqueous dispersion was determined from the absorbance.
〔実施例１〕
両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含む式（１）のＰＥＧ（重合平均分子量５０００、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）２５.１mg（４.６４μmol）と一級アミンとチオール基を含む式（２）のｕＰＡｓｕｂ（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）１２.５mg（９.２８μmol）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド５９６μLに溶解し、塩基としてＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン４μL（２３.０μmol）を加え、これを室温で３日間攪拌した。攪拌終了後、分画分子量２０００の透析膜を用いて水中にて３日間透析を行い、未反応のＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2を除去した。この結果、式[１]中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）は、式[２]の一級アミンと反応してアミド結合を形成し、式[３]の化合物（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ）が得られた。ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の結合は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのマススペクトルで、反応後の質量ピークが増大することにより確認された（図１(Ａ)ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、(Ｂ)ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−ＣｙｓのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）。
[Example 1]
PEG of formula (1) containing methoxy group and N-hydroxysuccinimide ester (NHS) at both ends (polymerization average molecular weight 5000, ME-PEG-NHS) 25.1 mg (4.64 μmol), primary amine and thiol group 12.5 mg (9.28 μmol) of uPAsub (H-uPAsub-Cys-NH 2 ) of formula (2) is dissolved in 596 μL of N, N-dimethylformamide, and 4 μL (23.0 μmol) of N, N-diisopropylethylamine as a base Was added and stirred at room temperature for 3 days. After completion of the stirring, for 3 days dialyzed against water using a dialysis membrane of a fractionation molecular weight of 2,000 to remove H-uPAsub-Cys-NH 2 unreacted. As a result, N-hydroxysuccinimide ester (NHS) in formula [1] reacts with a primary amine of formula [2] to form an amide bond, and the compound of formula [3] (PEG-uPAsub-Cys) Obtained. The bond between ME-PEG-NHS and H-uPAsub-Cys-NH 2 was confirmed by an increase in mass peak after the reaction in the mass spectrum of MALDI-TOF-MS (FIG. 1 (A) ME-PEG -MALDI-TOF-MS of NHS, (B) MALDI-TOF-MS of PEG-uPAsub-Cys).
〔実施例２〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が１０：１となるように、ＮＲｓ水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ水溶液を混合した（金原子濃度１ｍM）。これを室温で１２時間攪拌し、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを金ナノロッドに吸着させた。攪拌終了後、１４０００(×g)で１０分間遠心分離し金ナノロッドを沈降させ、上澄み液を除去し、水でＮＲｓを再分散させた。この遠心分離操作を２回繰り返して余剰のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを除去した後、水でＮＲｓを再分散させ、分散媒に相溶するＰＥＧと、特定の酵素で分解される基質ペプチドｕＰＡｓｕｂを含む有機物がｕＰＡｓｕｂをリンカーとして吸着したＮＲｓ水分散液が得られた（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の分光特性を図２(Ａ)に示す。ＮＲｓはＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着前後で、ＬＳＰＲの分光特性に変化はなく、水中に安定に分散していることが分かる。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認された（図３(Ａ)）。
[Example 2]
The NRs aqueous dispersion and the PEG-uPAsub-Cys aqueous solution were mixed so that the concentration ratio of gold atoms to PEG-uPAsub-Cys was 10: 1 (gold atom concentration 1 mM). This was stirred at room temperature for 12 hours to adsorb PEG-uPAsub-Cys to the gold nanorods. After completion of stirring, the mixture was centrifuged at 14000 (× g) for 10 minutes to precipitate the gold nanorods, the supernatant was removed, and NRs were redispersed with water. After this centrifugation operation is repeated twice to remove excess PEG-uPAsub-Cys, NRs is redispersed with water, and contains PEG compatible with the dispersion medium and substrate peptide uPAsub that is degraded by a specific enzyme An NRs aqueous dispersion in which organic substances were adsorbed using uPAsub as a linker was obtained (PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 aqueous dispersion). The spectral characteristics of the obtained PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 aqueous dispersion are shown in FIG. It can be seen that NRs is stably dispersed in water without any change in the spectral characteristics of LSPR before and after adsorption of PEG-uPAsub-Cys. Further, as a result of staining the PEG site with phosphotungstic acid and observing it with an electron microscope, it was confirmed that the PEG site was present around the NRs (FIG. 3A).
〔実施例３〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が５：１である以外は実施例２と同様にして、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２水分散液の分光特性を図２(Ｂ)に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認され、コントラストが実施例２の場合より強く、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を増やすとＮＲｓへの吸着量が増加することが確認された（図３(Ｂ)）。
Example 3
An NRs aqueous dispersion was obtained in the same manner as in Example 2 except that the concentration ratio of gold atom to PEG-uPAsub-Cys was 5: 1 (PEG-uPAsub-Cys-NRs-2 aqueous dispersion). The spectral characteristics of the obtained PEG-uPAsub-Cys-NRs-2 aqueous dispersion are shown in FIG. Further, as a result of staining the PEG site with phosphotungstic acid and observing with an electron microscope, the presence around NRs was confirmed, the contrast was stronger than in Example 2, and the addition amount of PEG-uPAsub-Cys was increased. It was confirmed that the amount of adsorption to NRs increased (FIG. 3B).
〔実施例４〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が２：１である以外は実施例２と同様にして、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３水分散液の分光特性を図２（ｃ）に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認され、コントラストが実施例３の場合より強く、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を増やすとＮＲｓへの吸着量が増加することが確認された（図３（ｃ））。
Example 4
An NRs aqueous dispersion was obtained in the same manner as in Example 2 except that the concentration ratio of gold atom to PEG-uPAsub-Cys was 2: 1 (PEG-uPAsub-Cys-NRs-3 aqueous dispersion). The spectral characteristics of the obtained PEG-uPAsub-Cys-NRs-3 aqueous dispersion are shown in FIG. Further, as a result of staining the PEG site with phosphotungstic acid and observing with an electron microscope, the presence around NRs was confirmed, the contrast was stronger than in Example 3, and the addition amount of PEG-uPAsub-Cys was increased. It was confirmed that the amount of adsorption to NRs increased (FIG. 3 (c)).
〔実施例５〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図４に酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液と、酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素トリプシンを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。図５に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率（任意反応時間での吸光度／反応開始時の吸光度×１００％）を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集によって速やかに吸光度が減少することが確認された。図６に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集によって速やかに散乱光強度が増加することが確認された。酵素反応後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１について電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの凝集が確認された（図７）。
Example 5
Prepared to be 0.1 mM (gold atom concentration) of PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 (NRs aqueous dispersion of Example 2), 100 nM trypsin, 10 mM CaCl 2 , 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). Enzymatic reaction with trypsin was performed. As a result, the color of the PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 aqueous dispersion changes from red before the enzyme reaction to purple, uPAsub is decomposed, the PEG moiety is desorbed from NRs, and NRs is dispersed in water. It was confirmed that the stability was lost and aggregated. FIG. 4 shows the spectral characteristics of the PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 aqueous dispersion after the enzymatic reaction (20 ° C. for 15 minutes) and the sample incubated under the same conditions without the enzyme. After adding the enzyme trypsin, sharp spectral characteristics are lost due to aggregation of NRs. FIG. 5 shows the change rate with time of the absorbance of NRs at a measurement wavelength of 900 nm (absorbance at arbitrary reaction time / absorbance at the start of reaction × 100%) as a spectral characteristic of the aqueous dispersion of NRs during enzyme reaction (20 ° C.). After the enzyme was added, it was confirmed that the absorbance decreased rapidly due to aggregation of NRs. FIG. 6 shows the scattered light intensity of NRs in the NRs aqueous dispersion during the enzyme reaction (25 ° C.). After the enzyme was added, it was confirmed that the scattered light intensity increased rapidly due to aggregation of NRs. As a result of observing the PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 after the enzyme reaction with an electron microscope, aggregation of NRs was confirmed (FIG. 7).
〔実施例６〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）をそれぞれ２５nM、５０nM、７５nMにし、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、どのトリプシン量の場合でも、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図８に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加するとＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。図９に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加するとＮＲｓの凝集により速やかに散乱光強度が増加することが確認された。トリプシンの添加量が多いほど分光特性や散乱光強度は速く変化し、その変化量も大きいことが確認された。
Example 6
0.1 mM (gold atom concentration) of PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 (NRs aqueous dispersion of Example 2) was adjusted to 25 nM, 50 nM, and 75 nM, respectively, 100 nM trypsin, 10 mM CaCl 2 , 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). The enzyme reaction with trypsin was performed. As a result, regardless of the amount of trypsin, the color of the PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 aqueous dispersion changes from red before the enzyme reaction to purple, the uPAsub is decomposed, and the PEG moiety is desorbed from the NRs. It was confirmed that the dispersion stability of NRs in water was lost and aggregated. FIG. 8 shows the time-dependent change rate of the absorbance of NRs at a measurement wavelength of 900 nm as spectral characteristics of the NRs aqueous dispersion during the enzyme reaction (20 ° C.). It was confirmed that when the enzyme was added, the absorbance rapidly decreased due to aggregation of NRs. FIG. 9 shows the scattered light intensity of NRs in the NRs aqueous dispersion during the enzyme reaction (25 ° C.). It was confirmed that when the enzyme was added, the scattered light intensity rapidly increased due to aggregation of NRs. It was confirmed that the larger the amount of trypsin added, the faster the spectral characteristics and scattered light intensity changed, and the larger the amount of change.
〔実施例７〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３（実施例２のＮＲｓ水分散液、実施例３のＮＲｓ水分散液、実施例４のＮＲｓ水分散液）を用い、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３の水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３の水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１：図４、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２：図１０、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３：図１１）。それぞれ、酵素トリプシンを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す（図１２）。それぞれ、酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す（図１３）。それぞれ、酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに散乱光強度が増加することが確認された。分光特性、吸光度の経時変化率、そして散乱光強度について、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量の多いＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３が最も変化量が少なかったことより、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量により、ＮＲｓの凝集能を制御できることが確認できた。
Example 7
0.1 mM (gold atom concentration) of PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 to 3 (NRs aqueous dispersion of Example 2, NRs aqueous dispersion of Example 3, NRs aqueous dispersion of Example 4) was used. , 100 nM trypsin, 10 mM CaCl 2 , 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), and an enzyme reaction with trypsin was performed. As a result, the color of the aqueous dispersion of PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 to 3 changes from red before the enzyme reaction to purple, uPAsub is decomposed, the PEG moiety is desorbed from NRs, It was confirmed that the dispersion stability was lost and aggregated. FIG. 6 shows the spectral characteristics of a sample incubated with an aqueous dispersion of PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 to 3 after enzymatic reaction (20 ° C. for 15 minutes) in the same condition without an enzyme (PEG-uPAsub-Cys-NRs- 1: FIG. 4, PEG-uPAsub-Cys-NRs-2: FIG. 10, PEG-uPAsub-Cys-NRs-3: FIG. 11). In each case, after the addition of the enzyme trypsin, sharp spectral characteristics disappear due to aggregation of NRs. The spectral characteristics of the NRs aqueous dispersion during the enzymatic reaction (20 ° C.) show the rate of change in NRs absorbance over time at a measurement wavelength of 900 nm (FIG. 12). It was confirmed that the absorbance decreased rapidly due to the aggregation of NRs after the addition of the enzyme. The scattered light intensity of NRs in the NRs aqueous dispersion during the enzyme reaction (25 ° C.) is shown (FIG. 13). In each case, it was confirmed that the intensity of scattered light rapidly increased due to aggregation of NRs after addition of the enzyme. Regarding the spectral characteristics, the rate of change of absorbance with time, and the intensity of scattered light, PEG-uPAsub-Cys-NRs-3, which has the largest amount of adsorption of PEG-uPAsub-Cys, has the smallest amount of change. It was confirmed that the NRs aggregation ability can be controlled by the amount of adsorption.
〔実施例８〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が１００：１となるように、ＮＲｓ水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ水溶液を混合した（金原子濃度１ｍM）。これを室温で１２時間攪拌し、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを金ナノロッドに吸着させた。攪拌終了後、１２０００(×g)で１０分間遠心分離し金ナノロッドを沈降させた。上澄み液を除去し、水でＮＲｓを再分散させ、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液の分光特性を図１７に示す。ＮＲｓはＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着前後で、ＬＳＰＲの分光特性に変化はなく、水中に安定に分散していることが分かる。
Example 8
The NRs aqueous dispersion and the PEG-uPAsub-Cys aqueous solution were mixed so that the concentration ratio of gold atoms to PEG-uPAsub-Cys was 100: 1 (gold atom concentration 1 mM). This was stirred at room temperature for 12 hours to adsorb PEG-uPAsub-Cys to the gold nanorods. After completion of the stirring, the mixture was centrifuged at 12000 (× g) for 10 minutes to precipitate the gold nanorods. The supernatant was removed, and NRs was redispersed with water to obtain an NRs aqueous dispersion (PEG-uPAsub-Cys-NRs-4 aqueous dispersion). FIG. 17 shows the spectral characteristics of the obtained PEG-uPAsub-Cys-NRs-4 aqueous dispersion. It can be seen that NRs is stably dispersed in water without any change in the spectral characteristics of LSPR before and after adsorption of PEG-uPAsub-Cys.
〔実施例９〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４（実施例８のＮＲｓ水分散液）、５５６nMｕＰＡ、１００mMＮａＣｌ、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）になるように調製してｕＰＡによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図１８に酵素反応（２０℃で１時間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素ｕＰＡを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。図１９に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。
Example 9
Prepared to be 0.1 mM (gold atom concentration) of PEG-uPAsub-Cys-NRs-4 (NRs aqueous dispersion of Example 8), 556 nMuPA, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5). Enzymatic reaction was performed. As a result, the color of the PEG-uPAsub-Cys-NRs-4 aqueous dispersion changed from red before the enzyme reaction to purple, and it was confirmed that the dispersion stability of NRs in water was lost and aggregated. . FIG. 18 shows the spectral characteristics of a sample incubated with the PEG-uPAsub-Cys-NRs-4 aqueous dispersion after the enzyme reaction (1 hour at 20 ° C.) without the enzyme under the same conditions. After the addition of the enzyme uPA, sharp spectral characteristics are lost due to aggregation of NRs. FIG. 19 shows the time-dependent change rate of the absorbance of NRs at a measurement wavelength of 900 nm as spectral characteristics of the NRs aqueous dispersion during the enzyme reaction (20 ° C.). After adding the enzyme, it was confirmed that the absorbance decreased rapidly due to aggregation of NRs.
〔比較例１〕
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの代わりに両末端がメトキシ基とチオール基であるＰＥＧ水溶液を用いた以外は実施例２と同様にして、金ナノロッド水分散液を得た（ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液）。得られたＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液の分光特性を図２（ｄ）に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸によって染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、金ナノロッドの周囲に存在が確認された（図３（ｄ））。
[Comparative Example 1]
A gold nanorod aqueous dispersion was obtained in the same manner as in Example 2 except that a PEG aqueous solution having both methoxy and thiol groups at both ends was used instead of PEG-uPAsub-Cys (PEG-NRs-1 aqueous dispersion). ). The spectral characteristics of the obtained PEG-NRs-1 aqueous dispersion are shown in FIG. Further, as a result of staining the PEG site with phosphotungstic acid and observing it with an electron microscope, the presence of the PEG site around the gold nanorods was confirmed (FIG. 3D).
〔比較例２〕
０.１ｍM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように混合した。この結果、ｕＰＡｓｕｂが分解されず、ＮＲｓは水中で安定に分散し、溶液の色は変化せず、凝集は観察されなかった。図８（トリプシン添加量０nMの場合）に混合（２０℃）後のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。混合後、ＮＲｓの吸光度は変化しなかった。図９（トリプシン添加量０nMの場合）に混合（２５℃）後のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。混合後、ＮＲｓの散乱光強度は変化しなかった。これらの結果より、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１は酵素によるｕＰＡｓｕｂ分解により、ＰＥＧがＮＲｓより脱離して、ＮＲｓが凝集することが確認できた。
[Comparative Example 2]
0.1mM PEG-uPAsub-Cys-NRs -1 (NRs aqueous dispersion of Example 2) (Fri atomic concentration) were mixed so that 10 mM CaCl 2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). As a result, uPAsub was not decomposed, NRs was stably dispersed in water, the color of the solution was not changed, and aggregation was not observed. FIG. 8 (in the case where the amount of trypsin added is 0 nM) shows the change rate with time of the absorbance of NRs at a measurement wavelength of 900 nm in the spectral characteristics of the NRs aqueous dispersion after mixing (20 ° C.). After mixing, the absorbance of NRs did not change. FIG. 9 (in the case where the amount of trypsin added is 0 nM) shows the scattered light intensity of NRs in the NRs aqueous dispersion after mixing (25 ° C.). After mixing, the scattered light intensity of NRs did not change. From these results, it was confirmed that PEG-uPAsub-Cys-NRs-1 was desorbed from NRs and NRs aggregated due to enzymatic degradation of uPAsub.
〔比較例３〕
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１の代わりに、比較例１で得られたＰＥＧ−ＮＲｓ−１を使用する以外は、実施例５と同様に酵素反応を行った。結果、ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液の色は赤色のままであり、凝集は観察されなかった。図１４に酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素トリプシンを添加した後も分光特性に変化は確認されなかった。図１５に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加後も吸光度に変化は確認されなかった。図１６に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加後も散乱光強度に変化は確認されなかった。
[Comparative Example 3]
An enzyme reaction was performed in the same manner as in Example 5 except that PEG-NRs-1 obtained in Comparative Example 1 was used instead of PEG-uPAsub-Cys-NRs-1. As a result, the color of the PEG-NRs-1 aqueous dispersion remained red and no aggregation was observed. FIG. 14 shows the spectral characteristics of a sample incubated with the PEG-NRs-1 aqueous dispersion after the enzyme reaction (20 ° C. for 15 minutes) under the same conditions without the enzyme. Even after the addition of the enzyme trypsin, no change was observed in the spectral characteristics. FIG. 15 shows the time-dependent change rate of the absorbance of NRs at a measurement wavelength of 900 nm as spectral characteristics of the NRs aqueous dispersion during the enzyme reaction (20 ° C.). There was no change in absorbance after addition of the enzyme. FIG. 16 shows the scattered light intensity of NRs in the NRs aqueous dispersion during the enzyme reaction (25 ° C.). Even after the enzyme was added, no change in the scattered light intensity was observed.
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