JP2010001303A - Hla-binding peptide and use thereof - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means and a method for selecting immunogenetic peptides and a composition of the immunogenic peptide specifically binding to a glycoprotein encoded by an HLA allele and inducing activation of T cells in the T cells restricted by the allele. <P>SOLUTION: The composition includes the immunogenetic peptide having an HLA-binding motif, wherein the immunogenic peptide is a specific peptide. The peptide is useful for expressing immuno response to a desired antigen. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本願発明は、ＨＬＡ分子のための結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。   The present invention provides a composition comprising an immunogenic peptide having a binding motif for an HLA molecule.

本願発明は、多数の病理学的症状、例えば、ウイルス疾患及び癌の予防、治療又は診断のための組成物及び方法に関する。特に、本願発明は、選択された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、そして免疫応答を誘発することができる新規のペプチドを提供する。   The present invention relates to compositions and methods for the prevention, treatment or diagnosis of a number of pathological conditions such as viral diseases and cancer. In particular, the present invention provides novel peptides that can bind to selected major histocompatibility complex (MHC) molecules and elicit an immune response.

ＭＨＣ分子は、クラスＩ又はクラスIIのいずれかの分子として分類される。クラスII ＭＨＣ分子は、免疫応答を開始し、そして持続させることに関係する細胞、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ、等の上で主に発現される。クラスII ＭＨＣ分子は、ヘルパーＴ細胞により認識され、そしてヘルパーＴリンパ球の増殖を、そして提示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を、誘導する。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほとんど全ての有核細胞上で発現され、そして細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）により認識される、これは次に抗原担持細胞により破壊される。ＣＴＬｓは、腫瘍拒絶において、そしてウイルス感染との戦いにおいて特に重要である。   MHC molecules are classified as either class I or class II molecules. Class II MHC molecules are mainly expressed on cells involved in initiating and sustaining an immune response, such as T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, and the like. Class II MHC molecules are recognized by helper T cells and induce the proliferation of helper T lymphocytes and the amplification of immune responses to the particular immunogenic peptides presented. Class I MHC molecules are expressed on almost all nucleated cells and are recognized by cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which are then destroyed by antigen bearing cells. CTLs are particularly important in tumor rejection and in the fight against viral infection.

ＣＴＬは、無傷の外来抗原自体よりもＭＨＣクラスＩ分子に結合したペプチド断片の形態にある抗原を認識する。抗原は、通常、細胞により内因的に合成されなければならず、そしてそのタンパク質抗原の一部は、細胞質内の小ペプチド断片に分解される。これらの小ペプチドのいくつかは、プレ−ゴルジ（ｐｒｅ−Ｇｏｌｇｉ）区画内に輸送され、そしてクラスＩの重鎖と相互作用して、適当な折り畳み、及びサブユニットβ２マイクログロブリンとの会合を容易にする。次に、このペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、特異的ＣＴＬｓによる発現及び潜在的な認識のために細胞表面に運ばれる。   CTL recognizes antigens in the form of peptide fragments bound to MHC class I molecules rather than intact foreign antigens themselves. Antigens usually must be synthesized endogenously by the cell, and some of the protein antigens are broken down into small peptide fragments in the cytoplasm. Some of these small peptides are transported into the pre-Golgi compartment and interact with class I heavy chains to facilitate proper folding and association with subunit β2 microglobulin. To. This peptide-MHC class I complex is then transported to the cell surface for expression and potential recognition by specific CTLs.

ヒトＭＨＣクラスＩ分子、ＨＬＡ−Ａ２．１の結晶構造の調査は、ペプチド結合性溝（ｇｒｏｏｖｅ）が、クラスＩ重鎖のα１ドメインとα２ドメインの折り畳みにより創られるということを示している(Bjorkman et al., Nature 329 : 506 (1987))。しかしながら、これらの調査においては、上記溝に結合するペプチドの同一性は、決定されなかった。 Investigation of the crystal structure of the human MHC class I molecule, HLA-A2.1, shows that peptide-binding grooves are created by folding the α1 and α2 domains of class I heavy chains (Bjorkman et al., Nature 329: 506 (1987)). However, in these studies, the identity of the peptide that binds to the groove was not determined.

Buus et al., Science 242 : 1065 (1988)は、ＭＨＣからの結合ペプチドの酸溶離の方法を最初に記載した。その後、Rammensee と共同研究者（Falk et al.,Nature 351 : 290 (1991))らは、クラスＩ分子に結合した天然にプロセスされたペプチドを特徴付けるためのアプローチを開発した。他の研究者らは、Ｂタイプの(Jardetzky, et al., Nature 353 : 326 (1991))及びマス・スペクトロメトリーによるＡ２．１タイプの（Hunt, et al., Science 225 : 1261 (1992)) のクラスＩ分子から溶離されたペプチドの慣用の自動配列決定によりさまざまなＨＰＬＣ画分内のより多量のペプチドの直接的アミノ酸配列決定を首尾よく達成した。ＭＨＣクラスＩにおける天然にプロセスされたペプチドの特徴付けのレビューは、Roetzschke and Falk (Roetzschke and Falk, Immunol. Today 12 : 447(1991)) により提示されている。 Buus et al., Science 242: 1065 (1988) first described the method of acid elution of bound peptides from MHC. Later, Rammensee and co-workers (Falk et al., Nature 351: 290 (1991)) and others developed an approach to characterize naturally processed peptides bound to class I molecules. Other investigators have shown that B type (Jardetzky, et al., Nature 353: 326 (1991)) and mass spectrometry A2.1 type (Hunt, et al., Science 225: 1261 (1992) The direct amino acid sequencing of larger amounts of peptides within the various HPLC fractions was successfully achieved by conventional automated sequencing of peptides eluted from a) class I molecule. A review of the characterization of naturally processed peptides in MHC class I is presented by Roetzschke and Falk (Roetzschke and Falk, Immunol. Today 12: 447 (1991)).

Sette et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 3296 (1989) は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的モチーフが、ＭＨＣ結合能力を予測するために使用されることができるであろうということを示した。Schaeffer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 4649 (1989) は、ＭＨＣ結合が、免疫原性に関係していることを示した。いくらかの著者（De Bruijn et al., Eur. J. Immunol., 21 : 2963-2970 (1991) ; Pamer et al., 991 Nature 353 : 852-955 (1991))は、クラスＩ結合モチーフが、動物モデルにおける潜在的に免疫原性のペプチドの同定に適用されることができるという予備的な証拠を提供した。与えられたクラスＩアイソタイプの多数のヒト対立遺伝子に特異的なクラスＩモチーフは、未だ記載されていない。これらの異なる対立遺伝子の組合せの頻度は、大きな画分又はたぶんヒト異系交配集団の大部分をカバーするために十分に高くなければならないということが望ましい。 Sette et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3296 (1989) states that MHC allele-specific motifs could be used to predict MHC binding capacity. Indicated. Schaeffer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4649 (1989) showed that MHC binding is involved in immunogenicity. Some authors (De Bruijn et al., Eur. J. Immunol. , 21: 2963-2970 (1991); Pamer et al., 991 Nature 353: 852-955 (1991)) Provided preliminary evidence that it can be applied to the identification of potentially immunogenic peptides in animal models. A class I motif specific for a number of human alleles of a given class I isotype has not yet been described. It is desirable that the frequency of these different allele combinations should be high enough to cover a large fraction or perhaps the majority of the human outbred population.

本分野における発展にも拘らず、従来技術は、未だ、上記研究に基づき有用なヒトペプチド−ベースのワクチン又は治療剤を提供していない。本願発明は、上記その他の利点を提供する。   Despite developments in the field, the prior art has not yet provided useful human peptide-based vaccines or therapeutics based on the above studies. The present invention provides the above and other advantages.

本願発明の要約
本願発明は、ＨＬＡ分子のための結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。適当なＭＨＣ対立遺伝子に結合する免疫原性ペプチドは、上記ペプチドが所望のＨＬＡ分子に結合することを許容する特定の位置に、保存された残基を含む。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a composition comprising an immunogenic peptide having a binding motif for an HLA molecule. Immunogenic peptides that bind to the appropriate MHC allele include conserved residues at specific positions that allow the peptide to bind to the desired HLA molecule.

多数の免疫原性標的タンパク質上のエピトープは、本願発明のペプチドを使用して同定されることができる。好適な抗原の例は、前立腺癌特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア及び表面抗原（ＨＢＶｃ，ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス抗原、ヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶ１）、カポジ肉腫ヘルペス・ウイルス（ＫＳＨＶ）、ヒト・パピローマ・ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサ（Ｌａｓｓａ）ウイルス、マイコバクテリウム・チューバーキュローシス（結核菌ＭＴ）、ｐ５３，ＣＥＡ、トリパノソーム表面抗原（ＴＳＡ）、及びＨｅｒ２／ｎｅｕを含む。従って、上記ペプチドは、治療と診断の両者の適用のための医薬組成物において有用である。   Epitopes on multiple immunogenic target proteins can be identified using the peptides of the present invention. Examples of suitable antigens include prostate cancer specific antigen (PSA), hepatitis B core and surface antigens (HBVc, HBVs), hepatitis C antigen, Epstein-Barr virus antigen, human immunodeficiency type 1 virus (HIV1), Kaposi's sarcoma herpesvirus (KSHV), human papillomavirus (HPV) antigen, Lassa virus, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis MT), p53, CEA, trypanosome surface antigen (TSA), And Her2 / neu. Accordingly, the peptides are useful in pharmaceutical compositions for both therapeutic and diagnostic applications.

特に、本発明は、その免疫原性ペプチドが表３〜１４に示すペプチドである、ＨＬＡ結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。表３〜１４中に示すペプチド内の残基の保存的置換を含むペプチドをも提供する。本願発明の免疫原性ペプチドは、第２のオリゴペプチドにさらに連結されることができる。いくつかの態様においては、第２のオリゴペプチドは、ヘルパーＴ応答を含むペプチドである。   In particular, the present invention provides a composition comprising an immunogenic peptide having an HLA binding motif, wherein the immunogenic peptide is a peptide shown in Tables 3-14. Also provided are peptides comprising conservative substitutions of residues within the peptides shown in Tables 3-14. The immunogenic peptide of the present invention can be further linked to a second oligopeptide. In some embodiments, the second oligopeptide is a peptide that includes a helper T response.

本願発明は、表３〜１４中に示すような免疫原性ペプチド、又は表３〜１４中に示すペプチドの残基の保存的置換を含むペプチドをコードする核酸をさらに提供する。上記核酸は、さらに、第２の免疫原性ペプチド又はヘルパーＴ応答を誘発するペプチドをコードする配列を含むことができる。   The present invention further provides a nucleic acid encoding an immunogenic peptide as shown in Tables 3-14, or a peptide comprising conservative substitutions of the residues of the peptides shown in Tables 3-14. The nucleic acid can further comprise a sequence encoding a second immunogenic peptide or peptide that elicits a helper T response.

本願発明において提供するペプチドは、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発するために使用されることができる。上記方法は、細胞毒性Ｔ細胞を本願発明のペプチドと接触させることを含む。   The peptides provided in the present invention can be used to elicit cytotoxic T cell responses either in vivo or in vitro. The method includes contacting cytotoxic T cells with the peptides of the present invention.

定義
用語“ペプチド”は、典型的には、隣接アミノ酸のアルファ−アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合により互いに結合された、一連の残基、典型的にはＬ−アミノ酸を指すために、本願明細書中、“オリゴペプチド”と互換的に使用される。本願発明のオリゴペプチドは、長さ約１５残基未満であり、そして通常、約８〜約１１の残基、好ましくは９又は１０の残基から成る。 Definitions The term “peptide” typically refers to a series of residues, typically L-amino acids, joined together by a peptide bond between the alpha-amino and carbonyl groups of adjacent amino acids. In the present specification, it is used interchangeably with “oligopeptide”. The oligopeptides of the present invention are less than about 15 residues in length and usually consist of about 8 to about 11 residues, preferably 9 or 10 residues.

“免疫原性ペプチド”は、そのペプチドがＭＨＣ分子に結合し、そしてＣＴＬ応答を誘発するであろうように、対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドである。本願発明の免疫原性ペプチドは、適当なＨＬＡ分子に結合し、そしてその免疫原性ペプチドが由来するところの抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発することができる。   An “immunogenic peptide” is a peptide that contains an allele-specific motif such that the peptide will bind to an MHC molecule and elicit a CTL response. The immunogenic peptides of the present invention can bind to appropriate HLA molecules and elicit a cytotoxic T cell response against the antigen from which the immunogenic peptide is derived.

免疫原性ペプチドは、便利には、本願発明のアルゴリズムを使用して同定される。このアルゴリズムは、免疫原性ペプチドの選択を可能にする等級（スコア）を作る数学的手順である。典型的には、当業者は、特定のアフィニティーにおける高い結合確率をもち、そして次に免疫原性となるであろう、ペプチドの選択を可能にする“結合しきい値（binding threshold)" をもつ上記アルゴリズム等級を使用する。このアルゴリズムは、ペプチドの特定の位置において特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果、又はモチーフ含有ペプチド内の特定の置換物の結合に対する効果のいずれかに基づく。   Immunogenic peptides are conveniently identified using the algorithm of the present invention. This algorithm is a mathematical procedure that creates a grade (score) that allows the selection of immunogenic peptides. Typically, one skilled in the art has a “binding threshold” that allows for the selection of peptides that have a high binding probability at a particular affinity and will then be immunogenic. Use the algorithm grade above. This algorithm is based either on the effect on the MHC binding of specific amino acids at specific positions of the peptide or on the binding of specific substitutions within the motif-containing peptide.

“保存（された）残基”は、ペプチドの特定の位置においてランダム分布により予測されるであろう有意に高い頻度において生じるアミノ酸である。典型的には、保存された残基は、そのＭＨＣ構造が、接触点に上記免疫原性ペプチドを提供することができるようなものである。所定長のペプチド内の少なくとも１〜３以上、好ましくは２の、保存された残基は、免疫原性ペプチドのためのモチーフを規定する。これらの残基は、典型的には、上記ペプチド結合性溝と密に接しており、それらの側鎖はその溝の特定のポケット内に埋められている。典型的には、免疫原性ペプチドは、３までの保存された残基、より普通には２つの保存された残基を含むであろう。   “Conserved residues” are amino acids that occur at a significantly higher frequency that would be predicted by a random distribution at a particular position in the peptide. Typically, the conserved residue is such that its MHC structure can provide the immunogenic peptide at the point of contact. At least 1-3 or more, preferably 2, conserved residues within a given length of peptide define a motif for an immunogenic peptide. These residues are typically in intimate contact with the peptide-binding groove and their side chains are buried in specific pockets of the groove. Typically, an immunogenic peptide will contain up to 3 conserved residues, more usually 2 conserved residues.

本願明細書中に使用するとき、“結合陰性残基（negative binding residues)" とは、特定の位置に存在する場合、非結合又は弱結合材（non binder or poor binder)であるペプチドをもたらし、そして次に免疫原性であること、すなわちＣＴＬ応答の誘発に失敗するであろうアミノ酸である。   As used herein, “negative binding residues”, when present at a particular position, results in a peptide that is a non- or a weak binder, And then the amino acids that will be immunogenic, i.e., fail to elicit a CTL response.

用語“モチーフ（ｍｏｔｉｆ）”とは、特定のＭＨＣ対立遺伝子により認識される、所定長の、通常、約８〜約１１のアミノ酸をもつペプチド内の残基のパターンをいう。このペプチド・モチーフは、典型的には、各ヒトＭＨＣ対立遺伝子について異なり、そして高く保存された残基及び陰性の残基のパターンにおいて相違する。   The term “motif” refers to a pattern of residues within a peptide of a predetermined length, usually from about 8 to about 11, amino acids that are recognized by a particular MHC allele. This peptide motif is typically different for each human MHC allele and differs in the pattern of highly conserved and negative residues.

対立遺伝子のための結合モチーフは、高い精度（increasing degrees of precision)をもって定義されることができる。ある場合には、保存された残基の全てがペプチド内の正しい位置に存在し、そして位置し、３、及び／又は７において陰性残基が存在しない。   Binding motifs for alleles can be defined with increasing degrees of precision. In some cases, all of the conserved residues are in the correct position in the peptide and are located and there are no negative residues at 3, and / or 7.

句“単離された”又は“生物学的に純粋”とは、その天然の状態において見られるような、通常それに同伴する成分を実質的に又は本質的に含有しない材料をいう。従って、本願発明のペプチドは、それらのイン・サイチュー環境と通常係わる材料、例えば抗原提示細胞上のＭＨＣ Ｉ分子を含まない。タンパク質が、均一又は優勢なバンドにまで単離されている場合にさえ、所望のタンパク質と同時に精製される、天然タンパク質の５〜１０％の範囲において、微量の汚染物質が存在する。本願発明の単離されたペプチドは、このような内因性の同時精製タンパク質は含まない。   The phrase “isolated” or “biologically pure” refers to material that is substantially or essentially free from components that normally accompany it, as found in its natural state. Thus, the peptides of the present invention do not include materials normally associated with their in situ environment, such as MHC I molecules on antigen presenting cells. Trace amounts of contaminants are present in the range of 5-10% of the native protein, which is purified at the same time as the desired protein, even when the protein is isolated to a uniform or dominant band. Isolated peptides of the present invention do not include such endogenous co-purified proteins.

用語“残基”とは、アミド結合又はアミド結合擬態によりオリゴペプチド内に取り込まれたアミノ酸又はアミノ酸擬態をいう。   The term “residue” refers to an amino acid or amino acid mimetic incorporated into an oligopeptide by an amide bond or amide bond mimetic.

好ましい態様の説明
本願発明は、（ときにＨＬＡという）ヒト・クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子サブタイプのための対立遺伝子特異的ペプチド・モチーフ、特にＨＬＡ対立遺伝子により認識されるペプチド・モチーフの決定に関する。 DESCRIPTION OF PREFERRED EMBODIMENTS The present invention relates to the determination of allele-specific peptide motifs for human class I MHC allele subtypes (sometimes referred to as HLA), particularly peptide motifs recognized by HLA alleles.

ＨＬＡ−Ａ２．１については、９アミノ酸のペプチドが、好ましくは、以下のモチーフをもつ：Ｉ，Ｖ，Ａ、及びＴから成る群から選ばれたＮ−末端から２番目の位置における第１の保存アミノ残基、並びにＶ，Ｌ，Ｉ，Ａ、及びＭから成る群から選ばれたＣ−末端位における第２の保存残基。他のモチーフは、選ばれたＮ−末端から２番目の位置における第１の保存残基がＬ，Ｍ，Ｉ，Ｖ，Ａ、及びＴから成る群に由来し、そして選ばれたＣ−末端位における第２の保存残基がＡ及びＭから成る群に由来するものである。１位のアミノ酸は、好ましくは、Ｄ及びＰから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。Ｎ−末端から３番目にあるアミノ酸は、Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｋ、及びＨから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。Ｎ−末端から６番目のアミノ酸は、Ｒ，Ｋ、及びＨから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。Ｎ−末端から７番目にあるアミノ酸は、Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｄ、及びＥから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。   For HLA-A2.1, a 9 amino acid peptide preferably has the following motif: the first in the second position from the N-terminus selected from the group consisting of I, V, A, and T A conserved amino residue and a second conserved residue at the C-terminal position selected from the group consisting of V, L, I, A and M. The other motif is derived from the group consisting of L, M, I, V, A, and T with the first conserved residue in the second position from the selected N-terminus and the selected C-terminus. The second conserved residue in position is from the group consisting of A and M. The amino acid at position 1 is preferably not an amino acid selected from the group consisting of D and P. The third amino acid from the N-terminus is not an amino acid selected from the group consisting of D, E, R, K, and H. The sixth amino acid from the N-terminus is not an amino acid selected from the group consisting of R, K, and H. The seventh amino acid from the N-terminus is not an amino acid selected from the group consisting of R, K, H, D, and E.

１０残基をもつペプチドのためのＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフは以下のものである：Ｌ，Ｍ，Ｉ，Ｖ，Ａ、及びＴから成る群から選ばれたＮ−末端から２番目にある第１の保存残基、並びにＶ，Ｉ，Ｌ，Ａ、及びＭから成る群から選ばれたＣ−末端位にある第２の保存残基。この第１及び第２保存残基は、７残基離れている。好ましくは、１位におけるアミノ酸は、Ｄ，Ｅ、及びＰから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。このＮ−末端残基は、Ｄ、及びＥから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。Ｎ−末端から４位にある残基は、Ａ，Ｋ，Ｒ、及びＨから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。Ｎ−末端から５位にあるアミノ酸はＰではない。Ｎ−末端から７位にあるアミノ酸は、Ｒ，Ｋ、及びＨから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。Ｎ−末端から８位にあるアミノ酸は、Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｋ、及びＨから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。Ｎ−末端から９位にあるアミノ酸は、Ｒ，Ｋ、及びＨから成る群から選ばれたアミノ酸ではない。   The HLA-A2.1 binding motif for a peptide having 10 residues is the following: second from the N-terminus selected from the group consisting of L, M, I, V, A, and T A first conserved residue and a second conserved residue at the C-terminal position selected from the group consisting of V, I, L, A, and M. The first and second conserved residues are 7 residues apart. Preferably, the amino acid at position 1 is not an amino acid selected from the group consisting of D, E, and P. The N-terminal residue is not an amino acid selected from the group consisting of D and E. The residue at position 4 from the N-terminus is not an amino acid selected from the group consisting of A, K, R, and H. The amino acid at position 5 from the N-terminus is not P. The amino acid at position 7 from the N-terminus is not an amino acid selected from the group consisting of R, K, and H. The amino acid at position 8 from the N-terminus is not an amino acid selected from the group consisting of D, E, R, K, and H. The amino acid at position 9 from the N-terminus is not an amino acid selected from the group consisting of R, K, and H.

ＨＬＡ−Ａ３．２のためのモチーフは、そのＮ−末端からＣ−末端まで、２位に、Ｌ，Ｍ，Ｉ，Ｖ，Ｓ，Ａ，Ｔ、及びＦからの第１保存残基、並びにそのＣ−末端にＫ，Ｒ、又はＹからの第２保存残基を含む。他の第１保存残基は、Ｃ，Ｇ又はＤ、そしてあるいはＥである。他の第２保存残基はＨ又はＦである。この第１及び第２保存残基は、好ましくは、６〜７残基離れている。   The motif for HLA-A3.2 is the first conserved residue from L, M, I, V, S, A, T, and F at position 2, from its N-terminus to the C-terminus, and It contains a second conserved residue from K, R, or Y at its C-terminus. Other first conserved residues are C, G or D, and alternatively E. The other second conserved residue is H or F. The first and second conserved residues are preferably 6-7 residues apart.

ＨＬＡ−Ａ１のためのモチーフは、そのＮ−末端からＣ−末端まで、Ｔ，Ｓ、又はＭの第１保存残基、Ｄ又はＥの第２保存残基、そしてＹの第３保存残基を含む。他の第２保存残基は、Ａ，Ｓ又はＴである。第１保存残基と第２保存残基は隣接し、そして好ましくは、６〜７残基程、第３保存残基から離れている。第２モチーフは、Ｅ又はＤからの第１保存残基、及びＹからの第２保存残基から成り、ここで第１保存残基と第２保存残基は５〜６残基離れている。   The motif for HLA-A1 is from its N-terminal to C-terminal, T, S, or M first conserved residues, D or E second conserved residues, and Y third conserved residues including. Another second conserved residue is A, S or T. The first conserved residue and the second conserved residue are adjacent and are preferably separated from the third conserved residue by about 6-7 residues. The second motif consists of the first conserved residue from E or D and the second conserved residue from Y, where the first and second conserved residues are 5-6 residues apart .

ＨＬＡ−Ａ１１のためのモチーフは、そのＮ−末端からＣ−末端まで、２位に、Ｔ，Ｖ，Ｍ，Ｌ，Ｉ，Ｓ，Ａ，Ｇ，Ｎ，Ｃ，Ｄ又はＦからの第１保存残基、並びにＫ，Ｒ，Ｙ又はＨからのＣ−末端保存残基を含む。第１保存残基と第２保存残基は、好ましくは、６又は７残基離れている。   The motif for HLA-A11 is the first from T, V, M, L, I, S, A, G, N, C, D or F from the N-terminus to the C-terminus in position 2. Conserved residues as well as C-terminal conserved residues from K, R, Y or H are included. The first and second conserved residues are preferably 6 or 7 residues apart.

ＨＬＡ−Ａ２４．１のためのモチーフは、そのＮ−末端からＣ−末端まで、２位に、Ｙ，Ｆ又はＷからの第１保存残基、並びにＦ，Ｉ，Ｗ，Ｍ又はＬからのＣ−末端保存残基を含む。この第１保存残基と第２保存残基は、好ましくは６〜７残基離れている。   The motif for HLA-A24.1 is from its N-terminal to C-terminal, in position 2, from the first conserved residue from Y, F or W, and from F, I, W, M or L Contains the C-terminal conserved residue. The first and second conserved residues are preferably 6-7 residues apart.

次にこれらのモチーフが、いずれかの所望の抗原由来のＴ細胞エピトープ、特に、ヒト・ウイルス疾患、癌又は自己免疫疾患に関係するものであって、それについて、潜在的な抗原又は自己抗原標的のアミノ酸配列が知られているものを定義するために使用される。   These motifs are then related to T cell epitopes from any desired antigen, in particular human viral diseases, cancers or autoimmune diseases, for which potential antigens or self antigen targets Are used to define the known amino acid sequence.

多数の潜在的な標的タンパク質上のエピトープがこのやり方で同定されることができる。好適な抗原の例は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア及び表面抗原（ＨＢＶｃ，ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス抗原、メラノーマ抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ヒト・ペピローマ・ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサ（Ｌａｓｓａ）ウイルス、マイコバクテリウム・チューバーキュローシス（結核菌ＭＴ）、ｐ５３，ＣＥＡ、トリパノソーム表面抗原（ＴＳＡ）、及びＨｅｒ２／ｎｅｕを含む。   A number of potential target protein epitopes can be identified in this manner. Examples of suitable antigens are prostate specific antigen (PSA), hepatitis B core and surface antigens (HBVc, HBVs), hepatitis C antigen, Epstein-Barr virus antigen, melanoma antigen (eg MAGE-1), human Immunodeficiency virus (HIV) antigen, human pepilloma virus (HPV) antigen, Lassa virus, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis MT), p53, CEA, trypanosome surface antigen (TSA), and Includes Her2 / neu.

上記抗原からのエピトープを含むペプチドを合成し、そして次に、例えば、免疫蛍光染色及びフロー・マイクロフルオロメトリー、ペプチド依存性クラスＩアセンブリー・アッセイ、及びペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害による、例えば、純粋クラスＩ分子及び放射性ヨウ素化ペプチド、及び／又は空クラスＩ分子を発現する細胞を使用したアッセイにおいて、適当なＭＨＣ分子に結合するそれらの能力についてテストする。上記クラスＩ分子に結合するようなペプチドを、感染又は免疫感作された個体から得られたＣＴＬｓのための標的として働くそれらの能力について、並びに潜在的な治療剤として事実上感染した標的細胞又は腫瘍細胞と反応することができるＣＴＬ集団を生ぜしめることができる１次インビトロ又はインビボＣＴＬ応答を誘発するそれらの能力について評価する。   Peptides containing epitopes from the antigens are synthesized and then, for example, purified by, for example, immunofluorescence staining and flow microfluorometry, peptide-dependent class I assembly assays, and inhibition of CTL recognition by peptide competition Tests for their ability to bind to appropriate MHC molecules in assays using class I molecules and radioiodinated peptides and / or cells expressing empty class I molecules. Peptides that bind to the above class I molecules for their ability to serve as targets for CTLs obtained from infected or immunized individuals, as well as target cells that are effectively infected as potential therapeutic agents or We assess their ability to elicit primary in vitro or in vivo CTL responses that can generate CTL populations that can react with tumor cells.

上記ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ、及びＣ座によりコードされる。ＨＬＡ−ＡとＢ抗原は、ほぼ等しい密度において細胞表面に発現され、一方、ＨＬＡ−Ｃの発現は、有意に低い（おそらく、１０−倍低い）。上記の座のそれぞれが、多数の対立遺伝子をもつ。本願発明のペプチド結合性モチーフは、各対立遺伝子サブタイプに比較的特異的である。   The MHC class I antigen is encoded by the HLA-A, B, and C loci. HLA-A and B antigens are expressed on the cell surface at approximately equal density, while HLA-C expression is significantly lower (probably 10-fold lower). Each of the above loci has multiple alleles. The peptide-binding motifs of the present invention are relatively specific for each allelic subtype.

ペプチド−ベース・ワクチンのためには、本願発明のペプチドは、好ましくは、ヒト集団において広い分布をもつＭＨＣ Ｉ分子により認識されるモチーフを含む。このＭＨＣ対立遺伝子は、異なる人種 (ethnic groups and races)内で異なる頻度で生じるので、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は、その標的集団に依存することができる。表１は、異なる人種間のＨＬＡ−Ａ座産物における各対立遺伝子の頻度を示す。例えば、白色人種集団の大多数は、４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ、特にＨＬＡ−Ａ２．１，Ａ１，Ａ３．２、及びＡ２４．１に結合するペプチドによりカバーされることができる。同様に、アジア人集団の大多数は、第５の対立遺伝ＨＬＡ−Ａ１１．２に結合するペプチドの付加により包含される。   For peptide-based vaccines, the peptides of the invention preferably comprise a motif that is recognized by MHC I molecules with a wide distribution in the human population. Since this MHC allele occurs at different frequencies within different ethnic groups and races, the selection of the target MHC allele can depend on the target population. Table 1 shows the frequency of each allele in the HLA-A locus product between different races. For example, the majority of the Caucasian population can be covered by peptides that bind to four HLA-A allele subtypes, particularly HLA-A2.1, A1, A3.2, and A24.1. Similarly, the majority of the Asian population is encompassed by the addition of peptides that bind to the fifth allele HLA-A11.2.

ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、以下の慣例に従う。ここで、アミノ基は、各アミノ酸残基の左（Ｎ−末端）に表され、そしてカルボキシル基は、右（Ｃ−末端）に表される。本願発明の選ばれた特定の態様を表す式においては、特に示さないが、アミノ−末端基とカルボキシル末端基は、特にことわらない限り、生理学的pHにおいてそれらが呈するであろう形態にある。アミノ酸構造式中、各残基は、一般的に、標準的な３文字又は１文字命名法により表される。アミノ酸残基のＬ−型は、大文字１文字又は３文字記号の第１の大文字で表され、そしてＤ−型をもつそれらアミノ酸のＤ型は、小文字１文字又は小文字３文字記号で表される。グリシンは、不斉炭素原子をもたず、そして単に、“Ｇｌｙ”又はＧという。   The nomenclature used to describe peptide compounds follows the following convention. Here, the amino group is represented on the left (N-terminal) of each amino acid residue, and the carboxyl group is represented on the right (C-terminal). In formulas representing selected specific embodiments of the present invention, the amino-terminal group and carboxyl terminal group are in the form they will exhibit at physiological pH unless otherwise stated. In amino acid structural formulas, each residue is generally represented by standard three letter or single letter nomenclature. The L-form of amino acid residues is represented by the first capital letter or the first capital letter of the three-letter symbol, and the D-form of those amino acids having the D-form is represented by the lowercase letter or the lowercase three-letter symbol. . Glycine has no asymmetric carbon atom and is simply referred to as “Gly” or G.

本願発明のペプチドを同定するために使用される手順は、一般に、Falk et al., Nature 351 : 290 (1991) （これを、本願明細書中に援用する）中に開示された方法に従う。簡単に言えば、これらの方法は、適当な細胞又は細胞系からの、典型的には、免疫沈降又はアフィニティー・クロマトグラフィーによる、ＭＨＣクラスＩ分子の大規模単離を含む。当業者に等しく周知の所望のＭＨＣ分子の単離のための別法の例は、イオン交換クロマトグラフィー、レクチン・クロマトグラフィー、サイズ排除、高性能リガンド・クロマトグラフィー、及び上記技術の全ての組合せを含む。 The procedure used to identify the peptides of the present invention generally follows the method disclosed in Falk et al., Nature 351: 290 (1991), which is incorporated herein. Briefly, these methods involve large-scale isolation of MHC class I molecules from appropriate cells or cell lines, typically by immunoprecipitation or affinity chromatography. Examples of alternative methods for the isolation of desired MHC molecules equally well known to those skilled in the art include ion exchange chromatography, lectin chromatography, size exclusion, high performance ligand chromatography, and all combinations of the above techniques. Including.

典型的な場合には、免疫沈降は、所望の対立遺伝子を単離するために使用される。使用される抗体の特異性に依存して、多くのプロトコールを使用することができる。例えば、対立遺伝子特異的ｍＡｂ試薬が、ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ１、及びＨＬＡ−Ｃ分子のアフィニティー精製のために使用されることができる。ＨＬＡ−Ａ分子の単離のためのいくつかのｍＡｂ試薬が入手可能である。モノクローナルＢＢ７．２は、ＨＬＡ−Ａ２分子を単離するために好適である。標準的な技術を使用して上記ｍＡｂｓにより調製されたアフィニティー・カラムは、対応のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精製するために首尾よく使用される。   Typically, immunoprecipitation is used to isolate the desired allele. Many protocols can be used, depending on the specificity of the antibody used. For example, allele-specific mAb reagents can be used for affinity purification of HLA-A, HLA-B1, and HLA-C molecules. Several mAb reagents are available for isolation of HLA-A molecules. Monoclonal BB7.2 is suitable for isolating HLA-A2 molecules. Affinity columns prepared with the mAbs using standard techniques are successfully used to purify the corresponding HLA-A allele product.

対立遺伝子特異的ｍＡｂｓに加えて、広い反応性をもつ抗−ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ ｍＡｂｓ、例えば、Ｗ６／３２とＢ９．１２．１、及び１の抗−ＨＬＡ−Ｂ，Ｃ ｍＡｂ，Ｂ１．２３．２が、先の出願中に記載したような他のアフィニティー精製プロトコールにおいて使用されることができるであろう。   In addition to allele-specific mAbs, anti-HLA-A, B, C mAbs with broad reactivity, eg, W6 / 32 and B9.12.1, and one anti-HLA-B, C mAb, B1 23.2 could be used in other affinity purification protocols as described in previous applications.

単離されたＭＨＣ分子のペプチド結合性溝に結合したペプチドは、典型的には、酸処理を使用して溶離される。ペプチドは、さまざまな標準的な変性手段、例えば、熱、pH、洗剤、塩、カオトロピズム剤、又はそれらの組合せにより、クラスＩ分子から解離されることもできる。   Peptides bound to the peptide binding groove of an isolated MHC molecule are typically eluted using acid treatment. Peptides can also be dissociated from class I molecules by various standard denaturing means such as heat, pH, detergents, salts, chaotropic agents, or combinations thereof.

ペプチド画分は、さらに、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりＭＨＣ分子から分離され、そして配列決定される。ペプチドは、濾過、限外濾過、電気泳動、サイズ・クロマトグラフィー、特異性抗体による沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、その他を含む、当業者によく知られた、さまざまな他の標準的な手段により分離されることができる。   The peptide fraction is further separated from MHC molecules by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) and sequenced. Peptides are available in a variety of other well known to those skilled in the art, including filtration, ultrafiltration, electrophoresis, size chromatography, precipitation with specific antibodies, ion exchange chromatography, isoelectric focusing, etc. They can be separated by standard means.

単離されたペプチドの配列決定は、標準的な技術、例えば、Ｅｄｍａｎ分解(Hunkapiller, M.W., et al., Methods Enzymol. 91, 399 [1983]) に従って行われることができる。配列決定のために好適な他の方法は、先に記載されたような、個体のペプチドのマス・スペクトロメトリー配列決定を含む（Hunt, et al., Sequencing of the isolated peptide can be performed according to standard techniques, such as Edman degradation (Hunkapiller, MW, et al. , Methods Enzymol. 91 , 399 [1983]). Other methods suitable for sequencing include mass spectrometric sequencing of individual peptides as previously described (Hunt, et al.,

Science 225 : 1261 (1992)、これを本願明細書中に援用する）。異なるクラスＩ分子からのバルク外来ペプチド（例えば、プールされたＨＰＬＣ画分）のアミノ酸配列決定は、典型的には、各クラスＩ対立遺伝子に特徴的な配列モチーフを表す。 Science 225: 1261 (1992), which is incorporated herein by reference). Amino acid sequencing of bulk foreign peptides (eg, pooled HPLC fractions) from different class I molecules typically represents sequence motifs characteristic of each class I allele.

異なるクラスＩ対立遺伝子に特異的なモチーフの定義は、そのアミノ酸配列が知られているところの抗原性タンパク質からの潜在的ペプチド・エピトープの同定を許容する。典型的には、潜在的ペプチド・エピトープの同定は、まず、モチーフの存在について所望の抗原のアミノ酸配列を走査するためのコンピューターを使用して行われる。次に、エピトープ配列が合成される。ＭＨＣクラス分子に結合する能力は、さまざまな異なる方法で計測される。１の手段は、上記の、関連出願中に記載されたようなクラスＩ分子結合アッセイである。上記文献中に記載された別法は、抗原提示の阻害(Sette, et al., J. Immunol. 141 : 3893 (1991))、インビトロ・アセンブリー・アッセイ（Townsend, et al., Cell 62 : 285 (1990)) 、及び突然変異された細胞、例えばＲＭＡ．Ｓを使用したＦＡＣＳベースのアッセイ（Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21 : 2963 (1991))を含む。 The definition of motifs specific for different class I alleles allows the identification of potential peptide epitopes from antigenic proteins whose amino acid sequences are known. Typically, identification of potential peptide epitopes is first performed using a computer to scan the amino acid sequence of the desired antigen for the presence of the motif. Next, an epitope sequence is synthesized. The ability to bind to MHC class molecules is measured in a variety of different ways. One means is a class I molecule binding assay as described in the related application mentioned above. Alternative methods described in the above references include inhibition of antigen presentation (Sette, et al., J. Immunol . 141: 3893 (1991)), in vitro assembly assay (Townsend, et al., Cell 62: 285). (1990)), and mutated cells, such as RMA. FACS based assay using S (Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21: 2963 (1991)).

次に、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイにおいて陽性結果であるペプチドを、インビトロにおいて特異的ＣＴＬ応答を誘導するそのペプチドの能力についてアッセイする。例えば、ペプチドと共にインキュベートされた抗原提示細胞を、応答物細胞集団内でＣＴＬ応答を誘導するその能力についてアッセイすることができる。抗原提示細胞は、正常細胞、例えば、末梢血単核細胞又は樹状細胞であることができる(Inaba, et al., J. Exp. Med. 166 : 182 (1987) ; Boog, Eur. J. Immunol. 18 : 219 [1988]) 。 The peptides that are positive in the MHC class I binding assay are then assayed for their ability to induce a specific CTL response in vitro. For example, antigen presenting cells incubated with a peptide can be assayed for their ability to induce a CTL response within a responder cell population. Antigen presenting cells can be normal cells, such as peripheral blood mononuclear cells or dendritic cells (Inaba, et al., J. Exp. Med. 166: 182 (1987); Boog, Eur. J. Immunol. 18: 219 [1988]).

あるいは、内部でプロセスされたペプチドでクラスＩ分子をロードするそれらの能力において欠陥がある突然変異体哺乳類細胞系、例えばマウス細胞系ＲＭＡ−Ｓ（Kaerre, et al., Nature, 319 : 675 (1986) ; Ljunggren, et al., Eur. J. Immunol. 21 : 2963-2970 (1991)) 、及びヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリッド、Ｔ−２(Cerundolo, et al., Nature 345 : 449-452 (1990))、並びに適当なヒト・クラスＩ遺伝子でトランスフェクトされている突然変異体哺乳類細胞系を、ペプチドがそれらに添加されるとき、インビトロにおける１次ＣＴＬ応答を誘発するそのペプチドの能力についてテストするために、便利には使用する。使用されることができるであろう他の真核細胞系は、さまざまな昆虫細胞系、蚊の幼虫（ＡＴＣＣ細胞系ＣＣＬ １２５，１２６，１６６０，１５９１，６５８５，６５８６）、カイコ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８８５１）、アワヨトウ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）、及びショウジョウバエ（Drosophila) 細胞系、例えば、Schneider 細胞系 (Schneider J. Embryol. Exp. Morphol. 27 : 353-365 [1927] 参照）を含む。 Alternatively, mutant mammalian cell lines that are defective in their ability to load class I molecules with internally processed peptides, such as the mouse cell line RMA-S (Kaerre, et al., Nature , 319: 675 (1986 Ljunggren, et al., Eur. J. Immunol. 21: 2963-2970 (1991)), and human somatic T cell hybrid, T-2 (Cerundolo, et al., Nature 345: 449-452 (1990) )), As well as mutant mammalian cell lines transfected with the appropriate human class I gene, are tested for the ability of the peptide to elicit a primary CTL response in vitro when the peptide is added to them. In order to use it conveniently. Other eukaryotic cell lines that could be used are various insect cell lines, mosquito larvae (ATCC cell lines CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), silkworms (ATCC CRL 8851). , Awayo (ATCC CRL 1711), Ga (ATCC CCL 80), and Drosophila cell lines, such as the Schneider cell line (see Schneider J. Embryol. Exp. Morphol . 27: 353-365 [1927]). .

末梢血リンパ球は、便利には、正常ドナー又は患者の単なる静脈穿刺又は白血球分離に従って単離され、そしてＣＴＬ前駆体の応答物細胞源として使用される。１の態様においては、適当な抗原−提示細胞を、適当な培養条件下４時間、無血清培地中、１０〜１００μＭのペプチドと共にインキュベートする。次に、ペプチド−ロードされた抗原提示細胞を、最適化された培養条件下、７〜１０日間、インビトロにおいて応答者細胞集団と共にインキュベートする。陽性ＣＴＬ活性化を、放射標識された標的細胞、すなわち、特異的ペプチド−パルス化標的、並びに上記ペプチド配列がそれに由来するところの関連ウイルス又は腫瘍抗原の内因的にプロセスされた形態を発現する標的細胞の両者を殺生するＣＴＬｓの存在について上記培養物をアッセイすることにより測定することができる。   Peripheral blood lymphocytes are conveniently isolated following simple venipuncture or leukocyte separation of a normal donor or patient and used as a responder cell source for CTL precursors. In one embodiment, appropriate antigen-presenting cells are incubated with 10-100 μM peptide in serum-free medium for 4 hours under appropriate culture conditions. The peptide-loaded antigen presenting cells are then incubated with the responder cell population in vitro for 7-10 days under optimized culture conditions. Positive CTL activation, radiolabeled target cells, ie specific peptide-pulsed targets, as well as targets that express endogenously processed forms of the relevant virus or tumor antigen from which the peptide sequence is derived It can be measured by assaying the culture for the presence of CTLs that kill both of the cells.

ＣＴＬの特異性及びＭＨＣ制限を、適当な又は不適当なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対してテストすることにより決定する。上記ＭＨＣ結合アッセイにおいて陽性結果となり、そして特異的ＣＴＬ応答を生じるペプチドを、本願明細書中、免疫原性ペプチドという。   CTL specificity and MHC restriction are determined by testing against different peptide target cells expressing appropriate or inappropriate human MHC class I. Peptides that give a positive result in the MHC binding assay and produce a specific CTL response are referred to herein as immunogenic peptides.

この免疫原性ペプチドを、合成により、又は組換えＤＮＡ技術により又は天然源、例えば、ウイルス又は腫瘍の全体から調製することができる。上記ペプチドは、好ましくは、他の天然宿主細胞タンパク質及びその断片を実質的に含有しないであろうが、ある態様においては、上記ペプチドは、生来の断片又は粒子に合成により結合されることができる。   The immunogenic peptide can be prepared synthetically or by recombinant DNA techniques or from natural sources such as viruses or whole tumors. The peptide will preferably be substantially free of other natural host cell proteins and fragments thereof, but in certain embodiments, the peptide can be synthetically bound to native fragments or particles. .

上記ポリペプチド又はペプチドは、それらの中性（無電荷）形態又は塩である形態のいずれかにおいて、さまざまな長さをもつことができ、そして修飾、グリコシル化、側鎖酸化、又はリン酸化されていないか、又はその修飾が本願明細書中に記載するようなポリペプチドの生物学的活性を破壊しないという条件に従って、これらの修飾を含むかのいずれかであることができる。   The polypeptides or peptides can have various lengths, either in their neutral (uncharged) form or in their salt form, and can be modified, glycosylated, side chain oxidized, or phosphorylated. Or include these modifications, provided that the modifications do not destroy the biological activity of the polypeptide as described herein.

望ましくは、上記ペプチドは、大ペプチドの生物学的活性の実質的に全てを未だ維持しながら、できるだけ小さいものであるであろう。可能な場合、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に結合する内因的にプロセスされたウイルス・ペプチド又は腫瘍細胞ペプチドとサイズにおいて均り合う、９又は１０アミノ酸残基の長さに、本願発明のペプチドを最適化することが望ましい。   Desirably, the peptide will be as small as possible while still maintaining substantially all of the biological activity of the large peptide. Where possible, the peptides of the present invention are of a length of 9 or 10 amino acid residues that are balanced in size with endogenously processed viral or tumor cell peptides that bind to MHC class I molecules on the cell surface It is desirable to optimize.

所望のＭＨＣ分子に結合し、かつ、適当なＴ細胞を活性化させる、非修飾ペプチドの生物学的活性の実質的に全てを高め又は少なくとも保持しながら、特定の望ましい特性、例えば改善された薬理学的特性を提供することが必要な場合、所望の活性をもつペプチドを修飾することができる。例えば、上記ペプチドは、そのような変化がそれらの使用においてある利点、例えば改良されたＭＨＣ結合を提供するかもしれない場合、保存的であるか非保存的であるかを問わず、さまざまな変化、例えば置換を受けることができる。保存的置換とは、あるアミノ酸残基を、生物学的及び／又は化学的に類似の他のもので置換すること、例えば、１の疎水性残基と他のものの置換、又は１の極性残基と他のものの置換を意味する。上記置換は、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；及びＰｈｅ，Ｔｙｒの組合せを含む。単一アミノ酸置換の効果は、Ｄ−アミノ酸を使用してプローブされることもできる。このような修飾は、例えば、Merrifield, Science 232 : 341-347 (1986), Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979) ；及び Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 2d Ed. (1984)本願明細書中に援用する）中に記載されているような、よく知られたペプチド合成手順を使用して、行われることができる。 Certain desirable properties, such as improved drugs, while enhancing or at least retaining substantially all of the biological activity of the unmodified peptide that binds to the desired MHC molecule and activates appropriate T cells If it is necessary to provide physical properties, peptides with the desired activity can be modified. For example, the peptides described above are subject to a variety of changes, whether conservative or non-conservative, if such changes may provide certain advantages in their use, such as improved MHC binding. For example, a substitution can be received. A conservative substitution refers to the substitution of one amino acid residue with another that is biologically and / or chemically similar, for example, substitution of one hydrophobic residue for another, or one polar residue. Means substitution of a group with another. The substitutions include Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; and Phe, Tyr. The effect of single amino acid substitution can also be probed using D-amino acids. Such modifications are described, for example, in Merrifield, Science 232: 341-347 (1986), Barany and Merrifield, The Peptides , Gross and Meienhofer, eds. (NY, Academic Press), pp. 1-284 (1979); and Using well-known peptide synthesis procedures such as those described in Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 2d Ed. (1984), incorporated herein) And can be done.

上記ペプチドは、その化合物のアミノ酸配列を延長し又は短縮することにより、例えば、アミノ酸の付加又は欠失により修飾されることもできる。本願発明のペプチド又はアナログは、特定の残基の順序又は組成を変えることにより修飾されることもできる。生物学的活性に不可欠な特定のアミノ酸残基、例えば、決定的な接触部位にあるもの又は保存された残基が、一般に、生物学的活性に対する悪影響を及ぼさずに、変更されることはできないということは容易に理解される。決定的ではないアミノ酸は、タンパク質内に天然にあるもの、例えば、Ｌ−α−アミノ酸、又はそれらのＤ−異性体に限られる必要はないが、非天然アミノ酸、例えば、β−γ−δ−アミノ酸並びにＬ−α−アミノ酸の多くの誘導体を含むこともできる。   The peptide can also be modified by extending or shortening the amino acid sequence of the compound, for example by adding or deleting amino acids. The peptides or analogs of the present invention can also be modified by changing the order or composition of specific residues. Certain amino acid residues essential for biological activity, such as those at critical contact sites or conserved residues, generally cannot be altered without adversely affecting biological activity That is easily understood. Non-critical amino acids need not be limited to those naturally occurring in the protein, such as L-α-amino acids, or their D-isomers, but non-natural amino acids such as β-γ-δ- Many derivatives of amino acids as well as L-α-amino acids can also be included.

典型的には、単一アミノ酸置換をもつ一連のペプチドが、結合に対する、静電荷、疎水性の効果を決定するために使用される。例えば、一連の正電荷（例えば、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）又は負電荷（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換が、さまざまなＭＨＣ及びＴ細胞レセプターに対する異なるパターンの感受性を現わすペプチドの長さに沿って、行われる。さらに、小さな、比較例中性の成分、例えば、Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏ、又は類似の残基を使用した多置換が使用されることができる。これらの置換は、ホモ−オリゴマー又はヘテロ−オリゴマーであることができる。置換され又は付加される残基の数とタイプは、本質的な接触点と、求められる特定の機能特性（例えば、疎水性対親水性）の間に必要な空間配置に依存する。ＭＨＣ分子又はＴ細胞レセプターについての高い結合アフィニティーも、その親ペプチドのアフィニティーに比較して、上記のような置換により達成されることができる。いずれの場合も、このような置換は、例えば、結合を破壊するかもしれない、立体的及び電気的妨害を回避するように選ばれる、アミノ酸残基又は他の分子断片を使用すべきである。   Typically, a series of peptides with single amino acid substitutions are used to determine the effect of electrostatic charge, hydrophobicity on binding. For example, a series of positively charged (eg, Lys or Arg) or negatively charged (eg, Glu) amino acid substitutions are made along the length of the peptide that exhibits different patterns of sensitivity to various MHC and T cell receptors. . In addition, multiple substitutions using small, comparative neutral components such as Ala, Gly, Pro, or similar residues can be used. These substitutions can be homo-oligomers or hetero-oligomers. The number and type of residues that are substituted or added depends on the spatial arrangement required between the essential contact point and the particular functional property sought (eg, hydrophobic versus hydrophilic). High binding affinity for MHC molecules or T cell receptors can also be achieved by substitution as described above compared to the affinity of its parent peptide. In any case, such substitutions should use, for example, amino acid residues or other molecular fragments that are chosen to avoid steric and electrical interference that might break the bond.

アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基を有する。置換、欠失、挿入、又はそのいずれかの組合せは、最終ペプチドを達成するように組み合せられることができる。置換変異体は、ペプチドの少なくとも１の残基が除去されており、そして異なる残基がその場所に挿入されているようなものである。このような置換は、一般に、そのペプチドの特性を細かく調節することが望ましいとき、以下の表２に従って行われる。

Amino acid substitutions typically have a single residue. Substitutions, deletions, insertions, or any combination thereof can be combined to achieve the final peptide. Substitutional variants are those in which at least one residue of the peptide has been removed and a different residue inserted in its place. Such substitutions are generally made according to Table 2 below when it is desirable to fine tune the properties of the peptide.

機能（例えば、ＭＨＣ分子又はＴ細胞レセプターについてのアフィニティー）における実質的な変更は、表２中のものより保存性ではない置換を選択することにより、すなわち、（ａ）例えば、シート又はヘリカル立体配置のような、その置換の領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位におけるその分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するそれらの効果においてより有意に異なる残基を選択することにより、行われる。一般に、ペプチド特性において最大の変化を作り出すと予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、又はアラニルにより置換されたもの；（ｂ）正電荷を有する側鎖をもつ残基、例えば、リジル、アルギニル又はヒスチジルが、負電荷を有する残基；例えば、グルタミル又はアスパルチルにより置換されたもの；又は（ｃ）嵩高い側鎖をもつ残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖をもたない残基、例えば、グリシンにより置換されたものであるであろう。   Substantial changes in function (eg, affinity for MHC molecules or T cell receptors) can be achieved by selecting substitutions that are less conservative than those in Table 2, ie, (a) eg, sheet or helical configuration. More significantly in their effect on maintaining the structure of the peptide backbone within the region of the substitution, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) the bulk of the side chain, such as This is done by selecting different residues. In general, substitutions that are expected to produce the greatest change in peptide properties are: (a) a hydrophilic residue such as seryl is replaced by a hydrophobic residue such as leucyl, isoleucyl, phenylalanyl, valyl, or alanyl. (B) a residue having a positively charged side chain, eg, lysyl, arginyl or histidyl, substituted with a negative charge; eg, glutamyl or aspartyl; or (c) bulky A residue with a side chain, such as phenylalanine, would be replaced by a residue without a side chain, such as glycine.

上記ペプチドは、免疫原性ペプチド内に２以上の残基のアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ) を含むこともできる。本願明細書中に定義するとき、アイソスターとは、第２の配列で置換されることができる２以上の残基の配列である。なぜなら、第１の配列の立体配置が第２の配列に特異的な結合部位にフィットするからである。上記用語“特異的に”とは、当業者によく知られたペプチド骨格修飾を含む。このような修飾は、アミド窒素、α−炭素、アミド・カルボニル、アミド結合の完全置換、伸長、欠失又は骨格架橋の修飾を含む。一般に、 Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, peptides and Proteins, Vol. VII (Weinstein ed., 1983)を参照のこと。 The peptide may also contain more than one residue isosteres within the immunogenic peptide. As defined herein, an isostere is a sequence of two or more residues that can be substituted with a second sequence. This is because the configuration of the first sequence fits the binding site specific for the second sequence. The term “specifically” includes peptide backbone modifications well known to those skilled in the art. Such modifications include amide nitrogen, α-carbon, amide carbonyl, amide bond full substitution, extension, deletion or backbone bridge modifications. See generally Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, peptides and Proteins , Vol. VII (Weinstein ed., 1983).

さまざまなアミノ酸擬態又は非天然アミノ酸によるペプチドの修飾は、インビボにおけるそのペプチドの安定性を高めるに際し特に有用である。安定性は多くの方法でアッセイされることができる。例えば、ペプチダーゼ及びさまざまな生物学的媒質、例えば、ヒト血漿及び血清が安定性をテストするために使用されてきた。例えば、Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin, 11 : 291-302 (1986) を参照のこと。本願発明のペプチドの半減期は、便利には２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して測定される。このプロトコールは一般に以下のようである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、非加熱失活）を、使用前に遠心分離により脱脂する。次に、この血清を、ＲＰＭＩ組織培養基で２５％に希釈し、そしてペプチド安定性をテストするために使用する。所定の時間間隔において、少量の反応溶液を除去し、そして６％水性トリクロロ酢酸又はエタノールのいずれかに添加する。濁った反応サンプルを１５分間、冷却し（４℃）、そして次にその沈殿した血清タンパク質をペレット化するために回転させる。次に、そのペプチドの存在を、安定性−特異的クロマトグラフィー条件を使用して逆相ＨＰＬＣにより測定する。 Modification of a peptide with various amino acid mimetics or unnatural amino acids is particularly useful in increasing the stability of the peptide in vivo. Stability can be assayed in a number of ways. For example, peptidases and various biological media such as human plasma and serum have been used to test stability. See, for example, Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin, 11: 291-302 (1986). The half-life of the peptides of the present invention is conveniently measured using a 25% human serum (v / v) assay. This protocol is generally as follows. Pooled human serum (type AB, unheated inactivated) is defatted by centrifugation prior to use. The serum is then diluted to 25% with RPMI tissue culture medium and used to test peptide stability. At predetermined time intervals, a small amount of reaction solution is removed and added to either 6% aqueous trichloroacetic acid or ethanol. The turbid reaction sample is cooled for 15 minutes (4 ° C.) and then spun to pellet the precipitated serum protein. The presence of the peptide is then measured by reverse phase HPLC using stability-specific chromatography conditions.

ＣＴＬ刺激活性をもつ本願発明のペプチド又はそのアナログを、改良された血清半減期以外の所望の特性を提供するように修飾することができる。例えば、ＣＴＬ活性を誘発する上記ペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を誘発することができる少なくとも１のエピトープを含む配列への連結により高めることができる。特に好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ) はスペーサー分子により連結される。このスペーサーは、典型的には、生理学的条件下で、実質的に変えられていない、比較的小さな、中性の分子、例えば、アミノ酸又はアミノ酸擬態から成る。これらのスペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ，Ｇｌｙ、又は非極性アミノ酸又は中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選ばれる。場合により存在するスペーサーは、同一残基から成る必要はなく、そしてこれ故、ヘテロ−又はホモ−オリゴマーであることができるということが理解されよう。存在するとき、スペーサーは、通常、少なくとも１又は２の残基、より普通には、３〜６の残基であるであろう。あるいは、上記ＣＴＬペプチドは、スペーサーを伴わずにＴヘルパー・ペプチドに連結されることができる。   The peptides of the present invention or analogs thereof having CTL stimulating activity can be modified to provide desired properties other than improved serum half-life. For example, the ability of the peptide to elicit CTL activity can be enhanced by linking to a sequence comprising at least one epitope capable of eliciting a T helper cell response. Particularly preferred immunogenic peptides / T helpers conjugates are linked by a spacer molecule. This spacer typically consists of a relatively small, neutral molecule, such as an amino acid or amino acid mimic, that is not substantially altered under physiological conditions. These spacers are typically selected from, for example, Ala, Gly, or other neutral spacers of nonpolar amino acids or neutral polar amino acids. It will be appreciated that the optionally present spacer need not consist of identical residues and therefore can be a hetero- or homo-oligomer. When present, the spacer will usually be at least 1 or 2 residues, more usually 3 to 6 residues. Alternatively, the CTL peptide can be linked to a T helper peptide without a spacer.

上記免疫原性ペプチドは、上記ＣＴＬペプチドのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかにおいて直接的にか又はスペーサーを介して、Ｔヘルパー・ペプチドに連結されることができる。上記免疫原性ペプチド又はＴヘルパー・ペプチドのいずれかのアミノ末端はアシル化されることができる。例示的なＴヘルパー・ペプチドは破傷風 (ｔｅｔａｎｕｓ) 毒素８３０−８４３、インフルエンザ３０７−３１９、マラリア・サーカンスポロゾイド（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）３８２−３９８及び３７８−３８９を含む。   The immunogenic peptide can be linked to the T helper peptide either directly at the amino or carboxy terminus of the CTL peptide or via a spacer. The amino terminus of either the immunogenic peptide or the T helper peptide can be acylated. Exemplary T helper peptides include tetanus toxin 830-843, influenza 307-319, malaria circusporozoites 382-398 and 378-389.

ある態様においては、ＣＴＬをプライムする少なくとも１の成分を、本願発明の医薬組成物中に含むことが望ましい。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボにおいてＣＴＬをプライムすることができる剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基のアルファ及びエプシロン・アミノ基に結合されることができ、そして次に、例えば、１以上のリンキング残基、例えば、Ｇｌｙ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、その他を介して、免疫原性ペプチドに連結されることができる。次に、この脂質化ペプチドは、ミセル形態で直接に注射され、リポソーム内に取り込まれ、又はアジュバント、例えば、不完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント中に乳化されることができる。好ましい態様においては、特に有効な免疫原は、リンケージ、例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒを介して、上記免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合されたＬｙｓのアルファ及びエプシロン・アミノ基に付着されたパルミチン酸を含む。   In certain embodiments, it is desirable to include in the pharmaceutical composition of the present invention at least one component that primes CTL. Lipids have been identified as agents capable of priming CTL in vivo against viral antigens. For example, palmitic acid residues can be linked to the alpha and epsilon amino groups of Lys residues, and then, for example, one or more linking residues such as Gly, Gly-Gly, Ser, Ser. Can be linked to immunogenic peptides via Ser, etc. The lipidated peptide can then be injected directly in micellar form, incorporated into liposomes, or emulsified in an adjuvant, such as incomplete Freund's adjuvant. In a preferred embodiment, a particularly effective immunogen comprises a palmitic acid attached to the alpha and epsilon amino groups of Lys linked to the amino terminus of the immunogenic peptide via a linkage, eg Ser-Ser. Including.

ＣＴＬ応答の脂質刺激の別例として、Ｅ．コリ（E. coli)リポタンパク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ ＣＳＳ）を、適当なペプチドに共有結合させてウイルス特異的ＣＴＬを刺激するのに用いることができる。Deres 他、Nature 342 : 561-564 (1989) を参照のこと（これは参考として本明細書中に組み入れられる）。本発明のペプチドは、例えばＰ３ ＣＳＳに結合させてリポペプチドとして個体に投与することにより、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に刺激することができる。更に、適当なエピトープを提示するペプチドに結合させたＰ３ ＣＳＳにより中和抗体の誘導も刺激することができるので、２つの組成物を組み合わせることによって、感染に対する体液性応答と細胞性応答の両方を一層効率的に惹起せしめることができる。 As another example of lipid stimulation of the CTL response, E. coli lipoproteins, such as tripalmitoyl-S-glyceryl cysteinyl seryl-serine (P3 CSS), can be used to stimulate virus-specific CTL by covalently binding to an appropriate peptide. See Deres et al., Nature 342: 561-564 (1989), which is incorporated herein by reference. The peptide of the present invention can specifically stimulate the CTL response to the target antigen by, for example, binding to P3 CSS and administering it to an individual as a lipopeptide. Furthermore, the induction of neutralizing antibodies can also be stimulated by P3 CSS conjugated to a peptide presenting the appropriate epitope, so that the combination of the two compositions results in both humoral and cellular responses to infection. It can be caused more efficiently.

その上、ペプチドを互いに連結する簡便性、担体支持体もしくは大型ペプチドへの結合、ペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的性質の変更などに備えて、ペプチドの末端に追加のアミノ酸を付加することができる。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸等のようなアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入することができる。Ｃ末端での修飾は、場合によりペプチドの結合特性を変更することがある。その上、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ２ アシル化、例えばアルカノイル（Ｃ１ −Ｃ２０）もしくはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミン等によって修飾することにより、生来の配列と異なることができる。場合により、それらの修飾が支持体または別の分子への結合のための部位を提供することがある。   In addition, adding additional amino acids to the end of the peptide in preparation for the convenience of linking the peptides together, binding to a carrier support or large peptide, or changing the physical or chemical properties of the peptide or oligopeptide Can do. Amino acids such as tyrosine, cysteine, lysine, glutamic acid or aspartic acid can be introduced at the C-terminus or N-terminus of the peptide or oligopeptide. Modifications at the C-terminus can sometimes alter the binding properties of the peptide. In addition, peptide or oligopeptide sequences can be modified with native sequences by modification by terminal NH2 acylation, such as alkanoyl (C1-C20) or thioglycolyl acetylation, terminal carboxylamidation, such as ammonia, methylamine, and the like. Can be different. In some cases, these modifications may provide a site for attachment to a support or another molecule.

本発明のペプチドは様々な方法で調製することができる。それらが比較的短いサイズであるために、常用技術に従って溶液中でまたは固体支持体上でペプチドを合成することが可能である。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って利用できる。例えば、 Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis 、第２版、Pierce Chemical Co. (1984)前掲を参照のこと。 The peptides of the present invention can be prepared in various ways. Because of their relatively short size, it is possible to synthesize peptides in solution or on a solid support according to conventional techniques. Various automatic synthesizers are commercially available and can be used according to known protocols. See, for example, Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd Edition, Pierce Chemical Co. (1984), supra.

あるいは、組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。その場合、着目の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションさせ、そしてそれらの細胞を発現に適した条件下で培養する。このような手法は当該技術分野で一般に周知であり、Sambrook他、Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982) に総説されている（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。よって、本発明は、適当なＴ細胞エピトープを提示させるために１または複数の本発明のペプチド配列を含んで成る融合タンパク質を用いることができる。 Alternatively, recombinant DNA technology may be used. In that case, a nucleotide sequence encoding the immunogenic peptide of interest is inserted into an expression vector, an appropriate host cell is transformed or transfected with the expression vector, and the cells are subjected to conditions suitable for expression. Incubate at Such techniques are generally well known in the art and are reviewed in Sambrook et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982). Incorporated in the book). Thus, the present invention can use a fusion protein comprising one or more of the peptide sequences of the present invention to present a suitable T cell epitope.

本発明において期待される長さのペプチドのコード配列は化学技術により、例えばMatteucci 他、J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185 (1981）のホスホトリエステル法により合成することができるので、生来のペプチド配列をコードする１または複数の塩基を適当な塩基によって置き換えることにより、簡単に修飾を行うことができる。次いでコード配列に適当なリンカーを提供し、当該技術分野で商業的に入手可能である発現ベクター中に連結し、そして該ベクターを用いて適当な宿主を形質転換せしめることにより、所望の融合タンパク質を生産させることができる。そのようなベクターと適当な宿主系は現在多数入手できる。融合タンパク質の発現には、作用可能に連結された開始および終止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域並びに通常は複製系をコード配列に提供して、所望の細胞宿主中での発現に向けて発現ベクターが用意されるだろう。例えば、所望のコード配列の挿入に便利な制限部位を含むプラスミドの中に、細菌宿主と適合性のプロモーター配列が用意されるだろう。得られた発現ベクターを用いて適当な細菌宿主が形質転換される。もちろん、適当なベクターと調節配列を使うことによって酵母や哺乳動物細胞宿主を使用することもできる。 The coding sequence of the peptide of the length expected in the present invention can be synthesized by chemical techniques, for example, by the phosphotriester method of Matteucci et al . , J. Am. Chem. Soc . 103: 3185 (1981). The modification can be easily performed by replacing one or a plurality of bases encoding the peptide sequence with an appropriate base. The desired fusion protein is then obtained by providing a suitable linker for the coding sequence, ligating into an expression vector that is commercially available in the art, and using the vector to transform a suitable host. Can be produced. Many such vectors and suitable host systems are currently available. For expression of the fusion protein, an operably linked start and stop codon, promoter and terminator regions and usually a replication system are provided in the coding sequence to provide an expression vector for expression in the desired cellular host. Will be done. For example, a promoter sequence compatible with the bacterial host will be provided in a plasmid containing restriction sites convenient for insertion of the desired coding sequence. A suitable bacterial host is transformed with the resulting expression vector. Of course, yeast and mammalian cell hosts can be used by using appropriate vectors and regulatory sequences.

本発明のペプチド並びにそれの医薬組成物およびワクチン組成物は、ウイルス感染や癌を治療および／または予防するため、哺乳動物、特にヒトへの投与に有用である。本発明の免疫原性ペプチドを使って治療できる疾病の例としては、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エイズ（ＡＩＤＳ）、腎臓癌、子宮頚癌、リンパ腫、ＣＭＶ、尖圭コンジローム (condyloma acuminatum) が挙げられる。   The peptides of the present invention and pharmaceutical compositions and vaccine compositions thereof are useful for administration to mammals, particularly humans, in order to treat and / or prevent viral infection and cancer. Examples of diseases that can be treated using the immunogenic peptides of the present invention include prostate cancer, hepatitis B, hepatitis C, AIDS, kidney cancer, cervical cancer, lymphoma, CMV, condyloma acuminatum).

医薬組成物の場合、本発明の免疫原性ペプチドは既に着目のウイルスに感染しているかまたは癌にかかっている個体に投与される。感染の潜伏期または急性期の個体は、適当ならば、個別にまたは別の治療と組み合わせて免疫原性ペプチドで治療することができる。治療用途では、組成物はウイルスまたは腫瘍抗原に対して有効なＣＴＬ応答を惹起せしめ、そして症状および／または合併症を治癒させるかまたは少なくとも緩和するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量は「治療有効量」として定義される。この用途に有効な量は、例えばペプチド組成、投与の方法、治療すべき病気の段階および重症度、患者の体重および総合的な健康状態、並びに担当医の判断に依存するだろうが、通常は７０kgの患者に対して約１．０μｇ〜約５０００μｇのペプチドの初回量（すなわち治療または予防投与）に続き、患者の血液中の特異的ＣＴＬ活性を測定することにより、患者の応答や状況に応じて数週間から数ヶ月に及ぶ追加免疫処置に従って約１．０μｇ〜約１０００μｇのペプチドの追加抗原投与量が用いられる。本発明のペプチドおよび組成物は一般に深刻な病気状態、すなわち生命を脅かすかまたは潜在的に生命を脅かす状態に使用できることを念頭におかなければならない。そのような場合には、該ペプチドが相対的に非毒性であり且つ外来物質が最少である点から見て、それらのペプチド組成物の実質的過剰量を投与することが可能であり且つまた望ましいと治療医は感じるかもしれない。   In the case of a pharmaceutical composition, the immunogenic peptide of the invention is administered to an individual who is already infected with the virus of interest or has cancer. Individuals in the latent or acute phase of infection can be treated with immunogenic peptides individually or in combination with another treatment, if appropriate. For therapeutic use, the composition is administered to the patient in an amount sufficient to elicit an effective CTL response against the virus or tumor antigen and to cure or at least alleviate symptoms and / or complications. An amount adequate to accomplish this is defined as a “therapeutically effective amount”. Effective amounts for this use will depend on, for example, the peptide composition, method of administration, stage and severity of the disease to be treated, the patient's weight and overall health, and the judgment of the attending physician, but usually Depending on the patient's response and situation by measuring specific CTL activity in the patient's blood following an initial dose (ie therapeutic or prophylactic administration) of about 1.0 μg to about 5000 μg of peptide for a 70 kg patient A booster dose of about 1.0 μg to about 1000 μg of peptide is used according to boosters ranging from weeks to months. It should be borne in mind that the peptides and compositions of the present invention can generally be used in serious disease states, ie life-threatening or potentially life-threatening conditions. In such cases, it is possible and desirable to administer a substantial excess of the peptide composition in view of the relative non-toxicity of the peptides and minimal foreign substances. The therapist may feel.

治療用途では、ウイルス感染の最初の徴候時または腫瘍の検出もしくは外科的切除時または急性感染の場合には診断直後に、投与を開始すべきである。この後で少なくとも症状が実質的に治まるまでそして更にその後一定期間に渡り、追加免疫処置が行われる。慢性感染の場合、負荷投与量に続いて追加抗原投与量が必要となり得る。   For therapeutic use, administration should begin at the first sign of viral infection or at tumor detection or surgical resection or in the case of acute infection, immediately after diagnosis. This is followed by booster treatment at least until the symptoms subside substantially and then over a period of time. In the case of chronic infection, a booster dose may be required following the loading dose.

本発明の組成物による感染個体の処置は、急性感染個体において感染の消退を早めることができる。慢性感染を発生しやすい（または慢性感染にかかりやすい）個体の場合、急性感染から慢性感染への進行を防ぐ方法において本発明の組成物が特に有用である。例えば本明細書中に記載するように感受性個体が感染前にまたは途中で同定される場合、本発明の組成物をそのような個体に特異的に差し向ける（ターゲッティングする）ことができ、より大きい母集団に投与する必要性を最少にすることができる。   Treatment of infected individuals with the compositions of the present invention can accelerate resolution of infection in acutely infected individuals. For individuals who are likely to develop a chronic infection (or who are susceptible to a chronic infection), the compositions of the present invention are particularly useful in a method of preventing progression from an acute infection to a chronic infection. For example, if susceptible individuals are identified before or during infection, as described herein, the compositions of the invention can be specifically directed to such individuals and are larger. The need to administer to the population can be minimized.

ペプチド組成物は、慢性感染の治療のためにおよび免疫系を刺激してウイルス保持者においてウイルス感染細胞を除去するために用いることができる。細胞傷害性Ｔ細胞応答を効率的に刺激するのに十分な製剤中の免疫強化ペプチド量および投与方法を提供することが重要である。よって、慢性感染の治療の場合、典型的な投与量は１回あたり体重７０kgの患者に対して約１．０μｇ〜約５０００μｇ、好ましくは約５〜１０００μｇの範囲内である。   The peptide composition can be used for the treatment of chronic infections and to stimulate the immune system to remove virus-infected cells in virus carriers. It is important to provide an amount of immunopotentiating peptide in the formulation and a method of administration sufficient to efficiently stimulate a cytotoxic T cell response. Thus, for the treatment of chronic infection, typical dosages are in the range of about 1.0 μg to about 5000 μg, preferably about 5 to 1000 μg, for a patient weighing 70 kg per dose.

免疫量に続いて、決められた間隔、例えば１〜４週間おきでの追加抗原投与量が、おそらく個体を効率的に免疫処置するためには更に長期間に渡り、必要となり得る。慢性感染の場合、少なくとも臨床症状または実験検査の上でウイルス感染が排除されたことまたは実質的に消散したことが示されるまで、そして更にその後も一定期間に渡り、投与を続けるべきである。   Subsequent to immunization, booster doses at defined intervals, such as every 1 to 4 weeks, may be needed over an even longer period of time to possibly immunize the individual efficiently. In the case of a chronic infection, administration should continue until at least clinical symptoms or laboratory tests indicate that the viral infection has been eliminated or substantially resolved, and for a period thereafter.

治療処置用の医薬組成物は、非経口、局所、経口または局部投与用に製造される。好ましくは、医薬組成物は非経口、例えば静脈内、皮下、皮内または筋内に投与される。よって、本発明は、適当な担体、好ましくは水性担体中に溶解または懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含んで成る非経口投与用組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、０．８％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。それらの組成物は、常用の周知滅菌技術により滅菌することができ、または滅菌ろ過してもよい。得られた水性溶液はそのままの状態での使用のために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥製剤は投与前に無菌溶液と混合することができる。組成物は、生理的条件に近づけるのに必要な医薬上許容される補助物質、例えばpH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、オレイン酸トリエタノールアミン等を含んでもよい。   The pharmaceutical composition for therapeutic treatment is manufactured for parenteral, topical, oral or topical administration. Preferably, the pharmaceutical composition is administered parenterally, eg intravenously, subcutaneously, intradermally or intramuscularly. The present invention thus provides a composition for parenteral administration comprising a solution of an immunogenic peptide dissolved or suspended in a suitable carrier, preferably an aqueous carrier. Various aqueous carriers such as water, buffered water, 0.8% saline, 0.3% glycine, hyaluronic acid and the like can be used. These compositions can be sterilized by conventional, well-known sterilization techniques, or may be sterile filtered. The resulting aqueous solution can be packaged for use as is, or lyophilized, and the lyophilized formulation can be mixed with a sterile solution prior to administration. The composition comprises pharmaceutically acceptable auxiliary substances necessary to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, toxicity adjusting agents, wetting agents, etc., such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, Calcium chloride, sorbitan monolaurate, triethanolamine, oleic acid triethanolamine, and the like may also be included.

医薬組成物中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は広範囲に渡って異なり、すなわち、約０．１重量％未満、通常少なくともまたは約２重量％から、２０〜５０重量％ほどにまで及び、そしてそれは選択した特定の投与方法に従って、例えば主に液量、粘度などにより選択決定されるだろう。   The concentration of the CTL stimulating peptide of the present invention in the pharmaceutical composition varies over a wide range, ie, less than about 0.1% by weight, usually at least or about 2% to about 20-50% by weight, and It will be selected and determined according to the particular method of administration chosen, for example primarily by liquid volume, viscosity, etc.

本発明のペプチドはリポソームを介して投与することができる。リポソームは、リンパ系組織のような特定組織に該ペプチドを差し向けるか、または感染細胞に特異的に差し向ける働きをするだけでなく、更にペプチド組成物の半減期も増加させる働きをする。リポソームは、乳濁液、フォーム、ミセル、不溶性単分子層、液晶、リン脂質分散体、多層膜などを包含する。送達させようとするペプチドは、単独でまたはそれに結合する分子と共に、例えばリンパ系細胞中に広く存在するレセプター、例えばＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体と共に、リポソームの一部としてそれらの製剤中に混和される。本発明で用いられるリポソームは、通常は中性リン脂質および負電荷を有するリン脂質とステロール、例えばコレステロールとを含んで成る、標準的な小胞形成性脂質から構成される。脂質の選択は、例えばリポソームの大きさ、酸不安定性および血流中でのリポソームの安定性を考慮することにより行われる。リポソームの調製には様々な方法、例えばSzoka 他、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 : 467 (1980) 、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号明細書（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載のような方法が利用可能である。 The peptides of the present invention can be administered via liposomes. Liposomes serve not only to direct the peptide to specific tissues, such as lymphoid tissues, or specifically to infected cells, but also to increase the half-life of the peptide composition. Liposomes include emulsions, foams, micelles, insoluble monolayers, liquid crystals, phospholipid dispersions, multilayers, and the like. The peptide to be delivered is incorporated into these formulations as part of a liposome, either alone or with a molecule that binds to it, eg, with a receptor that is prevalent in lymphoid cells, such as a monoclonal antibody that binds to the CD45 antigen. The Liposomes used in the present invention are usually composed of standard vesicle-forming lipids comprising neutral and negatively charged phospholipids and sterols such as cholesterol. The choice of lipid is made, for example, by taking into account liposome size, acid instability and liposome stability in the bloodstream. There are various methods for preparing liposomes, such as Szoka et al . , Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), US Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4 , 837,028 and 5,019,369, which are incorporated herein by reference, can be used.

免疫細胞をターゲッティングするために、リポソーム中に混和させるべきリガンドとしては、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片が挙げられる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、特に投与形式、送達させようとするペプチドおよび治療すべき疾病の段階に従って異なる投与量で、静脈内、局所、局部等に投与される。   In order to target immune cells, the ligand to be mixed in the liposome includes, for example, an antibody specific to a cell surface determinant of a desired immune system cell or a fragment thereof. Liposomal suspensions containing peptides are administered intravenously, topically, locally, etc., at different dosages, especially according to the mode of administration, the peptide to be delivered and the stage of the disease to be treated.

固体組成物には、例えば薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム等をはじめとする常用の非毒性固形担体を使用することができる。経口投与用には、常用される賦形剤、例えば前に列挙した担体のいずれかと、通常は１０〜９５％の活性成分、すなわち１または複数の本発明のペプチド、好ましくは２５％〜７５％の濃度の本発明のペプチドを含めることにより、医薬上許容される非毒性組成物が調製される。   For the solid composition, conventional non-toxic solid carriers such as medicinal mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate and the like can be used. For oral administration, commonly used excipients, such as any of the carriers listed above, and usually 10-95% active ingredient, ie one or more peptides of the invention, preferably 25% -75% A pharmaceutically acceptable non-toxic composition is prepared by including a concentration of the peptide of the invention.

エーロゾル投与には、好ましくは界面活性剤と噴射剤と一緒に、微粉末の形で本発明の免疫原性ペプチドが提供される。典型的なペプチドの割合は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。もちろん、界面活性剤は非毒性でなければならず、噴射剤中に可溶であるのが好ましい。そのような剤の典型例は、炭素原子数６〜２２の脂肪酸（例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸およびオレイン酸）と脂肪族多価アルコールまたはそれの環状無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば混合グリセリドまたは天然グリセリドを使用してもよい。界面活性剤は組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を占めるだろう。組成物の平衡は大抵は噴射剤で行う。所望により担体を含めてもよく、経鼻投与にはレシチンを含めてもよい。   For aerosol administration, the immunogenic peptides of the present invention are provided in the form of a fine powder, preferably together with a surfactant and a propellant. Typical peptide proportions are 0.01% -20% by weight, preferably 1-10% by weight. Of course, the surfactant must be non-toxic and is preferably soluble in the propellant. Typical examples of such agents are fatty acids having 6 to 22 carbon atoms (eg caproic acid, octanoic acid, lauric acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, olesteric acid and oleic acid) and aliphatic polyhydric acids. An ester or partial ester with a monohydric alcohol or a cyclic anhydride thereof. Mixed esters such as mixed or natural glycerides may be used. The surfactant will comprise 0.1% -20% by weight of the composition, preferably 0.25-5%. Equilibration of the composition is usually done with a propellant. A carrier may be included if desired, and lecithin may be included for nasal administration.

別の観点において、本発明は活性成分として本明細書に記載の免疫学的に有効な量の免疫原性ペプチドを含むワクチンに関連する。かかるペプチドはヒト等の宿主に、それ自体の担体に連結されて、又は活性ペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして導入されうる。かかるポリマーは増強された免疫学的反応の利点、及び種々のペプチドをこのポリマーの構築のために使用した場合、ウイルス又は腫瘍細胞の種々の抗原決定基と反応する抗体及び／又はＣＴＬを誘導する追加の能力という利点を有する。有用な担体は当業界において周知であり、そして例えばチログロブリン、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、破傷風毒素、ポリアミノ酸、例えばポリ（リジン：グルタミン酸）、インフレンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス組換ワクチン等が挙げられる。これらのワクチンは更に生理学的に寛容（許容）される希釈剤、例えば水、リン酸緩衝食塩水、又は食塩水を含んでよく、そして更に典型的にはアジュバントを含む。アジュバント、例えば不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はみょうばんは当業界において周知の材料である。また、前述の通り、ＣＴＬ応答は本発明のペプチドを脂質、例えばＰ３ ＣＳＳに接合させることによりプライミングされることができる。本明細書に記載のペプチド組成物による、注射、エアゾール、経口、経皮又はその他のルートを介する免疫により、宿主の免疫系はこのワクチンに対し所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬを産生することにより応答し、そしてこの宿主は少なくともその後の感染に対して部分的に免疫されるか、又は慢性感染症の発症に対して耐性となる。   In another aspect, the present invention relates to a vaccine comprising an immunologically effective amount of an immunogenic peptide described herein as an active ingredient. Such peptides can be introduced into a host, such as a human, linked to its own carrier, or as a homopolymer or heteropolymer of active peptide units. Such polymers induce the benefits of enhanced immunological responses, and antibodies and / or CTLs that react with various antigenic determinants of viruses or tumor cells when different peptides are used for the construction of this polymer. Has the advantage of additional capacity. Useful carriers are well known in the art and include, for example, thyroglobulin, albumin such as human serum albumin, tetanus toxin, polyamino acids such as poly (lysine: glutamate), inflenza, hepatitis B virus core protein, hepatitis B virus. Examples include recombinant vaccines. These vaccines may further include a physiologically tolerated (acceptable) diluent, such as water, phosphate buffered saline, or saline, and more typically include an adjuvant. Adjuvants such as incomplete Freund's adjuvant, aluminum phosphate, aluminum hydroxide or alum are materials well known in the art. Also, as described above, CTL responses can be primed by conjugating the peptides of the present invention to lipids such as P3 CSS. Immunization via injection, aerosol, oral, transdermal or other route with the peptide compositions described herein causes the host immune system to produce large amounts of CTL specific for the desired antigen for this vaccine. And the host is at least partially immunized against subsequent infections or is resistant to the development of chronic infections.

本発明のペプチドを含むワクチン組成物はウイルス感染症又は癌に対して感受性である又はそうでなければそれらに罹るおそれのある患者に投与され、抗原に対する免疫応答を誘導せしめ、その結果患者自身の免疫応答能力を強める。かかる量は「免疫学的に有効な用量」と定義される。使用の際、正確な量はここでも患者の健康状態及び体重、投与の方式、製剤の種類、等に依存するが、一般的な範囲は体重７０kgの患者当り約１．０μｇ〜約５，０００μｇ、より一般的には体重７０kgの患者当り約１０μｇ〜約５００μｇ mgである。   Vaccine compositions comprising the peptides of the present invention are administered to patients who are susceptible to or otherwise susceptible to viral infections or cancer and induce an immune response against the antigen, so that the patient's own Strengthen immune response ability. Such an amount is defined as an “immunologically effective dose”. In use, the exact amount will again depend on the patient's health and weight, the mode of administration, the type of formulation, etc., but the general range is from about 1.0 μg to about 5,000 μg per 70 kg patient. More typically from about 10 μg to about 500 μg mg per patient weighing 70 kg.

状況によっては、本発明のペプチドワクチンを、注目のウイルス、特にウイルスエンベロープ抗原に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと組合せることが所望されうる。   In some situations it may be desirable to combine the peptide vaccines of the invention with vaccines that induce neutralizing antibody responses against the virus of interest, particularly the viral envelope antigen.

治療的又は免疫的目的のため、本発明の１又は複数のペプチドをコードする核酸を患者に投与してもよい。核酸を患者に導入するのにはいくつかの方法が好適に利用される。例えば、核酸は「裸ＤＮＡ」として直接導入できうる。このアプローチは例えばWolff ら、Science 247 : 1465-1468 (1990)並びに米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた例えば米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているようにバリスチック導入を利用して投与してもよい。ＤＮＡだけを含む粒子を投与してよい。他方、ＤＮＡを粒子、例えば金粒子に付着させてよい。核酸はカチオン化合物、例えばカチオン脂質に複合させて導入してもよい。脂質媒介式遺伝子導入法は例えばＷＯ９６／１８３７２；ＷＯ９３／２４６４０；Mannino and Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6 (7) : 682-691 ；Rose米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０３；及びFelgner ら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 7413-7414 に記載されている。本発明のペプチドは弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニア又はフォウルポックスを介して発現させることもできうる。このアプローチは本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの利用を包含する。急性もしくは慢性感染宿主又は感染していない宿主への導入により、組換ワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それ故宿主のＣＴＬ応答を誘導する。免疫プロトコールに有用なワクシニアベクター及び方法は例えば引用することで本明細書に組入れる米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。その他のベクターはＢＣＧ（バチル・カルメッテ・グエリン：Bacille Calmette Guerin)である。ＢＣＧベクターは引用することで本明細書に組入れるStoverら（Nature 351 : 456-460 (1991))に記載されている。本発明のペプチドの治療的な投与又は免疫のために有用な多種多様なその他のベクター、例えばサルモネラ・チフィ（Salmonella typhi) ベクター等は本明細書の説明から当業者に明らかとなるであろう。 Nucleic acids encoding one or more peptides of the invention may be administered to a patient for therapeutic or immunological purposes. Several methods are preferably utilized to introduce the nucleic acid into the patient. For example, nucleic acids can be introduced directly as “naked DNA”. This approach is described, for example, in Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990) and US Pat. Nos. 5,580,859 and 5,589,466. Nucleic acids may also be administered using ballistic induction, as described, for example, in US Pat. No. 5,204,253. Particles containing only DNA may be administered. On the other hand, DNA may be attached to particles, such as gold particles. The nucleic acid may be introduced in a complex with a cationic compound such as a cationic lipid. Lipid-mediated gene transfer methods are described, for example, in WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino and Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6 (7): 682-691; Rose US Pat. No. 5,279,833; WO 91/06303; Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414. The peptides of the invention can also be expressed via an attenuated viral host, such as vaccinia or foulpox. This approach involves the use of vaccinia virus as a vector to express nucleotide sequences encoding the peptides of the invention. Upon introduction into an acute or chronically infected or uninfected host, the recombinant vaccinia virus expresses an immunogenic peptide and therefore induces a CTL response in the host. Vaccinia vectors and methods useful for immunization protocols are described, for example, in US Pat. No. 4,722,848, which is incorporated herein by reference. Another vector is BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG vectors are described in Stover et al. ( Nature 351: 456-460 (1991)), which is incorporated herein by reference. A wide variety of other vectors useful for therapeutic administration or immunization of the peptides of the invention, such as the Salmonella typhi vector, will be apparent to those skilled in the art from the description herein.

本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好適な手段は本発明の多重エピトープをコードするミニジーン構築体を利用する。ヒト細胞における発現のための選定のＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニジーン）を構築するため、このエピトープのアミノ酸配列を逆転写させる。各アミノ酸についてのコドン選択のガイドのため、ヒトコドン用法表を使用する。このようなエピトープをコードするＤＮＡ配列は直接連結し、連続ポリペプチド配列を構築する。発現及び／又は免疫原性の最適化を図るため、このミニジーンデザインの中に追加の要素を組込んでよい。逆転写され、そしてこのミニジーン配列の中に含ませることのできるアミノ酸配列の例には：ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体固定配列が挙げられる。更に、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示はＣＴＬエピトープの隣りに合成（例えばポリアラニン）又は天然隣接配列を含ませることにより向上しうる。   A preferred means of administering a nucleic acid encoding a peptide of the invention utilizes a minigene construct that encodes multiple epitopes of the invention. To construct a DNA sequence (minigene) encoding a selected CTL epitope for expression in human cells, the amino acid sequence of this epitope is reverse transcribed. A human codon usage table is used to guide codon selection for each amino acid. DNA sequences encoding such epitopes are linked directly to construct a continuous polypeptide sequence. Additional elements may be incorporated into this minigene design to optimize expression and / or immunogenicity. Examples of amino acid sequences that are reverse transcribed and can be included in this minigene sequence include: helper T lymphocyte epitopes, leader (signal) sequences, and endoplasmic reticulum anchoring sequences. Furthermore, MHC presentation of CTL epitopes can be improved by including synthetic (eg, polyalanine) or natural flanking sequences next to the CTL epitope.

ミニジーン配列はミニジーンの正及び負の鎖をコードするオリゴヌクレオチドを集成させることによりＤＮＡへと変換される。周知の技術を利用して重複オリゴヌクレオチド（長さ３０〜１００塩基）を合成し、リン酸化し、精製し、そして適当な条件下でアニーリングさせる。オリゴヌクレオチドの末端はＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニジーンを次に所望の発現ベクターの中にクローニングすることができる。   The minigene sequence is converted to DNA by assembling oligonucleotides that encode the positive and negative strands of the minigene. Overlapping oligonucleotides (30-100 bases in length) are synthesized using well-known techniques, phosphorylated, purified, and annealed under appropriate conditions. The ends of the oligonucleotides are ligated using T4 DNA ligase. This synthetic minigene encoding a CTL epitope polypeptide can then be cloned into a desired expression vector.

当業者に周知の標準的な調節配列をベクターの中に含ませ、標的細胞内での発現を確実なものとする。いくつかのベクター要素が必要とされる：ミニジーン挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写終止のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．コリ（E. coli)複製起点；及びＥ．コリ選択マーカー（例えば、アンピシリン又はカナマイシン耐性）。この目的のために数多くのプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターが使用できる。その他の適当なプロモーター配列については、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号を参照のこと。   Standard regulatory sequences well known to those skilled in the art are included in the vectors to ensure expression in the target cells. Several vector elements are required: a promoter with a downstream cloning site for minigene insertion; a polyadenylation signal for efficient transcription termination; E. coli origin of replication; E. coli selectable markers (eg ampicillin or kanamycin resistance). A number of promoters can be used for this purpose, such as the human cytomegalovirus (hCMV) promoter. See US Pat. Nos. 5,580,859 and 5,589,466 for other suitable promoter sequences.

ミニジーン発現及び免疫原性の最適化を図るために追加のベクター修飾が所望されうる。状況によっては、効率的な遺伝子発現のためにイントロンが必要とされ、そして１又は複数の合成又は天然イントロンをミニジーンの転写領域の中に組込んでよい。ｍＲＮＡ安定化配列の組込みもミニジーン発現のために考慮されうる。ＤＮＡワクチンの免疫原性において免疫刺激配列（ＩＳＳ又はＣｐＧｓ）が一役かっていることが最近になって提唱されている。このような配列は、免疫原性を高めることが認められているのなら、ベクターの中に、ミニジーンコード配列の外側にて含ませてよい。   Additional vector modifications may be desired to optimize minigene expression and immunogenicity. In some situations, introns are required for efficient gene expression, and one or more synthetic or natural introns may be incorporated into the transcription region of the minigene. Incorporation of mRNA stabilizing sequences can also be considered for minigene expression. It has recently been proposed that immunostimulatory sequences (ISS or CpGs) play a role in the immunogenicity of DNA vaccines. Such sequences may be included in the vector outside of the minigene coding sequence, provided that they are known to increase immunogenicity.

ある態様においては、ミニジーンコードエピトープの生産と免疫原性を強化又は低下するために含ませる第二タンパク質の生産とを可能とするバイシストロン発現ベクターを使用することができる。同時発現されると免疫応答を有利に増強しうるタンパク質又はポリペプチドの例にはサイトカイン（例えばＩＬ２，ＩＬ１２，ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導性分子（例えばＬｅＬＦ）、又は共刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内ターゲッティングシグナルに連結し、そしてＣＴＬエピトープとは独立に発現させることができる。これはＨＴＬエピトープの、ＣＴＬエピトープ以外の細胞区画への誘導を可能とするであろう。適宜、これはＨＴＬエピトープのＭＨＣクラスII経路へのより効率的な進入を促進し、それ故ＣＴＬ誘導を向上させる。ＣＴＬ誘導に反し、免疫抑制分子（例えばＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答の特異的な下降が所定の疾患において有利でありうる。   In certain embodiments, bicistronic expression vectors that allow for the production of minigene-encoded epitopes and the production of a second protein to be included to enhance or reduce immunogenicity can be used. Examples of proteins or polypeptides that can advantageously enhance the immune response when co-expressed include cytokines (eg, IL2, IL12, GM-CSF), cytokine-inducible molecules (eg, LeLF), or costimulatory molecules. Helper (HTL) epitopes can be linked to intracellular targeting signals and expressed independently of CTL epitopes. This will allow induction of HTL epitopes into cell compartments other than CTL epitopes. Optionally, this facilitates more efficient entry of HTL epitopes into the MHC class II pathway and therefore improves CTL induction. Contrary to CTL induction, specific decline in immune response by co-expression of immunosuppressive molecules (eg TGF-β) may be advantageous in certain diseases.

発現ベクターが選定できたら、ミニジーンをプロモーター下流のポリリンカー領域にクローニングする。このプラスミドを適当なＥ．コリ株に形質転換せしめ、そして標準の技術を利用してＤＮＡを調製する。ミニジーン及びこのベクター内に含まれているその他の要素の配向及びＤＮＡ配列を制限マッピング及びＤＮＡ配列分析により確認する。適正なプラスミドが定着した細菌細胞をマスター細胞バンク及び作業用細胞バンクとして保存することができる。   Once the expression vector is selected, the minigene is cloned into the polylinker region downstream of the promoter. This plasmid is transformed into the appropriate E. coli. E. coli strains are transformed and DNA is prepared using standard techniques. The orientation and DNA sequence of the minigene and other elements contained within this vector is confirmed by restriction mapping and DNA sequence analysis. Bacterial cells colonized with the appropriate plasmid can be stored as a master cell bank and a working cell bank.

治療的な量のプラスミドＤＮＡはＥ．コリの発酵、しかる後の精製により生産される。作業用細胞バンク由来のアリコートを発酵培地（例えばTerrific Broth) の接種に用い、そして周知の技術に従ってシェーカーフラスコ又はバイオリアクター内で飽和に至るまで増殖させる。プラスミドＤＮＡは標準のバイオ分離技術、例えばＱｕｉａｇｅｎ供給の固相アニオン交換樹脂を利用して精製できる。必要なら、スーパーコイルＤＮＡをゲル電気泳動又はその他の方法を利用して開環又は線形形態から単離できる。   A therapeutic amount of plasmid DNA is E. coli. Produced by fermentation of Kori and subsequent purification. An aliquot from the working cell bank is used to inoculate the fermentation medium (eg Terrific Broth) and is grown to saturation in a shaker flask or bioreactor according to well-known techniques. Plasmid DNA can be purified using standard bioseparation techniques, such as solid phase anion exchange resins supplied by Quiagen. If necessary, supercoiled DNA can be isolated from the open circle or linear form using gel electrophoresis or other methods.

精製プラスミドＤＮＡは様々な製剤を利用して注射用に調製できる。その最も簡単なものは、無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥ＤＮＡの再構築である。様々な方法が発表され、そして新たな技術が有用となってきている。前述の通り、核酸はカチオン脂質で簡単に調剤される。更に、集約的に保護性、相互作用性、非凝縮性（ＰＩＮＣ）と称される糖脂質、フソゲンリポソーム、ペプチド及び化合物を精製プラスミドＤＮＡに複合させ、変動因子、例えば安定性、筋肉内分散性、又は特定の器官もしくは細胞タイプへの輸送性を左右させることができる。   Purified plasmid DNA can be prepared for injection using a variety of formulations. The simplest is the reconstitution of lyophilized DNA in sterile phosphate buffered saline (PBS). Various methods have been announced and new technologies are becoming useful. As mentioned above, nucleic acids are easily formulated with cationic lipids. In addition, glycolipids, fusogenic liposomes, peptides and compounds that are collectively referred to as protective, interactive, non-condensable (PINC) are complexed to purified plasmid DNA to provide variable factors such as stability, intramuscular dispersion Or transport to a particular organ or cell type.

標的細胞の感作をミニジーンコードＣＴＬエピトープの発現及びＭＨＣクラスＩ提示の機能的アッセイのために利用できうる。プラスミドＤＮＡを標準のＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切な哺乳動物細胞系の中に導入する。使用するトランフェクション方法は最終製剤に依存するであろう。「裸」ＤＮＡのためにはエレクトロポレーションを利用でき、一方カチオン脂質は直接ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを可能とする。グリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時トランスフェクションし、蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣＳ）を利用することでトランスフェクション細胞の富化が可能となる。このような細胞を次いでクロム−５１ラベルし、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ系のための標的細胞として用いる。５１Ｃｒ放出により検出される細胞溶解はミニジーンコードＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示の結果を示唆する。   Target cell sensitization can be utilized for functional assays of minigene-encoded CTL epitope expression and MHC class I presentation. Plasmid DNA is introduced into a suitable mammalian cell line as a target for a standard CTL chromium release assay. The transfection method used will depend on the final formulation. Electroporation can be utilized for “naked” DNA, while cationic lipids allow direct in vitro transfection. Enrichment of transfected cells is possible by co-transfecting a plasmid expressing green fluorescein protein (GFP) and utilizing fluorescence activated cell sorting (FACS). Such cells are then chromium-51 labeled and used as target cells for the epitope specific CTL line. Cell lysis detected by 51Cr release suggests the result of MHC presentation of the minigene-encoded CTL epitope.

ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性はミニジーンＤＮＡ製剤の機能試験のための第二のアプローチである。適当なヒトＭＨＣ分子を発現する遺伝子導入マウスをこのＤＮＡ生成物で免疫する。用量及び投与ルートは製剤依存性である（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡは１Ｍ、脂質複合ＤＮＡは１Ｐ）。免疫の２１日後、脾臓細胞を回収し、そして試験すべき各々のエピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）を標準の技術を利用してペプチド負荷クロム−５１ラベル化標的細胞の細胞溶解についてアッセイする。ミニジーンコードエピトープに対応するペプチドのＭＨＣ負荷により感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのｉｎ ｖｉｖｏ誘導についてのＤＮＡワクチンの機能を証明する。   In vivo immunogenicity is a second approach for functional testing of minigene DNA formulations. Transgenic mice expressing the appropriate human MHC molecules are immunized with this DNA product. The dose and route of administration are formulation dependent (eg, 1M DNA in PBS, 1P lipid complex DNA). After 21 days of immunization, spleen cells are harvested and restimulated for 1 week in the presence of peptides encoding each epitope to be tested. These effector cells (CTL) are assayed for cytolysis of peptide-loaded chromium-51 labeled target cells utilizing standard techniques. Lysis of target cells sensitized by MHC loading of the peptide corresponding to the minigene-encoded epitope demonstrates the function of the DNA vaccine for in vivo induction of CTL.

抗原性ペプチドは同様にＣＴＬをｅｘ ｖｉｖｏで誘導するのに利用されうる。得られるＣＴＬはその他の慣用の治療形態に応答しない、又はペプチドワクチン治療アプローチに応答しないであろう患者の慢性感染症（ウイルス性又は細菌性）又は腫瘍の処置に利用できる。特定の病原体（感染因子又は腫瘍抗原）に対するｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ応答を組織培養物において患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）の起源及び適当な免疫原性ペプチドと一緒にインキュベーションすることにより誘導する。ＣＴＬｐが活性化して成熟し、そしてエフェクターＣＴＬへと発達するのに適当なインキュベーション時間経過後（典型的には１〜４週間）、細胞を患者に戻し、そこでそれらはその特定の標的細胞（感染細胞又は腫瘍細胞）を破壊するであろう。   Antigenic peptides can also be used to induce CTL ex vivo. The resulting CTL can be used to treat chronic infections (viral or bacterial) or tumors in patients who will not respond to other conventional treatment modalities or will not respond to peptide vaccine therapy approaches. Incubating ex vivo CTL responses against specific pathogens (infectious agents or tumor antigens) in tissue culture with patient CTL progenitor cells (CTLp) together with the origin of antigen presenting cells (APC) and appropriate immunogenic peptides To guide. After a suitable incubation period (typically 1 to 4 weeks) for CTLp to activate and mature and develop into effector CTLs, cells are returned to the patient where they are infected with their specific target cells (infections). Cell or tumor cell).

これらのペプチドは診断試薬としての用途も認められうる。例えば、本発明のペプチドは当該ペプチド又は近縁のペプチドを採用する処置養生法に対する特定の個体の感受性を決定するために利用されることができ、かくして現行の処置プロトコールを改訂するのに、又は冒された個体の予後を決定するのに有用でありうる。更に、これらのペプチドは慢性感染症の発症について相当のおそれのあるであろう個体を予測するのにも利用できうる。
以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。 These peptides may also find use as diagnostic reagents. For example, the peptides of the present invention can be used to determine a particular individual's susceptibility to treatment regimens that employ the peptide or related peptides, thus revising current treatment protocols, or It can be useful in determining the prognosis of affected individuals. In addition, these peptides can be used to predict individuals who are likely to be at considerable risk for the development of chronic infections.
The following examples are illustrative and do not limit the present invention.

実施例１
クラスＩ抗原の単離は前述の関連出願に記載の通りに実施した。それに記載の通りに天然プロセシングされたペプチドを単離し、そして配列決定した。アレル特異的モチーフ及びアルゴリズムも決定し、そして定量結合アッセイを実施した。 Example 1
Isolation of class I antigens was performed as described in the aforementioned related application. Naturally processed peptides were isolated and sequenced as described. Allele specific motifs and algorithms were also determined and quantitative binding assays were performed.

様々なＨＬＡアレルについての上記同定モチーフを利用し、多数の抗原由来のアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。表３−＊＊はこれらのサーチの結果を供与する。   Utilizing the above identified motifs for various HLA alleles, amino acid sequences from a number of antigens were analyzed for the presence of these motifs. Table 3-** provides the results of these searches.

上記例は本発明の例示であり、本発明の範囲を限定しない。本発明のその他の変異体は当業者に自明であり、本発明に包含される。全ての公開物、特許及び特許出願は引用することで本明細書に組入れる。

The above examples are illustrative of the invention and do not limit the scope of the invention. Other variants of the invention will be apparent to those skilled in the art and are encompassed by the invention. All publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference.

Claims (7)

ＨＬＡ結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物であって、その免疫原性ペプチドが、表３〜１４中に示すペプチド又は表３〜１４中に示すペプチド内の残基の保存的置換を含むペプチドである、前記組成物。   A composition comprising an immunogenic peptide having an HLA binding motif, wherein the immunogenic peptide comprises conservative substitutions of the peptides shown in Tables 3-14 or the residues in the peptides shown in Tables 3-14. The said composition which is a peptide containing. 前記免疫原性ペプチドが、第２のオリゴペプチドに結合されている、請求項１に記載の組成物。   2. The composition of claim 1, wherein the immunogenic peptide is conjugated to a second oligopeptide. 前記第２のオリゴペプチドが、ヘルパーＴ応答を誘発するペプチドである、請求項２に記載の組成物。   The composition of claim 2, wherein the second oligopeptide is a peptide that elicits a helper T response. 表３〜１４中に示す免疫原性ペプチド、又は表３〜１４中に示すペプチドの残基の保存的置換を含むペプチドをコードする核酸分子を含む組成物。   A composition comprising a nucleic acid molecule encoding an immunogenic peptide as shown in Tables 3-14, or a peptide comprising conservative substitutions of residues of the peptides shown in Tables 3-14. 前記核酸が、さらに、第２の免疫原性ペプチドをコードする配列を含む、請求項４に記載の組成物。   5. The composition of claim 4, wherein the nucleic acid further comprises a sequence encoding a second immunogenic peptide. 前記核酸がさらに、ヘルパーＴ応答を誘発するオリゴペプチドをコードする配列を含む、請求項４に記載の組成物。   5. The composition of claim 4, wherein the nucleic acid further comprises a sequence encoding an oligopeptide that elicits a helper T response. 細胞毒性Ｔ細胞を請求項１に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞毒性Ｔ細胞を誘導する方法。   A method of inducing cytotoxic T cells comprising contacting cytotoxic T cells with the peptide of claim 1.