JP2009545737A - 蛍光ベースのDNAイメージサイメトリーを用いたinvivoでの癌の検出及び/又は診断方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、共焦点走査顕微鏡法を用いて、第一に生体組織の細胞核を限局化し、後に、細胞核紫外線吸光度を測定することにより、細胞核DNAの量をヒト又は動物の対象においてin vivoで決定する方法に関する。本発明は、レーザ走査共焦点顕微鏡法により、第一に生体組織の細胞核の限局化を同定し、後に、細胞核紫外線吸光度を測定することによって、ヒト又は動物の対象においてin vivoで癌性の細胞を検出する方法にも関する。さらに、本発明は、in vivoでヒト又は動物の対象における癌を診断する方法に関し、当該方法は、レーザ走査共焦点顕微鏡法による、生体組織の細胞核における限局化の同定と細胞核紫外線吸光度の測定との組合せに依拠している。
Description
本発明は、in vivoで細胞核を限局化し、該細胞核の紫外線の吸収作用を測定することにより、ヒト又は動物の対象の細胞における細胞核の核酸の量をin vivoで決定する方法に関する。
本発明は、in vivoで細胞核を限局化し、該細胞核の紫外線の吸収作用を測定することにより、ヒト又は動物の対象においてin vivoで癌性の細胞を検出する方法にも関する。
同様に、本発明は、ヒト又は動物の対象における癌を診断及び/又は予測する方法に関し、当該方法は、in vivoで行われ、細胞核の限局化、及び、細胞核のUV吸収作用の測定に依拠している。
癌の早期発見は、癌患者を治療することにおいて鍵となる要点である。生物学的試料内の癌性の細胞を検出する、従って、実在する癌を診断する、又は、少なくとも将来癌が発生するという見込みを推定するといった種々の可能性が存在する。これらの種々の取り組みには、癌組織の理学的検査、癌性の細胞の形態学的特徴づけ、膜及び核等の細胞構造体の免疫組織化学染色並びに特徴づけ、腫瘍特異的因子の発現の測定等が含まれる。
癌性の細胞を検出するという1つの可能性は、核DNAの量を測定して通常のDNA含有量との偏差を検出する、いわゆるDNAサイメトリーである。突然変異誘発性の事象の結果としての細胞が、非癌性、すなわち、「健康」又は「正常」タイプの細胞として知られる既知の標準的な細胞よりも少ない又は多いDNAを含んでいる場合、このDNA含有量における偏差により、重大な染色体再構築、従って進行中の癌発生が示されるということが想定される。
従って、核酸特異的染色による核DNAの定量化は、癌診断という状況において、研究用途でも臨床用途でもますます慣例になってきている。
フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーによる核DNA含有量の測定は、とりわけ(i)DNAに結合した染料の量は存在するDNAの量に比例する、及び、(ii)放出、吸収、又は伝導による染料から生じる光学信号は染料の量に比例するという想定に基づいている。
DNAイメージサイトメトリーにより核DNAを測定するという目的に対して一般的に使用される1つのDNA特異的染色法は、フォイルゲン(Feulgen)とロッセンベック(Rossenbeck)の名にちなんだ、単にフォイルゲン反応と呼ばれる場合が多い、酸塩基反応である。実際に、フォイルゲン反応は、DNAが酸により加水分解され、遊離のアルデヒド基を有する、プリン塩基なしのDNA(すなわち、いわゆるアプリン酸、APA)を生じる発色反応である。次に、遊離のアルデヒド基に共有結合的に結合する染料を含有したシッフ試薬と反応させる。
フォイルゲン反応はDNAに特異的だけれども、種々の欠点を有している。フォイルゲン反応は時間のかかる反応で、むしろ、再現性及び意味のある結果を生じるために、注意深く制御及び確認する必要がある複雑な反応である。プリン塩基の除去において一般的に使用されるHClがAPAをより小さな断片に加水分解するという事実から1つの問題が生じる。しかし、APA分子の断片化により、これらの断片は細胞核から除去され、従って、染色可能なDNA物質は失われる。
フォイルゲン染色法に固有のこれらの欠点に加えて、フォイルゲン染色自体が突然変異誘発性であり、従って癌を発生させるため、フォイルゲン法による核DNAの着色はin vivoで可能ではない。
従来のDNAイメージサイトメトリー法における別の鍵となる要点は、これらの方法には、個々の細胞の測定を可能にするために細胞が例えばガラススライド上に広げられる作動モードが必要とされることである。しかし、in vivoでDNAサイトメトリー測定を行うことは、当然ながら、試料を単離することができないのではなく、個々の細胞をその生理学的環境から単離することが可能ではない状況においてDNA測定を行わなければならないという状況により複雑にされる。正しくは、in vivo、すなわち、ヒト又は動物の対象においてDNAイメージサイトメトリーを行う場合、個々の細胞を物理的にその自然環境から分離することはできず、個々の細胞の量を測定する方法を見つけなければならない。
新規の顕微鏡装置を提供することによって個々の細胞をその自然環境内で可視化させる試みが、当技術分野において行われてきた。
国際公開WO2004/113962 A2号は、厚膜試料内にある細胞の観察を可能にする小型化された共焦点顕微鏡システムを開示している。
しかし、現在まで解決されていない、in vivoでのDNAイメージサイトメトリーにおける必要条件のうちの1つは、生体組織内で核DNAの量を決定することである。
このように、信頼ができて迅速且つ能率的な、ヒト又は動物の対象においてin vivoで核DNAの量を測定する、並びに、癌性の細胞及び癌を検出する手段を可能にする方法が引き続き必要である。
細胞の核内にあるDNA等の二重鎖の細胞核の核酸の量をin vivoで決定する方法を提供することが、本発明の目的である。
癌性の細胞の存在をヒト又は動物の対象においてin vivoで検出する方法を提供することも、本発明の目的である。
癌の存在、又は、起こりそうな癌の発生のin vivoでの診断を可能にする方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
上記の目的を達成するために、独立請求項1において定義された方法が提供される。
本発明によると、ヒト又は動物の対象の少なくとも1つの細胞における細胞核の核酸の量をin vivoで決定する方法が提供され、当該方法は:
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外(UV)線の吸収作用を測定するステップ;
を含む。
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外(UV)線の吸収作用を測定するステップ;
を含む。
本発明の1つの例証的な実施形態において、細胞内の細胞核の核酸の量をin vivoで決定する前述の方法を使用して、ヒト又は動物の対象内にある少なくとも1つの癌性の細胞を検出することができる。
前述の方法のさらなる実施形態において、ステップ(b)において得られた細胞核紫外線吸光度を使用して、細胞の倍(異)数性状態を算出することができる。
これは、得られた細胞核紫外線吸光度を、非癌性の種類であると知られ、核DNA含有量が既知である細胞に対して実質的に同一の条件のもと得られた細胞核紫外線吸光度に参照することにより行うことができる。好ましい実施形態において、この算出はヒト又は動物の体外で行われる。
本発明のさらに別の実施形態では、2価から少なくとも10%はずれた異数性状態は、癌性の細胞を示しているとみなされる。健康な状態において増殖する細胞の場合、2及び4価からの少なくとも10%の異数性の偏差が、進行する癌の発生を示しているとみなされる。
本発明の一実施形態において、上記のように細胞内の核DNAの量を決定する方法を使用して、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる癌性の細胞が少なくとも1つ検出される。
本発明の実施形態のうちの1つにおいて、本発明による方法は、上記の方法のステップ(a)における核の限局化のために、共焦点レーザ走査顕微鏡法、2光子イメージング、走査型光コヒーレンス断層撮影法、高分解能の超音波、又は、UV内視顕微鏡法を使用する。
本発明のさらに別の実施形態において、ステップ(b)における細胞核紫外線吸収作用の測定は、紫外線吸収信号を較正し、前記細胞核の体積を決定することにより行われる。
好ましい実施形態において、細胞核紫外線吸収作用の決定は共焦点レーザ走査顕微鏡法により行われる。本発明の特に好ましい実施形態は、この目的のために、約240nmから約280nmの波長を有する紫外線を使用する。
本発明の別の実施形態において、ヒト又は動物の対象における癌をin vivoで診断及び/又は予測する方法が提供され、当該方法は:
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外線の吸収作用を測定するステップ;
(c)ステップ(b)で決定した前記核の紫外線吸収作用を、同じくステップ(a)から(b)を使用して得られた非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量を決定するステップ;
(d)前記細胞核の核酸の量に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ;
を含む。
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外線の吸収作用を測定するステップ;
(c)ステップ(b)で決定した前記核の紫外線吸収作用を、同じくステップ(a)から(b)を使用して得られた非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量を決定するステップ;
(d)前記細胞核の核酸の量に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ;
を含む。
ステップ(c)では、ヒト又は動物の体外で比較を行うことができる。
本発明のこの態様におけるさらに別の実施形態は、前述の特徴を含み、2価から少なくとも10%はずれた倍数性状態が癌性の細胞、従って、(今後)起こりそうな癌の発生を示す方法を用いてヒト又は動物の対象における癌を診断及び/又は予測する方法に関する。健康な状態において増殖する細胞の場合、2及び4価からの少なくとも10%の異数性の偏差が、進行する癌の発生を示しているとみなされる。
ヒト又は動物の対象における癌を診断及び/又は予測する前述の特徴の方法に関係する本発明のさらに別の実施形態において、当該方法を使用して、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌が検出される。
本発明の他の実施形態において、診断及び予測の態様に関連して、ステップ(a)における核の限局化、及び、ステップ(b)における細胞核紫外線吸収作用の測定は、上記のように行うことができる。
従って、好ましい実施形態において、共焦点レーザ走査顕微鏡法が、好ましくは約240nmから約280nmの波長の紫外線を用いて、細胞核紫外線吸収作用を測定するために使用される。
DNAサイトメトリーによる癌性の細胞の同定は、一般的に、フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーを用いて実行される。
ICMと呼ぶこともできるDNAイメージサイトメトリーの場合には、DNAを可視化するために、DNAはマーカーで染色される。その後、一般的に異数性と呼ばれるDNAの量における変化を使用して、癌性の細胞の存在を検出する。それは、異数性が、すでに実在している癌性の状態、又は、発生している癌性の状態の特徴であるとみなされるためである。従って、DNA異数性の検出は、癌性の細胞を検出することによる早期の且つ敏感な癌の診断を可能にし、その診断は、組織診の形態学的及び組織学的特徴づけより何年も前に進められる場合が多くある。
しかし、上記のように、フォイルゲン染色法等の確立されたDNA発色反応は、面倒で時間がかかってしまう。さらに、フォイルゲン染色法等のDNA発色反応はそれ自体が突然変異誘発性であり、従って癌を発生させるため、in vivoで使用することは可能ではない。
本発明者等は、ヒト又は動物の対象においてin vivoで、自然環境に取り囲まれた細胞の細胞核の核酸の量を、第一にそのような細胞の核を限局化し、第二に前記核による紫外線の吸収作用を測定することによって決定することが可能であることを意外にも発見した。
このように、一実施形態における本発明は、少なくとも1つの細胞における細胞核の核酸の量をヒト又は動物の対象においてin vivoで決定する方法を対象としており、当該方法は:
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外(UV)線の吸収作用を測定するステップ;
を含む。
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外(UV)線の吸収作用を測定するステップ;
を含む。
そのような方法を使用して、特に、個々又は種のゲノムサイズを決定することができる。当然ながら、そのような方法を使用して、例えば生体組織内にある少なくとも1つの癌性の細胞を検出することもできる。
ステップ(b)には、約240nmから約280nmという波長の紫外線を使用することが好ましい。特に好ましいのは、約250nm、255nm、又は260nmという波長の紫外線であり得る。核の限局化が紫外線を用いて行われる場合、同じことがステップ(a)にも適用される。このように、1つの好ましい実施形態において、ステップ(a)及び(b)に、上記の波長の紫外線が使用される。
本発明の目的に対して、「癌性の細胞」という用語は、いかなる細胞、細胞組織、又は、細胞からなる器官にも関し、当該細胞の一部又は全てが、染色体の複製、欠失、挿入、転座等の結果として、非癌性の細胞に対して決定された核DNAの量からはずれた核DNAの量を含んでいる。
染色体DNAの挿入、複製、欠失、及び転座が、癌の発生に対する大きな原因であり、従って、癌性の細胞の特徴であるとみなすことができるということは既知である。
本発明による方法によって調査することができる細胞は、骨髄細胞、リンパ節細胞、リンパ球、赤血球、神経細胞、筋細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、粘膜細胞等を含めた群から選択することができる。
同様に、本発明による方法を使用して、ヒト又は動物の体内の種々の組織をin vivoで分析することができる。そのような組織は、肝臓、心臓、腎臓等の器官の一部である、及び/又は、前述の細胞型を収容している場合がある。
好ましくは少なくとも1つの癌性の細胞を検出するための、細胞核の核酸の量をヒト又は動物の対象においてin vivoで決定する上記の方法は、次に、各々のステップ(a)及び(b)に関して詳細に記述される。
ステップ(a)と上記で呼ばれた第一のステップにおいて、ヒト又は動物の対象内の少なくとも1つの細胞は、その核の位置に関してin vivoで分析される。好ましい実施形態において、前記少なくとも1つの細胞は、癌性又は癌性であると疑われた、すなわち、推測上癌性の細胞であり得る。
一般的に、細胞核の限局化は、その自然環境、すなわち生体組織内で細胞に対して行われる。細胞核の限局化は、例えば、共焦点レーザ走査顕微鏡法、走査型光コヒーレンス断層撮影法、2光子イメージング、高分解能の超音波、又は、UV内視顕微鏡法を用いて達成することができる。
組織の形態、従って核の位置が既知である場合、DNA含有量(ステップ(b))等の各細胞における細胞核の核酸の量の測定を開始することができる。このことは、一実施形態において好ましい場合があるけれども、例えば核DNAの測定が開始される前に、核の位置、従って限局化は正確に決定される必要はなく、概算で十分な場合がある。細胞境界の知識で十分な場合さえある。この理由のため、核の限局化を決定するために紫外線を使用することは、好ましい実施形態であり得るけれども必要でない場合がある。
共焦点レーザ走査顕微鏡法
in vivoでの細胞の核の限局化における好ましい実施形態のうちの1つは、共焦点レーザ走査顕微鏡法の使用に依拠しており、さらに好ましい実施形態においては、紫外線光源を使用することができる。共焦点顕微鏡法は、従来の光学顕微鏡法と比較していくつか利点を提供している。最も重要な利点の1つは、画像をゆがめてしまう焦点がずれた情報の除去、制御可能な被写界深度、及び、サブミクロンの解像度である。共焦点顕微鏡法のさらなる利点は、標本のうち焦点がずれた種々の部分における蛍光を取り除くことができるので、焦点の合った部分又は切片を妨害せず、その結果、古典的な光学顕微鏡法によって得られた類似の画像よりもかなり鮮明でより良い解像度を示す画像を生じることである。
in vivoでの細胞の核の限局化における好ましい実施形態のうちの1つは、共焦点レーザ走査顕微鏡法の使用に依拠しており、さらに好ましい実施形態においては、紫外線光源を使用することができる。共焦点顕微鏡法は、従来の光学顕微鏡法と比較していくつか利点を提供している。最も重要な利点の1つは、画像をゆがめてしまう焦点がずれた情報の除去、制御可能な被写界深度、及び、サブミクロンの解像度である。共焦点顕微鏡法のさらなる利点は、標本のうち焦点がずれた種々の部分における蛍光を取り除くことができるので、焦点の合った部分又は切片を妨害せず、その結果、古典的な光学顕微鏡法によって得られた類似の画像よりもかなり鮮明でより良い解像度を示す画像を生じることである。
共焦点走査顕微鏡法の基本原理は、対物レンズの焦点が合わされた点に「結合」された顕微鏡レンズシステムの焦点にピンホールを有したスクリーンの使用である。対物レンズの焦点からの光のみがピンホールにて集められ、例えば電荷結合素子(CCD)であり得る検出器を通り抜けることができる。試料のうち焦点がずれた切片からの光は、ほぼ完全に取り除かれる。
このように、共焦点顕微鏡は、x及びy方向に対して従来の顕微鏡よりも有意に優れた分解能を有している。さらに、共焦点顕微鏡は、z方向においてより浅い被写界深度を有している。このように、試料中焦点を走査することにより、試料の異なる面を見ることが可能であり、従って、試料の3次元画像を再構築することが可能である。さらに、共焦点顕微鏡法は、種々の波長の光と両立し得る。
共焦点レーザ走査顕微鏡が例えば内視鏡装置に統合された場合、アクチュエータを使用して、関心のある組織上で共焦点顕微鏡に走査させることができる。従って、第一の粗い走査を使用して組織の形態を決定することができ、関心のある核をこの選別から同定することができる。核が限局化されたこの段階で、次に、細胞核の紫外線の吸収作用を測定するためにステップ(b)に進むことができる。
核の限局化に対して、共焦点走査顕微鏡は、単色光又は多色光を使用することができる。しかし、240nmから280nmという波長を有した単色紫外線が好ましい場合がある。特に好ましいのは、250nm、255nm、又は260nmという波長の紫外線であり得る。
共焦点レーザ走査顕微鏡として、LEICA DMLM等で、蛍光信号の信号強度を測定するためのQimaging Regita 2000R FASTCooled Mono 12−bitカメラ装置(QImaging社、Burnaby、BC、Canada)を有した顕微鏡を使用することができる。Leica DM6000は特に好ましい場合がある。
細胞がその自然な組織の環境において検査されることになる本発明の目的に対して、共焦点レーザ走査顕微鏡は内視鏡内に統合することができる。この目的に対して既知のシステムは、画像が走査される様式において主に異なる。2つのいくぶん進歩した市販のシステムが、例えばOptiscan社及びMauna Kir Technology社から入手可能である。Mauna Kirの機器は、コヒーレント光ファイバー束で画像が内視鏡の下に転送される近位走査システムである。選択された点又はファイバーは、遠心端にて標本にされた組織に画像化される。この共焦点レーザ内視鏡は、内視鏡のワーキングチャンネル介して送達される。共焦点レーザ内視鏡の視野は狭いため、プローブの配置はスタンダードなビデオ内視鏡により導かれる。従って、内視鏡のプラットフォームは、ビデオイメージャも共焦点顕微鏡も含まなければならない。当然ながら、内視鏡ユニットは、得られた画像の処理を可能にするコンピュータ装置及びソフトウェアパッケージも含むことができるか、又は、それらに連結することができる。
検出装置は、例えば、BQ6000フレームグラバーボードを介してコンピュータに接続されたOptronics DEI−700 CE three−chip CCDカメラであり得る。或いは、Hitachi HV−C20 three−chip CCDカメラを使用することができる。画像分析用ソフトウェアパッケージは、例えば、Bioquant True Color Windows(登録商標) 98 v3.50.6 画像分析ソフトウェアパッケージ(R&M Biometrics社,Nashville,TN)、又は、Image−Pro Plus 3.0画像分析ソフトウェアであり得る。使用することができる別のシステムは、デュアル・モードに基づいたBioView Duet system(BioView Ltd社,Rehovot,Israel)、全自動の顕微鏡(Axioplan 2,Carl Zeiss社,Jena,Germany)、XY電動8スライドステージ(Marzhauser社,Wetzler,Germany)、3CCDプログレッシブスキャンカラーカメラ(DXC9000,Sony社,Tokyo,Japan)、並びに、システムの制御及びデータの分析用コンピュータである。
Optiscan社は、遠位走査(distal scanning)を使用する共焦点レーザ内視鏡を開発した。このシステムで、1本のファイバーが光を内視鏡の下に伝達し、遠位ヘッド(distal head)のファイバー端は空間的に走査され、オプティクスで組織に画像化される。Optiscan社は内視鏡をPentax社と共同開発した。その機器には共焦点顕微鏡が統合され、その結果、ワーキングチャンネルがはずされた。このシステムを使用して得られた組織の画像は、細胞核限局化の同定を可能にする解像度によるものである。
他の小型の共焦点光学装置は、本明細書に援用する国際公開WO2004/113962 A2号に記載されている。生体組織の共焦点イメージングのためのシステムも、国際公開WO02/073246 A2号並びに米国特許第2005/0036667号に記載されており、どちらも同様に本明細書に援用する。
光コヒーレンス断層撮影法
ヒト又は動物の対象の生体組織においてin vivoで細胞核を限局化することにおけるさらに別の可能性は、光コヒーレンス断層撮影法(OCT)の使用である。
ヒト又は動物の対象の生体組織においてin vivoで細胞核を限局化することにおけるさらに別の可能性は、光コヒーレンス断層撮影法(OCT)の使用である。
OCTは、超高解像度(数ミクロン)で数ミリメートルまでの浸透度(一般的に、1.5bis2mm)を達成し、リアルタイムで3−Dの組織画像を生じるイメージングテクノロジーである。OCTは、任意に機能的及び分子的イメージングを達成するため、並びに、分光学的情報を与えるために3−D構造の画像(組織層、密度変化)を実現する。OCTは、−90dBくらい小さい信号を測定することができる干渉法ベースの技術である。1つのスタンダードなファイバーベースのOCT機構が、図5に示されている。
カプラーは、光源から生じる光を分割する。1つのアームは干渉計(interpherometer)の参照アームとして役立つけれども、もう一方のアームは光を試料まで伝え、従って、サンプルアームと呼ばれる。走査型オプティクスは左右走査の能力を与えるため、OCT機構は各側臥位に対してアキシャルスキャン(A−scan)を得る。全ての組み合わされたA−scanが、3−D構造の画像を形成する。
各A−scanを得る際に、参照ミラー変位は深度情報を提供する。波長を走査することにより深度情報を得ることも可能である。さらに短い時間でより優れた深度情報を得るために、より進歩した技術がいくつか開発された。分光学的OCTは、いかなる移動部分もなしで前後走査のデータを提供するOCTの中で最も進歩している。
現在最速のOCTシステムは、1フレームあたり1000回を超えるA−scanで、1秒あたりおよそ30フレームという速さで画像を生成することができる。方位分解能は、走査型オプティクス及び光フォーカスシステム(light focusing sytem)によってのみ制限される。距離分解能は、今度は光源に依存している。およそ70nmから930nmの帯域幅を有する市販のスーパールミネッセントダイオードを用いて現在入手可能である典型的な距離分解能は約5μmである。およそ1.5μmという最も優れた実証済みの分解能のうちの1つは、Ti:サファイア fsレーザーを用いることによって達成した。
本発明の目的に対して、上記のOCT装置、及び、特に分光学的OCT装置は小型化することができるため、すなわち内視鏡システムにおいて使用することができる。OCT技術を小型化するために、例えばOptics Letters29,2261(2004)の刊行物において練られた案を参照することができる。一般的に、内視鏡システムに使用することができる小型化されたOCT装置は以下のものを提供する:
光源。これは光源の帯域幅に比例する距離分解能を決定する。商業的に入手可能なSLD(スーパールミネッセントダイオード)は、およそ5μmの距離分解能を得る。より優れた分解能(1μmに近い分解能)は、Ti:サファイア fsレーザー又はタングステン電球(非常に低電力)が使用された場合に入手可能である。チューナブルレーザーは、フーリエ領域OCTに必要とされる。
光源。これは光源の帯域幅に比例する距離分解能を決定する。商業的に入手可能なSLD(スーパールミネッセントダイオード)は、およそ5μmの距離分解能を得る。より優れた分解能(1μmに近い分解能)は、Ti:サファイア fsレーザー又はタングステン電球(非常に低電力)が使用された場合に入手可能である。チューナブルレーザーは、フーリエ領域OCTに必要とされる。
光の送達を提供するためのファイバーオプティクス要素、マイケルソン干渉計を実現するための循環装置、及び/又は、ファイバーカプラー。
検出要素。これはOCTの種類次第である。フォトダイオードが一般的に使用されるが、スペクトルOCTの場合は、スペクトル分解された検出(リニアCCDアレイと組み合わせたスペクトルアナライザ)が必要である。
偏光又は位相(phase)OCTの場合、エンジン及びプローブ要素は偏光特性を維持することができなくてはならない。
高分解能超音波
前述したように、細胞核の限局化は、高分解能超音波を用いて行うこともできる。
前述したように、細胞核の限局化は、高分解能超音波を用いて行うこともできる。
2光子イメージング
当然ながら、細胞核は、2光子イメージングテクノロジーを用いて限局化することもできる。2光子の方法により、in vivoでのリアルタイムの組織の3次元イメージングが可能である。この技術において、組織内の蛍光物質が低エネルギーの2つの光子を吸収することにより励起され、蛍光を放出するということが基本原理である。このことは、より高いエネルギーの1光子が蛍光物質を励起させる従来の(共焦点)顕微鏡法に対立する。
当然ながら、細胞核は、2光子イメージングテクノロジーを用いて限局化することもできる。2光子の方法により、in vivoでのリアルタイムの組織の3次元イメージングが可能である。この技術において、組織内の蛍光物質が低エネルギーの2つの光子を吸収することにより励起され、蛍光を放出するということが基本原理である。このことは、より高いエネルギーの1光子が蛍光物質を励起させる従来の(共焦点)顕微鏡法に対立する。
2光子処理を生じるために、一般的に共焦点顕微鏡の焦点で得られる比較的高い光子束が必要とされる。結果として、共焦点顕微鏡法の利点は、3次元イメージング及び高分解能(〜0.2ミクロンの方位分解能、及び、〜0.5ミクロンの距離分解能)のように、2光子イメージングにも適用される。
低エネルギーの励起光子のため、組織による1光子吸収は比較的少なく、組織における光子誘起の損害の量は最小限にされる。このことは、in vivoの利用にとって重要な利点である。さらに、低い吸収率により、光子は組織内により深く浸透し、0.5mmまでのイメージング深度を生じる。
要するに、2光子イメージングは、高分解能の共焦点顕微鏡法という利点と大きなイメージング深度及び少ない量の光子誘起の損害を兼ね備えている。2光子イメージングは、in vivoでのリアルタイムの組織の細胞レベルまでの特徴づけを可能にし、疾患を診断するのに適していると証明した。
上記の方法のうちステップ(b)に話を変えると、in vivoで核による紫外(UV)線の吸収作用を測定することは、種々の方法によって達成することができる。
共焦点顕微鏡機構を使用することにより、細胞の核内にあるプローブに焦点を合わせることができる。一般的に、共焦点機構のプローブスポットは核よりも小さくさせる。
共焦点機構により測定された核から反射される紫外線の量は、スポットにより探られた領域によって吸収された光の量に逆比例している。吸収作用は核を通してほぼ等しいと仮定すると、唯一残されたことは、測定値を較正し、核のサイズを決定することである。
較正
較正は、共焦点走査の同じ面内にある核及び核外の領域による紫外線の吸収作用を決定することからなる。核内外のどちらの測定に対しても、光は、関心のある細胞に到達する前に組織のほぼ同じ量及び同じ距離だけ伝わり、どちらの測定においても、類似のバックグラウンド信号を生じた。従って、細胞核による吸収対細胞核によらない吸収に対する測定値間の比は、細胞核の吸収に対する絶対測定値として利用することができる。
較正は、共焦点走査の同じ面内にある核及び核外の領域による紫外線の吸収作用を決定することからなる。核内外のどちらの測定に対しても、光は、関心のある細胞に到達する前に組織のほぼ同じ量及び同じ距離だけ伝わり、どちらの測定においても、類似のバックグラウンド信号を生じた。従って、細胞核による吸収対細胞核によらない吸収に対する測定値間の比は、細胞核の吸収に対する絶対測定値として利用することができる。
好ましい実施形態において、約240nmから約280nmという波長の紫外線が使用される。特に好ましい実施形態において、約250nm、255nm、又は260nmという波長を有する紫外線が使用される。波長の状況において「約」という用語は、1.5%、好ましくは1%、最も好ましくは0.5%の偏差に関している。紫外線、特に、240nmから280nmという波長の紫外線を使用する理由は、細胞の核に存在するDNAが、この波長範囲において、その細胞の蛋白質よりもはるかに高い吸収作用を示すためである(図3を参照されたい)。
従って、蛋白質もDNAも含有している核は、DNAではなく主に蛋白質を含有する残りの細胞よりも光を吸収するであろう。
共焦点レーザ走査顕微鏡を好んで使用することにより、核内の物質による紫外線の反射を測定し、その値を核外の細胞物質による反射と比較することができる。核により吸収された紫外線対核外の領域により吸収された紫外線の比を算出することによって、共焦点走査で得られた一面内のDNAの密度に対する測定値である信号が得られる。
核容積の決定
核内にある細胞核の核酸の量を決定することにおける第2のステップでは、細胞核の全容積を決定しなければならない。これは、以下のように行うことができる。
核内にある細胞核の核酸の量を決定することにおける第2のステップでは、細胞核の全容積を決定しなければならない。これは、以下のように行うことができる。
核を通して3−Dで光スポット(light spot)を走査することによって、測定値を較正する際に記述されたように反射光の強度を決定することができる。反射光の強度により、依然として核内にいるのか、核の境界に達したのか、又は、すでに核外にいるのかわかる。このことは、図4に示されている。
反射し得る紫外線の信号は、すでに説明したように、顕微鏡の光スポットが核内で焦点を合わせられた場合と核外で合わせられた場合とで異なる。焦点を合わせた光スポットが核外にある場合、紫外線吸収作用は比較的低く、高強度の反射光が測定される。光スポットの焦点が細胞を通して移動して核の縁を通過した場合、より多くの光が核内に吸収されるため、反射光の強度は徐々に減少する。光スポットが完全に核内にある限り、核のもう一方の縁に再び達するまで、反射光の信号は一定で比較的小さい。次に、信号は、以前の高い値まで連続的に大きくなる。移動方向において信号が比較的低い箇所の距離により、核の局所的な厚さが測定される。
核の一面内での一走査を図4が示しているように、異なる面に対して同じ測定を行うことにより、これら1−D走査を三次元まで広げて核の全形を得ることができる。異なる座標(xy)で、核の局所的な厚さがz方向において測定される。このように、種々の面の異なる1−D画像から3−D画像を再構築することにより、核の外見を再構築して、核の容積を算出することができる。
このように、細胞核紫外線吸光度の測定値は、本発明によると、核内の紫外線吸光度信号を較正すること、及び、核の容積を決定することにより得られる。較正には、細胞核内の領域の紫外線吸光度対細胞核外の領域に対する吸光度の比が一つの面に対して考慮されることになる。
次に、核の容積の決定は、核の各面に対して得られた、較正された紫外線吸光度を加算することにより得られる。
この全ては、約240nmから約280nmという波長の紫外線を用いた共焦点レーザ走査顕微鏡法を使用して行われることが好ましい。特に好ましい実施形態では、約250nm、255nm、又は260nmという波長を有した紫外線が使用される。
このように、核の異なる面に対して共焦点走査顕微鏡を用いて紫外線吸光度を決定することにより、細胞核による紫外線の吸収作用を決定することが可能である。細胞核により吸収された光の量とDNAの量は比例するため、DNAイメージサイトメトリーに必要とされているように、核におけるDNAの量を決定することができる。
細胞核吸収信号と細胞核内のDNAの量を相関させることは、例えばハーディー(Hardie)等(The Journal of Histochemistry and Cytochemistry(2002),50(6),735−749、以下も参照)により記載されたスタンダードなDNAイメージサイトロジー手順に従って行うことができる。
細胞核の紫外線の吸収作用が決定及び測定され、この工程がいくつかの細胞に対して繰り返されると、例えば、種々の細胞に含有されるDNAの量に対する統計を算出することができる。これらの統計から、古典的なDNAイメージサイトメトリーにおいて一般的に行われるように、組織の癌性又は非癌性の状態に関する結論を引きだすことができる。
当業者は、当然ながら、紫外線吸光度信号を記録する方法、並びに、これらの信号を使用して、例えば細胞核の画像を算出する方法に精通している。
信号強度、すなわち吸収又は透過された光の量の決定は、これらの目的に対して一般的に使用される機器を用いて行われる。
従って、例えば、前述の光源を用いて励起された場合にその細胞を見るために使用される顕微鏡の口径につながれた電荷結合素子又はデジタルカメラを使用することができる。当然ながら、フィルム等も使用することができる。
発光スペクトルが総合感度のスペクトル範囲内にある場合、蛍光の測定は、いかなる標準的な(バリアフィルター、励起フィルター、及びダイクロイックミラーからなる)フィルターキューブ、又は、特別な用途に対してカスタマイズされたいかなるフィルターキューブを用いても行うことができる。暗視野顕微鏡法及び位相差顕微鏡法等のいかなる標準的な空間フィルタリング方法と共にスペクトルバイオイメージングを使用することもでき、さらには、偏向顕微鏡法と共に使用することさえもできる。
検出装置は、例えば、BQ6000フレームグラバーボードを介してコンピュータに接続されたOptronics DEI−700 CE three−chip CCDカメラであり得る。或いは、Hitachi HV−C20 three−chip CCDカメラを使用することができる。画像分析用ソフトウェアパッケージは、例えば、Bioquant True Color Windows(登録商標) 98 v3.50.6 画像分析ソフトウェアパッケージ(R&M Biometrics社,Nashville,TN)、又は、Image−Pro Plus 3.0画像分析ソフトウェアであり得る。使用することができる別のシステムは、デュアル・モードに基づいたBioView Duet system(BioView Ltd社,Rehovot,Israel)、全自動の顕微鏡(Axioplan 2,Carl Zeiss社,Jena,Germany)、XY電動8スライドステージ(Marzhauser社,Wetzler,Germany)、3CCDプログレッシブスキャンカラーカメラ(DXC9000,Sony社,Tokyo,Japan)、並びに、システムの制御及びデータの分析用コンピュータである。
DNA含有量の算出、及び、細胞の癌性又は非癌性の状態に対するDNA含有量の相関がより詳細に記述される前に、本発明のさらなる実施形態が記述される。これらの実施形態は種々の例を与えており、その技術及び方法を使用して、生体組織の細胞における核を限局化し、そのような核による紫外線の吸収作用を測定することができる。
一実施形態において、細胞核の限局化並びに細胞核紫外線吸収作用の測定は、共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて行うことができる。
この実施形態では、共焦点顕微鏡は例えば内視鏡装置内に統合される。この装置は、さらに、光記録装置との類似点を有している。アクチュエータを使用して、関心のある組織上で共焦点顕微鏡を走査させる。第一の粗い走査を使用して形態を決定する。この選別から関心のある核は同定される。後に、核における細胞核紫外線吸収作用の測定、従って、DNAサイトメトリー測定が上記のように行われる。
このように、一実施形態において本発明は、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をin vivoで決定するための、共焦点レーザ走査顕微鏡法光学装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をin vivoで同定するための、共焦点レーザ走査顕微鏡法光学装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。前記装置は、例えば国際公開WO02/073246号、米国特許第2005/0036667号、及び、国際公開WO2004/113962 A2号に記載されたもの等の内視鏡装置に組み込まれる小型の共焦点レーザ走査顕微鏡法装置であり得る。
別の実施形態では、組織の形態は、内視鏡の先端で統合されている顕微鏡である共焦点レーザ内視鏡により決定することができる。好ましい実施形態において共焦点レーザ内視鏡は、紫外線で作動させることができる。国際公開WO02/073246号に記載されたもの等の共焦点レーザ内視鏡が、細胞核を限局化するために使用されるであろう。次に、走査型共焦点顕微鏡法を用いてDNAサイトメトリー測定を行うことができる。共焦点レーザ内視鏡を追加することにおける利点は、共焦点顕微鏡法に対して走査が必要ではなく、細胞の形態の画像をリアルタイムで得ることができるということである。
一実施形態において本発明は、従って、国際公開WO02/073246号に記載されたもの等、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をin vivoで決定するための紫外線及び共焦点レーザ走査顕微鏡法で作動させることができる共焦点レーザ内視鏡のための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をin vivoで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
このリアルタイムイメージングの結果として、細胞核紫外線吸収作用を決定するための共焦点顕微鏡を用いた核走査は非常に正確に行うことができる。当然ながら、使用される、核紫外線吸収作用の測定のための共焦点顕微鏡は、同じ核が測定されるのを確実にするために共焦点レーザ内視鏡と一列に並べなければならないであろう。
第三の実施形態において、核の形態、従って限局化は、光コヒーレンス断層撮影法により決定され、走査型共焦点顕微鏡法が核探索、従って細胞核紫外線吸収作用の測定を行う。これら2つの異なる方法が核の限局化及び細胞核吸光度の決定に使用される場合、DNAサイトメトリーの精度は上がる。
一実施形態において本発明は、従って、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をin vivoで決定するために光コヒーレンス断層撮影法及び共焦点レーザ走査顕微鏡法のための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をin vivoで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
第四の実施形態では、100MHzを超えるトランスデューサーが、高分解能超音波を使用して組織内の核の限局化を決定する。これらの条件のもと、組織内の細胞を分解することができる分解能を得ることが可能になる。核走査及び細胞核紫外線吸収作用の測定は、ここでも共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて行うことができる。
一実施形態において本発明は、従って、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をin vivoで決定するために高分解能超音波の利用及び共焦点レーザ走査顕微鏡法のための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をin vivoで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
第五の実施形態において、細胞核の形態、従って限局化は、上記の方法により、従って、例えばレーザ走査顕微鏡法により、共焦点レーザ内視鏡により、光コヒーレンス断層撮影法により、及び高分解能超音波により達成することができる。しかし、細胞核の紫外線の吸収作用を測定することは、共焦点走査顕微鏡法を用いて行われず、2光子イメージング処理において行われる。
一実施形態において本発明は、従って、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をin vivoで決定するために、共焦点レーザ走査顕微鏡法、共焦点レーザ内視鏡、光コヒーレンス断層撮影法、及び/又は高分解能超音波、並びに、2光子イメージングのための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をin vivoで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
2光子イメージング処理の場合、レーザービームが関心のある細胞に焦点を合わせられる。検出モジュールは、2光子吸収により誘起された蛍光を検出する。そのような場合、DNAの自己蛍光に依拠しなければならない。2光子イメージングテクノロジーを使用する場合、原則共焦点レーザ走査顕微鏡法に対して記述されたのと同じ機構を実行することができる。しかし、この時点では2光子吸収により生じた蛍光を探しているため、検出器の前にフィルターが配置されて、2光子蛍光とは異なる波長を有したいかなる光も取り除かれる。この方法を使用して、DNAサイトメトリーの精度を上げることができる。
上記の実施形態の大多数において、調査される組織の形態を同定する、従って前記組織の細胞内の核を限局化するという第一のステップは、細胞核紫外線吸収作用を測定するために、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて、いくぶん粗い走査を行い、続いて精密な走査を行うことにより達成された。しかし、共焦点レーザ走査顕微鏡法を使用して、細胞核を限局化し、細胞核の吸収作用を測定する高分解能走査をたった1回行うことも可能である。
例えばin vivoでのリアルタイムの癌検出を可能にするために、上記の方法をヒト又は動物の対象におけるin vivoでのDNAサイトメトリー測定に使用することができる。前記の方法は、従って、例えば皮膚癌、口腔、肺、喉頭、甲状腺、及び子宮頸部等の粘膜表面の癌の検出に適用することができる。内視鏡法等の最小限の侵襲的手法が適用された場合、前記方法を使用して内部の癌を検出することもできる。
本発明による方法はリアルタイムでの癌性の細胞の検出を可能にするため、DNAイメージサイトメトリーは、単離された細胞集団に対するDNAイメージサイトメトリーに主に依拠する既知の方法と比較して有意に早められる。
以下において説明されるように、ただ細胞核の吸光度、すなわち細胞核により吸収された紫外線を考慮することにより、本発明による方法は、迅速で正確な細胞核内にある細胞核の核酸の量の決定を可能にする。
大抵の哺乳動物細胞が各2対の染色体を含んでいることは常識である。従って、染色体の数は、nを染色体の数として2nで算出することができる。しかし、細胞は複製する時、娘細胞への染色体の分離が起こる前に染色体の数を2倍にする。
従って、DNA複製中及び細胞***の前に、哺乳動物細胞は、ここでもnを染色体の数として4nで算出することができる多数の染色体を含む。
哺乳動物細胞のDNA量が染色体の数に参照された場合、「健康な」又は「正常な」細胞と呼ぶこともできる非癌性の細胞のDNA含有量には、従って、細胞の複製状態に応じて2又は4の価を割り当てることができる。
本発明の状況において「倍数性」という用語は、正常で非癌性の細胞のDNA含有量を意味し、説明されたように、2及び4の価を有することができる。
例えば前述されたフォイルゲン染色法を使用することによる非癌性の細胞の倍数性状態の決め方も当技術分野では常識である。この状況においては、ハーディー(Hardie)等の刊行物(The Journal of Histochemistry&Cytochemistry(2002),50(6),735−749)を、DNA染色法を用いた細胞のDNA含有量の決定を記載している限り援用する。
ハーディー等による参考文献の738頁にある“Image Analysis Densitometry”という項において、例えばフォイルゲン染色法又は蛍光マーカーにより得られた信号強度をどのようにして濃度測定値に変換することができるかが説明されている。同じことが、本発明による方法によって測定された吸収信号に適用されるはずである。上記において説明されたように、健康で非癌性の細胞は、nを染色体の数として、2n又は4nの染色体を含む。従って、本発明において使用されたフォイルゲン染色法又は吸収信号から得られた信号強度の濃度測定分析は、2つのピーク領域を有した濃度プロファイルを生じる。
これら2つのピーク領域には、2又は4の価がそれぞれ割り当てられる。そのような濃度プロファイルの例が図1に提供されている。特定の場合において、非増殖の細胞を分析し、なぜ4に対応するピークがないのかを説明した。
手短に言えば、画像分析デンシトメトリーに対して、細胞を目視するため及び吸収信号を測定するために使用される顕微鏡視野は、コンピュータに接続された、顕微鏡に取り付けられたCCD(電荷結合素子)検出装置又はデジタルカメラにより捕らえられる。デジタル化された画像の写真は、一連のピクセルとして記録され、各ピクセルには特有の色及び彩度が割り当てられる。次に、前記彩度は、一般的にコンピュータベースのアルゴリズムによって吸光度に変換され、次に、前述のデンシトグラムとして画像分析ソフトウェアにより表示される。
当然ながら、正常で非癌性の細胞における、意義があり信頼できるデンシトグラムは、好ましくは数多くの細胞からなる集団から算出するべきであり、25〜100という多数の細胞が一般的には十分であるということに当業者は気づいている。従って、本発明の好ましい実施形態において細胞核DNAの量は、上記のように少なくとも約30、40、50、又は60個の細胞の細胞核紫外線吸光度を測定することにより決定される。
本発明による上記の方法を用いて推測上癌性の細胞の細胞核DNA含有量又は倍数性状態を決定することにより、癌性の細胞の存在における決定を達成することができる。決定された倍数性状態は、次に、同一の方法により得られた細胞核の吸収強度から決定された非癌性の細胞の倍数性状態と比較される。本発明の一実施形態において、これら全ての計算はヒト又は動物の体外で行うことができる。
従って、推測上癌性の細胞が実際に癌になりやすい細胞かどうかを決定するために、上記のようにデンシトグラムが決定される。非癌性の細胞に対して観察されたデンシトグラムは、「標準」又は「参照」デンシトグラムと呼ばれる。
好ましくは、そのような参照デンシトグラムは癌性の細胞を検出するのと同じ方法を用いて測定されるが、非癌性の細胞のみが使用されることが確実にされる。これは、同じ個体の細胞だが、癌性であると思われる組織部位ではない他の組織部位由来の細胞を使用することにより達成することができる。或いは、又は、さらに、同じ組織から、形態が非癌性の状態を示す同一若しくは類似の細胞型を使用することができる。好ましくは類似の細胞型を、非癌性であると保証されている限り使用するべきである。標準デンシトグラムを得るために調査されることになる細胞の数及び細胞型は、当業者の知識内のもので十分であり、25から100個の細胞までさまざまで、好ましくは、約30、40、50、又は60個の細胞である。
従って、本発明の目的に対して「類似の細胞型」という用語は、疑われた癌性の細胞と類似の由来で類似の細胞特徴を有した細胞型に関している。例えば、粘膜の細胞が癌発生に対して検査される場合、標準対照細胞も粘膜由来のものであるべきである。一方、リンパ系細胞が癌発生に対して検査される場合、標準対照細胞も、類似の細胞型であるためにリンパ由来のものであるべきである。
非癌性であると知られ、推測上癌性の細胞に対して得られた細胞核紫外線吸光度の標準対照として使用される類似の細胞型の細胞核紫外線吸光度は、同一の条件下ではない場合、可能であれば、非常に類似の条件下で測定されるべきである。
推測上癌性の組織において十分な数の細胞核が分析された場合、2及び4に対応するピークの「広がり」、並びに、追加のピークの発生は、すでに癌の発生を示している場合がある。
特定の細胞に対して、前述された2又は4の価からはずれた倍数性状態が決定された場合、これは、実質的な複製、挿入、欠失、又は、染色体再構築を示し、従って、癌性の細胞を示している。この場合のように、そのような細胞の倍数性状態は2及び4の価からはずれており、異数性状態も表している。このことは、当然ながら、正常な状態においてでさえも一般的に増殖性である細胞型が考慮されていると仮定している。
このように、非増殖性であると通常知られる細胞を検査する場合、4という倍数性の価は、癌発生を示している場合がある。
正常な状態において増殖性であると知られる細胞が検査された場合、4の価は癌発生を示しているとはみなされない。この場合、2及び/又は4の価からの偏差のみが癌発生を示すことになる。
本発明の状況における「異数性状態」という用語は、従って、細胞内の細胞核DNAの異常量に関している。
当然ながら、細胞核紫外線吸光度、従って、推測上癌性の細胞のデンシトグラムは細胞の集団からも算出され、一般的に約100から700個、好ましくは約100から300個の細胞が測定される。
例えば、肝組織由来の癌性の細胞が検査される場合、2及び/又は4の価が割り当てられた2つの主なピークを有したデンシトグラムを得ることができる。しかし、非癌性の細胞の場合以外では、前記2つの主なピークのデンシトグラムはそれほど鋭く細くないが、いくぶん広い。さらに、2未満、2を越える、4未満、及び4を越えるデンシトグラムにおけるピーク及び信号が観察される。例が図2に提供されている。
いかなる試料においても過半数の細胞が2というDNA含有量を有するはずであるため、その過半数からの偏差も異常又は不審であるとみなすことができる。正常な細胞が少数である癌性試料の事象においても、試料を不審であるとラベルするために使用することができるDNA含有量における大きな変動が依然として存在する。
従って、上記のように本発明により得られる細胞核紫外線吸光度を基準として算出されるデンシトグラムが2価(及び、正常状態において増殖性である細胞の場合は4価)に対応するピーク外でピーク信号を示す場合、細胞は癌性と評価される。
しかし、2(及び4)の価に対応するピークがいくぶん広い曲度を示す場合、そのピーク自体が細胞の癌の可能性を示すことができる。2(及び4)価に対応するピークの形状を考慮してデンシトグラムが実際に癌の発生を示しているかどうかを決めるために、推測上癌性の細胞試料のデンシトグラムが上記の標準又は参照デンシトグラムと重ねられる。
標準デンシトグラムの2価及び4価を示しているデンシトグラムのピークにおける曲線下の面積(AUC)は非癌性の細胞を示していると解され、推測上癌性の細胞のデンシトグラムの対応するピークのAUCにおける少なくとも10%のいかなる偏差も癌性の細胞又は状態を示しているとみなされる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は、少なくとも50%である。
細胞が正常又は癌性であるとみなされる場合について詳細に説明されている、ハロスク(Haroske)等の刊行物“1997 ESACP consensus report on diagnostic DNA image cytometry”, Analytical Cellular Pathology 17(1998)189−200に明記された基準も適用することができる。
このように、類似の非癌性の細胞型に対して得られた細胞核紫外線吸光度と比較した不審な癌性の細胞の細胞核紫外線吸光度の有意な偏差は、進行中の癌発生又は今後起こりそうな癌発生を示している。
本発明の目的に対して、不審な癌性の細胞の倍数性状態が、2(又は4)という倍数性の価から少なくとも10%はずれている場合、DNA含有量における有意な異常は、癌発生を示しているとみなされる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は、少なくとも50%である。デンシトグラムにおけるピークには、該ピークのうち、参照デンシトグラムにおいて対応するピークと同一の部分に対して2価又は4価が割り当てられる。
慣習によると、参照デンシトグラムの2価のピークに対応するピークが1.8から2.2に及ぶ場合、細胞のDNA含有量は近二倍体(peridiploid)と呼ぶことができる。
参照デンシトグラムの4価のピークに対応するピークが3.6から4.4に及ぶ場合、細胞のDNA含有量は近四倍体(peritetraploid)であるとみなされる。
これらの範囲外にある価はどれも、X倍体(X−ploid)とみなされる。
近二倍体、近四倍体、及びX倍体の価を有した細胞及び組織は、本発明の目的に対して癌性の細胞とみなされる。
このように、本発明の方法に従い得られた推測上癌性の細胞に対する細胞核紫外線吸光度を、同じ方法を用いた、非癌性であると知られる類似の細胞型に対する細胞核紫外線吸光度と参照させることによって推測上癌性の細胞の倍数性(異数性)状態を算出するために、上記の方法を使用することができる。
本発明の目的に対して、「非癌性の」という用語は、癌発生の徴候を示していないとして知られる細胞を意味している。
本発明の一実施形態において、癌性の細胞は、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけることができる。
本発明の別の実施形態では、ヒト又は動物の対象においてin vivoで癌を診断及び/又は予測する方法が提供され、当該方法は:
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外線の吸収作用を測定するステップ;
(c)ステップ(b)で決定した前記核の紫外線吸収作用を、同じくステップ(a)から(b)を使用して得られた非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量を決定するステップ;
(d)前記細胞核の核酸の量に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ;
を含む。
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外線の吸収作用を測定するステップ;
(c)ステップ(b)で決定した前記核の紫外線吸収作用を、同じくステップ(a)から(b)を使用して得られた非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量を決定するステップ;
(d)前記細胞核の核酸の量に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ;
を含む。
ステップ(c)では、ヒト又は動物の体外で比較を行うことができる。
ステップ(a)から(c)は、上記の細胞核の核酸の量をヒト又は動物の対象においてin vivoで決定する方法のように行うことができる。
従って、ステップ(b)には、約240nmから約280nmという波長の紫外線を使用することが好ましい。特に好ましいのは、約250nm、255nm、又は260nmという波長の紫外線であり得る。核の限局化が紫外線を用いて行われる場合、同じことがステップ(a)に適用される。このように、1つの好ましい実施形態において、ステップ(a)及び(b)に、上記の波長の紫外線が使用される。
当然ながら、推測上癌性の細胞に対するデンシトグラム、及び、参照又は標準デンシトグラムの決定に関する上記の説明、「癌性の細胞」、「非癌性の細胞」、「倍数性」、「異数性」、「近二倍体」、「近四倍体」、「X倍体」、「AUC」等の用語の意味は、本発明によるin vivoでの癌を診断及び/又は予防する方法の状況において等しく適用される。
上記でステップ(d)と呼ばれた最後のステップでは、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生が、検査中の細胞の細胞核DNA含有量又は倍数性状態に応じて決定される。
推測上癌性の細胞に対して決定された細胞核DNA含有量又は倍数性の価が、非癌性であると知られる、非常に類似の条件下若しくは同一の条件下で細胞核紫外線吸光度が測定された類似の細胞型の細胞核DNA含有量又は2(及び4)という倍数性の価から少なくとも10%はずれている場合、癌の診断は陽性であると考えることができる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は、少なくとも50%である。
標準デンシトグラムの2(及び4)価を示しているピークの曲線下の面積(AUC)は非癌性の細胞を示していると解され、推測上癌性の細胞のデンシトグラムの対応するピークのAUCにおける少なくとも10%のいかなる偏差も癌性の細胞を示しているとみなされ、従って、陽性の診断をもたらす。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は、少なくとも50%である。
慣習によると、参照デンシトグラムの2価のピークに対応するピークが1.8から2.2に及ぶ場合、細胞のDNA含有量は近二倍体と呼ばれる。
参照デンシトグラムの4価のピークに対応するピークが3.6から4.4に及ぶ場合、細胞のDNA含有量は近四倍体であるとみなされる。
これらの範囲外にある価はどれも、X倍体とみなされる。
近二倍体、近四倍体、又はX倍体と評価されたいかなる細胞又は組織も癌性の細胞とみなされ、陽性の診断が下される。
癌を診断及び/又は予測する方法を使用して、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌を診断及び/又は予測することができる。
Claims (11)
- ヒト又は動物の対象の少なくとも1つの細胞における細胞核の核酸の量をin vivoで決定する方法であって:
(a)ヒト又は動物の対象においてin vivoで前記少なくとも1つの細胞の核を限局化するステップ;
(b)in vivoで、前記核による紫外(UV)線の吸収作用を測定するステップ;
を含む方法。 - ヒト又は動物の対象における少なくとも1つの推測上癌性の細胞を検出するために使用される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載のステップ(b)で決定された前記核の紫外線吸収作用を、同じく請求項1に記載のステップ(a)から(b)を使用して得られた少なくとも1つの非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量が決定される、請求項2に記載の方法。
- 倍数性状態又は細胞核DNA含有量における、2価から少なくとも10%はずれた偏差が、癌性の細胞を示している、請求項3に記載の方法。
- 1.8から2.2という倍数性状態又は細胞核DNA含有量が近二倍体の状態を示し、3.6から4.4という倍数性状態又は細胞核DNA含有量が近四倍体の状態を示し、さらに、1.8から2.2及び3.6から4.4という範囲外にある倍数性状態又は細胞核DNA含有量がX倍体の状態を示している、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの癌性の細胞が、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる、請求項2に記載の方法。
- ステップ(a)における前記核の限局化が、共焦点レーザ走査顕微鏡法、2光子イメージング、走査型光コヒーレンス断層撮影法、高分解能の超音波、又は、UV内視顕微鏡法を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)における前記核による紫外線吸収作用の測定が、共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記紫外線が、約240nmから約280nm、好ましくは250nm、255nm、又は260nmという波長を有する、請求項8に記載の方法。
- ヒト又は動物の対象の少なくとも1つの細胞における細胞核の核酸の量をin vivoで決定する装置の使用であって、
(a)請求項1に記載のステップ(a)を行うための、共焦点レーザ走査顕微鏡法、内視顕微鏡法、光コヒーレンス断層撮影法、及び/又は、高プロファイルの超音波の利用;及び
(b)請求項1に記載のステップ(b)を行うための、共焦点レーザ走査顕微鏡法、及び/又は、2光子イメージング;
のための機器を含む装置の使用。 - 共焦点レーザ走査顕微鏡法のための機器を含んだ、ステップ(a)もステップ(b)も行うための装置の、請求項10に記載の使用。
Applications Claiming Priority (2)
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EP06118437 | 2006-08-04 | ||
PCT/IB2007/052764 WO2008015599A2 (en) | 2006-08-04 | 2007-07-11 | A method of in vivio detection and/or diagnosis of cancer using fluorescence based dna image cytometry |
Publications (1)
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