JP2009543582A - 一般化された方法―特異的な配列補完(dsf)により可能になる連続的アダプター連結および増幅を用いたハイスループット突然変異スクリーニング法およびキット - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
注1:*は922の位置のヌクレオチドの「G」のうしろにGATTAを挿入することを意味する
注2:WT:野生型
注3:各変異体におけるヌクレオチドの配列の変化(下線)と関与するコドンおよび予想されるアミノ酸の変化(上線)を示す
Claims (18)
- ヘテロ二本鎖分子が試験対象と成るリボ核酸(RNA)鎖の一方と5‘側オーバーハング(好ましくは少なくとも1つのデオキシチミジン「デオキシ-T」を持つオーバーハング)が埋め込まれたアンチセンスデオキシリボ核酸(DNA)プローブ鎖の一方を含むことと、第1母集団として前記試料が標的領域内部に完全なハイブリダイゼーションを受けた野生型ヘテロ二本鎖と、第2母集団として1つの標的領域内部にハイブリダイゼーションされていない少なくとも1種類のリボヌクレオチドを持つ変異体ヘテロ二本鎖と、第3母集団として1つの標的領域内部にハイブリダイゼーションされていない多数のリボヌクレオチドの少なくとも1つのストレッチを持つ相同性ヘテロ二本鎖とを含んでいることと、前記リボヌクレアーゼ酵素がハイブリダイゼーションされていないリボヌクレオチドを切り出し、各目的RNAの3’末端などの消化部位で3‘ヒドロキシ基に接触させることとを特徴とする、多数の多様な遺伝子領域とリボヌクレアーゼ酵素を含む少なくとも1種類のヘテロ二本鎖分子試料をインキュベートするステップと、
単一の基質として4種類のdNTPの1種類(好ましくはdATPを使用)を用いて前記RNA:DNAヘテロ二本鎖のセンス鎖上に3‘側一ヌクレオチドオーバーハングを、鋳型として前記アンチセンスDNAプローブの5’オーバーハングを作製するため、RNAプライマーを用いたDNAポリメラーゼにより各目的RNAの前記3‘末端から配列を伸長させるステップと、
RNA:DNAヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドを形成するため、ブロッキング・アダプターと前記RNA:DNAヘテロ二本鎖の前記3‘一ヌクレオチドオーバーハングとを連結させるステップと、
4種類の反応において4種類のdNTP(dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP)のいずれか(または2種類の反応において4種類のdNTP中の2種類)を用いてRNAプライマーを用いたDNAポリメラーゼによりニックしたリボヌクレオチド部位における特異的な配列補完(DSF)ステップと、
相同性ヘテロ二本鎖および相補dNTPにより補完されていない変異体ヘテロ二本鎖における保護されていないデオキシリボヌクレオチドを消化し、相補dNTPにより補完された完全に保護された野生型ヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドおよび変異体ヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドを使わずにすませるため、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いてインキュベートするステップと、
完全長配列拡張が実行され、前記完全に保護された変異体ヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッド上の遊離3‘‐ヒドロキシル基を持つ新たな3‘側一塩基「デオキシ‐A」オーバーハングが作製され、野生型ヘテロ二本鎖では前記ブロッキング・アダプターにより遮断されたままとなり、部分的に保護されたヘテロ二本鎖が断片化されるため、DNA依存DNAポリメラーゼと4種類全てのdNTPによりインキュベートするステップと、
特徴的な変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドを形成するため、標識レポーター・アダプターと前記新たに作製された3‘側一塩基「デオキシ‐A」オーバーハングとを連結させるステップと、
前記特徴的な変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドまたは二本鎖アダプター連結産物を検出するステップとを含む、
多数の多様な試料中の多数の多様な遺伝子の遺伝子変異に対する同時スクリーニングの、方法。 - 前記アンチセンスDNAプローブに別のデオキシリボヌクレオチドが埋め込まれておらず、平滑末端連結反応により前記RNA:DNAヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドが形成されるため、前記ブロッキング・アダプターとRNA:DNAヘテロ二本鎖を連結させる前にRNAプライマーを用いたDNA配列の伸長が不要になることを特徴とする、請求項1の方法。
- ブロッキング・アダプターを用いずに変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの前記形成により突然変異を検出することと、RNA試料とアンチセンスDNAプローブによるハイブリダイゼーションステップ、RNA:DNAヘテロ二本鎖のリボヌクレアーゼ消化ステップ、DSF反応ステップ、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化ステップ、4種類全てのdNTPによる完全長配列の伸長ステップ、および標識レポーターとの連結ステップとを連続的に利用することにより突然変異を検出し得ることとを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記ステップの一部または全てを固相培地上で実施することを特徴とする、請求項1〜請求項3の方法。
- 前記アンチセンスDNAプローブが基質上に固定されていることと、前記プローブのいずれか、あるいは前記プローブの組み合わせが前記基質上の固有の位置に存在することとを特徴とする、請求項1〜請求項3の方法。
- 前記アンチセンスDNAプローブが基質上に固定されていることと、前記プローブが混合物として混合され、前記基質上の不特定の位置に存在し得ることとを特徴とする、請求項1〜請求項3の方法。
- 前記RNA試料が基質上に固定されていることを特徴とする、請求項1〜請求項3の方法。
- 組織片または細胞調製品が基質上に固定されていることを特徴とする、請求項1〜請求項3の方法。
- 前記レポーター・アダプターが検出/定量化/増幅可能な分子または基質を含むことと、前記検出ステップが前記特徴的なレポーター・アダプター、前記特徴的な変異体‐二本鎖アダプター連結産物、または前記変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドを同定/定量化/増幅することを含むこととを特徴とする、請求項1〜請求項8の方法。
- 前記ブロッキング・アダプターが検出/定量化/増幅可能な分子または基質を含むことと、前記検出ステップが野生型、相同型、および変異体型のハイブリッドなどの前記特徴的なRNA:DNAヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドを同定/定量化/増幅することを含むことを特徴とする、請求項1、請求項2、および請求項4〜請求項7の方法。
- 別のアダプター5’と前記変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドまたは前記変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの連結により、あらゆる起源の変異体を検出、定量化、および/または増幅するための共有するフランキング配列を作製する前記ステップをさらに含む、請求項1〜請求項10の方法。
- 前記変異体‐二本鎖アダプターハイブリッド、変異体‐三本鎖アダプターハイブリッド、または前記変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの部分長または完全長配列を増幅する前記ステップをさらに含む、請求項1〜請求項11の方法。
- 前記配列増幅ステップがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、リアルタイムPCR増幅、リガーゼ連鎖反応(LCR)増幅、核酸増幅法(TMA)、または転写増幅後のPCRを含むことを特徴とする、請求項12の方法。
- 前記変異体‐二本鎖アダプターハイブリッド、変異体‐三本鎖アダプターハイブリッド、または変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドのDNAまたはRNA塩基配列決定ステップをさらに含む、請求項12および請求項13の方法。
- 前記RNA試料が、あらゆる供給源由来の細胞、液体、組織,臓器、微生物から単離されることを特徴とする、請求項1〜請求項14の方法。
- 前記RNA試料が、TMA産物またはPCR産物のin vitroRNA転写産物であることを特徴とする、請求項1〜請求項14の方法。
- 遺伝子変異スクリーニングのために請求項1〜請求項16に記載の方法を実施するキット又はキット一式であって,
前記DNAプローブのいずれかが固有の遺伝子領域を含むことと、前記DNAプローブのいずれかが、基質上の固有の位置での固定の有無を問わず、個別あるいは混合物として提供されることを特徴とする1つまたは複数のアンチセンスDNAプローブと、
必要とされる試薬の一部または全てと、請求項1〜請求項16に記載の方法を実施するためのアダプターと、
請求項1〜請求項16に記載の方法を実施するための指示からなるユーザーズガイドとを備える、
キットまたはキット一式。 - 前記多数の多様なアンチセンスプローブの目的配列が、疾患、疾患のサブタイプ、疾患の状態、病的状態、細胞性機能、細胞性機能経路、またはこれらの組み合わせと関連のある遺伝子、マーカー、または微生物から選択されることを特徴とする、請求項17のキット。
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