JP2009538611A - Chymotrypsin obtained from Lucilia sericata larvae and its use for the treatment of wounds - Google Patents

Abstract

幼虫の酵素、特にキモトリプシンの使用が本明細書に記載されている。創傷郭清のための及び細胞再生のための創傷の治療において、この酵素を使用することができる。  The use of larval enzymes, particularly chymotrypsin, is described herein. This enzyme can be used in the treatment of wounds for wound dissection and for cell regeneration.

Description

本発明は、幼虫の酵素に関する。より具体的には、本発明は、ルシリア・セリカータ（Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｅｒｉｃａｔａ）から取得することができる１つ又はそれ以上の幼虫の酵素に関し、該酵素は組織再生及び創傷治癒において有用である。   The present invention relates to larval enzymes. More specifically, the present invention relates to one or more larval enzymes that can be obtained from Lucilia sericata, which enzymes are useful in tissue regeneration and wound healing.

幾つかの創傷の幼虫の繁殖の有益な効果が長年にわたって観察されてきた。しかしながら、感染の抗生物質耐性株の蔓延が、医学、特に創傷治癒の分野において問題となるまで、このプロセスに関与する機序についてのさらなる調査は実施されなかった。   The beneficial effects of larval propagation in several wounds have been observed over the years. However, no further investigation was conducted on the mechanisms involved in this process until the spread of infectious antibiotic-resistant strains became a problem in the field of medicine, particularly wound healing.

以前の研究は、旧来の抗生物質への添加物又は補助剤としての、創傷郭清（創傷から壊死性物質、被感染物質又は外来物質を除去すること）、感染管理（感染の予防又は治療）における幼虫の酵素の役割、より最近では、創傷中の新しい組織を増殖させ、創傷を閉じさせる（治癒）ための組織の再生の促進における幼虫の役割を観察してきた。使用される幼虫の酵素は、予め幼虫を洗浄して又は洗浄せずに、完全な幼虫の血リンパから又はホモジネートから、幼虫の表面上に見出されるあらゆる排出産物又は分泌産物を除去するために、幼虫を洗浄することによって取得し得る。以前の研究は、無菌又は非無菌条件で幼虫を育てることの効果、幼虫のホモジネート、血リンパ又は***／分泌を使用することの効果及び幼虫の年齢（新たに孵化した、又は第一若しくは第二齢）の効果についても調査した。これらの要因の全ては、幼虫から得られた産物の性質又は活性に影響を与えることが見出されている。   Previous studies have shown wound dissection (removing necrotic, infected or foreign substances from wounds), infection control (prevention or treatment of infection) as an additive or adjunct to traditional antibiotics We have observed the role of larval enzymes in, and more recently the role of larvae in promoting the regeneration of tissue to grow new tissues in the wound and to close the wound (healing). The larval enzyme used is to remove any excretory or secreted products found on the surface of the larva, either from the complete larval hemolymph or from the homogenate, with or without pre-washing the larvae. It can be obtained by washing the larvae. Previous studies have shown that the effects of growing larvae under aseptic or non-sterile conditions, the effect of using larvae homogenate, haemolymph or excretion / secretion, and the age of the larvae (newly hatched or first or second) The effect of age was also investigated. All of these factors have been found to affect the nature or activity of products obtained from larvae.

本発明者らは、最近、組織増殖を促進することによって創傷の閉鎖を促進する幼虫の産物の成分である幼虫の産物、特に酵素の創傷治癒特性に焦点を当ててきた。驚くべきことに、本発明者らは、ルシリア・セリカータの幼虫の***物／分泌物（表面洗浄）中に見出される１つ又はそれ以上のキモトリプシン酵素が組織形成において重大な役割を果たしていることを見出した。このような酵素は、通常、組織の破壊に関連している。   The inventors have recently focused on the larval product, particularly the enzyme's wound healing properties, which are components of the larval product that promote wound closure by promoting tissue growth. Surprisingly, the inventors have shown that one or more chymotrypsin enzymes found in the larval excretion / secretion (surface wash) of Lucilia sericata play a critical role in tissue formation. I found it. Such enzymes are usually associated with tissue destruction.

従って、本発明は、昆虫の幼虫由来の単離されたキモトリプシン又はその類縁体若しくは合成様式を提供する。   Accordingly, the present invention provides an isolated chymotrypsin from an insect larva or an analog or synthetic mode thereof.

有利なことに、本発明のキモトリプシンは、プロテアーゼの予想される特性であり得る創傷郭清（壊死性物質、被感染物質又は外来物質の除去）において有用であるのみならず、繊維芽細胞の接着（すなわち、組織増殖）を促進する上でも有用である（これは、プロテアーゼ酵素に関しては、全く予想されない特性である。）という点で、相反する二重の特性を発揮することが示された。本発明のキモトリプシンは選択的な活性を有する。本発明のキモトリプシンは、創傷痂皮などの幾つかの組織を除去又は分解するが、健康な組織又は新たな組織など、全ての組織を除去又は分解するわけではない。このプロテアーゼ又は各プロテアーゼが、壊死性組織と健康な組織が分解されるルシリア・キュプリナによって引き起こされるハエ幼虫症で起こるような、種類に関わらずに組織を分解又は除去することが合理的に予想され得る。同じ酵素における創傷郭清と細胞増殖の促進という二重の特性は一般的でなく、これらの特性は相反することが予想されるので、当業者にとって驚くべきものである。   Advantageously, the chymotrypsin of the present invention is not only useful in wound dissection (removal of necrotic, infectious or foreign substances), which may be an expected property of proteases, but also fibroblast adhesion (I.e., tissue proliferation) is also useful (which is an unexpected property for protease enzymes) and has been shown to exhibit conflicting dual properties. The chymotrypsin of the present invention has selective activity. The chymotrypsin of the present invention removes or degrades some tissues, such as wound crusts, but does not remove or degrade all tissues, such as healthy tissue or new tissue. It is reasonably expected that this protease or each protease will degrade or remove tissue regardless of type, such as occurs in fly larvae caused by Lucilia cuprina, where necrotic and healthy tissues are degraded. obtain. The dual properties of wound dissection and promotion of cell growth in the same enzyme are not common and are surprising to those skilled in the art because these properties are expected to conflict.

本明細書において使用される「痂皮」という用語は、やけど、壊疽、潰瘍（特に、褥瘡）、感染（特に、真菌感染）、炭そ菌又は他の何れかの壊死性組織への後期曝露後のものなど、皮膚の表面から排出されたあらゆる死亡した組織を定義するものとする。   As used herein, the term “crust” refers to burns, gangrene, ulcers (especially pressure ulcers), infections (especially fungal infections), late exposure to anthrax or any other necrotic tissue. Define any dead tissue excreted from the surface of the skin, such as later.

昆虫は、好ましくは、クロバエ類であるルシリア・セリカータである。   The insect is preferably Lucylia sericata, which is a fly.

本発明のキモトリプシンは、好ましくは、昆虫の幼虫の***物／分泌物から取得され、又は取得可能である。しかしながら、同じ成分が血リンパ中に又はホモジネート中に存在し得、これらの採取源から取得できる可能性がある。キモトリプシンは、例えば、幼虫を洗浄し、洗浄媒体を集めることによって取得され得る。本発明者らは、昆虫の幼虫の***物／分泌物（ＥＳ）が、酵素、ホルモンなどを含む恒常的に発現される成分と誘導性成分の両方を含むことを以前に見出した。この理由のために、幼虫の増殖条件は一定に保たれることが好ましい。本発明の最も好ましい実施形態において、無菌条件中で増殖された新たに孵化した幼虫から***物／分泌物が収集され、使用される。   The chymotrypsin of the present invention is preferably obtained or obtainable from the excretion / secretion of insect larvae. However, the same components may be present in the hemolymph or in the homogenate and may be obtained from these sources. Chymotrypsin can be obtained, for example, by washing the larvae and collecting the washing medium. The inventors have previously found that insect larval feces / secretions (ES) contain both constitutively expressed and inducible components including enzymes, hormones, and the like. For this reason, it is preferable that the growth conditions of the larvae are kept constant. In the most preferred embodiment of the invention, excreta / secretions are collected and used from newly hatched larvae grown in aseptic conditions.

キモトリプシンは、図１、図２若しくは図１３中に示されている配列又は天然の若しくは完全なキモトリプシンの活性を保持する生物学的に活性なこれらのペプチド断片を有することが好ましく、図１、２及び１３中には、活性部位が特定されている。好ましくは、断片は図１、２及び１３に特定されている活性部位に対して、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするＤＮＡと高い相同性を有し、例えば、活性部位に対する相同性は少なくとも９０％、好ましくは９５％超、より好ましくは９９％の相同性であるべきである。理想的には、断片は、ペプチドの活性部位と同一性を有するべきであり、又はキモトリプシンのペプチド断片をコードするＤＮＡと同一性を有するべきである。関連するＤＮＡ配列が、図１、２及び１２に示されている。   The chymotrypsin preferably has the sequence shown in FIG. 1, FIG. 2 or FIG. 13 or a biologically active peptide fragment thereof that retains the activity of natural or complete chymotrypsin. And 13 indicate the active site. Preferably, the fragment has a high homology to the active site specified in FIGS. 1, 2 and 13 or to DNA encoding a peptide fragment of chymotrypsin, eg, at least 90% homology to the active site Should preferably be greater than 95%, more preferably 99% homology. Ideally, the fragment should have identity with the active site of the peptide or with the DNA encoding the peptide fragment of chymotrypsin. Related DNA sequences are shown in FIGS.

これらの配列のキモトリプシンは、組織再生特性及び創傷郭清活性を有するが、健康な組織又は生きた組織を分解又は消化せず、これは、ルシリア・キュプリナに由来するキモトリプシン（健康な組織又は生きた組織に対してさえ周知の組織分解特性を有する、ハエ幼虫症（組織変性性のプロセス）の原因因子）に対するその高い相同性に鑑みれば特に驚くべきである。この相同性は、図１及び２にも示されている。   Although these sequences of chymotrypsin have tissue regeneration properties and wound dissection activity, they do not degrade or digest healthy or living tissue, which is a chymotrypsin derived from Lucilia cuprina (healthy tissue or living tissue). It is particularly surprising in view of its high homology to fly larvae (causative factors of tissue degenerative processes), which have well-known tissue degradation properties even for tissues. This homology is also shown in FIGS.

本発明者らは、トリプシン様及びキモトリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するセリンプロテイナーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とともに温置した後に、ＥＳの組織再構築及び再生特性が喪失又は阻害されるが、トリプシン様セリンプロテイナーゼを阻害するに過ぎない４−（アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド（ＡＰＭＳＦ）との温置後には喪失／阻害されないことを見出した。   We lose or inhibit the tissue remodeling and regeneration properties of ES after incubation with phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), a serine proteinase inhibitor that inhibits trypsin-like and chymotrypsin-like serine proteinases Was not lost / inhibited after incubation with 4- (amidinophenyl) methanesulfonyl fluoride (APMSF), which only inhibits trypsin-like serine proteinase.

従って、細胞外マトリックスの再構築又は組織再構築及び組織再生活性に必要なＥＳの重要な成分又は不可欠でさえある成分はキモトリプシン又はキモトリプシン様酵素であると結論付けられた。これは、以下に記載されているように、二重特性を有するキモトリプシンの配列が同定された配列決定によって確認された。実施例が示すように、このキモトリプシンが除去されると、ＥＳの組織再生特性は失われ、このキモトリプシンは創傷の痂皮を郭清するので、同じキモトリプシン酵素が組織再生及び創傷郭清という二重活性を有する。   Therefore, it was concluded that the important or even essential component of ES required for extracellular matrix remodeling or tissue remodeling and tissue regeneration activity is chymotrypsin or a chymotrypsin-like enzyme. This was confirmed by sequencing where the sequence of chymotrypsin with dual properties was identified, as described below. As the examples show, when this chymotrypsin is removed, the tissue regeneration properties of ES are lost, and this chymotrypsin dissects the wound scab, so the same chymotrypsin enzyme is a dual tissue regeneration and wound dissection. Has activity.

本発明のキモトリプシンは、創傷郭清又は創傷郭清の改善によるのみならず、繊維芽細胞の遊走、マトリックス再構築及び繊維芽細胞形態の修飾を促進することによっても、創傷の治癒を促進するために創傷の治療において使用することができる。特に、壊死性組織と生きた組織の両方を破壊する疾病であるハエ幼虫症を引き起こすルシリア・セリカータ由来のキモトリプシンに対する高い相同性に鑑みれば、これらの反対の効果（タンパク質分解及びタンパク質生成）が同じ酵素中に存在するという事実は当業者にとって驚くべきことであり、従来技術からは予測することができない。   The chymotrypsin of the present invention promotes wound healing not only by wound dissection or improved wound dissection, but also by promoting fibroblast migration, matrix remodeling and fibroblast morphology modification. It can be used in the treatment of wounds. In particular, these opposite effects (proteolysis and protein production) are the same, given the high homology to chymotrypsin from Lucilia sericata that causes fly larvae, a disease that destroys both necrotic and living tissues The fact that it is present in the enzyme is surprising for those skilled in the art and cannot be predicted from the prior art.

従って、本発明は、創傷を治癒するための組成物におけるキモトリプシンの使用を提供する。   Thus, the present invention provides the use of chymotrypsin in a composition for healing a wound.

本発明は、創傷の治癒のための医薬の調製におけるキモトリプシンの使用及びキモトリプシンを用いて創傷を治療する方法も提供する。好ましくは、組成物又は医薬中で使用されるキモトリプシンは、図１、図２若しくは図１３の配列を有し、図１、２若しくは１２のＤＮＡ配列によってコードされる。   The invention also provides the use of chymotrypsin in the preparation of a medicament for wound healing and a method of treating a wound using chymotrypsin. Preferably, chymotrypsin used in the composition or medicament has the sequence of FIG. 1, FIG. 2 or FIG. 13 and is encoded by the DNA sequence of FIG.

あるいは、キモトリプシンの活性断片をこのような組成物又は医薬中に使用し得る。キモトリプシン又はその断片は、天然又は合成であり得る。キモトリプシン又はその断片は、ルシリア・セリカータの幼虫から好ましく取得される。本発明の創傷は以下に定義されており、感染していてもよく、又は感染していなくてもよい。好ましくは、創傷は慢性的な創傷であり、旧来の治療に対して抵抗性であり得る。   Alternatively, active fragments of chymotrypsin can be used in such compositions or medicaments. Chymotrypsin or a fragment thereof can be natural or synthetic. Chymotrypsin or a fragment thereof is preferably obtained from a larva of Lucilia sericata. The wound of the present invention is defined below and may or may not be infected. Preferably, the wound is a chronic wound and may be resistant to traditional treatment.

創傷は繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、又は繊維芽細胞の形態の修飾によって治療され得る。好ましくは、創傷は、本発明のキモトリプシンによって創傷郭清される。   Wounds can be treated by promoting fibroblast migration, by promoting matrix remodeling, or by modifying the morphology of fibroblasts. Preferably, the wound is wound dissected by the chymotrypsin of the present invention.

さらなる態様において、本発明は、創傷に対する包帯も提供し、該包帯は本発明の一部を形成するものとして記載されているキモトリプシンを含有する。従って、本発明は、治療を必要としている創傷に上記包帯を適用する工程を含む、創傷を治療する方法も包含する。   In a further aspect, the present invention also provides a dressing for a wound, the dressing containing chymotrypsin described as forming part of the present invention. Accordingly, the present invention also encompasses a method of treating a wound comprising applying the bandage to a wound in need of treatment.

本発明者らは、大豆のトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）とともにＥＳを温置することによって、繊維芽細胞の遊走を増強するＥＳの能力及び細胞外マトリックスタンパク質を分解するＥＳの能力が除去されることを見出した。同様に、キモトリプシン活性が除去されると、タンパク質分解（創傷郭清）活性は変化したが、以下に示されているように、いくらかのトリプシン活性は残存していた。ＳＴＩによって除去されたタンパク質の配列を決定した。配列は図１、２及び１３に示されているキモトリプシン又はキモトリプシン様配列であることが見出され、この酵素及びその相同体が本明細書に記載されている活性のために必要であることを確認する。   The present inventors removed the ability of ES to enhance fibroblast migration and the ability of ES to degrade extracellular matrix proteins by incubating ES with soybean trypsin inhibitor (STI). I found. Similarly, when chymotrypsin activity was removed, proteolytic (wound dissection) activity changed, but some trypsin activity remained, as shown below. The sequence of the protein removed by STI was determined. The sequence was found to be the chymotrypsin or chymotrypsin-like sequence shown in FIGS. 1, 2 and 13, indicating that this enzyme and its homologues are required for the activities described herein. Check.

従って、本発明は、図１、図２又は図１３中に示されている配列を有するキモトリプシンも提供する。本発明は、図１、２及び１３に示されているキモトリプシンをコードするＤＮＡ配列並びにｐＢａｃ−３ベクター多重クローニング部位ＤＮＡ配列中のＬ．セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すＤＮＡ配列（図１２）も提供する。キモトリプシンの活性部位をコードするＤＮＡの断片（図１３参照）も、本発明の一部を構成する。   Accordingly, the present invention also provides chymotrypsin having the sequence shown in FIG. 1, FIG. 2 or FIG. The present invention relates to the DNA sequence encoding chymotrypsin shown in FIGS. 1, 2 and 13 as well as the L. pylori in the pBac-3 vector multiple cloning site DNA sequence. Also provided is a DNA sequence (FIG. 12) showing the Sericata chymotrypsinogen sequence. A fragment of DNA encoding the active site of chymotrypsin (see FIG. 13) also forms part of the present invention.

本明細書において使用される「創傷」という用語は、傷害によるか又は疾病によるかを問わず、皮膚、表皮又は結合組織に対するあらゆる損傷を定義することが意図され、従って、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど（熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。）、皮膚の擦過又は暴行（ａｓｓａｕｌｔ）、骨髄炎並びに整形外科的創傷が含まれるが、これらに限定されるものではない。創傷は、感染された状態であり得る。さらに、創傷は、慢性又は急性であり得る。慢性的な創傷は、様々な症状に起因し、糖尿病性の足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、感染性手術創、整形外科的創傷、骨髄炎及び褥瘡が含まれる。   The term “wound” as used herein is intended to define any damage to the skin, epidermis or connective tissue, whether due to injury or disease, and thus cuts, stabs, surgical Includes wounds, ulcers, pressure sores, burns (including burns caused by heat, freezing, chemicals, electricity and radiation), skin abrasion or assault, osteomyelitis and orthopedic wounds. It is not limited to. The wound can be in an infected state. Furthermore, the wound can be chronic or acute. Chronic wounds result from various symptoms and include diabetic foot ulcers, venous leg ulcers, infectious surgical wounds, orthopedic wounds, osteomyelitis and pressure ulcers.

本発明のキモトリプシンは天然であり得、又は図１３に示されているものなど、天然の酵素の合成様式であり得る。酵素の合成様式は、例えば、組み換えベクター発現系を用いて、又は以下の実施例中に示されているように何れかの公知のペプチド合成法又は装置の使用によって、慣用の様式で、与えられた配列から作製され得る。酵素の活性な断片（すなわち、酵素の機能を維持する酵素の断片、特に、図１３に特定されている活性部位を含む断片）も、これらをコードするＤＮＡ断片と同様に、本発明の一部であると考えられる。   The chymotrypsin of the present invention can be natural or can be in the form of a natural enzyme synthesis, such as that shown in FIG. Enzyme synthesis modes are given in a conventional manner, for example, using a recombinant vector expression system, or by using any known peptide synthesis method or apparatus as shown in the examples below. Can be created from Active fragments of enzymes (ie, fragments of enzymes that maintain the function of the enzyme, particularly fragments containing the active site specified in FIG. 13) are also part of the present invention, as are the DNA fragments that encode them. It is thought that.

本発明のキモトリプシンは、未精製であり得若しくは精製され得る抽出物として使用され得、又は溶媒、希釈剤、緩衝剤、ビヒクル、安定化剤、保湿剤、賦形剤、結合剤、補助剤、防腐剤、抗ケーキ剤、酸性化剤、ゲル化剤、乳化剤、着色剤、香料などの、特に局所製剤中で使用されるものなど、慣用の添加物を含む医薬組成物中へ取り込まれ得る。好ましい実施形態において、キモトリプシンは局所的に適用されるが、本発明の範囲から投与の経口様式又は他の非経口様式が除外されることを意図するものではない。従って、投与の好ましい様式、局所投与において、本発明のキモトリプシンは、洗浄溶液、懸濁液、洗浄液、クリーム、ローション、ゲル、軟膏（ｕｎｇｕｅｎｔ）、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、粉末又は固体又は流体送達ビヒクル中に存在し得る。あるいは、キモトリプシンは、徐放様式で、又は調節された放出様式で、キモトリプシンを創傷中に送達することができる適切な材料中に取り込まれ、又は封入され得る。このような適切な材料の例は、調節された放出様式でペプチドを放出するように調合され得るポリ（ラクチド−コグリコリド）又はＰＬＧＡ粒子である。最も好ましくは、キモトリプシンは、創傷に適用されるべき包帯中に取り込まれ得る。このような包帯の例には、キモトリプシンを含有する徐放性親水コロイド粒子を取り込んだ段階化された又は層状化された包帯又は旧来の包帯によって場合によって重層されたキモトリプシンを含有するスポンジが含まれる。例えば、Ｓｍｉｔｈら２００６に記載されているものを参照されたい。現在使用されているこの種の親水コロイド包帯、例えば、「Ｇｒａｎｕｆｌｅｘ」の商品名で販売されているものは、キモトリプシンを創傷中に放出するように改変され得る。   The chymotrypsin of the present invention can be used as an extract that can be unpurified or purified, or a solvent, diluent, buffer, vehicle, stabilizer, humectant, excipient, binder, adjuvant, It can be incorporated into pharmaceutical compositions containing conventional additives such as preservatives, anti-cake agents, acidifiers, gelling agents, emulsifiers, colorants, fragrances, etc., especially those used in topical formulations. In a preferred embodiment, chymotrypsin is applied topically, but is not intended to exclude oral or other parenteral modes of administration from the scope of the invention. Thus, in a preferred mode of administration, topical administration, the chymotrypsin of the present invention can be used as a wash solution, suspension, wash solution, cream, lotion, gel, ointment, ointment, salve, powder or solid. Or it can be present in a fluid delivery vehicle. Alternatively, chymotrypsin can be incorporated or encapsulated in a suitable material capable of delivering chymotrypsin into the wound in a sustained release manner or in a controlled release manner. Examples of such suitable materials are poly (lactide-coglycolide) or PLGA particles that can be formulated to release peptides in a controlled release manner. Most preferably, chymotrypsin can be incorporated into a bandage to be applied to the wound. Examples of such bandages include staged or layered bandages incorporating sponge-containing sustained release hydrocolloid particles or sponges containing chymotrypsin optionally overlaid by traditional bandages. . See, for example, those described in Smith et al. 2006. This type of hydrocolloid dressing currently in use, such as that sold under the trade name “Granuflex”, can be modified to release chymotrypsin into the wound.

本発明のキモトリプシンは未精製であり得、又は慣用のタンパク質精製法を用いて精製され得る。キモトリプシンは、例えば、ＣＯＯＨでのアミド化、非コード異常アミノ酸を用いた置換及び／又は同配体（ｉｓｏｔｅｒｅ）によるＣＯ−ＮＨアミド結合の置換によって、アミノペプチダーゼ又はその他の酵素活性に対して保護され得る。さらに、キモトリプシン、特に合成されたキモトリプシン又はその他の新生キモトリプシンは、特に、ヒドロキシル化、グリコシル化、硫酸化、リン酸化され得、又は、特に二次若しくは三次プロセシングが酵素に安定性を与え、若しくは酵素に改善された溶解度若しくは他の望ましい特性を与える場合には、その他二次若しくは三次プロセッシングを受け得る。二次又は三次プロセシングを施すことが酵素の活性を低減しなければ、酵素の合成様式は、天然酵素の立体構造に近い立体構造に到達させるために、二次又は三次プロセシングを施されることが特に好ましい。   The chymotrypsin of the present invention can be unpurified or can be purified using conventional protein purification methods. Chymotrypsin is protected against aminopeptidases or other enzymatic activities, for example, by amidation with COOH, substitution with non-coding unusual amino acids, and / or substitution of CO-NH amide bonds by isoteres. obtain. Furthermore, chymotrypsin, in particular synthesized chymotrypsin or other nascent chymotrypsin can be hydroxylated, glycosylated, sulfated, phosphorylated in particular, or in particular secondary or tertiary processing can provide stability to the enzyme or enzyme Other improved secondary or tertiary processing may be provided to provide improved solubility or other desirable properties. If secondary or tertiary processing does not reduce the activity of the enzyme, the enzyme synthesis mode may be subjected to secondary or tertiary processing to reach a conformation close to that of the natural enzyme. Particularly preferred.

さらに、本発明者らは、細胞を維持するために、組織培養又は組織マトリックスモデル化において、昆虫の幼虫、特にルシリア・セリカータの***／分泌産物を使用できることを見出した。すなわち、ルシリア・セリカータの***／分泌産物は、細胞の生存性を維持するために、ウシ血清などの血清の代わりに使用することができる。これは、血清を使用する必要性をなくすことによって、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）に関連するプリオンなどの潜在的感染源又は潜在的な疾病転移源を除去するので、このような細胞が創傷上に又は創傷中に移植され又は植えつけられるべき場合に、これは特に重要である。   In addition, the inventors have found that the excretion / secretion products of insect larvae, especially Lucilia sericata, can be used in tissue culture or tissue matrix modeling to maintain cells. That is, the excretion / secretion product of Lucilia sericata can be used in place of serum, such as bovine serum, to maintain cell viability. This eliminates potential infectious or metastatic sources such as prions associated with Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) by eliminating the need to use serum so that such cells can be wounded. This is particularly important when it is to be implanted or implanted on or in a wound.

従って、本発明は、昆虫の幼虫の***／分泌産物を含む、生きた細胞の維持において使用するための培地も提供する。好ましくは、幼虫はルシリア・セリカータの幼虫である。   Accordingly, the present invention also provides a medium for use in the maintenance of living cells, including the excretion / secretion products of insect larvae. Preferably, the larvae are Lucilia sericata larvae.

典型的には、ルシリア・セリカータの幼虫又はクロバエ類のウジは、旧来の治療が奏効しない慢性的な創傷に適用される。臨床的な観察は、ウジが壊死性組織を除去し（創傷郭清）、消毒を促進し、肉芽組織の形成を加速するという証拠を提供する（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，２０００；Ｗｏｌｌｉｎａ ｅｔ ａｌ，２００２）。これらの効果の背後に存在する機序を解明するために、本発明者らは、ウジの分泌物及び／又は***物（ＥＳ）（ウジが継続的に滲出する物質は分泌及び／又は***物を起源とし得るので、このように称される。）内に存在する別の研究が示した酵素活性が創傷中に放出されることを調べた（Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２００３）。セリンプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ及びアスパルチルプロテイナーゼ活性の証拠が見出された（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００３）。さらに、ＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼ活性は、様々な一般的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を分解することが示された（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００３）。   Typically, Lucilia sericata larvae or black fly maggots are applied to chronic wounds where traditional treatments do not work. Clinical observations provide evidence that maggots remove necrotic tissue (wound dissection), promote disinfection and accelerate granulation tissue formation (Sherman et al, 2000; Wollina et al, 2002). . In order to elucidate the mechanism behind these effects, the inventors have found that maggot secretions and / or excretion (ES) (substances that ooze continuously are secreted and / or excretion) The enzyme activity shown in another study present within was investigated in the wound (Schmidtchen et al, 2003). Evidence for serine proteinase, metalloproteinase and aspartyl proteinase activity was found (Chambers et al, 2003). Furthermore, serine proteinase activity present in ES has been shown to degrade various common extracellular matrix (ECM) components (Chambers et al, 2003).

本発明者らは、ウジのＥＳが組織形成において重大な役割を果たすので（Ｅｃｋｅｓ ｅｔ ａｌ，２０００）、ヒト皮膚の繊維芽細胞及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分間の相互作用に対するウジのＥＳの効果も調べた。細胞膜受容体（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９９）との結合を通じて、細胞外マトリックスは接触を誘導するための足場を提供し、繊維芽細胞の接着を調節し、細胞の遊走を誘導する（Ｃｌａｒｋ，１９９６；Ｇｒｅｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，１９９７）。繊維芽細胞を含む多くの源から得られるプロテアーゼは、このような相互作用を調節する。これは、繊維芽細胞の増殖（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ，２０００；Ｄｅｒｙ ａｎｄ Ｂｕｎｎｅｔｔ，１９９９）及び血管新生（Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ，１９９７）に影響を与える細胞表面受容体の直接的な活性化を介するものであり得、又は細胞外マトリックス成分（最も顕著なものは、フィブロネクチン）のタンパク分解性分解産物が繊維芽細胞の遊走及び走化性（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，１９９７；Ｌｉｖａｎｔ ｅｔ ａｌ，２０００）、再上皮化（Ｇｉａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９７）及び組織再構築（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｗｅｒｂ ｅｔ ａｌ，１９８０）を誘導する間接的な方法によるものであり得る。本発明者らの結果は、ＥＳの存在下で、フィブロネクチン及びコラーゲンに被覆された表面への繊維芽細胞の接着が低下することを示した（Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ，２００３）。より最近になって、二次元インビトロアッセイを用いて、本発明者らは、ＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼによって、フィブロネクチンを横切る繊維芽細胞の遊走が加速されることを示した（Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ，２００５）。すなわち、本発明者らは、平面を横切る強化された繊維芽細胞の遊走とこのような酵素活性を関連付けた。しかしながら、記載されているものなどの証拠は、二次元内において、細胞は、細胞の一般的な三次元インビボ環境内とは異なる挙動を示すことを示唆する（Ａｂｂｏｔｔ，２００３；Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００１；Ｆｒｉｅｄｌ ａｎｄ Ｂｒｏｃｋｅｒ，２０００）。例えば、平面上で、細胞は平坦な層状の外観を呈する。これに対して、原位置で観察される細胞は星状の形状を採り、伸長突起の樹状ネットワークを突出する。細胞は三次元マトリックス接着と名付けられた、周囲のマトリックスへの異なる付着も示す（Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００１）。平面上の前進する細胞体に対する抵抗が欠如しているので、二次元では、表面を横切る遊走は、主に、接着及び脱接着現象の関数である。しかしながら、三次元内では、マトリックス障壁は細胞がそれらの形態を採るように強制し、運動を促進するために、細胞に形状を変化させ、及び／又は細胞外マトリックス成分を酵素的に分解させる。従って、本発明者らは、ＥＳに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイを開発した。   Since the maggot ES plays a critical role in tissue formation (Eckes et al, 2000), the present inventors have shown that maggot ES's interaction with the interaction between human skin fibroblasts and extracellular matrix (ECM) components. The effect was also investigated. Through binding to cell membrane receptors (Giancotti and Ruoslahti, 1999), the extracellular matrix provides a scaffold for inducing contact, regulates fibroblast adhesion, and induces cell migration (Clark, 1996; Greiling and Clark, 1997). Proteases obtained from many sources, including fibroblasts, regulate such interactions. This is through direct activation of cell surface receptors that affect fibroblast proliferation (Abe et al, 2000; Derry and Bunnett, 1999) and angiogenesis (Blair et al, 1997). Or proteolytic degradation products of extracellular matrix components (most notably fibronectin) are fibroblast migration and chemotaxis (Greiling and Clark, 1997; Livant et al, 2000), re-epithelialization ( (Gianelli et al, 1997) and tissue remodeling (Gould et al, 1997; Werb et al, 1980). Our results have shown that fibroblast adhesion to surfaces coated with fibronectin and collagen is reduced in the presence of ES (Horobin et al, 2003). More recently, using a two-dimensional in vitro assay, we have shown that serine proteinase present in ES accelerates fibroblast migration across fibronectin (Horobin et al, 2005). That is, we have associated such enzymatic activity with enhanced fibroblast migration across the plane. However, evidence such as that described suggests that in two dimensions, cells behave differently than in the general three-dimensional in vivo environment of the cell (Abbott, 2003; Cukierman et al, 2001). Friedl and Blocker, 2000). For example, on a flat surface, the cells have a flat layered appearance. In contrast, cells observed in situ take a star-like shape and protrude through a dendritic network of elongated protrusions. The cells also exhibit a different attachment to the surrounding matrix, termed three-dimensional matrix adhesion (Cukierman et al, 2001). In two dimensions, migration across the surface is primarily a function of adhesion and de-adhesion phenomena, since there is a lack of resistance to advancing cell bodies on a plane. However, within three dimensions, the matrix barrier forces the cells to take their form, causing the cells to change shape and / or enzymatically degrade extracellular matrix components to promote movement. Accordingly, the present inventors have developed a three-dimensional in vitro assay to observe fibroblast migration and morphology in response to ES.

従って、本発明者らは、ＥＳに応答した繊維芽細胞の遊走及び形態を観察するための三次元インビトロアッセイの推進を目指して研究を行った。細胞がインビボで存在する微小環境により近いこのようなモデルの確立は、創傷治癒プロセス中での細胞外マトリックス、常在性細胞及びＥＳ間の相互作用の重要性のよりよい理解を与える。このようなモデルの確立は、治癒を促進するために、支持性の、水和された、生物分解性の及び生物活性な組織様マトリックス内に保たれた生きた皮膚及び上皮細胞が開放創へ送達されるシステムを開発するための基礎も与える。（何れも、遊走に最適と考えられる濃度の）コラーゲン及びフィブロネクチンから構成されるゲル内に包埋された初代ヒト***繊維芽細胞（ＨＦＦ）の単離された集団を含有するアッセイが開発された（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，１９９７；Ｆｒｉｅｄｌ ａｎｄ Ｂｒｏｃｋｅｒ，２０００）。コラーゲンゲルはインビボ様の細胞培養に対して広く使用されており、表皮の生物物理学的構造を正しく再生したものであると考えられている（Ｆｒｉｅｄｌ ａｎｄ Ｂｒｏｃｋｅｒ，２０００）。さらに、コラーゲンゲル内に包埋された細胞は、原位置様形態と幾分の類似性を共有する伸長突起の樹状ネットワークを採ることが示されている（Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００１）。フィブロネクチンは創傷空間中に細胞遊走を誘導する上で主要な役割を果たしているので、フィブロネクチンが含められた（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，１９９７）。結果は、用量依存的な様式で、ＥＳがゲルを通じた繊維芽細胞の遊走を加速することを示した。これは、マトリックス再構築の強化及びより十分に広がった細胞形態の誘導によって促進された可能性がある。以下の実施例中に示されているように、適切な対照と比較して、１及び５μｇ／ｍＬのＥＳ濃度は遊走している細胞の数及びそれらが細胞小滴から移動した距離をともに著しく増加させた。ＥＳのこれらの濃度は十分に広がった細胞形態も誘導し、低い集団密度で、５μｇ／ｍＬのＥＳは細胞間のマトリックス原繊維の並列を促進した。これに対して、１０μｇ／ｍＬのＥＳ（検査された最高濃度）は細胞の遊走を阻害したが、細胞の形態を変化させた。０．１μｇ／ｍＬの濃度のＥＳは、調べた温置期間にわたって、ほとんど効果を示さなかった。   Therefore, the present inventors conducted research aiming to promote a three-dimensional in vitro assay for observing fibroblast migration and morphology in response to ES. The establishment of such a model that is closer to the microenvironment in which cells exist in vivo provides a better understanding of the importance of interactions between extracellular matrix, resident cells and ES during the wound healing process. The establishment of such a model is that living skin and epithelial cells kept in a supportive, hydrated, biodegradable and bioactive tissue-like matrix are opened to open wounds to promote healing. It also provides the basis for developing the delivered system. An assay was developed containing an isolated population of primary human foreskin fibroblasts (HFF) embedded in a gel composed of collagen and fibronectin (both at concentrations considered to be optimal for migration) (Greiling and Clark, 1997; Friedl and Blocker, 2000). Collagen gels are widely used for in vivo-like cell cultures and are believed to correctly regenerate the biophysical structure of the epidermis (Friedl and Blocker, 2000). Furthermore, cells embedded in collagen gels have been shown to adopt a dendritic network of elongated processes that share some similarity with in situ-like morphology (Cukierman et al, 2001). Fibronectin was included because it plays a major role in inducing cell migration into the wound space (Greiling and Clark, 1997). The results showed that ES accelerates fibroblast migration through the gel in a dose-dependent manner. This may have been facilitated by enhanced matrix remodeling and induction of more fully spread cell morphology. As shown in the examples below, compared to appropriate controls, ES concentrations of 1 and 5 μg / mL markedly increased both the number of migrating cells and the distance they traveled from the cell droplet. Increased. These concentrations of ES also induced well-expanded cell morphology, and at low population density, 5 μg / mL ES promoted matrix fibril alignment between cells. In contrast, 10 μg / mL ES (the highest concentration tested) inhibited cell migration but changed cell morphology. ES at a concentration of 0.1 μg / mL had little effect over the incubation period studied.

これらの観察から、ＥＳはマトリックスの再構成及び細胞の牽引力の発揮を促進したと結論付け得る。遊走アッセイの中で、牽引が生じたことは、５μｇ／ｍＬのＥＳを含有するゲルの剥離後における及び１０μｇ／ｍＬのＥＳに曝露されたゲルの液状化の間における細胞小滴サイズの収縮によって表される。より低い播種密度で細胞が観察される場合には、牽引力の存在は、反対方向の牽引力の発揮によって、おそらくこのようにして組織化された、細胞間で緊張した状態に保たれた真っ直ぐな整列されたマトリックス原繊維の出現によって示される。牽引力の存在は、十分に広がった細胞形態によっても示される。Ｈａｒｒｉｓ及び共同研究者（１９８１）は、「・・・繊維芽細胞が細胞周囲のコラーゲンを圧縮及び伸展するにつれて、細胞は短縮されずに伸長するので」、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞では、繊維芽細胞の牽引は、「筋肉の収縮のような単純な収縮とは異なる」ことを観察した。   From these observations it can be concluded that ES promoted matrix reconstitution and the exertion of cell traction. In the migration assay, traction occurred because of cell droplet size contraction after exfoliation of gels containing 5 μg / mL ES and during liquefaction of gels exposed to 10 μg / mL ES. expressed. When cells are observed at lower seeding densities, the presence of traction forces is a straight alignment, maintained in tension between cells, possibly organized in this way by exerting traction forces in the opposite direction. Indicated by the emergence of treated matrix fibrils. The presence of traction is also indicated by fully expanded cell morphology. Harris and co-workers (1981) stated that "... as the fibroblasts compress and stretch the collagen around the cells, the cells grow without shortening," fibroblasts embedded in the collagen gel. In cells, we observed that fibroblast traction is "different from simple contractions like muscle contractions".

ＥＳが繊維芽細胞によるマトリックス再構築を強化したこと、及びこのようにすることによって、遊走の促進を実施することは、おそらく、Ｂｅｌｌｏｗｓら（１９８１）によって提案されたゲル圧縮のモデルによって明らかにされる。異なる細胞種がコラーゲンゲルを収縮し、組織化する能力を比較する際に、これらの研究者は、表１に示されているように、ゲル圧縮の一連の連続する段階を同定した。本発明者らの観察から、ＥＳが、細胞付着及び広がりを促進し、並びにマトリックス（コラーゲンである可能性が最も高い）繊維の整列を促進するというゲル圧縮の最初の３つの段階を開始させることが明らかである。このようにすることにより、細胞遊走の第四段階に到達した。マトリックス再構築と細胞遊走間の関連は、コラーゲンゲル内に包埋された細胞の集団間でのコラーゲン「ストラップ」（整列されたコラーゲン原繊維のパターン）形成が細胞の前進を引き起こし、細胞遊走を隣接する細胞集団の方向に誘導する（接触誘導）ことを見出したＳａｗｈｎｅｙ及びＨｏｗａｒｄ（２００２）の研究によってさらに強化される。   The enhancement of matrix remodeling by fibroblasts and, in this way, the promotion of migration is probably demonstrated by the model of gel compression proposed by Bellows et al. (1981). The In comparing the ability of different cell types to shrink and organize collagen gels, these investigators identified a series of successive stages of gel compression, as shown in Table 1. From our observations, ES initiates the first three stages of gel compression that promote cell attachment and spreading, as well as alignment of matrix (most likely collagen) fibers. Is clear. In this way, the fourth stage of cell migration was reached. The link between matrix remodeling and cell migration is that the formation of collagen “straps” (patterns of aligned collagen fibrils) between populations of cells embedded in a collagen gel causes cell advancement and cell migration Further strengthened by the study of Sawney and Howard (2002), which found to induce in the direction of adjacent cell populations (contact induction).

これらの比較から、ＥＳの存在下にある細胞は、他の研究者によって、コラーゲンゲル内に包埋された細胞について観察されたものと類似の形態特性及びマトリックスの再構成を示した。他の研究はウジ由来の産物を含んでいなかったので、ＥＳが存在しない本発明者らの対照中の細胞に対してこのような挙動が観察されなかった理由が問われなければならない。比較研究は血清を含有するアッセイを含んでいたのに対して、ここでは、血清が除外されたので、答えは血清と関連している可能性がある。血清による細胞−マトリックス相互作用の促進に対する証拠は、係留された繊維芽細胞が集合したコラーゲンゲルの放出の直前に血清を除去することが、常在性細胞によるその後のゲル収縮の程度を阻害することを見出したＴｏｍａｓｅｋら（１９９２）によって与えられている。一旦ゲルが放出された後にゲルに血清を添加することによって、直ちに収縮が引き起こされた。他の研究者らも、マトリックスの再構成に関して、血清への依存を観察している（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，１９８０；Ｇｕｉｄｒｙ ａｎｄ Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，１９８５）。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）及び生物活性脂質媒介物質リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が血清中に見出されており、全て、マトリックス再構成の刺激に関与していると推定されている（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ ａｎｄ Ｏｒｃｉ，１９８８；Ｇｒｉｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｔｏｅｗｓ ｅｔ ａｌ，２００２；Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ，２００４）。   From these comparisons, cells in the presence of ES showed morphological characteristics and matrix reconstitution similar to those observed by other investigators for cells embedded in collagen gels. The other studies did not include products from maggots, so the reason why such behavior was not observed for cells in our control without ES present must be questioned. The comparative study included an assay containing serum, whereas here the serum was excluded, so the answer may be related to serum. Evidence for the promotion of cell-matrix interactions by serum is that removal of serum immediately before the release of collagen gels with tethered fibroblasts aggregates inhibits the extent of subsequent gel contraction by resident cells It is given by Tomasek et al. (1992) who found out. The contraction was triggered immediately by adding serum to the gel once it was released. Other investigators have also observed dependence on serum for matrix reconstitution (Steinberg et al, 1980; Guidry and Grinnell, 1985). Platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor β (TGFβ) and the bioactive lipid mediator lysophosphatidic acid (LPA) have been found in serum and are all involved in stimulating matrix reconstitution (Montesano and Orci, 1988; Grinnell et al, 1999; Roy et al, 1999; Toews et al, 2002; Kondo et al, 2004).

従って、ウジのＥＳが血清中にも見出される活性成分を含有している可能性がある。別の可能性は、本発明者らが以前に繊維芽細胞の遊走を加速することを示したＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼ（Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ，２００５）は、膜結合型プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の切断を通じて寄与し得ることである。Ｇタンパク質共役型受容体のこのファミリーは、トロンビン及びトリプシン様酵素などのセリンプロテイナーゼによるそれらの酵素的切断後に活性化される。このような作用は、受容体上のＮ末端係留されたリガンドを露出させ、次いで、露出されたリガンドは切断された受容体を結合し、活性化させる。活性化されたＰＡＲは、細胞の形状、分泌、インテグリン活性化、代謝性応答、転写応答及び細胞の移動性に影響を与えるシグナル伝達カスケードに共役している（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２００２）。以前の研究は、ＰＡＲのプロテイナーゼ活性化を通じて、トロンビンがコラーゲンゲル中の胎児性ニワトリ繊維芽細胞内の等尺性張力の発生を促進することを示している（Ｋｏｌｏｄｎｅｙ ａｎｄ Ｗｙｓｏｌｍｅｒｓｋｉ，１９９２；Ｐｉｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００１）。ＥＳ内に存在するセリンプロテイナーゼは、トロンビンとプラスミン基質であるトシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対して活性を示し（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００３）、これは、ＥＳがトロンビンと同様の効果を繊維芽細胞に対して発揮し得ることを意味することに注目するのが興味深い。プラスミンは細胞によって分泌される様々なマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のチモーゲン前駆体を活性化させ、従って、局所化されたマトリックス再構成に寄与する（Ｍｉｇｎａｔｔｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）ことが示されているので、何らかのプラスミン様活性が関連している可能性もあり得る。   Therefore, maggot ES may contain active ingredients found in serum. Another possibility is that the serine proteinase present in ES that we have previously shown to accelerate fibroblast migration (Horobin et al, 2005) is a membrane-bound protease-activated receptor ( (PAR) can contribute through cleavage. This family of G protein-coupled receptors is activated after their enzymatic cleavage by serine proteinases such as thrombin and trypsin-like enzymes. Such action exposes the N-terminally anchored ligand on the receptor, which then binds and activates the cleaved receptor. Activated PARs are coupled to signaling cascades that affect cell shape, secretion, integrin activation, metabolic responses, transcriptional responses and cell mobility (Cottrell et al, 2002). Previous studies have shown that thrombin promotes the development of isometric tension in fetal chicken fibroblasts in collagen gels through PAR proteinase activation (Kolodney and Wysolmerski, 1992; Pilcher et al. , 1994; Chang et al, 2001). Serine proteinases present in ES show activity against thrombin and the plasmin substrate tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (Chambers et al, 2003), which shows that ES has similar effects to thrombin. It is interesting to note that it means that it can be exerted on blasts. Since plasmin has been shown to activate zymogen precursors of various matrix metalloproteinases (MMPs) secreted by cells and thus contribute to localized matrix reconstitution (Mignatti et al, 1996). Some plasmin-like activity may be related.

ウジのＥＳは、ウロキナーゼ様活性に対して不安定なペプチドに対して活性を有することも示されている。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の別称でも知られるセリンプロテイナーゼであるウロキナーゼは、その活性形態であるプラスミンへとプラスミノーゲンを転化させる。ウロキナーゼはプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）とも結合し、この研究は繊維芽細胞によって発現されることを示した（Ｍｉｇｎａｔｔｉ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｂｅｈｒｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ，１９９３）。一旦結合されると、ｕＰＡＲは局所的な接着部位に局在化し、インテグリンによって媒介される機能を調節し（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｗｅｉ，２００１；Ｐｏｒｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｇｇ，１９９８）、従って、より誘導性が高い細胞表現型を誘導するための機序を与える。実際に、ｕＰＡＲは細胞遊走、接着及び走化性において、シグナル伝達の役割を有することが報告されている（Ｏｄｅｋｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９２；Ｗａｌｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｇｙｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ，１９９４）。従って、ＥＳ内のウロキナーゼ様活性は細胞挙動の変化にも寄与している可能性があると推測することは合理的である。   Uzi ES has also been shown to have activity against peptides labile to urokinase-like activity. Urokinase, a serine proteinase also known as urokinase plasminogen activator (uPA), converts plasminogen to its active form, plasmin. Urokinase also binds to the plasminogen activator receptor (uPAR) and this study has been shown to be expressed by fibroblasts (Mignatti et al, 1996; Ellis et al, 1993; Behrendt et al, 1993). . Once bound, uPAR localizes to local adhesion sites and regulates integrin-mediated functions (Wang et al, 1995; Chapman and Wei, 2001; Porter and Hogg, 1998) and thus more Provides a mechanism for inducing a highly inducible cell phenotype. Indeed, uPAR has been reported to have a signaling role in cell migration, adhesion and chemotaxis (Odekon et al, 1992; Waltz et al, 1993; Gyetko et al, 1994). Therefore, it is reasonable to speculate that urokinase-like activity in ES may also contribute to changes in cell behavior.

繊維芽細胞−マトリックス相互作用を促進した可能性があるＥＳの他の作用は、ゲルマトリックス成分を分解するその能力と関連し得る。これは、存在するＥＳの濃度が高いほど、ゲルがその外観をより素早く変化させ、より半透明の状態となり、最高のＥＳ濃度では液体様になるという観察によって示される。これは、ＥＳ内のセリンプロテイナーゼがコラーゲン及びフィブロネクチンを分解することを本発明者らが示した以前の研究によっても示されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００３）。マトリックス原繊維と組織培養皿表面間の接触が侵食され、原繊維ネットワークが破壊されるにつれて、ゲルの分解は機械的張力の緩和をもたらしたであろう。緊張性の培養力モニターを開発した研究者による多数の研究は、コラーゲンゲル内に包埋された繊維芽細胞が機械的張力の変化を感知し、機械的張力の変化に対して反応することができるという証拠を与えている。これらの研究者は、繊維芽細胞が活性な張力性ホメオスタシスを維持し、外的に適用された負荷とは反対方向に内在性マトリックスの張力を修飾するように反応する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｅａｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，１９９４）。従って、適用された負荷の増加は細胞によって媒介される収縮の減少を引き起こし、逆も同様である。おそらく、この応答に寄与しているのは、機械的張力がＭＭＰ産生のレベルに影響を与え、従って、周囲のマトリックスを再構築するためにプロテイナーゼを放出することによって細胞を反応させるという知見である（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２００１）。従って、ゲルのタンパク分解性分解によって引き起こされる機械的張力の緩和は、細胞周囲のマトリックスを収縮及び再構築し、より高い移動性の表現型を採るように細胞を刺激した可能性がある。別の帰結は、繊維芽細胞の接着と遊走に影響を与えることが示されている分解されたコラーゲンとフィブロネクチンからの生物活性ペプチドの放出であった可能性がある（Ｇｒｅｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，１９９７；Ｌｉｖａｎｔ ｅｔ ａｌ，２０００）。   Other effects of ES that may have promoted fibroblast-matrix interactions may be related to its ability to degrade gel matrix components. This is shown by the observation that the higher the concentration of ES present, the faster the gel will change its appearance, become more translucent, and become liquid at the highest ES concentration. This has also been shown by previous studies that we have shown that serine proteinases in ES degrade collagen and fibronectin (Chambers et al, 2003). As the contact between the matrix fibrils and the tissue culture dish surface was eroded and the fibril network was destroyed, the degradation of the gel would have resulted in relaxation of the mechanical tension. Numerous studies by researchers who have developed tonic culture force monitors show that fibroblasts embedded in collagen gel can detect changes in mechanical tension and react to changes in mechanical tension. Evidence that it can be done. These researchers respond that fibroblasts maintain active tensile homeostasis and modify the tension of the endogenous matrix in the opposite direction to the externally applied load (Brown et al, 1998; Eastwood et al, 1994). Thus, an increase in applied load causes a decrease in cell-mediated contraction, and vice versa. Perhaps contributing to this response is the finding that mechanical tension affects the level of MMP production and thus reacts cells by releasing proteinases to reconstruct the surrounding matrix. (Lambert et al, 2001). Thus, the relaxation of mechanical tension caused by the proteolytic degradation of the gel may have stimulated the cells to contract and rebuild the pericellular matrix and adopt a higher mobility phenotype. Another consequence may have been the release of bioactive peptides from degraded collagen and fibronectin that have been shown to affect fibroblast adhesion and migration (Greiling and Clark, 1997; Livant) et al, 2000).

繊維芽細胞は機械的張力の変化を検出し、この変化に応答することができるので、マトリックスを再構築するために、ＥＳがどれだけ繊維芽細胞を刺激しても、細胞間の連絡の強化がもたらされ得ることは本発明者らの観察から明らかである。これは、マトリックス原繊維の配列を引き起こす別の細胞からの反対方向の牽引力によって、各細胞がマトリックスの機械的張力の局所的な差を検出することができたからである。隣接する細胞のこのような増強された認識は、比較的長距離に対してさえ、細胞間の作用の改善された協調をもたらし、増強された遊走に寄与した可能性がある。実際には、Ｓｈｅｅｔｚ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ及びＧａｂｒａｉｔｈ（１９９８）は、細胞外マトリックスタンパク質繊維の配向及び硬直性に従って、細胞がその運動を誘導するという協調された細胞遊走の同様の機序を提案している（Ｓｈｅｅｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９８）。   Because fibroblasts can detect and respond to changes in mechanical tension, no matter how much the ES stimulates fibroblasts to rebuild the matrix, enhanced communication between cells It is clear from our observation that This is because each cell could detect a local difference in the mechanical tension of the matrix due to the opposite traction force from another cell causing the matrix fibril alignment. Such enhanced recognition of neighboring cells may have resulted in improved coordination of action between cells, even for relatively long distances, and may have contributed to enhanced migration. In fact, Sheetz, Felsenfeld and Gabraith (1998) have proposed a similar mechanism of coordinated cell migration in which cells induce their movement according to the orientation and rigidity of extracellular matrix protein fibers ( (Sheetz et al, 1998).

遊走及びマトリックス再構築を強化する上でのＥＳの利点にも関わらず、ＥＳ内に存在するプロテイナーゼの作用はマトリックスの広範囲な破壊を引き起こすので、ＥＳ内に存在するプロテイナーゼの活性は過剰なものではないことは重要である。接触誘導及び転位を促進するために、十分な原繊維構造が残存する必要があることは、１０μｇ／ｍＬという最高のＥＳ濃度を含有した本発明者らのアッセイによって示される。ここでは、ＥＳは遊走を阻害したのみならず、粘性のある液体状態へゲルを素早く分解した。従って、明らかに、創傷治癒に貢献し得る細胞の活動を促進するためのＥＳの最適な濃度が存在する。   Despite the benefits of ES in enhancing migration and matrix remodeling, the activity of proteinases present in ES causes extensive destruction of the matrix, so the activity of proteinases present in ES is not excessive. It is important not to be. The need for sufficient fibril structure to remain to facilitate contact induction and translocation is shown by our assay containing the highest ES concentration of 10 μg / mL. Here, ES not only inhibited migration, but also quickly degraded the gel into a viscous liquid state. Clearly, therefore, there is an optimal concentration of ES to promote cellular activity that can contribute to wound healing.

要約すれば、本発明者らの結果は、第一に、ＥＳが繊維芽細胞の遊走を促進することを見出した。第二に、血清の不存在下において、細胞が十分に広がった形態を維持し、拡張するのを補助するためにＥＳが必要であった。第三に、同じく血清の不存在下において、ＥＳは、特に細胞間での細胞外マトリックスの再構成を促進した。第四に、ＥＳは、細胞外マトリックスの直接的なタンパク分解性修飾によって、及び／又は細胞の受容体との相互作用による繊維芽細胞表現型の表現型の直接的な変化により、血清を不要とすることによってこれらの効果を付与した。本発明者らは、ＥＳから活性な要素を単離するための技術的能力を有しており（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００３；Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ，２００３，２００５）、従って、関与する活性及び機序の同定に進む。   In summary, our results first found that ES promotes fibroblast migration. Second, in the absence of serum, ES was required to help maintain and expand the cells in a fully expanded form. Third, ES also promoted extracellular matrix reconstitution, particularly between cells, also in the absence of serum. Fourth, ES does not require serum by direct proteolytic modification of the extracellular matrix and / or by direct alteration of the fibroblast phenotype phenotype by interaction with cellular receptors. These effects were imparted. We have the technical ability to isolate active elements from ES (Chambers et al, 2003; Horobin et al, 2003, 2005) and therefore of the activities and mechanisms involved. Proceed to identification.

実施例２のデータが示すように、創傷の痂皮中のタンパク質を溶解する点で、幼虫のＥＳから抽出されたキモトリプシンは創傷郭清活性を有している（図２１参照）。阻害剤研究によって、及び配列決定によって、これはキモトリプシンであることが明らかとなっている。   As shown in the data of Example 2, chymotrypsin extracted from larval ES has wound dissection activity in that it dissolves proteins in the scab of the wound (see FIG. 21). Inhibitor studies and sequencing have shown that this is chymotrypsin.

ここで、添付の図面を参照しながら、添付の図面によって例示されているように、本発明の実施例を記載する。   Embodiments of the present invention will now be described with reference to the accompanying drawings, as illustrated by the accompanying drawings.

図１は、タンパク質翻訳及びＬ・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、Ｌ．セリカータ遺伝子配列を示す完全な（１）及び部分的な（２）配列表を示している。ここで、ＤＮＡコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のＬ．キュプリナ配列と比較した場合の、Ｌ．セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域（ＵＴＲ）を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。FIG. 1 shows L. culin, as well as protein translation and homology to L. culina chymotrypsinogen. A complete (1) and partial (2) sequence listing showing the sericata gene sequence is shown. Here, the DNA codon is described in lower case. Protein translations are written in capital letters. The underlined capital letters indicate the L. When compared to the cuprina sequence, L. Amino acid residues unique to the sericata sequence are shown. Bold indicates active site residues. Italics indicate signaling peptides. Arrows indicate candidate cleavage sites and indicate cleavable signaling peptides. An asterisk represents a stop codon. The underlined lowercase letters indicate untranslated regions (UTRs). Underlined bold lowercase letters indicate polyadenylation tails, and underlined italics indicate polyadenylation signals. 図２は、タンパク質翻訳及びＬ・キュプリナのキモトリプシノーゲンに対する相同性とともに、Ｌ．セリカータ遺伝子配列を示す完全な（１）及び部分的な（２）配列表を示している。ここで、ＤＮＡコドンは小文字で記載されている。タンパク質の翻訳は大文字で記載されている。下線が付された大文字は、最も近い相同性のＬ．キュプリナ配列と比較した場合の、Ｌ．セリカータ配列に特有なアミノ酸残基を示している。太字は活性部位の残基を示している。斜字体はシグナル伝達ペプチドを示している。矢印は切断部位の候補を示しており、切断可能なシグナル伝達ペプチドを示している。アスタリスクは停止コドンを表している。下線が付された小文字は非翻訳領域（ＵＴＲ）を示している。下線が付された太字の小文字はポリアデニル化尾部を示しており、下線が付された斜字体はポリアデニル化シグナルを示している。FIG. 2 shows L. cuprina and its homology to chymotrypsinogen. A complete (1) and partial (2) sequence listing showing the sericata gene sequence is shown. Here, the DNA codon is described in lower case. Protein translations are written in capital letters. The underlined capital letters indicate the L. When compared to the cuprina sequence, L. Amino acid residues unique to the sericata sequence are shown. Bold indicates active site residues. Italics indicate signaling peptides. Arrows indicate candidate cleavage sites and indicate cleavable signaling peptides. An asterisk represents a stop codon. The underlined lowercase letters indicate untranslated regions (UTRs). Underlined bold lowercase letters indicate polyadenylation tails, and underlined italics indicate polyadenylation signals. 図３は、三次元インビトロアッセイがどのようにして組み立てられたかの図解である。１．１．５ｍｇ／ｍＬコラーゲンと３０μｇ／ｍＬフィブロネクチンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）を５８ｍｍの組織培養皿の中に注ぎ、薄い均一な層中に３７℃でゲル化した。２．１×１０^７個のＨＦＦ細胞／ｍＬを含有するＤ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチンの小滴を第一のゲル層の上に置き、３７℃でゲル化した。３．Ｄ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチン溶液の第二の層を細胞小滴の上に注ぎ、３７℃でゲル化した。４．次いで、ＦＣＳ−遊離細胞培地をゲルの上に注いだ。５．完全に組み立てられたアッセイが断面図で示されており、小滴中の全ての細胞がマトリックスゲルによってどのようにして完全に取り囲まれているか、従って、三次元に遊走しなければならないかについて図示している。FIG. 3 is an illustration of how a three-dimensional in vitro assay was assembled. 1. Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) containing 1.5 mg / mL collagen and 30 μg / mL fibronectin was poured into a 58 mm tissue culture dish and gelled at 37 ° C. in a thin uniform layer. A drop of D-MEM / collagen / fibronectin containing 2.1 × 10 ⁷ HFF cells / mL was placed on the first gel layer and gelled at 37 ° C. 3. A second layer of D-MEM / collagen / fibronectin solution was poured onto the cell droplets and gelled at 37 ° C. 4). FCS-free cell medium was then poured over the gel. 5. A fully assembled assay is shown in cross-section, showing how all the cells in a droplet are completely surrounded by a matrix gel and therefore must migrate in three dimensions. Show. 図４は、三次元インビトロアッセイ内の２μＬのゲル小滴からの繊維芽細胞の遊走が、位相差顕微鏡画像からどのようにして定量されたかの図解である。１．アッセイ組み立ての直後における、繊維芽細胞が播種された小滴（０時間の温置）。２．２４時間の温置後の同じ小滴。３．コントラストを付けるために黒で着色され、２４時間の温置から得られた画像に対して重ね合わせられた、繊維芽細胞が播種された０時間温置時点での小滴。４．２４時間にわたって小滴から遊走した細胞のみが示されたままとなっており、従って、それらを計数することが可能となる。各細胞の先端から重ね合わされた０時間画像の周囲へ引かれたベクトルの長さを測定することによって、各細胞が移動した距離を計算した。０時間の温置時における繊維芽細胞が播種された小滴の周囲距離も、重ね合わされた０時間画像周囲に線を引くことによって測定された。ミクロンのバーは、３００μｍに相当する。FIG. 4 is an illustration of how fibroblast migration from 2 μL gel droplets in a three-dimensional in vitro assay was quantified from phase contrast microscopy images. 1. Droplets seeded with fibroblasts (0 hour incubation) immediately after assay assembly. 2. Same droplet after 24 hours incubation. 3. Droplets at 0 hour incubation time seeded with fibroblasts, colored in black for contrast and superimposed on the image obtained from the 24 hour incubation. 4. Only those cells that have migrated from the droplets over the 24 hour period remain shown so that they can be counted. The distance traveled by each cell was calculated by measuring the length of the vector drawn from the tip of each cell to the periphery of the 0 hour image superimposed. The peripheral distance of the droplets seeded with fibroblasts at 0 hour incubation was also measured by drawing a line around the superimposed 0 hour image. A micron bar corresponds to 300 μm. 図５は、ａ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは０．１μｇ／ｍＬＥＳ（０．１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下で、又はｂ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは１０μｇ／ｍＬＥＳ（１０ＥＳ）の存在下で、アッセイ組み立て直後に（０時間）又は２４時間若しくは４８時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、３００μｍに相当する。FIG. In the absence of ES (0ES) or in the presence of 0.1 μg / mLES (0.1ES) or 5 μg / mLES (5ES), or b. Three-dimensional in vitro in the absence of ES (0ES) or in the presence of 1 μg / mLES (1ES) or 10 μg / mLES (10ES) immediately after assay assembly (0 hours) or after 24 or 48 hours incubation Shown is a representative phase contrast image of 2 μL of a gel droplet seeded with fibroblasts in the assay. In all cases, the micron bar corresponds to 300 μm. 図５は、ａ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは０．１μｇ／ｍＬＥＳ（０．１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下で、又はｂ．ＥＳの不存在下（０ＥＳ）若しくは１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは１０μｇ／ｍＬＥＳ（１０ＥＳ）の存在下で、アッセイ組み立て直後に（０時間）又は２４時間若しくは４８時間の温置後における、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの代表的な位相差画像を示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、３００μｍに相当する。FIG. In the absence of ES (0ES) or in the presence of 0.1 μg / mLES (0.1ES) or 5 μg / mLES (5ES), or b. Three-dimensional in vitro in the absence of ES (0ES) or in the presence of 1 μg / mLES (1ES) or 10 μg / mLES (10ES) immediately after assay assembly (0 hours) or after 24 or 48 hours incubation Shown is a representative phase contrast image of 2 μL of a gel droplet seeded with fibroblasts in the assay. In all cases, the micron bar corresponds to 300 μm. 図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。FIG. 6 shows a representative image of the tip of a 2 μL gel droplet seeded with fibroblasts in a three-dimensional in vitro assay, highlighting differences in cell morphology. Unless otherwise noted, images are phase differences. a. Comparison of cells in the absence of ES (0ES) with cells exposed to 5 μg / mL ES after incubation for 24 hours (5ES); b. Comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 1 μg / mL ES after 48 hours incubation-confocal maximal intensity projection of z-series optical cross section, FITC-phalloidin (actin) And cells stained with propidium iodide (nuclei); comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 10 μg / mL ES after incubation for 24 hours (c) or 48 hours (10 ES). (D) A micron bar in a, c, d represents 50 μm (top) or 20 μm (bottom), and b represents 50 μm. 図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。FIG. 6 shows a representative image of the tip of a 2 μL gel droplet seeded with fibroblasts in a three-dimensional in vitro assay, highlighting differences in cell morphology. Unless otherwise noted, images are phase differences. a. Comparison of cells in the absence of ES (0ES) with cells exposed to 5 μg / mL ES after incubation for 24 hours (5ES); b. Comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 1 μg / mL ES after 48 hours incubation-confocal maximal intensity projection of z-series optical cross section, FITC-phalloidin (actin) And cells stained with propidium iodide (nuclei); comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 10 μg / mL ES after incubation for 24 hours (c) or 48 hours (10 ES). (D) A micron bar in a, c, d represents 50 μm (top) or 20 μm (bottom), and b represents 50 μm. 図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。FIG. 6 shows a representative image of the tip of a 2 μL gel droplet seeded with fibroblasts in a three-dimensional in vitro assay, highlighting differences in cell morphology. Unless otherwise noted, images are phase differences. a. Comparison of cells in the absence of ES (0ES) with cells exposed to 5 μg / mL ES after incubation for 24 hours (5ES); b. Comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 1 μg / mL ES after 48 hours incubation-confocal maximal intensity projection of z-series optical cross section, FITC-phalloidin (actin) And cells stained with propidium iodide (nuclei); comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 10 μg / mL ES after incubation for 24 hours (c) or 48 hours (10 ES). (D) A micron bar in a, c, d represents 50 μm (top) or 20 μm (bottom), and b represents 50 μm. 図６は、三次元インビトロアッセイ内の繊維芽細胞が播種されたゲル小滴２μＬの先端の代表的な画像を示しており、細胞形態の差を強調表示している。別段の記載がなければ、画像は位相差である。ａ．ＥＳが存在しない（０ＥＳ）対照中の細胞と、２４時間の温置後に５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（５ＥＳ）との比較；ｂ．対照中の細胞（０ＥＳ）と、４８時間の温置後に１μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞（１ＥＳ）との比較−ｚシリーズ光学断面の共焦点最大起強度投影、ＦＩＴＣ−ファロイジン（アクチン）及びヨウ化プロピジウム（核）で染色された細胞；対照中の細胞（０ＥＳ）と２４時間（ｃ）又は４８時間の温置後に１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞（１０ＥＳ）との比較。（ｄ）ａ、ｃ、ｄ中のミクロンのバーは５０μｍ（上）又は２０μｍ（下）を表し、ｂでは、５０μｍを表す。FIG. 6 shows a representative image of the tip of a 2 μL gel droplet seeded with fibroblasts in a three-dimensional in vitro assay, highlighting differences in cell morphology. Unless otherwise noted, images are phase differences. a. Comparison of cells in the absence of ES (0ES) with cells exposed to 5 μg / mL ES after incubation for 24 hours (5ES); b. Comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 1 μg / mL ES after 48 hours incubation-confocal maximal intensity projection of z-series optical cross section, FITC-phalloidin (actin) And cells stained with propidium iodide (nuclei); comparison of cells in control (0ES) with cells exposed to 10 μg / mL ES after incubation for 24 hours (c) or 48 hours (10 ES). (D) A micron bar in a, c, d represents 50 μm (top) or 20 μm (bottom), and b represents 50 μm. 図７は、２４時間にわたる、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種されたゲル小滴２μＬからの繊維芽細胞の遊走を示している。結果は、小滴の周囲ｍｍ当りの遊走細胞の平均数±平均値の標準誤差（ｎ＝５）として表されている。ａ．ＥＳの不存在下（対照）又は０．１μｇ／ｍＬＥＳ（０．１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下での遊走。ｂ．ＥＳの不存在下（対照）又は１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは１０μｇ／ｍＬＥＳ（１０ＥＳ）の存在下での遊走。FIG. 7 shows fibroblast migration from 2 μL of gel droplets seeded with cells in a three-dimensional in vitro assay over 24 hours. The results are expressed as the average number of migrating cells per mm surrounding the droplets ± standard error of the mean (n = 5). a. Migration in the absence of ES (control) or in the presence of 0.1 μg / mL ES (0.1 ES) or 5 μg / mL ES (5 ES). b. Migration in the absence of ES (control) or in the presence of 1 μg / mL ES (1 ES) or 10 μg / mL ES (10 ES). 図８は、三次元インビトロアッセイ内の細胞が播種された各２μＬのゲル小滴から遊走する繊維芽細胞が移動した距離の中央値を示している。５つの反復小滴から得られた値が示されている。黒塗りの記号（実験１）は、ＥＳの不存在下（対照＃１）又は０．１μｇ／ｍＬＥＳ若しくは５μｇ／ｍＥＳの存在下で移動した距離を表している。白い記号（実験２）は、ＥＳの不存在下（対照＃２）又は１μｇ／ｍＬＥＳ若しくは１０μｇ／ｍＥＳの存在下で移動した距離を表している。FIG. 8 shows the median distance traveled by fibroblasts migrating from each 2 μL gel droplet seeded with cells in a three-dimensional in vitro assay. Values obtained from five repeated droplets are shown. The black symbols (Experiment 1) represent the distance traveled in the absence of ES (Control # 1) or in the presence of 0.1 μg / mLES or 5 μg / mES. The white symbol (Experiment 2) represents the distance traveled in the absence of ES (Control # 2) or in the presence of 1 μg / mLES or 10 μg / mES. 図９は、アッセイ組み立て直後（０時間の温置）又は２４時間若しくは４８時間の温置後における、２０μＬのゲル小滴内の、３×１０^５細胞／ｍＬの播種密度の繊維芽細胞を示す代表的な位相差画像を示す。ＥＳの不存在下（０ＥＳ）又は１μｇ／ｍＬＥＳ（１ＥＳ）若しくは５μｇ／ｍＬＥＳ（５ＥＳ）の存在下での細胞の外観。黒い矢印は、並列されている場合、細胞間の鎖状結合性原繊維が可視的になっていることを示している。全ての事例で、ミクロンのバーは、２０μｍに相当する。FIG. 9 shows fibroblasts with a seeding density of 3 × 10 ⁵ cells / mL in 20 μL gel droplets immediately after assay assembly (0 hour incubation) or after 24 or 48 hours incubation. A typical phase difference image is shown. Appearance of cells in the absence of ES (0ES) or in the presence of 1 μg / mLES (1ES) or 5 μg / mLES (5ES). The black arrows indicate that the chain-binding fibrils between cells are visible when they are juxtaposed. In all cases, a micron bar corresponds to 20 μm. 図１０は、２４時間の温置後における、各酵素濃度のタンパク質分解活性に関連した、ＦＮ被覆された表面への繊維芽細胞接着に対するＥＳ、トリプシン、キモトリプシン及びトリプシン／キモトリプシン混合物の効果を示す２つのグラフである。このような活性は、ａ．トリプシン又はｂ．キモトリプシンに対する合成ペプチド基質からの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の放出をモニタリングすることによって評価された。細胞の接着は、蛍ルシフェラーゼをベースとする発光アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイを用いて測定された。結果は、対照の平均％細胞接着±１ＳＤとして表した（ｎ＝３）。FIG. 10 shows the effect of ES, trypsin, chymotrypsin and trypsin / chymotrypsin mixture on fibroblast adhesion to FN-coated surfaces in relation to proteolytic activity at each enzyme concentration after 24 hours incubation. It is one graph. Such activity is a. Trypsin or b. It was assessed by monitoring the release of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) from a synthetic peptide substrate for chymotrypsin. Cell adhesion was measured using a luminescent adenosine triphosphate (ATP) assay based on firefly luciferase. Results were expressed as mean% cell adhesion ± 1SD of controls (n = 3). 図１１は、３７℃で２４時間の温置後のフィブロネクチンのゲル電気泳動の写真である。値は、分子量標準（ｋＤａ）を示している。１．ＦＮ単独。２．ＦＮ＋ｔｒｙ／ｃｈｙ。３．ＦＮ＋ｃｈｙ。４．ＦＮ＋ｔｒｙ。５．ＦＮ＋ＥＳ。各酵素濃度は、適切なトリプシン又はキモトリプシン基質に対する活性の同じレベルを示した。Ｔｒｙ＝０．３２μｇ／ｍＬトリプシン。Ｃｈｙ＝０．０２μｇ／ｍＬキモトリプシン。ＥＳ＝１μｇ／ｍＬ。FIG. 11 is a photograph of gel electrophoresis of fibronectin after incubation at 37 ° C. for 24 hours. Values indicate molecular weight standards (kDa). 1. FN alone. 2. FN + try / chy. 3. FN + chy. 4). FN + try. 5). FN + ES. Each enzyme concentration showed the same level of activity against the appropriate trypsin or chymotrypsin substrate. Try = 0.32 μg / mL trypsin. Chy = 0.02 μg / mL chymotrypsin. ES = 1 μg / mL. 図１２は、ｐＢａｃ−３ベクター多重クローニング部位ＤＮＡ配列中のＬ．セリカータキモトリプシノーゲン配列を示すＤＮＡ配列表であり、ｐｂａｃ−３ベクターの配列に下線が付されている。FIG. 12 shows the L. in the pBac-3 vector multiple cloning site DNA sequence. It is a DNA sequence table | surface which shows a sericarta chymotrypsinogen arrangement | sequence, and the sequence of pbac-3 vector is underlined. 図１３は、活性部位の残基が太字で示されている図１２のＤＮＡ配列の予想されるタンパク質配列である。FIG. 13 is the predicted protein sequence of the DNA sequence of FIG. 12, with active site residues shown in bold. 図１４は、Ｓ３００ゲルろ過後のトリプシン／キモトリプシン活性を示すグラフである。FIG. 14 is a graph showing trypsin / chymotrypsin activity after S300 gel filtration. 図１５は、ゼラチンＳＤＳ−ＰＡＧＥ基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性を示す一連の写真である。FIG. 15 is a series of photographs showing typical proteolytic properties for each peak of activity measured by gelatin SDS-PAGE substrate gel analysis. 図１６は、Ｃ１プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。FIG. 16 is a graph showing protein properties of soybean trypsin inhibitor agarose affinity chromatography after application of the C1 pool. 図１７は、Ｃ１プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。FIG. 17 is a photograph of a gel showing the proteolytic activity and inhibitor characterization of protein bound to soybean trypsin inhibitor agarose after application of the C1 pool. 図１８は、Ｔ２プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースアフィニティークロマトグラフィーのタンパク質特性を示すグラフである。FIG. 18 is a graph showing protein characteristics of soybean trypsin inhibitor agarose affinity chromatography after application of the T2 pool. 図１９は、Ｔ２プールの適用後の大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示すゲルの写真である。FIG. 19 is a photograph of a gel showing the proteolytic activity and inhibitor characterization of protein bound to soybean trypsin inhibitor agarose after application of the T2 pool. 図２０は、Ｌ．セリカータのＥＳ産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す２つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図２０ａは処理されていない痂皮を示しており、図２０ｂは一晩処理された痂皮を示している。FIG. FIG. 2 is a photograph showing two gels showing changes in the protein properties of wound crusts that may occur after treatment with a Sericata ES product. The area where the change may occur is circled. FIG. 20a shows a crust that has not been treated, and FIG. 20b shows a crust that has been treated overnight. 図２１は、Ｌ．セリカータのＥＳ産物で処理した後に生じ得る創傷痂皮のタンパク質特性の変化を示す４つのゲルを示す写真である。変化が生じる可能性がある領域が円で囲まれている。図２１ａは処理されていない痂皮を示しており、２０ｂはキモトリプシンピーク（Ｃ１）で処理され、２０ｃは第一のトリプシンピーク（Ｔ１）で処理され、２０ｄは第二のトリプシンピーク（Ｔ２）で処理された。FIG. FIG. 4 is a photograph showing four gels showing changes in protein properties of wound crusts that may occur after treatment with Sericata ES product. The area where the change may occur is circled. FIG. 21a shows an untreated scab, 20b treated with a chymotrypsin peak (C1), 20c treated with a first trypsin peak (T1), and 20d with a second trypsin peak (T2). It has been processed.

（実施例１）
組織の再生
繊維芽細胞の接着の促進
ルシリア・セリカータの幼虫の***物／分泌物の収集及び性質決定
***物／分泌物（ＥＳ）を、以前に記載されているとおりに（Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ，２００３）、孵化した直後の無菌のルシリア・セリカータの幼虫（ＬａｒｖＥ^ＴＭ，Ｚｏｏｂｉｏｔｉｃ Ｌｔｄ，ＵＫ）から収集した。簡潔に述べると、ＥＳ産物を回収するために、無菌のリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬ中において、室温で（ＲＴ）３０分間、４００個の生きた幼虫を洗浄した。それぞれ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）タンパク質アッセイキット及びフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）−カゼイン消化アッセイ（Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ，２００３）を用いて、ＥＳのタンパク質濃度及びタンパク質分解活性を測定した。ともに、これらは、１６１．７４μｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び６．０４×１０^６相対蛍光単位／ｍｇＥＳタンパク質の比活性であることを明らかにした。 (Example 1)
Tissue regeneration Facilitating fibroblast adhesion. Collection and characterization of Lucilia sericata larvae excretion / secretion. Excretion / secretion (ES) as previously described (Horobin et al, 2003). ), Collected from sterile Lucilia sericata larvae (LarvE ^™ , Zoobiotic Ltd, UK) immediately after hatching. Briefly, 400 live larvae were washed in 1 mL of sterile phosphate buffered saline (PBS) for 30 minutes at room temperature (RT) to recover ES product. The protein concentration and proteolytic activity of ES were measured using the Bio-Rad (Hercules, CA) protein assay kit and fluorescein isothiocyanate (FITC) -casein digestion assay (Horobin et al, 2003), respectively. Together, these revealed a protein concentration of 161.74 μg / mL and a specific activity of 6.04 × 10 ⁶ relative fluorescence units / mg ES protein.

初代ヒト***繊維芽細胞（ＨＦＦ）細胞培養
ダルベッコの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ^ＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ，ＵＫ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｓｉｇｍａ^（Ｒ），ＵＫ）、抗生物質／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ^（Ｒ））（１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬアムフォテリシンＢ）及び２ｍＭＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ^（Ｒ））を含有するＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）内で、ＨＦＦ細胞（ＴＣＳ Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ^（Ｒ），ＵＫ）を単層培養した。５％ＣＯ_２を含有する加湿された雰囲気中において、細胞を３７℃に維持した。 Primary human foreskin fibroblast (HFF) cell culture Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (Gibco ^™ , Invitrogen Ltd, UK), 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma ^(R) , UK), antibiotics / antimycotic solution ^{(Sigma (R)) (100} units / mL penicillin, 100 [mu] g / mL streptomycin and 0.25 [mu] g / mL amphotericin B) and 2mML- glutamine ^{(Sigma (R))} containing T75 flasks (Nunc, Life Technologies Ltd, in UK), HFF cells ^{(TCS Cellworks (R), UK} ) were monolayer culture. Cells were maintained at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO ₂ .

三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
通常の細胞培養（上記参照）に対して使用した濃度の２倍のＤ−ＭＥＭ、抗生物質／抗真菌物質及びＬ−グルタミンを含有する原液を作製した。冷蔵後、１：１の比で、３ｍｇ／ｍＬウシコラーゲンＩ型（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）、６０μｇ／ｍＬウシフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ^（Ｒ））及び幼虫のＥＳ又はＰＢＳブランクを含有する***液と原溶液を氷上で混合した。１×Ｄ−ＭＥＭ、１．５ｍｇ／ｍＬコラーゲン及び３０μｇ／ｍＬフィブロネクチンの最終濃度を得た。幼虫のＥＳの最終タンパク質濃度は、表記されているように、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌであった。図３に示されているように、及びここに記載されているように、アッセイを組み立てた。すなわち、上述のように、５８ｍｍ組織培養皿（Ｎｕｎｃ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）の中に、Ｄ−ＭＥＭ−コラーゲン／フィブロネクチン混合物１０００μＬを注ぎ、均一な薄い連続層の中に３７℃でゲル化した。ＨＦＦ細胞（継代６）をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために、１０％ＦＣＳを含有するＤ−ＭＥＭ中に懸濁した。次いで、遠心によってそれらを沈降させ、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭ中に再懸濁した。血球計数器を用いた細胞数の推定後に、細胞を再び沈降させ、１×１０^７細胞／ｍＬの密度で、Ｄ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチンゲル混合物内に再懸濁した。次いで、皿の中のゲル層の上に、それぞれ、この細胞懸濁物２μＬを含有する５つの小滴を配置し、ゲル化されるまで、３７℃で温置した。次いで、細胞小滴を完全に覆うために、細胞小滴の上に、Ｄ−ＭＥＭ／コラーゲン／フィブロネクチン混合物をさらに１０００μＬに注ぎ、ゲル化させるために３７℃で放置した。最後に、上部ゲル層を覆うために、ゲル中と同じ濃度で抗生物質／抗真菌物質、Ｌ−グルタミン及びＰＢＳブランク又は幼虫のＥＳを含有する、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭを添加した。次いで、表記の時間、加湿された５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で、組み立てられたアッセイを温置した。この間、無菌条件を維持した。 Three-dimensional in vitro assay-fibroblast migration A stock solution was made containing D-MEM, antibiotic / antimycotic and L-glutamine at twice the concentration used for normal cell culture (see above). After refrigeration, 1: 1 ratio, 3 mg / mL bovine collagen type I (ICN Biomedicals, Ohio, USA) , and a cold solution containing ES or PBS blank 60 [mu] g / mL bovine fibronectin ^{(Sigma (R))} and larvae The stock solution was mixed on ice. Final concentrations of 1 × D-MEM, 1.5 mg / mL collagen and 30 μg / mL fibronectin were obtained. The final protein concentration of larval ES was 0.1 μg / ml, 1 μg / ml, 5 μg / ml or 10 μg / ml as indicated. The assay was assembled as shown in FIG. 3 and as described herein. That is, as described above, 1000 μL of the D-MEM-collagen / fibronectin mixture was poured into a 58 mm tissue culture dish (Nunc, Life Technologies Ltd) and gelled at 37 ° C. in a uniform thin continuous layer. HFF cells (passage 6) were trypsinized and suspended in D-MEM containing 10% FCS to neutralize trypsin. They were then sedimented by centrifugation and resuspended in D-MEM without FCS. Following estimation of the cell number using a hemocytometer, the cells were reprecipitated and resuspended in a D-MEM / collagen / fibronectin gel mixture at a density of 1 × 10 ⁷ cells / mL. Then, 5 droplets each containing 2 μL of this cell suspension were placed on the gel layer in the dish and incubated at 37 ° C. until gelled. The D-MEM / collagen / fibronectin mixture was then poured onto the cell droplets in an additional 1000 μL to completely cover the cell droplets and left at 37 ° C. for gelation. Finally, to cover the top gel layer, D-MEM without FCS containing antibiotic / antimycotic, L-glutamine and PBS blank or larval ES at the same concentration as in the gel was added. The assembled assay was then incubated at 37 ° C. in a humidified 5% CO ₂ atmosphere for the indicated times. During this time, aseptic conditions were maintained.

各実験を通じて、計４８時間の期間にわたって、位相差を用いる倒立Ｌｅｉｃａ（ＵＫ）ＤＭＩＲＢ顕微鏡を通して、細胞を観察した。２４時間の温置後に細胞遊走を定量するために、各ゲル内に包埋された各細胞小滴の領域全体を示す低倍率画像を使用した。ここで、２４時間の温置後の同じ小滴の画像上に０時間の時点での各細胞小滴の画像を重ね合わせるために、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＰａｉｎｔＳｈｏｐＰｒｏ６を使用した。図４に示されているように、次いで、ＬｅｉｃａＱＵＩＰＳソフトウェアを用いて、これらの複合画像を分析した。最初に、０時間での、各細胞小滴を取り囲む周囲の距離を計算した。この後、２４時間の期間にわたって、元の細胞小滴周囲を横切り、元の細胞小滴周囲から離れるように遊走した細胞の数を計数した。変動する小滴周囲距離を補正するために、遊走する細胞の数は、元の細胞小滴境界のｍｍ周囲長当りの細胞として表された。各細胞が周囲から離れるように遊走した直線距離も測定した。   Throughout each experiment, cells were observed through an inverted Leica (UK) DMIRB microscope using phase contrast for a total period of 48 hours. In order to quantify cell migration after 24 hours incubation, low magnification images showing the entire area of each cell droplet embedded in each gel were used. Here, Microsoft PaintShopPro6 was used to overlay the image of each cell droplet at time 0 on the same droplet image after 24 hours incubation. These composite images were then analyzed using Leica QUIIPS software as shown in FIG. Initially, the perimeter surrounding each cell droplet at 0 hour was calculated. This was followed by counting the number of cells that migrated away from and around the original cell droplets over a 24-hour period. In order to compensate for the varying droplet perimeter, the number of cells migrating was expressed as cells per mm perimeter of the original cell droplet boundary. The linear distance that each cell migrated away from the surroundings was also measured.

４８時間の温置後、４％パラホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ，Ａｌｄｅｒｍａｓｔｏｎ，ＵＫ）中に、２０分間、完全な状態のゲルを固定した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ^（Ｒ））を含有するＰＢＳで３回洗浄した。次いで、２０ｍＭＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）；４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３００ｍＭスクロース、５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ_２及び０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（全てＳｉｇｍａ^（Ｒ）から）を含有する氷冷した透過溶液（ｐＨ７．４）を添加し、１０分間放置した。再度、１％ＢＳＡでゲルを洗浄した。（エタノール中の）０．０８％ＦＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ^（Ｒ））溶液を１％ＢＳＡで１：１００希釈し、次いで、ゲルに添加した。３０分後、先述のように、ゲルを洗浄した。１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ^（Ｒ））を含有するＢＳＡ（１％）を添加し、ゲルを再度洗浄する前に、１分間放置した。 48 hours of incubation, 4% paraformaldehyde (TAAB, Aldermaston, UK) during the contain were fixed for 20 minutes, the intact gel, 1% bovine serum albumin ^{(BSA) (Sigma (R)} ) Wash 3 times with PBS. 20 mM N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N ′-(2-ethanesulfonic acid); 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES), 300 mM sucrose, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl ₂ and 0.5% TritonX-100 to permeate solution of ice-cold containing (all from Sigma ^{(R)) (pH7.4)} was added and allowed to stand for 10 minutes. The gel was washed again with 1% BSA. 1 (in ethanol) 0.08% FITC-phalloidin (Sigma ^(R)) solution with 1% BSA: 100 diluted, was then added to the gel. After 30 minutes, the gel was washed as before. It was added BSA (1%) containing 10 [mu] g / mL propidium iodide ^{(PI) (Sigma (R)} ), before washing the gel again, allowed to stand for 1 minute.

ＦＩＴＣ−ファロイジン／ＰＩ染色後、過剰な液体を除去するために、ゲルを慎重に吸収転移させ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛍光搭載培地及びカバーガラスを載せた。ＬｅｉｃａＤＭＲＢＥ直立蛍光顕微鏡を内蔵した共焦点ＬｅｉｃａＴＣＳ４Ｄシステムを用いてゲルを可視化した。遊走している細胞の形態を観察するために、細胞小滴の縁の最大強度画像を撮影した。ゲルの光学的断面のＺシリーズも撮影し、組み立て直後に固定及び染色された別のアッセイの撮影された光学的断面（０時間温置）と比較した。これは、小滴から全ての方向に細胞遊走が起こったことを示すために行われた。   After FITC-phalloidin / PI staining, in order to remove excess liquid, the gel was carefully absorbed and transferred and mounted with Bio-Rad fluorescence loaded medium and cover glass. Gels were visualized using a confocal Leica TCS4D system with a built-in Leica DMRBE upright fluorescence microscope. To observe the morphology of the migrating cells, a maximum intensity image of the edge of the cell droplet was taken. The Z series of gel optical cross sections was also photographed and compared to the photographed optical cross section (0 hour incubation) of another assay that was fixed and stained immediately after assembly. This was done to show that cell migration occurred in all directions from the droplet.

統計解析
各処理内において各細胞小滴反復のｍｍ周囲当りの遊走する細胞数に相当する値を平方根に変換した。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ^ＴＭソフトウェアを用いて、これらを一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットの多重比較検定にかけた。各処理内の各小滴反復下で、細胞によって達成された直線遊走距離をまとめた。次いで、正常な分布を確保するために、それらを対数変換し、適切な処理カテゴリー下において、幾何平均を順に並べた。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ^ＴＭソフトウェア内で使用できる一元配置のＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定を用いて、順に並べられた平均を解析した。全ての事例で、各分散を確認し、統計的な有意性をＰ＜０．０５と定義した。 Statistical analysis Within each treatment, the value corresponding to the number of migrating cells per mm circumference of each cell droplet repeat was converted to square root. These were then subjected to one-way analysis of variance (ANOVA) and Dunnett's multiple comparison test using GraphPad Prism ^™ software. The linear migration distance achieved by the cells under each droplet iteration within each treatment was summarized. They were then log-transformed to ensure normal distribution and the geometric means were ordered in order under the appropriate processing category. Sequential means were analyzed using a one-way ANOVA and Dunnett's multiple comparison test available within GraphPad Prism ^™ software. In all cases, each variance was confirmed and statistical significance was defined as P < 0.05.

三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化Ｉ
別の実験において、僅かな修飾を加えて、上述のように三次元インビトロアッセイを組み立てた。ここで、３×１０^５細胞／ｍＬのより低い細胞密度を含有する１つの２０μＬ小滴を各アッセイ中に組み込んだ。１μｇ／ｍＬＥＳ、５μｇ／ｍＬＥＳ又はＰＢＳブランク（対照）の何れかでアッセイを処理した。位相差顕微鏡を用いて、０、２４及び４８時間の温置後に、細胞の形態を観察した。ゲルマトリックスの外観にも着目した。 Three-dimensional in vitro assay-fibroblast morphology and matrix organization I
In another experiment, a three-dimensional in vitro assay was assembled as described above with minor modifications. Here, one 20 μL droplet containing a lower cell density of 3 × 10 ⁵ cells / mL was incorporated into each assay. Assays were treated with either 1 μg / mLES, 5 μg / mLES or PBS blank (control). Cell morphology was observed after 0, 24, and 48 hours incubation using a phase contrast microscope. We also focused on the appearance of the gel matrix.

三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞遊走
繊維芽細胞の遊走を調べるために、三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイ組み立て直後（０時間）又は４８時間の温置後（４８時間）に固定されたゲルの共焦点顕微鏡画像は、第一に、０時間の温置の時点で細胞小滴の外側に細胞が全く観察されなかったこと、第二に、４８時間にわたって細胞小滴からの細胞の遊走が水平及び垂直の両配向で起こることを確認し、遊走の三次元の性質を確認した（ＨｏｒｏｂｉｎＡＪＰｈＤｔｈｅｓｉｓ，２００４）。 Three-dimensional in vitro assay-fibroblast migration To examine fibroblast migration, a three-dimensional in vitro assay was assembled. Confocal microscopic images of gels fixed immediately after assay assembly (0 hour) or after 48 hours incubation (48 hours) show that first the cells are outside the cell droplets at 0 hour incubation. It was not observed at all, and secondly, it was confirmed that cell migration from cell droplets occurred in both horizontal and vertical orientation over 48 hours, confirming the three-dimensional nature of migration (HorobinAJPhDthesis, 2004). .

幼虫のＥＳに応答する細胞の遊走を定量する上で、２つの別個の実験を行った。一方の実験は、ＥＳが存在しない対照に対して０．１μｇ／ｍＬＥＳ及び５μｇ／ｍＬＥＳの効果を比較した。他方の実験は、別の対照と比較した場合の１μｇ／ｍＬＥＳ及び１０μｇ／ｍＬＥＳの効果を調べた。各実験において、同じフラスコ及び継代からの細胞を使用した。   In quantifying cell migration in response to larval ES, two separate experiments were performed. One experiment compared the effect of 0.1 μg / mL ES and 5 μg / mL ES against a control in the absence of ES. The other experiment examined the effect of 1 μg / mLES and 10 μg / mLES when compared to another control. In each experiment, cells from the same flask and passage were used.

各小滴からの細胞遊走を調べるために画像を撮影した。２４時間の温置で、５μｇ／ｍＬのＥＳの存在下での細胞の遊走が最も大規模であるように見受けられることが視覚的観察によって明らかとなった（図５ａ）。形態的には、これらの細胞は、対照内の細胞より十分に広がっているようにも見受けられ、周囲のゲル中に、より長く、より多数の伸長突起を突出させていた（図６ａ）。４８時間の温置までに、５μｇ／ｍＬＥＳに曝露されたゲルは半透明であり、皿の表面から剥離された状態となった。細胞小滴は収縮し、マトリックスを内側に引っ張り、小滴間のマトリックス内の張力を増加させた。この時点までに、１μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞は、それぞれの対照よりさらに遊走するように見受けられ（図５ｂ）、周囲のゲル中に長い伸長突起を有する十分に広がった形態も採っていた（図６ｂ）。これに対して、１０μｇ／ｍＬＥＳの存在下の細胞小滴はサイズが低下し、細胞の幾つかの領域は緊密な暗い塊へ収縮していた（図５ｂ）。これは、予めゲル化された溶液の、この時点で、透明な粘性のある液体状態と関連していた可能性がある。対照と比較すると、１０μｇ／ｍＬＥＳに曝露された細胞の形態は明確に異なっていた。ここでは、２４時間の温置において、細胞は多数の細い伸長突起を呈し、それらの幾つかは極めて長かった（図６ｃ）。４８時間の温置では、細胞は収縮して、丸くなるが、長く、細い細胞間伸長突起の突出を通じた他の細胞との直接的な物理的接触を維持していた（図６ｄ）。   Images were taken to examine cell migration from each droplet. Visual observation revealed that cell migration in the presence of 5 μg / mL ES appeared to be the most extensive at 24 hours incubation (FIG. 5a). Morphologically, these cells also appeared to spread more fully than the cells in the control, with longer and more elongated protrusions protruding in the surrounding gel (FIG. 6a). By 48 hours of incubation, the gel exposed to 5 μg / mL ES was translucent and became detached from the surface of the dish. The cell droplets shrunk and pulled the matrix inward, increasing the tension in the matrix between the droplets. By this time, cells exposed to 1 μg / mL ES appeared to migrate further than their respective controls (FIG. 5b), and also took a fully spread form with long elongated protrusions in the surrounding gel. (Figure 6b). In contrast, cell droplets in the presence of 10 μg / mL ES were reduced in size and some areas of the cells contracted into tight dark masses (FIG. 5b). This may have been associated with a clear viscous liquid state at this point of the pregelled solution. Compared to the control, the morphology of cells exposed to 10 μg / mL ES was distinctly different. Here, at 24 hours of incubation, the cells exhibited numerous thin elongated processes, some of which were extremely long (FIG. 6c). At 48 hours of incubation, the cells contracted and rounded, but maintained direct physical contact with other cells through the projection of long, thin intercellular elongated processes (FIG. 6d).

各小滴の全体を見ることができる低倍率画像を用いて、各小滴からの細胞遊走の合計を定量した。２４時間の温置で、適切な対照と比べて、遊走している細胞の数（Ｐ＜０．０１）（図７）及び移動した距離（Ｐ＜０．００１）（図８）の両方の観点で、５μｇ／ｍＬＥＳは細胞の遊走を有意に増強したことが分析によって確認された。１μｇ／ｍＬのＥＳも、その対照を上回って、細胞遊走を有意に増強した（細胞数に関してＰ＜０．０１及び移動した距離に関してＰ＜０．０５）（図７、８）。これに対して、１０μｇ／ｍＬのＥＳは、その対照と比べて、細胞遊走を有意に阻害した（細胞数に関してＰ＜０．０１及び移動した距離に関してＰ＜０．００１）（図７、８）。０．１μｇ／ｍＬＥＳへの曝露は、遊走する細胞の数を僅かに阻害するように見受けられた（対照に対してＰ＜０．０５）（図７）。しかしながら、０．１μｇ／ｍＬＥＳは、対照と比べて、遊走距離に対して有意な影響を有さず（Ｐ＞０．０５）（図８）、細胞の形態にも影響を与えないように見受けられた（データは示さず）。実験１の対照（図７ａ）中で遊走する細胞の数は実験２の対照（図７ｂ）中より高いことにも注目し得る。実験間のこのような差は、血球計測器を用いて細胞数を推定する場合に避けることができない誤差水準によってもたらされる細胞小滴内の細胞密度の僅かな差によるものであり得る。しかしながら、このような潜在的な変動源は実験間に存在するに過ぎず、（各実験内の各アッセイを組み立てるために、多数の細胞の計数に同じものが使用されたので）実験内には存在しない。従って、各実験内で結果を比較することはなお妥当であるが、実験間で結果を比較することは妥当でない。   The total cell migration from each droplet was quantified using a low magnification image where the whole of each droplet could be seen. Both the number of cells migrating (P <0.01) (FIG. 7) and distance traveled (P <0.001) (FIG. 8) compared to the appropriate controls at 24 hours incubation. In view, analysis confirmed that 5 μg / mL ES significantly enhanced cell migration. 1 μg / mL ES also significantly enhanced cell migration over that control (P <0.01 for cell number and P <0.05 for distance traveled) (FIGS. 7, 8). In contrast, 10 μg / mL ES significantly inhibited cell migration compared to its control (P <0.01 for cell number and P <0.001 for distance traveled) (FIGS. 7, 8). ). Exposure to 0.1 μg / mL ES appeared to slightly inhibit the number of migrating cells (P <0.05 vs control) (FIG. 7). However, 0.1 μg / mLES does not have a significant effect on migration distance (P> 0.05) compared to the control (FIG. 8) and does not appear to affect cell morphology. (Data not shown). It can also be noted that the number of cells migrating in the control of experiment 1 (FIG. 7a) is higher than in the control of experiment 2 (FIG. 7b). Such differences between experiments may be due to slight differences in cell density within the cell droplets caused by unavoidable error levels when estimating cell numbers using a hemocytometer. However, such a potential source of variation only exists between experiments, since within the experiment the same was used to count a large number of cells to assemble each assay within each experiment. not exist. Therefore, it is still valid to compare results within each experiment, but it is not reasonable to compare results between experiments.

三次元インビトロアッセイ−繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化ＩＩ
繊維芽細胞の形態及びマトリックスの組織化を調べるために、繊維芽細胞のより低い密度を含有する三次元インビトロアッセイを組み立てた。アッセイを組み立てた直後には、ＥＳの存在下又は不存在下の細胞は同じように見えた（図９）。しかしながら、２４時間の温置までに、１μｇ／ｍＬＥＳ、特に５μｇ／ｍＬＥＳの存在下の細胞は、ＥＳの不存在下の細胞より、より長い細胞質伸長突起を有するより十分に広がった形態を採った。５μｇ／ｍＬのＥＳが存在する場合には、細胞間の並列された鎖様結合性マトリックス原繊維が観察された。４８時間の温置では、アッセイ間の差はより顕著であった。この時点までに、ＥＳの不存在下では、細胞はより丸い状態となった（図９）。一方、１μｇ／ｍＬのＥＳ又は５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞は十分に広がった形態を維持していた。５μｇ／ｍＬのＥＳに曝露された細胞間で観察された、並列された鎖様結合性原繊維は、より見やすく、数が多かった。さらに、マトリックスはより透明であるように見え、原繊維の無作為な網目構造はより目立たなかった。 Three-dimensional in vitro assay-fibroblast morphology and matrix organization II
To examine fibroblast morphology and matrix organization, a three-dimensional in vitro assay containing a lower density of fibroblasts was assembled. Immediately after assembling the assay, cells in the presence or absence of ES looked the same (Figure 9). However, by 24 hours of incubation, cells in the presence of 1 μg / mL ES, especially 5 μg / mL ES, took a more fully expanded form with longer cytoplasmic extension processes than cells in the absence of ES. . In the presence of 5 μg / mL ES, parallel chain-like matrix fibrils between cells were observed. At 48 hours incubation, the difference between assays was more pronounced. By this time, cells were more rounded in the absence of ES (FIG. 9). On the other hand, cells exposed to 1 μg / mL ES or 5 μg / mL ES maintained a fully expanded morphology. The side-by-side chain-like binding fibrils observed between cells exposed to 5 μg / mL ES were more visible and numerous. Moreover, the matrix appeared to be more transparent and the random network structure of the fibrils was less noticeable.

（比較例１）
本発明者らは、ＥＳキモトリプシンの効果を市販のウシキモトリプシンと比較するためにさらなる実験を行った。従って、フィブロネクチンへの繊維芽細胞の接着に対するＥＳの効果をトリプシン及びキモトリプシンの市販の調製物と比較した。これは、ＥＳ、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンの様々な濃度の存在下で、フィブロネクチンで被覆された表面上に繊維芽細胞を播種することによって達成された。最大４８時間の温置期間後に、全ての培地から試料を吸引し、穏やかに洗浄して、表面に付着することができなかった細胞を除去した。次いで、検出されたＡＴＰの濃度に従って、表面上に残存する細胞の相対数を定量するためにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイを行った。トリプシン特異的な基質に対する活性の同等のレベルを含有するＥＳ及びトリプシンの効果を比較すると、ＥＳは、表面への繊維芽細胞の接着を低下させる上でより効果的であった。例えば、２４時間の温置後、５μｇ／ｍＬのＥＳは、対照の１６．６％まで細胞接着を低下させた（図１０ａ）。トリプシン特異的な蛍光発生基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対するＥＳの活性の１０３．２％を示した市販のトリプシン（１．６μｇ／ｍＬ）は、対照の３４．９％まで細胞接着を低下させた。４８時間の温置後、５μｇ／ｍＬＥＳの存在下での細胞接着は対照の９．３％まで減少したのに対して、１．６μｇ／ｍＬの市販のトリプシンは細胞の接着を対照の２４．７％まで低下させた。 (Comparative Example 1)
We conducted further experiments to compare the effects of ES chymotrypsin with commercial bovine chymotrypsin. Therefore, the effect of ES on fibroblast adhesion to fibronectin was compared with commercial preparations of trypsin and chymotrypsin. This was achieved by seeding fibroblasts on a fibronectin-coated surface in the presence of various concentrations of ES, commercial trypsin or commercial chymotrypsin. After an incubation period of up to 48 hours, samples were aspirated from all media and gently washed to remove cells that could not adhere to the surface. Adenosine triphosphate (ATP) assay was then performed to quantify the relative number of cells remaining on the surface according to the detected ATP concentration. When comparing the effects of ES and trypsin containing comparable levels of activity on trypsin-specific substrates, ES was more effective in reducing fibroblast adhesion to the surface. For example, after 24 hours of incubation, 5 μg / mL ES reduced cell adhesion to 16.6% of the control (FIG. 10a). Commercial trypsin (1.6 μg / mL), which showed 103.2% of the activity of ES against the trypsin-specific fluorogenic substrate Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC, showed cell adhesion to 34.9% of the control. Reduced. After 48 hours of incubation, cell adhesion in the presence of 5 μg / mL ES was reduced to 9.3% of the control, whereas 1.6 μg / mL commercial trypsin resulted in cell adhesion 24. Reduced to 7%.

キモトリプシン特異的な蛍光発生基質（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ）に対する５μｇ／ｍＬのＥＳの活性の９４．１％を示した市販のキモトリプシン（０．１μｇ／ｍＬ）は、繊維芽細胞の接着を修飾する能力を示さなかった（図１０ｂ）。キモトリプシン特異的な基質に対する５μｇ／ｍＬのＥＳの活性の２０４．９％を示す０．２μｇ／ｍＬの市販のキモトリプシンでさえ、繊維芽細胞接着に対して効果を有していなかった。市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの両方に曝露された繊維芽細胞は、市販のトリプシンのみの同様の濃度に曝露された細胞を上回る接着の修飾を同時に一切示さなかった。   Commercial chymotrypsin (0.1 μg / mL), which showed 94.1% of the activity of 5 μg / mL ES against chymotrypsin specific fluorogenic substrate (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC) It did not show the ability to modify cell adhesion (Figure 10b). Even 0.2 μg / mL of commercially available chymotrypsin, which shows 204.9% of the activity of 5 μg / mL ES against chymotrypsin specific substrate, had no effect on fibroblast adhesion. Fibroblasts exposed to both commercial trypsin and commercial chymotrypsin did not simultaneously show any modification of adhesion over cells exposed to similar concentrations of commercial trypsin alone.

これらの結果は、繊維芽細胞接着を修飾する上で、ＥＳ内に存在するキモトリプシンなどの酵素が市販のトリプシン若しくは市販のキモトリプシン単独又は組み合わせより有効であることを示している。ＥＳが繊維芽細胞の接着を修飾する能力が、タンパク質分解を介して、フィブロネクチンで被覆された表面を修飾するその能力と関連していることが以前の研究によって示されている（Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ２００３、上記）。従って、これらの結果は、細胞外マトリックスタンパク質を分解する上で、ＥＳは、市販のトリプシン又は市販のキモトリプシンより有効であり得ることを示唆している。これは、ゲル電気泳動を用いて確認される。ここでは、トリプシン特異的又はキモトリプシン特異的な基質に対して類似の活性を有する溶液を得るために、幼虫のＥＳ、市販のトリプシン、市販のキモトリプシン又は市販のトリプシンと市販のキモトリプシンの組み合わせの試料を希釈した。次いで、１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離する前に、２４時間、ウシフィブロネクチン（１００μｇ／ｍＬ）を、３７℃で、これらの溶液に曝露した。図示されているように、ＥＳは、市販の両酵素と比較した場合に、フィブロネクチンを主により小さな断片へより大規模に分解した（図１１）。さらに、ＥＳ内に存在するタンパク質分解性酵素は繊維芽細胞の遊走を強化することが示された（Ｈｏｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ２００５上記）。これは、繊維芽細胞の接着の変化と関連し得る。創傷の中で、繊維外細胞の遊走の加速は、創傷空間中への肉芽組織増殖を促進し得る。このように、ＥＳ由来の酵素は、現在市販されている酵素より有効な創傷郭清因子であることが明らかとなり得るのみならず、創傷治癒応答も同時に増強し得る。   These results indicate that enzymes such as chymotrypsin present in ES are more effective than commercially available trypsin or commercially available chymotrypsin alone or in combination in modifying fibroblast adhesion. Previous studies have shown that the ability of ES to modify fibroblast adhesion is related to its ability to modify fibronectin-coated surfaces via proteolysis (Horobin et al 2003, the above). Thus, these results suggest that ES may be more effective than commercially available trypsin or commercially available chymotrypsin in degrading extracellular matrix proteins. This is confirmed using gel electrophoresis. Here, in order to obtain solutions with similar activity against trypsin-specific or chymotrypsin-specific substrates, samples of larval ES, commercially available trypsin, commercially available chymotrypsin or a combination of commercially available trypsin and commercially available chymotrypsin are used. Diluted. Bovine fibronectin (100 μg / mL) was then exposed to these solutions at 37 ° C. for 24 hours before separation on a 12% polyacrylamide gel. As shown, ES degraded fibronectin predominantly on a larger scale when compared to both commercially available enzymes (FIG. 11). Furthermore, proteolytic enzymes present in ES have been shown to enhance fibroblast migration (Horobin et al 2005, supra). This may be associated with a change in fibroblast adhesion. Within the wound, acceleration of extrafibrotic cell migration can promote granulation tissue growth into the wound space. Thus, not only can the ES-derived enzyme be a more effective wound dissection factor than currently available enzymes, but it can simultaneously enhance the wound healing response.

（実施例２）
創傷郭清
ウジのキモトリプシンの精製
Ｌ．セリカータＥＳ産物のＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００クロマトグラフィー。 (Example 2)
Wound dissection Purification of maggot trypsin from maggots Sephacryl S300 chromatography of Sericata ES product.

ガラスクロマトグラフィーカラム（１．５ｃｍ×５０ｃｍ）にＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲを充填し、ＰＢＳで平衡化した（流速０．３３ｍＬ／分）。幅広い範囲のゲルろ過標準物質（２００−１２．５ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ）を用いて、カラムを較正し、空隙容量を求めた。Ｌ．セリカータのＥＳ産物約２ｍＬ（０．５ｍｇ）をカラムにかけ、空隙容量５０画分の溶出後（２ｍＬ／画分）を集め、それぞれ、蛍光性基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ及びトリス−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用いて、キモトリプシン及びトリプシン活性に関してアッセイを行った。Ｓ３００ゲルろ過後のキモトリプシン／トリプシン活性を示す図１４及び１５を参照されたい。典型的には、トリプシンが濃縮された２つのピーク（Ｔ１及びＴ２と名付けられた。）及びキモトリプシン活性が濃縮された１つのピーク（Ｃ１と名付けられた。）というタンパク質分解活性の３つのピークが観察された。図１５は、ゼラチンＳＤＳ−ＰＡＧＥ基質ゲル分析によって測定された活性の各ピークに対して典型的なタンパク質分解特性も示す。   A glass chromatography column (1.5 cm × 50 cm) was packed with Sephacryl S-300HR and equilibrated with PBS (flow rate 0.33 mL / min). The column was calibrated using a wide range of gel filtration standards (200-12.5 kDa, Sigma) to determine void volume. L. About 2 mL (0.5 mg) of the ES product of sericata was applied to the column, and after elution (2 mL / fraction) of the void volume of 50 fractions, the fluorescent substrates Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC and Tris were collected, respectively. -Assays for chymotrypsin and trypsin activity using Gly-Pro-Arg-AMC. See FIGS. 14 and 15 showing chymotrypsin / trypsin activity after S300 gel filtration. There are typically three peaks of proteolytic activity: two peaks enriched in trypsin (named T1 and T2) and one peak enriched in chymotrypsin activity (named C1). Observed. FIG. 15 also shows typical proteolytic properties for each peak of activity measured by gelatin SDS-PAGE substrate gel analysis.

蛍光性合成ペプチド基質を用いたキモトリプシン／トリプシン活性のアッセイ
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ（キモトリプシン）及びトシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（トリプシン）からの放出をモニタリングすることによって、キモトリプシン／トリプシン活性を評価した。ＰＢＳ中に希釈された基質１５０μＬ（５μＭ）とともに各画分５０μＬを温置した。３７℃で３０分間、試料を温置し、その後、ＤｙｎｅｘＭＦＸマイクロプレート蛍光光度計を用いて蛍光を測定した（励起３６５ｎｍ、発光検出４６５ｎｍ）。ゼロ時点の読み取りの推測後、３０分にわたって発せられた蛍光単位の数として、タンパク質分解活性を表す。 Assay of chymotrypsin / trypsin activity using a fluorescent synthetic peptide substrate 7-amino-4-methylcoumarin (AMC), Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC (chymotrypsin) and tosyl-Gly-Pro-Arg- Chymotrypsin / trypsin activity was assessed by monitoring release from AMC (trypsin). 50 μL of each fraction was incubated with 150 μL (5 μM) of substrate diluted in PBS. Samples were incubated for 30 minutes at 37 ° C., after which fluorescence was measured using a DynexMFX microplate fluorometer (excitation 365 nm, emission detection 465 nm). Proteolytic activity is expressed as the number of fluorescent units emitted over 30 minutes after estimation of the zero time point reading.

ゼラチン基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたキモトリプシン／トリプシン活性のアッセイ
Ｋｕｍａｒ＆Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ（１９９２）によって記載された方法を用いて、基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。分離ゲル中に０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含めて、１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製した。ゼラチンを溶解するために、ゲルを５５℃まで加温した。各画分１０μＬを非還元試料緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、２０％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．０１ ％ブロモフェノールブルー）の等容量と混合し、３７℃で３０分間温置した。次いで、スタッキングゲル中に形成された各ウェルに画分を適用し、２０ｍＡの定常電流で試料を電気泳動した。電気泳動後、Ｌａｃｋｓ＆Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎ（１９８０）によって記載されたように酵素を再生するために、室温で２０分間、２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中でゲルを洗浄した。次いで、水の中で２０分間、ゲルを洗浄し、最後に、ＰＢＳ中において、３７℃で一晩温置した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅＲ２５０でゲルを染色することによって、タンパク分解活性を検出し、青の背景に対する透明なバンドの領域として観察される。 Assay of chymotrypsin / trypsin activity using gelatin substrate SDS-PAGE Substrate SDS-PAGE was performed using the method described by Kumar & Pritchard (1992). A 12% (w / v) SDS-PAGE gel was prepared with 0.1% (w / v) gelatin in the separation gel. The gel was warmed to 55 ° C. to dissolve the gelatin. Mix 10 μL of each fraction with an equal volume of non-reducing sample buffer (0.5 M Tris, pH 6.8, 5% SDS (w / v), 20% glycerol (w / v), 0.01% bromophenol blue). And incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The fraction was then applied to each well formed in the stacking gel and the sample was electrophoresed at a constant current of 20 mA. After electrophoresis, the gel was washed in 2.5% Triton X-100 for 20 minutes at room temperature to regenerate the enzyme as described by Lacks & Springhorn (1980). The gel was then washed in water for 20 minutes and finally incubated at 37 ° C. overnight in PBS. Proteolytic activity is detected by staining the gel with Coomassie brilliant blueR250 and is observed as a region of a clear band against a blue background.

大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるキモトリプシンの精製
キモトリプシン活性のＣ１プールの塩濃度を０．５ＭＮａＣｌに調整し、ＰＢＳ、０．５ＭＮａＣｌで平衡化された大豆トリプシン阻害剤アガロースカラム３ｍＬ（流速０．２ｍＬ／分）にかけた。カラムを通過する緩衝液の２８０ｎｍでの吸光度がゼロになるまで、ＰＢＳ、０．５ＭＮａＣｌでカラムを洗浄した。０．７％エタノールアミンによって、結合されたタンパク質を溶出し、１ｍＬ画分を集め、２ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（１：１ｖ／ｖ）で直ちに中和し、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した（図１６）。蛍光性基質及びゼラチンＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いるタンパク分解活性に関して、溶出されたタンパク質をアッセイした（図１７）。 Purification of chymotrypsin by affinity chromatography on soybean trypsin inhibitor agarose 3 ml of soybean trypsin inhibitor agarose column equilibrated with PBS, 0.5 M NaCl adjusted to salt concentration of C1 pool of chymotrypsin activity to 0.5 M NaCl 0.2 mL / min). The column was washed with PBS, 0.5 M NaCl until the absorbance at 280 nm of the buffer passing through the column was zero. Bound protein was eluted with 0.7% ethanolamine and 1 mL fractions were collected, immediately neutralized with 2M Tris-Cl (1: 1 v / v), pooled and dialyzed overnight against PBS ( FIG. 16). The eluted protein was assayed for proteolytic activity using a fluorescent substrate and gelatin SDS-PAGE (FIG. 17).

図１７は、Ｃ１プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はキモトリプシンの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣを切断し、ＰＭＳＦによってのみ阻害され得ることが示された。トリプシンの基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも３つの異なる領域が観察された（矢印が付されている。）。   FIG. 17 shows the proteolytic activity and inhibitor characterization of protein bound to soybean trypsin inhibitor agarose after application of the C1 pool. It was shown that the protein eluting from the soybean trypsin inhibitor agarose column cleaves the chymotrypsin substrate Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Arg-AMC and can only be inhibited by PMSF. No activity was observed against the trypsin substrate tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC. When analyzed by gelatin substrate SDS-PAGE, at least three different regions of proteolytic activity were observed (marked with arrows).

大豆トリプシン阻害剤アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるトリプシンの精製
同様に、大豆トリプシン阻害剤カラムにトリプシン画分のＴ２プールを通した。カラムから溶出する画分を直ちに中和し、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した（図１９）。 Purification of Trypsin by Affinity Chromatography on Soybean Trypsin Inhibitor Agarose Similarly, a T2 pool of trypsin fraction was passed through a soybean trypsin inhibitor column. Fractions eluting from the column were immediately neutralized, pooled and dialyzed overnight against PBS (Figure 19).

図１９は、Ｔ２プールの適用後に大豆トリプシン阻害剤アガロースに結合されたタンパク質のタンパク質分解活性及び阻害剤の性質決定を示している。大豆トリプシン阻害剤アガロースカラムから溶出するタンパク質はトリプシンの基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣを切断し、ＰＭＳＦ及びＡＰＭＳＦによって阻害され得ることが示された。キモトリプシンの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣに対しては、活性が見られなかった。ゼラチン基質ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、タンパク質分解活性の少なくとも１つの明瞭な領域が観察された（矢印が付されている。）。   FIG. 19 shows the proteolytic activity and inhibitor characterization of proteins bound to soybean trypsin inhibitor agarose after application of the T2 pool. It was shown that the protein eluting from the soybean trypsin inhibitor agarose column cleaves the trypsin substrate tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC and can be inhibited by PMSF and APMSF. No activity was observed against the chymotrypsin substrate Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Arg-AMC. When analyzed by the gelatin substrate SDS-PAGE, at least one distinct region of proteolytic activity was observed (arrowed).

創傷痂皮に対するＥＳ産物の効果
Ｌ．セリカータＥＳ産物１０μｇとともに、創傷痂皮の約１ｍｇを一晩温置した。温置後、Ｂｉｏｒａｄ等電点電気泳動再水和緩衝液（８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭＤＴＴ、０．２％Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）中に処理された痂皮及び処理されていない痂皮を溶解した。Ｂｉｏｒａｄ２Ｄタンパク質「クリーンアップ」キットを用いて、タンパク質をさらに精製し、得られた沈降物を等電点電気泳動再水和緩衝液中に再度可溶化した。 Effect of ES product on wound crust L. About 1 mg of wound crust was incubated overnight with 10 μg of Sericata ES product. After incubation, treated and untreated scabs were dissolved in Biorad isoelectric focusing rehydration buffer (8M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0.2% Ampholytes). The protein was further purified using the Biorad 2D protein “cleanup” kit, and the resulting precipitate was resolubilized in isoelectric focusing rehydration buffer.

次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するＥＳ産物の効果を調べた。製造業者によって記載された条件下で、「ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ」７ｃｍＩＰＧ片ｐＨ３から１０（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、タンパク質約１００μｇを一次元に集中させた。１０％トリセンゲルを用いて、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（Ｓｃｈａｇｇｅｒ ａｎｄ Ｖｏｎｊａｇｏｗ，１９８７）。ＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーＲ２５０でゲルを染色した。図２０。   The effect of the ES product on the wound crust was then examined by two-dimensional gel analysis. Approximately 100 μg of protein was concentrated in one dimension using “Ready Strip” 7 cm IPG strips pH 3 to 10 (Biorad) under the conditions described by the manufacturer. Two-dimensional SDS-PAGE was performed using 10% Tricene gel (Schagger and Vonjagow, 1987). The gel was stained with Coomassie blue R250. FIG.

創傷痂皮に対するキモトリプシン／トリプシンプールの効果
Ｌ．セリカータＣ１、Ｔ１又はＴ２プール１００μＬとともに、創傷痂皮の約１ｍｇを一晩温置した。温置後、処理された痂皮及び処理されていない痂皮を上記のように処理した。 Effect of chymotrypsin / trypsin pool on wound crusts. Approximately 1 mg of wound crust was incubated overnight with 100 μL of Sericata C1, T1, or T2 pool. After incubation, treated and untreated crusts were treated as described above.

次いで、二次元ゲル分析によって、創傷痂皮に対するＣ１、Ｔ１又はＴ２プールの効果を調べた。上記のように、タンパク質約１００μｇを二次元に集中させた。ＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーＲ２５０でゲルを染色した。図２１。   The effect of the C1, T1 or T2 pool on the wound crust was then examined by two-dimensional gel analysis. As above, about 100 μg of protein was concentrated in two dimensions. The gel was stained with Coomassie blue R250. FIG.

Ｌ．セリカータのキモトリプシン遺伝子をクローニングする
ＮｃｏＩ制限部位（５’−ＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＡＧＴＴ−３’）を付加するフォワードプライマー及びＮｈｅＩ部位（５’−ＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＧ−３’）を付加するリバースプライマーを使用するＰＣＲによって、ｃＤＮＡライブラリーからＬ．セリカータキモトリプシノーゲンの完全長翻訳領域（ＯＲＦ）を増幅した。生じた断片をｐＢａｃ−３中のポリヘドリンプロモーターの下流にクローニングさし、配列決定し（図１２）、アミノ酸配列を予想した（図１３）。 L. Cloning the Sericata chymotrypsin gene by PCR using a forward primer that adds an NcoI restriction site (5′-CTGCCCATGGTCATGAAATTCTTAATATAGTT-3 ′) and a reverse primer that adds an NheI site (5′-GACGCTAGCATAAGAAAATTCCGGTGTG-3 ′) To L. The full-length translation region (ORF) of Sericata chymotrypsinogen was amplified. The resulting fragment was cloned downstream of the polyhedrin promoter in pBac-3, sequenced (FIG. 12), and predicted amino acid sequence (FIG. 13).

従って、ルシリア・セリカータのＥＳが本明細書に示されているアミノ酸及びＤＮＡ配列を有するキモトリプシン酵素を含有し、この酵素は創傷を郭清するとともに、繊維芽細胞の遊走の促進によって、マトリックス再構築の促進によって、及び繊維芽細胞の形態の修飾によって創傷の治癒を促進すると結論付けることができる。   Thus, the Lucilia sericata ES contains a chymotrypsin enzyme having the amino acid and DNA sequences shown herein, which dissects the wound and promotes fibroblast migration to reconstruct the matrix It can be concluded that the promotion of wounds and the healing of wounds by modification of the fibroblast morphology.

Claims (25)

昆虫の幼虫から得られる単離されたキモトリプシン又はその合成様式。   An isolated chymotrypsin obtained from an insect larva or a synthetic mode thereof. キモトリプシンが図１若しくは図１３の配列を有し、又は図１、２若しくは１２のＤＮＡ配列によってコードされる、請求項１に記載のキモトリプシン。   14. Chymotrypsin according to claim 1, wherein the chymotrypsin has the sequence of FIG. 1 or FIG. 13 or is encoded by the DNA sequence of FIG. 請求項１又は請求項２に記載のキモトリプシンと同じ活性を有するキモトリプシンの断片。   A fragment of chymotrypsin having the same activity as the chymotrypsin according to claim 1 or 2. キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫から得られる、請求項１から３の何れか一項に記載のキモトリプシン。   The chymotrypsin according to any one of claims 1 to 3, wherein the chymotrypsin is obtained from a larva of Lucilia sericata. キモトリプシンがルシリア・セリカータの幼虫の***物／分泌物から得られる、請求項１から４の何れか一項に記載のキモトリプシン。   The chymotrypsin according to any one of claims 1 to 4, wherein the chymotrypsin is obtained from the excretion / secretion of Lucilia sericata larvae. 幼虫が新たに孵化されている、請求項１から５の何れか一項に記載のキモトリプシン。   The chymotrypsin according to any one of claims 1 to 5, wherein the larva is newly hatched. 幼虫が初齢である、請求項１から５の何れか一項に記載のキモトリプシン。   The chymotrypsin according to any one of claims 1 to 5, wherein the larva is first-aged. 幼虫が無菌環境中で育てられる、請求項１から７の何れか一項に記載のキモトリプシン。   The chymotrypsin according to any one of claims 1 to 7, wherein the larvae are grown in a sterile environment. 創傷の治療において使用するための、請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む組成物。   9. A composition comprising chymotrypsin according to any one of claims 1 to 8 for use in the treatment of wounds. 創傷の治療用医薬の調製における、請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンの使用。   Use of chymotrypsin according to any one of claims 1 to 8 in the preparation of a medicament for the treatment of wounds. キモトリプシンが図１、図２若しくは図１３の配列を有し、又は図１、２若しくは１２のＤＮＡ配列によってコードされる、請求項９又は請求項１０に記載の使用。   Use according to claim 9 or claim 10, wherein the chymotrypsin has the sequence of Fig. 1, Fig. 2 or Fig. 13 or is encoded by the DNA sequence of Fig. 1, 2 or 12. キモトリプシンの活性な断片が使用される、請求項９から１１の何れかに記載の使用。   12. Use according to any of claims 9 to 11, wherein an active fragment of chymotrypsin is used. キモトリプシンが合成である、請求項９から１２の何れか一項に記載の使用。   13. Use according to any one of claims 9 to 12, wherein chymotrypsin is synthetic. キモトリプシンがルシリア・セリカータから得られる、請求項９から１３の何れか一項に記載の使用。   14. Use according to any one of claims 9 to 13, wherein chymotrypsin is obtained from Lucilia sericata. 創傷が、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど（熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどを含む。）、皮膚の擦過又は暴行、骨髄炎並びに整形外科的創傷を含む群から選択される、請求項９から１４の何れか一項に記載の使用。   Wounds are cuts, stabs, surgical wounds, ulcers, pressure ulcers, burns (including burns caused by heat, freezing, chemicals, electricity and radiation), skin abrasion or assault, osteomyelitis and orthopedic wounds 15. Use according to any one of claims 9 to 14, selected from the group comprising 創傷が感染状態である、請求項９から１５の何れか一項に記載の使用。   16. Use according to any one of claims 9 to 15, wherein the wound is in an infected state. 創傷が慢性的である、請求項９から１６の何れか一項に記載の使用。   Use according to any one of claims 9 to 16, wherein the wound is chronic. 創傷が繊維芽細胞遊走の促進によって治療される、請求項９から１７の何れか一項に記載の使用。   18. Use according to any one of claims 9 to 17, wherein the wound is treated by promoting fibroblast migration. 創傷がマトリックス再構築の促進によって治療される、請求項９から１７の何れか一項に記載の使用。   18. Use according to any one of claims 9 to 17, wherein the wound is treated by promoting matrix remodeling. 創傷が繊維芽細胞形態の修飾によって治療される、請求項９から１７の何れか一項に記載の使用。   18. Use according to any one of claims 9 to 17, wherein the wound is treated by modification of fibroblast morphology. 創傷がキモトリプシンによって郭清される、請求項９から２０の何れか一項に記載の使用。   21. Use according to any one of claims 9 to 20, wherein the wound is dissected by chymotrypsin. 請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む、創傷用の包帯。   A wound dressing comprising the chymotrypsin according to any one of claims 1-8. 請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを含む医薬組成物。   A pharmaceutical composition comprising chymotrypsin according to any one of claims 1 to 8. 治療を必要としている創傷に、請求項１から８の何れか一項に記載のキモトリプシンを適用することを含む、創傷を治療する方法。   A method of treating a wound comprising applying a chymotrypsin according to any one of claims 1 to 8 to a wound in need of treatment. 請求項２２に記載の包帯、請求項９に記載の組成物又は請求項２３に記載の医薬組成物を、治療を必要としている創傷に適用する段階を含む、創傷を治療する方法。   24. A method of treating a wound comprising applying the bandage of claim 22, the composition of claim 9 or the pharmaceutical composition of claim 23 to a wound in need of treatment.

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