JP2009537812A - Biomarker for type 2 diabetes preform and method for detecting the presence or absence of type 2 diabetes preform - Google Patents
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Abstract
耐糖能異常など、代謝性障害、特に２型糖尿病又はインスリン欠損と関連する他の病態若しくは疾患の前形成状態の診断、予後予測、及び層別化の方法。単独又は併用で２型糖尿病のプリフォームの診断、予後予測、又は層別化を可能とするペプチド。加えて、本発明は、前記方法のための試験キット、並びに新規のペプチド分子及びその使用に関する。 Methods for diagnosing, prognosticating and stratifying the pre-formed state of metabolic disorders, such as impaired glucose tolerance, particularly type 2 diabetes or other conditions or diseases associated with insulin deficiency. A peptide that enables diagnosis, prognosis prediction, or stratification of a type 2 diabetes preform alone or in combination. In addition, the present invention relates to a test kit for said method, as well as to novel peptide molecules and their use.
Description
本出願は、耐糖能異常（ＩＧＴ）など、２型糖尿病プリフォーム又はインスリン欠損と関連する他の病態若しくは疾患の診断、予後予測、及び層別化の方法に関する。具体的には、単独又は併用で２型糖尿病プリフォームの診断、予後予測、又は層別化（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を可能にする新規のペプチドを提供する。
The present application relates to methods for diagnosis, prognosis, and stratification of
糖尿病とは、インスリン分泌、インスリン作用、又はその両方の欠損から生じる高血糖を特徴とする代謝性疾患の群である。糖尿病の慢性高血糖は、各種の器官、特に、眼、腎臓、神経、心臓、及び血管の長期にわたる損傷、機能障害、不全を伴う。世界保健機構（「ＷＨＯ」）は、１型糖尿病、２型糖尿病、及び妊娠性糖尿病（又は３型糖尿病、妊娠中に生じる）という糖尿病の３大形態を認めているが、糖尿病のこれらの３つの「型」は、単一の疾患というよりも、より正確には膵不全のパターンとして考えられる。１型糖尿病がインスリン産生細胞の自己免疫性破壊に起因するのに対し、２型糖尿病及び妊娠性糖尿病は、組織によるインスリン抵抗性に起因する。
Diabetes is a group of metabolic diseases characterized by hyperglycemia resulting from a deficiency in insulin secretion, insulin action, or both. Diabetic chronic hyperglycemia is associated with long-term damage, dysfunction, and failure of various organs, particularly the eyes, kidneys, nerves, heart, and blood vessels. The World Health Organization (“WHO”) recognizes three major forms of diabetes:
糖尿病の危険性のスクリーニングを目的として、異常なグルコースホメオスタシスの分類が定義されている。耐糖能異常（ＩＧＴ）と、より近年に創出された分類である空腹時血糖異常（ＩＦＧ）とは、それぞれ、糖負荷後血糖値又は空腹時血糖値（ＦＰＧ）に基づき、糖尿病を発症する危険性の高い個体を同定する。ＩＧＴ及びＩＦＧは、「前糖尿病」と総称されるが、基礎的な病態生理において異なる。ＩＦＧにおいてはインスリン分泌の欠損が明らかであることが多いのに対し、ＩＧＴにおいてはインスリン感受性の異常がより明らかであることがある。人口の大半において、ＩＧＴの方がＩＦＧよりもはるかに高頻度であるため、前者の方が糖尿病を発症する人々のより大きな割合を示す。ＩＧＴ及びＩＦＧは、糖尿病への異なる進行速度及び心血管疾患（ＣＶＤ）の危険性における差と関連することが示唆されている。複数の研究結果は、食後の高血糖（又は血糖負荷２時間後の血糖値）の方が、空腹時血糖値よりも、将来の心血管疾患事象の危険性を評価するのに優れていることを示す。ＣＶＤ又は将来の糖尿病の危険性は血糖値範囲にわたって連続的であるように思われ、範囲の区切りは、証拠よりもむしろ同意に基づいている。
For the purpose of screening for the risk of diabetes, a class of abnormal glucose homeostasis has been defined. Glucose intolerance (IGT) and a more recently created category of fasting blood glucose abnormalities (IFG) are the risk of developing diabetes based on post-glucose glucose levels or fasting blood glucose levels (FPG), respectively. Identify highly individual individuals. IGT and IFG are collectively referred to as “pre-diabetes” but differ in their basic pathophysiology. In IFG, a deficiency in insulin secretion is often evident, whereas in IGT, abnormal insulin sensitivity may be more apparent. In the majority of the population, IGT is much more frequent than IFG, so the former represents a greater percentage of people who develop diabetes. It has been suggested that IGT and IFG are associated with different rates of progression to diabetes and differences in cardiovascular disease (CVD) risk. Multiple studies have shown that postprandial hyperglycemia (or
２時間のＯＧＴＴ（経口ブドウ糖負荷試験）は、その診断的価値にもかかわらず、患者及び検査者の双方にとって煩雑で時間をとるため、多くの医療提供者は、同試験法の施行に消極的である。したがって、ＩＧＴの特異的でより正確な診断を可能とする別のマーカーを同定することが望ましい。 The two-hour OGTT (oral glucose tolerance test), despite its diagnostic value, is cumbersome and time consuming for both the patient and the examiner, and many health care providers are reluctant to perform the test. It is. Therefore, it is desirable to identify another marker that allows a specific and more accurate diagnosis of IGT.
２型糖尿病、耐糖能異常（ＩＧＴ）、肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、及びアテローム性動脈硬化は、すべて相互に関連する疾患である。
耐糖能異常又はＩＧＴは、正常よりも高いが、糖尿病患者の場合よりも低い血糖値を定義する名称である。ＩＧＴは、（ｉ）インスリンの分泌異常と、（ｉｉ）インスリン感受性の低下（インスリン抵抗性）との組合せである。 Glucose intolerance or IGT is a name that defines a blood glucose level that is higher than normal but lower than in diabetic patients. IGT is a combination of (i) abnormal insulin secretion and (ii) reduced insulin sensitivity (insulin resistance).
耐糖能異常（ＩＧＴ）は、後年に２型糖尿病及び心血管疾患（ＣＶＤ）を発症する危険性の高さと関連する主要な健康問題である。ＩＧＴ及びＩＦＧは「前糖尿病」と総称されるが、ＩＦＧは、ＩＧＴとは異なる病態生理的特徴を有する。人口の大半において、ＩＧＴの方がＩＦＧよりもはるかに高頻度であるため、前者の方が糖尿病を発症する人々のより大きな割合を同定する。ＩＧＴは、経口ブドウ糖負荷試験のみにより同定することができ、空腹時血糖値（ＦＰＧ）の測定にはよらない。さらに、ＩＧＴは、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性症候群、又は症候群Ｘとして知られる、相互に関連する心血管危険因子の一群と関連することが多い。
Glucose intolerance (IGT) is a major health problem associated with an increased risk of developing
通常、いわゆる経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施して、ＩＧＴ又は糖尿病の存在を判定する。すなわち、ＩＧＴ患者においては、７５ｇグルコースを摂取した後に生じる血糖の増加が正常よりも大きく、とりわけ長時間続く、すなわち、６．７ｍＭ超１０ｍＭ未満の血漿グルコースを示す。ＷＨＯが定義する通り、７５ｇグルコースの摂取２時間後に決定した血糖値（ＯＧＴＴ）１０ｍＭ以上から、糖尿病の血糖値となる。空腹時血糖値は、正常又は中程度に上昇する。ＩＧＴは、２型糖尿病へと進行する高い危険性、米国糖尿病学会が「前糖尿病」と呼ぶ状態、又は境界型糖尿病若しくは無症状糖尿病を生じる高い危険性を伴う。すなわち、ＩＧＴを発症する人々には、正常な耐糖能に戻りうる人々もいる。ＩＧＴの状態にとどまる人々もいる。しかし、ＩＧＴを発症すると、体内のインスリン分泌及び感受性が減退し続ける傾向があり、最終的には２型糖尿病を生じる。実際、ＩＧＴを有する個体の約４０〜５０％は、１０年以内に２型糖尿病を発症する（心血管疾患及び微小血管合併症の危険性増大を伴う）。現在のところ、ＩＧＴ患者の数が最も多く、有病率が最も高い東南アジア地域では、３億１４００万人の人々がＩＧＴを有すると推定されている。ＩＧＴの有病率は年齢とともに上昇し、男女間に著明な差はなく、特定の民族集団がＩＧＴのより高い有病率を有し、欧州におけるＩＧＴの有病率は米国の場合と同様であることが判明した。
Usually a so-called oral glucose tolerance test (OGTT) is performed to determine the presence of IGT or diabetes. That is, in IGT patients, the increase in blood glucose that occurs after ingesting 75 g glucose is greater than normal, and especially lasts for a long time, ie, more than 6.7 mM and less than 10 mM plasma glucose. As defined by WHO, the blood glucose level of diabetes is determined from a blood glucose level (OGTT) of 10 mM or more determined 2 hours after ingestion of 75 g glucose. Fasting blood glucose levels rise to normal or moderate. IGT is associated with a high risk of progression to
別の研究は、２型糖尿病患者が追跡期間中に死亡する可能性は、正常な血糖コントロールを有する人々と比べて２倍超高いことを示した。ＩＧＴ患者が追跡期間中に心血管合併症で死亡する可能性は、正常な血糖コントロールを有する人々と比べて５０％超高かった。
Another study showed that
今日、ＩＧＴは、上記に示した通り、個体が７５ｇグルコースを摂取し、１及び２時間後にそれぞれ血糖値を決定する、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて判定される。或いは、被験者が試料採取以前に何も食べないように求められる、空腹時血糖値試験が用いられる。ＩＧＴを有する患者は、病態の診断がまれであるために、治療されることもまれである。ＩＧＴは、身体活動を増やすこと、健康な体重を維持すること、及び健康的でバランスのとれた食事をとることによって予防することができる。 Today, IGT is determined using the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT), where an individual consumes 75 g glucose and determines blood glucose levels after 1 and 2 hours, respectively, as indicated above. Alternatively, a fasting blood glucose test is used, where the subject is asked not to eat anything before sampling. Patients with IGT are rarely treated because the diagnosis of the condition is rare. IGT can be prevented by increasing physical activity, maintaining a healthy weight, and eating a healthy and balanced diet.
上記の観点から、ＩＧＴの判定及び診断を可能とする手段を提供することに対する依然として強い関心が存在する。 In view of the above, there remains a strong interest in providing a means that allows for the determination and diagnosis of IGT.
メタボリックシンドロームは、糖尿病又は前糖尿病、腹部肥満又は肥満、コレステロールの変化、及び高血圧という、最も危険な心血管疾患（ＣＶＤ）の危険因子の一群である。腹部肥満又は肥満は、メタボリックシンドロームの有病率の上昇の主な原因である。肥満は、インスリン抵抗性と因果関係のある軽度の炎症状態に寄与する複数の急性期タンパク質及び炎症性サイトカインの循環レベルの上昇と関連する。インスリン抵抗性は、メタボリックシンドローム患者の大半において存在し、心血管疾患及び２型糖尿病の危険性とも強く関連している。
Metabolic syndrome is a group of risk factors for the most dangerous cardiovascular disease (CVD): diabetes or pre-diabetes, abdominal obesity or obesity, cholesterol changes, and hypertension. Abdominal obesity or obesity is a major cause of increased prevalence of metabolic syndrome. Obesity is associated with elevated circulating levels of multiple acute phase proteins and inflammatory cytokines that contribute to a mild inflammatory state that is causally related to insulin resistance. Insulin resistance is present in the majority of patients with metabolic syndrome and is also strongly associated with the risk of cardiovascular disease and
脂肪組織又は脂肪細胞は、「アディポカイン」と総称される広範なタンパク質因子を分泌又は放出する。これらのアディポカインは、脂質代謝、インスリン感受性、副経路補体系、血管止血、血圧調節、及び血管新生のほか、エネルギーバランスの調節に関与する。加えて、炎症（ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、形質転換成長因子、神経成長因子）及び急性期反応（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ）に関与するアディポカインのリストが増大しつつある。ＰＡＩ−１レベルの上昇が血栓形成促進状態に寄与する一方、アディポネクチンの低レベルは、代謝性危険因子の増悪と相関する。インスリン抵抗性も、ＩＩ型糖尿病の根底をなす主要な影響の１つである。 Adipose tissue or adipocytes secrete or release a wide range of protein factors collectively referred to as “adipokines”. These adipokines are involved in the regulation of energy balance as well as lipid metabolism, insulin sensitivity, alternative pathway complement system, vascular hemostasis, blood pressure regulation, and angiogenesis. In addition, inflammation (TNF-alpha, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, transforming growth factor, nerve growth factor) and acute phase reaction (plasminogen activator inhibitor 1 (PAI) -1) The list of adipokines involved in haptoglobin, serum amyloid A) is increasing. While elevated PAI-1 levels contribute to a prothrombotic state, low levels of adiponectin correlate with exacerbation of metabolic risk factors. Insulin resistance is also one of the major effects underlying Type II diabetes.
現在のところ、耐糖能異常（ＩＧＴ）など２型糖尿病プリフォームに罹患する患者の初期同定を裏付ける唯一の診断法は、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施することである。この試験は、時間がかかり、その結果費用がかかり、定期的には実施されない。バイオマーカー、例えば、血液、血漿、血清、尿などの体液に由来するタンパク質又はペプチドを測定する診断的試験であれば、２型糖尿病プリフォームの診断に対する価値が高いであろう。
At present, the only diagnostic method that supports the initial identification of patients with
現在のところ、耐糖能異常（ＩＧＴ）など２型糖尿病プリフォームの治療は、まず、身体活動及び特別の食事及び体重減量によって治療する。これは、多くの場合に、ともに強力なインスリン増感剤であるグリタゾン又はチアゾリジネジオン（ＴＺＤ）などの物質を用いて２型糖尿病を治療する、化学的治療法の早期の適用を回避することができる。最後に、これらの化学的治療法が失敗し始めた後で、これにインスリン注射を併用するか、又はインスリン注射を２型糖尿病の単一の治療として用いる。
Currently, treatment of
しかし、すべての患者が初期の治療的試みに対して同様に反応するわけではない。身体活動、特別の食事、及び体重減量から利益を得ない患者もいるが、利益を得る患者もいる。この差の理由は不明であり、どのＩＧＴ患者が身体活動の増加、食事、及び体重減量から利益を得るかを層別化又は予測する、信頼できる診断法は現在のところ得られていない。こうした診断法であれば、この治療戦略に対して最も有望な患者を同定する価値が高いであろう。同時に、予測結果が陽性であれば、他の方法では達成の困難な、身体活動及び食事に関する自身の生活の変更に対する患者の遵守を高度に改善する可能性が最も高いであろう。 However, not all patients respond similarly to early therapeutic attempts. Some patients do not benefit from physical activity, special diets, and weight loss, while others benefit. The reason for this difference is unknown, and no reliable diagnostics are currently available to stratify or predict which IGT patients will benefit from increased physical activity, diet, and weight loss. Such a diagnostic would be worth identifying the most promising patients for this treatment strategy. At the same time, if the predictive result is positive, it is most likely to improve the patient's compliance to physical activity and dietary changes that are difficult to achieve otherwise.
本出願は、耐糖能異常などの２型糖尿病プリフォームの検出を可能とし、この目的に利用可能な現在の診断法（経口ブドウ糖負荷試験）に代替することのできる新規の方法を提供する。
The present application provides a novel method that allows detection of
加えて、患者が、身体活動の増加、特別な食事、及び体重減量から利益を得られるかどうか、又は患者がインスリン増感剤などの薬剤での治療を直接に開始すべきであるかどうかを決定するに際し、患者を予測又は層別化する方法を開示する。 In addition, whether patients should benefit from increased physical activity, special diets, and weight loss, or whether patients should start treatment directly with drugs such as insulin sensitizers In determining, a method for predicting or stratifying patients is disclosed.
さらに、本出願は、個体が２型糖尿病又は２型糖尿病プリフォームを発症する可能性が高いかどうか、又は個体が過去に２型糖尿病プリフォームに中程度に罹患した場合、この患者がこうした２型糖尿病プリフォームを再発する危険性が増大するかどうかを予測する方法を提供する。後者は、これらの患者に対する緊密なモニタリングにより、２型糖尿病プリフォームを再発するかどうかを迅速に観察することを可能にし、これによって、認知されず対処されない２型糖尿病プリフォームの結果としての合併症を回避する。これらの診断法に加えて、これらの方法にバイオマーカーとして適するペプチド、試験キット、及びこれらのバイオマーカーを認識する抗体を提供する。
In addition, the present application provides information regarding whether an individual is likely to develop
本発明及びその各種の実施形態は、１）耐糖能異常のスクリーニング及び／又は耐糖能異常のサブグループの診断を可能とする新規のペプチドバイオマーカーの同定、２）正常な耐糖能から耐糖能異常への進行に対する予測因子を見出すこと、及び３）ライフスタイルの変化に反応する予測因子を見出すことを対象とする。 The present invention and various embodiments thereof include 1) screening for abnormal glucose tolerance and / or identification of novel peptide biomarkers that enable diagnosis of subgroups of impaired glucose tolerance, and 2) normal glucose tolerance to abnormal glucose tolerance. It aims to find predictors for progression to 3) and 3) find predictors that respond to lifestyle changes.
本発明及び各種の実施形態はさらに、耐糖能異常など、代謝性障害、特に２型糖尿病、又はインスリン欠損と関連する他の病態若しくは疾患の前形成状態の診断、予後予測、及び層別化の方法を対象とする。単独又は併用で２型糖尿病プリフォームの診断、予後予測、又は層別化を可能とするペプチド。
The present invention and various embodiments further provide for the diagnosis, prognostication, and stratification of metabolic disorders such as impaired glucose tolerance, particularly
本出願は、本発明の方法及びバイオマーカーに従って用いる試験キットをも企図する。 The present application also contemplates test kits for use in accordance with the methods and biomarkers of the present invention.
以下に添付する説明において、本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細を示す。本発明の実施又は試験では、本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料を用いることができるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、その説明から明らかであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単一の形態は、文脈が別段に明示しない限り、複数の形態をも含む。別段に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に引用するすべての特許及び刊行物を、参照により本明細書に組み込む。 The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the accompanying description below. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are now described. Other features, objects, and advantages of the invention will be apparent from the description. In the specification and the appended claims, a single form also includes the plural forms unless the context clearly indicates otherwise. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. All patents and publications cited herein are hereby incorporated by reference.
本発明は、添付図を参照することにより、よりよく理解されるであろう。 The invention will be better understood with reference to the following drawings.
本明細書で用いる「個体」又は「対象」又は「生物」という用語は、治療若しくは予防を必要とするか、又は本明細書に記載の病態若しくは疾患に罹患すると推定される個体又は対象又は生物を、本明細書の全体において互換的に指す。対象又は個体又は生物は、脊椎動物であることが好ましく、哺乳類、特にヒトであることがより好ましい。 As used herein, the term “individual” or “subject” or “organism” refers to an individual or subject or organism that is in need of treatment or prevention or is suspected of suffering from the pathology or disease described herein. Are referred to interchangeably throughout the specification. The subject or individual or organism is preferably a vertebrate, more preferably a mammal, especially a human.
本発明の実施形態による方法は、個体に由来する試料を用いるステップと、当業者に知られる適切な手段及び手順を用いて、本発明に従う少なくとも１つのタンパク質若しくはペプチド又はその修飾形態の量をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて測定するステップとにより実施することが好ましい。 The method according to embodiments of the present invention uses a sample from an individual and the amount of at least one protein or peptide or modified form thereof in accordance with the present invention using appropriate means and procedures known to those skilled in the art. Preferably, the measurement is performed in vitro.
図１では、７つの大ボックスのそれぞれが、試料グループを表す。「ＮＧＴ」と標識したボックスは、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）による測定で、正常な耐糖能を有する試料を表す。「ＩＧＴ」と標識したボックスは、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）による測定で、耐糖能異常を有する試料を表す。中段の２つのボックスは、試験開始（ｔ０、ベースライン）時において分析した試料を表し、下段の４つのボックスは、１２カ月後の試験終了（ｔ１２、追跡）時に測定した試料を表す。「ベースライン」とは、ライフスタイル介入試験以前に測定したペプチドのシグナルを意味し、「追跡」とは、ライフスタイル介入試験以後に測定したペプチドのシグナルを意味する。中段の２つのボックスは、下半分において、各々が、これもまたＮＧＴ及びＩＧＴで標識した２つの「サブボックス」に分かれる。これらのサブボックスは、試験開始時ｔ０における試料であって、将来試験終了時ｔ１２においてＮＧＴ試料又はＩＧＴ試料となる試料を表す。小文字ａ、ａ１、ａ２、ｂ、ｂ１、ｂ２、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆを付したグレーの小ボックスは、試料の各グループの標識であり、これが、図２に対応し、どのグループのどの測定値を分析において比較したのかを示す。グループ「ａ」は、グループ「ａ１」と「ａ２」との和に等しく、グループ「ｂ」は、グループ「ｂ１」と「ｂ２」との和に等しい。 In FIG. 1, each of the seven large boxes represents a sample group. The box labeled “NGT” represents a sample with normal glucose tolerance as measured by the oral glucose tolerance test (OGTT). The box labeled “IGT” represents a sample with impaired glucose tolerance as measured by the oral glucose tolerance test (OGTT). The middle two boxes represent the samples analyzed at the start of the test (t 0 , baseline), and the lower four boxes represent the samples measured at the end of the test after 12 months (t 12 , follow-up). “Baseline” means the peptide signal measured before the lifestyle intervention test, and “follow-up” means the peptide signal measured after the lifestyle intervention test. The middle two boxes are divided in the lower half into two “sub-boxes”, each of which is also labeled with NGT and IGT. These sub-boxes represent samples at the test start time t 0 and become NGT samples or IGT samples at the future test end time t 12 . Small gray boxes with lowercase letters a, a1, a2, b, b1, b2, c, d, e, and f are labels for each group of samples, which corresponds to FIG. Show which measurements were compared in the analysis. Group “a” is equal to the sum of groups “a1” and “a2”, and group “b” is equal to the sum of groups “b1” and “b2”.
図２は、データ解析中に相互に比較した試料の異なるグループ（ａ、ｂ、ａ１、ａ２、ｂ１、・・・）を表し、その結果としてペプチドグループ（グループＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ）が得られ、これらのグループが、「食事及び身体運動による介入」の有益性の判定、２型糖尿病プリフォームの判定、及び２型糖尿病プリフォームの予後予測に適するペプチドを表す。加えて、グループＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブグループを示す（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ１、・・・）。
FIG. 2 represents different groups of samples (a, b, a1, a2, b1,...) Compared to each other during data analysis, resulting in peptide groups (groups I, II, and III). These groups represent peptides suitable for determining the benefits of “meal and physical exercise intervention”, determining
図３は、本発明の各種の実施形態に従うペプチド及び各々のシグナルＩＤを番号順に収載する。シグナルＩＤとは、対応するペプチドが、分画３６（Ｆ０３６．）で同定され、該ペプチドが、２５９１．５ドルトンの分子量を有することを示す。質量決定の精度が±１ドルトンであることに注意する。これらのデータは、本発明書で以下に記載の実施例の説明とともに、その配列が今まで知られておらず、このために図３の表の右端の欄に収載されない場合であっても、前記ペプチドを正確に同定する。さらに、図３中の表は、「グループ番号」と称する欄において、各ペプチドが属するペプチドの１つ又は複数のグループを収載する。本特許出願の特許請求の範囲においては、これらのグループを参照する。図３中の表は、図１に示し、本記載の後出において説明するＡ１、Ａ２、Ａ３など、グループＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブグループをも収載する。「エンドポイントマーカー」及び「パネルに対する適性」と称する欄は、ペプチドバイオマーカーが有用である測定の１つ又は複数の種類を示す。 FIG. 3 lists peptides according to various embodiments of the invention and their respective signal IDs in numerical order. The signal ID indicates that the corresponding peptide is identified in fraction 36 (F036.) And has a molecular weight of 2591.5 daltons. Note that the accuracy of mass determination is ± 1 Dalton. These data, together with the description of the examples described below in the present invention, even if the sequence has not been known so far and therefore is not listed in the rightmost column of the table of FIG. Accurately identify the peptide. Further, the table in FIG. 3 lists one or more groups of peptides to which each peptide belongs in a column called “group number”. These groups are referred to in the claims of this patent application. The table in FIG. 3 also includes subgroups of groups I, II, and III, such as A1, A2, and A3 shown in FIG. 1 and described later in this description. The columns labeled “Endpoint Marker” and “Adequacy for Panel” indicate one or more types of measurements for which peptide biomarkers are useful.
図３中の表で用いる「有益性」という用語は、このペプチドの測定が、個体が２型糖尿病プリフォームの改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得るかどうかを判定する個体の層別化に適することを示す。「ＯＧＧＴ」又は「ＩＧＴ」は、このペプチドの測定が、経口ブドウ糖負荷試験又は２型糖尿病プリフォームを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適することを示す。
The term “beneficial” as used in the table in FIG. 3 is used to determine whether this peptide measurement determines whether the individual benefits from physical exercise and / or dietary intervention for improvement of the
図３中の表と関連して用いる「診断」という用語は、特定のペプチドの測定が、経口ブドウ糖負荷試験又は２型糖尿病プリフォーム、特に、ＩＧＴを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適することを示す。
The term “diagnosis” as used in connection with the table in FIG. 3 replaces the measurement of a specific peptide with an oral glucose tolerance test or another diagnostic method for diagnosing
図３で用いる「予後予測」という用語は、特定のペプチドの測定が、２型糖尿病プリフォームを発症する及び／又は２型糖尿病を発症する危険性が高い遺伝的な素因を有するか、又は過去に２型糖尿病プリフォームに罹患した及び／又は２型糖尿病に罹患した可能性が高い個体を検出するのに適することを示す。２型糖尿病プリフォームにかつて罹患したがもはや罹患しない、及び／又は２型糖尿病に罹患した個体は、その体内に一定の不可逆的な変化を蒙る可能性があり、この不可逆的な変化が、その体内のペプチド量の変化により反映される可能性があることを仮定する。これらの個体は、２型糖尿病プリフォームを再発する、及び／又は２型糖尿病を再発する可能性が高いことをさらに仮定する。結果として、「予後予測」に分類されたペプチドは、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患することに関する個体の予後予測に適しうる。
The term “prognostic” as used in FIG. 3 refers to whether a particular peptide measurement has a genetic predisposition to developing a
図３中の「調節」と称する欄は、個体が２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患しつつある、又は罹患する可能性が高い、又は過去に罹患した可能性が高い場合に、前記個体において特定のペプチド量がどちらの方向に変化するのかを示す。ペプチド量の変化の方向（増加又は減少）は、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病、特に、ＩＧＴに罹患する、又は罹患する可能性が高い、又は過去に罹患した可能性が高い個体の群のいずれの１つにも属さない個体における同一のペプチド量と比べて計算する。
The column labeled “modulation” in FIG. 3 indicates that the individual is suffering from, or is likely to suffer from
図３において、「前駆体の名称」と称する欄は、該ペプチドが由来するタンパク質の名称を示す。「配列」と称する欄は、１文字のアミノ酸コードで記した該ペプチドのアミノ酸配列を列挙し、「分子と配列位置」と称する欄は、該タンパク質の省略名を提示し、該ペプチドの由来及び前記タンパク質内における該ペプチドのアミノ酸配列位置を示す。さらに、「修飾」と称する欄は、前記ペプチド中で同定されるか、又は質量分析検査により前記ペプチド中に存在する可能性が高い修飾を示す。 In FIG. 3, a column called “precursor name” indicates the name of the protein from which the peptide is derived. The column referred to as “sequence” lists the amino acid sequence of the peptide described in the one-letter amino acid code, the column referred to as “molecule and sequence position” provides the abbreviated name of the protein, the origin of the peptide and The amino acid sequence position of the peptide in the protein is shown. Furthermore, the column termed “modification” indicates a modification that is identified in the peptide or is likely to be present in the peptide by mass spectrometry.
図４は、２型糖尿病プリフォームの「マーカー」として役立ち、マーカーパネルを提供するのに適する他のペプチドマーカーと組み合わせる、本明細書に開示のペプチドの組合せを収載する。
FIG. 4 lists the combinations of peptides disclosed herein that serve as “markers” for
図５では、個体が２型糖尿病プリフォームの改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得るかどうかを判定する、個体の層別化のためのマーカーパネルとして適するペプチドの組合せを収載する。図５の左側の欄は、「マーカーパネルに適するマーカー」と称する欄における任意の１つのペプチドと組み合わせてマーカーパネルを作製することのできるペプチド（図３中の表に従う「シグナルＩＤ」により示す）を収載する。
FIG. 5 lists combinations of peptides suitable as marker panels for stratification of individuals that determine whether an individual would benefit from physical exercise and / or dietary intervention for improvement of
グループＩ、ＩＩ、及び／又はＩＩＩのペプチドと組み合わせる、図４及び５のペプチドを、特許請求の範囲では「追加のペプチドマーカー」と呼ぶ。 The peptides of FIGS. 4 and 5 in combination with peptides of Group I, II, and / or III are referred to as “additional peptide markers” in the claims.
図６は、本明細書に記載の現在の方法により用い、及び／又は調べ、若しくは同定する２８８のペプチドを収載する。図６のペプチドはすべて、サブグループＡ１、Ａ２、又はＡ３に属するペプチドを表す。これらのペプチドの一部は、図３にも収載する。 FIG. 6 lists 288 peptides used and / or examined or identified by the current methods described herein. All of the peptides in FIG. 6 represent peptides belonging to subgroup A1, A2, or A3. Some of these peptides are also listed in FIG.
２型糖尿病プリフォームの診断
図３中の表に示す通り、一実施形態に従うグループＩのペプチドは、２型糖尿病プリフォームの診断において役割を果たすペプチドを含む。グループＩのペプチドは、Ｆ０６７．４１８１．５、Ｆ０６７．２４４０．５、Ｆ０２４．１１６１．５、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５を含む。
Diagnosis of
第１の実施形態では、個体における２型糖尿病プリフォームの存在又は不在を検出する方法であって、
ａ）個体の試料中における、Ｆ０６７．４１８１．５、Ｆ０６７．２４４０．５、Ｆ０２４．１１６１．５、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５からなる群（グループＩ）から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における前記２型糖尿病プリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法を記載する。
In a first embodiment, a method for detecting the presence or absence of a
a) F067.44181.5, F066.72440.5, F024.1161.5, F034.2008.5, F029.1736.5, F066.44390.5, F075.33345.5, in samples of individuals F075.3561.5, F073.1122.5, F075.4399.5, F075.3561.5, F033.21210.5, F075.4342.5, F075.33474.5, F075.33345.5, F068. Measuring the amount of at least one peptide selected from the group consisting of 3841.5, F075.33988.5, F034.2638.5 (Group I), or a modified form thereof,
b) comparing the results of a) with the results determined using a control sample or using known reference values;
c) determining the presence or absence of the
前記方法は、グループＩの少なくとも１つ若しくは２つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定することを特徴とすることが好ましい。 Preferably, the method is characterized in that the amount of at least one or two peptides of group I, or modified forms thereof, is measured.
その方法は、グループＩから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態、及びグループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する、図４中のペプチドから選択される少なくとも１つの追加のペプチドの量を測定することを特徴とすることが好ましい。 The method comprises at least one peptide selected from group I or a modified form thereof, and at least selected from the peptides in FIG. 4 in combination with a corresponding peptide of group I to form a peptide marker panel or a modified form thereof. It is preferred to measure the amount of one additional peptide.
好ましい実施形態において、その方法は、グループＩの少なくとも２つのペプチド又はその修飾形態の量を測定することを特徴とする。さらに、その方法は、グループＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増大することを特徴とする。
In a preferred embodiment, the method is characterized by measuring the amount of at least two peptides of Group I or modified forms thereof. Further, the method is characterized in that the amount of at least one peptide of Group I or a modified form thereof is increased in said individual having a
別の実施形態において、その方法は、グループＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少するか又は不在であることを特徴とする。例えば、本方法は、グループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成する、図４中のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド、又は図４中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増加することを特徴とする。或いは、その方法は、グループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成する、図４中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又は図４中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少するか又は不在であることを特徴とする。
In another embodiment, the method is characterized in that the amount of at least one peptide of Group I or a modified form thereof is reduced or absent in said individual having a
食事及び運動療法の成功に対する予後予測
別の好ましい実施形態において、本方法は、食事及び／又は運動（身体運動）レジメンを含む治療法の有用性を判定する、２型糖尿病プリフォームに罹患した個体の層別化に関する。この方法は、図３に示す少なくとも１つのグループＩＩペプチドの量の検出及び決定を含む。具体的には、グループＩＩペプチドは、ペプチドＦ０３６．２５９１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０を含む。
Predicting Prognosis for Successful Diet and Exercise Therapy In another preferred embodiment, the method comprises an individual suffering from a
より具体的には、この代替の好ましい実施形態に従う方法は、
ａ）個体の試料中における、Ｆ０３６．２５９１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０からなる群（グループＩＩ）から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体に対する前記治療法の有用性を判定するステップと
を含む。
More specifically, the method according to this alternative preferred embodiment is:
a) F036.2591.5, F046.44874.5, F076.44758.5, F046.44745.5, F035.2615.5, F041.1906.5, F046.44901.5, in samples of individuals Measuring the amount of at least one peptide selected from the group consisting of F046.4874.5, F046.1690.5, F050.2199.5, F031.1820 (group II), or modified forms thereof;
b) comparing the results of a) with the results determined using a control sample or using known reference values;
c) determining the usefulness of the treatment for the individual.
前記方法は、グループＩＩの少なくとも１つ若しくは少なくとも２つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定することを特徴とすることが好ましい。例えば、該方法では、グループＩＩのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増加する。或いは、グループＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少するか不在である。
Preferably, the method is characterized by measuring the amount of at least one or at least two peptides of group II, or modified forms thereof. For example, in the method, the amount of Group II peptide or modified form thereof is increased in said individual having a
例えば、上述の方法は、グループＩＩから選択される少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態、及びグループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネル又はその修飾形態を形成する図６中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの量を測定することを特徴とする。さらなる実施形態において、その方法は、グループＩＩの少なくとも２つのペプチドの量を測定することを特徴とする。 For example, the method described above consists of at least one peptide selected from Group II or a modified form thereof and the peptide in FIG. 6 that forms a peptide marker panel or a modified form thereof in combination with a corresponding peptide of Group II. The amount of at least one peptide selected from is measured. In a further embodiment, the method is characterized by measuring the amount of at least two peptides of Group II.
さらに、その方法は、グループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成する、図５中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又は図５中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増大することを検出するステップに関する。グループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを形成するペプチド、図５中のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又は図５中のこれらのペプチドの修飾形態の量が、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において減少する又は不在であることが好ましい。
Furthermore, the method comprises at least one peptide selected from the group consisting of the peptides in FIG. 5 or a modified form of these peptides in FIG. 5, which in combination with the corresponding peptides of group II forms a peptide marker panel Detecting that the amount of is increased in said individual having a
２型糖尿病プリフォーム又は２型糖尿病の予後予測
さらに好ましい実施形態において、個体が２型糖尿病プリフォームに罹患する予後の判定法を提供する。この方法は、図３に示す通り、少なくとも１つのグループＩＩＩペプチドの量の検出及び決定を含む。具体的には、グループＩＩＩペプチドは、ペプチドＦ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４．５、Ｆ０６４．２７８９．５、Ｆ０６４．３０２０、Ｆ０６６．１３９４．５、Ｆ０１８．２０６９．５、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５、Ｆ０２１．２３７８．５、Ｆ０２４．１７５３．５、Ｆ０６８．７６６５．５を含む。
より具体的には、個体が２型糖尿病プリフォームに罹患する予後の判定法は、
ａ）個体の試料中における、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５、Ｆ０６４．３０２０、Ｆ０６６．１３９４．５、Ｆ０１８．２０６９．５、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５、Ｆ０２１．２３７８．５、Ｆ０２４．１７５３．５、Ｆ０６８．７６６５からなる群（グループＩＩＩ）から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における２型糖尿病プリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む。
More specifically, the prognostic method for determining that an individual suffers from a
a) F066.4390.5, F075.33345.5, F075.33561.5, F073.11122.5, F066.2843.5, F066.2804, F064.27889.5, F064. 3020, F06.1394.5, F018.2069.5, F034.1870.5, F0399.2158.5, F046.44901.5, F068.5171.5, F066.2851.5, F066.44390.5, Selected from the group consisting of F025.22966.5, F068.790.5, F076.44758.5, F024.1463.5, F021.2378.5, F024.1753.5, F0688.765 (Group III) A step of measuring the amount of at least one peptide, or a modified form thereof. And-flops,
b) comparing the results of a) with the results determined using a control sample or using known reference values;
c) determining the presence or absence of a
前記方法は、グループＩＩＩの少なくとも１つ若しくは２つのペプチド又はその修飾形態の量を測定することを特徴とすることが好ましい。さらに、該方法は、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において増大する、グループＩＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の量を測定することが好ましい。別の実施形態では、２型糖尿病プリフォームを有する前記個体において、グループＩＩＩのペプチド又はその修飾形態の量が減少する又は不在である。前述の方法は、２型糖尿病プリフォームが、耐糖能異常（ＩＧＴ）であることを特徴とすることが好ましい。
Preferably, the method is characterized in that the amount of at least one or two peptides of group III or a modified form thereof is measured. Furthermore, the method preferably measures the amount of at least one peptide of Group III or a modified form thereof increased in said individual having a
その方法は、全血、血漿、血清、尿、脂肪組織及び肝組織を含みうる試料を用いて行ってよい。加えて、該ペプチドは、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定）法、ＲＩＡ法（ラジオイムノアッセイ）、ウェスタンブロット法、プロテインチップ法、質量分析法、免疫組織学法、フローサイトメトリー法などの１つ若しくは複数の方法、又は分子生物学的方法により決定する。 The method may be performed using a sample that may include whole blood, plasma, serum, urine, adipose tissue and liver tissue. In addition, the peptide may include one or more of ELISA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay), Western blot, protein chip, mass spectrometry, immunohistochemistry, flow cytometry, etc. Determined by method or molecular biological method.
別の実施形態は、グループＩ、ＩＩ、若しくはＩＩＩの任意の１つの分子であるペプチド又はその修飾形態に関する。該ペプチドは、図３の表に示す配列を有することが好ましい。 Another embodiment relates to a peptide that is any one molecule of group I, II, or III, or a modified form thereof. The peptide preferably has the sequence shown in the table of FIG.
本出願は、記載した実施形態に従うペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、ペプチド自体が由来するタンパク質には結合しない抗体をさらに開示する。 The application further discloses an antibody that specifically binds to a neoepitope of a peptide according to the described embodiments and does not bind to the protein from which the peptide itself is derived.
加えて、
ａ）本発明に従うペプチド；並びに／又は
ｂ）本明細書に記載の抗体若しくは前記抗体の断片；及び
ｃ）本明細書に記載の実施形態に従う方法に前記試験キットをどのように用いるかについての説明書
を含む試験キットを提供する。
in addition,
a) a peptide according to the present invention; and / or b) an antibody or fragment of said antibody as described herein; and c) how to use said test kit in a method according to an embodiment described herein. Provide a test kit with instructions.
最後に、別の実施形態に従って、本明細書に記載の実施形態に従う試験キットの製造のための、
ａ）上述のペプチド；及び／又は
ｂ）本明細書において特許請求に係る抗体若しくは前記抗体の断片
の使用を開示する。
Finally, according to another embodiment, for the manufacture of a test kit according to an embodiment described herein,
Disclosed herein is the use of a) the above-mentioned peptides; and / or b) the claimed antibody or fragment of said antibody.
個体における２型糖尿病プリフォームの診断のための、場合によってはグループＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを作製する図４に収載の少なくとも１つのペプチド又は図４中のこれらのペプチドの修飾形態と組み合わせた、グループＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用について特許請求することが好ましい。
4. At least one peptide listed in FIG. 4 or modifications of these peptides in FIG. 4 to create a peptide marker panel, optionally in combination with corresponding peptides of group I, for diagnosis of
或いは、２型糖尿病プリフォームの改善に関する若しくは２型糖尿病の改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得る個体の層別化のための場合によってはグループＩＩの対応するペプチドと組み合わせてペプチドマーカーパネルを作製する図５に収載の少なくとも１つのペプチド又は図５中のこれらのペプチドの修飾形態と組み合わせた、グループＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用について特許請求する。さらに、本出願は、２型糖尿病プリフォームに罹患する可能性の高い個体の予後予測のための、グループＩＩＩの少なくとも１つのペプチド又はその修飾形態の使用に関する。
Alternatively, peptide in combination with a corresponding peptide of group II, optionally for stratification of individuals who benefit from physical exercise and / or dietary intervention for improvement of
好ましい実施形態において、本発明に従う使用は、ＩＧＴの予後予測、診断、又は層別化への使用である。 In a preferred embodiment, the use according to the invention is for prognosis, diagnosis or stratification of IGT.
本明細書に記載の方法及びペプチドは、本明細書に記載し、図３に示す少なくとも２つの異なるペプチド又はその修飾形態を用いて、個体のペプチド若しくはタンパク質パターン又はパネル（例えば、それぞれ、図４及び５を参照のこと）を決定することにより、前記個体における本明細書に記載の病態をモニターするのに特に有用である。ＭＳ−ＴＯＦ法又はＣＥ−ＭＳ法、ＳＥＬＤＩ法（表面増強レーザー脱離イオン化法）など、当業者に知られた通例の機器を用いることができる。 The methods and peptides described herein use an individual peptide or protein pattern or panel (eg, FIG. 4 respectively) using at least two different peptides described herein and shown in FIG. And 5) are particularly useful for monitoring the pathology described herein in said individual. Conventional equipment known to those skilled in the art, such as MS-TOF method, CE-MS method, and SELDI method (surface enhanced laser desorption ionization method) can be used.
以下の定義は、本出願全体において頻用される特定の用語の理解を容易にする目的で提示する。 The following definitions are presented for the purpose of facilitating the understanding of certain terms frequently used throughout this application.
ペプチド
本明細書で用いる「ペプチド」は、リン酸基、炭水化物基、又は脂質部分などの翻訳後修飾を含むタンパク質を含む、天然に存在するすべての種類のタンパク質の断片でありうる。遺伝子コードがコードする標準的な２０種類のアミノ酸のセットとは異なるアミノ酸を含むペプチドをも含む。試料は、全血、血清、血漿若しくは尿、残余の血液細胞を含む血清、血小板、赤血球、白血球など残余の血液細胞、又は試料が由来する個体に感染した微生物を含む血漿であることが好ましい。個体は、ヒト、哺乳類、げっ歯類、霊長類、マウス若しくはラット又は別の実験動物であることが好ましい。
Peptide As used herein, a “peptide” can be a fragment of all naturally occurring types of proteins, including proteins that contain post-translational modifications such as phosphate groups, carbohydrate groups, or lipid moieties. Also included are peptides containing amino acids that differ from the standard 20 amino acid set encoded by the genetic code. The sample is preferably whole blood, serum, plasma or urine, serum containing residual blood cells, residual blood cells such as platelets, red blood cells, white blood cells, or plasma containing microorganisms infected with the individual from which the sample is derived. The individual is preferably a human, mammal, rodent, primate, mouse or rat or another laboratory animal.
本明細書で用いる「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により共有結合した２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上のアミノ酸からなる物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１６０アミノ酸を有するペプチドを指すが、一般に、「ペプチド」という用語と「タンパク質」という用語とは同意語であり、本出願においては同意語として用いる。本発明に従う「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸を含む物質のみでなく、非アミノ酸成分を含む物質をも含み、ペプチド結合のみを含む物質のほか、他の結合、例えば、エステル結合、チオエーテル結合、又はジスルフィド結合をも含む物質を含む。 As used herein, the term “peptide” refers to 2 or more, preferably 3 or more, preferably 4 or more, preferably 6 or more, preferably 8 or more, preferably 10 or more, preferably 13 or more, covalently bonded by peptide bonds. , Preferably 16 or more, preferably 21 or more amino acids. The term “protein” refers to large peptides, preferably peptides having at least 160 amino acids, but in general, the terms “peptide” and “protein” are synonymous and are used synonymously in this application. . The terms “peptide” and “protein” according to the present invention include not only substances containing amino acids but also substances containing non-amino acid components, in addition to substances containing only peptide bonds, other bonds such as ester bonds, It includes substances that also contain thioether bonds or disulfide bonds.
修飾ペプチド
本明細書で用いるペプチドの「修飾形態」は、翻訳後修飾、化学修飾、酵素修飾による修飾、及び他の機構による修飾などの修飾を含むペプチドを含む。可能な修飾の例は、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、ピログルタミン酸修飾、システイン−ジスルフィド架橋、メチル化、アセチル化、アシル化、ファルネシル化、ホルミル化、ゲラニルゲラニル化、ビオチニル化、ステアロイル化、パルミチル化、リポイル化、Ｃ−マンノーシル化、ミリストイル化、アミド化、脱アミド化、メチル化、脱メチル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、酸化、ＰＥＧ化、プレニル化、ＡＤＰ−リボシル化、脂質付加、ホスファチジルイノシトール付加、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー付加、リン酸ピリドキサール付加、カルボキシアミドメチルシステインをもたらすシステイン残基修飾、カルボキシメチルシステインをもたらすシステイン残基修飾、ピリジルエチルシステインをもたらすシステイン残基修飾、リポ酸をもたらすリシン残基修飾、ピログルタミン酸をもたらすグルタミン酸修飾などを含むがこれに限定されない。
Modified peptides As used herein, “modified forms” of peptides include peptides containing modifications such as post-translational modifications, chemical modifications, modifications by enzymes, and modifications by other mechanisms. Examples of possible modifications are glycosylation, phosphorylation, sulfation, pyroglutamic acid modification, cysteine-disulfide bridge, methylation, acetylation, acylation, farnesylation, formylation, geranylgeranylation, biotinylation, stearoylation, palmityl , Lipoylation, C-mannosylation, myristoylation, amidation, deamidation, methylation, demethylation, carboxylation, hydroxylation, iodination, oxidation, PEGylation, prenylation, ADP-ribosylation, lipid Addition, phosphatidylinositol addition, glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor addition, pyridoxal phosphate addition, cysteine residue modification leading to carboxyamidomethylcysteine, cysteine residue modification leading to carboxymethylcysteine, pyridyleth Cysteine residue modification that results in a cysteine, lysine residue modification resulting in lipoic acid, including but not such glutamic modifications resulting in pyroglutamic acid is not limited thereto.
本発明の実施形態に従うペプチドの修飾形態は、アルファアミノブチル酸、ベータアミノブチル酸、ベータアミノイソブチル酸、ベータアラニン、ガンマブチル酸、アルファアミノアジピン酸、４−アミノ安息香酸、アミノエチルシステイン、アルファアミノペニシラン酸、アリシン、４−カルボキシグルタミン酸、シスタチオニン、カルボキシグルタミン酸、カルボキシアミドメチルシステイン、カルボキシメチルシステイン、システイン酸、シトルリン、デヒドロアラニン、ジアミノブチル酸、デヒドロアミノ−２−ブチル酸、エチオニン、グリシン−プロリンジペプチド、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、ホモセリン、ホモシステイン、ヒスタミン、イソバレイン、リシノアラニン、ランチオニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、２−ピピリジン−カルボキシル酸、ピログルタミン酸、ピロリシン、プロリン−ヒドロキシプロリンジペプチド、サルコシン、４−セレノシステイン、シンデシン、チオプロリンなどを含むがこれに限定されない、まれなアミノ酸、化学的若しくは酵素的に修飾されたアミノ酸などを含んでよい。さらなる例は、ＡＢＲＦ「分子生物資源機関会議」のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｆ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｃｆｍ／ｄｍ．ｈｏｍｅ？ＡｖｇＭａｓｓ＜：＞＝ａｌｌ）で検索可能なデータベース「Ｄｅｌｔａ Ｍａｓｓ」などのデータベース中に見出すことができる。 Modified forms of peptides according to embodiments of the present invention include alpha aminobutyric acid, beta amino butyric acid, beta amino isobutyric acid, beta alanine, gamma butyric acid, alpha amino adipic acid, 4-aminobenzoic acid, aminoethyl cysteine, alpha amino Penicillanic acid, allicin, 4-carboxyglutamic acid, cystathionine, carboxyglutamic acid, carboxyamidomethylcysteine, carboxymethylcysteine, cysteic acid, citrulline, dehydroalanine, diaminobutyric acid, dehydroamino-2-butyric acid, ethionine, glycine-proline Dipeptide, 4-hydroxyproline, hydroxylysine, hydroxyproline, homoserine, homocysteine, histamine, isovalein, ricinoalanine, lanthionine, Rare amino acids, chemical or Enzymatically modified amino acids and the like may be included. A further example is the database “Delta Mass”, which is searchable on the ABRF “Molecular Bioresources Organization Conference” website (http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home?AvgMass<:>=all). Etc. can be found in the database.
加えて、本発明に従うペプチドの修飾形態は、１つ又は複数のアミノ酸残基の変化、１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入（ペプチド若しくはタンパク質の突然変異体又はその多型形態）を含みうるアミノ酸配列における差異を特徴とする。 In addition, a modified form of the peptide according to the invention comprises a change of one or more amino acid residues, a deletion of one or more amino acid residues, and an insertion of one or more amino acid residues (peptide or protein Or a polymorphic form thereof) is characterized by differences in the amino acid sequence.
ペプチド及び／又はタンパク質の多型形態とは、天然に存在する突然変異又は分子生物学、遺伝学、若しくは化学（核酸又はペプチド合成）などの技術を用いる実験的若しくは無作為的な配列の操作により生じる突然変異による配列の変異を意味する。さらに、ペプチド及び／又はタンパク質の多型形態は、配列アライメントにより判定する通り、相互に好ましくは７０％の配列同一性、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９７％、及び好ましくは９９％の配列同一性を有する。２つの配列の配列アライメント内においてアミノ酸残基又はヌクレオチドが同一の配列位置におかれる場合、このアミノ酸又はヌクレオチドをこれら２つの配列において同一であるとみなす。例えば、第１の架空の配列「ＡＣＤＥＦ」と、「Ｄ」が欠失した第２の架空の配列「ＡＣＥＦ」とを整列する場合、第２の配列の「Ｆ」と「Ｈ」との間にギャップを挿入する結果として「ＡＣ−ＥＦ」が生じ、これにより、第２の配列の第１の配列に対するより良好なアライメントが可能となる。結果として生じるアライメントにおいては、５つの配列位置のうち４つが、同一のアミノ酸残基により占められる結果として、第１の配列の第２の配列に対する８０％の配列同一性を生じる。配列アライメントをどのように計算するかという方法は、本明細書の以下において記載する。 Peptide and / or protein polymorphic forms are naturally occurring mutations or experimental or random sequence manipulations using techniques such as molecular biology, genetics, or chemistry (nucleic acid or peptide synthesis). It means the variation of the sequence due to the resulting mutation. Furthermore, the polymorphic forms of peptides and / or proteins are preferably 70% sequence identity to each other, preferably 75%, preferably 80%, preferably 85%, preferably 90% as determined by sequence alignment. Preferably 95%, preferably 97%, and preferably 99% sequence identity. An amino acid or nucleotide is considered identical in the two sequences if the amino acid residue or nucleotide is placed in the same sequence position within the sequence alignment of the two sequences. For example, when aligning the first fictitious sequence “ACDEF” with the second fictitious sequence “ACEF” from which “D” has been deleted, between the “F” and “H” of the second sequence As a result of inserting a gap in “AC-EF”, a better alignment of the second sequence to the first sequence is possible. In the resulting alignment, 4 out of 5 sequence positions are occupied by identical amino acid residues, resulting in 80% sequence identity of the first sequence to the second sequence. The method of how sequence alignment is calculated is described later in this specification.
一般に、「修飾ペプチド」又は「ペプチドの修飾形態」という用語は、天然に見出される該ペプチドのすべての種類の修飾を含む。加えて、「修飾ペプチド」という用語は、天然に見出されるペプチドに存在しうる修飾であって、試料を分析又は測定する、例えば、質量分析又は他の適切な方法により該ペプチドを測定する過程以前又は該過程中において、これらのペプチドを含むこれらの試料を保存及び／又は操作することから生じるすべての種類の修飾を含む。試料の保存及び／又は操作の結果として生じるこうした修飾の例は、酸化ペプチドである。 In general, the term “modified peptide” or “modified form of a peptide” includes all types of modifications of the peptide found in nature. In addition, the term “modified peptide” is a modification that may be present in a peptide found in nature, prior to the process of analyzing or measuring a sample, eg, measuring the peptide by mass spectrometry or other suitable method Or in the process all types of modifications resulting from storage and / or manipulation of these samples containing these peptides. An example of such a modification that occurs as a result of sample storage and / or manipulation is an oxidized peptide.
２型糖尿病プリフォーム
糖尿病の「前形成状態」とは、耐糖能異常（ＩＧＴ）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、境界型糖尿病、無症状糖尿病、インスリン抵抗性など、２型糖尿病をもたらすと考えられる疾患又は病態を指す。
陰性対照試料
「陰性対照試料」とは、２型糖尿病プリフォーム又は２型糖尿病に罹患しない同一種の個体の試料である。陰性試料は、試料と同一の種類である、例えば、試料及び陰性試料ともに、血漿試料である、又はともに午前中に採取した尿試料である、又はともに生検により採取した脂肪組織試料などであることが好ましい。
Negative Control Sample A “negative control sample” is a sample of an individual of the same species who does not suffer from
基準値
「基準値」とは、診断法において決定する同一のマーカー又はペプチドの既知の値である。基準値は、試料の値を決定する前、決定すると同時、又は決定した後に決定することができる。
Reference value A “reference value” is a known value of the same marker or peptide determined in a diagnostic method. The reference value can be determined before, simultaneously with, or after determining the value of the sample.
試料
本発明に従う「試料」とは、全血、血漿、血清、血液濾液、尿、脂肪組織、肝組織など、個体から得た生物学的材料である。試料は、個体から得た細胞であって、細胞自体又はこれら細胞から得た細胞培養物上清でありうる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養した細胞から試料を得る前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養していた細胞など、個体から間接に得た材料でもありうる。試料は、本発明の方法による分析前に前処理することもできる。こうした前処理は、例えば、室温、４℃、０℃、−２０℃、−７０℃、−８０℃、若しくは他の温度などの各温度における試料の保存、又は水氷若しくはドライアイス上での保存、又は液体窒素中における保存、或いは他の固体媒質、液体媒質、又は気体媒質中での保存でありうる。とりわけ、さらなる前処理は、１、３、５、３０、５０、１００、１５０、３００、又は１０００ｋＤａの分子分画値によることが好ましい限外濾過などの試料の濾過、塩、エタノール又は他のアルコール、アセトンなどの有機溶媒を用いる試料の沈析、クロマトグラフィー、液相抽出、固相抽出などの方法を用いる試料の亜分画への分離、抗体、抗体断片、又は試料成分に結合する他の物質を用いる免疫沈降反応である。とりわけ、クロマトグラフィー法は、限外クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー又は陽イオンクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィーなどであり、逆相クロマトグラフィーが好ましい。亜分画への分離により試料を前処理する場合、個々の、一部の、又はすべての分画及び／又は流動物及び／又はクロマトグラフィー媒質上に残った任意の物質を、試料のさらなる分析に用いてよい。
Sample A “sample” according to the present invention is a biological material obtained from an individual, such as whole blood, plasma, serum, blood filtrate, urine, adipose tissue, liver tissue. The sample is a cell obtained from an individual, which may be the cell itself or a cell culture supernatant obtained from these cells, the cells that have been cultured in vitro before obtaining the sample from the cells cultured in vitro It can also be a material obtained indirectly from an individual. The sample can also be pretreated prior to analysis by the method of the present invention. Such pre-treatment may be performed, for example, at room temperature, 4 ° C., 0 ° C., −20 ° C., −70 ° C., −80 ° C., or other temperatures, or storage on water ice or dry ice. Or storage in liquid nitrogen, or storage in other solid, liquid, or gaseous media. In particular, further pre-treatment is preferably sample filtration such as ultrafiltration, salt, ethanol or other alcohols with molecular fraction values of 1, 3, 5, 30, 50, 100, 150, 300 or 1000 kDa. Sample separation using organic solvents such as acetone, chromatography, liquid phase extraction, separation into sample subfractions using methods such as solid phase extraction, antibodies, antibody fragments, or other components that bind to sample components It is an immunoprecipitation reaction using a substance. In particular, chromatographic methods include ultrachromatography, anion chromatography or cation chromatography, affinity chromatography, capillary chromatography and the like, and reverse phase chromatography is preferred. When samples are pretreated by separation into subfractions, individual, partial or all fractions and / or fluids and / or any material remaining on the chromatographic medium can be further analyzed in the sample. May be used for
量
「量」という用語は、ペプチドの絶対量又は、例えば、陰性試料中の同一のペプチドと比べた、若しくは同一のペプチドの基準値と比べたペプチドの相対量について述べる。相対的とは、モル又はｍｇ／リットルなどの明確な量を明示することではなく、例えば、該試料が、基準試料又は基準値と比べて、より多い量の、より少ない量の、又は同一量の特定ペプチドを含むことを明示することを意味する。この状況における「より多い量、より少ない量、又は同一量」という用語は、測定単位が明示されさえすれば、吸光値、減衰係数、質量分析シグナル強度、ウェスタンブロット法の濃度測定値、又は該ペプチドの絶対量に変換されない他の種類の測定値などをも含む。
Amount The term “amount” describes the absolute amount of peptide or the relative amount of peptide, eg, compared to the same peptide in a negative sample or compared to a reference value for the same peptide. Relative does not indicate a clear amount, such as moles or mg / liter, but, for example, the sample is larger, lesser, or the same amount compared to a reference sample or reference value. It is meant that the specific peptide is included. The term “greater, lesser or the same” in this context means that the absorbance value, extinction coefficient, mass spectrometry signal intensity, Western blot concentration measurement, or Other types of measurements that are not converted to absolute amounts of peptides are also included.
減少した又は不在である
本発明に従う「減少した」は、試料中にペプチドが、別の試料と比べて、又は対照試料と比べて、又は陰性対照試料と比べて、又は、これらの測定値が相対測定値であるか若しくは絶対測定値であるかにかかわらず、基準値と比べて、より低量（ｓｍａｌｌｅｒ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ， ｏｒ ａｍｏｕｎｔｓ）又はより低濃度において存在することを意味する。本発明に従う「不在である」とは、ペプチドが試料中に全く存在しないこと、又はペプチドが試料中に一定量（ａ ｑｕａｎｔｉｔｙ， ｏｒ ａｍｏｕｎｔ）又は一定濃度において存在するが、その量又は濃度が、前記ペプチドを検出又は測定するのに用いる試験系の検出限界未満であることを意味する。減少したペプチドは、一定の濃度又は量において存在し、比較対象の値を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、又は少なくとも１０００％超下回ることが好ましい。
Decreased or absent “Decreased” according to the present invention means that a peptide in a sample is compared to another sample, or compared to a control sample, or compared to a negative control sample, or these measurements are It means that it is present at a lower concentration (smaller quantities, or amounts) or at a lower concentration compared to the reference value, whether relative or absolute. “Absent” in accordance with the present invention means that the peptide is not present in the sample at all, or the peptide is present in the sample in a constant, or amount, or at a constant concentration, It means less than the detection limit of the test system used to detect or measure the peptide. The reduced peptide is present at a constant concentration or amount and the comparative value is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%. %, At least 90%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least 300%, at least 400%, at least 500%, at least 1000%, or at least more than 1000%.
増加した又は存在する
「増加した」とは、試料中にペプチドが、別の試料と比べて、又は対照試料と比べて、又は陰性対照試料と比べて、又は、これらの測定値が相対測定値であるか若しくは絶対測定値であるかにかかわらず、基準値と比べて、より高量（ｈｉｇｈｅｒ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ， ｏｒ ａｍｏｕｎｔｓ）又はより高濃度において「存在する」ことを意味する。増加したペプチドは、一定の濃度又は量において存在し、比較対象の値を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、又は少なくとも１０００％超上回ることが好ましい。
Increased or present “increased” means that a peptide in a sample is compared to another sample, or compared to a control sample, or compared to a negative control sample, or these measurements are relative measurements. Or “absolutely measured” means “present” in higher quantities, or amounts or higher concentrations compared to the reference value. The increased peptide is present at a constant concentration or amount and the comparative value is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%. %, At least 90%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least 300%, at least 400%, at least 500%, at least 1000%, or at least more than 1000%.
試料を分析するのに適する方法
一般に、試料中に存在するペプチドを検出及び分析するのに適するすべての方法を、開示の方法において用いることができ、本発明のペプチド、核酸及び断片、誘導体の存在、不在、又は量を測定するのに用いることができる。好ましくは、質量分析法、プロテインチップアッセイ、免疫学及び分子生物学の方法を用いうる。
Suitable Methods for Analyzing Samples Generally, any method suitable for detecting and analyzing peptides present in a sample can be used in the disclosed methods, and the presence of the peptides, nucleic acids and fragments, derivatives of the present invention. Can be used to measure, absence, or amount. Preferably, mass spectrometry, protein chip assay, immunology and molecular biology methods can be used.
とりわけ、適切な質量分析法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、連続的又はパルス状のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、及びイオンスプレー法若しくはサーモスプレー法若しくはマッシブクラスター衝撃（ＭＣＩ）法などの関連する方法でありうる。イオン供給源は、リニア反射型又は非リニア反射型の飛行時間（ＴＯＦ）法、単独又は多重の四重極法、単独又は多重の磁場法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）法、イオントラップ法、及びこれらの組合せ、例えば、イオントラップ／飛行時間法を含む検出形式と適合させることができる。イオン化では、多数のマトリックス／波長の組合せ（ＭＡＬＤＩ）又は溶媒の組合せ（ＥＳＩ）を用いることができる。他の適切な質量分析法は、例えば、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）質量分析法、又は親和性質量分析法である。 In particular, suitable mass spectrometry methods include matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI), continuous or pulsed electrospray ionization (ESI), and ion spray or thermospray or massive cluster bombardment (MCI). Or related methods. The ion source includes linear reflection type or non-linear reflection type time-of-flight (TOF) method, single or multiple quadrupole method, single or multiple magnetic field method, Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) method, ion trap method And combinations thereof, eg, detection formats including ion trap / time-of-flight methods. For ionization, a number of matrix / wavelength combinations (MALDI) or solvent combinations (ESI) can be used. Other suitable mass spectrometry methods are, for example, fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry, surface enhanced laser desorption ionization (SELDI) mass spectrometry, isotope-coded affinity tag (ICAT) mass spectrometry, or affinity Mass spectrometry.
さらに、適切な免疫学的方法は、とりわけ、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、直接ＥＬＩＳＡ法、間接ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、酵素結合免疫スポット測定（ＥＬＩＳＰＯＴ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ法）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ＝蛍光活性化細胞選別）法、免疫組織化学法、ウェスタンブロット法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、例えば、開示のペプチドに対して特異的な抗体、抗体断片、受容体、リガンド、又は他の結合作用物質を用いるプロテインチップ法である。 In addition, suitable immunological methods include, among others, enzyme linked immunoassay (ELISA), sandwich ELISA, direct ELISA, indirect ELISA, competitive ELISA, enzyme linked immunospot (ELISPOT), radioimmunoassay ( RIA method), flow cytometry (FACS = fluorescence activated cell sorting) method, immunohistochemistry method, Western blotting method, fluorescence resonance energy transfer (FRET) method, for example, antibodies specific to the disclosed peptides, antibodies Protein chip method using fragments, receptors, ligands, or other binding agents.
食事及び／又は身体運動を含む治療
本明細書で用いる「食事及び／又は身体運動を含む治療」という表現は、２型糖尿病プリフォームを予防、治癒、若しくは改善するための治療戦略及び／又は２型糖尿病を予防、治癒、若しくは改善するための治療戦略を指す。２型糖尿病プリフォームの改善、又は２型糖尿病の改善とは、個体が、食事及び／又は身体運動により、２型糖尿病プリフォームを治療する又は２型糖尿病を治療するのにもはや薬剤を必要としない、或いはより少量の薬剤及び／又はより低用量の薬剤及び／又はより低投与回数の薬剤、及び／又は「より弱い薬剤」のみを必要とすることを意味する。「より弱い薬剤」とは、例えば、２型糖尿病プリフォームを治療するのに用いるのが通例である、又は２型糖尿病を治療するのには用いない若しくは他の薬剤との併用でのみ用いる薬剤を意味する。例えば、インスリン注射と比べて「弱い薬剤」は、化学療法剤である。
Treatment including diet and / or physical exercise As used herein, the expression “treatment including diet and / or physical exercise” refers to a therapeutic strategy and / or 2 for preventing, curing, or ameliorating a
予後予測
「予後予測」とは、個体が、２型糖尿病プリフォーム又は２型糖尿病などの病態を発症する可能性が高いかどうかを予測することを目的とする。予後予測は、個体が将来においてこうした病態に罹患する可能性が高いこと、又は個体が将来においてこうした病態に罹患する可能性が低いこと、又は個体が過去においてこうした病態に罹患した可能性が高いこと、又は個体が過去においてこうした病態に罹患した可能性が低いことでありうる。
Prognosis Prediction “Prognosis prediction” is intended to predict whether an individual is likely to develop a pathological condition such as
ネオエピトープ
「ネオエピトープ」とは、その抗原にいまだ結合している抗体又は抗体断片が認識する抗原のエピトープであって、タンパク質の断片である特定のペプチド中のみにおいて存在し、完全なタンパク質中には存在しないエピトープである。
Neoepitope A “neoepitope” is an epitope of an antigen that is recognized by an antibody or antibody fragment that is still bound to the antigen, and exists only in a specific peptide that is a fragment of the protein. Is an epitope that does not exist.
抗体
「抗体」は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、畜牛、ブタ、ヤギ、ヒツジなど、すべての種の抗体、血清、血漿、卵子など、天然において見出される材料に由来する抗体、分子生物学又は遺伝子組換え技術を用いて作製した抗体、例えば、マウスなど異なる種の抗体に由来する抗体の抗原結合部分以外の部分に限りヒトアミノ酸配列を含む、ヒト化抗体などのキメラ抗体を含むものとする。さらに、本発明には、抗体が依然その抗原に結合する限りにおけるＦａｂ、Ｆａｂ２、又は他の抗体断片などの抗体断片、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＹなどすべての抗体クラスの抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（複数のモノクローナル抗体の混合物）、及びポリクローナル抗体、血漿、血清、組織培養物上清、腹水、細胞培養槽などの供給源から精製した又は非精製の又は部分精製の抗体、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、９８％超の純度まで精製した抗体が含まれる。抗体は、目的の抗原に特異的な抗体のみを含むことができるか、又は加えて、例えば、非精製のポリクローナル抗血清若しくは非精製の抗体含有細胞培養物上清（抗体産生細胞を培養するのに用いる血清に由来することが通例である非特異的抗体）の場合が通例である、他の特異性を有する他の抗体を含むことができる。
Antibody “Antibodies” refers to antibodies, molecular organisms derived from materials found in nature such as humans, mice, rats, cows, rabbits, cattle, pigs, goats, sheep, etc., all kinds of antibodies, serum, plasma, eggs, etc. An antibody produced using a genetic or genetic recombination technique, for example, a chimeric antibody such as a humanized antibody containing a human amino acid sequence only in a portion other than the antigen binding portion of an antibody derived from an antibody of a different species such as a mouse . Furthermore, the present invention includes antibody fragments such as Fab, Fab2, or other antibody fragments, antibodies of all antibody classes such as IgG, IgA, IgM, IgE, IgY, monoclonal antibodies as long as the antibody still binds to its antigen , Oligoclonal antibodies (mixtures of monoclonal antibodies), and polyclonal antibodies, plasma, serum, tissue culture supernatants, ascites, cell culture vessels, and other sources, purified or unpurified or partially purified antibodies, about Includes antibodies purified to purity greater than 1%, about 5%, about 10%, about 20%, about 50%, about 75%, about 80%, about 90%, about 95%, about 98%, 98% It is. The antibody can include only antibodies specific for the antigen of interest, or in addition, for example, non-purified polyclonal antiserum or non-purified antibody-containing cell culture supernatant (for culturing antibody-producing cells). Other antibodies with other specificities can be included, typically in the case of non-specific antibodies typically derived from serum used in
試験キット
「試験キット」は、試験キットにより検出するペプチドと同一の精製した、又は部分精製の若しくは非精製のペプチドでありうる標準物質を含んでよい。さらに、試験キットは、陽性対照試料（試験中にシグナルを発する）及び陰性対照試料（シグナルを発しないか、又は予測される背景シグナルを示す）、抗体又は抗体断片又は酵素と結合した抗体などの結合作用物質、フルオロフォア、放射性物質、前記結合作用物質で被覆したマイクロタイタープレート、ＳＥＬＤＩチップ、プロテインチップ、ＢＩＡＣＯＲＥチップなどの表面、酵素基質、オリゴヌクレオチドプローブ、緩衝液、ペプチド標準物質、試験をどのように行うかの説明書などを含んでよい。
Test Kit A “test kit” may include a standard that can be the same purified or partially purified or non-purified peptide as the peptide detected by the test kit. In addition, test kits include positive control samples (which emit a signal during the test) and negative control samples (which do not emit a signal or exhibit a predicted background signal), antibodies or antibody fragments or antibodies conjugated to an enzyme, Binding agents, fluorophores, radioactive materials, microtiter plates coated with the binding agents, SELDI chips, protein chips, BIACORE chips and other surfaces, enzyme substrates, oligonucleotide probes, buffers, peptide standards, tests Instructions on how to do so may be included.
本発明の方法と他の診断法との併用
本発明の方法を他の診断法と併用して、診断の正確さ、信頼性、特異性などを改善してよい。例えば、本発明の方法を以下の１つ又は複数の診断法と併用することができる。肥満指数（ＢＭＩ）の判定、「ウエスト対ヒップ比」の判定、血圧の測定、「経口ブドウ糖負荷試験」の実施、磁気共鳴分光法などの方法を用いる肝脂肪含量の測定、以下の物質のいずれか１つの測定：Ｃペプチド（インスリンの断片）、インスリン、アディポネクチン、グリコシル化ヘモグロビン（Ｈｂａ１ｃとも呼ぶ）、並びにコレステロール及び／又は脂肪酸若しくは脂質の測定。
Combination of the method of the present invention with other diagnostic methods The method of the present invention may be used in combination with other diagnostic methods to improve the accuracy, reliability, specificity, etc. of the diagnosis. For example, the methods of the invention can be used in combination with one or more of the following diagnostic methods. Determination of body mass index (BMI), determination of “waist to hip ratio”, measurement of blood pressure, implementation of “oral glucose tolerance test”, measurement of liver fat content using methods such as magnetic resonance spectroscopy, any of the following substances: One measurement: measurement of C-peptide (fragment of insulin), insulin, adiponectin, glycosylated hemoglobin (also called Hba1c), and cholesterol and / or fatty acid or lipid.
有益性
「有益性」という用語は、個体が２型糖尿病プリフォームの改善に関する身体運動及び／又は食事による介入から利益を得るかどうかを判定する、個体の層別化に適する特定のペプチドの測定に関して用いる。「ＯＧＧＴ」又はＩＧＴは、このペプチドの測定が、経口ブドウ糖負荷試験又は２型糖尿病プリフォームを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適することについて述べる。
Benefit The term “beneficial” is a measure of a specific peptide suitable for stratification of an individual that determines whether the individual will benefit from physical exercise and / or dietary intervention for improvement of a
「予後予測」
本明細書で用いる「予後予測」とは、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病を発症する危険性の高い素因、好ましくは遺伝的素因を有する個体、或いは過去において２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患した可能性の高い個体を検出するのに適するペプチドを測定することを指す。２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病を過去に有したがもはや有さない個体は、その体内に一定の不可逆的変化を蒙る可能性があり、この不可逆的変化がその体内におけるペプチド量の変化により反映される可能性があることを仮定する。これらの個体が、２型糖尿病プリフォームを再発する及び／又は２型糖尿病を再発する可能性が高いことをさらに仮定する。結果として、「予後予測」に分類されるペプチドは、２型糖尿病プリフォーム及び／又は２型糖尿病に罹患する個体の予後予測に適しうる。
"Prognosis Prediction"
As used herein, “prognosis” refers to a
「診断」
「診断」という用語は、経口ブドウ糖負荷試験、又は２型糖尿病プリフォーム、特に、ＩＧＴを診断するための別の診断法に代替する又はこれを補完するのに適するペプチドの測定について述べることを目的とする。
"Diagnosis"
The term “diagnosis” is intended to describe the measurement of peptides suitable to replace or complement an oral glucose tolerance test or
配列アライメント並びに配列相同性及び配列同一性の計算の準備
配列相同性を計算するために、ＧＡＰアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１２巻、３８７〜３９５頁）、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０頁）又はよく知られたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎｎアルゴリズムを含む、ＧＣＧソフトウェア一式（米国、ウィスコンシン州、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）などのコンピュータプログラムを用いることができる。アミノ酸配列の比較又はアライメントに用いる好ましいパラメータは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３〜４５３頁）、ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックス（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、第８９巻、１０９１５〜１０９１９頁）、ギャップペナルティー１２、ギャップ長ペナルティー４、及び類似性の閾値０を含む。ＧＡＰソフトウェアは、前述のパラメータにより用いるのにも適する。前述のパラメータは、アミノ酸比較のためのデフォルトのパラメータであって、配列の端部におけるギャップが相同性値を減少させないパラメータである。８〜２０アミノ酸残基長の配列など極めて短い配列を比較する場合、期待値を１０００００まで増加させ、ワード長を２まで減少させることが必要な場合がある。さらに適切なアルゴリズムは、ギャップ開始ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティーの使用、及び１９９７年９月以降のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９のプログラムハンドブックに見出される行列の使用である。最適のアルゴリズムの選択は、実施する比較の種類によって決まる。２つの配列を比較する場合は、ＧＡＰアルゴリズム又はＢｅｓｔ Ｆｉｔアルゴリズムが好ましく、１つの配列を配列データベースと比較する場合は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム及びＢＬＡＳＴアルゴリズムが好ましい。７０％の配列同一性を、７０％の相同性ともいう。同一性とは、アライメントのいずれの配列内においても同一の配列位置に同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドが存在することを意味する。
Preparation for Sequence Alignment and Calculation of Sequence Homology and Sequence Identity To calculate sequence homology, the GAP algorithm (Nucleic Acids Res., Vol. 12, pages 387-395), BLASTP algorithm, BLASTN algorithm, FASTA algorithm ( J Mol Biol., 215, 403-410) or using a computer program such as the well-known Smith-Watermann algorithm (University of Wisconsin, Madison, University of Wisconsin, Genetics Computer Group). be able to. Preferred parameters used for amino acid sequence comparison or alignment are the Needleman and Wunsch algorithm (J Mol Biol., 48, 443-453),
ＩＧＴ用となる可能性のあるバイオマーカー
食後のグルコース代謝における変化と相関するペプチドバイオマーカーを得るために、以下のグループをｔ０及びｔ１２において比較した（ｐ＜０．０１）。２つのマーカーセットの間には最小限の重複が存在する結果、１４ペプチドのより頑健なリスト（「ＩＧＴマーカー」）が得られた。
Potential biomarkers for IGT The following groups were compared at t 0 and t 12 to obtain peptide biomarkers that correlate with changes in postprandial glucose metabolism (p <0.01). The minimal overlap between the two marker sets resulted in a more robust list of 14 peptides (“IGT markers”).
ベースライン時（ｔ０）のＯＧＴＴにおいて正常であった被験者をＮ＠ＢＬ又はグループａ（図１参照）（ベースライン時におけるＮＧＴ）と記し、追跡来院時（ｔ１２）に正常であった被験者をＮ＠ＦＵ又はグループｂ（図１参照）（追跡時におけるＮＧＴ）と記した。同様に、ベースライン時のＯＧＴＴにおいて異常であった被験者をＩ＠ＢＬ又はグループｂ（ベースライン時におけるＩＧＴ）と記し、追跡来院時（ｔ１２）に異常であった被験者をＩ＠ＦＵ又はグループｄ＋ｆ（追跡時におけるＩＧＴ）と記した。ＮＧＴからＩＧＴを発症した個体は、ベースライン来院時におけるＮＢＬＩＦＵ又はグループａ２（ベースライン時にはＮＧＴであったが、追跡時にはＩＧＴを発症した）、及び追跡来院時におけるＩＦＵＮＢＬ又はグループｄ（追跡時にはＩＧＴであったが、ベースライン時にはＮＧＴであった）と記した。他のＩＧＴサブグループ又はＮＧＴサブグループにも同じ表記法を用いた。
Ａ１＋Ａ３＝マーカーがより頑健
Subjects who were normal in OGTT at baseline (t0) are designated N @ BL or group a (see FIG. 1) (NGT at baseline) and subjects who were normal at follow-up visit (t12) are N @FU or group b (see FIG. 1) (NGT at the time of tracking). Similarly, subjects who were abnormal at baseline OGTT were noted as I @ BL or group b (IGT at baseline) and subjects who were abnormal at follow-up visit (t 12 ) were identified as I @ FU or group It was written as d + f (IGT at the time of tracking). Individuals who developed IGT from NGT, N BL I FU or group a2 at baseline visit (the baseline was the NGT, who developed IGT during tracking), and I FU N BL or group during track visits d (IGT at the time of follow-up but NGT at the baseline). The same notation was used for other IGT or NGT subgroups.
A1 + A3 = marker is more robust
ＩＧＴからＮＧＴへの転換者は、食後高血糖の履歴を有する。被験者が追跡来院時にＮＧＴでありえても、過去における耐糖能異常に関連する代謝特性又は表現型特性は残存し、特定のペプチドプロファイル（「不可逆性マーカー」）と相関すると仮定した。マーカーグループＡ２は、別のグループへ転換したか否かにかかわらず、追跡時におけるもとのＮＧＴグループ及びＩＧＴグループの間で異なるペプチドについて述べる。
Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＝マーカーがより頑健
Convertors from IGT to NGT have a history of postprandial hyperglycemia. Even if a subject could be NGT at a follow-up visit, it was assumed that metabolic or phenotypic characteristics associated with impaired glucose tolerance in the past remain and correlate with a specific peptide profile ("irreversible marker"). Marker group A2 describes peptides that differ between the original NGT group and the IGT group at the time of follow-up, whether or not they have switched to another group.
A1 + A2 + A3 = Marker is more robust
ライフスタイル介入に対する反応の予測因子
以下のグループ比較を行い、どの被験者がライフスタイルの変化から利益を得てＩＧＴからＮＧＴへと転換するかを予測するバイオマーカーを同定する。当初ＩＧＴでＮＧＴに転換した被験者のペプチドプロファイルを、ＩＧＴにとどまった被験者の場合とＴ０及びＴ１において比較した。さらに、２つのマーカーセットの間の重複を計算した。
Ｄ１＋Ｄ２＝マーカーがより頑健
Predictors of Response to Lifestyle Intervention The following group comparisons are performed to identify biomarkers that predict which subjects will benefit from lifestyle changes and convert from IGT to NGT. The peptide profile of subjects who initially converted to NGT at IGT was compared at T 0 and T 1 with subjects who remained at IGT. In addition, the overlap between the two marker sets was calculated.
D1 + D2 = Marker is more robust
遺伝的素因マーカー
肥満であるか、ＩＧＴと診断されたか、又は２型糖尿病患者の第１等親者であるかした被験者を試験に組み入れた（１）。２型糖尿病を発症する家族的素因を有する被験者において、これらの異常は、ＩＧＴの診断以前に存在することがある。２回の検査間でＮＧＴにとどまる患者が遺伝的素因を有さないのに対し、ＮＧＴからＩＧＴに転換する患者又は該検査間でＩＧＴにとどまる患者は遺伝的素因を有すると仮定した。将来においてＩＧＴを発症する素因を示すマーカーを同定するため、Ｔ０におけるペプチドプロファイルであって、試験の全期間においてＮＧＴにとどまる患者に由来するプロファイルと、試験の全期間においてＩＧＴにとどまる患者に由来するプロファイルとを比較した。
Genetic predisposition markers Subjects who were obese, diagnosed with IGT, or first-degree relatives of patients with
加えて、Ｔ０及びＴ１におけるＮＧＴ及びＩＧＴの非転換者のサブグループを統合し、相互に比較した。いずれのペプチドリストも、３６ペプチドの重複（「遺伝マーカー」）を有した。
Ｆ１＋Ｆ２＝マーカーがより頑健
In addition, NGT and IGT non-converter subgroups at T 0 and T 1 were integrated and compared with each other. Both peptide lists had 36 peptide duplications (“genetic markers”).
F1 + F2 = marker is more robust
ペプチドの同定
統計学的解析に基づき、異なるグループ比較に由来する２５ペプチドのリストをまとめた。配列の同定には、同一分画中における低〜高存在比である５％のピークを上回る質量分析シグナルのみを選択した。ペプチドプロファイルの作製には患者の血漿を用いたので、前述の試験以来の既に分画された血漿のみが使用可能であった。こうして、ＩＧＴグループにおいて増加したペプチドの存在量があまりに少量であるため、健康ボランティア被験者の血漿プールに由来するペプチドを同定することができない場合もあった。
Peptide identification A list of 25 peptides from different group comparisons was compiled based on statistical analysis. For the identification of the sequences, only mass spectrometry signals above the 5% peak, which is a low to high abundance ratio in the same fraction, were selected. Since the patient's plasma was used to generate the peptide profile, only the already fractionated plasma since the previous study was usable. Thus, the increased amount of peptides present in the IGT group may be too small to identify peptides derived from the plasma pool of healthy volunteer subjects.
１３前駆体に由来する全２０ペプチドを同定した。その前駆体タンパク質に仮定される代謝機能に従って、そのペプチドを、以下の種類に類別することができる。
・ 高密度リポタンパク質：アポＣ−ＩＩＩ、アポＬ−Ｉ
・ 鉄及びヘムの代謝及び輸送タンパク質及びペプチド：ヘモペキシン、ヘプシジン
・ 炎症感受性血漿タンパク質：補体Ｃ４、フィブリノーゲン
・ 活性化血小板から放出されるタンパク質：チモシンベータ４
・ 骨吸収／形成に関与するペプチドホルモン：オステオカルシン、ＩＧＦ−Ｉ
・ Ｉ型コラーゲン
・ アルブミン（プレアルブミン＝トランスチレチン）
・ グルコース輸送及び代謝：ＩＧＦ−Ｉ及びインスリン
All 20 peptides derived from 13 precursors were identified. Depending on the metabolic function assumed for the precursor protein, the peptides can be categorized into the following types:
High density lipoprotein: Apo C-III, Apo LI
-Iron and heme metabolism and transport proteins and peptides: hemopexin, hepcidin-Inflammation sensitive plasma proteins: complement C4, fibrinogen-Proteins released from activated platelets:
Peptide hormones involved in bone resorption / formation: osteocalcin, IGF-I
・ Type I collagen ・ Albumin (prealbumin = transthyretin)
Glucose transport and metabolism: IGF-I and insulin
マーカー候補物質の詳細な説明
アポＣ−ＩＩＩ
アポＣ−ＩＩＩの一般的な説明
血漿アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣ−ＩＩＩ）は、トリグリセリド（Ｔｇ）に富むリポタンパク質（キロミクロン及びＶＬＤＬ）の主要成分及びＨＤＬの微量成分である。アポＣ−ＩＩＩは、リポタンパク質粒子のクリアランスに干渉するが、その主要な役割は、リポタンパク質リパーゼに対する生化学的な阻害によるとともに、脂肪分解酵素及びリポタンパク質受容体が滞留する細胞表面のグリコサミノグリカンマトリックスへのリポタンパク質の結合に対する干渉にもよる、脂肪分解阻害剤としてのものである。アポＣ−ＩＩＩ発現の変化は、高トリグリセリド血症において重要な役割を有することが、明確に実証されている。食後の試験は、Ｔｇに富むリポタンパク質（ＴＲＬ）クリアランスの遅延が、心筋虚血症、頸動脈アテローム性硬化症、及びアテローム性動脈硬化の危険性と関連することを見出した。アポＣ−ＩＩＩは、ヒト血漿において最も豊富なＣアポリポタンパク質であり、約１２ｍｇ／ｄＬの濃度である。
Detailed Description of Marker Candidate Substances Apo C-III
General Description of Apo C-III Plasma apolipoprotein CIII (Apo C-III) is a major component of lipoproteins (kilomicrons and VLDL) rich in triglycerides (Tg) and a minor component of HDL. Apo C-III interferes with the clearance of lipoprotein particles, but its main role is due to biochemical inhibition of lipoprotein lipase as well as cell surface glycosami in which lipolytic enzymes and lipoprotein receptors reside. It is a lipolysis inhibitor due to interference with lipoprotein binding to the noglycan matrix. It has been clearly demonstrated that changes in apo C-III expression have an important role in hypertriglyceridemia. Post-prandial studies have found that delayed Tg-rich lipoprotein (TRL) clearance is associated with the risk of myocardial ischemia, carotid atherosclerosis, and atherosclerosis. Apo C-III is the most abundant C apolipoprotein in human plasma, with a concentration of about 12 mg / dL.
同定されたアポＣ−ＩＩＩペプチド
そのグリコシル化のパターンのみが異なる、３つの同一なアポＣ−ＩＩＩ（アミノ酸８９〜９９）ペプチドを同定した。そのＣ末端の長さのみが異なるアポＣ−ＩＩＩのＮ末端から、さらに２つのペプチドを同定した（アミノ酸２０〜６０、２０〜６１）。アポＣ−ＩＩＩのＮ末端に由来するペプチド（アミノ酸２６〜４６）は、脂質間相互作用特性を有することが示されている。親水性残基が、トリグリセリド代謝にとって重要なアポリポタンパク質と脂質との交換に関与すると推測された。
Identified apo C-III peptides Three identical apo C-III (amino acids 89-99) peptides that differ only in their glycosylation pattern were identified. Two more peptides were identified from the N-terminus of Apo C-III that differ only in their C-terminal length (amino acids 20-60, 20-61). Peptides derived from the N-terminus of Apo C-III (amino acids 26-46) have been shown to have lipid interaction properties. It was speculated that hydrophilic residues are involved in the exchange of apolipoproteins and lipids important for triglyceride metabolism.
アポＣ−ＩＩＩの潜在的な開裂部位
アポＣ−ＩＩＩは、肝臓で、また少量は腸で、９９アミノ酸のペプチドとして合成される。小胞体内における２０アミノ酸のシグナルペプチドの除去後、７９アミノ酸の成熟アポＣ−ＩＩＩタンパク質は、８．８ｋＤａの分子量を有する。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアポＣ−ＩＩＩのトロンビン開裂の結果、残基２１〜６０のＮ末端ドメイン、及び残基６１〜７９のＣ末端ドメインが生じる。こうして、同定されたアポＣ−ＩＩＩ断片の１つ（アミノ酸２１〜６０）は、トロンビン開裂産物でありうる。
Potential cleavage sites for Apo C-III Apo C-III is synthesized as a 99 amino acid peptide in the liver and a small amount in the intestine. After removal of the 20 amino acid signal peptide in the endoplasmic reticulum, the 79 amino acid mature apo C-III protein has a molecular weight of 8.8 kDa. In vitro thrombin cleavage of apo C-III results in an N-terminal domain of residues 21-60 and a C-terminal domain of residues 61-79. Thus, one of the identified apo C-III fragments (amino acids 21-60) may be a thrombin cleavage product.
アポＣ−ＩＩＩの示差的なグリコシル化
アポＣ−ＩＩＩは、配列位置７４のスレオニン残基におけるＯ結合型シアリル化の程度に応じて、アポＣ−ＩＩＩ−０（シアル酸なし）、アポＣ−ＩＩＩ−１（１モルのシアル酸）、及びアポＣ−ＩＩＩ−２（２モルのシアル酸）の３つの異なるアイソフォームにおいて存在する。本試験において本発明者らが同定したペプチドは、そのグリコシル化のパターンにおいて異なる。
Differential glycosylation of Apo C-III Apo C-III depends on the degree of O-linked sialylation at the threonine residue at
アポＣ−ＩＩＩの機能
アポＣ−ＩＩＩは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、リポタンパク質リパーゼによるＴＧに富む粒子の加水分解、及びアポＥが介在する該分解物の肝臓による取り込みを阻害する。こうして、アポＣ−ＩＩＩは、Ｔｇに富むリポタンパク質の分解において重要な役割を有する可能性がある。ＭｃＣｏｎａｔｈｙらは、アポＣ−ＩＩＩの合成ポリペプチド断片を用いて、アポＣ−ＩＩＩのＮ末端ドメインが、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性の阻害の主な原因であることを観察した。候補物質１８（アミノ酸２１〜６１）と同一なＣＮＢｒ開裂ペプチド（アミノ酸１〜４１）が、ＬＰＬ活性を阻害する。
Apo C-III function Apo C-III inhibits the hydrolysis of TG-rich particles by lipoprotein lipase in vivo and in vitro, and the uptake of the degradation product mediated by apo E by the liver. Thus, apo C-III may have an important role in the degradation of Tg rich lipoproteins. McConathy et al., Using a synthetic polypeptide fragment of Apo C-III, observed that the N-terminal domain of Apo C-III is the main cause of inhibition of lipoprotein lipase (LPL) activity. A CNBr-cleaving peptide (amino acids 1-41) identical to candidate substance 18 (amino acids 21-61) inhibits LPL activity.
アポＣ−ＩＩＩと糖尿病又はＩＧＴ
アポＣ−ＩＩＩのアテロームを誘発する役割のほか、メタボリックシンドロームにおいて冠動脈疾患（ＣＡＤ）の危険性を生じる高トリグリセリド血症の該役割がよく認識されている。大規模なＣＡＲＥ（コレステロール及び再発事象）臨床試験の結果は、アポＣ−ＩＩＩレベルが、従来測定されたＴＧレベルよりも優れた、ＣＡＤの発現及び進行危険性に関する予測因子であることを示した。
Apo C-III and diabetes or IGT
In addition to the role of apo C-III in inducing atheroma, the role of hypertriglyceridemia that creates a risk of coronary artery disease (CAD) in the metabolic syndrome is well recognized. Results from a large-scale CARE (cholesterol and recurrent event) clinical trial showed that apo C-III levels were a predictor of CAD expression and progression risk, superior to previously measured TG levels .
アポＣ−ＩＩＩ遺伝子は、インスリンレベルにより転写が下方調節され、インスリン応答を媒介する核転写因子に対する親和性の低下と関連する、プロモーター領域における遺伝子多型が記載されている。こうして、遺伝子レベルにおいて「インスリン抵抗性」と関連すると思われる、インスリン応答要素における遺伝子多型が記載された。アポＣ−ＩＩＩ Ｔ−４５５Ｃ変異体のホモ接合性は、ＣＡＤの危険性に対する感受性の独立因子をなす。 The apo C-III gene has been described as a genetic polymorphism in the promoter region that is down-regulated by insulin levels and associated with reduced affinity for nuclear transcription factors that mediate insulin responses. Thus, genetic polymorphisms in insulin response elements have been described that appear to be associated with “insulin resistance” at the genetic level. The homozygosity of the Apo C-III T-455C mutant is an independent factor in susceptibility to CAD risk.
欧州アテローム性動脈硬化研究試験（ＥＡＲＳ）ＩＩでは、アポＣ−ＩＩＩ変異体を有する男性被験者の食後応答が解析された。まれなＣ−４８２Ｔ変異体の相同保有が、ＯＧＴＴ後におけるグルコース濃度及びインスリン濃度を著明に上昇させた。 In the European Atherosclerosis Research Study (EARS) II, the postprandial response of male subjects with an apo C-III variant was analyzed. The rare homology of the C-482T mutant markedly increased glucose and insulin concentrations after OGTT.
バイオマーカーとしてのアポＣ−ＩＩＩペプチドの使用
同定されたペプチドは、アポＣ−ＩＩＩのＮ末端及びＣ末端に由来し、ＩＧＴと正に相関した。これらのペプチドレベルの上昇は、ＯＧＴＴを用いる必要なく見出された。こうして、一晩の絶食後にレベルの上昇を検出しうる。該ペプチドレベルは、アポＣ−ＩＩＩ前駆体レベルの上昇と相関する可能性が高い。血漿アポＣ−ＩＩＩ濃度は、ＥＤＴＡ血漿中で、和光純薬工業株式会社（日本、大阪）製のキットを用いて測定することができる。
Use of Apo C-III Peptide as a Biomarker The identified peptide was derived from the N-terminus and C-terminus of Apo C-III and was positively correlated with IGT. These increased peptide levels were found without the need to use OGTT. Thus, elevated levels can be detected after an overnight fast. The peptide level is likely to correlate with increased apo C-III precursor levels. The plasma apo C-III concentration can be measured in EDTA plasma using a kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan).
該ペプチドを用いて、インスリン感受性の異常を診断してよい。さらに、タンパク質分解による開裂は、ＬＰＬ活性を阻害する可能性を有する循環ペプチドを放出する。アポＣ−ＩＩＩ発現の上昇のほか、ＬＰＬ活性を阻害しうるペプチドの放出もともに、ＬＰＬ活性の低下に寄与しうる。 The peptide may be used to diagnose abnormal insulin sensitivity. Furthermore, proteolytic cleavage releases circulating peptides that have the potential to inhibit LPL activity. In addition to increased apo C-III expression, the release of peptides that can inhibit LPL activity can also contribute to a decrease in LPL activity.
アポＬ−Ｉ
アポＬ−Ｉの一般的な説明
アポＬ−Ｉは、血漿並びに肝臓、肺、脳、膵臓、胎盤、及び血管内皮など各種の組織中に見出される４２ｋＤａのタンパク質である。血漿中において、アポＬ−Ｉは、大径ＨＤＬ粒子（アポＡ−Ｉを含むリポタンパク質の１０％において見出される）と主に関連する。遊離アポＬは、血漿中において検出されなかった。コレステロールの輸送に関与するリポタンパク質との関連により、アポＬ−Ｉは、脂質の輸送及び代謝に役割を果たすと考えられる。
Apo LI
General Description of ApoLI ApoLI is a 42 kDa protein found in plasma and various tissues such as liver, lung, brain, pancreas, placenta, and vascular endothelium. In plasma, apoL-I is mainly associated with large HDL particles (found in 10% of lipoproteins including apoA-I). Free apoL was not detected in plasma. Due to its association with lipoproteins involved in cholesterol transport, apoLI is thought to play a role in lipid transport and metabolism.
加えて、アポＬ−Ｉは、ヒト血清におけるトリパノソーマ溶解因子であることが近年判明した。該タンパク質は、病原体の膜を透過化する、細孔形成ドメインを含む。 In addition, apoLI has recently been found to be a trypanosoma lytic factor in human serum. The protein contains a pore-forming domain that permeabilizes the membrane of the pathogen.
アポＬ−Ｉの潜在的な開裂部位
同定されたアポＬ−Ｉペプチドは、該タンパク質のＮ末端に由来する。Ｌｐ（Ａ−Ｉ）粒子から単離されたアポＬは、４２ｋＤａ及び３９ｋＤａ（微量形態）の２つの形態において観察された。切断型の種は、他の複数の血漿アポリポタンパク質の場合と同様に、該タンパク質のタンパク質分解による活性化形態を表しうると推測された。Ｎ末端配列決定を実施して、該３９Ｋｄａ形態のＮ末端である、ＤＷＡＡＧＴＭＤＰＥを決定した。本発明者らが同定したＮ末端ペプチドは、タンパク質分解による予測開裂部位と一致する。
Potential cleavage sites for ApoL-I The identified apoLI peptide is derived from the N-terminus of the protein. Apo L isolated from Lp (AI) particles was observed in two forms, 42 kDa and 39 kDa (micro form). It was speculated that the truncated species could represent the proteolytically activated form of the protein, as in other plasma apolipoproteins. N-terminal sequencing was performed to determine DWAAGTM DPE, the N-terminus of the 39 Kda form. The N-terminal peptide that we have identified is consistent with the predicted cleavage site by proteolysis.
アポＬ−Ｉと糖尿病又はＩＧＴ
血漿アポＬ−Ｉレベルは、原発性高コレステロール血症（対照における８．５μｇ／ｍＬに対して１０．１μｇ／ｍＬ）、内因性高トリグリセリド血症（１３．８μｇ／ｍＬ）、高脂血症表現型の統合（１８．７ｇ／ｍＬ）、及び高脂血性のＩＩ型糖尿病患者（１６．２μｇ／ｍＬ）において上昇する。アポＬと、肥満指数、年齢、性別、ＨＤＬコレステロール、又は空腹時の血糖値及びグリコヘモグロビンレベルとの間に著明な相関関係は認められなかった。原発性コレステリルエステル輸送タンパク質欠損症患者の血漿中におけるアポＬレベルは、著明に上昇した（５．４７±０．２７に対して７．１±０．５）。
Apo LI and diabetes or IGT
Plasma apoLI levels are: primary hypercholesterolemia (10.1 μg / mL vs 8.5 μg / mL in control), endogenous hypertriglyceridemia (13.8 μg / mL), hyperlipidemia Phenotypic integration (18.7 g / mL) and elevated in hyperlipidemic type II diabetic patients (16.2 μg / mL). There was no significant correlation between ApoL and body mass index, age, gender, HDL cholesterol, or fasting blood glucose and glycated hemoglobin levels. ApoL levels in plasma of patients with primary cholesteryl ester transfer protein deficiency were markedly elevated (7.1 ± 0.5 versus 5.47 ± 0.27).
バイオマーカーとしてのアポＬ−Ｉの使用
同定されたペプチドは、ＩＧＴ（ＷＨＯ基準）の存在と正に相関する。この知見は、これまで述べられなかった。アポＬ−Ｉ値の上昇は、ＩＦＧ又は２型糖尿病を有する被験者のみにおいて測定されてきた。該ペプチドは、３９Ｋｄａ形態の存在とも相関しうる。しかし、３９Ｋｄａ形態が明確な生物学的機能を有するかどうかは、現在のところ知られていない。こうして、該ペプチドは、ＯＧＴＴを実施する必要なくＩＧＴ（及び高い可能性でＩＦＧも）を測定する単独マーカー又は多重マーカーとして用いてよい。しかし、アポＬ−Ｉレベル間の高度のばらつきにより、明確な分画値を定めることが困難となりうる。
Use of ApoL-I as a biomarker The identified peptides are positively correlated with the presence of IGT (WHO criteria). This finding has not been described so far. Increased apoLI levels have been measured only in subjects with IFG or
オステオカルシンプロペプチド
オステオカルシンの一般的な説明
オステオカルシン又は骨ガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）タンパク質（ＢＧＬＡＰ、又はＢＧＰ）は、翻訳中に開裂する２３残基の転座シグナルペプチド、ガンマカルボキシル化するタンパク質を標的とする２６残基のプロペプチド、及び４９残基の成熟ペプチドからなる、１１ｋＤの分子として当初合成される。新規に合成されたオステオカルシンの大半が骨マトリックス内に沈着するが、少量は血中で検出することができ、骨芽細胞活性の特異的な指標としての現在の臨床的使用をもたらしているのはこの特性である。オステオカルシンは、完全な分子及び断片として、骨吸収中にも骨マトリックスから放出される。こうして、オステオカルシンは、骨形成及び骨代謝回転の両方に対するマーカーとして考えるべきである。オステオカルシンは、主に骨芽細胞、骨細胞、及び象牙芽細胞により産生されるが、メッセンジャーＲＮＡは、骨以外の組織においても検出されている。
General Description of Osteocalcin Propeptide Osteocalcin Osteocalcin or bone gamma carboxyglutamate (Gla) protein (BGLAP, or BGP) targets a 23-residue translocation signal peptide that is cleaved during translation, a protein that gamma carboxylates It is initially synthesized as an 11 kD molecule consisting of a 26-residue propeptide and a 49-residue mature peptide. Most of the newly synthesized osteocalcin is deposited in the bone matrix, but a small amount can be detected in the blood, leading to current clinical use as a specific indicator of osteoblast activity. This is the characteristic. Osteocalcin is released as a complete molecule and fragment from the bone matrix during bone resorption. Thus, osteocalcin should be considered as a marker for both bone formation and bone turnover. Osteocalcin is mainly produced by osteoblasts, bone cells, and odontoblasts, but messenger RNA has also been detected in tissues other than bone.
しかし、該プロペプチドの帰趨についてはほとんど知られていない。オステオカルシン及びそのプロペプチドが共分泌されるならば、そのプロペプチドの濃度も骨芽細胞機能のマーカーとして有用でありえ、さらに、骨への結合による影響を受けないのでオステオカルシンより優れている可能性もある。オステオカルシンプロペプチドの血中における存在については、矛盾する結果が公表されている。 However, little is known about the consequences of the propeptide. If osteocalcin and its propeptide are co-secreted, the concentration of the propeptide can also be useful as a marker of osteoblast function and may be superior to osteocalcin because it is not affected by binding to bone. is there. Contradicting results have been published for the presence of osteocalcin propeptide in the blood.
オステオカルシンプロペプチドのタンパク質分解によるプロセシング
同定されたペプチドは、予測プロペプチドに由来する。オステオカルシンプロペプチドは、そのＣ末端の二塩基部位において開裂して成熟オステオカルシンペプチドを放出する。同定されたプロペプチドは、予測プロペプチドの小型の形態であり、Ｎ末端における２アミノ酸Ｌｙｓ−Ａｌａ及びＣ末端におけるＡｒｇを欠いている。これらの知見は、該プロペプチドのＮ末端が、ＤＰＰＩＶ開裂部位を含む一方、Ｃ末端は、細胞内において、又はＣ末端のＡｒｇ残基に特異的な血漿カルボキシペプチダーゼＢによりプロセシングされる可能性がある。
Proteolytic processing of osteocalcin propeptide The identified peptide is derived from the predicted propeptide. Osteocalcin propeptide cleaves at its C-terminal dibasic site to release the mature osteocalcin peptide. The identified propeptide is a small form of the predicted propeptide, lacking the 2 amino acids Lys-Ala at the N-terminus and Arg at the C-terminus. These findings indicate that the N-terminus of the propeptide contains a DPPIV cleavage site, while the C-terminus may be processed intracellularly or by plasma carboxypeptidase B specific for the C-terminal Arg residue. is there.
こうして、本知見は、なぜ特定の抗体が該プロペプチドの循環形態を検出できないのかを説明する一助となるであろう。 Thus, this finding will help explain why certain antibodies cannot detect the circulating form of the propeptide.
オステオカルシンと糖尿病又はＩＧＴ
高血糖値及びインスリン分泌の欠如を標識とするインスリン依存性糖尿病は、骨量の低下及び骨折率の上昇と関連する。これに対して、２型糖尿病患者は、健康な対照と比べて、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）レベルが上昇することさえ多い。Ａｋｉｎら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第１７巻、１９〜２９頁、２００３年、は、閉経後の２型糖尿病患者における骨代謝回転を評価し、糖尿病患者におけるＢＭＤ値が健康な閉経後の対照群よりも高く、血清オステオカルシンレベルが該対照群よりも著明に低いことを見出した。肥満指数とＢＭＤ値との間にも著明な相関関係が観察された。これらの知見は、２型糖尿病患者における骨代謝回転速度が、健康な閉経後患者と比べて著明に低いことを示唆する。
Osteocalcin and diabetes or IGT
Insulin dependent diabetes, which is marked by high blood glucose levels and lack of insulin secretion, is associated with decreased bone mass and increased fracture rate. In contrast,
Ｄｅｎｎｉｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第４７巻、１９６３〜１９６８頁、２００４年、は、１９３０年代にハートフォードシャーに生まれた男女を、グルコース代謝、インスリン分泌及びインスリン抵抗性並びに骨量の測定値に関して特徴づけた、ハートフォードシャーコホート試験において、２型糖尿病と骨密度の上昇との関係を探索した。彼らは、その根底にある機序は不明なままであるが、部分的には脂肪症を介し、男性よりも女性において著明な、ＢＭＤと２型糖尿病との間の正の相関をも見出した。
Dennison et al., Diabetologia, 47, 1963-1968, 2004, characterized men and women born in Hertfordshire in the 1930s in terms of glucose metabolism, insulin secretion and insulin resistance, and bone mass measurements. In the Hertford Sharkhort study, we explored the relationship between
Ｒｏｓａｔｏら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ、第６３巻、１０７〜１１１頁、１９９８年、は、糖尿病患者において、血糖コントロールの改善が、血清オステオカルシン値及び血清インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）値の上昇と関連することを示した。糖尿病患者においては、オステオカルシン及びＨｂＡ１ｃ及びグルコースに関して、ベースライン時から血糖コントロールの改善時に至る百分率変化に逆相関が存在した。これらのデータは、血糖コントロールの改善が、男女の糖尿病患者の骨代謝回転の上昇を伴い、おそらくは循環ＩＧＦ−Ｉレベルの上昇を介していることを示唆する。 Rosato et al., Calcif. Tissue Int, 63, 107-111, 1998, shows that improved diabetes control is associated with elevated serum osteocalcin levels and serum insulin-like growth factor I (IGF-I) levels in diabetic patients. Indicated. In diabetic patients, there was an inverse correlation between percent change from baseline to improved glycemic control for osteocalcin and HbA1c and glucose. These data suggest that the improvement in glycemic control is accompanied by an increase in bone turnover in male and female diabetic patients, possibly through an increase in circulating IGF-I levels.
バイオマーカーとしてのオステオカルシンプロペプチドの使用
本発明者らは、オステオカルシンのプロペプチドが、ベースライン時におけるＮＧＴ被験者と比較して、ＩＧＴ被験者においては減少することを見出した（ＩＧＴマーカー）。オステオカルシンレベルは、ライフスタイルの変更後にＮＧＴに転換するＩＧＴ被験者における方が、転換しない被験者の場合と比べて高い。現在までのところ、本発明者らは、オステオカルシンプロペプチドレベルを年齢又は性別と相関させていない。
Use of osteocalcin propeptide as a biomarker We have found that osteocalcin propeptide is reduced in IGT subjects compared to NGT subjects at baseline (IGT markers). Osteocalcin levels are higher in IGT subjects who switch to NGT after lifestyle changes than in subjects who do not convert. To date, we have not correlated osteocalcin propeptide levels with age or gender.
ＩＧＴにおける血漿オステオカルシンレベルは、様々な機序により低下しうる。該プロペプチドが、骨芽細胞の活性及び機能（骨形成）の直接のマーカーであるらしい。
Ａ）骨芽細胞のオステオカルシン分泌は、高血糖値により減少するので、オステオカルシンにより評価される骨形成は、糖尿病コントロールに応じて低下する。
Ｂ）ヒトオステオカルシンの発現は、グルココルチコイドにより負に調節される。グルココルチコイドは、生理学的効果の広いスペクトルを有するストレスホルモンであり、メタボリックシンドロームの病態生理に関与している（１９）。
Ｃ）一般に、身体活動は骨喪失を低下させ、これも部分的に、オステオカルシンレベルの変化に反映される。
こうして、オステオカルシンプロペプチドレベルの差は、ＩＧＴを有する個体における身体活動又はホルモンレベルの違いを反映しうる。
Plasma osteocalcin levels in IGT can be reduced by various mechanisms. The propeptide appears to be a direct marker of osteoblast activity and function (bone formation).
A) Since osteocalcin secretion of osteoblasts decreases with high blood glucose levels, bone formation as assessed by osteocalcin decreases with diabetic control.
B) Human osteocalcin expression is negatively regulated by glucocorticoids. Glucocorticoids are stress hormones with a broad spectrum of physiological effects and have been implicated in the pathophysiology of metabolic syndrome (19).
C) In general, physical activity reduces bone loss, which is also partially reflected in changes in osteocalcin levels.
Thus, differences in osteocalcin propeptide levels may reflect differences in physical activity or hormone levels in individuals with IGT.
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）
ＩＧＦ−Ｉの一般的な説明
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、骨成長、細胞分化、及び代謝を刺激するペプチドである。ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ及びそのアミノ酸の約５０パーセントを共有するインスリンからなる、ＩＧＦファミリーに属する。ＩＧＦは、インスリンと構造的に関連するが、Ｃペプチドを保持し、延長されたＣ末端を有する。インスリンがピコモル濃度で循環し、分単位の半減期を有するのに対し、ＩＧＦは、はるかに高い（ナノモル）濃度で循環し、ＩＧＦ活性を調節する６つのＩＧＦ結合タンパク質の１つに大部分が結合する。これらの結合タンパク質は、ＩＧＦと同様、主に肝臓で合成される。ＩＧＦ及びその結合タンパク質は、大半の組織によっても局所的に産生され、この場合、自己分泌的又は傍分泌的に作用する。インスリンが主に肝臓、筋肉、及び脂肪組織に作用するのに対し、ＩＧＦは、体内のほとんどすべての器官の機能において重要である。どちらのＩＧＦも、胚発生に不可欠であり、成人となっても両方のナノモル濃度は循環中で維持される。年齢、性別、栄養状態、及び成長ホルモン分泌など、多くの変数が、血清ＩＧＦ−Ｉ濃度に影響する。その濃度は出生時には低く、幼少期及び思春期に著明に上昇し、第三期に低下し始める。これらの変化は、成長ホルモンの分泌と並行する。
Insulin-like growth factor I (IGF-I)
General Description of IGF-I Insulin-like growth factor I (IGF-I) is a peptide that stimulates bone growth, cell differentiation, and metabolism. IGF-I belongs to the IGF family consisting of IGF-I and IGF-II and insulin which shares about 50 percent of its amino acids. IGF is structurally related to insulin, but retains the C peptide and has an extended C-terminus. Insulin circulates at picomolar concentrations and has a half-life of minutes, whereas IGF circulates at much higher (nanomolar) concentrations and is predominantly one of six IGF binding proteins that regulate IGF activity. Join. These binding proteins are synthesized primarily in the liver, similar to IGF. IGF and its binding proteins are also produced locally by most tissues and in this case act autocrine or paracrine. Insulin acts primarily on the liver, muscles, and adipose tissue, whereas IGF is important in the function of almost every organ in the body. Both IGFs are essential for embryonic development, and both nanomolar concentrations are maintained in the circulation as adults. Many variables affect serum IGF-I levels, such as age, sex, nutritional status, and growth hormone secretion. Its concentration is low at birth, rises markedly in childhood and adolescence, and begins to decline in the third period. These changes parallel the growth hormone secretion.
同定されたＩＧＦ−Ｉペプチド
ＩＧＦ−Ｉは、不活性のプロペプチド前駆体として合成される。７０アミノ酸の成熟ＩＧＦ−Ｉ分子は、２つの異なるプロホルモン前駆体であるプロ−ＩＧＦ−ＩＡ又はプロ−ＩＧＦ−ＩＢから、Ｅドメインの除去により産生することができる。ＩＧＦ−Ｉ ｍＲＮＡの別のスプライシングが、２つのＩＧＦ−Ｉプロホルモンの産生の原因であるが、異なる形態の生理学的な意義は知られていない。ヒトプロＩＧＦ−ＩＡ及びプロＩＧＦ−ＩＢの配列は、独自の五塩基プロホルモン開裂モチーフであるＬｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇを含む、Ｅドメインの最初の１６残基を介して一致する。このモチーフは、哺乳類、鳥類、両生類、及び硬骨類において保存されている。
The identified IGF-I peptide IGF-I is synthesized as an inactive propeptide precursor. A 70 amino acid mature IGF-I molecule can be produced by removal of the E domain from two different prohormone precursors, pro-IGF-IA or pro-IGF-IB. Alternative splicing of IGF-I mRNA is responsible for the production of two IGF-I prohormones, but the physiological significance of the different forms is unknown. The human pro-IGF-IA and pro-IGF-IB sequences include the unique pentabasic prohormone cleavage motif Lys-XX-Lys-XX-Arg-XX-Arg-XX-Arg. Matches through the first 16 residues of the E domain. This motif is conserved in mammals, birds, amphibians, and teleosts.
本研究において、本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉの２つの形態を同定した。分子量７６６５を有する１つのペプチドが、Ａｒｇ１１９での開裂から生じる成熟ＩＧＦ−Ｉ １〜７０に対応する一方、他のペプチド（１〜７６）は、Ａｒｇ１９５での開裂から生じるＣ末端における６つの追加アミノ酸を含む。いずれのＩＧＦ−Ｉ形態も、プロ−ＩＧＦ−ＩＡを発現するＨＥＫ２９３細胞から同定されており、フリンが、五塩基モチーフ内の複数の部位においてプロＩＧＦ−ＩＡを開裂しうることが示された。本発明者らの知る限りで、ＩＧＦ−Ｉの長い方の形態は、いまだ血漿中で同定されていない。新規に同定され、肝臓において高度に発現する、ヒトプロタンパク質転換酵素ＰＣＳＫ９又はＮＡＲＣ−１（神経アポトーシス調節型転換酵素）における突然変異が、家族性高コレステロール血症と関連する。ＰＣＳＫ９の発現は、肝細胞においてインスリン又は脂質降下剤スタチンにより調節され、ＩＧＦ−Ｉの別のプロセシング形態を心血管疾患及び耐糖能異常と関連させうる。 In this study, we identified two forms of IGF-I. One peptide with a molecular weight of 7665 corresponds to mature IGF-I 1-70 resulting from cleavage at Arg119, while the other peptide (1-76) has 6 additional amino acids at the C-terminus resulting from cleavage at Arg195 including. Both IGF-I forms have been identified from HEK293 cells expressing pro-IGF-IA, indicating that furin can cleave pro-IGF-IA at multiple sites within the five base motif. To the best of our knowledge, the longer form of IGF-I has not yet been identified in plasma. A newly identified and highly expressed mutation in the human proprotein convertase PCSK9 or NARC-1 (a neuronal apoptosis-regulating convertase) that is highly expressed in the liver is associated with familial hypercholesterolemia. PCSK9 expression is regulated by insulin or the lipid-lowering agent statins in hepatocytes and may associate another processing form of IGF-I with cardiovascular disease and impaired glucose tolerance.
ＩＧＴ、糖尿病、及び心血管疾患とＩＧＦ−Ｉとの関連
近年、ＩＧＦ−Ｉが、グルコースのホメオスタシス及び心血管疾患のいずれにおいても役割を有する可能性があることを示唆する証拠が増えつつある。正常被験者、極度のインスリン抵抗性を有する患者、及び１型又は２型糖尿病患者を対象に実施された臨床試験は、組換えＩＧＦ−Ｉの投与が、血糖を著明に低下させ、インスリン感受性を著明に上昇させたことを示している。ＩＧＦ−Ｉがインスリン作用を促進するという考えを裏付ける近年の研究（Ｎａｔｕｒｅ、第４２２巻、８３〜８７頁、２００３年）は、循環中におけるＩＧＦ−Ｉ濃度が低いと、４〜５年間の追跡期間中に２型糖尿病を発症する危険性が極めて高くなると結論づけた。循環中の低ＩＧＦ−Ｉレベルは、非糖尿病被験者において血管造影法により記録された冠動脈疾患のほか、頸動脈におけるアテローム硬化性プラーク、及び冠動脈疾患と関連している。様々な程度の耐糖能を有する被験者における血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度とインスリン感受性との間の関係が、Ｓｅｓｔｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ、第２８巻、１２０〜１２５頁、２００５年によって研究されている。彼らのデータは、血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度が、インスリン感受性の異常及びメタボリックシンドロームの他の構成要素と独立に関連することを示し、低ＩＧＦ−Ｉレベルが、心血管疾患の危険性にある被験者を同定する有用なマーカーでありうることを示唆した。
Association of IGF-I with IGT, Diabetes, and Cardiovascular Disease In recent years, there has been increasing evidence suggesting that IGF-I may have a role in both glucose homeostasis and cardiovascular disease. Clinical trials conducted on normal subjects, patients with extreme insulin resistance, and patients with
複数の研究が、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型の、循環ＩＧＦ−Ｉレベル及び２型糖尿病及び心筋梗塞との関係について述べている。
Several studies have described the relationship of genetic polymorphisms in the promoter region of the IGF-I gene to circulating IGF-I levels and
バイオマーカーとしてのＩＧＦ−Ｉの使用
本明細書における方法を用いると、ＩＧＴを有する個体においてＩＧＦ−Ｉレベルが低下することが示される。ＩＧＦ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びカテプシンＤなどのＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）及びＩＧＦＢＰプロテアーゼの自己分泌による産生を含むＩＧＦ軸の異常が、前立腺癌、肺癌、及び乳癌の細胞及び組織で同定されている。近年の症例対照研究は、最も高頻度で診断される癌のうち、前立腺癌、乳癌、及び肺癌の患者において、血清ＩＧＦ−Ｉレベルが約１０％上昇することを見出している。血漿ＩＧＦ−Ｉレベルは、年齢依存的に低下するので、ＩＧＦ−Ｉは、別のマーカーペプチドとの併用に限り、診断検査マーカーとして考えるべきである。
Use of IGF-I as a biomarker Using the methods herein shows that IGF-I levels are reduced in individuals with IGT. Abnormalities in the IGF axis, including autologous production of IGF binding proteins (IGFBP) and IGFBP proteases such as IGF, prostate specific antigen (PSA) and cathepsin D, have been identified in prostate cancer, lung cancer, and breast cancer cells and tissues Yes. Recent case-control studies have found that among the most frequently diagnosed cancers, serum IGF-I levels increase by about 10% in patients with prostate cancer, breast cancer, and lung cancer. Since plasma IGF-I levels decrease in an age-dependent manner, IGF-I should be considered as a diagnostic test marker only in combination with another marker peptide.
ヘプシジン
ヘプシジンの一般的な説明
肝臓において産生される２５アミノ酸のペプチドホルモンであるヘプシジンは、全身の鉄ホメオスタシスの主要な調節因子である。ヘプシジンは、腸による鉄吸収、マクロファージによる鉄再利用、及び肝貯蔵からの鉄移動を阻害することにより、血漿鉄濃度及び鉄の組織分布を制御する。ヘプシジンは、細胞内で唯一知られた鉄エクスポーターであるフェロポルチンへの結合及びその分解の誘導を介して、細胞からの鉄流出を阻害することにより作用する。ヘプシジンの合成はホメオスタシスを維持するように、鉄負荷により増加し、貧血症及び低酸素症により減少する。ヘプシジンは、おそらくは侵入する微生物への鉄利用能を制限する宿主防御機構として、感染症及び炎症中にも増加し、血清鉄レベルの低下を生じ、炎症性貧血症の発症に寄与する。スペクトルの反対側において、ヘプシジン欠損は、ヘプシジン遺伝子自体における突然変異、又はヘプシジン合成の調節因子における突然変異により、大半の形態のヘモクロマトーシスの最終原因であると思われる。
General Description of Hepcidin Hepcidin, a 25 amino acid peptide hormone produced in the liver, is a major regulator of systemic iron homeostasis. Hepcidin controls plasma iron concentration and tissue distribution of iron by inhibiting iron absorption by the intestine, iron recycling by macrophages, and iron migration from liver storage. Hepcidin acts by inhibiting iron efflux from the cell through binding to ferroportin, the only known iron exporter in the cell, and inducing its degradation. Hepcidin synthesis increases with iron load and decreases with anemia and hypoxia to maintain homeostasis. Hepcidin is also increased during infection and inflammation, possibly as a host defense mechanism that limits iron availability to invading microorganisms, resulting in decreased serum iron levels and contributing to the development of inflammatory anemia. On the other side of the spectrum, hepcidin deficiency appears to be the ultimate cause of most forms of hemochromatosis due to mutations in the hepcidin gene itself, or mutations in regulators of hepcidin synthesis.
同定されたヘプシジンペプチド
ヘプシジンは、循環抗菌ペプチドとして個別に単離されている。主要なヘプシジン形態は、２５アミノ酸残基及び４ジスルフィド架橋を有する陽イオン性ペプチドであった。ヒトにおいて、該ペプチドは８４アミノ酸プレプロペプチドのＣ末端に由来する。
Identified hepcidin peptide Hepcidin has been individually isolated as a circulating antimicrobial peptide. The major hepcidin form was a cationic peptide with 25 amino acid residues and 4 disulfide bridges. In humans, the peptide is derived from the C-terminus of the 84 amino acid prepropeptide.
ヘプシジンと糖尿病、ＩＧＴ、及び脂肪肝
血清フェリチン濃度として表現される鉄貯蔵が、インスリン抵抗性症候群の構成要素であると仮定されている。実際、循環フェリチン濃度は、主に体内脂肪の分布と関連するほか、他の複数の肥満測定値とも著明に関連している。見掛け上健康な一般の集団において、フェリチンの血清レベルは、経口ブドウ糖負荷試験中におけるベースライン時の血清グルコース及びグルコースの曲線下面積とも正に相関した。妊娠性糖尿病では、ＢＭＩレベル及び血清フェリチンレベルともに、２時間にわたる経口ブドウ糖負荷試験中におけるグルコースの独立した予測因子であることがわかった。フェリチンレベルは、ＢＭＩについて調整した後でなお、拡張期動脈血圧とも相関した。鉄貯蔵の減少を生じる頻繁な献血は、健康なボランティア被験者における食後の高インスリン血症を低減し、インスリン感受性を改善し、２型糖尿病の発現に対する防御因子を構成することが示されている。欧米諸国の人口全般における鉄貯蔵増加の高有病率、及び鉄貯蔵の増加が２型糖尿病の高発症率を予測するらしいという観察を踏まえると、この知見は極めて重要である。
Hepcidin and diabetes, IGT, and fatty liver Iron storage expressed as serum ferritin levels has been postulated to be a component of insulin resistance syndrome. In fact, circulating ferritin levels are not only mainly related to the distribution of body fat, but are also significantly related to several other obesity measurements. In the apparently healthy general population, ferritin serum levels also positively correlated with baseline serum glucose and the area under the curve of glucose during the oral glucose tolerance test. In gestational diabetes, both BMI and serum ferritin levels were found to be independent predictors of glucose during the 2-hour oral glucose tolerance test. Ferritin levels also correlated with diastolic arterial blood pressure after adjusting for BMI. Frequent blood donations resulting in decreased iron storage have been shown to reduce postprandial hyperinsulinemia, improve insulin sensitivity, and constitute a protective factor against the development of
新規の肝鉄過剰症候群が記載され、インスリン抵抗性関連肝鉄過剰症（ＩＲ−ＨＩＯ）として知られている。その症候群は、鉄代謝異常（正常なトランスフェリン飽和率を伴う孤発性高フェリチン血症）、脂肪性肝炎、及びインスリン抵抗性症候群（肥満、高脂血症、異常グルコース代謝、及び高血圧）を統合する。ＩＲ−ＨＩＯでは、肝細胞及び類洞細胞の両方において鉄過剰が生じるが、類洞細胞における方が高頻度であり、症例の４５％で生じ、所見がヘモクロマトーシスを有する被験者において見られるのは３％に過ぎない。これらの患者の約３分の２が脂肪症を発症し、残りの３分の１が孤発性の炎症徴候を示す。こうして、これら患者は、肝線維症を発症する危険性が高く、鉄過剰の存在が中程度である場合でも、全症例の６０％において合併症が観察される。 A novel hepatic iron overload syndrome has been described and is known as insulin resistance related hepatic iron overload (IR-HIO). The syndrome integrates iron metabolism abnormalities (spontaneous hyperferritinemia with normal transferrin saturation), steatohepatitis, and insulin resistance syndromes (obesity, hyperlipidemia, abnormal glucose metabolism, and hypertension) To do. In IR-HIO, iron overload occurs in both hepatocytes and sinusoidal cells, but is more frequent in sinusoidal cells and occurs in 45% of cases, and the findings are seen in subjects with hemochromatosis Is only 3%. About two-thirds of these patients develop steatosis and the remaining one-third show sporadic signs of inflammation. Thus, these patients are at high risk of developing liver fibrosis and complications are observed in 60% of all cases, even in the presence of moderate iron overload.
ヘプシジンの合成及び放出は、細菌性リポ多糖及びサイトカイン、特に、ＩＬ−６により迅速に調節される。こうして、ヘプシジン遺伝子は、炎症に反応して過剰発現する急性期反応性遺伝子である。 The synthesis and release of hepcidin is rapidly regulated by bacterial lipopolysaccharides and cytokines, particularly IL-6. Thus, the hepcidin gene is an acute phase responsive gene that is overexpressed in response to inflammation.
バイオマーカーとしてのヘプシジンの使用
肥満において、脂肪組織は、ＩＬ−６を含む広範な炎症分子であって、脂肪組織に対する局所性の効果を有するだけでなく他の器官に対する全身性の効果をも有しうる炎症分子の産生及び分泌の増加を特徴とする。ＩＬ−６は、大網脂肪組織から門脈を経て肝臓に運ばれ、これによりヘプシジン発現を増加させることがある。まとめると、ヘプシジン２５は、耐糖能異常を有する個体における酸化ストレスの増大及び肝機能異常／脂肪肝の新規マーカーとして考えてよい。
Use of hepcidin as a biomarker In obesity, adipose tissue is a broad spectrum of inflammatory molecules, including IL-6, that have not only a local effect on adipose tissue but also a systemic effect on other organs. Characterized by increased production and secretion of possible inflammatory molecules. IL-6 is carried from the omental adipose tissue through the portal vein to the liver, which may increase hepcidin expression. In summary,
ヘモペキシン
ヘモペキシンの一般的な説明
ヘモペキシンは、既知のタンパク質中で、ヘムに対する結合親和性が最も高い血漿タンパク質である。該タンパク質は、主に肝臓で発現し、炎症後にその合成が誘発される急性期反応物質に属する。ヘムは、呼吸及びエネルギー移動を含む広範な生物学的過程において用いられ、全血清タンパク質の約１．４％を占める。ヘムタンパク質、特にヘモグロビンの代謝回転は、細胞外液中へのヘム放出を生じ、健康に重大な結果を生じる可能性がある。遊離鉄と同様に、ヘムは、侵入する細菌性病原体に対する必須鉄の供給源であり、そのフリーラジカル形成に対する触媒能のために毒性が高い。遊離ヘムレベルは低いことが通例であるが、溶血性疾患の病態においては危険なまでに高くなりうる。防御は６０ｋＤａの血清糖タンパク質であるヘモペキシンによってもたらされ、それは極めて高い親和性（Ｋｄ＜１０１２Ｍ）で血流からヘムを隔離し、肝細胞上の特異的な受容体にヘムを輸送し、そこでヘムが受容体媒介エンドサイトーシスを受け、それと結合したヘムを細胞中に放出する。こうして、ヘモペキシンは、ヘム毒性に対する防御並びに鉄の保持及び再利用の両方に寄与する。
General description of hemopexin Hemopexin is the plasma protein with the highest binding affinity for heme among known proteins. The protein belongs to an acute phase reactant that is expressed primarily in the liver and whose synthesis is induced after inflammation. Heme is used in a wide range of biological processes including respiration and energy transfer, accounting for about 1.4% of total serum proteins. The turnover of heme proteins, particularly hemoglobin, can result in heme release into the extracellular fluid, which can have serious health consequences. Like free iron, heme is a source of essential iron for invading bacterial pathogens and is highly toxic due to its catalytic ability to form free radicals. Free heme levels are typically low, but can be dangerously high in the pathology of hemolytic disease. Protection is provided by hemopexin, a 60 kDa serum glycoprotein that sequesters heme from the bloodstream with extremely high affinity (Kd <10 12 M) and transports heme to specific receptors on hepatocytes. There, heme undergoes receptor-mediated endocytosis and releases bound heme into the cell. Thus, hemopexin contributes to both heme toxicity protection and iron retention and reuse.
同定されたヘモペキシンペプチド
同定されたペプチドは、ヘモペキシンのＮ末端に由来し、ＤＰＰＩＶ開裂部位に一致する予測Ｎ末端の最初の２アミノ酸を欠く。したがって、ヘモペキシンペプチドは、ＤＰＰＩＶ開裂の産物でありうる。そのペプチドの新規のＮ末端をＤＰＰＩＶ（ＬＰ／Ｐ）により開裂することはできないので、そのペプチド（少なくともＮ末端部分）が血中に蓄積するように思われる。ＤＰＰＩＶは、より小型のタンパク質及びペプチドを優先的に開裂するので、ヘモペキシンの全体もＤＰＰＩＶ基質であると結論づけることはできない。
Identified hemopexin peptide The identified peptide is derived from the N-terminus of hemopexin and lacks the first two amino acids at the predicted N-terminus, which corresponds to the DPPIV cleavage site. Thus, hemopexin peptides can be the product of DPPIV cleavage. Since the new N-terminus of the peptide cannot be cleaved by DPPIV (LP / P), it appears that the peptide (at least the N-terminal portion) accumulates in the blood. Since DPPIV preferentially cleaves smaller proteins and peptides, it cannot be concluded that hemopexin as a whole is also a DPPIV substrate.
ヘモペキシンと糖尿病、ＩＧＴ、又は脂肪肝
ヘモペキシンは、ＩＬ−６及び成長ホルモンがその転写を上方調節する急性期肝タンパク質であるが、インスリンは、ヘモペキシンの転写速度には影響を与えない。２型糖尿病患者においては、ヘモペキシンレベルの上昇がみられた。
Hemopexin and diabetes, IGT, or fatty liver Hemopexin is an acute liver protein in which IL-6 and growth hormone upregulate its transcription, while insulin does not affect the transcription rate of hemopexin. In patients with
バイオマーカーとしてのヘモペキシンの使用
本発明者らは、ヘモペキシンのＮ末端に由来するペプチドが、ＩＧＴを有する個体であって、ＮＧＴに転換する個体の場合と比べて、ライフスタイルの変化によって耐糖能が改善しない個体において減少することを見出した。この知見は新しく、２型糖尿病患者におけるヘモペキシンの増加が公表されているので、より詳細な分析を要する。可能な説明は、再生肝ではヘモペキシンレベルが上昇するという知見でありうる。こうして、レベルの低下は、肝インスリン耐性再生能の低下を示しうる。
Use of hemopexin as a biomarker The inventors have found that the peptide derived from the N-terminus of hemopexin is an individual with IGT and has improved glucose tolerance due to lifestyle changes compared to an individual that converts to NGT. It was found to decrease in individuals who did not improve. This finding is new and requires more detailed analysis as an increase in hemopexin has been published in patients with
補体Ｃ４−Ａ
Ｃ４の一般的な説明
補体系は、生得的免疫の主要な構成要素であり、侵入する病原体に対する防御の最前線を提供する。補体タンパク質は、血清タンパク質の約１０％を構成し、第４成分であるＣ４は、血中に３５０〜６００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。Ｃ４は、細胞内でアルファ鎖、ベータ鎖、及びガンマ鎖にプロセシングされ、これらはジスルフィド架橋により連結される。補体の古典的経路及びレクチン経路による認識は、それ自体セリンプロテアーゼである補体成分Ｃ２、及びＣ４を開裂するセリンプロテアーゼの活性化をもたらし、Ｃ３をＣ３ａ及びＣ３ｂに開裂するプロテアーゼ複合体Ｃ４ｂ２ａの形成をもたらす。Ｃ３ｂ及びＣ４ｂは、Ｃ３及びＣ４における表面のヒドロキシ基又はアミノ基と同内部のチオールエステルとの間のエステル交換反応により、補体活性化表面に共有結合する。古典的経路の複数の産物は、宿主防御に寄与する強力な生物学的活性を有する、例えば、放出されたＣ４ａ断片が弱いアナフィロトキシンであるのに対し、Ｃ４ｂは補体受容体への結合による食作用を促進するオプソニンである。
Complement C4-A
General Description of C4 The complement system is a major component of innate immunity and provides the first line of defense against invading pathogens. Complement protein constitutes about 10% of serum protein, and the fourth component, C4, is present in the blood at a concentration of 350-600 μg / ml. C4 is processed intracellularly into alpha, beta, and gamma chains, which are linked by disulfide bridges. Recognition by the classical and lectin pathways of complement results in activation of the complement components C2 and C4, which are themselves serine proteases, and the protease complex C4b2a that cleaves C3 into C3a and C3b. Bring about formation. C3b and C4b are covalently bound to the complement activated surface by a transesterification reaction between the surface hydroxy or amino group at C3 and C4 and the internal thiol ester. Multiple products of the classical pathway have potent biological activities that contribute to host defense, for example, the released C4a fragment is a weak anaphylotoxin, whereas C4b binds to complement receptors Is an opsonin that promotes phagocytosis.
古典的経路の重要な下方調節因子は、アルギニル特異性を有するセリンプロテアーゼ因子Ｉである。該因子は、活性型で循環し、タンパク質分解活性を必要としない。因子Ｉは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）又は因子Ｈ（ＦＨ）などの補因子タンパク質に結合する場合に限り、補体因子３（Ｃ３ｂ）及び４（Ｃ４ｂ）の活性型を分解する。因子Ｉによる分解の間、Ｃ３ｂ及びＣ４ｂのα鎖における複数のペプチド結合が開裂する（３７）。 An important down-regulator of the classical pathway is serine protease factor I with arginyl specificity. The factor circulates in an active form and does not require proteolytic activity. Factor I degrades the active forms of complement factors 3 (C3b) and 4 (C4b) only when it binds to a cofactor protein such as C4b binding protein (C4BP) or factor H (FH). During degradation by factor I, multiple peptide bonds in the C3b and C4b α-chains are cleaved (37).
同定されたＣ４ペプチド
Ｃ４前駆体に由来する２つのペプチドを同定した。いずれのペプチドも、補体Ｃ４−Ａアルファ鎖（Ｃ４ｂａ、アミノ酸６８０〜１４４６）に由来する。アミノ酸１３３７〜１３５２に由来するＣ４−Ａアルファペプチドは、著明には調節されなかった。そのペプチドは、アミノ酸Ｒ／Ｎにおける因子Ｉ開裂により放出されうる。Ｎ末端開裂産物が、Ｃ４ｄ（アミノ酸９５７ １３３６）である。Ｃ４分子の活性化及び分解に続き、Ｃ４活性化部位の近傍における内皮細胞表面及び血管基底膜細胞外マトリックス成分に対する、分解産物Ｃ４ｄの一過性共有結合を可能にするチオエステル基が露出される。Ｃ４ｄは、体液媒介アロ反応の免疫組織化学的マーカーとみなされる。アミノ酸１４２９〜１４４９を含む第２のペプチドは、Ｃ末端側に延長され、補体アルファ鎖と同ガンマ鎖（アミノ酸１４５４〜１７４４）との間の予測プロペプチドドメインにわたる。どちらのペプチドも、予測外の翻訳後修飾を有する。
Identified C4 peptides Two peptides derived from the C4 precursor were identified. Both peptides are derived from complement C4-A alpha chain (C4ba, amino acids 680-1446). The C4-A alpha peptide derived from amino acids 1337 to 1352 was not significantly regulated. The peptide can be released by factor I cleavage at amino acids R / N. The N-terminal cleavage product is C4d (amino acids 957 1336). Following activation and degradation of the C4 molecule, a thioester group is exposed that allows transient covalent binding of the degradation product C4d to endothelial cell surface and vascular basement membrane extracellular matrix components in the vicinity of the C4 activation site. C4d is regarded as an immunohistochemical marker for fluid-mediated alloreactivity. A second peptide containing amino acids 1429 to 1449 is extended C-terminally and spans the predicted propeptide domain between the complement alpha chain and the same gamma chain (amino acids 1454 to 1744). Both peptides have unexpected post-translational modifications.
チモシンβ４ペプチド
チモシンβ４の一般的な説明
βチモシンは、高度に保存的で極めて水溶性の高い５ｋＤａのポリペプチドファミリーを構成する。チモシンβ４が最も多く存在するメンバーであり、大半の細胞型において発現し、主要な細胞内Ｇアクチン隔離ペプチドとみなされる。この４３アミノ酸のオリゴペプチドは、Ｇアクチンと１：１複合体を形成し、これによりＦアクチンへの塩誘導重合を阻害する。チモシンβ４は、白血球及び血小板中に極めて高濃度で存在するが、該ペプチドは分泌のシグナル配列を有さないので、その血漿濃度は低い。しかし、凝血が生じると、血清中のチモシンβ４レベルは著明に上昇しうる。細胞外のチモシンβ４は、血管新生、創傷治癒、及び炎症の調節を含む複数の生理学的過程に寄与しうる。このペプチドは、内皮細胞のマトリックス成分への付着及び拡大の速度を増大させ、ヒト臍静脈内皮細胞の移動を刺激し、マトリックスメタロプロテイナーゼを誘発し、角質創傷の治癒を促進し、炎症メディエータを調節する。チモシンβ４の硫酸化物は、炎症反応を阻害すると報告されている。血小板の活性化後、チモシンβ４が放出され、組織トランスグルタミナーゼによりフィブリン及びコラーゲンなどのタンパク質に架橋する。
General Description of Thymosin β4 Peptide Thymosin β4 β Thymosin constitutes a highly conserved and highly water soluble 5 kDa family of polypeptides. Thymosin beta 4 is the most abundant member of the expressed in most cell types, are considered major intracellular G-actin sequestration peptide. This 43 amino acid oligopeptide forms a 1: 1 complex with G-actin, thereby inhibiting salt-induced polymerization to F-actin. Thymosin β4 is present in very high concentrations in leukocytes and platelets, but its plasma concentration is low because the peptide has no secretory signal sequence. However, when clotting occurs, serum thymosin β4 levels can be significantly elevated. Extracellular thymosin β4 can contribute to multiple physiological processes including regulation of angiogenesis, wound healing, and inflammation. This peptide increases the rate of attachment and expansion of endothelial cells to matrix components, stimulates migration of human umbilical vein endothelial cells, induces matrix metalloproteinases, promotes horny wound healing, and regulates inflammatory mediators To do. Thymosin β4 sulfate is reported to inhibit the inflammatory response. After activation of platelets, thymosin beta 4 is released, crosslink proteins such as fibrin and collagen by tissue transglutaminase.
同定されたチモシンβ４ペプチド
本発明者らは、チモシンβ４ペプチドに対応する配列タグを同定した。しかし、該ペプチドは、さらなる解明を要する翻訳後修飾を有する。
Identified Thymosin β4 Peptides We have identified sequence tags that correspond to thymosin β4 peptides. However, the peptide has post-translational modifications that require further elucidation.
チモシンβ４の役割
本明細書に開示される方法によれば、チモシンβ４ペプチドは、ＩＧＴを有する個体であって、ライフスタイルの変更後にＮＧＴに転換しない個体において増加した。他の試験は、血漿試料中のチモシンβ４ペプチド量が、試料の血小板含量の間接的な測定値であることを見出している。チモシンｂ４ペプチドレベルの上昇は、血液採取、血液凝固における変化、又は血小板カウント及び血小板体積における変化までも示しうる。
Role of Thymosin β4 According to the methods disclosed herein, thymosin β4 peptide was increased in individuals with IGT who did not convert to NGT after lifestyle changes. Other studies have found that the amount of thymosin β4 peptide in a plasma sample is an indirect measure of the platelet content of the sample. An increase in thymosin b4 peptide levels may also indicate changes in blood collection, blood clotting, or even changes in platelet count and platelet volume.
複数の研究が、血小板カウント又は血小板体積のインスリン抵抗性、糖尿病、及び肥満との関係を示してきた。ＮＧＴ又はＩＧＴ分類との関係における血小板カウント及び血小板体積に関する追加のデータが、この仮定を裏付ける必要がある。本発明者らは、チモシンペプチドのレベルが、ベースライン時の試料と比べて追跡時の試料においてより低いことをも見出している。 Several studies have shown a relationship between platelet count or platelet volume insulin resistance, diabetes, and obesity. Additional data regarding platelet count and platelet volume in relation to the NGT or IGT classification needs to support this assumption. The inventors have also found that the level of thymosin peptide is lower in the sample at follow-up compared to the sample at baseline.
フィブリノーゲンペプチド
フィブリノーゲンの一般的な説明
フィブリノーゲンは、肝臓で合成される３４０ｋＤａのタンパク質であり、主に血漿中に見出される。該タンパク質は、ジスルフィド結合により結合される同一でない３つの鎖の２つのセットからなり、１つの中心ドメイン、及び同一な２つの外側ドメインを有する３結節構造を生じる。フィブリノーゲンからフィブリンへの転換は、軟凝血塊の形成の原因であるＮ末端重合部位を露出させるアルファ鎖及びベータ鎖からフィブリノペプチドＡ及びＢを開裂する、トロンビンにより開始される。トロンビンは、フィブリンにおけるイプシロン−（ガンマ−グルタミル）−リシン架橋の形成を介して凝血塊を安定化させる因子ＸＩＩＩａをも活性化する。したがって、フィブリノペプチドＡ及びＢ並びに因子ＸＩＩＩａの活性化ペプチドは、凝固経路のマーカーである。
General Description of Fibrinogen Peptide Fibrinogen Fibrinogen is a 340 kDa protein synthesized in the liver and is found primarily in plasma. The protein consists of two sets of three non-identical chains joined by disulfide bonds, resulting in a three-nodal structure with one central domain and two identical outer domains. The conversion of fibrinogen to fibrin is initiated by thrombin, which cleaves fibrinopeptides A and B from the alpha and beta chains that expose the N-terminal polymerization site responsible for soft clot formation. Thrombin also activates factor XIIIa, which stabilizes the clot through the formation of epsilon- (gamma-glutamyl) -lysine bridges in fibrin. Thus, fibrinopeptides A and B and factor XIIIa activation peptides are markers of the coagulation pathway.
不溶性のタンパク質マトリックスであるフィブリンの沈着は、一過性であるに過ぎない。タンパク質分解によるフィブリン除去の主に知られた機構（線溶）は、プラスミノーゲンからのプラスミンの形成をもたらすカスケード型のタンパク質分解過程を伴う。プラスミンは、循環中にプラスミノーゲンとして放出され、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、フィブリン、及び因子ＸＩＩ（Ｈａｇｅｍａｎ因子）により活性化されるセリンプロテアーゼである。線溶において、プラスミンは、様々な部位でフィブリンメッシュを切開し、他のプロテイナーゼによりさらにプロセシングされる循環断片の産生をもたらす。 The deposition of fibrin, an insoluble protein matrix, is only transient. The main known mechanism of fibrin removal by proteolysis (fibrinolysis) involves a cascade of proteolytic processes that lead to the formation of plasmin from plasminogen. Plasmin is a serine protease that is released in the circulation as plasminogen and is activated by tissue plasminogen activator, urokinase plasminogen activator, thrombin, fibrin, and factor XII (Hageman factor). In fibrinolysis, plasmin cuts through the fibrin mesh at various sites, resulting in the production of circulating fragments that are further processed by other proteinases.
同定されたペプチド
フィブリノーゲン前駆体から、２つのペプチドを同定した。１つのペプチド候補物質であるＦ４６＿１６９０．５がＦｉｂＡであり、活性化トロンビンがフィブリンを開裂するときに放出される。したがって、ＦｉｂＡは、凝固マーカーである。同定された第２のペプチドは、フィブリノーゲンアルファ鎖に由来するペプチドであって、プラスミン開裂により放出されうるペプチドであるので、線溶マーカーでありうる。
Two peptides were identified from the identified peptides fibrinogen precursor. One peptide candidate, F46 — 1690.5, is FibA and is released when activated thrombin cleaves fibrin. Thus, FibA is a clotting marker. The identified second peptide can be a fibrinolytic marker because it is a peptide derived from the fibrinogen alpha chain and can be released by plasmin cleavage.
凝固及び線溶と糖尿病、肥満、及び耐糖能異常に対する関係
本発明の方法を用いると、ＦｉｂＡペプチドのレベルは、ＩＧＴを有する個体であって、ライフスタイルの変更後にＩＧＴに転換しない個体において、ＮＧＴに転換する個体と比べて低下する。本発明者らは、線溶の潜在的なペプチドマーカーが、ＮＧＴを有する個体と比べて、ＩＧＴを有する個体において低下することをも見出した。これらの結果は、インスリン抵抗性、肥満、及びメタボリックシンドロームの症状として十分に確立された凝固線溶系の障害と一致する。止血異常においては、線溶の強力な阻害剤であるプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）−１の血漿中における増加が、メタボリックシンドロームの主要症状であると考えられる。ＰＡＩ−１の高血漿濃度は、血栓形成と関連し、心血管事象を生じることがある。
Relationship between coagulation and fibrinolysis and diabetes, obesity, and impaired glucose tolerance Using the methods of the present invention, the level of FibA peptide is NGT in individuals with IGT who do not convert to IGT after lifestyle changes. Reduced compared to individuals that convert to. The inventors have also found that the potential peptide marker for fibrinolysis is reduced in individuals with IGT compared to individuals with NGT. These results are consistent with the well-established coagulation-fibrinolysis disorder as a symptom of insulin resistance, obesity, and metabolic syndrome. In hemostasis abnormalities, an increase in plasma of plasminogen activator inhibitor (PAI) -1, which is a potent inhibitor of fibrinolysis, is considered to be a major symptom of metabolic syndrome. High plasma concentrations of PAI-1 are associated with thrombus formation and can cause cardiovascular events.
さらに、ＰＡＩ−１レベルの低下が示す通り、食事及び身体運動による強化介入は、線溶に対して長期の有益な効果を及ぼす。これらの結果は、耐糖能異常を有する肥満被験者におけるＰＡＩ−１レベルの上昇は、ライフスタイルの変更、特に、体重減量に向けられた変更により、大半は可逆的であることを示唆する。 In addition, dietary and physical exercise-intensive interventions have long-term beneficial effects on fibrinolysis, as shown by reduced PAI-1 levels. These results suggest that elevated PAI-1 levels in obese subjects with impaired glucose tolerance are largely reversible due to lifestyle changes, particularly changes directed at weight loss.
コラーゲンペプチド
他の多くの細胞もそれを合成することができるが、哺乳類体内における大部分のＩ型コラーゲンは、線維芽細胞及び骨芽細胞により産生される。
Collagen peptides Many other cells can also synthesize it, but most type I collagen in the mammalian body is produced by fibroblasts and osteoblasts.
骨は、頻繁なリモデリングを受け、大きな再生能を有する組織である。成体では、約１０〜１１年ごとに骨格が置き換わるようにリモデリングが生じる。この生理的リモデリングは、骨を吸収する破骨細胞により開始され、骨芽細胞による新規の等量の骨の形成がこれに続く。骨吸収量が新規の骨形成量を上回るときに、骨喪失という。これは、老齢の骨格において、特に閉経に関連する骨粗鬆症の間に生じる。 Bone is a tissue that has undergone frequent remodeling and has a large regenerative capacity. In adults, remodeling occurs so that the skeleton is replaced about every 10 to 11 years. This physiological remodeling is initiated by osteoclasts that resorb bone, followed by the formation of new equal amounts of bone by osteoblasts. When the amount of bone resorption exceeds the amount of new bone formation, it is called bone loss. This occurs in the aging skeleton, especially during osteoporosis associated with menopause.
Ｉ型糖尿病は、実質的な骨喪失とも関連してきた。これに対して、２型糖尿病における骨喪失の存在はそれほど明らかでなく、現在の理解は、この形態の糖尿病の方が、より頻繁に骨ミネラル密度の上昇と関連することを示唆する。
Type I diabetes has also been associated with substantial bone loss. In contrast, the existence of bone loss in
骨吸収が、血漿Ｉ型コラーゲン架橋Ｃテロペプチド（ＣＴＸ）の測定により判定される一方、骨形成は、Ｉ型プロコラーゲン血漿アミノ末端プロペプチド（ＰＩＮＰ）レベル及びオステオカルシンレベルの測定により判定される。骨吸収は夜間に最高となり、ＣＴＸ値は早朝に最高となる。最高値及び最低値は、２４時間の平均値と２４％異なる。骨吸収は、摂食により抑制され、インクレチンホルモンＧＬＰ−２が関与すると思われる（４７、４８）。 Bone resorption is determined by measuring plasma type I collagen cross-linked C telopeptide (CTX), while bone formation is determined by measuring type I procollagen plasma amino terminal propeptide (PINP) levels and osteocalcin levels. Bone resorption is highest at night and CTX values are highest in the early morning. The highest and lowest values are 24% different from the 24-hour average. Bone resorption is suppressed by feeding and appears to involve the incretin hormone GLP-2 (47, 48).
同定されたコラーゲンペプチド
同定されたコラーゲンペプチドは、コラーゲンアルファ−１（Ｉ）鎖の三重らせん領域にマップされ、多重分解事象の産物である。本発明者らは、このペプチドが、ＮＧＴを有する個体と比べてＩＧＴを有する個体において減少し、骨吸収の低下を反映しうることを見出した。
Identified Collagen Peptides Identified collagen peptides map to the triple helix region of the collagen alpha-1 (I) chain and are the product of multiple degradation events. The inventors have found that this peptide is reduced in individuals with IGT compared to individuals with NGT and may reflect a decrease in bone resorption.
本発明のさらなる特性及び利点については、制限を含意するのでなく例示のみを目的に提示される、以下の実施例との関連でより明確に理解されたい。 Additional features and advantages of the present invention will be more clearly understood in the context of the following examples, which are presented for purposes of illustration only and are not meant to be limiting.
（実施例１）
試験デザインと被験者
９６例のヒト個体が、試験に参加した（男性３９例、女性６１例）。すべての個体は、２型糖尿病の既罹患者の親近者であるか、又は肥満指数＞２７／ｍ２を有する肥満者若しくは過体重者、耐糖能異常を有する個体、及び妊娠性糖尿病の履歴を有する女性であるなどの理由による２型糖尿病の危険性が高い者であった。アルコール乱用が臨床的に疑われる者は、本試験から除外した。すべての個体は、一晩の絶食後、午前中に、当技術分野で知られる経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）に従って、７５ｇグルコース溶液の経口摂取前に１つ目、また同摂取の２時間後に２つ目の２つの血液試料の採取を受けた。両血液試料の血糖値は、当技術分野で知られる標準的な臨床的方法により測定し、ＯＧＴＴ開始の２時間後に個体が正常血糖値（＜６．７ｍＭ）を有するか、個体を耐糖能異常（ＩＧＴ）に罹患すると分類する血糖値の上昇（≧６．６ｍＭ〜≦１０ｍＭ）を有するか、又は個体を２型糖尿病に罹患すると分類する血糖値（＞１０ｍＭ）を有するかを判定した。グルコースに関するすべての閾値は、１９９７年の世界保健機構（ＷＨＯ）による診断基準（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ、１９９７年、第２０巻、１１８３〜１１９７頁）に従った。
(Example 1)
Study design and subjects 96 human individuals participated in the study (39 men, 61 women). All individuals are close relatives of pre-affected individuals with
この初回来院の後、すべての個体が、標準化された身体運動及び食事による介入プログラムを開始した。身体運動プログラムは、すべての試験参加者が、各自の身体能力に応じて、週に３回各回１時間ずつ運動することを要請した。身体運動は、例えば、徒歩、ジョギング、トレッドミル上でのランニングなどであった。参加者の食事は、脂肪摂取を減らし、線維摂取を増やすことを意図し、その結果、全個体の約５０％が、食物摂取１０００ｋｃａｌあたり線維約１５ｇの線維を摂取した。この介入プログラムの１２カ月後、一晩の絶食後、午前中に、すべての個体が、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）に従って、７５ｇグルコースの摂取前に１つ目、また同摂取の２時間後に２つ目の２つの血液試料の２回目の採取に来院した。試験を完了した各個体から採取した計４つの血液試料から、実施例２に従って血漿を調製した。血漿グルコースは、ベッドサイドグルコースアナライザー（米国、コロラド州、イエロースプリング、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ［ＹＳＩ］社製、グルコースオキシダーゼ法）を用いて決定した。 After this first visit, all individuals began a standardized physical exercise and dietary intervention program. The physical exercise program required that all study participants exercise for one hour, three times a week, depending on their physical abilities. The physical exercise was, for example, walking, jogging, running on a treadmill, or the like. Participant's diet was intended to reduce fat intake and increase fiber intake so that about 50% of all individuals ingested about 15 g of fiber per 1000 kcal of food intake. Twelve months after this intervention program, after an overnight fast, in the morning, all individuals were subject to a first before 75 g glucose intake and 2 hours after the same intake, according to the oral glucose tolerance test (OGTT). Visited the second collection of two blood samples. Plasma was prepared according to Example 2 from a total of four blood samples taken from each individual who completed the study. Plasma glucose was determined using a bedside glucose analyzer (Yellow Springs, Colorado, USA, Yellow Springs Instruments [YSI], glucose oxidase method).
（実施例２）
血清及び血漿の調製
健康ヒト成人及び耐糖能異常（ＩＧＴ）に罹患することが疑われる又は知られているヒトが、書面によるインフォームドコンセントを提出し、ハノーバー医学院の施設内倫理委員会がプロトコールを承認した後で、本試験に組み入れられた。血液試料は、一晩絶食後の個体から採取し、次いで個体が所定のグルコース溶液を摂取し、グルコース摂取の１２０分後に２つ目の血液試料を採取した。１年後に、同じ個体が同じ手順に従ったので、試験を完了した各個体から、計４つの血液試料を採取した。この１年間に、すべての個体が、その健康状態を変更するために、標準化された身体運動及び食事の介入プログラムを実行した。経口ブドウ糖負荷試験及び試験デザインの詳細は、実施例１に述べてある。血液試料は、肘脈から血液採取試験管（ドイツ、ニュンブレヒト、ザールシュテット、ＥＤＴＡカリウムを含む、又は０．１０６ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を含む９ｍＬのＳ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ）に採取した。採取直後、２０００×ｇ、室温で１０分間の遠心分離により、血漿を得た。低温は、血小板を活性化して、何よりもタンパク質及びペプチドを血漿内に放出させ、これが血漿試料中に存在するペプチド又はタンパク質分析のための試料品質に好ましくない影響を与えるので、４℃のような低温での遠心分離は避けるべきである。２ｍｌ容の血漿試料は、細孔径０．２μｍで濾過面積５ｃｍ２の酢酸セルロース製濾過ユニットを装着した２ｍｌ試験管（ドイツ、ニュンブレヒト、ザールシュテット、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標））に移した。血漿試料は、さらなる解析まで、−８０℃の冷凍庫に移した。
(Example 2)
Serum and plasma preparation Healthy human adults and humans suspected or known to suffer from impaired glucose tolerance (IGT) submit written informed consent, and the institutional ethics committee of the Hannover Medical School Was approved for inclusion in the study. A blood sample was taken from an individual after an overnight fast, then the individual took a predetermined glucose solution and a second blood sample was taken 120 minutes after the glucose ingestion. One year later, the same individual followed the same procedure, so a total of four blood samples were taken from each individual who completed the study. During the past year, all individuals have run a standardized physical exercise and dietary intervention program to change their health status. Details of the oral glucose tolerance test and test design are described in Example 1. Blood samples were collected from the elbow vein into blood collection tubes (9 mL S-Monovette containing Germany, Numbrecht, Saarstett, potassium EDTA, or 0.106 mol / L citrate solution). Immediately after collection, plasma was obtained by centrifugation at 2000 × g for 10 minutes at room temperature. The low temperature activates platelets and, above all, releases proteins and peptides into the plasma, which adversely affects the sample quality for peptide or protein analysis present in plasma samples, such as 4 ° C Centrifugation at low temperatures should be avoided. A 2 ml plasma sample was placed in a 2 ml test tube (Nubrecht, Saarstett, Sartorius, Minisart (registered trademark)) equipped with a cellulose acetate filtration unit having a pore size of 0.2 μm and a filtration area of 5 cm 2. Moved. Plasma samples were transferred to a −80 ° C. freezer until further analysis.
（実施例３）
試料の液体クロマトグラフィー
実行した分離法は、逆相クロマトグラフィーであった。各種のＲＰクロマトグラフィー用樹脂及び溶離剤が、同様に適切である。ペプチド及びタンパク質の分離は、供給源５ＲＰＣ、４．６×１５０ｍｍの逆相クロマトグラフィーカラム（ドイツ、フライブルク、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ製）を用いて行った。分離は、以下に述べる通りに行った。以下の成分からなる移動相を用いた。移動相Ａ：０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、移動相Ｂ：０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル。クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のマイクロフローセルを伴うＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＨＰ １１００を用い、３３℃で行った。
(Example 3)
Liquid Chromatography of Samples The separation method performed was reverse phase chromatography. Various RP chromatography resins and eluents are equally suitable. Peptide and protein separations were performed using a source 5RPC, 4.6 × 150 mm reverse phase chromatography column (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany). Separation was performed as described below. A mobile phase consisting of the following components was used. Mobile phase A: 0.06% (v / v) trifluoroacetic acid, mobile phase B: 0.05% (v / v) trifluoroacetic acid, 80% (v / v) acetonitrile. Chromatography was performed at 33 ° C. using Agilent Technologies HP 1100 with a microflow cell manufactured by Agilent Technologies.
試料は、ｐＨを２〜３に調整した０．０６％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により希釈し、該試料を１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、こうして調製された最終的に７５０μｌの血漿同等物を、クロマトグラフィーカラムに投入した。クロマトグラフィーの条件は、以下の通りであった。時点０分において５％の移動相Ｂ、時点１〜４５分において移動相Ｂ濃度を５０％まで継続的に上昇させ、時点４５〜４９分において移動相Ｂ濃度を１００％まで継続的に上昇させ、その後時点５３分まで緩衝液Ｂを１００％で一定に保つ。０．５ｍｌずつ９６分画の採取は、クロマトグラフィー開始の７分後から開始する。
Samples were diluted with 0.06% (v / v) trifluoroacetic acid adjusted to pH 2-3, the samples were centrifuged at 18000 × g for 10 minutes, and finally 750 μl of plasma thus prepared The equivalent was loaded onto a chromatography column. Chromatographic conditions were as follows. 5% mobile phase B at
（実施例４）
試料の質量分析
質量分析法による解析のため、ペプチドの典型的な陽イオンスペクトルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（マトリックス支援レーザー脱イオン化法）により産生した。適切なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ社製（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＰＲＯ、又はＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ）、又はＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ Ｂｒｅｍｅｎ社製（ＢＩＦＬＥＸ）である。試料は、有機酸からなることが通例であるマトリックス物質と試料とを混合することにより調製する。ペプチドに適する通例のマトリックス物質は、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸、αα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸である。逆相クロマトグラフィーにより得られ、１５μｌ血漿又は血清に対応する凍結乾燥した同等物を用いて、ペプチド及び／又はタンパク質及び／又は標準物質を測定する。クロマトグラフィーにかけた試料を１５μｌのマトリックス溶液中に溶解する。このマトリックス溶液は、例えば、容積比で４９：４９：１：１のアセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸、及びアセトンからなる溶媒混合液中に溶解した、１０ｇ／ｌのαα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸及び１０ｇ／ｌのＬ（−）フコースを含む。この溶液０．３μｌをＭＡＬＤＩキャリアプレートに移し、乾燥試料を、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ質量分析計により解析する。測定は、遅延抽出法による直線モードで行う。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて、例えば、質量分析計の測定ダイナミックレンジ内の濃度でこれらのペプチドが存在し、このために検出器飽和を回避する場合は、本発明の標準的なペプチドなどのペプチドを定量することができる。各ペプチドの測定するシグナルと濃度との間には特定の存在比が存在し、これは、ＭＡＬＤＩ質量分析法を、好ましくは、ペプチドの相対的な定量に用いうることを意味する。標準物質及び試料に由来するペプチドのシグナル強度を測定することができる。
(Example 4)
Sample Mass Spectrometry For analysis by mass spectrometry, a typical cation spectrum of the peptide was generated by a MALDI-TOF mass spectrometer (matrix-assisted laser deionization method). Suitable MALDI-TOF mass spectrometers are from PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager-DE, Voyager-DE PRO, or Voyager-DE STR), or from Bruker Daltonik Bremen (BIFLEX). The sample is prepared by mixing the sample with a matrix material, which is typically made of an organic acid. Suitable matrix materials suitable for peptides are 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, αα-cyano-4-hydroxycinnamic acid, and 2,5-dihydroxybenzoic acid. Peptides and / or proteins and / or standards are measured using lyophilized equivalents obtained by reverse phase chromatography and corresponding to 15 μl plasma or serum. The chromatographed sample is dissolved in 15 μl of matrix solution. This matrix solution is, for example, 10 g / l αα-cyano-4-hydroxy cinnamon dissolved in a solvent mixture consisting of acetonitrile, water, trifluoroacetic acid, and acetone in a volume ratio of 49: 49: 1: 1. Contains acid and 10 g / l L (-) fucose. 0.3 μl of this solution is transferred to a MALDI carrier plate, and the dried sample is analyzed with a Voyager-DE STR MALDI mass spectrometer manufactured by PerSeptive Biosystems. The measurement is performed in the linear mode by the delay extraction method. If these peptides are present at a concentration within the measurement dynamic range of the mass spectrometer, for example using a MALDI-TOF mass spectrometer, thus avoiding detector saturation, the standard peptides of the invention, etc. Can be quantified. There is a specific abundance between the signal and concentration measured for each peptide, which means that MALDI mass spectrometry can be used, preferably for relative quantification of peptides. The signal intensity of peptides derived from standards and samples can be measured.
（実施例５）
ペプチドの同定
ペプチドからなる標準物質は、例えば、ｎａｎｏＳｐｒａｙ−ＭＳ／ＭＳを用いて同定することができる。これは、当業者に知られた方式で、特定のｍ／ｚ（質量／電荷）値に基づき、質量分析計内において選択される標準的なペプチドイオンを必要とする。次いで、この選択されたイオンを、衝突ガス、例えば、ヘリウム又は窒素による衝突エネルギーを供給することにより断片化し、結果として得られる標準ペプチドの断片を、質量分析計の統合解析ユニットにより検出し、対応するｍ／ｚ値を決定する（タンデム質量分析法の原理）。ペプチドの断片化挙動は、ペプチドの明確な同定を可能にする。この特殊事例では、米国、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｓｃｉｅｘ社製の四重極ＴＯＦ機である、ＱＳｔａｒ−Ｐｕｌｓａｒモデルを用いて、質量分析法による解析を行った。
(Example 5)
Identification of Peptide A standard substance consisting of a peptide can be identified using, for example, nanoSpray-MS / MS. This requires standard peptide ions that are selected in the mass spectrometer based on specific m / z (mass / charge) values in a manner known to those skilled in the art. This selected ion is then fragmented by supplying collision energy with a collision gas, eg, helium or nitrogen, and the resulting fragment of the standard peptide is detected by the integrated analysis unit of the mass spectrometer and corresponding The m / z value to be determined is determined (the principle of tandem mass spectrometry). The fragmentation behavior of the peptide allows unambiguous identification of the peptide. In this special case, analysis by mass spectrometry was performed using a QStar-Pulsar model, which is a quadrupole TOF machine manufactured by Applied Biosystems-Sciex, USA.
（実施例６）
データ解析
実施例３に述べた分画化に続き、実施例４に述べたＭＡＬＤＩ質量分析法により各分画を個別に解析する結果、各試料につき９６の質量スペクトルが得られる。これらの９６の質量スペクトルを、いわゆるペプチドディスプレイに電気的に統合する。これらのペプチドディスプレイのｘ軸が分子量を示し、ｙ軸が分画番号を示し、色強度が質量分析法によるシグナル強度を表す。
(Example 6)
Data analysis Following fractionation as described in Example 3, each fraction was analyzed individually by MALDI mass spectrometry as described in Example 4, resulting in 96 mass spectra for each sample. These 96 mass spectra are electrically integrated into a so-called peptide display. The x-axis of these peptide displays indicates the molecular weight, the y-axis indicates the fraction number, and the color intensity indicates the signal intensity by mass spectrometry.
解析グループ間の識別が可能な属性の同定（図１及び２を参照のこと）には、多重仮説検定手順を適用した。多重仮説検定は、ランクに基づく統計解析法であるＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定手順を用いて実行した。ランクに基づく方法の利点は、比較するシグナル強度について正規性を仮定しないことである。集めたクラスが、異なる個体特性を有する異なる個体からなるため、この方法が必要であり、正規性は予測されない。データの許容基準は、Ｕ検定のｐ値≦０．０１であった。 Multiple hypothesis testing procedures were applied to identify attributes that could be distinguished between analysis groups (see FIGS. 1 and 2). Multiple hypothesis testing was performed using the Mann-Whitney U test procedure, which is a rank-based statistical analysis method. The advantage of the rank-based method is that it does not assume normality for the signal intensity to be compared. This method is necessary because the collected class consists of different individuals with different individual characteristics, and normality is not predicted. Acceptance criteria for the data were U-test p-value ≦ 0.01.
１９１試料から産生したペプチドディスプレイを、１つの平均マスターペプチドディスプレイに統合した。この平均マスターペプチドディスプレイに基づき、ピーク認識及びシグナル座標の定義（分画及び質量）を実行した。各ディスプレイからシグナル強度をエクスポートしてシグナル座標の行列を生成した。次いで、グループ間において、ベースピーク強度のｐ値及び百分率を計算した。Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ ３．１１ソフトウェア（企業名、国名、所在地名）を用いて、異常値検出及び主成分分析を行った。Ｍａｈａｌａｎｏｂｉｓの距離に関する臨界値を超える（＞１０）試料は、該分析から除外した。この手順の結果、ベースラインのノイズから識別された計９９６６シグナルが得られ、これを各ペプチドディスプレイの個別の特徴として後続の生物統計学的解析に用いた。 Peptide displays produced from 191 samples were combined into one average master peptide display. Based on this average master peptide display, peak recognition and signal coordinate definitions (fractionation and mass) were performed. Signal intensity was exported from each display to generate a matrix of signal coordinates. The p-value and percentage of base peak intensity were then calculated between groups. Outlier detection and principal component analysis were performed using Piroette 311 software (company name, country name, location name). Samples that exceeded the critical value for the Mahalanobis distance (> 10) were excluded from the analysis. This procedure resulted in a total of 9966 signals identified from baseline noise, which were used for subsequent biostatistical analysis as individual features of each peptide display.
ペプチドディスプレイのデータは、背景ノイズについて調整することによって予め加工することができ、異常値は解析から除外することができる。ペプチドディスプレイ間の差は、ペプチドディスプレイ同士を電子的に減じ合うことにより計算する。ペプチドの異なる濃度の検出は、異なる時間間隔にわたりインキュベートした血清試料又は血漿試料からの質量分析データ（シグナル強度）の比較、又は異なる濃度の１３ペプチド混合物でスパイクした血清試料又は血漿試料の比較により行う。血漿試料中に存在する他のペプチドに由来する何千ものシグナルから１３個の標準ペプチドを識別するため、相関解析を行った。異なる濃度の標準ペプチド混合物をスパイクした血漿試料により得られるペプチドディスプレイを、ｒ＝０．８の相関係数を用いる相関解析により比較した。標準ペプチドの濃度は試料ごとに極めて一様に変化するので（異なる濃度を異なる血清試料に加えたので）、この高相関係数ｒのみが結果として得られる。 Peptide display data can be pre-processed by adjusting for background noise and outliers can be excluded from the analysis. Differences between peptide displays are calculated by electronically subtracting peptide displays together. Detection of different concentrations of peptides is performed by comparing mass spectrometric data (signal intensity) from serum samples or plasma samples incubated over different time intervals or by comparing serum samples or plasma samples spiked with 13 peptide mixtures of different concentrations. . Correlation analysis was performed to distinguish 13 standard peptides from thousands of signals derived from other peptides present in plasma samples. Peptide displays obtained with plasma samples spiked with different concentrations of the standard peptide mixture were compared by correlation analysis using a correlation coefficient of r = 0.8. Since the concentration of the standard peptide varies very uniformly from sample to sample (because different concentrations were added to different serum samples), only this high correlation coefficient r results.
他の実施形態
本発明をその詳細な記載とともに述べてきたが、上記の記載は本発明の例示を目的とし、付属の特許請求の範囲が定義する本発明の適用範囲の制限を目的とするものではない。他の態様、利点、及び変更も、以下の特許請求の範囲内にある。
Other Embodiments While the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing descriptions are intended to be illustrative of the invention and are intended to limit the scope of the invention as defined by the appended claims. is not. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.
Claims (39)
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における前記２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法。 A method for detecting the presence or absence of a type 2 diabetes preform in an individual comprising:
a) F067.4181.5 (SEQ ID NO: 3), F067.2440.5 (SEQ ID NO: 4), F024.1161.5 (SEQ ID NO: 5), F034.2088.5, F029. 1736.5 (SEQ ID NO: 6), F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.3561.5, F073.11122.5, F075.44399.5 (SEQ ID NO: 14), F075 .3561.5, F033.1210.5, F075.4342.5 (SEQ ID NO: 15), F075.33474.5, F075.33345.5, F068.3841.5, F075.33988.5, F034.2638. Measuring the amount of at least one peptide selected from the group consisting of 5 (SEQ ID NO: 16) or a modified form thereof ,
b) comparing the results of a) with the results determined using a control sample or using known reference values;
c) determining the presence or absence of the type 2 diabetes preform in the individual.
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体に対する前記治療法の有用性を判定するステップと
を含む方法。 A method for stratification of an individual that is a preform for type 2 diabetes to determine the usefulness of a therapy comprising a diet and / or exercise regimen comprising:
a) F036.4591.5 (SEQ ID NO: 1), F046.44874.5 (SEQ ID NO: 2), F076.44758.5, F046.44745.5, F035.2615.5, F041 in samples derived from individuals .1906.5, F046.44901.5, F046.44874.5, F046.1690.5 (SEQ ID NO: 17), F050.2199.5, F031.1820 (SEQ ID NO: 18) at least Measuring the amount of one peptide, or a modified form thereof,
b) comparing the results of a) with the results determined using a control sample or using known reference values;
c) determining the usefulness of the treatment for the individual.
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法。 A method of predicting the prognosis of an individual suffering from a type 2 diabetes preform, comprising:
a) F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.33561.5, F073.1122.5, F066.2843.5, F066.2804, F064. in samples derived from individuals. 2789.5 (SEQ ID NO: 8), F064.3020 (SEQ ID NO: 9), F06.1394.5 (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11), F018.2069.5 (SEQ ID NO: 12), F034.1870.5, F039.2158.5, F046.44901.5 (SEQ ID NO: 13), F068.5171.5, F066.2851.5, F066.4390.5, F025.22966.5, F068.790.5, F076.4758 .5, F024.1463.5 (SEQ ID NO: 19), F021.2378.5 (SEQ ID NO: 20), F0 4.1753.5 (SEQ ID NO: 21), at least one peptide selected from the group consisting of F068.7665 (SEQ ID NO: 22), or determining the amount of a modified form thereof,
b) comparing the results of a) with the results determined using a control sample or using known reference values;
c) determining the presence or absence of a type 2 diabetes preform in said individual.
ａ）Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）；
からなる群から選択されるペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、前記ペプチドが由来するタンパク質には結合しない抗体若しくは抗体断片、及び
ｃ）２型糖尿病のプリフォームの存在若しくは不在を判定する前記試験キットを用いるための説明書
を含む試験キット。 A test kit for determining the presence or absence of a type 2 diabetes preform in an individual comprising:
a) F067.44181.5 (SEQ ID NO: 3), F066.72440.5 (SEQ ID NO: 4), F024.1161.5 (SEQ ID NO: 5), F034.020085, F029.1736.5 (SEQ ID NO: 6) ), F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.3561.5, F073.1122.5, F075.4399.5 (SEQ ID NO: 14), F075.3561.5, F033. 1210.5, F075.4342.5 (SEQ ID NO: 15), F075.33474.5, F075.33345.5, F068.3841.5, F075.39988.5, F034.2638.5 (SEQ ID NO: 16), F036.4591.5 (SEQ ID NO: 1), F046.44874.5 (SEQ ID NO: 2), F076.44758.5, F046.4 45.5, F035.2615.5, F041.1906.5, F046.44901.5, F046.44874.5, F046.1690.5 (SEQ ID NO: 17), F050.2199.5, F031.1820 (sequence) No. 18), F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.33561.5, F073.1122.5, F06.2843.5, F066.2804, F064.2784 (sequence) No. 8), F064.3020 (SEQ ID NO: 9), F06.1394.5 (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11), F018.2069.5 (SEQ ID NO: 12), F034.1870.5, F039.2158.5 F046.44901.5 (SEQ ID NO: 13), F068.5171.5, F066.2851.5, F 66.4390.5, F025.22966.5, F068.7960.5, F076.44758.5, F024.11463.5 (SEQ ID NO: 19), F021.2378.5 (SEQ ID NO: 20), F024.1753. 5 (SEQ ID NO: 21), F0688.7665 (SEQ ID NO: 22);
A peptide selected from the group consisting of: and / or b) an antibody or antibody fragment that specifically binds to the neoepitope of the peptide and does not bind to the protein from which the peptide is derived, and c) a preform for type 2 diabetes A test kit comprising instructions for using the test kit to determine the presence or absence of.
ａ）１つ又は複数の前記ペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合する抗体若しくは抗体断片
を含むペプチドの使用。 Use of a peptide in the manufacture of a test kit according to claim 22,
Use of a peptide comprising an antibody or antibody fragment that specifically binds to a) one or more of said peptides, and / or b) a neoepitope of said peptide.
ａ）Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）；
からなる群から選択されるペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、前記ペプチドが由来するタンパク質には結合しない抗体若しくは抗体断片及び、
ｃ）個体が２型糖尿病のプリフォームに罹患する可能性を判定する前記試験キットを用いるための説明書
を含む試験キット。 A test kit for determining a prognosis in which an individual suffers from a type 2 diabetes preform,
a) F067.44181.5 (SEQ ID NO: 3), F066.72440.5 (SEQ ID NO: 4), F024.1161.5 (SEQ ID NO: 5), F034.020085, F029.1736.5 (SEQ ID NO: 6) ), F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.3561.5, F073.1122.5, F075.4399.5 (SEQ ID NO: 14), F075.3561.5, F033. 1210.5, F075.4342.5 (SEQ ID NO: 15), F075.33474.5, F075.33345.5, F068.3841.5, F075.39988.5, F034.2638.5 (SEQ ID NO: 16), F036.4591.5 (SEQ ID NO: 1), F046.44874.5 (SEQ ID NO: 2), F076.44758.5, F046.4 45.5, F035.2615.5, F041.1906.5, F046.44901.5, F046.44874.5, F046.1690.5 (SEQ ID NO: 17), F050.2199.5, F031.1820 (sequence) No. 18), F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.33561.5, F073.1122.5, F06.2843.5, F066.2804, F064.2784 (sequence) No. 8), F064.3020 (SEQ ID NO: 9), F06.1394.5 (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11), F018.2069.5 (SEQ ID NO: 12), F034.1870.5, F039.2158.5 F046.44901.5 (SEQ ID NO: 13), F068.5171.5, F066.2851.5, F 66.4390.5, F025.22966.5, F068.7960.5, F076.44758.5, F024.11463.5 (SEQ ID NO: 19), F021.2378.5 (SEQ ID NO: 20), F024.1753. 5 (SEQ ID NO: 21), F0688.7665 (SEQ ID NO: 22);
A peptide selected from the group consisting of: and / or b) an antibody or antibody fragment that specifically binds to the neoepitope of the peptide and does not bind to the protein from which the peptide is derived, and
c) A test kit comprising instructions for using said test kit to determine the likelihood that an individual will suffer from a type 2 diabetes preform.
ａ）１つ又は複数の前記ペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合する抗体若しくは抗体断片
を含むペプチドの使用。 Use of a peptide in the manufacture of a test kit according to claim 24,
Use of a peptide comprising an antibody or antibody fragment that specifically binds to a) one or more of said peptides, and / or b) a neoepitope of said peptide.
ａ）Ｆ０６７．４１８１．５（配列番号３）、Ｆ０６７．２４４０．５（配列番号４）、Ｆ０２４．１１６１．５（配列番号５）、Ｆ０３４．２００８．５、Ｆ０２９．１７３６．５（配列番号６）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０７５．４３９９．５（配列番号１４）、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０３３．１２１０．５、Ｆ０７５．４３４２．５（配列番号１５）、Ｆ０７５．３４７４．５、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０６８．３８４１．５、Ｆ０７５．３９８８．５、Ｆ０３４．２６３８．５（配列番号１６）、Ｆ０３６．２５９１．５（配列番号１）、Ｆ０４６．４８７４．５（配列番号２）、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０４６．４７４５．５、Ｆ０３５．２６１５．５、Ｆ０４１．１９０６．５、Ｆ０４６．４９０１．５、Ｆ０４６．４８７４．５、Ｆ０４６．１６９０．５（配列番号１７）、Ｆ０５０．２１９９．５、Ｆ０３１．１８２０（配列番号１８）、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）；
からなる群から選択されるペプチド、及び／又は
ｂ）請求項１８に記載のペプチドのネオエピトープに特異的に結合し、前記ペプチドが由来するタンパク質には結合しない抗体若しくは抗体断片及び、
ｃ）２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定する前記試験キットを用いるための説明書
を含む試験キット。 A test kit for stratifying individuals suffering from a type 2 diabetes preform to determine the usefulness of a treatment program comprising a diet and / or a physical exercise regimen comprising:
a) F067.44181.5 (SEQ ID NO: 3), F066.72440.5 (SEQ ID NO: 4), F024.1161.5 (SEQ ID NO: 5), F034.020085, F029.1736.5 (SEQ ID NO: 6) ), F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.3561.5, F073.1122.5, F075.4399.5 (SEQ ID NO: 14), F075.3561.5, F033. 1210.5, F075.4342.5 (SEQ ID NO: 15), F075.33474.5, F075.33345.5, F068.3841.5, F075.39988.5, F034.2638.5 (SEQ ID NO: 16), F036.4591.5 (SEQ ID NO: 1), F046.44874.5 (SEQ ID NO: 2), F076.44758.5, F046.4 45.5, F035.2615.5, F041.1906.5, F046.44901.5, F046.44874.5, F046.1690.5 (SEQ ID NO: 17), F050.2199.5, F031.1820 (sequence) No. 18), F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.33561.5, F073.1122.5, F06.2843.5, F066.2804, F064.2784 (sequence) No. 8), F064.3020 (SEQ ID NO: 9), F06.1394.5 (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11), F018.2069.5 (SEQ ID NO: 12), F034.1870.5, F039.2158.5 F046.44901.5 (SEQ ID NO: 13), F068.5171.5, F066.2851.5, F 66.4390.5, F025.22966.5, F068.790.5, F076.44758.5, F024.1463.5 (SEQ ID NO: 19), F021.2378.5 (SEQ ID NO: 20), F024.1753. 5 (SEQ ID NO: 21), F0688.7665 (SEQ ID NO: 22);
A peptide selected from the group consisting of: and / or b) an antibody or antibody fragment that specifically binds to the neoepitope of the peptide of claim 18 and does not bind to the protein from which the peptide is derived; and
c) A test kit comprising instructions for using the test kit to determine the presence or absence of a type 2 diabetes preform.
ａ）１つ又は複数の前記ペプチド、及び／又は
ｂ）前記ペプチドのネオエピトープに特異的に結合する抗体若しくは抗体断片
を含むペプチドの使用。 Use of a peptide in the manufacture of a test kit according to claim 26,
Use of a peptide comprising an antibody or antibody fragment that specifically binds to a) one or more of said peptides, and / or b) a neoepitope of said peptide.
ａ）個体由来の試料中における、Ｆ０６６．４３９０．５（配列番号７）、Ｆ０７５．３３４５．５、Ｆ０７５．３５６１．５、Ｆ０７３．１１２２．５、Ｆ０６６．２８４３．５、Ｆ０６６．２８０４、Ｆ０６４．２７８９．５（配列番号８）、Ｆ０６４．３０２０（配列番号９）、Ｆ０６６．１３９４．５（配列番号１０；配列番号１１）、Ｆ０１８．２０６９．５（配列番号１２）、Ｆ０３４．１８７０．５、Ｆ０３９．２１５８．５、Ｆ０４６．４９０１．５（配列番号１３）、Ｆ０６８．５１７１．５、Ｆ０６６．２８５１．５、Ｆ０６６．４３９０．５、Ｆ０２５．２９６６．５、Ｆ０６８．７９６０．５、Ｆ０７６．４７５８．５、Ｆ０２４．１４６３．５（配列番号１９）、Ｆ０２１．２３７８．５（配列番号２０）、Ｆ０２４．１７５３．５（配列番号２１）、Ｆ０６８．７６６５（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド、又はその修飾形態の量を測定するステップと、
ｂ）ａ）の結果を、陰性対照試料を使用して、又は既知の基準値を用いて決定した結果と比較するステップと、
ｃ）前記個体における２型糖尿病のプリフォームの存在又は不在を判定するステップと
を含む方法。 A method for determining the likelihood that an individual will suffer from a metabolic disorder comprising:
a) F066.44390.5 (SEQ ID NO: 7), F075.33345.5, F075.33561.5, F073.1122.5, F066.2843.5, F066.2804, F064. in samples derived from individuals. 2789.5 (SEQ ID NO: 8), F064.3020 (SEQ ID NO: 9), F06.1394.5 (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11), F018.2069.5 (SEQ ID NO: 12), F034.1870.5, F039.2158.5, F046.44901.5 (SEQ ID NO: 13), F068.5171.5, F066.2851.5, F066.4390.5, F025.22966.5, F068.790.5, F076.4758 .5, F024.1463.5 (SEQ ID NO: 19), F021.2378.5 (SEQ ID NO: 20), F0 4.1753.5 (SEQ ID NO: 21), at least one peptide selected from the group consisting of F068.7665 (SEQ ID NO: 22), or determining the amount of a modified form thereof,
b) comparing the result of a) with the result determined using a negative control sample or using known reference values;
c) determining the presence or absence of a type 2 diabetes preform in said individual.
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