JP2009537137A - 脂肪吸引後の脂肪吸引物からの造血幹細胞の単離および精製 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明を例示するために、本発明の特定の実施形態を図面に記載する。しかしながら、本発明は、図面に記載された実施形態の正確な配置および手段に限定されない(図面の簡単な説明については別節を参照)。
特に指摘しない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、一般的には、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。一般的には、本明細書で用いられる命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、当業界でよく知られ、一般的に用いられるものである。
本発明においては、CD34+細胞、ALDHbr細胞およびABCG2発現細胞が、脂肪組織から多量に得られることが証明される。得られる細胞は、HSCに特徴的な様々なサブ集団を含むことがさらに示される。該サブ集団の非限定例としては、ALDHbrSSClo細胞、CD34+SSClo細胞、CD34+ALDHbr細胞、CD34+CD38-CD41-細胞、CD34+CD38-CD41-ALDHbr細胞、CD34+CD38-CD41-SSClo細胞、CD34+CD45-細胞、CD34+CD45+細胞、およびCD34+ALDHbrSSClo細胞が挙げられる。得られるCD34+細胞は、様々な多能性造血前駆細胞および系列が決まっている造血前駆細胞を含むことがさらに示される。かくして、本発明は、脂肪組織から、HSCを含む、CD34+細胞、ALDHbr細胞またはABCG2発現細胞の集団を高収率で単離する方法を提供する。本発明はさらに、一次培養物としてHSCの高度に富化された集団を得るために本発明の方法により単離された、HSCを含む、CD34+細胞、ALDHbr細胞またはABCG2発現細胞の組成物を提供する。本発明はさらに、HSCを必要とする被験体を治療する方法を提供する。従って、有利には、本発明の方法および組成物は、治療的処置における使用の前に、HSCを含む、単離されたCD34+細胞、ALDHbr細胞またはABCG2発現細胞の増殖の必要性を低下させるか、または排除する。
本発明において有用な脂肪組織を、当業者には公知の任意の方法を用いて任意の哺乳動物から取得することができる。本発明の方法において脂肪組織の起源として有用な哺乳動物としては、限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウマ、ネコ、非ヒト霊長類およびヒトが挙げられる。好ましくは、脂肪組織を、霊長類、およびより好ましくは、ヒトから単離する。好ましくは、脂肪組織は、皮下の白色脂肪組織である。脂肪組織の好ましい起源は、大網脂肪である。ヒトにおいては、典型的には、脂肪を脂肪吸引術により単離する。本発明の細胞をヒト被験者に移植しようとする場合、脂肪組織を、自己移植片を提供するように、同じ被験者から単離するか、または同系移植片を提供するように遺伝的に同一の兄弟姉妹(例えば、一卵性双生児)から単離するのが好ましい。しかしながら、あるいは、投与されるHSCは同種異系であってよい。
本発明の方法により得られた脂肪由来HSCを、HSCを使用するための当業界で公知の任意の方法において用いることができる。さらに、HSCを、さらに探索しようとする方法および組成物において用いることができる。HSCを使用する1つの方法は、HSCを必要とするレシピエント被験体にそれらを投与することである。
別の実施形態においては、本発明の脂肪由来HSCを遺伝的に改変して、例えば、外因性遺伝子もしくはコード配列を発現させるか、または内因性遺伝子の発現を抑制するか、もしくはさもなければ変化させる。そのような遺伝子改変は、HSCを被験体に投与する場合、治療的利益を有し得る。あるいは、遺伝子改変は、例えば、そのように遺伝子改変された、脂肪由来HSCの被験体への移植後に、そのように改変された細胞を追跡または同定するための手段を提供することができる。細胞の追跡は、移植された遺伝子改変細胞の移動、同化および生存を追跡することを含んでもよい。遺伝子改変は、少なくとも1個の第2の遺伝子を含んでもよい。第2の遺伝子は、例えば、選択可能な抗生物質耐性遺伝子または別の選択可能なマーカーをコードしてもよい。
本発明を、以下の実施例を参照することによりさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供されるものであり、別途特定しない限り、限定することを意図するものではない。かくして、本発明は、以下の実施例に限定されるといかなる意味でも解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意かつ全ての変更を包含すると解釈されるべきである。
脂肪組織を、美容的理由でヒト被験者に対して実施される脂肪吸引術の脂肪吸引物から取得した。50ミリリットル(ml)の脂肪吸引物材料を、50 mlのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)と混合し、脂肪分の下の水層を吸引することにより洗浄した。洗浄液が淡黄色になるまで、細胞懸濁液をPBSでさらに2回洗浄した。水性洗浄液をプールし、「吸引物洗浄後ペレット」(APWP)として保存した。50 mlのPBS+1%ウシ血清アルブミン(BSA)に溶解した50 mlの95 mgのコラゲナーゼを、洗浄された細胞懸濁液に添加し、混合物をT-185フラスコに移した。このフラスコを、Belly Dancer(登録商標)振とう器(Stovall Life Science, Greensboro, NC)上で1時間、37℃でインキュベートした。
実施例1で得られたヒト脂肪組織由来造血幹細胞を、骨髄再生アッセイに基づいて造血分化について試験する。免疫不全SCIDまたはヌード/ベージュマウスに、分割された用量で11 Gyのγ線の致死量を照射し、酸性化された水とオートクレーブされた食品の食餌上で維持する。造血細胞を、マウス起源の場合、約107個の細胞/移植造血細胞(107個の骨髄由来細胞)またはヒト起源の場合、約106個の細胞/移植(106個の脂肪由来HSCもしくは106個のSVF細胞)の量で単離し、尾静脈もしくは逆行眼窩静脈を介する注入、または腹腔内注入による致死量の照射の16時間後にマウスに導入する。あるいは、ヒト細胞を、約1:10の比率でマウス造血細胞と混合した後、致死量以下の放射線を照射した宿主動物中に移植して、競合的再生をアッセイする。動物を、メトキシフルラン麻酔下で輸液する。
個々のヒトドナーに由来するヒト脂肪組織を、脂肪吸引術により単離し、脂肪由来HSCを、上記の方法に従ってin vitroで単離する。10%ウシ胎仔血清、5%ニワトリ胚抽出物、幹細胞因子、flt-3リガンドおよび抗生物質を含むIscove's培地中に37℃で最初に播種した後、最大で約5日間、一次培養物として細胞を培養する。
Claims (38)
- 脂肪組織から造血幹細胞を単離する方法であって、
脂肪組織を取得すること、
該脂肪組織から間質血管系画分(SVF)を調製すること、および
SVF中の非接着細胞を単離すること、
を含み、該非接着細胞が造血幹細胞を含む、前記方法。 - 前記取得工程が、脂肪吸引術を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記脂肪組織がヒトのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、ALDHbrSSClo細胞、CD34+細胞、CD34+SSClo細胞、CD34+CD45+細胞、CD34+CD38-CD41-細胞、CD34+CD45-細胞、CD34+CD38-CD41-SSClo細胞、およびABCG2発現細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記非接着細胞からCD34hi細胞を単離する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記非接着細胞からALDHbr細胞を単離する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ALDHbr細胞が、ALDHbrSSCloである、請求項6に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、コロニー形成単位顆粒球マクロファージ(CFU-GM)、バースト形成単位赤血球(BFU-E)およびコロニー形成単位顆粒球赤血球マクロファージ巨核球(CFU-GEMM)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- CD34+細胞を単離する方法であって、
脂肪組織を取得すること、
該脂肪組織から間質血管系画分(SVF)を調製すること、
SVF中の非接着細胞を接着細胞から分離すること、および
該非接着細胞からCD34+細胞を単離することによって、CD34+細胞を単離すること、
を含む、前記方法。 - 前記SVFが少なくとも約40%のCD34+細胞を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記CD34+細胞を、約100 mlの脂肪組織あたり、少なくとも約1 x 107個の単離されたCD34+細胞の比率で単離する、請求項10に記載の方法。
- 前記取得工程が脂肪吸引術を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記脂肪組織がヒトのものである、請求項9に記載の方法。
- 前記CD34+細胞が、CD34+SSClo細胞、CD34+CD45+細胞、CD34hiCD38-CD41-細胞、CD34+CD38-CD41-SSClo細胞、CD34loCD45-細胞、CD34loCD45+細胞、CD34+ALDHbr細胞およびCD34+ALDHbrSSClo細胞からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- CD34hi細胞またはCD34lo細胞を単離する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 請求項9に記載の方法に従って単離されたCD34+細胞を含む組成物であって、該CD34+細胞が、約1 mlの脂肪組織あたり、少なくとも約1 x 105個の単離されたCD34+細胞の比率で単離されたものである、前記組成物。
- 前記脂肪組織がヒトのものである、請求項16に記載の組成物。
- 被験体に造血幹細胞を提供する方法であって、
ドナー被験体から脂肪組織を取得すること、
該脂肪組織から間質血管系画分(SVF)を調製すること、
該SVF中の非接着細胞を単離すること、
該非接着細胞から造血幹細胞を単離すること、および
治療上有効量の造血幹細胞を、それを必要とするレシピエント被験体に投与すること、を含む、前記方法。 - 前記ドナー被験体およびレシピエント被験体がヒトである、請求項18に記載の方法。
- 前記ドナー被験体およびレシピエント被験体が同じヒトである、請求項19に記載の方法。
- 前記ドナー被験体およびレシピエント被験体が同じヒトではない、請求項19に記載の方法。
- 前記造血幹細胞がCD34+細胞であり、且つ約100 mlの脂肪組織あたり、少なくとも約1 x 107個の単離されたCD34+細胞の比率で単離する、請求項18に記載の方法。
- 前記取得工程が、脂肪吸引術を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記単離工程が、ALDHbrSSClo細胞またはCD34+CD38-CD41-SSClo細胞を単離することを含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも約40%の非接着性間質血管系画分(SVF)CD34+細胞を含む単離された細胞の組成物。
- 前記単離された細胞が、少なくとも約20%のCD34+CD45-細胞を含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記間質血管系画分が、ヒト脂肪組織から取得されたものである、請求項25に記載の組成物。
- 前記CD34+細胞が、CD34+CD38-CD41-ALDHbr細胞を含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記CD34+細胞が、CD34+CD38-CD41-SSClo細胞を含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記CD34+細胞が、コロニー形成単位顆粒球マクロファージ(CFU-GM)、バースト形成単位赤血球(BFU-E)およびコロニー形成単位顆粒球赤血球マクロファージ巨核球(CFU-GEMM)を含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記細胞が遺伝子改変されたものである、請求項25に記載の組成物。
- 少なくとも約10%の非接着性間質血管系画分(SVF)ALDHbr細胞を含む単離された細胞の組成物。
- 少なくとも約15%の非接着性SVF ALDHbr細胞を含む、請求項32に記載の組成物。
- 前記ALDHbr細胞がALDHbrSSClo細胞である、請求項32に記載の組成物。
- 前記SVFがヒト脂肪組織から取得されたものである、請求項32に記載の組成物。
- 請求項16に記載の組成物および製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。
- 請求項25に記載の組成物および製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。
- 請求項32に記載の組成物および製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。
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