JP2009536028A - 遺伝子発現制御用のエピジェネティック調節複合体 - Google Patents

Abstract

部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１ドメインとアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２ドメインとを少なくとも含む、エピジェネティック調節ポリペプチド複合体であって、第２ドメインは、ヒストンＨ２Ａの尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能である。複合体は、ヒストンＨ２ＡおよびＨ４の尾部領域におけるＲ３のメチル化を制御することによって、細胞、特に哺乳類幹細胞における遺伝子発現を調節可能である。複合体の例として、Ｂｌｉｍｐ１のＤＮＡ結合活性とＰｒｍｔ５のアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性とを含むポリペプチド複合体が挙げられる。

Description

本発明は、遺伝子発現のエピジェネティックな調節の分野に関する。本発明は特に、インヴィヴォおよびインヴォトロでの遺伝子発現を制御するように標的化したヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む組成物および方法に関する。

エピジェネティックスは、遺伝子のヌクレオチド配列にコードされない情報の、単細胞又は多細胞生物からその子孫への伝達に関するものである。エピジェネティックな制御は通常、ＤＮＡ又はクロマチン構造の化学修飾を介して確立される。遺伝子発現は、例えば、ゲノムＤＮＡに関連するヒストンのメチル化およびアセチル化を介して調節されうる。ヒストンのメチル化およびアセチル化は、表面に露出し、アルギニン（Ｒ）やリシン（Ｋ）等のアミノ酸残基に富んでいるため正味の正電荷を有するドメインである、ヒストン尾部において起こりやすい。ヒストン尾部の化学修飾は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素（ＨＭＴａｓｅ）やヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性（ＨＡＴ）を有する酵素によって、調節されている。

エピジェネティックな修飾は、生物の正常な発達の様々な段階において、また正常細胞から癌性細胞へ形質転換する間に、起こりうる。この修飾により、多くの場合は特定の遺伝子が発現停止するか活性化されることとなる。癌においては、腫瘍細胞のほとんどが、異常なＤＮＡエピジェネティックなインプリンティングを示すことが文献に詳しく示されている（Feinberg AP & Vogelstein B, (1983) Nature 1(5895):89-92）。

幹細胞は、高頻度の自己再生と前駆細胞への分化とが可能な細胞である。従って幹細胞も癌の原発部位の有力候補である。幹細胞の寿命は長く、その間に悪性腫瘍となる傾向を高める遺伝的突然変異やエピジェネティック修飾を獲得しうる。幹細胞は、増殖と分化との間での競合する利益において細微なバランスを成り立たせているニッチにあるので、小さくても深刻なエピジェネティック変化が起こることで、そのバランスが失われて癌幹細胞表現型を取り易くなっているということが仮定される。エピジェネティック修飾の制御が起こる理由と機構を解明することが、癌の理解、検出および治療、特に癌幹細胞の治療にとって重要である。実際のところ、再発癌および侵襲性癌の症例において治療を困難としている一要因が、腫瘍には、従来の治療に応答しない癌幹細胞が含まれるということにあると考えられている。

体細胞核移植（ＳＣＮＴ）は、家畜生産用（クローニング用又は幹細胞治療用）、タンパク質のバイオマニュファクチャリング（biomanufacturing）用、および疾患モデル用の動物を得るのに用いられている（Wilmut I, Beaujean N, de Sousa PA, DinnyesA, King TJ, Paterson LA, Wells DN, Young LE. (2002) Nature. Oct 10;419(6907):583-6）。ＳＣＮＴを得る効率かつ成功率に関する問題の１つとして、体細胞ゲノムが、正常な再プログラム化を阻害するエピジェネティックマークを、広範かつ安定的に含んでいることが挙げられる。またレシピエントの卵細胞が、エピジェネティック効果を呈する因子を含みうるので、これも前記手順の失敗の一因となっている。従って、ＳＣＮＴの効率を改善する組成物および方法と、この手順によって促進されるバイオプロセス用途を提供することが必要とされている。

マウスにおける始原生殖細胞（ＰＧＣ）の特異化に基づいて、インヴィヴォでのエピジェネティック修飾の効果を分析する良好な実験モデルが提供されている。約４５個のＰＧＣからなる初代集団が、マウス胚においてまずＥ７．５で検出される（Ginsburg, M., Snow, M. H.およびMcLaren, A. (1990) Development 110, 521-8）。その後、これらＰＧＣは移動してＥ１０．５から生殖***に入り、そこで生殖細胞の更なるエピジェネティックなプログラム化が継続する。Ｅ１３．５には、生殖細胞はメスでは減数***前期に入り、オスの性腺では有糸***停止に入る。

ＰＧＣの特異化の直後、ＨＭＴａｓｅおよびＨＡＴそれぞれによるヒストン尾部のメチル化およびアセチル化などの顕著なエピジェネティック修飾が起きる（Surani他, 2004 (CSH Symposium); Seki他, 2004; Lachner, M., O'Sullivan, R. J.およびJenuwein, T. (2003) J Cell Sci116, 2117-24,ならびにVaquero, A., Loyola, A.およびReinberg, D. (2003) Sci Aging Knowledge Environ 2003, RE4）。ＰＧＣにおけるこれらのエピジェネティックな変化を調節する役割を担っていることが仮定される候補遺伝子としては、保存ＳＥＴ／ＰＲドメインタンパク質ファミリーに属するＨＭＴａｓｅが挙げられる。

従って、細胞内におけるエピジェネティック調節機構の制御を向上する試薬および方法を提供することが必要とされている。特に、幹細胞および癌細胞の細胞運命決定に影響を与えるように遺伝子発現を大きく制御することが可能な、組成物および方法が必要とされている。

本発明の第１の側面において、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１ドメインとアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２ドメインとを少なくとも含む単離ポリペプチド複合体であって、前記第２ドメインは、ヒストンＨ２Ａの尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能であるポリペプチド複合体が提供される。

本発明の特定の態様において、前記第２ドメインは、アルギニン残基の対称性ＮＧ，Ｎ’Ｇジメチル化を供するアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有し、好適にはヒストンＨ２Ａの尾部領域の第３位に位置するアルギニン残基（Ｈ２Ａ Ｒ３）をメチル化する。あるいは任意に、前記第２ドメインはさらに、ヒストンＨ４の尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能であり、好適にはヒストンＨ４の尾部領域の第３位に位置するアルギニン残基（Ｈ４Ｒ３）をメチル化する。本発明のある態様において、アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性は、Ｐｒｍｔ５アルギニンメチルトランスフェラーゼドメインもしくはその誘導体又は相同体が呈する。

本発明によると、前記第１ドメインは、哺乳類のゲノムＤＮＡにおける遺伝子発現の制御に必要な１以上のコンセンサス配列への結合を特異的に対象としていてもよい。通常（ただし例外もある）、そのような部位は、非コードプロモーター領域、非翻訳領域又はイントロン内に位置していてもよい。特定の態様において、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、４個のＧＧＧＡＡＡＧモチーフ（２個が標的遺伝子の５’プロモーター領域内に、２個が転写開始点の下流に位置する）のコンセンサス配列を有するＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１型結合部位に結合可能である。好適にはＤＮＡ結合ドメインは、Ｂｌｉｍｐ１タンパク質、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドのＤＮＡ結合部、その相同体又は誘導体を含む。

本発明の第２の側面において、哺乳類細胞におけるポリペプチド複合体の発現を誘導するのに好適な核酸発現ベクター構築体であって、前記ベクターは、プロモーター配列に操作可能に連結した１以上のコード配列を備え、前記１以上のコード配列は、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１のポリペプチドドメインとアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２のポリペプチドドメインとを少なくともコードし、前記第１ドメインは、哺乳類のゲノムＤＮＡにおける遺伝子発現の制御に必要な１以上のコンセンサス配列への結合を特異的に対象とし、前記第２ドメインは、ポリペプチド基質内に位置するアルギニン残基の対称性ＮＧ，Ｎ’Ｇジメチル化を呈するアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有してなるベクターが提供される。

本発明の特定の態様によると、前記ポリペプチド基質はヒストンである。任意に、前記第２のポリペプチドドメインは、ヒストンＨ２Ａの尾部領域の第３位に位置するアルギニン残基（Ｈ２Ａ Ｒ３）をメチル化することができ、またヒストンＨ４の尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化することができる。

好適な発現ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターおよび人工染色体（ＹＡＣ等）が挙げられる。任意に、前記プロモーター配列は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターのいずれかから選択することができる。好適な誘導性プロモーターの例としては、特徴が詳細に知られるＴｅｔ又はタモキシフェン調節システムが挙げられる。別のシステムとして、熱ショック感受性プロモーターが挙げられる。

本発明の一態様において、前記発現ベクターは、第１のコード配列が第１のポリペプチドドメインをコードし、第２のコード配列が第２のポリペプチドドメインをコードする発現カセットを含む。任意に、前記第１のコード配列は、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドをコードし、前記第２のコード配列は、Ｐｒｍｔ５ポリペプチドをコードする。特定の態様において、前記第１および第２のコード配列は、１以上の介在配列によって隔てられていることが有利である。好適には、細胞内での第１および第２のコード配列のバイシストロニック性の発現を促進するように、前記１以上の介在配列は、少なくとも１個の内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を含んでいてもよい。本発明の発現ベクターはまた、選択マーカー、抗生物質耐性マーカーおよびレポーターから選択されるポリペプチドをコードする核酸配列１以上を含んでいてもよい。

本発明の第３の側面において、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１ドメインと、ヒストンＨ２Ａの尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能であるアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２ドメインと、を少なくとも含むポリペプチド複合体の形成を哺乳類細胞内で誘導する工程を含む、哺乳類細胞における遺伝子発現を制御する方法が提供される。特定の態様において、前記細胞内における前記ポリペプチド複合体の形成は、前記細胞内におけるＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチド、もしくはその相同体又は誘導体の発現の誘導によって誘導される。

特定の態様において、細胞内における前記ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドの発現は、Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチド、もしくはその誘導体又は相同体をコードする発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトすることによって誘導される。あるいは任意に、細胞内におけるＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドの発現は、上記発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトすることによって誘導される。通常、前記哺乳類細胞は、組織由来の又は細胞株形状のヒト細胞である。本発明の特定の態様において、前記哺乳類細胞は、腫瘍性細胞又は癌性の細胞又は細胞株である。好適には、本発明の本側面の方法は、インヴィトロあるいはインヴィヴォで実施することができる。

本発明の特定の態様において、遺伝子発現を制御すると、ｃ−Ｍｙｃ、Ｄｈｘ３８、Ｐｃｄｈ７、Ｑ８Ｃ９Ｔ７、Ｘｙｌｔ１、ＤｎａＨ１、Ｂａｉｐ２、Ｎｅｋ７、Ｄｕｓｐ２、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７０４１、Ｓｉｒｔ４およびＢｌｉｍｐ１からなる群より選択される１以上の遺伝子の発現が制御される。細胞におけるポリペプチド複合体を誘導することで、これら遺伝子の１以上の発現を低減させることができる。

本発明の第４の側面において、幹細胞内でのＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の形成を阻害する工程を含む、幹細胞内における自己再生を促進し分化を阻害する方法が提供される。任意に、前記幹細胞は哺乳類幹細胞であり、好適にはヒト幹細胞である。本発明の特定の態様において、前記幹細胞は、成体幹細胞、幹細胞前駆体および多能性幹細胞からなる群より選択される。本発明は、ヒトの生殖型クローニング、あるいはヒト生殖型クローニングを促進する目的でのヒト胚の操作および使用を対象とするものではないことが理解されよう。

本発明の本則面の特定の態様において、前記幹細胞内におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の形成の阻害は、前記細胞を、Ｂｌｉｍｐ１阻害化合物、Ｐｒｍｔ５阻害化合物および／又はＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体阻害化合物に曝露することによって行われる。好適には、前記阻害化合物は、小分子阻害剤、Ｂｌｉｍｐ１又はＰｒｍｔ５ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ分子、Ｂｌｉｍｐ１又はＰｒｍｔ５ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＢｌｉｍｐ１又はＰｒｍｔ５ポリペプチドのドミナントネガティブ体からなる群より選択することができる。

本発明の更なる側面において、細胞内におけるＢｌｉｍｐ１ポリペプチドの発現を誘導し、これにより前記細胞内におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の形成を誘導する工程を含む、細胞内におけるＰｒｍｔ５局在化、一般には内在性Ｐｒｍｔ５局在化を制御する方法が提供される。細胞内で誘導されるＢｌｉｍｐ１は、外来性Ｂｌｉｍｐ１又は内在性Ｂｌｉｍｐ１のどちらであってもよい。好適には、細胞は哺乳類幹細胞である。

本発明の更に別の側面において、本発明のポリペプチド複合体の癌治療における使用、および上記した発現ベクター構築体を含む細胞（好適には哺乳類／ヒト細胞）が提供される。

図１は、（ａ）Ｅ７．５−Ｅ１２．５における、マウス生殖細胞特異化および発達時の主要な現象の概要と、（ｂ）２種の代表的な初代ＰＧＣ（灰色）および２種の体細胞（白）から得た単一細胞ｃＤＮＡのＰＣＲによる候補ＳＥＴ／ＰＲドメイン遺伝子の発現分析を示す。黒色はＰＧＣおよび体細胞における発現の検出を示す。
図２は、免疫沈降したマウスＢｌｉｍｐ１複合体がアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を呈することを示す。（ａ）Ｍｙｃ標識マウスＢｌｉｍｐ１又はその対照を、２９３Ｔ細胞において発現した。Ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングで、Ｍｙｃ免疫沈降物を分析した。（ｂ）同じ免疫沈降物を用いて、精製ヒストンＨ３、Ｈ２Ａおよび組換えＨ２Ａ（ｒＨ２Ａ）に対するＨＭＴａｓｅアッセイを行った。各々について、蛍光像（Ｆ）およびポンソー染色膜（Ｐ）を示す。（ｃ）放射標識ｒＨ２Ａのマイクロシークエンシングを示す。ｘ軸はｒＨ２Ａのアミノ酸１〜１４、ｙ軸は１分あたりの各アミノ酸残基の［^３Ｈ］取り込み（ｃｐｍ）を表す。（ｄ）Ｈ４およびＨ２ＡのＮ最末端の配列保存の配列比較を示す。
図３は、生殖細胞におけるＢｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５の重複発現がＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅの特有パターンとなることを示す。（ａ、ｂ、ｃ）発達の様々な段階でのＰＧＣにおいてＢｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５およびＰｒｍｔ１の発現パターンが、Ｂｌｉｍｐ１（ａ）、Ｐｒｍｔ５（ｂ）およびＰｒｍｔ１（ｃ）特異的抗体を用いた免疫染色によって検出された。生殖細胞は、図示するように、ｓｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７、Ｏｃｔ４又はＴＧ１／ＳＳＥＡ１に対する抗体を用いて検出した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。（ｄ、ｅ）Ｍｙｃ標識マウスＢｌｉｍｐ１又はその対照を２９３Ｔ細胞において発現し、図示するように、Ｐｒｍｔ５、Ｍｙｃ又はＰｒｍｔ１抗体を用いるウエスタンブロッティングで、Ｍｙｃ、Ｐｒｍｔ５又はＰｒｍｔ１免疫沈降物を分析した。星印は非特異的シグナルを示す。（ｆ）生殖細胞におけるＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３メチル化を、発達の様々な段階でのＰＧＣにおいて、Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ抗体を用いる免疫染色によって評価した。生殖細胞を、段階特異的なマーカー、すなわちＯｃｔ４又はＴＧ１／ＳＳＥＡ１に対する抗体で共染色した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。スケールバーは１０μｍである（各画像のスケールは同一）。
図４は、Ｄｈｘ３８のゲノム遺伝子座内のＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５結合因子のインヴィヴォ同定を示す。（ａ）Ｄｈｘ３８転写開始（ＴＳ）および開始コドン（ＡＴＧ）、ＣｈＩＰアッセイの増幅配列近傍の推定Ｂｌｉｍｐ１結合部位の位置を示す（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。（ｂ）ＣｈＩＰアッセイによる、内在性Ｐｒｍｔ５とＤｈｘ３８遺伝子座のゲノムＤＮＡとの相互作用を示す。Ｅ１０．５胚から単離した生殖***細胞からの細胞抽出物としての上澄み液（ｓ）又は核画分（ｎ）をＰｒｍｔ５又はＩｇＧ抗体のいずれかで免疫沈降した。尾部ゲノムＤＮＡ（＋）および水（−）を対照として用いた。
図５は、核から細胞質へＢｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５が移行する際に、生殖細胞においてＤｈｘ３８が発現上昇し、その結果Ｈ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ修飾のレベルが低下したことを示す。（ａ）Ｄｈｘ３８、（ｂ）Ｂｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５ならびに（ｃ）Ｈ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓの免疫染色を、図示する発達段階における生殖***の凍結切片について行った。生殖細胞を、特異的抗体ｓｔｅｌｌａ／Ｐｇｃ７、Ｏｃｔ４又はＴＧ１／ＳＳＥＡ１を用いて検出した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。スケールバーは１０μｍである（各画像のスケールは同一）。
図６は、多能性ＥＧおよび胚性癌腫（ＥＣ）細胞におけるＢｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５およびＤｈｘ３８の分析を示す。（ａ）Ｂｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５およびＤｈｘ３８の免疫染色を、ＥＧ細胞について行った。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。なお、Ｄｈｘ３８およびＢｌｉｍｐ１の発現に逆相関関係がある。（ｂ）Ｂｌｉｍｐ１およびＯｃｔ４についてのＥＳ、ＥＧ又はＥＣ（Ｐ１９）抽出物のウエスタンブロット分析を示す。（ｃ）Ｍｙｃ標識マウスＢｌｉｍｐ１をＰ１９多能性ＥＣ細胞において発現した。Ｐｒｍｔ５免疫沈降物を、図示するようにＰｒｍｔ５、Ｂｌｉｍｐ１又はＤｈｘ３８抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。入力レーンの充填量が同等であることを示すチューブリンレベルが、抗チューブリン抗体を用いて検出された。なお、Ｂｌｉｍｐ１がＥＣ（Ｐ１９）細胞に導入された場合、Ｄｈｘ３８は抑制される。（ｄ）Ｍｙｃ−Ｂｌｉｍｐ１トランスフェクトＥＣ（Ｐ１９）細胞におけるＤｈｘ３８遺伝子座上のＨ４Ｒ３ｍｅ２ｓ量の増加を、ＣｈＩＰにより検定した。Ｐ１９細胞由来の細胞抽出物をＭｙｃ又はＨ４Ｒ３ｍｅ２ｓ抗体のいずれかで免疫沈降した。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、図４で説明した、Ｂｌｉｍｐ１結合部位を含むＤｈｘ３８遺伝子座における領域を意味する。
図７は、（ａ）図１に示したＥ７．５でのＰＣＲ発現スクリーニングで得た候補ＳＥＴ／ＰＲドメイン遺伝子の免疫蛍光分析を示す。図示するように特定のヒストンメチルトランスフェラーゼに特異的な抗体を用いて、Ｅ８．５胚からの単離細胞の免疫染色を行った。生殖細胞特異的抗体Ｏｃｔ４又はＳｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７を用いて生殖細胞を検出した。（ｂ）Ｅ８．５でのＰＧＣにおいて対応する抗体を用いたＢｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５の免疫共染色を示す。組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＡＰ）によって生殖細胞を標識した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。スケールバーは１０μｍである（各画像のスケールは同一）。
図８は、Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ抗体の特徴検討を示す。アルギニンは、１個のメチル基で修飾することができ（ａ）、あるいは対称的に配置した２個のメチル基（ｂ）、非対称的に配置した２個のメチル基（ｃ）で修飾することもできる。Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓに対する抗体（Abcam（登録商標））は、Ｒ３対称性脱メチル化したＨ４合成ペプチドを用いて作成されており、その特異性を調べるためにウエスタンブロット分析を行った。（ｄ）免疫沈降したＭｙｃ−Ｂｌｉｍｐ１と共に、あるいは無しで、ウシ胸腺ヒストン（Ｈ４、Ｈ３、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ）を保温した。（ｅ）非修飾、Ｒ３ｍｅ２ｓおよびＲ３ｍｅ２ａのＨ４ペプチドについて競合アッセイを行ったところ、抗体は対称性ジメチル化ペプチドを顕著に認識した。

本発明の詳細な説明に先立って、本発明の理解を助ける一連の定義を示しておく。本明細書に引用する全ての参考文献は、参照することで本明細書に全体が含まれるものとする。特に定義しない限りは、本明細書で用いる全ての技術用語・科学用語は、当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を持つものとする。

本明細書で用いる「再プログラム化」の語は、細胞核のエピジェネティックな修飾を改変又は除去する工程のことをいう。再プログラム化によって、細胞運命への拘束の減少、従って細胞全体のそして特に核の分化状態の減少が促進される。本質的には再プログラム化は、分化したあるいは運命決定した体細胞核を、胚細胞、生殖細胞又は幹細胞に特徴的な遺伝子発現、エピジェネティックおよび機能状態に戻すことから構成される。体細胞核の再プログラム化は、ＳＣＮＴ等の処理において最初に行う工程として好ましいが、細胞分化状態すなわち能力の制御が重要である他の処理においても用途が期待される。

本明細書で用いる「癌」の語は、新生物内に存在する、あるいは新生物に関連する特性を有する、組織又は細胞のことをいう。新生物は一般に、正常組織および正常細胞から区別される特徴を有する。そのような特徴の例としては、一定の退形成、細胞形態の変化、形状の不整、細胞付着性の低下、転移能、血管形成レベルの増加、細胞感染度の増加、細胞アポトーシスレベルの低下、細胞悪性度の全体的な増加などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「癌」に関連し、しばしば同義に用いられる語の例として、肉腫、癌腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、形質転換、新生物などがある。

「エピジェネティックな修飾」の語は、ゲノムの化学的マーキングをいう。エピジェネティックマークとしては、ＤＮＡメチル化（インプリンティング）や、ＤＮＡに関連するタンパク質、例えばヒストン等の、メチル化およびアセチル化が挙げられる。由来する親に特有の遺伝子発現（母系又は父系染色体のいずれかに由来するもの）は、哺乳類でしばしば観察され、これはエピジェネティックな修飾によるものである。親の生殖系列において、エピジェネティックな修飾によって遺伝子の発現停止又は活性化が安定したものとなっている。

「バイオプロセス化」の語は、生細胞又はその構成要素を用いて所望の最終産物を得る技術をいう。本発明に照らしていうと、細胞をエピジェネティックに修飾して、バイオプロセスで使用されるこれらの細胞の能力を強化することに使用ができる。一般にバイオプロセス技術にはＳＣＮＴが含まれる。

本明細書においてＤＮＡ結合ドメインおよび／又はアルギニンメチルトランスフェラーゼについて用いる「誘導体又は相同体」の語は、本発明の分子それぞれと実質的に同様の配列同一性を有するｍＲＮＡおよびポリペプチドをいう。誘導体および相同体は、他の種に由来する配列のオルソログや突然変異であって、にもかかわらずかつ高レベルの機能的同等性を示すものを含むものとする。実質的に同様の配列同一性とは、配列類似性のレベルが、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、約９９％まで同一であることをいう。配列同一性のパーセントは従来法を用いて調べることができる（HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89:10915、およびAltschul他、Nucleic Acids Res. 1997; 25:3389-3402）。あるいは本発明のポリペプチドの相同体は、高、中又は低程度のストリンジェントな条件下での、本明細書で説明する配列とのハイブリダイズ能を発揮する配列であってもよい。

「発現ベクター」の語は、適当なサイズの他のＤＮＡ配列断片を組み込むことができる、線形又は環状のＤＮＡ分子をいう。このＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列断片にコードされる遺伝子の転写をもたらす追加領域を含んでいてもよい。追加領域の例としては、プロモーター、転写終結因子、エンハンサー、内部リボソーム進入部位、非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、選択可能マーカー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターおよび酵母菌人工染色体に由来するものが挙げられる。またベクターは、複数の供給源に由来するＤＮＡ配列を含む組換え分子であってもよい。

「操作可能に連結した」の表現は、ＤＮＡ配列について（例えば発現ベクターにおいて）いう場合、企図する目的を達するために配列が協働して機能するように配置されていることをいう。すなわちプロモーター配列が転写開始し、連結したコード配列から終止コドンまで進行することができることをいう。

「ポリヌクレオチド」とは、各ヌクレオチドの３’および５’末端がリン酸ジエステル結合によって連結した、一本鎖又は二本鎖の共有結合したヌクレオチド配列をいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基で構成されていてもよいし、リボヌクレオチド塩基で構成されていてもよい。ポリヌクレオチドの例としてＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、インヴィトロで合成してもよいし、あるいは自然の供給源から単離してしてもよい。ポリヌクレオチドのサイズは通常、二本鎖ポリヌクレオチドの塩基対数（ｂｐ）で表され、あるいは一本鎖ポリヌクレオチドの場合は、ヌクレオチド数（ｎｔ）で表される。１０００ｂｐ（又はｎｔ）はキロベース（ｋｂ）に等しい。ヌクレオチド長が約４０未満のポリヌクレオチドは通常、「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。

本明細書における「プロモーター」の語は、関連コード配列の発現を制御するように転写因子および／又はＲＮＡポリメラーゼが結合する、遺伝子内の領域をいう。プロモーターは通常、ただし常にではないが、遺伝子の、翻訳開始コドンの上流の５’非コード領域に位置している。遺伝子のプロモーター領域は、ＤＮＡ結合タンパク質の配列特異的ＤＮＡ結合ドメインに対する認識可能結合部位として作用する１以上のコンセンサス配列を含んでいてもよい。とはいえ、このような結合部位は、プロモーター外の領域（例えばイントロン内又はコード配列の下流に位置するエンハンサー領域）に位置していてもよい。

「単離」の語は、ポリペプチド又はポリペプチドの複合体についていう場合、由来する天然生物から取り出したポリペプチドをいう。単離ポリペプチドは、由来する生物のプロテオームに本来的に含まれる他のポリペプチドを実質的に含まないことが好ましい。単離ポリペプチドが、少なくとも９５％の純度、より好ましくは９９％を超える純度の形態であることが最も好ましい。本明細書に照らしていうと、「単離」の語は、天然型、変性型、二量体／多量体、グリコシル化されたもの、結晶化されたもの、あるいは誘導体化されたものなど、様々な物理的形状をとる同一のポリペプチドを含むことを企図している。本明細書でいう「複合体」の語は、例えば第１および第２のポリペプチドドメインがポリペプチド単鎖内に含まれるもの、第１および第２ドメインが、互いに非共有結合的に関連する別々のポリペプチド鎖内に含まれるもの、翻訳後共有結合が形成されて別々のドメインが連結して関連機能ユニットを形成するものなどが含まれる。

本発明のある態様において、エピジェネティックな制御機構を通じて哺乳類細胞における遺伝子発現を調節することのできる、Ｂｌｉｍｐ１とＰｒｍｔ５との新規な複合体が提供される。

体細胞は通常、分化経路に沿って進むにつれ、特殊化の低い状態から、特殊化の高い、あるいは運命決定された状態へと発達する。特殊化の低い体細胞は、数種の細胞型を生じる前駆幹細胞として作用する能力を発揮することができる。所与の幹細胞がその前駆細胞として作用しうる異なる細胞型の量は、一般にその幹細胞の「能力」と称される。従って多能性幹細胞は、非常に多くの異なる分化細胞型の前駆細胞として作用することができる。ある細胞が体の全ての細胞に分化できる場合、その細胞は全能性である。細胞がほとんどの細胞型に分化できる場合、その細胞は多能性である。胚幹細胞は、胚外組織（すなわち栄養外胚葉）を除く哺乳類のほとんどの細胞型を生じるため、一般に多能性であると称される。本発明は、遺伝子発現制御レベルで細胞運命決定を制御する手段を提供する。本発明のタンパク質複合体を発現した場合、あるいは哺乳類細胞内に導入した場合、細胞運命決定を多能性から遠ざけるように作用する。逆に、幹細胞における本発明のタンパク質複合体（又はＢｌｉｍｐ１成分のみでも）の活性を阻害することで、細胞運命決定を多能性および自己再生に偏向させることができる。

本発明用途の別の関連分野として、癌治療が挙げられる。全てではないにせよ、ほとんどの癌は、腫瘍抑制遺伝子のダウンレギュレーションおよび発現停止、癌遺伝子のアップレギュレーションなどのエピジェネティックな変化を経る。腫瘍抑制遺伝子を再活性化することによって、癌の表現型を改善させ、また癌遺伝子の発現を低下させることができる。従って、インヴィヴォで遺伝子発現および細胞運命決定を制御する方法は、癌治療の非常に有望な手段である。

Ｂリンパ球誘導成熟タンパク質（Ｂｌｉｍｐ１）
Ｂｌｉｍｐ１は、５個のＤＮＡ結合ジンクフィンガーモチーフを有する１００ｋＤａのタンパクである（GENBANK受入番号：ＮＭ＿００７５４８）。Ｂｌｉｍｐ１のヒト相同体は、ＰＲＤＩ−ＢＦ１又はＰＲＤＭ１のいずれかで表される（GENBANK受入番号：ＮＭ＿０００１９８）。Ｂｌｉｍｐ１のｃＤＮＡは元来、Ｂ細胞リンパ腫細胞株（ＢＣＬ_１）をサブアトラクティブスクリーニングにかけ、サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−５で処理して単離されていた。Ｂｌｉｍｐ１を異所性発現すると、ＢＣＬ_１細胞の最終分化が十分に引き起こされる。Ｂｌｉｍｐ１は最終Ｂ細胞発達の「主要制御因子」であると考えられている（Yu J.他 (2000) MoI. Cell. Biol. 20(7): 2592-2603）。

ヒトの場合、マウスＢｌｉｍｐ１のヒトオルソログであるＰＲＤＩ−ＢＦ１は、Ｈ３リシンメチルトランスフェラーゼＧ９ａと複合体を形成することができる。この複合体は、遺伝子のプロモーター領域におけるクロマチン媒介機構を通じて、ヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）遺伝子を発現停止可能であることが示されている（Gyory I.他(2004) Nat. Imm. 5: 299-308）。

Ｂｌｉｍｐ１は、エピジェネティック修飾に必要な因子と複合体を形成することが示されている。Ｂｌｉｍｐ１とヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）とを含む複合体は、ヒストン尾部のリシン残基を脱アセチル化することで、ヌクレオソーム構造を変化させ、遺伝子の転写を阻害すると考えられている。リシン残基のアセチル化は効率的に正荷電を中和するが、脱アセチル化は荷電を回復させて立体（stearic）効果およびその他の効果によりヌクレオソーム構造を変化させる。

Ｂｌｉｍｐ１の標的として公知なものの例として、ｃ−Ｍｙｃ、ＩＦＮ−β、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＢＳＡＰ（Ｐａｘ５）、初期Ｂ細胞因子およびＣＩＩＴＡが挙げられる。これらの遺伝子はすべてＢｌｉｍｐ１により転写抑制される。ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の転写は、Ｂ細胞分化の間にＢｌｉｍｐ１によって抑制され、ＢＣＬ_１リンパ腫細胞におけるＢｌｉｍｐ１の重要な標的となっている。Ｂｌｉｍｐ１がｃ−Ｍｙｃプロモーターを抑制するのには、Ｂｌｉｍｐ１分子の複数領域（例えばＮ末端酸性ドメインやアミノ酸９０と４６４との間の領域）が必要である（Yu J.他、上記参照）。

ｃ−Ｍｙｃ腫瘍性タンパク質は、成長制御、アポトーシスおよび／又は分化の調節に重要であり、その異常調節は、様々な新生物において一般的な役割を担っている。Ｂ細胞におけるｃ−Ｍｙｃ発現の異常調節は、しばしば発癌性となる。Ｉｇ遺伝子座へのｃ−Ｍｙｃ遺伝子の染色体転座は、ヒトバーキットリンパ腫およびマウス形質細胞腫のほとんどに存在している（Lin K.I.他 (2000) MoI. Cell Biol. (20)23: 8684-8695）。

ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３依存性シグナルによって、マウスＥＳ細胞を、多能性で自己再生する集団として維持することができる。ＳＴＡＴ３は、Ｍｙｃ転写因子の発現を調節することが示されている。さらに成体幹細胞は、Ｍｙｃ活性化を必要とすると考えられている。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、ＥＳ細胞においてＭｙｃ転写が増加していることが示されている。通常、ＥＳ細胞はＬＩＦを含む培地を必要としており、含まない場合にはＥＳ細胞は自己再生ではなく分化する傾向がある。ＥＳ細胞におけるＭｙｃレベルは、培養条件からＬＩＦを無くすと急速に低下することが判明しており、これがＥＳ細胞分化の必要条件であろうことを意味している。実験の結果は、ＭｙｃのみでＬＩＦに匹敵するレベルでＥＳ細胞状態（すなわち多能性表現型）を維持でき、Ｍｙｃを不活化すると、幹細胞プールが減少することを示唆している（Cartwright P.他(2005) Development 132: 885-896）。

タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（Ｐｒｍｔ５）
ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）は、２種類あることが知られており、リシン特異的メチラーゼ活性を有するタンパク質に主に見られるＳＥＴ（Ｓｕｖａｒ３−９、ｚｅｓｔｅのエンハンサーおよびＴｒｉｔｈｏｒａｘ）ドメイン、あるいはＰＲＭＴに見られるアルギニン特異的メチラーゼ触媒ドメインのいずれかを有する。ＰＲＭＴにはＩ型とＩＩ型がある。Ｉ型のＰＲＭＴは、アルギニン残基のモノメチル化と非対称脱メチル化を触媒し、一方ＩＩ型のＰＲＭＴは、モノメチル化と対称性ジメチル化アルギニンの形成を触媒する。公知の６種のＰＲＭＴのうち、ＰＲＭＴ５（GENBANK受入番号：ＮＭ＿００６１０９（ヒト）；ＮＭ＿０１３７６８（マウス））のみが、ヒストンを標的とするＩＩ型ＰＲＭＴとして挙動する。具体的には、ＰＲＭＴ５は、Ｈ３およびＨ４Ｎ末端尾部の特定のアルギニン残基を標的とすることが示されている。

ＰＲＭＴ５は、ＢＲＧ１およびｈＢＲＭを含むｈＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体と結合させることができる。このような複合体において、ＰＲＭＴ５は、ヒストンＨ３のアルギニン８残基（Ｈ３Ｒ８）をメチル化することによって細胞成長と足場非依存性増殖とを刺激する能力があり、これによって腫瘍抑制における役割を果たすことが知られるＳＴ７やＮＭ２３などの遺伝子発現を低減する（Richard S.他(2005) Biochem. J. 388: 379-386）。ＰＲＭＴ５は、ＣＹＣＬＩＮ ＥおよびＣＡＤの転写抑制にも関係があると考えられている。

Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体
これまでのところＢｌｉｍｐ１自体による特定のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性が存在しないため、本発明者らは、Ｂｌｉｍｐ１ＳＥＴ／ＰＲドメインが有しうる活性の同定に着手した。本発明者らは、Ｂｌｉｍｐ１がＰＲＭＴ５と新規な複合体を形成可能であることを実証した。この複合体はマウス生殖細胞系列においてＰＧＣが生殖***に入るまでにインヴィヴォに存在しており、Ｂｌｉｍｐ１が初期の哺乳類生殖細胞系列において継続して役割を果たしていることを示唆している。さらなる分析の結果（後に詳述する）、新規なＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体は、ヒストンＨ２ＡおよびＨ４をメチル化することによって独特のエピジェネティックなサインを与えることが示された。これは、ヒストンＨ２Ａ尾部のメチル化がエピジェネティック調節機構であることを示した最初の例であると思われる。さらに、実験の結果（後に詳述する）、Ｐｒｍｔ５は多能性ＥＧおよびＥＳ細胞に存在するが、Ｂｌｉｍｐ１は存在しないことが示された。

多能性ＥＣ細胞株Ｐ１９においてＢｌｉｍｐ１が発現すると、多能性細胞において高レベルで発現することが知られる遺伝子が抑制される。実験の結果は、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体は遺伝子発現の重要な制御因子であり、（特に多能性および分化に関する）細胞運命の選択において、重要な効果を及ぼすことが可能であることを示唆している。このように、本発明のある態様は、インヴィトロ又はインヴィヴォでのＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体によって示される生物学的活性の利用に基づく遺伝子制御機構を提供する。

理論に拘泥するわけではないが、５個のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有することから、Ｂｌｉｍｐ１は複合体中で遺伝子標的機能を賦与すると考えられる。Ｐｒｍｔ５は、ＤＮＡに局在化した場合にＨＭＴａｓｅとして作用するアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を賦与し、これによって遺伝子発現を抑制する。Ｂｌｉｍｐ１のヒトオルソログは、ヒトＩＦＮ−βプロモーター領域内のＰＲＤＩ部位に結合することが知られている（Keller A. D.およびManiatis T.(1991) Genes Dev. 5:868-879）。上述したように、Ｂｌｉｍｐ１にｃ−Ｍｙｃ発現の抑制能があることも知られている。本発明によるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の特異的標的であることが示されており、この新規な複合体によって発現が制御される、新規な遺伝子サブセットを同定した。このサブセットは、様々な機能を有する遺伝子を含むが、作用強度、細胞周期、分化、細胞付着性、エピジェネティックな再プログラム化、およびおそらくは腫瘍抑制の調節において、重要な役割を果たすと考えられる。

本発明によるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５抑制複合体の存在は、生殖細胞におけるＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓが高レベルで存在することに関連している。しかし、Ｂ細胞が形質細胞に分化する間、Ｂｌｉｍｐ１はＧ９ａ依存性Ｈ３Ｋ９ｍｅ２を導く。従ってＢｌｉｍｐ１は、様々な結合パートナーとの関連によって、様々な細胞運命決定と性質を方向付けることが可能であり、クロマチンリモデリングがこれら過程の中心にあると思われる。マウスの生殖細胞特異化の初期段階におけるＢｌｉｍｐ１の明らかな重要性に加えて、本発明は、ＰＧＣ特異化後の生殖細胞に見られるような、独特のエピジェネティックなクロマチンサインの形成において、Ｂｌｉｍｐ１がさらに関与していることを実証している。しかし、ゲノム全域でのプログラム化が生殖細胞において検出されるＥ１０．５より後で、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５はＰＧＣ核から出て細胞質に入る。生殖細胞における、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体、Ｈ２Ａ／Ｈ４上のアルギニン３の対称性ジメチル化、およびそれに続くゲノム全域でのエピジェネティックな再プログラム化の関係を理解することで、この重要な過程の元になる機構についてと、どのように核再プログラム化が細胞内において制御されているかを洞察することができる。

本発明はまた、ＰＧＣから誘導するとＢｌｉｍｐ１が明らかに喪失する、多能性胚性性腺（ＥＧ）細胞におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５の役割の洞察を提供する。本発明は、新生および移動ＰＧＣによる明らかな多能性幹細胞様表現型の獲得を抑制するのに、Ｂｌｉｍｐ１が不可欠であるということの直接的な証拠を提供する。従ってＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５活性のアゴニストおよびアンタゴニストはそれぞれ、多能性表現型を喪失させる又は獲得させる細胞運命決定の調節において、重要な役割を果たしうる。さらに、細胞内でのＢｌｉｍｐ１発現は、Ｐｒｍｔ５アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を核内で捕捉して、潜在的な細胞質基質から遠ざける機構を提供する。このような効果は、幹細胞分化の間、および所望の細胞又は細胞株における一般的な細胞周期進行の間において、望ましいものである。

Ｂｌｉｍｐ１および／又はＰｒｍｔ５の阻害剤として本発明に用いられる特定の小核酸分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い二本鎖ＲＮＡである。これらの干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）法によって、インヴィヴォでの遺伝子機能の選択的不活化が可能になる。本発明において、ＲＮＡｉを用いて、細胞内でのＢｌｉｍｐ１および／又はＰｒｍｔ５発現をノックダウンすることができる。この方法では、二本鎖ｍＲＮＡがダイサーＲＮａｓｅによって認識され切断されて、２１−２３ヌクレオチド長のＲＮＡｉが得られる。これらのＲＮＡｉを、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に導入してほどく。アンチセンス一本鎖は、相補的配列を含むｍＲＮＡにＲＩＳＣを誘導し、その結果ｍＲＮＡのヌクレオチド鎖が切断される（Elbashir他(2001) Nature 411; 494-498）。従ってこの方法は、バイオプロセスの用途で、あるいは自己再生する多能性表現型の促進が望ましい場合の、体細胞におけるＢｌｉｍｐ１および／又はＰｒｍｔ５ｍＲＮＡを標的化し分解する手段を提供する。Ｐｒｍｔ５に対するｓｉＲＮＡを作成する方法は、当分野の文献に記載がある（Richard S.、上記参照）。ヒトＰＲＭＴ５を標的化する好適なｓｉＲＮＡ配列の例として、下記が挙げられる。
５’ＣＴＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡ ３’［配列番号１］
５’ＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴＡＴＡ ３’［配列番号２］
５’ＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＡＴ ３’［配列番号３］

本発明のＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体を用いて、細胞環境中でその複合体と相互作用する他のタンパク質やポリペプチドを同定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用を調べる従来法（例えば酵母ツーハイブリッドスクリーニング）を用いて、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体相互作用についての潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。例えば、他のタンパク質と直接に相互作用することが知られるＢｌｉｍｐ１のドメイン（Yu J.他、上記参照）との相互作用を遮蔽又は撹乱することによって、Ｂｌｉｍｐ１とＰｒｍｔ５との関連を阻害する小分子を同定することも、本発明の検討事項内である。Ｂｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５および／又はＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体のタンパク質−タンパク質相互作用又はタンパク質−小分子相互作用は、表面プラズモン共鳴を用いた分子相互作用を検出するBIAcore（登録）等の技術（BIAcore社、ニュージャージー州ピスカタウェイ。www.biacore.comも参照）を用いて調べることができる。

Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体に対する結合能についての、分子およびタンパク質のスクリーニングは、自動高処理スクリーニング法によって行うことができる。従って本発明は、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体と標的分子との正の結合相互作用を検出することで、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体と相互作用する分子を同定する方法を提供する。さらにスクリーニング工程を用いて、同定した正の結合相互作用が薬理学的に重要であるか否か、すなわち標的分子が、Ｂｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５および／又はＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の生物学的活性又は機能を緩和することができるか否かを調べることができる。正の緩和効果を有する分子が同定されれば、その分子を「的中（ヒット）」として分類し、有力候補薬物として評価することができる。その他の要因として、これまでのところ、例えば分子の吸収・分布・代謝・***（ＡＤＭＥ）、生物学的利用可能性および毒性プロフィール等が考慮されうる。潜在的な薬物分子が、薬理学的必要条件を満たせば、薬学的に適合性があると考えられる。好適な組成物を調合して、当分野で公知の標準的手順に従ってインヴィトロおよびインヴィヴォでの活性を調べることができる。

方法および試薬
胚の単離。発達の様々な段階で、非近交系のＭＦ１マウスの胚から始原生殖細胞を単離した。膣栓形成の日をＥ０．５とした。出版されている文献（Saitou, M., Barton, S. C.およびSurani, M. A. (2002) Nature 418, 293-300）に従って単一細胞ｃＤＮＡライブラリーを作成した。

免疫染色。生殖細胞を含む胚切片をトリプシンで処理し、単一細胞懸濁液を調製した。次いで細胞をポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたスライド上に置き、２％ＰＦＡで固定してＰＢＳで３回洗浄し、更なる処理を行った。Ｅ１１．５の全胚性生殖***を切り出し、ＰＢＳ中で洗浄し、４％ＰＦＡ中で４℃にて２時間固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、２０％スクロース中で４℃にて一晩静置した。ＯＣＴ（BDH社）に包理し、凍結切片とした。単一細胞又は切片をＩＦ緩衝液（ＰＢＳ；０．１％トリトン；１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で透過処理した。一次抗体保温を４℃にて一晩行い、次いでＩＦ緩衝液中で３回洗浄し、二次抗体（Ａｌｅｘａ５６４、Ａｌｅｘａ４８８；Molecular Probes）で室温にて２時間保温し、ＰＢＳ中で洗浄した。スライドを、ＤＡＰＩ染色を用いるｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector laboratories社）にセットした。免疫蛍光をｒａｄｉａｎｃｅ２０００共焦点顕微鏡（BioRad社）上で可視化した。以下の抗体および希釈率を用いた。ＰＧＣ７（T.Nakano氏より入手、１：２５００）、Ｏｃｔ４（BD Transduction Laboratories、１：２００）、ＴＧ１（マウス生殖細胞特異的抗ＳＳＥＡ１モノクローナル抗体、１：１）、Ｂｌｉｍｐ１（K.Calame氏より入手、１：１０）、Ｐｒｍｔ５（Upstate社、１：２５０）、Ｐｒｍｔ１（Upstate社、１：２００）、Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ（Abcam、１：１０００）、Ｄｈｘ３８／Ｐｒｐ１６（ProteintechGroup社、１：２００）、Ｅｚｈ２（Upstate社、１：５０）、Ｇ９ａ（Abcam（登録商標）、１：１００）、Ｐｆｍ１（Abcam（登録商標）、１：５０）、Ｓｅｔ１（W.Herr氏より入手、１：２００）。

免疫沈降分析および核抽出物の調製。マウスＢｌｉｍｐ１のコード領域をＲＴ−ＰＣＲで増幅し、産物をｐｃＤＮＡ３−ＭｙｃＨｉｓＡ内にクローニングし、構築体ｐＣＭＶ−ＭｙｃＢｌｉｍｐ１を得た。元のベクター（ｐＣＭＶ−Ｍｙｃと称する）又はｐＣＭＶ−ＭｙｃＢｌｉｍｐ１のいずれかでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞又はＰ１９細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．１％トリトン、５０ｍＭトリスｐＨ８．０および完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Roche社）を含むＩＰ緩衝液中で溶解した。２×１０^７個の細胞を用いて通常の免疫沈降反応を行った。全細胞抽出物を、２μｇのＭｙｃ抗体（New England Biolabs社）と共に保温した。それとは別に、Ｐｒｍｔ５又はＰｒｍｔ１抗体（Upstate社）のいずれかを用い、４℃にて一晩保温した。次いで３０μｌのタンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズを４℃で２時間添加した。ビーズをＩＰ緩衝液で５回洗浄した。結合したタンパク質をＬａｅｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰して溶出した。製品（核抽出物キット；Active Motif）のマニュアルに従って、ＥＳ、ＥＧ又はＰ１９細胞の核抽出物を調製し、１充填（loading）あたり２５μｇの核画分を用いた。

インヴィトロメチルトランスフェラーゼアッセイ。ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ又はｐＣＭＶ−ＭｙｃＢｌｉｍｐ１のいずれかでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の免疫沈降分析で得たビーズを、ＨＭＴａｓｅ緩衝液（２５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスｐＨ８．８）でさらに２回洗浄し、文献１６に記載の方法をわずかに変更してＨＭＴａｓｅアッセイを行った。以下、簡単に述べると、基質としての１μｇのＨ３又はＨ２Ａ（Roche社）又は組換えＨ２Ａ（A.Brehmより提供していただいたもの）と、メチル供与体としての２μＣｉのＳアデノシル−Ｌ［メチル−^３Ｈ］メチオニン（［^３Ｈ］ＳＡＭ；Amersham Biosciences社）とを、２０μｌのＨＭＴａｓｅ緩衝液の混合液中、３７℃で３時間保温した。タンパク質を１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＤＶＦ膜上に転写し、ポンソー染色およびフルオログラフィーによって可視化した。インヴィトロメチル化ｒＨ２Ａを連続エドマン分解（Protein and Nucleic acid Chemistry Facility、ケンブリッジ大学、英国）によってマイクロシークエンシングし、次いでシンチレーションカウントによって各アミノ酸の^３Ｈ取り込みを調べた。Ｈ２Ａ／Ｈ４特異的メチル化を調べるために、Ｈ４、Ｈ３、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂ（Roche社）を、上記したように免疫沈降したＢｌｉｍｐ１複合体およびＳＡＭと共に保温し、競合アッセイで特異性を調べた（図８の補足データ参照）Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ抗体（Abcam（登録商標）、英国ケンブリッジ）を用いてウエスタンブロット分析を行った。

クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）クローニングおよびＣｈＩＰ。単一細胞懸濁液を、１％ホルムアルデヒド中にて室温で１０分間架橋した。次いで細胞を破壊し、核を５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ中で溶解し、さらに超音波処理を行った。上記したように抽出物を免疫沈降にかけた（負の対照として精製ＩｇＧ（Santa Cruz社）を添加した）。ビーズを５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１％ＳＤＳ中で２回溶出し、上澄みを６５℃にて５時間プロテイナーゼＫで処理し、続いてフェノール／クロロフォルム精製およびエタノール沈殿を行った。次いでＰＲＭＴ５（Upstate社）又はＨ４Ｒ３ｍ３２（Abcam（登録商標））ＣｈＩＰ試料を、以下のプライマーを用いた標準的なＰＣＲ反応によって分析した（フォワード１−ｃｃａｇｇａｇｇｇｇｔｔｔｃａｔｃａａｃｔｇ［配列番号４］およびリバース１−ｔｇｔｔａｃｃｇｔｃｔｃａｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｇ［配列番号５］；フォワード２−ａｃｃｔｃａｃａａｃｔｇｃｔｇｇｇａｔｔａｃ［配列番号６］およびリバース２−ｔｔｃｇｔｔｔｔｃｔｇｃｇｔｃｃｇｔｇ［配列番号７］；フォワード３−ｔｔｔｇｔｃｇｃａｇｔｇｔｃｔｔａｔｃｇｔａａｃ［配列番号８］およびリバース３−ｔａｇｇａａｇｇｔｇｔｔｇｇｇｇａｇｇｇ［配列番号９］；フォワード４−ａｔｇａｇｇｔｔｔｇａｇａａｇｔｇｔｇｇｃ［配列番号１０］およびリバース４−ａｔｃａｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｃａｇｃ［配列番号１１］）。ＣｈＩＰクローニングアッセイでは、抗Ｍｙｃ抗体を用いる免疫沈降を２回連続して行った。その後ＤＮＡを沈降し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、アニールしたＪＷ１０２およびＪＷ１０３に連結した（文献２５）。ＪＷ１０２を用いて連結産物をＰＣＲ増幅した（５５℃で２分間、７２℃で５分間、９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を２０サイクル、最後に７２℃で５分間を１サイクル）。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Promega社）内にクローニングし、ＰＣＲによりコロニー内の挿入物の有無を調べ、標準法によって産物の配列決定をした。次いでオンラインのバイオインフォマティクスリソース（Ensembl（http://www.ensembl.org）等）を用いてＢＬＡＳＴ検索を行った。

実施例１：Ｂｌｉｍｐ１活性の同定
マウスＰＧＣの特異化の直後、メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）およびアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）それぞれによるヒストン尾部のメチル化およびアセチル化などの顕著なエピジェネティック修飾が起きる。ＰＧＣにおけるこれらのエピジェネティックな変化の調節で役割を担うと思われる候補遺伝子の１つとして、保存ＳＥＴ／ＰＲドメインタンパク質ファミリーに属するＨＭＴａｓｅが挙げられる。遺伝子を含む２５個の候補ＳＥＴ／ＰＲドメインを、Ｅ７．５でのＰＧＣとその周辺の体細胞の発現について分析したところ、Ｂｌｉｍｐ１、Ｇ９ａ、Ｓｅｔ１、Ｅｚｈ２およびＰｆｍ１は、ＰＧＣを含む胚性領域において発現することが判明した（図１ｂおよび図７）。しかし、Ｂｌｉｍｐ１発現のみがＥ７．５のＰＧＣに限定されており、その発現はその後、生殖細胞において持続した。

Ｂｌｉｍｐ１ＳＥＴ／ＰＲドメインの活性を調べるために、最初に、Ｍｙｃ標識マウスＢｌｉｍｐ１が、２９３Ｔ細胞において一過性発現された場合、Ｍｙｃ抗体を用いて効率的に免疫沈降することを確認した（図２ａ）。免疫沈降物を、ヒストンＨ３に関する標準的放射ヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイに供した（Rea、 S. 他 (2000) Nature 406, 593-9）。Ｈ３に対応する比較的弱い信号が観察されたが、驚くべきことに、ヒストンＨ２ＡおよびＨ４に対応する顕著なバンドも検出された（図２ｂ）。ウエスタンブロッティングで調べたところ、後者はＨ３調製物中で低レベルの混入として存在していた（データ示さず）。インヴィトロでのＨ３の弱い信号は、これまでにＢ細胞について報告されているＢｌｉｍｐ１関連Ｇ９ａ（Gyory他、上記参照）によるものであると考えるのが妥当である。しかし生殖細胞は、Ｇ９ａに寄与する主な修飾である、ヒストンＨ３リシン９ジメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ２）を顕著に示しておらず、ＰＧＣ特異化はＧ９ａ機能の喪失による検出可能な影響を受けてもいない。従って、Ｈ２ＡおよびＨ４ヒストンに関して免疫沈降したＢｌｉｍｐ１の、観察された活性に焦点をあてることにした。

Ｈ２Ａ尾部メチル化の発見が新規であるため、まずウシ胸腺Ｈ２Ａ調製物と組換えＨ２Ａ調製物とについて免疫沈降物のメチルトランスフェラーゼ活性を調べることにした。その結果、このヒストンについて強いメチル化活性を有していた（図２ｂ）。Ｈ２Ａ尾部上の標的アミノ酸残基を同定するために、メチルトランスフェラーゼアッセイの放射標識組換えタンパク質産物を、連続エドマン分解にかけた。放出アミノ酸画分のシンチレーション測定を行ったところｒＨ２Ａ Ｒ３の放射標識を検出した（図２ｃ）。ウシ胸腺Ｈ４調製物と組換えＨ４調製物とで同じ結果が得られた（データ示さず）。これは、ヒストンＨ２ＡとＨ４との間での第１のＮ末端残基のアミノ酸配列が保存されている（図２ｄ）ことに矛盾しない知見である。Ｈ４Ｒ３メチル化は、転写調節において重要な役割を果たすことが知られている。しかし、これらの結果は、ヒストンＨ２Ａ上のＲ３の新規なメチル化がさらに存在することを示唆している。

実施例２：Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の同定
ＳＥＴ／ＰＲドメインが、リシン残基のみにおいてヒストンメチルトランスフェラーゼ活性に関連しているので、上記で検出されたアルギニンメチル化活性はＢｌｉｍｐ１によるものではなく、免疫沈降物に存在する他のＨＭＴａｓｅに関係があるとするのが妥当である。２個のタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼである、Ｐｒｍｔ１およびＰｒｍｔ５は、ヒストンＨ４Ｒ３メチル化を媒介することがこれまでに報告されている。Ｐｒｍｔ１は、多様な種類の基質上でＮＧモノメチルアルギニン（Ｒｍｅ１）および非対称性ＮＧ，Ｎ’Ｇジメチルアルギニン（Ｒｍｅ２ａ）を導くクラスＩアルギニンメチルトランスフェラーゼである。上記したように、Ｐｒｍｔ５は、アルギニンのモノメチル化（Ｒｍｅ１）および対称性ＮＧ，Ｎ’Ｇジメチル化（Ｒｍｅ２ｓ）を導くクラスＩＩアルギニンメチルトランスフェラーゼに属している（図８）２０。これらのタンパク質がインヴィヴォでＢｌｉｍｐ１に関連しているかを調べるために、新生ＰＧＣおよびその周辺の体細胞中でのそれらの発現を、上記したように単一細胞ｃＤＮＡライブラリーを用いて分析した。Ｐｒｍｔ１はＥ７．５のＰＧＣには見られず、一方Ｐｒｍｔ５はＰＧＣおよび体細胞の両方に存在することが判明した（データ示さず）。しかしタンパク質レベルについては、Ｐｒｍｔ５は核染色を示し、Ｅ８．５以降の体細胞と比較して、ＰＧＣにおいて高レベルで存在している（図３ａ、ｂ；図Ｓ１ｂおよび下記参照）。一方Ｐｒｍｔ１は、これらの段階において、主に生殖細胞の細胞質において検出された（図３ｃ）。

次に、Ｂｌｉｍｐ１と相互作用するのはＰｒｍｔ５とＰｒｍｔ１とのいずれかであるかを調べた。実際に、Ｍｙｃ標識Ｂｌｉｍｐ１は、２９３Ｔ細胞における内在性Ｐｒｍｔ５を効率的に免疫共沈降することが可能であると判明した（図３ｄ）。逆に、Ｐｒｍｔ５もＭｙｃ標識Ｂｌｉｍｐ１のプルダウンが可能であった（図３ｄ）。これに対して、Ｍｙｃ標識Ｂｌｉｍｐ１と内在性Ｐｒｍｔ１との相互作用（図３ｅ）は見られなかった。これらの実験により、Ｂｌｉｍｐ１とＰｒｍｔ５とは２９３Ｔ細胞において複合体を形成できることが確認された。ＰＧＣにおけるこれらタンパク質の重複発現（図３ａ、ｂ；図Ｓ１ｂ）を考慮すると、Ｂｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５はＰＧＣにおける同じタンパク質複合体の一部であり、この複合体が、発達の間にどこか別の場所で、又は正常のおよび腫瘍性の成体組織で生じる、と考えるのが妥当である。

実施例３：インヴィヴォでのＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体活性
Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓに対して作成した抗体の特異性を調べたところ、ウシ胸腺由来のヒストンＨ２ＡとＨ４との両方を効果的に認識することが示された（図８ｂ）、図面左側。Ｈ２ＡおよびＨ４は、Ｈ３およびＨ２Ｂ調製物中の混入物としても存在する）。競合アッセイにおいて、この抗体はＲ３ｍｅ２ｓを含むＨ４（１−９Ｃ）ペプチドによって効率的に滴定された（図Ｓ２ｃ）。その上この抗体は、Ｈ４とＨ２Ａとの両方のＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５ＨＭＴａｓｅアッセイの産物を認識し（図Ｓ２ｂ、図面右側）、従って複合体に寄与するのは、Ｐｒｍｔ５の対称性ジメチル化活性であってＰｒｍｔ１の非対称性ジメチル化活性ではない、ということの更なる証拠となっている。

Ｈ２／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ改変体特異的抗体を用いて、初期胚から単離したＰＧＣを免疫細胞化学法によって分析した。Ｅ８．５において、Ｈ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓはＰＧＣと体細胞との両方で明確に見られた（図３ｆ）が、Ｅ１０．５において、より高いレベルのＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓの蓄積が生殖細胞において顕著に観察された（図３ｆ）。しかし、Ｈ４Ｒ３のモノメチル化および／又は非対称性ジメチル化（Ｈ４Ｒ３ｍｅ１およびＨ４Ｒ３ｍｅ２ａ）を認識する別の抗体を用いた場合、ＰＧＣにおけるこの修飾がＥ８．５で起きたが、Ｅ１０．５では起きなかったことが観察された（データ示さず）。これら２種の抗体についてのデータを併せると、Ｅ８．５からＥ１０．５まで、ＰＧＣにおいてＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓへと進行することがわかる。これらの結果は、生殖細胞分化の間に特異的クロマチンサインが存在することを実証しており、これはＰｒｍｔ５とＢｌｉｍｐ１とが併せて存在するためであると考えられる。重要なことに、生殖細胞の特異的クロマチン状態に寄与するヒストン尾部修飾は、更に複数存在する。Ｂｌｉｍｐ１の機能を喪失させると、初代ＰＧＣ様細胞が増殖を停止して異常な発達をすることが近年示されている（Ohinata, Y.他(2005)Nature 5, 5）。

実施例４：Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体のインヴィヴォ標的の同定
これまでに示したように、Ｂｌｉｍｐ１は、相互作用因子を特定部位に補充することで、細胞分化中に遺伝子制御を引き起こすことができる。推定Ｂｌｉｍｐ１標的を同定するために、クロマチン免疫沈降クローニング法を用い、まずＭｙｃ標識化したＢｌｉｍｐ１を２９３Ｔ細胞で過発現した。これら２９３Ｔ細胞からの核抽出物をＭｙｃ抗体で免疫沈降し、免疫沈降したＤＮＡを抽出し、精製し、連結リンカーにより平滑末端化し、ＰＣＲ増幅してクローニングした。多数のクローンを選択して配列決定で分析し、次いでＢＬＡＳＴ分析によりクローン挿入片をマッピングした。３２個のクローンのうち１１個が、公知遺伝子の制御配列と思しき配列の近辺およびその内部に位置する領域に対応していた（表１参照）。

実施例５：Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体によるＤｈｘ３８遺伝子発現制御の特徴検討
同定された推定Ｂｌｉｍｐ１標的のうち、さらなる研究用にＤｈｘ３８を選択した。Ｄｈｘ３８は、ＤＥＡＨボックス含有ＲＮＡヘリカーゼをコードする保存遺伝子（Ｐｒｐ１６としても知られる）で、線虫においては、***から卵母細胞への切換え間に性決定遺伝子の翻訳後調節に必須なものである（Graham, P. L.およびKimble, J. (1993). Genetics 133, 919-31）。

Ｄｈｘ３８遺伝子座を詳細に調べたところ、Ｂｌｉｍｐ１コンセンサス結合部位に対応する４個のＧＧＧＡＡＡＧモチーフを含んでいることが判明した。うち２個は５’領域内に、２個は転写開始点の下流に存在していた（図４ａ）。現在入手可能なＢｌｉｍｐ１抗体は免疫染色処理に有効であるが、Ｂｌｉｍｐ１の免疫沈降には効率的ではない（データ示さず）。従ってＰｒｍｔ５を用いて、Ｄｈｘ３８が生殖細胞におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の標的であるかを調べた。Ｂｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５が生殖細胞核において同時発現される段階であるＥ１０．５（上記参照）での胚に由来する生殖***の細胞懸濁液に含まれるＰＧＣについて、Ｐｒｍｔ５抗体を用いたＣｈＩＰアッセイを行った。実際にＰｒｍｔ５は、Ｄｈｘ３８遺伝子のエクソン１１を含むヌクレオチド＋７１６５２〜＋７５４１にわたる選択配列（Ｂｌｉｍｐ１コンセンサス結合部位を含む）を特異的にプルダウンできることが判明した（図４ｂ）。本ＣｈＩＰアッセイでは、他の３個の推定結合部位はＰｒｍｔ５に関連していなかった。これらの結果は、Ｐｒｍｔ５がＢｌｉｍｐ１標的（Ｄｈｘ３８等）に補充されることを示しており、従ってＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体が生殖細胞におけるそのような標的遺伝子の発現を調節することを示唆している。

Ｄｈｘ３８が生殖細胞におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の標的であるということを元に、ＰＧＣにおけるＤｈｘ３８の発現／抑制を調べた。Ｄｈｘ３８はＥ１０．５およびＥ１１．５では検出されないことが判明した（図５ａ）。しかしＥ１２．５までに、Ｄｈｘ３８はメスおよびオス両方のＰＧＣにおいて上方制御されており（図５ａ）、顕著なことに、これはＥ１１．５での生殖細胞における核から細胞質へのＰｒｍｔ５およびＢｌｉｍｐ１の非局在化と同時に起こっていた（図５ｂ）。Ｅ１２．５では、Ｐｒｍｔ５とＢｌｉｍｐ１のいずれもＰＧＣ核に存在しなかった（データ示さず）。メスおよびオス生殖細胞それぞれの減数***停止および有糸***停止の直前にＤｈｘ３８アップレギュレーションが起きる。従って、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５およびＤｈｘ３８の発現には逆相関の関係がある。これらの結果は、Ｂｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５が、生殖系列においてＤｈｘ３８等の標的遺伝子の転写を抑制する機能を有する可能性を示している。この抑制は、生殖細胞が生殖***に入り、またＢｌｉｍｐ１とＰｒｍｔ５との両方が核から細胞質へ輸送された場合に無くなるようである。なお、ヒストンアルギニンメチル化はこれまで主に転写活性化に関連付けられてきたが、近年、Ｐｒｍｔ５関連Ｈ３Ｒ８ｍｅ活性は、遺伝子発現の低減に関連付けられている（Pal S.他、上記参照）。さらに、Ｂｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５の両方が転写抑制因子であるとこれまでに報告されているので、本明細書で説明する生殖細胞におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体関連対称性アルギニンジメチル化が、遺伝子抑制に有利に作用する可能性が高い。

実施例６：多能性幹細胞におけるＢｌｉｍｐ１−Ｐｒｍｔ５複合体
Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の役割についてさらに洞察を得るために、多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞を調べた。ＥＧ細胞は、インヴィトロでの単離ＰＧＣに由来するものであってもよく、従ってＰＧＣに同等な、最も密接する細胞株であると考えられる。ＥＧ細胞はＰｒｍｔ５について陽性であるが、ＰＧＣとは異なり、Ｂｌｉｍｐ１を有していないことが判明した（図６ａ、ｂ）。この観察結果と一致して、ＥＧ細胞はＤｈｘ３８についても陽性であることが判明しており、この遺伝子の発現は、Ｂｌｉｍｐ１が存在しないことによるものであることを示唆している（図６ａ、ｂ）。Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５抑制複合体を再生するために、Ｍｙｃ標識Ｂｌｉｍｐ１をＥＧ細胞において過発現させた。しかしその結果、細胞トランスフェクションの僅か１２時間後には強い細胞毒性が現れ、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃトランスフェクト対照ＥＧ細胞の細胞生存能力は阻害された（データ示さず）。同様の結果が、多能性胚性幹（ＥＳ）細胞についても得られた（データ示さず）。

ＥＧおよびＥＳ細胞に似た多能性の特徴を有する多能性マウス胚性癌腫（ＥＣ）細胞株Ｐ１９を選択した。実際にＰ１９細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞と同様に、Ｐｒｍｔ５およびＤｈｘ３８を発現したが、Ｂｌｉｍｐ１を発現しなかった（図６ｂ、ｃ）。しかし、これらの細胞はＢｌｉｍｐ１の発現に対し許容性があることが判明し、従って免疫沈降を用いたところ、過発現されたＭｙｃ−Ｂｌｉｍｐ１がマウスＥＣ細胞において内在性Ｐｒｍｔ５と相互作用することが実際に確認された（図６ｃ）。とりわけ、この一過性Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体は、続いてＰ１９細胞におけるＤｈｘ３８のダウンレギュレーションを引き起こした（図６ｃ）。ＣｈＩＰ分析の結果、このＤｈｘ３８のダウンレギュレーションには、Ｄｈｘ３８遺伝子座におけるＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓのレベル増加が伴われることが確認された（図６ｄ）。これらの観察結果は、Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体が、おそらくはＰＧＣにおいても、Ｄｈｘ３８等の標的遺伝子の抑制の原因となっている、という考えを裏付けている。

本発明の特定の態様を詳細に説明したが、一例の説明に過ぎず、例証のみを目的とするものである。上記した態様は、添付した特許請求の範囲を限定することを企図していない。請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を様々に置換、変更、修正することが可能であることを本発明者らは意図している。

（ａ）Ｅ７．５−Ｅ１２．５における、マウス生殖細胞特異化および発達時の主要な現象の概要を示し、（ｂ）２種の代表的な初代ＰＧＣ（灰色）および２種の体細胞（白）から単一細胞ｃＤＮＡのＰＣＲによる候補ＳＥＴ／ＰＲドメイン遺伝子の発現分析を示す。黒色はＰＧＣおよび体細胞における発現の検出を示す。 免疫沈降したマウスＢｌｉｍｐ１複合体がアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を呈することを示す。（ａ）Ｍｙｃ標識マウスＢｌｉｍｐ１又はその対応の対照を、２９３Ｔ細胞において発現した。Ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングで、Ｍｙｃ免疫沈降物を分析した。（ｂ）同じ免疫沈降物を用いて、精製ヒストンＨ３、Ｈ２Ａおよび組換えＨ２Ａ（ｒＨ２Ａ）に対するＨＭＴａｓｅアッセイを行った。各々について、蛍光像（Ｆ）およびポンソー染色膜（Ｐ）を示す。（ｃ）放射標識ｒＨ２Ａのマイクロシークエンシングを示す。ｘ軸はｒＨ２Ａのアミノ酸１〜１４、ｙ軸は１分あたりカウントとしての各アミノ酸残基の［^３Ｈ］取り込み（ｃｐｍ）を表す。（ｄ）Ｈ４およびＨ２Ａ．１のＮ最末端の配列保存の配列比較のアイラインメントを示す。 生殖細胞におけるＢｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５の重複発現がＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅの特有パターンとなることを示す。（ａ、ｂ、ｃ）発達の様々な段階でのＰＧＣにおけるＢｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５およびＰｒｍｔ１の発現パターンを、Ｂｌｉｍｐ１（ａ）、Ｐｒｍｔ５（ｂ）およびＰｒｍｔ１（ｃ）特異的抗体を用いた免疫染色によって検出した。生殖細胞は、図示するように、ｓｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７、Ｏｃｔ４又はＴＧ１／ＳＳＥＡ１に対する抗体を用いて検出した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。（ｄ、ｅ）Ｍｙｃ標識マウスＢｌｉｍｐ１又はその対応の対照を２９３Ｔ細胞において発現し、図示するように、Ｐｒｍｔ５、Ｍｙｃ又はＰｒｍｔ１抗体を用いるウエスタンブロッティングで、Ｍｙｃ、Ｐｒｍｔ５又はＰｒｍｔ１免疫沈降物を分析した。星印は非特異的シグナルを示す。（ｆ）生殖細胞におけるＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３メチル化を、発達の様々な段階でのＰＧＣにおいて、Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ抗体を用いる免疫染色によって評価した。生殖細胞を、段階特異的なマーカー、すなわちＯｃｔ４又はＴＧ１／ＳＳＥＡ１に対する抗体で共染色した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。スケールバーは１０μｍである（各画像のスケールは同一）。 Ｄｈｘ３８のゲノム遺伝子座内のＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５結合因子のインヴィヴォ同定を示す。（ａ）Ｄｈｘ３８転写開始（ＴＳ）および開始コドン（ＡＴＧ）、ＣｈＩＰアッセイの増幅配列近傍の推定Ｂｌｉｍｐ１結合部位の位置を示す（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。（ｂ）ＣｈＩＰアッセイによる、内在性Ｐｒｍｔ５とＤｈｘ３８遺伝子座のゲノムＤＮＡとの相互作用を示す。Ｅ１０．５胚から単離した生殖***細胞からの細胞抽出物としての上澄み液（ｓ）又は核画分（ｎ）をＰｒｍｔ５又はＩｇＧ抗体のいずれかで免疫沈降した。尾部ゲノムＤＮＡ（＋）および水（−）を対照として用いた。 核から細胞質へＢｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５が移行する際に、生殖細胞においてＤｈｘ３８が発現上昇し、その結果Ｈ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ修飾のレベルが低下したことを示す。（ａ）Ｄｈｘ３８、（ｂ）Ｂｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５ならびに（ｃ）Ｈ２Ａ／Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓの免疫染色を、図示する発達段階における生殖***の凍結切片について行った。生殖細胞を、特異的抗体ｓｔｅｌｌａ／Ｐｇｃ７、Ｏｃｔ４又はＴＧ１／ＳＳＥＡ１を用いて検出した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。スケールバーは１０μｍである（各画像のスケールは同一）。 多能性ＥＧおよび胚性癌腫（ＥＣ）細胞におけるＢｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５およびＤｈｘ３８の分析を示す。（ａ）Ｂｌｉｍｐ１、Ｐｒｍｔ５およびＤｈｘ３８の免疫染色を、ＥＧ細胞について行った。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。なお、Ｄｈｘ３８およびＢｌｉｍｐ１の発現に逆相関関係がある。（ｂ）Ｂｌｉｍｐ１およびＯｃｔ４についてのＥＳ、ＥＧ又はＥＣ（Ｐ１９）抽出物のウエスタンブロット分析を示す。（ｃ）Ｍｙｃ標識マウスＢｌｉｍｐ１をＰ１９多能性ＥＣ細胞において発現した。Ｐｒｍｔ５免疫沈降物を、図示するようにＰｒｍｔ５、Ｂｌｉｍｐ１又はＤｈｘ３８抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。入力レーンの充填量が同等であることを示すチューブリンレベルが、抗チューブリン抗体を用いて検出された。なお、Ｂｌｉｍｐ１がＥＣ（Ｐ１９）細胞に導入された場合、Ｄｈｘ３８は抑制される。（ｄ）Ｍｙｃ−Ｂｌｉｍｐ１トランスフェクトＥＣ（Ｐ１９）細胞におけるＤｈｘ３８遺伝子座上のＨ４Ｒ３ｍｅ２ｓ量の増加を、ＣｈＩＰにより検定した。Ｐ１９細胞由来の細胞抽出物をＭｙｃ又はＨ４Ｒ３ｍｅ２ｓ抗体のいずれかで免疫沈降した。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、図４で説明した、Ｂｌｉｍｐ１結合部位を含むＤｈｘ３８遺伝子座における領域を意味する。 （ａ）図１に示したＥ７．５でのＰＣＲ発現スクリーニングで得た候補ＳＥＴ／ＰＲドメイン遺伝子の免疫蛍光分析を示す。図示するように特定のヒストンメチルトランスフェラーゼに特異的な抗体を用いて、Ｅ８．５胚からの単離細胞の免疫染色を行った。生殖細胞特異的抗体Ｏｃｔ４又はＳｔｅｌｌａ／ＰＧＣ７を用いて生殖細胞を検出した。（ｂ）Ｅ８．５でのＰＧＣにおいて対応する抗体を用いたＢｌｉｍｐ１およびＰｒｍｔ５の免疫共染色を示す。組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＡＰ）によって生殖細胞を標識した。ＤＡＰＩで染色したＤＮＡとの合成像を示す。スケールバーは１０μｍである（各画像のスケールは同一）。 Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓ抗体の特徴検討を示す。アルギニンは、１個のメチル基で修飾することができ（ａ）、あるいは対称的に配置した２個のメチル基（ｂ）、非対称的に配置した２個のメチル基（ｃ）で修飾することもできる。Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ｓに対する抗体（Abcam（登録商標））は、Ｒ３対称性脱メチル化したＨ４合成ペプチドを用いて作成されており、その特異性を調べるためにウエスタンブロット分析を行った。（ｄ）免疫沈降したＭｙｃ−Ｂｌｉｍｐ１と共に、あるいは無しで、ウシ胸腺ヒストン（Ｈ４、Ｈ３、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ）を保温した。（ｅ）非修飾、Ｒ３ｍｅ２ｓおよびＲ３ｍｅ２ａのＨ４ペプチドについて競合アッセイを行ったところ、抗体は対称性ジメチル化ペプチドを顕著に認識した。

Claims (51)

1. 部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１ドメイン、及びアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２ドメインとを少なくとも含む単離ポリペプチド複合体であって、前記第２ドメインは、ヒストンＨ２Ａの尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能である、ポリペプチド複合体。
2. 前記第２ドメインは、アルギニン残基の対称的なＮＧ，Ｎ’Ｇジメチル化を供するアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する請求項１に記載のポリペプチド複合体。
3. 前記第２ドメインは、ヒストンＨ２Ａの尾部領域の第３位に位置するアルギニン残基（Ｈ２ＡＲ３）をメチル化可能である請求項１又は２に記載のポリペプチド複合体。
4. 前記第２ドメインは、ヒストンＨ４の尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能である請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
5. 前記第２ドメインは、ヒストンＨ４の尾部領域の第３位に位置するアルギニン残基（Ｈ４Ｒ３）をメチル化可能である請求項４に記載のポリペプチド複合体。
6. 前記アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性は、Ｐｒｍｔ５アルギニンメチルトランスフェラーゼドメイン、若しくはその誘導体又は相同体内で呈される請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
7. 前記第１ドメインは、哺乳類のゲノムＤＮＡにおける遺伝子発現の制御に関連する１以上のコンセンサス配列への結合を特異的に対象とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
8. 前記第１ドメインは、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１型コンセンサス結合部位に特異的に結合する請求項７に記載のポリペプチド複合体。
9. 前記第１ドメインは、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチド、前記ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドのＤＮＡ結合部、又はその誘導体を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
10. 部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１ドメインとアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２ドメインとを少なくとも含む単離ポリペプチドであって、前記第１ドメインは、哺乳類のゲノムＤＮＡにおける遺伝子発現の制御に関与する１以上のコンセンサス配列への結合を特異的に対象とし、前記第２ドメインは、アルギニン残基の対称的なＮＧ，Ｎ’Ｇジメチル化を供するアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
11. 前記第１ドメインは、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１型コンセンサス結合部位に特異的に結合する請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
12. 前記アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性は、Ｐｒｍｔ５アルギニンメチルトランスフェラーゼドメイン、若しくはその誘導体又は相同体内で呈される請求項１０又は１１に記載の単離ポリペプチド。
13. 哺乳類細胞におけるポリペプチド複合体の発現を誘導するのに好適な核酸発現ベクター構築体であって、
    前記ベクターは、プロモーター配列に操作可能に連結した１以上のコード配列を備え、
    ここで、前記１以上のコード配列は、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１のポリペプチドドメインとを少なくとも、そして、アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２のポリペプチドドメインを少なくともコードし、前記第１ドメインは、哺乳類のゲノムＤＮＡにおける遺伝子発現の制御に必要な１以上のコンセンサス配列への結合を特異的に対象とし、前記第２ドメインは、ポリペプチド基質内に位置するアルギニン残基の対称性ＮＧ，Ｎ’Ｇジメチル化を呈するアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有してなる発現ベクター。
14. 前記ポリペプチド基質は、ヒストンである請求項１３に記載の発現ベクター。
15. 前記第２のポリペプチドドメインは、ヒストンＨ２Ａの尾部領域の第３位に位置するアルギニン残基（Ｈ２ＡＲ３）をメチル化可能である請求項１３又は１４に記載の発現ベクター。
16. 前記第２のポリペプチドドメインはさらに、ヒストンＨ４の尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能である請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
17. 前記第２ドメインは、ヒストンＨ４の尾部領域の第３位に位置するアルギニン残基（Ｈ４Ｒ３）をメチル化可能である請求項１６に記載の発現ベクター。
18. 前記アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性は、Ｐｒｍｔ５アルギニンメチルトランスフェラーゼドメイン、若しくはその誘導体又は相同体内で備える請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
19. 前記第１ドメインは、遺伝子発現の制御に関連する哺乳類のゲノムＤＮＡにおける１以上のコンセンサス配列への結合を特異的に対象とする請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
20. 前記第１ドメインは、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１型コンセンサス結合部位に特異的に結合する請求項１９に記載の発現ベクター。
21. 前記第１ドメインは、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチド、前記ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドのＤＮＡ結合部、又はその誘導体を含む請求項２０に記載の発現ベクター。
22. 前記プロモーターは、誘導性プロモーターである請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
23. 前記プロモーターは、構成的活性化プロモーターである請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
24. 第１のコード配列が前記第１のポリペプチドドメインをコードし、第２のコード配列が前記第２のポリペプチドドメインをコードする発現カセットを含む請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
25. 前記第１のコード配列は、ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドをコードし、前記第２のコード配列は、Ｐｒｍｔ５ポリペプチドをコードする請求項２４に記載の発現ベクター。
26. 前記第１および第２のコード配列は、１個以上の介在配列によって隔てられている請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
27. 前記１以上の介在配列は、少なくとも１の内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を含む請求項２６に記載の発現ベクター。
28. 選択マーカー、抗生物質耐性マーカーおよびレポーターから選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を１以上含む請求項１３〜２７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
29. 部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する第１ドメインと、ヒストンＨ２Ａの尾部領域に位置するアルギニン残基をメチル化可能であるアルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を有する第２ドメインとを、少なくとも含むポリペプチド複合体の形成を哺乳類細胞内で誘導する工程を含む、哺乳類細胞における遺伝子発現を制御する方法。
30. 前記細胞内における前記ポリペプチド複合体の形成は、前記細胞内におけるＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチド、もしくはその相同体又は誘導体の発現の誘導によって誘導される請求項２９に記載の方法。
31. 前記細胞内における前記ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドの発現は、Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチド、もしくはその誘導体又は相同体をコードする発現ベクターを用いて前記細胞をトランスフェクトすることによって誘導される請求項３０に記載の方法。
32. 前記細胞内における前記ＰＲＤＩ／Ｂｌｉｍｐ１ポリペプチドの発現は、請求項１３〜２８のいずれか一項に記載の発現ベクターを用いて前記細胞をトランスフェクトすることによって誘導される請求項３０に記載の方法。
33. 前記哺乳類細胞は、ヒト細胞である請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記哺乳類細胞は、腫瘍性細胞又は癌性細胞である請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. インヴィトロで行う請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
36. インヴィヴォで行う請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記遺伝子発現制御の結果、ｃ−Ｍｙｃ、Ｄｈｘ３８、Ｐｃｄｈ７、Ｑ８Ｃ９Ｔ７、Ｘｙｌｔ１、ＤｎａＨ１、Ｂａｉｐ２、Ｎｅｋ７、Ｄｕｓｐ２、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７０４１、Ｓｉｒｔ４およびＢｌｉｍｐ１からなる群より選択される１以上の遺伝子の発現が制御される請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記細胞における前記ポリペプチド複合体の誘導は、請求項３７に記載の遺伝子１以上の発現を低減させる請求項３７に記載の方法。
39. 幹細胞内でのＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の形成を阻害する工程を含む、幹細胞における自己再生を促進し分化を阻害する方法。
40. 前記幹細胞は、哺乳類幹細胞である請求項３９に記載の方法。
41. 前記幹細胞は、ヒト幹細胞である請求項３９又は４０に記載の方法。
42. 前記幹細胞は、成体幹細胞、幹細胞前駆体および多能性幹細胞からなる群より選択される請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記幹細胞内におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の形成の阻害は、前記細胞を、Ｂｌｉｍｐ１阻害化合物、Ｐｒｍｔ５阻害化合物および／又はＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体阻害化合物に曝露することによって行われる請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記阻害化合物は、小分子阻害剤、Ｂｌｉｍｐ１又はＰｒｍｔ５ ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ分子、Ｂｌｉｍｐ１又はＰｒｍｔ５ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＢｌｉｍｐ１又はＰｒｍｔ５ポリペプチドのドミナントネガティブ体からなる群より選択される請求項４３に記載の方法。
45. 細胞内におけるＢｌｉｍｐ１ポリペプチドの発現を誘導し、これにより前記細胞内におけるＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｍｔ５複合体の形成を誘導する工程を含む、細胞内におけるＰｒｍｔ５の局在化を制御する方法。
46. 前記細胞は、哺乳類幹細胞である請求項４５に記載の方法。
47. 癌処置に用いる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド複合体。
48. 癌処置用の薬物の作成における請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド複合体の使用。
49. 請求項１３〜２８のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む細胞。
50. 哺乳類細胞である請求項４９に記載の細胞。
51. ヒト細胞である請求項５０に記載の細胞。

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