JP2009534342A - 血管内皮に特異的に送達するためのリポプレックス処方剤 - Google Patents

血管内皮に特異的に送達するためのリポプレックス処方剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、担体に含有される、および/または担体を含有する脂質組成物であって、少なくとも第1の脂質成分、少なくとも第1のヘルパー脂質、およびインビボ条件下において、任意で脂質組成物から除去することができる遮蔽化合物を含む組成物であり、担体を含有する脂質組成物のオスモル濃度が、約50から600mosmole/kg、好ましくは、約250〜350mosmole/kg、およびより好ましくは、約280〜320mosmole/kgであって、かつ/または、第1の脂質成分、および/または担体中のヘルパー脂質および遮蔽化合物の一方またはその両方よって形成されたリポソームの粒子サイズが、約20から200nm、好ましくは、約30から100nm、より好ましくは、約40から80nmである組成物に関する。

Description

本発明は、脂質組成物およびその使用に関する。
薬学的活性化合物の送達は、過去に既にかなりの注意を引いて来たが、細胞の中で活性であるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNA分子など、新しい治療剤の出現によって、細胞内への送達の必要性がより重要になり、これまでに様々な方策が追求されている。
siRNA治療剤の開発に向けた最初の段階において、siRNA分子の安定性は、これらの分子をヌクレアーゼによる分解から防ぐ、様々な化学的骨格修飾を取り込むことによって強化された(Chiu and Rana,2003;Czauderna et al.,2003;Morrissey et al.,2005;Soutschek et al.,2004)。例えば、両鎖に交互の2’−O−メチル修飾パターンを有する平滑末端のsiRNA分子を開発したが、それらは、非修飾のsiRNAよりも血漿由来ヌクレアーゼに対して有意に抵抗性が強く、形質転換後の哺乳動物細胞における遺伝子発現のサイレンシングを行う能力を有する(Czauderna et al.,2003)。安定性の問題に加えて、インビボにおけるsiRNA分子の機能的な送達が、依然としてsiRNA治療薬を開発する上での主な障害であり、必須の条件となっている(Uprichard,2005)。siRNAを利用した治療薬の有効で非毒性の全身への投与法は、適当な非ウイルス性の送達技術が存在しないため、未だ臨床応用するためには開発されていない。
特に、siRNAなどの細胞内活性剤の場合における良好な送達技術は、強く負に荷電したsiRNAを機能的に細胞内に取り込むこと、インビボ送達に特異的な器官および細胞型の薬力学的性質、および最後には、siRNAを処方することによる有毒な副作用の可能性を含む、いくつかの問題に対処する必要がある。これらの問題を克服するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ送達について広範に調べられた方法は、核酸の直接的化学変質法である。これらの化学的修飾法は、骨格の修飾(Morrissey et al.,2005)か、または輸送ペプチド(Muratovska and Eccles、2004;Richard et al.,2003;Shadidi and Sioud、2003;Turner et al.,2005)または疎水性残基(例えば、コレステロール(Soutschek et al.,2004))のような、取り込みを仲介する実体とのコンジュゲートである。いくつかの試薬が、マウスにおいて、siRNAの共有結合修飾に代わるものとして、siRNAの全身への静脈内投与に使用されている。正に荷電した担体、例えば、プロタミン−抗体融合タンパク質、ナノ粒子、シクロデキストリン含有ポリカチオン、PEI、およびアテロコラーゲンなどが、インビボにおいて適用するために、siRNAとのコンジュゲート形成について調べられている(Chae et al.,2004;Hu−Lieskovan et al.,2005;Landen et al.,2005;Schiffelers et al.,2004;Song et al.,2005;Takeshita et al.,2005;Urban−Klein et al.,2005)。より細胞型特異的なsiRNA送達を行うために、いくつかのグループは、細胞標的化のための受容体リガンド(Hu−Lieskovan et al.,2005)、または抗体の取り込み、または結合を行った(Song et al.,2005)。
インビトロにおける哺乳動物細胞への核酸送達には、カチオン性脂質が日常的に使用され(Felgner et al.,1987)、リポプレックス(カチオン性脂質、中性ヘルパー脂質、および核酸から構成されている)の全身静脈内投与が、インビボにおける遺伝子およびsiRNAの送達に利用されている(Barron et al.,1999;Chae et al.,2004;Chien et al.,2005;Liu et al.,2004;Morrissey et al.,2005;Nogawa et al.,2005;Yano et al.,2004)。しかし、これまでの研究のほとんどは、概念を実証するために設計され、利用されるsiRNA処方剤の薬力学的挙動および毒性である可能性についての情報を提供するものではなかった。この情報は、さらなる臨床開発をするために、具体的な送達技術を正しくリスク便益評価する上で必要なものである。例えば、生体利用能、細胞型特異的送達、およびインビボにおける薬物動態(投与経路に依存する。i.v.、皮下、経口)が、インビボにおける遺伝子サイレンシング効果を明らかにすること以外にも評価すべき重要なパラメーターである。これまでに多数の研究で、様々な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボでの性質が報告されているが、非処方siRNAまたは処方siRNAおよびインビボにおいて化学修飾されたそれらの類似体の薬力学的挙動についてはほとんど知られていない。化学修飾されたsiRNAを静脈内注射したところ、広範に組織分布したが、肝臓、空腸、および腎臓に選択的に蓄積した(Braasch et al.,2004;Soutschek et al.,2004)。別の研究では、放射性標識されたsiRNAは、PEI複合体として腹腔内投与されると、異種移植されたマウスの筋肉組織および腫瘍組織で主に検出され、肝臓および腎臓ではほとんど検出されない(Urban−Klein et al.,2005)。しかし、これらの研究は、各器官に存在する多様な細胞型への送達を区別していなかった。
本発明の基礎にある課題は、限定されないが、siRNAなどの機能的な核酸のための送達剤を提供することである。さらに、本発明の基礎にある課題は、限定されないが、siRNAなどの機能的な核酸のための送達剤を提供することによって、その送達が内皮に対して特異的、より具体的には血管内皮に対して特異的であることである。
これらおよびその他の問題は、本発明の内容によって解決される。より好ましい実施形態は、従属請求項から得ることができる。
本発明の基礎にある課題は、第1の態様において、担体に含有されるか、担体を含有する脂質組成物であって、
少なくとも第1の脂質成分、
少なくとも第1のヘルパー脂質、および
インビボ条件下において、脂質組成物から任意で除去することができる遮蔽化合物を含む組成物であって、
前記担体を含有する脂質組成物が、約50から600mosmole/kg、好ましくは、約250〜350mosmole/kg、およびより好ましくは、約280〜320mosmole/kgのオスモル濃度であり、かつ/または、
第1の脂質成分、および/または担体中のヘルパー脂質および遮蔽化合物の一方または両方よって形成されるリポソームの粒子径が約20から200nm、好ましくは、約30から100nm、より好ましくは、約40から80nmである脂質組成物によって解決される。
本発明の第1の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、PEG、HEG、ポリヒドロキシエチルスターチ(ポリHES)、およびポリプロピレンからなる群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、遮蔽化合物はPEG2000またはPEG5000である。
本発明の第1の態様の実施形態において、組成物は、さらなる構成成分および/または第2のヘルパー脂質を含む。
本発明の第1の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、PEGとセラミドのコンジュゲートである。
本発明の第1の態様の実施形態において、セラミドは、6個から10個の炭素原子、好ましくは、8個の炭素原子からなる、少なくとも1つの短鎖炭素置換基を含む。
本発明の第1の態様の実施形態において、セラミドが第1のヘルパー脂質である。
本発明の第1の態様の別の実施形態において、セラミドは第2のヘルパー脂質である。
本発明の第1の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、pH感受性リンカーまたはpH感受性成分を含む。
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、このリンカーまたは部分はアニオン性リンカーまたはアニオン性部分である。
本発明の第1の態様のより好ましい実施形態において、このアニオン性リンカーまたはアニオン性部分は酸性環境においてアニオン性が低いか中性であるが、これにより、好ましくは、そのような酸性環境はエンドソームである。
本発明の第1の態様の実施形態において、pH感受性リンカーまたはpH感受性部分は、オリゴ(グルタミン酸)、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、第1の脂質成分は、下記の化学式(I)に記載された化合物であって、
Figure 2009534342
式中、RおよびRはそれぞれ独立して、アルキルを含む基から選択され、nは1から4までの任意の整数であり、Rは、下記の化学式(II)に記載のリシル、オルニチル、2,4−ジアミノブチリル、ヒスチジル、およびアシル部分であって、
Figure 2009534342
式中、mは1から3までの任意の整数であり、NH は、任意で存在しなくてもよく、Yは薬学的に許容されるアニオンである。
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、RおよびRはそれぞれ独立して、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む基から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、Rがラウリル、およびRがミリスチル、またはRがパルミチル、およびRがオレイルである。
本発明の第1の態様の実施形態において、mは1または2である。
本発明の第1の態様の実施形態において、化合物はカチオン性脂質であり、好ましくは、アニオンYと結合している。
本発明の第1の態様の実施形態において、Yは、ハロゲン化合物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸を含む群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、化合物は、以下の群
β−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸、
Figure 2009534342
β−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸、および
Figure 2009534342
ε−アルギニル−リジン−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸
Figure 2009534342
から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、オスモル濃度は、糖によってほとんど決定されるが、この糖は、好ましくは、ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択され、より好ましくは、ショ糖、トレハロース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、組成物は、1種類または数種類の塩基性化合物を含み、このような塩基性化合物は、好ましくは、塩基性アミノ酸、および弱塩基を含む群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、このアミノ酸は、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンを含む群から選択される。
本発明の第1の態様の別の実施形態において、弱塩基は、TRISおよびエタノールアミンを含む群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、塩基性化合物は、pH調整のために提供されている。
本発明の第1の態様の実施形態において、脂質組成物は核酸を含み、このような核酸は、好ましくは、さらなる構成成分である。
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、核酸は、RNAi、siRNA、siNA、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、遮蔽化合物は核酸に結合している。
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、遮蔽化合物は、リンカー部分によって核酸に結合、好ましくは、リンカー部分によって核酸に共有結合している。
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、リンカー部分は、ssRNA、ssDNA、dsRNA、dsDNA、ペプチド、S−Sリンカー、およびpH感受性リンカーを含む群から選択される。
本発明の第1の態様の実施形態において、核酸は、RNAi、siRNA、およびsiNAを含む群から選択され、リンカーは、センス鎖の3’末端に結合している。
本発明の第1の態様の実施形態において、組成物は核酸を含み、この核酸は、リポソームとともにリポプレックスを形成する。
本発明の第1の態様の実施形態において、担体中の脂質濃度は、リポプレックスによって提供される脂質の全体量に基づいて、約0.01から100mg/ml、好ましくは約0.01から40mg/ml、およびより好ましくは約0.01から25mg/mlである。
本発明の第1の態様の実施形態において、核酸はsiRNAであり、脂質組成物のsiRNAの濃度が約0.2から0.4mg/ml、好ましくは0.28mg/mlであり、総脂質濃度が約1.5から2.7mg/ml、好ましくは2.17mg/mlである。
本発明の基礎にある課題は、第2の態様において、本発明の第1の態様に係る組成物、および任意には薬学的活性化合物、および好ましくは、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物によって解決される。
本発明の第2の態様の実施形態において、薬学的活性化合物および/または更なる構成成分は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群から選択される。
本発明の第2の態様の実施形態において、タンパク質は抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
本発明の第2の態様の実施形態において、核酸は、DNA、RNA、PNA、およびLNAを含む群から選択される。
本発明の第2の態様の実施形態において、核酸は機能的核酸であり、好ましくは、この機能的核酸は、RNAi、siRNA、siNA、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、第1のヘルパー脂質および/または第2のヘルパー脂質は、リン脂質およびステロイドを含む群から選択されるが、ただし、好ましくは、第1および/または第2のヘルパー脂質はセラミドではない。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、第1および/または第2のヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分は、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンおよび1,2?ジオレイル?sn?グリセロ?3?ホスホエタノールアミンを含む群から選択される。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、ヘルパー脂質成分の含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約20モル%から約80モル%である。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、ヘルパー脂質成分の含有量は、約35モル%から約65モル%である。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、脂質はβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸であり、ヘルパー脂質は1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンである。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、脂質は50モル%であり、ヘルパー脂質は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の50モル%である。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、組成物は、さらに第2のヘルパー脂質を含む。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、第1および/または第2のヘルパー脂質は、PEG部分、HEG部分、ポリヒドロキシエチルスターチ(ポリHES)部分、およびポリプロピレン部分を含む群から選択される基を含み、その部分が、好ましくは、約500から10000Da、より好ましくは、約2000から5000Daの分子量を提供する。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、PEG部分を含むヘルパー脂質が、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンおよび1,2−ジアルキル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、ヘルパー脂質のPEG部分が、約2,000から5,000Daの分子量、好ましくは2,000Daの分子量を有する。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、組成物は、脂質成分としてβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸を、第1のヘルパー脂質として1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンを、また第2のヘルパー脂質として1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−PEG2000を含む。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、第2のヘルパー脂質の含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約0.05モル%から4.9モル%、好ましくは、約1から2モル%である。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、組成物は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約1から10モル%、より好ましくは1から7.5モル%、および最も好ましくは1から5モル%のPEGとセラミドとのコンジュゲートを含有する。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、セラミドはC8mであり、PEGはPEG2000であり、かつ、PEGとセラミドのコンジュゲートの含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約1から5モル%である。
本発明の第1および第2の態様の別の好ましい実施形態において、セラミドはC8mであり、PEGはPEG5000であり、かつ、PEGとセラミドのコンジュゲートの含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約1から5モル%である。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、第1の脂質成分の含有量は、約42.5モル%から50モル%、第1のヘルパー脂質の含有量は、約42.5モル%から50モル%であって、第1の脂質成分、第1のヘルパー脂質、およびPEGとセラミドのコンジュゲートの含有量の合計が100モル%である。
本発明の第1および第2の態様のいずれかの実施形態において、組成物は、核酸、好ましくは、機能的な核酸、より好ましくは、二本鎖リボ核酸、および最も好ましくは、RNAi、siRNA、siNA、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群から選択される核酸であって、好ましくは、カチオン性脂質に対するRNAiのモル比は、約0から0.075、好ましくは、約0.02から0.05、およびさらにより好ましくは0.037である核酸をさらに含む。
本発明の第1および第2の態様のいずれかの実施形態において、担体は水性媒体であり、好ましくは、糖含有等張性水溶液であって、この担体に含有される脂質組成物が分散物として、好ましくは、リポソームおよび/またはリポプレックスの分散物として存在している。
本発明の第1および第2の態様のいずれかの実施形態において、脂質組成物は、約50モル%のβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸、約48から49モル%の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、および約1から2モル%の1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコールを含み、この担体は水溶液である。
本発明の基礎にある課題は、第3の態様において、リポプレックスによって解決されるが、リポプレックスは、好ましくは、本発明の第1および第2の態様のいずれかに係る組成物であるか、またはその組成物に含有され、以下を含む。
a)以下のものからなる正に荷電したリポソーム、
aa)約50モル%のβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸、好ましくは、(β−(L−アルギニル)−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸)
ab)約48から49モル%の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE)
ac)約1から2モル%の1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、N−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩;および
b)機能的核酸、好ましくはsiRNA。
本発明の第3の態様の実施形態において、リポプレックスのζ電位は約40から55mV、好ましくは約45から50mVである。
本発明の第3の態様の実施形態において、リポプレックスは、QELSによって測定すると、約80から200nm、好ましくは、約100から140nm、より好ましくは、約110nmから130nmのサイズを有する。
別の実施形態において、リポプレックスは、好ましくはQELSによって測定すると、約60nmのサイズを有する。
本発明の第1および第2の態様の実施形態において、組成物は、本発明の第3の態様に係るリポプレックスを含む。
本発明の基礎にある課題は、第4の態様において、第1および第2の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第3の態様に記載されたリポプレックスを薬剤の製造のために使用することによって解決される。
本発明の第4の態様の実施形態において、薬剤は、核酸、好ましくは機能的核酸を、内皮、好ましくは血管内皮に送達するためのものである。
本発明の第4の態様の実施形態において、薬剤は、血管形成依存性疾患を治療するためのものである。
本発明の第4の態様の実施形態において、疾患は、癌疾患、より好ましくは固形腫瘍である。
本発明の第4の態様の実施形態において、疾患は、腫瘍性疾患を含む群から選択され、より好ましくは、疾患は、骨癌、乳癌、前立腺癌、消化器官系の癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、膵臓癌、下垂体癌、精巣癌、眼窩癌(orbital cancer)、頭頸部癌、中枢神経系の癌、および呼吸器官系の癌を含む群から選択される。
本発明の第4の態様の実施形態において、薬剤は、1つまたはいくつかの他の治療法と併用して用いられる。
本発明の第4の態様の実施形態において、治療法は、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、および放射線療法を含む群から選択される。
本発明の基礎にある課題は、第5の態様において、第1および第2の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第3の態様に記載されたリポプレックスを移動剤(transferring agent)として使用することによって解決される。
本発明の第5の態様の実施形態において、移動剤は核酸を移動させ、この核酸は、好ましくは、組成物に含有される核酸であるか、この核酸は、好ましくは、リポプレックスの核酸成分である。
本発明の第5の態様の実施形態において、核酸は機能的核酸であり、好ましくはsiRNAである。
本発明の第5の態様の実施形態において、移動剤は、内皮、好ましくは血管内皮に特異的である。
本発明の第5の態様の実施形態において、移動剤は、薬学的活性成分および/または更なる構成成分を細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の中に移動させる。
本発明の基礎にある課題は、第6の態様において、薬学的活性化合物および/または更なる構成成分を、細胞内へ、または膜、好ましくは細胞膜を通過して移動させる方法であって、以下の工程を含む方法によって解決される。
細胞または膜を提供するステップと、
本発明の第1および第2の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第3の態様に記載されたリポプレックスであって、組成物が、任意で、薬学的活性化合物および/または更なる構成成分を含むものを提供する工程ステップと、
細胞または膜を、本発明の第1および第2の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第3の態様に記載されたリポプレックスに接触させるステップ。
本発明の第6の態様の実施形態において、本方法は、さらに以下のステップを含む。
細胞内および/または膜の向こう側で薬学的活性化合物および/または更なる構成成分を検出するステップ。
本発明者らは、意外にも、未修飾のsiRNA分子または非処方siRNA分子とは対照的に、siRNA−リポプレックスが血管内皮によって強力に取り込まれたことを見出した。この観察されたsiRNA−リポプレックスのインビボにおける取り込みは、ノックダウン解析によると、RNAiの有効性と相関があった。標的特異的なsiRNA−リポプレックスを反復して全身に静脈内投与すると、内皮特異的に発現される標的遺伝子のmRNAおよびタンパク質が明確にノックダウンされ、機能的取り込みおよびRNAiによるサイレンシング活性を示した。従って、本明細書に記載の脂質組成物は、特異的な送達、または内皮/内皮細胞、より特異的には、血管内皮を標的とするのに特に有用である。
更に、本発明者らは、第1の脂質成分に関して、本発明の脂質組成物があると、先行技術の脂質組成物と比較して少量の脂質により、siRNA分子との複合体を形成できることに気づいた。また、意外なことに、本発明の脂質組成物を用いると、HeLa細胞においてインターフェロン応答性のOAS−1遺伝子およびOAS−2遺伝子の発現が増加することによって示される、非特異的なインターフェロン応答性も、サイトカインであるIFN−γおよびIL−12の誘導も、本発明に従って脂質組成物を用いると観察されなかった。
最後に、本発明者らは、意外にも、本発明の脂質組成物を用いると、そのような組成物およびそれから形成されるリポプレックスの比較的特異的な取り込みだけでなく、より重要なことには、血管内皮細胞によるエンドサイトーシス取り込みの後に、エンドソームから細胞特異的な機能的送達および放出がみられることを見出した。機能的核酸(具体的にはsiRNA)などの機能的な活性因子が放出されただけで、細胞レベルでその作用を発揮できる限りにおいて、後者は非常に重要である。
この点から見て、本明細書に開示されている脂質組成物およびリポプレックスは、特に、限定ではないが、siRNAなどの機能的な核酸を送達するための薬学的処方剤として使用されると、様々な疾患のそれぞれの治療および予防に用いることができる。様々な疾患は、限定ではないが、白血病および血管形成依存性固形癌などであり、これらは、癌腫、肉腫ならびにリンパ腫のカテゴリ、ならびに、その他の新生物、例えば、骨、***、前立腺、消化器系、直腸結腸、肝臓、肺、腎臓、泌尿生殖器、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭頸部、中枢神経系、呼吸器などのそれぞれのがんおよび腫瘍などを含むが、これらに限定されない。そのような薬剤および薬学的処方剤を用いることができる更なる疾患は、脳卒中、潰瘍、アテローム性動脈硬化症、および関節リウマチであり、これらは全部、血管形成の過剰または不足を特徴としている。言い換えれば、本発明の脂質組成物およびリポプレックスはそれぞれ、血管新生を促進および抑制する療法、従って血管新生を改善または強化する薬物、または血管新生を低下させる薬物の製造に用いることができる。
さらに、この種の薬剤および薬学的処方剤はそれぞれ、他の治療法、例えば、化学療法、凍結療法、温熱療法、モノクローナル抗体療法、特にVEGF−モノクローナル抗体療法などの抗体療法、放射線療法などと併用することが可能であろう。
このような種類の薬学的処方剤、およびこのような脂質組成物およびリポプレックスをそれぞれ含む薬剤を使用して原理上治療可能な、更なる具体的な疾患は、以下のリストから選ばれることが可能である:(成人)急性リンパ芽球性白血病、(小児)急性リンパ芽球性白血病、(成人)急性骨髄性白血病、(小児)急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、(小児)副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、(小児)星状細胞腫、(小児)小脳星状細胞腫、(小児)大脳星状細胞腫、胆管癌、肝外胆管癌、膀胱癌、(小児)膀胱癌、骨癌、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、(小児)脳幹グリオーマ、(成人)脳腫瘍、(小児)脳幹グリオーマ脳腫瘍、(小児)小脳星状細胞腫脳腫瘍、(小児)大脳星状細胞腫/悪性グリオーマ脳腫瘍、(小児)上衣細胞腫脳腫瘍、(小児)髄芽腫脳腫瘍、(小児)テント上原始神経外胚葉腫脳腫瘍、(小児)視経路および視床下部膠腫、(小児)脳腫瘍、乳癌、(小児)乳癌、男性乳癌、(小児)気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、(小児)カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、消化器カルチノイド腫瘍、原発不明癌腫、中枢神経権リンパ腫、原発性中枢神経権リンパ腫、(小児)小脳星状細胞腫、(小児)大脳星状細胞腫/悪性グリオーマ、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、(小児)直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮体癌、(小児)上衣細胞腫、食道癌、(小児)食道癌、ユーイング腫瘍、(小児)頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫、眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、(小児)胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、(小児)頭蓋外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、(成人)脳幹グリオーマ、(小児)脳幹グリオーマ、(小児)大脳星状細胞腫グリオーマ、(小児)視経路および視床下部グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部癌、(成人)(原発性)肝細胞癌(肝癌)、(小児)(原発性)肝細胞癌(肝癌)、(成人)ホジキンリンパ腫、(小児)ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、(小児)視床下部および視経路グリオーマ、眼内黒色腫、(膵臓内分泌部)島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓(腎細胞)癌、(小児)腎臓癌、喉頭癌、(小児)喉頭癌、(成人)急性リンパ性白血病、(小児)急性リンパ性白血病、(成人)急性骨髄性白血病、(小児)急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、***・口蓋癌、(原発性)(成人)肝臓癌、(原発性)(小児)肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、AIDS関連性リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、(成人)ホジキンリンパ腫、(小児)ホジキンリンパ腫、(成人)非ホジキンリンパ腫、(小児)非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、マクログロブリン血症、ワンデルシュレーム骨悪性線維性組織球腫/骨肉腫、(小児)髄芽腫、(眼球)眼内黒色腫、メルケル細胞腫、悪性(成人)中皮腫、(小児)中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、(小児)多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性(成人)骨髄性白血病、急性(小児)骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、口蓋および副鼻腔の癌、上咽頭癌、(小児)上咽頭癌、神経芽細胞腫、(成人)非ホジキンリンパ腫、(小児)非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、(小児)口腔癌、口蓋癌、***および中咽頭癌、骨髄腫/悪性骨繊維性組織球腫、(小児)卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、(小児)膵臓癌、膵島細胞癌、副鼻腔・口蓋癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、(小児)松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、脳下垂体腫瘍、形質細胞腫/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳癌、妊娠期ホジキンリンパ腫、妊娠期非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞(腎臓)癌、(小児)腎細胞(腎臓)癌、腎盂および尿菅の移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、(小児)横紋筋肉腫、唾液腺癌、(小児)唾液腺癌、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、(成人)軟部組織肉腫、(小児)軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、(非メラノーマ)皮膚癌、(小児)皮膚癌、(メラノーマ)皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、(成人)軟部組織肉腫、(小児)軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性胃癌、(小児)胃癌、(小児)テント上原始神経外胚葉性腫瘍、皮膚T細胞リンパ腫、精巣癌、(小児)胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、(小児)甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛性腫瘍、腎盂および尿管の絨毛性腫瘍、尿道癌移行細胞癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路および視床下部膠腫、(小児)視路および視床下部膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍。
このような特異性を示す脂質組成物およびリポプレックスの特徴を以下に述べる。
本発明者らは、驚くべきことに、核酸、特に、RNAi、siRNA、およびsiNAなど、小型の核酸のインビボでの用途における非常に効率のよい送達を、少なくとも第1の脂質成分、少なくとも第1のヘルパー脂質、および遮蔽化合物を含む脂質組成物を利用することによって達成できることを見出した。好ましくは、第1のヘルパー脂質は、中性、すなわち電荷中性または無電荷のヘルパー脂質である。このような脂質組成物は、典型的には、担体に含有されるが、凍結乾燥状態で存在することも可能である。担体に含有される脂質組成物は、通常、分散体を形成している。より好ましくは、担体は、本明細書においても更に詳しく特徴が述べられている水性溶媒または水溶液である。脂質組成物は、一般的には、担体内でリポソームを形成するが、そのようなリポソームも、好ましくは、内部に担体を含有する。
担体内に含有される脂質組成物、および担体は、それぞれ、オスモル濃度が、好ましくは約50〜600mosmole/kg、好ましくは約250〜350mosmole/kg、およびより好ましくは約280〜320mosmole/kgである。
第1の脂質成分によって、また、任意には、第1のヘルパー脂質によって、好ましくは第1の脂質成分との組み合わせによって形成されるリポソームの粒子径は、約20〜200nm、好ましくは約30〜100nm、およびより好ましくは約40〜80nmである。
更に、粒子のサイズが一定の分布に従うものと理解される。あくまで代表的な粒子サイズの分布が図1cに示されているのであって、これは、原則として、他の平均サイズの粒子にも、すなわち、リポソームおよびリポプレックスのそれぞれにも適用可能である。
本発明に係る脂質組成物の更なる選択的な特徴は、担体のpH値が、好ましくは約4.0〜6.0であることである。しかし、他のpH範囲、例えば、4.5〜8.0、好ましくは約5.5〜7.5、およびより好ましくは約6.0〜7.0なども本発明の範囲に含まれる。
これらの具体的な特徴を実現するために、当分野において周知されているような、様々な手段をとることができる。例えば、オスモル濃度の調節するについては、糖または糖類の配合物が特に有用である。その限りにおいて、本発明の脂質組成物は、以下の糖類のうちの1つまたはいくつかを含むことができる。ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクツロース、イヌリン、およびラフィトース、ただし、ショ糖、トレハロース、イヌリン、およびラフィトースが特に好ましい。特に好ましい実施形態において、主に糖の添加によって調節されるオスモル濃度は約300mosmole/kgであり、これは270mMのショ糖溶液または280mMのグルコース溶液に相当する。好ましくは、担体は、そのような脂質組成物が投与されることになる体液と等張である。本明細書において、主に糖の添加によって調節されるオスモル濃度という用語は、オスモル濃度の少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%が、前記糖または前記糖類配合物によってもたらされることを意味する。
本発明の脂質組成物のpHを調節する場合、基本的には当業者に知られているような緩衝物質を用いて、これを行う。好ましくは、カチオン性脂質、より具体的には、カチオン性頭部基のアンモニウム基の塩基性の性質を補うのに適した塩基性物質を用いる。塩基性アミノ酸および弱塩基などの塩基性物質をそれぞれ添加するときは、上記のオスモル濃度を考慮すべきである。そのような脂質組成物およびそのような脂質組成物によって形成されるリポソームの粒子サイズは、好ましくは、動的光散乱(QELS)によって、例えば、製造業者の指示に従って、Beckman CoulterのN5サブミクロン粒子サイズ解析装置を使用することによって決定される。
脂質組成物が1個または数個の核酸を含有していれば、そのような脂質組成物は、通常、リポプレックス複合体、すなわち、リポソームおよび核酸からなる複合体を形成する。好ましくは等張性の270mMショ糖または280mMグルコース中のリポプレックスにおける総脂質含有量の、より好ましい濃度は、約0.01〜100mg/ml、好ましくは0.01〜40mg/ml、より好ましくは0.01〜25mg/mlである。この濃度は、適当な保存液を調製するために、一般的には、2〜3倍まで上げることができると理解されるべきである。このことに基づいて、オスモル濃度が上記で規定された範囲内になるように希釈液を調製することも、本発明の範囲に含まれる。より好ましくは、この希釈液は、脂質組成物に関して使用された担体、またはその中に脂質組成物が含まれている担体と同一であるか、または機能の点から見て、より具体的には、オスモル濃度の点から見て類似している担体中で調製される。脂質が核酸、より好ましくは、限定ではないが、siRNAなどの機能的核酸を含む、本発明の脂質組成物の実施形態において、脂質組成物中のsiRNAの濃度は、約0.2〜0.4mg/ml、好ましくは0.28mg/mlであり、総脂質濃度は約1.5〜2.7mg/ml、好ましくは2.17mg/mlである。核酸画分と脂質画分の間のこの質量比が、それによって実現される電荷比に関しても、特に好ましいと理解されるべきである。本発明の脂質組成物の更なる濃度もしくは希釈度に関しては、そのような濃度もしくは希釈度にかかわらず、この具体的な実施形態において実現される質量比および電荷比のそれぞれが、維持されることが好ましい。
例えば、薬学的組成物において用いられる、このような濃度は、適量の媒体、好ましくは生理学的に許容される緩衝液、または本明細書に記載されているいずれかの担体中に脂質を分散させることによってか、あるいは、適当な手段で濃縮することによって得ることができる。そのような適当な手段は、例えば、クロスフロー限外濾過法などの限外濾過法である。濾過膜の細孔幅は、約1,000〜300,000Daの分画分子量(MWCO)または5nm〜1μmである。特に好ましいのは、約10,000〜100,000DaMWCOの細孔幅である。脂質組成物、より具体的には、本発明に係るリポプレックスが、凍結乾燥状態で存在し得ることを、当業者は理解する。このような凍結乾燥状態は、典型的には、リポプレックスの保存期間を延ばすのに適している。特に、適当なオスモル濃度をもたらすために添加された糖が、それに関しては、抗凍結剤として用いられる。それに関して、前記したオスモル濃度、pH、およびリポプレックス濃度の特徴は、担体中で溶解、懸濁または分散している脂質組成物の状態を指すが、そのような担体は、原則として、本明細書に記載されている担体のいずれかであって、典型的には、水または生理学的に許容される緩衝液、好ましくは等張性緩衝液もしくは等張液などの水性担体である。
遮蔽化合物によって、インビボにおける循環時間が延長され、その結果、核酸を含有する脂質組成物の生体内分布が改善される。このような機序によって、静脈内投与を行う場合、脂質組成物は、通常は脈菅系の内壁である、注射部位の周りの組織によって直ちに分解されないため、そのような脂質組成物の投与部位から比較的離れている、ヒトまたは動物の体内の部位、より具体的には、哺乳動物の体内の部位を標的化することが可能である。本明細書で用いられるとき、遮蔽化合物とは、好ましくは、脂質組成物が、血清化合物、または他の体液の化合物、または、好ましくは、脂質組成物が好ましく投与される血菅系内壁の細胞質膜の化合物と直ちに相互作用するのを防止する化合物である。遮蔽という用語は、そのような脂質組成物が投与された身体の免疫系またはその他の防御機構もしくは除去機構の要素が、脂質組成物と直ちに相互作用せずに、生体内における循環時間を再度延長することを意味する。この限りにおいて、遮蔽化合物は、抗オプソニン化化合物として作用する。いかなる機構または理論に拘泥しようとするものではないが、遮蔽化合物は、外部環境との相互作用に利用可能な、脂質組成物の表面積を減少させる被覆または被膜を形成し、それを形成しなければ、そのような相互作用が起こるのには早すぎる時期に他の脂質と融合したり、人体もしくは動物の体のそれぞれの因子が結合してきたりする脂質組成物にしてしまうと思われる。ただし、より後期(すなわち、脂質組成物を投与してから長時間経過後)には、リポソームおよびリポプレックスのペイロードが送達されるためには、このような相互作用は、少なくとも一定の程度までは好ましい、または望ましいと理解しなければならない。遮蔽化合物の観察された有効性に依拠していると考えられる別の機序は、脂質化合物、特に、核酸、好ましくは、本明細書に規定されているような機能的核酸、より好ましくは、siRNA、siNA、およびRNAiを含有する脂質化合物の総電荷の遮蔽である。ここでも、脂質化合物の相互作用が影響を受けるが、この効果は、脂質成分の遮断ではなく、電荷の遮断から生じると思われる。本開示に関しては、組成物は、1種類の脂質しか含むことができないと理解されるべきである。
遮蔽化合物は、好ましくは、生物学的に不活性な化合物である。より好ましくは、遮蔽化合物は、その表面上、またはその分子自体にも電荷をもたない。従って、特に好ましい遮蔽化合物は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルグルコースベースのポリマー、ポリヒドロキシエチルスターチ(polyHES)、およびポリプロピレンであるが、該化合物のいずれも、好ましくは約500〜10000Da、より好ましくは約2000〜5000Daの分子量を有する。
インビボ条件下で、好ましくは、遮蔽化合物を脂質組成物から除去できるということは、本発明の重要な特徴である。このような除去は、一つの実施形態では、遮蔽化合物自体を除去することを含むことができるが、異なった実施形態では、遮蔽化合物が、好ましくは共有結合している化合物とともに遮蔽化合物を除去することも含むことができる。このような除去によって、脂質組成物のその他の成分、またはそれらの一部が、動物の体または人体などの環境に曝露され、最終的には、脂質組成物に含まれた核酸などの化合物の放出および送達がそれぞれ可能となる。インビボ条件という用語は、好ましくは、動物、より好ましくは哺乳動物の体、または人体の中、好ましくは、血液、溶液、間質、および細胞内液などの体液中に存在する状況、ならびに/またはエンドソームおよび/もしくはリソソーム中に存在する状況を意味する。遮蔽化合物の設計に応じて、以下でより詳しく説明されるような様々な方法で、除去が影響を受けることがあるかもしれない。
遮蔽剤が失われることから生じる更なる効果は、特に、遮蔽剤がPEGである場合には、PEGを有する脂質処方剤を提供する (PEG化とも呼ばれる) ことで、そのような脂質処方剤によって細胞質に送達されるべき核酸分子の機能的な送達がしばしば損なわれる結果になるという事実によるものである。脂質処方剤にPEGが大量に存在すると、典型的には脂質処方剤によって形成されるリポソームのエンドソームへの取り込みが損なわれるか、または、脂質化合物に含有されているか、それに結合している核酸が、必要なエンドソーム脱出を妨害する。
一つの実施形態において、遮蔽化合物は、セラミドに結合、好ましくは、共有結合している、PEG、HEG、ポリヒドロキシエチルスターチ(ポリHES)、およびポリプロピレンからなる群から選択される。セラミドは、脂質化合物と相互作用し、存在すれば、ヘルパー脂質と相互作用する。その限りにおいて、セラミドは、第1のヘルパー脂質であっても、第2のヘルパー脂質であってもよい。PEGに結合したセラミドは、第1のヘルパー脂質とは異なっていることが好ましい。セラミドは、一般的に、好ましくは、第1の脂質成分および第1のヘルパー脂質によって形成された脂質組成物の脂質画分に埋め込まれ、比較的短い炭化水素鎖によって、一定の速度で放出される。セラミドが脂質組成物からこのように放出されると、遮蔽剤も同様に放出される。従って、この実施形態では、インビトロ条件によって脂質処方剤の分解が可能になり、それによって、脂質組成物のインビボにおける寿命または循環時間が延長される。
更なる実施形態において、遮蔽剤は、脂質組成物に含有されるか、それに結合している核酸に結合している。好ましくは、遮蔽剤は、核酸に共有結合し、最も好ましくはリンカーを介して共有結合している。より好ましい実施形態において、リンカーは、生理学的条件下、すなわち、動物またはヒトの体内に広く存在する状況下で切断されるように設計されている。好ましい実施形態において、一定の割合の核酸のみが、リンカーを介して、そのような多量体を実際に備える。いかなる理論にも拘泥するものではないが、該脂質組成物に遮蔽効果をもたらすためには、脂質組成物の一部を形成する一定の数の核酸分子だけがそのような巨大成分を持てば十分である。好ましくは、核酸分子の部分は約0〜20%、より好ましくは3〜10%、さらに好ましくは6〜10%の範囲内にある。遮蔽剤を有する核酸(本明細書において遮蔽化合物とも呼ばれている)の好ましい含有量は、約0〜3%、3〜6%、6〜10%および10〜20%であるが、本段落において、および本出願全体を通して使用されている%は、特に明記しない限り、モル%である。
このようなリンカーは一本鎖RNAリンカーであってもよく、より好ましくは、インビボの状態において、もしくはインビボ条件下で存在するRNAエンドヌクレアーゼ活性によって切断される1〜20個のヌクレオチドを含む一本鎖RNAリンカーであってもよい。更なる実施形態において、このリンカーは、インビボ状態において、もしくはインビボ条件下でも存在するDNAエンドヌクレアーゼによって切断される一本鎖DNAリンカーによって形成されている。更なる実施形態において、このリンカーは、二本鎖RNAまたは二本鎖DNAによって形成させることができる。核酸からなるリンカーの安定性は、一般的には以下の通りである。ssRNA<dsRNA<ssDNA<<dsDNA。このように安定性が多様であるため、それぞれが、前記リンカーを含む、そのようにして改変された核酸および脂質組成物の残留時間を特異的に設計すること可能になる。
更なる実施形態において、リンカーは、インビボの状態もしくはインビボ条件下で存在するプロテアーゼによって切断されるオリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質によって形成されることができる。更なる実施形態によって、酸化還元状態に感受性が高いS−S結合を含むリンカーが提供される。
更なる実施形態において、リンカーはpH感受性リンカーである。pH感受性リンカーという概念は、脂質組成物(原則としてリポプレックスまたはリポソームのいずれかであり得る)の取り込みにおいて、遮蔽剤(取り込まれる前の脂質組成物の保護に取りかかる場合には明らかに有益である)が、細胞内に輸送された化合物の更なる使用に制限を加えるという観察結果によるものである。本明細書において、遮蔽剤は、好ましい実施形態においてアニオン性部分であるか、またはこれを含む、pH感受性リンカーと結合している。エンドソームなどの酸性環境においては、このようなアニオン性部分の電荷が変化する。それによって、静電学に基づいた、脂質処方剤に含まれたカチオン性脂質とのpH感受性リンカーの相互作用も変化するが、通常は低下し、その結果、pH感受性リンカーが、程度の差はあるが、脂質処方剤を含むカチオン性脂質から徐々に放出される。その結果、リポソームまたはリポプレックスは遮蔽剤を失って、その影響を細胞の外および/または中に及ぼすことができる。この種のリンカーは、当分野において知られているようなリンカー、およびこの種の新規のリンカー、すなわち、この種の特徴を有する新規のリンカーを含む。好ましくは、そのようなリンカーは、リンカーが上述のように反応することを可能にする電荷特性を有するリンカーである。そのようなpH感受性リンカーの代表的なものは、オリゴ(グルタミン酸)、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸などを含む。そのようなリンカーを遮蔽剤に結合させること、およびそのようなリンカーを、一般に遮蔽剤の部分と言われている遮蔽剤に取り込ませることは、両方とも当業者に知られている。
本明細書において本発明に係る化合物とも称される、本発明に係る脂質組成物の第1の脂質成分として用いられる化合物は、図1に示されているように、R1−N−R2部分によって形成された親油基、C(O)−CH(NH )(CH−NH成分によって形成されたリンカー基、およびR3成分によって形成された頭部基を含むものと見なすことができる。本発明者らは、驚いたことに、リンカー基において正電荷を示す、この種の化合物が、細胞膜全面に、より好ましくは細胞内に、より好ましくは動物細胞内に生物活性化合物を移動させるのに特に適していることを見出した。また、本発明者らは、驚いたことに、生物活性化合物が、核酸、好ましくはsiRNAおよびsiNAである場合には、本発明に係る化合物によって仲介される移動が特に効率的であることを見出した。
本明細書において好ましく使用されている、アルキルという用語は、8〜20個の炭素原子、好ましくは、12〜18個の炭素原子を含有する飽和型脂肪族置換基、または8〜30個の炭素原子を含有し、少なくとも1つの二重結合または三重結合をそれぞれ含む、一価もしくは多価の不飽和型脂肪族置換基を意味する。従って、好ましい実施形態において、アルキルという用語はアルケニルまたはアルキニル(alkinyl)も含む。アルキルは、分岐型および非分岐型、すなわち、非線形型または直鎖型のアルキル基を意味する。好ましい直鎖型アルキル基は、8〜30個の炭素原子を含む。より好ましいアルキル基は、12〜18個の炭素原子を含む。好ましい分岐型アルキル基は、8〜30個の炭素原子を含むが、8〜30個の炭素原子という数は、そのような分岐型アルキル基の骨格を形成している炭素原子の数を意味する。分岐型アルキル基の骨格は、骨格から分岐している、少なくとも1つのアルキル基を含むが、このアルキル基は、本明細書において定義されているアルキル基であり、より好ましくは、短鎖アルキル基を含むアルキル基であり、より好ましくは1〜6個、更に好ましくは1〜3個、および最も好ましくは1個の炭素原子を含む。より好ましいのは、骨格に12〜18個の炭素原子を含む分岐型アルキル基で、その分岐アルキル基が上記で定義されているものである。特に好ましいアルキル基はフィタニル基である。
別の実施形態において、アルキルは、上記に定義されている不飽和型の分岐型アルキル基または非分岐型アルキル基である。より好ましくは、そのような不飽和型脂肪族炭化水素置換基が1つ、2つ、または3つ、または4つの二重結合を含むが、二重結合を1つ有する遊離基が特に好ましい。最も好ましいものは、C18:Idelta9、すなわち、18個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素であって、9位に、9番炭素原子を10番炭素原子に結びつける一重結合ではなく、cis型二重結合が示されているオレイル基である。
本明細書において、nは1から4の間の任意の整数であって、nが1、2、3、および4であり得ることを意味する。本明細書において、mは1から3の間の任意の整数であって、mが1、2、および3であり得ることを意味する。
本発明に係る化合物は、好ましくはカチオン性脂質であると理解されるべきである。より好ましくは、本発明に係る化合物に存在するNH基またはNH基はどちらも、プロトン化型として存在する。典型的には、本発明に係る化合物の正電荷は、アニオンの存在によって相殺される。そのようなアニオンは、一価アニオンまたは多価アニオンであってもよい。好ましいアニオンは、ハロゲン化物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸である。本明細書におけるハロゲン化物は、好ましくはフッ化物、塩化物、ヨウ化物、および臭化物である。塩化物が最も好ましい。カチオン性脂質が、細胞内に移動する前の生物活性化合物に結合すると、ハロゲン化物のアニオンが、1個または数個の負電荷を好ましくは示す生物活性化合物によって置換される。ただし、生物活性化合物の全電荷は負であるとは限らないと認識されるべきである。
化学式(I)に記載された任意の化合物は、少なくとも2つの不斉炭素原子を含むと認認されるべきである。本明細書に記載された、そのような化合物のあらゆる可能な鏡像異性体、すなわち、特にR−R;S−S;R−SおよびS−Rという鏡像異性体が本明細書に開示されていることも、本発明の範囲に含まれる。
本発明に係る化合物は、組成物を形成したり、組成物の一部となったりすることができ、そのような組成物は担体を含む。本明細書において脂質組成物とも言われる、そのような組成物において、本発明に係る化合物も脂質成分を指す。そのような担体は、好ましくは液体担体である。好ましい液体担体は、水性担体または非水性担体である。好ましい水性担体は、水、水性緩衝系、より好ましくは、生理学的緩衝強度および生理食塩濃度を有する緩衝系である。好ましい非水性担体は、溶媒、好ましくは、エタノール、およびtert−ブタノールなどの有機溶媒である。いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、原則として、任意の水混和性有機溶媒も利用することができる。従って、組成物、より具体的には脂質組成物は、このようにリポソームとして存在したり、リポソームを形成したりすることができるものと認識されるべきである。本発明の脂質組成物に関して規定されているオスモル濃度およびpH、ならびにリポプレックス濃度は、それぞれ、脂質組成物およびリポプレックス、ならびに前記担体を含む系を意味することも、本発明の範囲に含まれる。
本発明に係る組成物は、本明細書においてヘルパー脂質成分とも呼ばれているヘルパー脂質を1つ以上含むことができる。ヘルパー脂質成分は、好ましくは、リン脂質およびステロイドからなる群から選択される。リン脂質は、好ましくは、リン酸ジエステルおよびリン酸モノエステルである。リン脂質の好ましいメンバーはホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質である。本明細書において、ステロイドは、部分的に水素化したシクロペンタ[a]フェナントレンに基づく天然化合物および合成化合物である。好ましくは、ステロイドは21〜30個の炭素原子を含有する。特に好ましいステロイドはコレステロールである。
特に好ましいヘルパー脂質は、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE)および1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)である。
本発明に係る特に好ましい組成物は、DPhyPEと一緒に、β−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸[♯6]、β−アルギニル−2,3−ジアモノプロピオン酸−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸[♯11]またはε−アルギニル−リジン−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸[♯15]のいずれかを含み、DPhyPEの含有量が、約90〜20モル%、好ましくは、80モル%、65モル%、50モル%、および35モル%である。ただし、モル%という用語は、組成物の総脂質含有量、すなわち、本発明に係るカチオン性脂質、および任意のヘルパー脂質など、別の任意の脂質を含むがこれらに限定されない、組成物の脂質含有量の百分率を意味する。
本発明に係る組成物が、好ましくは、本発明に係る化合物および/または本明細書に開示されているヘルパー脂質のうちの1つもしくはいくつかを含み、本発明に係る化合物、すなわち、カチオン性脂質、および/またはヘルパー脂質成分が、水性媒体中に分散物として存在していることは、本発明の範囲に含まれる。あるいは、本発明に係る化合物、すなわち、カチオン性脂質、および/またはヘルパー脂質成分は、水混和性溶媒中で溶液として存在している。水性媒体として、好ましくは、本明細書に開示されている水性担体のいずれかを使用する。好ましい水混和性溶媒は、任意の比率で水と均質相を形成する任意の溶媒である。好ましい溶媒はエタノールおよびtert−ブタノールである。組成物、より具体的には、脂質組成物は、このように、リポソームとして存在しているか、リポソームを形成することができると認識されるべきである。
本発明に係る組成物は、その様々な実施形態において、薬学的組成物として用い、かつ用いることができると認められるべきである。後者の場合、薬学的組成物は、薬学的活性化合物、および任意で、薬学的に許容される担体を含む。このような薬学的に許容される担体は、好ましくは、本発明に係る組成物に関して本明細書において定義されている担体の群から選択することができる。本明細書に記載されている組成物はいずれも、その成分およびその任意の組み合わせが薬学的に許容されれば、原則として、薬学的組成物としても使用することができることが当業者によって理解される。薬学的組成物は薬学的活性化合物を含む。そのような薬学的活性化合物は、好ましくは、任意の生物学的活性化合物、より好ましくは、本明細書に開示されている任意の生物活性化合物である、本発明に係る組成物の更なる構成成分と同じものであり得る。更なる構成成分、薬学的活性化合物、および/または生物活性化合物は、好ましくは、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される。
好ましくは、そのような生物活性化合物はいずれも、負に荷電した分子である。本発明者らは、いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、負に荷電した分子という用語は、本発明に係るカチオン性脂質の正荷電を有する基とイオン対合することができる、少なくとも1つの負に電荷した基を有する分子を含むことを意味する。原則として、リンカー部分における正電荷も、リンカーそれ自体、またはカチオン性脂質と負に荷電した分子、すなわち、生物活性化合物との間で形成される複合体のいずれかの全体的な構造にいくらかの影響を与えるかもしれない。その一方で、Xu Y,Szoka FC Jr.;Biochemistry;1996 May 07,35(18):5616−23によって教示されているように、本発明に係る脂質に導入された更なる正荷電は、米国特許第6,395,713号に開示されているカチオン性脂質と比較して、この脂質の毒性を強めるのに寄与するはずである。当業者がこの先行技術文書から期待したものとは対照的に、本発明に係る化合物は、本明細書において開示されている様々な目的に特に適し、特に、毒性を欠いているか、または毒性を増加させない。
本明細書において好ましく使用されるペプチドは、好ましくは、ペプチド結合を介して、相互に共有結合している、少なくとも2個のアミノ酸からなる任意のポリマーである。より好ましくは、ペプチドは2個から10個のアミノ酸からなる。このペプチドの特に好ましい実施形態は、更に一層好ましくは、約10個〜約100個のアミノ酸を含むオリゴペプチドである。本明細書において、好ましく使用されるタンパク質は、相互に共有結合している複数のアミノ酸からなるポリマーである。好ましくは、そのようなタンパク質は、少なくとも約100個のアミノ酸またはアミノ酸残基を含む。
本発明に係るカチオン性脂質および組成物に関して使用することができる好ましいタンパク質は、任意の抗体、好ましくは任意のモノクローナル抗体である。
特に好ましい生物活性化合物、すなわち、薬学的活性化合物、および本発明に係る組成物に関連して使用される更なる構成成分は核酸である。そのような核酸は、DNA、RNA、PNA、またはそれらの任意の混合物であってもよい。より好ましくは、核酸は機能的な核酸である。本明細書において好ましく用いられているような機能的核酸は、ペプチドおよびタンパク質をコードしていない核酸である。好ましい機能的核酸は、siRNA、siNA、RNAi、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびスピーゲルマーであり、これらはすべて当分野において公知である。
siRNAは、例えば、国際特許出願第PCT/EP03/08666号に記載されている低分子の干渉RNAである。典型的には、これらの分子は、相互に塩基対形成している、すなわち、典型的にはワトソン−クリック塩基対によって、本質的に相互に相補的である15〜25個、好ましくは、18〜23個の間のヌクレオチド対を含む二本鎖RNA構造物からなる。この二本鎖RNA分子の一方の鎖は標的核酸、好ましくは、mRNAと本質的に相補的であるのに対し、該二本鎖RNA分子のもう一方の鎖は該標的核酸の鎖と本質的に同一である。siRNA分子は、両側および両鎖のそれぞれに、必ずしも塩基対合する必要のない、いくつかの付加的なオリゴヌクレオチドが配置されていてもよい。
RNAiは、siRNAと本質的に同じ設計を有するが、これらの分子はsiRNAと比較して有意に長い。RNAi分子は、典型的に、50個以上のヌクレオチドおよび塩基対をそれぞれ含む。
siRNAおよびRNAiと同じ作用様式に基づいて活性である、更なる種類の機能的核酸がsiNAである。siNAは、例えば、国際特許出願PCT/EP03/074654に記載されている。より具体的には、siNAはsiRNAに対応しているが、siNAは、リボヌクレオチドを全く含まない。
本明細書において好ましく使用されているアンチセンス核酸は、標的RNA、好ましくはmRNAとの塩基相補性に基づいてハイブリダイズして、RNaseHを活性化させるオリゴヌクレオチドである。RNaseHは、リン酸ジエステルおよびリン酸チオエートに結合したDNAによって活性化される。しかし、リン酸ジエステルに結合したDNAで、リン酸チオエートに結合したDNA以外のものは、細胞内ヌクレアーゼによって急速に分解される。このように、アンチセンスポリヌクレオチドは、DNA−RNAハイブリッド複合体としてのみ効果的である。アンチセンス核酸の好ましい長さは、16〜23ヌクレオチドの範囲である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、特に、米国特許第5,849,902号および第5,989,912号に記載されている。
機能的核酸の更なる群が、基本的に2つの成分を含むRNAからなる、好ましくは、触媒活性を有する核酸であるリボザイムである。第1の成分は触媒活性を示すが、第2の成分は標的核酸との特異性相互作用に関与する。典型的には、ハイブリダイズする2本の鎖上にある本質的に相補的な塩基鎖のハイブリダイゼーションおよびワトソン−クリック塩基対形成によって、標的核酸とリボザイムの第2の成分が相互作用すると、触媒活性を有する成分が活性化する可能性があるが、これは、リボザイムの触媒活性がホスホジエルテル活性であるならば、そのような成分が標的核酸を分子内または分子間で切断することを意味する。リボザイム、その使用法および設計原理は当業者に公知であり、例えば、DohertyおよびDoudna(Annu.Ref.Biophys.Biomolstruct.2000;30:457−75)に記載されている。
機能的核酸の更なる群がアプタマーである。アプタマーは、一本鎖型または二本鎖型いずれかのD型核酸であって、標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの製造または選択は、例えば、欧州特許EP0533838号に記載されている。RNAi,siRNA、siNA、アンチセンスヌクレオチド、およびリボザイムとは対照的に、アプタマーは、標的mRNAを全く分解しないが、タンパク質などの標的化合物の二次構造物または三次構造物と特異的に相互作用する。標的と相互作用すると、標的は、典型的には、その生物活性に変化を示す。アプタマーの長さは、典型的には、わずか15ヌクレオチドから80ヌクレオチドにも及び、好ましくは、約20ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲にある。
機能的核酸の別のグループが、例えば、国際特許出願第WO98/08856号に記載されているスピーゲルマーである。スピーゲルマーは、アプタマーに類似した分子である。しかし、スピーゲルマーはアプタマーとは対照的に、全部または大部分が、D型ヌクレオチドではなくL型ヌクレオチドからなる。それ以外では、特にスピーゲルマーの可能な長さについては、アプタマーに関して概説したことがスピーゲルマーに適用される。
前述したように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明に係る化合物、および該化合物を含む各々の組成物が、RNAi、より具体的には、siRNAおよびsiNAを血管内皮細胞の中に移動させるのに特に有効となり得ることを見出した。いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、ヘルパー脂質が、PEG非含有ヘルパー脂質であっても、あるいは、特定の実施形態においては、PEG含有ヘルパー脂質であってもよいが、本発明に係る脂質組成物に含有されるヘルパー脂質の特定のモル百分率のために、より具体的には、この種のヘルパー脂質のいずれかの含有量が、本明細書に規定されている濃度範囲内に含有されれば、驚くべき効果を実現することができることに注目すべきである。このことに関して、本発明に係る脂質組成物が、PEG部分を含むヘルパー脂質を含有する場合には、そのようなPEG由来ヘルパー脂質含有組成物を用いた送達もしくは形質転換の作用が、核酸、具体的にはRNAi分子、最も具体的には、siRNA、siNA、アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムを送達する上で有効であることが特に注目される。
この理由は、本発明者らが、驚くべきことに、少なくとも第1の脂質成分、および少なくとも第1のヘルパー脂質によって形成され、約4%以上のPEG含有ヘルパー脂質を含有するリポソームは活性がないが、4%未満(好ましくは0%以上3%未満)を含むリポソームは機能的な送達を媒介するが、ただし、ある程度の送達は、原理上、このような限界を超えても観察されることを見出した。基本的には、本発明者らによって、本発明に係る脂質組成物中の特定量のPEGが、内皮細胞の効率的な形質転換および内皮細胞への送達を行うのに適していることが発見された。
更なる態様において、本発明者らは、驚くべきことに、好ましくはリポプレックスまたはリポソームとして存在する、本発明に係る脂質組成物が、好ましくは、全体的にカチオン性電荷を示し、少なくとも1つの余分な正電荷を示すことを見出した。より好ましくは、脂質組成物では、負:正の形の電荷比が約1:1.3〜1:5であることを示す。従って、本発明は、更なる態様において、負:正の形の電荷比が約1:1.3〜1:5である、少なくとも1つのカチオン性脂質および1つの核酸、また、好ましくはRNAi、siRNA、またはsiNA、もしくは本明細書に定義されているその他の機能的核酸のいずれかを含む任意の脂質組成物に関係している。カチオン性脂質は、好ましくは、本明細書に記載されているカチオン性脂質である。脂質組成物は、好ましい実施形態においては、本明細書に記載されているヘルパー脂質またはヘルパー脂質を組み合わせたものを含む。
また、本発明者らは、特に、核酸含有脂質処方剤の全体的なカチオン性電荷に関連して上記した内容に鑑みて、特に、siRNAおよびカチオン性脂質のモル比が、本発明に係る脂質組成物の適用の成功に不可欠であるかもしれないことも見出した。いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、1モルのカチオン性脂質で、特に、本明細書に開示されているものは、1分子あたり最大3つの正の電荷を生じさせることができるが、一方で、核酸、より具体的には、本明細書に開示されているsiRNA分子は、1分子あたり最大40個の負の電荷を生じる。本発明に係るsiRNA含有脂質処方剤を全体的に正に荷電させるためには、モル比が、好ましくは、0から最大0.075の範囲にわたることができる。好ましいモル比の範囲は約0.02〜0.05であり、さらに好ましくは、約0.037である。本発明の組成物およびリポプレックスのそれぞれの更なる実施形態において、siRNAの重量に対する全脂質の重量比は、典型的には、2:1〜1000:1(m/m)であるが、ただし、5:1〜15:1(m/m)の比が好ましく、6:1〜9:1(m/m)の比が更に好ましい。
組成物、より具体的には、本発明に係る組成物が、薬学的活性化合物として、および更なる構成成分としてそれぞれ、本発明に係る組成物に含まれ得る前記の生物活性化合物の1つ以上を含有し得るということは、本発明の範囲内にあることである。これらの化合物の任意のものを、原則として、薬学的化合物として使用できることが、当業者には理解できる。このような薬学的化合物は、典型的には、疾患の病理学的機序に関与する標的分子に向けられたものである。様々な生物活性化合物、従って、本発明の態様に関連して使用される薬学的活性化合物の基礎にある一般的な設計原理および作用様式のために、事実上いかなる標的も対象とすることができる。従って、本発明に係る化合物およびこれを含有するそれぞれの組成物は、この種の生物活性化合物を用いて処置、予防および/または治療することができる疾患または病態を治療または予防するために使用することができる。これらの生物活性化合物以外に、その他の生物活性化合物も、本発明の任意の実施形態に係る組成物の一部となり得る。好ましくは、そのような他の生物学的活性化合物は、好ましくは、そのような他の生物活性化合物が、本発明に係る化合物、より好ましくは、カチオン性脂質として存在する本発明に係る化合物と相互作用するか、複合体を形成する条件下で、少なくとも1つの負荷電を含む。
本明細書において、生物活性化合物は、好ましくは、生物学的に活性があり、好ましくは、何らかの生物学的、化学的、および/または物理的な効果を生体系に対して示す任意の化合物である。このような生体系は、好ましくは、任意の生化学反応、任意の細胞、好ましくは、任意の動物細胞、より好ましくは、任意の脊椎動物細胞、最も好ましくは、任意の哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない、任意のヒト細胞、任意の組織、任意の器官、および任意の生物などである。このような任意の生物、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、およびヒトからなる群から選択される。
本発明に係る組成物のいずれか、より具体的には、本発明に係る薬学的組成物のいずれかは、さらに何らかの薬学的活性化合物を含むことができるということも、本発明の範囲内にある。
組成物、具体的には、本発明に係る薬学的組成物は、様々な形の投与法に使用することができるが、局所投与および全身投与が特に好ましい。さらに好ましいのは、筋肉内、経皮、皮下、静脈内および肺内投与からなる群から選択される投与経路である。本明細書において好ましく使用される、局所投与とは、組成物および生物活性化合物のそれぞれを投与すべき細胞、組織、および器官のそれぞれと空間的に近接した関係で、それぞれの組成物を投与することを意味する。本明細書において、全身投与とは、局所投与とは異なった投与法であって、より好ましくは、血液および溶液など、それぞれの体液の中に投与し、それによって、体液が、その組成物および生物活性化合物がそれぞれ送達されるべき細胞、組織、および器官に組成物を輸送する。しかし、器官移植の場合のようなエクスビボ投与も、本発明に含まれる。
本明細書において、本発明に係る化合物および組成物のそれぞれによって生物活性化合物が移動して行く細胞膜に沿った細胞は、好ましくは、真核生物細胞、より好ましくは、脊椎動物細胞、さらに好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましい細胞はヒト細胞である。いずれの場合も、当該細胞は内皮細胞である。
本発明に係る化合物および組成物をそれぞれ用いて製造することができる任意の薬剤は、それぞれ、患者における疾患を治療および予防するためのものである。好ましくは、そのような患者は脊椎動物であり、より好ましくは、哺乳動物であり、さらに好ましくは、そのような哺乳動物はマウス、ラット、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、およびヒトである。さらなる態様において、本発明に係る化合物および組成物は、移動剤として使用することができ、より好ましくは、形質転換剤として使用することができる。
本明細書において好ましく使用される移動剤は、本明細書において前述されているように、膜、好ましくは、細胞膜を通して化合物、より好ましくは、薬学的活性化合物のような生物学的活性化合物を移動させる、より好ましく、細胞内にそのような化合物を移動させるのに適した任意の薬である。更に好ましくは、そのような移動は、エンドソームおよび/またはリソソームからの放出も含む。好ましい実施形態において、細胞膜という用語は、小胞膜、エンドソームおよびリソソームの膜など、細胞内部にある膜も含む。
更なる態様において、本発明は、生物活性化合物によって細胞を移動させる、より具体的には、形質転換する方法に関係している。工程の順序は必ずしも限定されず、具体的には、以下に概説する工程順序に限定されないが、第1のステップにおいて、細胞および細胞膜がそれぞれ提供される。第2のステップにおいて、本発明に係る化合物もしくは組成物、および薬学的活性化合物などの生物活性化合物が提供される。この反応は、細胞および膜をそれぞれ接触させることができ、本発明に係る化合物および組成物の生物物理学的特性のために、生物学的活性化合物は、膜の片側から反対側に、あるいは膜が細胞を形成する場合は、細胞の外側から内側に移動する。細胞および膜をそれぞれ接触させる前に、生物活性化合物、および本発明に係る化合物もしくは組成物を接触させると、好ましくは、複合体が形成され、そのような複合体を細胞および膜のそれぞれと接触させることは、本発明の範囲に含まれる。
本発明の更なる態様において、生物活性化合物および薬学的活性化合物それぞれを移動させる方法は、細胞および膜のそれぞれを提供するステップ、本発明に係る組成物を提供するステップ、および組成物および細胞ならびに膜をそれぞれ接触させるステップを含む。細胞および膜のそれぞれを接触させる前またはその過程で、組成物を形成させることができることは、本発明の範囲に含まれる。
本明細書に開示されている生物活性化合物を移動させる任意の方法の実施形態において、この方法は、さらなるステップ、好ましくは、生物活性化合物が移動したか否かを検出するステップを含むことができる。そのような検出反応は、本方法に従って移動させられる生物活性化合物の種類に強く依存し、当業者には容易に明白である。本明細書に記載されている細胞、組織、器官、および生物に、そのような方法を実施することは、本発明の範囲に含まれる。
更なる実施形態において、遮蔽剤は、本明細書に記載した通り、本発明に係る脂質組成物の脂質成分に、より好ましくは、カチオン性脂質に結合していると認識されよう。
本明細書において、疾患の治療という用語は、そのような疾患を予防することも含む。
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、それらから、更なる特徴、実施形態および長所を理解することができる。
実施例1:材料および方法
<siRNA>
本研究で使用されるsiRNA分子(AtuRNAi)は、両鎖に対する交互2’−O−メチル修飾によって安定化された、平滑で19重合体の二本鎖RNAオリゴヌクレオチドであり(詳細については、(Czauderna et al.,2003)参照)、BioSpring社(Frankfurt a.M.,Germany)によって合成されたものである。本研究において使用されたsiRNAの配列を表1に列挙した。
Figure 2009534342
<siRNA−リポプレックスの調製および特徴>
脂質膜を、RNaseフリーの300mM滅菌ショ糖溶液で、総脂質濃度4.34,g/mlの300mMショ糖、pH=4.5〜6.0に再水和することによって、β−L−アルギニル−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸である新規のカチオン性脂質AtuFECT01(Atugen AG(Berlin))、中性/ヘルパー脂質リン脂質である1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE)(Avanti Polar Lipids Inc.,Alabaster,AL)、およびPEG化脂質であるN−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩(DSPE−PEG)(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)を50/49/1というモル比で含むカチオン性リポソームを調製した。そして、この多重膜分散液を、EmulsiFlex C3装置(Avestin,Inc.,Ottawa,Canada)を用いた高圧ホモジナイズ法(750バールにて22サイクル、そして1000バールにて5サイクル)によってさらに処理した。siRNA−リポプレックス(AtuPLEX)を生成させるために、得られたリポソーム分散液を、等量の300mMショ糖液中0.5625mg/mlのsiRNA溶液と混合したところ、核酸のリン酸骨格対カチオン性脂質の窒素原子の計算電荷比が約1:4となった。リポソームとリポプレックス分散物のサイズを、準弾性光散乱法(N5 Submicron Particle Size Analyzer,Beckman Coulter,Inc.,Miami,FL)によって決定し、Zetasizer Nano−ZS(Malvern Instruments,Worcestershire,UK)を用いてζ電位を測定した。
siRNA−リポプレックスを二重標識するには、蛍光標識されたトレーサー脂質であるTexasRed(登録商標)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩(TexasRed(登録商標)−DHPE;Molecular Probes)を以下の比率で加えて、蛍光標識されたリポソームを生成させた。50モル%カチオン性脂質(AtuFECT01)/44モル%ヘルパー脂質DPhyPE/1モル%DSPE−PEG/5モル%TexasRed(登録商標)DHPE。このリポソームは、混合する前に400nmポリカーボネート膜に通す射出サイクルを51回行って処理し、脂質については全部で最終濃度2.17mg/ml、また0.28mg/ml siRNAが得られた(200μlを30gのマウスに注射するのは、1.88 mg/kg siRNAおよび14.5mg/kg脂質に相当する)。
<インビトロにおける形質転換およびイムノブロッティング>
ヒトHeLa細胞株およびマウスEOMA細胞株をAmerican Type Culture Collectionから入手して、ATCCの推奨するところに従って培養した。上記したカチオン性リポソームを用いて、細胞株をsiRNAにより形質転換した。簡潔に説明すると、細胞を播種してから約12時間後に、10%血清含有培地に希釈した様々な量のsiRNA−リポプレックス溶液を細胞に加えて、形質転換濃度が1〜50nMのsiRNAの範囲になるようにした。形質転換(48時間)後の細胞を溶解し、(Klippel et al.,1998)に記載されているようにしてイムノブロッティングを行った。全タンパク質を抽出するには、組織を切り出して、直ちに液体窒素内で急冷凍結した。20mgの組織を、Mixer Mill MM 301(Retsch GmbH,Haan,Germany)内で、タングステンカーバイドビーズ(Qiagen)を用いてホモジナイズし、タンパク質をNP40−溶解バッファー内で抽出した。DCタンパク質アッセイ(BioRad)を用いてタンパク質濃度を決定し、以下の抗体を用いてイムノブロッティング解析を行うために等量をロードした。ウサギ抗PTEN(Ab−2,Neomarkers)、モノクローナルp110α(Klippel et al.,1994)、ウサギ抗PKN3(Leenders et al.,2004)、ヤギ抗CD31(Santa Cruz Biotechnology)、ウサギ抗Tie−2(Cell Signaling Technology)。
<細胞培養およびマウスにおけるsiRNA−Cy3の取り込み実験>
細胞内における非処方siRNA−Cy3分子の取り込み研究では、細胞を、血清含有培地内で所定量のsiRNA溶液とともに一晩インキュベートした。リポプレックス化siRNA−Cy3の取り込みは、上記のとおり、一晩形質転換して行った。処理した細胞を氷冷PBSで洗浄し、顕微鏡観察する前に15分間、4%ホルムアルデヒド/PBS溶液で固定した。蛍光標識されたsiRNA−Cy3を用いたインビボにおける送達実験は、処方されたsiRNAおよび未修飾のsiRNAを静脈内に投与して行った。最終用量が1.88mg/kgのsiRNA−Cy3および14.5mg/kgの脂質となるように200μlの単回静脈注射によってマウスを処理し、所定の時点で殺処分して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片またはOCT固定凍結組織切片のいずれかに対し、蛍光の取り込みを顕微鏡によって調べた。
<組織学的解析および顕微鏡観察>
マウスを殺処分した後、組織を直ちに4.5%緩衝ホルマリンで16時間固定し、それによって、パラフィン包埋のための処理をした。4μmの切片を切り出し、スライドガラスに載せた。組織切片を、ヤギポリクローナル抗CD31抗体/PECAM−I(Santa Cruz Biotechnology)(あるいは、凍結切片にはラットCD31、Pharmingen)で染色して、パラフィン切片内の内皮細胞を可視化した。標準的なプロトコールに従って、パラフィン組織切片に対する免疫組織化学的検査およびヘマトキシリン/エオシン(H+E)染色法を行った。蛍光標識されたsiRNAのインビボでの取り込みを研究するために、Zeiss Axioplan顕微鏡を用いた落射蛍光顕微鏡検査法によってパラフィン切片を直接調べた。画像を記録し、Zeiss LSM5画像化ソフトウェアを用いて処理した。Zeiss LSM510 Meta共焦点顕微鏡を用いてsiRNA取り込みの精密顕微鏡分析を行った。そのために、切片をキシレンで脱パラフィン化し、エタノールで段階的に洗浄して再水和化し、Sytox Green dye(Molecular Probes 100nM)で対比染色して洗浄し、最後に、顕微鏡検査するためにFluorSave(Calbiochem)に載せた。
<RT−PCR(TaqMan)によるmRNAの定量>
組織を切り出して、直ちに液体窒素内で急冷凍結した。約20mgの組織を、Mixer Mill MM 301(Retsch GmbH,Haan,Germany)内で、タングステンカーバイドビーズ(Qiagen)を用いてホモジナイズし、全RNAを、Invisorb Spin組織RNAミニキット(Invitek,Berlin,Germany)を用いて調製した。以下の単位複製配列セット(BioTez GmBH,Berlin,Germany)を用いた定量的TaqMan RT−PCRには、組織に応じて25〜100ngの全RNAを用いた(UPR:上流側プライマー、LWR:顆粒側プライマー、PRB:プローブ):マウスmRNAに対しCD31特異的、UPR 5’GGGAACGAGAGCCACAGAGAC3’、LWR 5’CATTAAGGGAGCCTTCCGTTC3’、PRB FAM−5’CGGAAGGTCGACCCTAATCTCATGGAAA3’−TAMRA;両マウススプライスバリアントに対しCD34特異的、UPR 5’GAGGCTGATGCTGGTGCTAGT3’;LWR 5’CAGCAAACACTCAGGCCTAACC3’;PRB FAM−5’CTGCTCCCTGCTTCTAGCCCAGTCTGA3’−TAMRA;マウスmRNAに対しTie2特異的、UPR 5’ATGCCTCTGCTCTCAAGGATG3’;LWR 5’TCTGGCAAATCCTCTATCTGTG3’;PRB FAM−5’TGAGAAAGAAGGCAGGCCAAGGATGACT3’−BHQl。TaqMan RT−PCR反応は、プライマーを濃度300nM、またはプローブを100nMとし、RT−PCR用の標準的プロトコール(48℃30分間、95℃ l0分間、40×(95℃15秒間、60℃1分間)を用いて、ABI PRISM 7700配列検出装置(Software:Sequence Detection System vl.6.3(ABI))で行った。TaqManデータは、比較C法を用いて計算した。ここで、標的mRNA(CD31またはTie2)の量は、内部参照(CD34)に対して標準化され、キャリブレーター(ショ糖群)に対して相対的なものであるが、式2−ΔΔC によって与えられる。個々のマウスに関するデータは、CD31のmRNA、CD34のmRNA、またはTie2のmRNAのCとして示され、3回反復の平均値±s.e.m.を表している。処理群に関するデータは、内部参照に対して標準化された、ショ糖に対して相対的なΔΔCとして示され、群当たり6〜8匹のマウスの平均値±s.e.m.を表している。
<ELISAによる可溶型Tie2の定量>
血清解析には、0日目と5日目に、麻酔をかけたマウスから眼窩静脈叢出血により採血した。製造業者の指示に従ってELISAにより可溶型Tie2を測定した(R&D Systems,Minneapolis,USA)。
<ELISAによるインターロイキン−12の定量>
オスのC57BL/6マウスに、ポリ(I:C)(Sigma,Taufkirchen,Germany)またはsiRNA−リポプレックス溶液(最終用量が1.88 mg/kgのsiRNAまたはPoIy(I:C)、および14.5 mg/kgのlipid)を200μl尾静脈に単回注射した。注射後2時間目と24時間目に、麻酔をかけたマウスから眼窩静脈叢出血により採血し、製造業者の指示に従ってELISA(R&D Systems,Minneapolis,USA)により血清IL−12(p40)およびインターフェロン−αのレベルを測定した。
<マウス研究>
免疫不全のオスHsd:NMRI−nu/nuヌードマウス(9週齢)を、インビボにおけるsiRNA−リポプレックスの毒性を評価するため、ならびにRNAi(インビボにおけるノックダウン解析)およびTie2のELISAを検出するために用いた。蛍光標識されたsiRNA−リポプレックスの器官分布および細胞型分布の顕微鏡による解析、ならびにIL−12のELISA解析は、免疫適格オスC57BL/6マウス(8〜10週齢)を用いて行った。動物の維持管理および実験は、認可されたプロトコールに従い、労働保護・健康保護ならびに技術的安全性に関する州庁、Berlin、Germany(No.G0264/99)のガイドラインに則って行われた。
<統計学的解析>
データは、平均値±平均値の標準誤差(s.e.m.)で表示されている。差異の統計的有意性は、Mann−WhitneyのU検定によって決定した。P値<0.05を統計的に有意であると見なした。
実施例2:インビトロにおけるsiRNA−リポプレックスの特性
本発明者らは、3’突出を持たない19重合体のsiRNA二重鎖であって、両鎖上を交互に2’−O−メチル糖修飾し、実施例1の表1に図示されているように、修飾されていないヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドと反対鎖同士で向き合うようにすることによって化学的に安定化されている(Czauderna et al.,2003)siRNA二重鎖を用いた。
これら特別に修飾された分子が、RNAi活性を保持しつつ、血清ヌクレアーゼに対する抵抗性を促進することが、これまでに細胞培養(エクスビボ)(Czauderna et al.,2003)において明らかにされている。まず、本発明者らは、これらの分子が、カチオン性リポソームと複合体を形成するか、あるいは非処方(「未修飾」)で、細胞培養においてRNAiをもたらすか否かを解析した。本目的のため、本発明者らは、新規に設計され、AtuFECT01と名付けられたカチオン性脂質を、市販されているヘルパー脂質であって、その構造を図1aに示した脂質と組み合わせて合成した。この新規の脂質は、高電荷の頭部基に特徴があり、他の市販されているカチオン性脂質、例えば、DOTAPやDOTMAに比べて効率のよいsiRNA結合ができるようになっている。以下の研究では、本発明者らは、正に荷電したリポソーム(50モル%カチオン性脂質AtuFECT01、49モル%中性/ヘルパー脂質DPhyPE、および1モル%DSPE−PEG)からなるsiRNA−リポプレックスを、様々な標的特異的siRNA分子と組み合わせて用いた。QELS(90°の角度における単一モード解析)およびζ電位測定によって、サイズと電荷について、リポソームおよびsiRNA−リポプレックスの特徴を調べた。その結果を図1cおよび1dに示す。代表的なカチオン性脂質処方剤のζ電位は+63mVであったが、本発明に係るリポプレックス処方剤は、+46mVというζ電位を示した。
インビトロ送達について行ったイムノブロット解析によって、図2aから分かるように、siRNA−リポプレックスではナノモル濃度が使用されているのに対し、未修飾のsiRNAは、マイクロモル濃度でも遺伝子のサイレンシングが起こらなかったことが実証された。遺伝子サイレンシングが起こらなかったことが、アニオン性siRNAと負に帯電した細胞膜との間に反発作用があるために細胞内取り込みが不効率になった結果であるか否かを解析するために、本発明者らは、3’蛍光(Cy3)標識したsiRNAを用いて、共焦点顕微鏡により、それらの取り込みを調べた。本発明者らは、それ以前に、アンチセンス分子の3’末端を蛍光標識しても、送達媒体で形質転換すれば、RNAのサイレンシング活性を損なうことはないことを明らかにしていた。(Chiu and Rana,2002;Czauderna et al.,2003)。驚いたことに、本発明者らは、図2bに示したように、高濃度の(10μM)のsiRNA−Cy3分子を適用すると、形質転換用試薬がなくても、蛍光標識されたsiRNAの有意な取り込みが行われることを観察した。これに対し、1000倍低いsiRNA−Cy3濃度(10nM)にてAtuFECT01により形質転換させると、同等のsiRNA−Cy3取り込みが生じた。これらの結果は、siRNA−リポプレックスによって、siRNAの機能的な送達にとって以下の2つの有益な効果がもたらされることを示している。細胞内取り込みの向上、さらに重要なのは、RNAiによるmRNA分解が起きる、細胞質の中へのエンドサイトーシス/エンドソーム経路から免れることができる(Zelphati and Szoka,1996)点である。
実施例3:PEG化されたsiRNA−リポプレックスはインビトロで機能するとともに、インビボでの適用にも適している。
カチオン性リポソーム粒子が、負に荷電した血清タンパク質と相互作用するか、または他の血清成分に結合することができるということが示唆されている。これらの非特異的相互作用は、インビボにおけるリポソーム処方剤の分配・送達特性に消極的な影響を与える恐れがある。この問題を克服するために、多くのリポソーム担体は、ポリマーであるポリ(エチレングリコール)、すなわちPEGで被覆され、血清タンパク質または補体系によって担体がクリアランスされるのを防止して循環時間を向上させている。また、PEGの取り込みは、マクロファージクリアランスを遮蔽および低減させることによってリポソームを安定化するのにも役立ち得る(Allen et al.,1995;Felgner et al.,1987)。
siRNA−リポプレックスの場合におけるPEG化の利点を明らかにするため、本発明者らは、PEG化脂質を用いた実験と用いない実験を行った。以下の実験において、本発明者らは、正に荷電したリポソーム(カチオン性脂質Atufect01、中性/ヘルパー脂質DPhyPE、および様々な量のDSPE−PEG−2000)を含んでなるsiRNA−リポプレックスを、様々な標的特異的siRNA分子と組み合わせて用いた。まず、本発明者らは、インビトロにおいて、RNA干渉活性に対する様々な量のPEG化の効果を測定した。siRNAPTENによる遺伝子サイレンシングは、5モル%のDSPE−PEG−2000が存在すると完全に無効になったが、処方剤中に1〜2モル%存在する場合には維持された。これらの結果は、HeLa細胞の形質転換による、様々なモル%のPEGを含むsiRNAリポソーム処方剤のウエスタンブロット解析検査を示す図3aに示されている(20nM(左図)または5nM(右図)のsiRNA濃度;ut:非処理)が、ここでは、抗抗PTENおよび抗p110αをプローブにしてタンパク質抽出物が調べられた。図3bに示されているように、1〜2%PEG化を、大型の核周辺小胞から小型で均一の小胞に変えたところ、蛍光標識されたsiRNA−リポプレックスの細胞内分布が変化した。これに対し、5モル%のPEG化では、図3bの左図から分かるように、リポプレックス化siRNA−Cy3が主に細胞表面に結合してしまうため、RNAiは観察されず(図3a)、取り込みが遮断されていると考えられる。PTEN遺伝子またはPKN3遺伝子の標的配列に相補的なsiRNAを、1モル%DSPE−PEG−2000の存在下または不在下で処方すると、図3cから分かるように、PEG化されているにも関わらず、特異的なsiRNAによるタンパク質ノックダウンが観察された。しかし、PEG化された変異体と比較すると(図3c、1nMのsiRNA濃度を比較)、非PEG化siRNA−リポプレックスの方が、より低い濃度で僅かに効率よくタンパク質ノックダウンを生じさせたものの、高い用量(20nM、図3c)で適用すると、非特異的なノックダウン効果も見られた(siRNAPKN3−リポプレックスに関するPTENローディング用対照参照)。このような非標的タンパク質レベルの非特異的阻害は、おそらく、インビトロにおける非PEG化リポプレックスのより強い毒性作用によるものである。
siRNA−リポプレックスのPEG化が、インビボでも毒性を低下させることができるか否かを解析するために、本発明者らは、同一用量のPEG化(1モル%DSPE−PEG−2000)および非PEG化siRNA−リポプレックスを尾静脈注射によってマウスに適用した。非PEG化siRNA−リポプレックス(以下の4種類のsiRNA配列を用いた。siRNALuc、siRNAPKN3、siRNACD31、およびsiRNAPTEN)を、全身投与(i.v.)によって毎日連続して(1〜5日目)処理すると、時間とともに体重が減少した。一方、図3dから分かるように、同じ日用量のPEG化変異体(1モル%DSPE−PEG−2000)で処理されたマウスには変化が見られなかった。
PEG化siRNA−リポプレックスおよび非PEG化siRNA−リポプレックスによる処理後の体重減少の差異を解明するために、リポプレックス処理に対する免疫反応の可能性を検討した。そのために、非複合体化ポリ(I:C)(陽性対照)、またはPEG化siRNA−リポプレックス、または非PEG化siRNA−リポプレックス(siRNAPTEN、siRNALuc)の静脈内ボーラス単回注入後、免疫適格マウスにおけるインターロイキン−12(IL−2)の量を測定した(Alexopoulou et al.,2001;Liu et al.,2003)。ELISA解析によって、図3eから分かるように、PEG化したにも関わらず、siRNA−リポプレックス処理によってIL−12の増加は起きなかったことが明らかになった。従って、非PEG化siRNA−リポプレックスで処理した時に、非特異的なサイトカイン反応によって、観察された体重減少が起きたとは考えにくい。まとめると、これらのデータは、siRNA−リポプレックス処方剤中1モル%のDSPE−PEG−2000で、充分にインビトロにおけるRNAi効果の顕著な消失を起こすことなく、インビボにおける非特異的副作用を抑制できることを示している。従って、一定のPEG化度が、本明細書において特徴づけられているsiRNA−リポプレックスの安全で効率的なインビボ適用を行うための重要な必要条件であると考えられる。
実施例4:血管内皮へのリポプレックス化siRNAの特異的取り込みおよび未修飾のsiRNAの腎***
次の工程で、本発明者らは、マウスの全身処理後の非処方siRNAとの比較したsiRNA−リポプレックスの生体内分布および動態を調べることにした。本目的で、本発明者らは、Cy3蛍光標識されたsiRNAの単回用量を、脂質と複合体を形成させて(200μlを1.88mg/kgのsiRNA−Cy3、および14.5mg/kgの脂質という最終用量で静脈内注射)、あるいは非処方で(15μMに等しいsiRNA−Cy3:0.188mg/ml)、免疫適格マウスに注射し、落射蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法で調べるために、9つの時点(5分から48時間)で6種類の異なる器官を切り出した。最初の顕微鏡解析によって、図4aの下側の図に示したように、siRNA−Cy3−リポプレックスによる処理後20分の動物から解析した組織のすべてで蛍光が検出された。Cy3−蛍光は、各器官について異なる染色パターンとなって現れた。この器官特異的Cy3−染色パターンは、組織内皮の分布に似ている。これに対し、未修飾のsiRNAは、注射後20分には、主に腎臓で見られたが、他の器官では検出できるシグナルはなかった。これは、非処方siRNA分子が速やかに腎***されることを示唆している(図4a、上列)。また、適用された未修飾のsiRNA−Cy3は、注射後5分で近位尿細管の極および管腔の中、および尿中に蓄積するが、これは、リポプレックス化siRNA−Cy3では見られなかった。結論として、非処方siRNAは、全身投与後のインビボで解析された組織のいかなる細胞型にも標的とされなかったが、これは、即座に腎***されるためである可能性が最も高い。しかし、siRNA−Cy3−リポプレックスでは、顕微鏡による蛍光データによって、siRNA分子が、様々な器官の血管系内皮によって、顕著に遅いクリアランス速度で取り込まれたことが示唆されている。siRNA−Cy3−リポプレックスの薬理動態をより詳しく解析するために、本発明者らは、様々な時点におけるsiRNA−Cy3−リポプレックスの取り込みをより詳細に比較した。この解析のため、注射(200μlを1.88mg/kgのsiRNA−Cy3、および14.5mg/kgの脂質という最終用量で静脈内注射)して20分後に最も高いCy3蛍光量もつ4種類の器官(肺、心臓、肝臓、および脾臓)を選択した。同じ記録用パラメーターを用いた顕微鏡検査によってCy3−蛍光を比較した。図4bから分かるように、これらの器官すべてにおいて相当量のリポプレックス化siRNA−Cy3が、注射後5分から蓄積していた。この蛍光量は、心臓と肺の組織では、その後2時間内に次第に減少して行った。それに対し、siRNA−Cy3−リポプレックス投与後20分では、ほとんどの蛍光が脾臓で検出され、この組織では20時間後までそれが続いた。肝臓では、長時間にわたってsiRNA−Cy3−リポプレックスが蓄積し、注射後2時間でCy3蛍光が最も高量になり、その後4〜20時間をかけて次第に減少して行った。驚いたことには、各組織におけるsiRNA−Cy3−リポプレックスの異なった蛍光染色パターンは、時間がたっても変化せず、siRNA分子が組織全体にわたって拡散しないことを示唆していた。この顕微鏡アッセイ法によって解析した試料のいずれにおいても、siRNA−Cy3−リポプレックスの単回投与後48時間目にはCy3蛍光は観察されなかった。これらの結果は、リポプレックスに処方されたsiRNA分子は、未修飾のsiRNAとして投与されたsiRNA分子と比較して、より良好な器官取り込みを達成することを示している。
しかし、器官によるsiRNA取り込みが向上したことは、送達されたsiRNAが機能するための必要条件ではあるが、これらの分子の細胞内または細胞型に特異的な取り込みを必ずしも示すものではない。処方されたsiRNA−Cy3の心臓および肺への取り込みを共焦点顕微鏡検査によってさらに詳しく解析したところ、細胞レベルでは、蛍光染色が、主に血管の内壁に存在することが明らかになり、内皮細胞に送達されることを示唆した。抗CD31抗体を用いた免疫組織化学検査によって、心臓の血管内皮を可視化した。結果を図4cに示す。CD31を発現する内皮細胞を染色すると、心筋細胞に沿って多数の毛細血管が存在することが示される(図4c;矢印:毛細血管の横断面と縦断面)。これらの毛細管構造は、共焦点顕微鏡検査によって明らかになったように、siRNA−Cy3−リポプレックスの単回静脈内注射によって処理したマウスの心臓内で標識されていた(図4c、右図)。
siRNA−Cy3−リポプレックスで処理したマウスの肺切片の共焦点顕微鏡検査によって、図4dから分かるように、肺胞壁が強調して染色されるが、細気管支内皮は強調して染色されないことが明らかになった。抗CD31による染色によって可視化された通り、肺胞壁には、肺胞の毛細管が縦横に行き交っている(図4D、左図)。そのため、本発明者らは、本明細書記載のリポソームを用いてリポプレックス化されたsiRNAは、肺の毛細血管内皮に送達されるようになると結論する。同じような内皮細胞特異的siRNA取り込みが、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、胃など、他の器官でも観察された。まとめると、これらデータは、カチオン性脂質に基づいたsiRNAの処方剤が、siRNAの生体内分布特性を改善して、身体全体の内皮細胞へのsiRNAの主な取り込みを可能にすることを明らかにしている。
実施例5:肺、心臓、および肝臓の血管系における、siRNA−リポプレックスに仲介されるRNAi
siRNA−Cy3−リポプレックスで全身処理したマウスは、様々な器官の内皮区画へのsiRNAの送達を示唆している。この観察を行った後、本発明者らは、siRNAの取り込みと分布を、具体的な器官におけるRNA干渉の有効性と関連づけようとした。本目的のため、本発明者らは、以下のインビボ実験を設計した。ヌードマウス(1コホート当たり6〜8匹)を、3種類の標的特異的siRNA−リポプレックスで4日間続けて静脈内注射(日用量:1.88mg/kgのsiRNA−Cy3、および14.5mg/kgの脂質)によって処理した。2種類の内在遺伝子標的であるCD31(PECAM−I)およびTie2に特異的な強力なsiRNAをインビトロで同定し、選択された器官の血管系におけるRNAiサイレンシングを明らかにするために適用した。重要なことに、これら2種類の遺伝子の発現は、内皮細胞に強く限定されている。別のマウス群を、非特異的作用に対する対照として、並行してショ糖液、またはマウスPTENのコード配列に特異的なsiRNA−リポプレックスによって処理した。CD31およびTie2とは対照的に、PTENは、マウスのすべての細胞型において普遍的に発現している。最後にsiRNA−リポプレックス処理してから24時間後に、RT−PCRを用いてmRNA量の変化を測定し、イムノブロット法およびELISA法によってタンパク質量の変化を測定して、遺伝子発現を評価した。これらの結果を図5に示す。全RNAを、対応する処理群(ショ糖、siRNAPTEN、siRNATie2、siRNACD31)の肺、心臓、および肝臓から調製し、定量的RT−PCR(TaqMan)によって、2種類の標的遺伝子の内皮におけるmRNAのノックダウンを解析した。血管内皮細胞に発現が限定されているもう一つの遺伝子であるCD34のmRNA量を測定し、内皮細胞のRNAの同等量に対して標準化した。CD34のmRNA量に対する標準化したCD31またはTie2のmRNA量の平均割合を図5aに示す。それぞれのmRNA定量データで明らかになったように、siRNATie2−およびsiRNACD31−リポプレックスで処理された動物に由来する試料においてのみ、CD31またはTie2のmRNA量が有意に減少した。siRNATie2−リポプレックス処理群におけるTie2のmRNA量の減少、またはsiRNACD31−リポプレックス群におけるCD31のmRNAの減少は、siRNA処理が標的特異的であることを実証している。肝臓において、mRNA量のノックダウンは、Tie2よりも顕著であった(図5a、下側の図)が、一方、肺および心臓では、どちらの標的遺伝子の発現も同じように阻害された。両方の標的遺伝子のsiRNAによる阻害を確認するために、本発明者らは、イムノブロットによりTie2タンパク質の発現の阻害の確認に着手した(図5b)。siRNATie2−リポプレックス処理群またはsiRNACD31−リポプレックス処理群の6〜7匹の個々の動物から器官のタンパク質ライセートを調製し、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法によって分離し、対応するイムノブロットを、抗Tie2および抗PTEN(ローディング対照)をプローブとして調べた。siRNATie2−リポプレックス処理された動物の3種類の器官すべてにおいてTie2タンパク質の有意な減少が見られた。肝臓からのタンパク質ライセートでは、本発明者らは、イムノブロットによって、有意な量のCD31を検出することができなかった。しかし、肺および心臓では、有意なsiRNACD31−リポプレックス特異的CD31タンパク質量の減少が明らかになった。まとめると、これらのデータは、マウスの血管内皮において、mRNA量およびタンパク質量に対するsiRNAによる「遺伝子サイレンシング」があることを実証している。
解析した3種類の器官すべてのタンパク質ライセートにおいて、Tie−2タンパク質の量が有意に減少したため、本発明者らは、siRNATie2−リポプレックス処理された動物の血液において、Tie2の可溶型の量が減少していることを検出することができるか否かを検討した。Tie2タンパク質は、そのリガンドであるアンギオポエチンと協調して、専ら内皮細胞の中で受容体型チロシンキナーゼとして働き、血管の再構築と完全性に寄与している(Davis et al.,1996;Thurston,2003)。Tie2の可溶型であるs−Tie2は、受容体の細胞外ドメインをタンパク質切断した産物であり、ELISAアッセイによって血液中から簡単に検出することができる。本発明者らは、s−Tie2 ELISAの読み取り結果を用いて、siRNA−リポプレックス処理の前後における血清中のs−Tie2の変化を観察した。検査した4つのマウス群のすべてが、処理前には、同じようなs−Tie2量を示していた(0日目;図5c、左図)。siRNATie2−リポプレックス処理されたマウスは、対照コホートの処理マウス(ショ糖、siRNAPTEN、siRNACD31)と比較すると、処理日程の5日目で、有意なs−Tie2量の減少を示した(5日目;図5c、右図)。この結果は、siRNATie2−リポプレックスの全身投与によって、おそらく、身体の血管系内皮においてTie2タンパク質の発現が抑制されることによって、インビボにおける全体的なTie2遺伝子発現が影響を受けたことを意味している。結論として、AtuFECT01に基づくsiRNA−リポプレックスは、静脈内注射後、多くの組織の血管内皮に標的される。siRNA−リポプレックスを繰り返し投与したところ、肺、心臓、および肝臓などの組織において標的特異的にRNAおよび内皮遺伝子発現のタンパク質のノックダウンが生じた。
実施例6:siRNAリポプレックスの調製法
<平均粒子サイズが約120nmであるsiRNAリポプレックス>
本出願のリポプレックスをクロロホルム内(c=20mg/ml)で形成する脂質の溶液を、混合液内におけるカチオン性脂質のβ−(L−アルギニル)−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸(AtuFECT01):ヘルパー脂質の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE):PEG脂質のN−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩(DSPE−PEG)の比率が50モル%:49モル%:1モル%になるように、100mlの丸底フラスコに分注した。その後、真空下で溶媒を除去し、得られた脂質膜を高真空下で4時間乾燥させる。乾燥した脂質に、270mMの滅菌ショ糖液を加え、4.335mg/mlの総脂質濃度にする。超音波洗浄機の中で5分間、短い超音波処理を行った後、脂質を分散させ、その後、高圧ホモジナイズ処理によってホモジナイズする(Avestin C3)。リポソームのこのようなホモジナイズは、それらを750バールで21サイクル、1250バールで52サイクル処理することによって行われる。このようにして得られたリポソームは、図6に示されているように、QELS(Beckman−Coulter N5およびMalvern Zetasizer NS)によって決定すると約85nmの平均粒子径を有する。
これらのリポソームを、無菌条件下でさらに処理する。本目的では、それらを、同量の270mMショ糖内siRNA溶液(c=0.5625mg/ml)と混合する。1500rpmで振とうしながら、シリンジを用いて、siRNA溶液をリポソームに加える。この結果、平均粒子径が約120nmのリポプレックスが形成される。
このようにして得られたリポプレックスのサイズ分布を図7に示す。粒子径は、QELS(Beckman−Coulter N5およびMalvern Zetasizer NS)によって決定された。
<平均粒子サイズが約60nmであるsiRNAリポプレックス>
平均粒子径が約120nmであるsiRNA−リポプレックスの調製物(上記の比率50:49:1で、c=86.5mg/mlの総脂質)に関して上記で特定した脂質を、含む30%のtert−ブタノール中に含む溶液の1mlを、無菌条件下、1500rpmで振とうしながら、シリンジを用いて、滅菌した270mMショ糖溶液19mlに1分間以内に加える。このようにすることによって、約30nmの平均粒子径を有するリポソームを得ることができる。図8は、それぞれのサイズ分布を示している。粒子のサイズは、QELS(Beckman−Coulter N5およびMalvern Zetasizer NS)によって決定した。
このようにして得られたリポソーム溶液を1.6mlの等量液を、5mlの凍結乾燥用バイアルに入れた後、−80℃に急速凍結してから凍結乾燥した。
リポプレックスを調製するために、135mlの滅菌ショ糖溶液中0.28mg/mlのsiRNA溶液3.2mlを、凍結乾燥物とも呼ばれる凍結乾燥リポソームを含有するバイアルに注入する。その後、凍結乾燥物と溶液を含有するバイアルを振とうして、凍結乾燥によって形成された固形物が完全に溶解させた。このようにして得られたリポプレックスは、図9に示すように、約60nmの平均粒子径を有する。粒子のサイズは、QELS(Beckman−Coulter N5およびMalvern Zetasizer NS)によって決定した。
参考文献
本明細書において、様々な先行技術文書に言及される限り、当該文書は、その完全な書誌データは以下の通りであり、それらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
Figure 2009534342
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本明細書、特許請求の範囲、および/または図面において開示されている本発明の特徴が、別々にでも、それらを組み合わせてでも、様々な形態で本発明を実施するための材料となる。
本発明に係る脂質組成物の構成成分の構造を示す。 本発明に係る脂質組成物によって形成されるリポソーム、および脂質組成物とsiRNA分子によって形成される本発明に係るsiRNAリポプレックスの略図が示され、siRNA分子は、リポソームに含有されるのではなく、リポソームの外面に主に複合体を形成し、これにより負に荷電したsiRNAはカチオン性脂質の正の荷電との静電相互作用によって複合される。 本発明に係る脂質組成物および本発明に係るsiRNAリポプレックスによって形成されるリポソームのサイズを示した図表である。 本発明に係る脂質組成物および本発明に係るsiRNAリポプレックスによって形成されるリポソームのζ電位を示す図表である。 HeLa細胞における、リポプレックス化siRNAおよび未修飾のsiRNAのそれぞれによる、PKN3タンパク質発現の濃度依存的阻害をウエスタンブロット解析した結果を示す。ただし、PTENがローディング対照として用いられている。 Cy3で標識された、未修飾の、または本発明に係るリポプレックスとして投与されたsiRNAで処理されたHeLa細胞を共焦点顕微鏡で撮影した写真を示す。 様々なモル%のPEGを含むリポソーム製剤を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。 0、1、2、および5モル%のPEGを含むsiRNA−Cy3−リポプレックスの細胞内取り込みの共焦点顕微鏡写真を示す。蛍光標識されたsiRNA−リポプレックスでEOMA細胞を形質転換した。注記:5モル%PEGで、最も多くのリポプレックスが細胞表面を修飾している(矢印)。 ウエスタンブロット解析、より具体的には、様々な量のPEG(1モル%)化されているか、PEG化されていないsiRNAPKN3−リポプレックス(上図)またはsiRNAPTEN−リポプレックス(下図)によって形質転換されたHUVEC細胞の抽出物を用いたイムノブロットの結果を示す。siRNAの最終濃度が示されている(1〜20nM;ut:非処理)。イムノブロットを抗PTENおよび抗PKN3をプローブとして調べた。 様々な処方剤で5日間にわたって処理されたヌードマウスの体重の変化を示す多様な図表を示す。ここで、マウスは、5日間にわたってsiRNALuc、siRNAPKN3、siRNACD31、およびsiRNAPTENのPEG化されたリポプレックス(三角形)またはPEG化されていないリポプレックス(四角形)で処理された(1〜5日目に単回静脈内(i.v.)注射)。体重の相対的変化が、各処理群当たり7匹のマウスの平均±s.e.mで示されている。 C57/BL6マウス(各群につきマウス2匹)をポリ(I:C)、または図に表示されたsiRNA−リポプレックスで2時間(暗灰色)または24時間(明灰色)単回処理したものから採取した血液試料のIL−12についてのELISAの結果を示した図表である。 尾静脈注射から20分後の様々な組織における、未修飾の(中段)またはリポプレックス化された(下段)siRNA−Cy3(1.88mg/kg)の分布を可視化した、パラフィン包埋切片の落射蛍光顕微鏡写真を示す。 siRNA−Cy3−リポプレックスの単回全身静脈内注射後の様々な時点において解析された、心臓、肺、脾臓、および肝臓の落射蛍光顕微鏡写真を示す。組織試料は、(各器官につき)同一の顕微鏡設定で記録した。サイズバー:100μm、ただし、肝臓および脾臓については200μm。 毛細血管の横断面と縦断面をラベルする抗CD31抗体(矢印)を用いたIHCによって明らかにされた(左側の写真)、心臓における内皮細胞の分布の共焦点顕微鏡写真である。血管系内の内皮細胞がCy3染色されている(右側の写真、矢印)。 肺の中の肺毛細血管をラベルする抗CD31抗体を用いたIHCによって明らかにされた(左側の写真)、肺における内皮細胞の分布の共焦点顕微鏡写真である(矢印、血管;2倍の矢印、肺胞マクロファージ)。血管系内の内皮細胞がCy3染色されている(右側の写真、矢印)。肺胞マクロファージも強い蛍光を示している(右側の写真、小さな矢印)。 TaqMan RT−PCRによって定量すると、ショ糖、siRNACD31−リポプレックス、siRNAPTEN−リポプレックス、またはsiRNATie2−リポプレックスで4連続日毎日処理された動物の肺、心臓、および肝臓の組織におけるTie2(右側の図表)またはCD31(左側の図表)のmRNA量がノックダウンしていることを示す図表である。表示されているmRNA量は、ショ糖群と比較した割合であり、CD34のmRNA量に対して標準化されている。数値は、各群のすべての動物から得られた割合の平均値±s.e.m.である。 siRNACD31−リポプレックスまたはsiRNATie2−リポプレックスのいずれかによって処理された6〜7個体のマウスからの肺、心臓、肝臓のタンパク質抽出物を抗Tie2、または抗CD31および抗PTEN(ローディング対照)でプローブしたイムノブロットを示す。注記:タンパク質の発現量は、Tie−2またはCD31においてのみ、適用されたリポプレックスに比例して変化しているが、PTENの発現量は変化しなかった。 s−Tie2を様々な処方剤の関数として示す、すなわち、siRNATie2−リポプレックスで4日間毎日処理すると可溶型Tie2(s−Tie2)は減少するが(5日目、左側図表)、対照であるリポプレックス(siRNAPTEN、siRNACD31)およびショ糖では減少していないことを示す図表である。処理群毎に各マウスで測定されたs−Tie2量がひし形で示され、処理前(0日目)のマウスの可溶型Tie2量が左側の図表に、処理後のものが右側の図表に示されている。各群についてのs−Tie2の平均値を線で示す。 約120nmの平均粒子サイズを有するリポプレックスの調製に適した、平均粒子サイズが約85nmであるリポソームのサイズ分布を示す図表である。 約120nmの平均粒子サイズを有するリポプレックスのサイズ分布を示す図表である。 約60nmの平均粒子サイズを有するリポプレックスの調製に適した、平均粒子サイズが約30nmであるいくつかのバッチのサイズ分布を示す図表である。 平均粒子サイズが約60nmであるリポプレックスのサイズ分布を示す図表である。

Claims (75)

  1. 担体に含有される、および/または担体を含有する脂質組成物であって、
    少なくとも第1の脂質成分と、
    少なくとも第1のヘルパー脂質と、
    インビボ条件下において、脂質組成物から任意で除去することができる遮蔽化合物と
    を含む組成物であって、
    前記担体を含有する前記脂質組成物が、約50から600mosmole/kg、好ましくは、約250〜350mosmole/kg、およびより好ましくは、約280〜320mosmole/kgのオスモル濃度を有し、かつ/または、
    前記第1の脂質成分、および/または前記担体中の前記ヘルパー脂質および前記遮蔽化合物の一方または両方よって形成されるリポソームの粒子径が約20から200nm、好ましくは、約30から100nm、より好ましくは、約40から80nmである脂質組成物。
  2. 前記遮蔽化合物が、PEG、HEG、ポリヒドロキシエチルスターチ(ポリHES)、およびポリプロピレンからなる群から選択される、請求項1に記載の脂質組成物。
  3. 前記遮蔽化合物がPEG2000またはPEG5000である、請求項2に記載の脂質組成物。
  4. さらなる構成成分および/または第2のヘルパー脂質を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  5. 前記遮蔽化合物が、PEGとセラミドのコンジュゲートである、請求項1から4のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  6. 前記セラミドが、6個から10個の炭素原子、好ましくは、8個の炭素原子からなる、少なくとも1つの短鎖炭素置換基を含む、請求項5に記載の脂質組成物。
  7. 前記セラミドが前記第1のヘルパー脂質である、請求項5または6に記載の脂質組成物。
  8. 前記セラミドが前記第2のヘルパー脂質である、請求項5または6に記載の脂質組成物。
  9. 前記遮蔽化合物が、pH感受性リンカーまたはpH感受性部分を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  10. 前記リンカーまたは部分がアニオン性リンカーまたはアニオン性部分である、請求項9に記載の脂質組成物。
  11. 前記アニオン性リンカーまたはアニオン性部分が、酸性環境においてはアニオン性が低いか中性であって、好ましくは、前記酸性環境がエンドソームである、請求項10に記載の脂質組成物。
  12. 前記pH感受性リンカーまたは前記pH感受性部分が、オリゴ(グルタミン酸)、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群から選択される、請求項9から11のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  13. 前記第1の脂質成分が、下記の化学式(I)に記載された化合物であって、
    Figure 2009534342
    式中、RおよびRがそれぞれ独立して、アルキルを含む基から選択され、
    nが1から4までの任意の整数であり、
    が、下記の化学式(II)に記載のリシル、オルニチル、2,4−ジアミノブチリル、ヒスチジル、およびアシル部分であって、
    Figure 2009534342
    式中、mが1から3までの任意の整数であり、NH が、任意では存在しなくてもよく、また、
    が薬学的に許容されるアニオンである、請求項1から12のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  14. およびRがそれぞれ独立して、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む群から選択される、請求項13に記載の脂質組成物。
  15. がラウリルおよびRがミリスチルであり、または、
    がパルミチルおよびRがオレイルである、請求項13または14に記載の脂質組成物。
  16. mが1または2である、請求項13から15のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  17. 前記化合物がカチオン性脂質であり、好ましくは、アニオンYと結合している、請求項13から16のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  18. が、ハロゲン化合物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸を含む群から選択される、請求項13から17のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  19. 前記化合物が、以下の群、
    β−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸、
    Figure 2009534342
    β−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸、および
    Figure 2009534342
    ε−アルギニル−リジン−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸
    Figure 2009534342
    から選択される、請求項13から18のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  20. 前記オスモル濃度が、糖によってほとんど決定され、前記糖が、好ましくは、ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択され、より好ましくは、ショ糖、トレハロース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択される、請求項1から19のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  21. 1種類または数種類の塩基性化合物を含有し、該塩基性化合物が、好ましくは、塩基性アミノ酸および弱塩基を含む群から選択される、請求項1から20のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  22. 前記アミノ酸が、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンを含む群から選択される、請求項21に記載の脂質組成物。
  23. 前記弱塩基が、TRISおよびエタノールアミンを含む群から選択される、請求項21に記載の脂質組成物。
  24. 前記塩基性化合物が、pH調整のために提供されている、請求項21から23のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  25. 前記脂質組成物が核酸を含み、該核酸が、好ましくは、さらなる構成成分である、請求項1から24のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  26. 前記核酸が、RNAi、siRNA、siNA、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される、請求項25に記載の脂質組成物。
  27. 前記遮蔽化合物が核酸に結合している、請求項1から26のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  28. 前記遮蔽化合物が、リンカー部分によって核酸に結合している、好ましくは、リンカー部分によって核酸に共有結合している、請求項27に記載の脂質組成物。
  29. 前記リンカー部分が、ssRNA、ssDNA、dsRNA、dsDNA、ペプチド、S−Sリンカー、およびpH感受性リンカーを含む群から選択される、請求項28に記載の脂質組成物。
  30. 前記核酸が、RNAi、siRNA、およびsiNAを含む群から選択され、前記リンカーが、センス鎖の3’末端に結合している、請求項27から29のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  31. 組成物が核酸を含み、前記核酸が、リポソームとともにリポプレックスを形成する、請求項1から30のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  32. 前記担体中の脂質濃度が、リポプレックスによって提供される脂質の全体量に基づいて、約0.01から100mg/ml、好ましくは約0.01から40mg/ml、およびより好ましくは約0.01から25mg/mlである、請求項1から31のいずれか1項に記載の脂質組成物。
  33. 前記核酸がsiRNAであり、前記脂質組成物のsiRNAの濃度が約0.2から0.4mg/ml、好ましくは0.28mg/mlであり、総脂質濃度が約1.5から2.7mg/ml、好ましくは2.17mg/mlである、請求項31から32のいずれかに記載の脂質組成物。
  34. 請求項1から33のいずれかに記載の組成物、および任意には薬学的活性化合物、および好ましくは、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  35. 前記薬学的活性化合物および/または更なる構成成分が、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群から選択される、請求項34に記載の組成物。
  36. 前記タンパク質が抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項35に記載の組成物。
  37. 前記核酸が、DNA、RNA、PNA、およびLNAを含む群から選択される、請求項35に記載の組成物。
  38. 前記核酸が機能的核酸であって、好ましくは、前記機能的核酸が、RNAi、siRNA、siNA、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される、請求項35または37のいずれか1項に記載の組成物。
  39. 前記第1のヘルパー脂質および/または前記第2のヘルパー脂質が、リン脂質およびステロイドを含む群から選択されるが、ただし、好ましくは、第1および/または第2のヘルパー脂質がセラミドではない、請求項1から38のいずれか1項に記載の組成物。
  40. 前記第1および/または第2のヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分が、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンおよび1,2?ジオレイル?sn?グリセロ?3?ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項39に記載の組成物。
  41. 前記ヘルパー脂質成分の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約20モル%から約80モル%である、請求項39から40のいずれかに記載の組成物。
  42. 前記ヘルパー脂質成分の含有量が約35モル%から約65モル%である、請求項41に記載の組成物。
  43. 前記脂質がβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸であり、前記ヘルパー脂質が1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンである、請求項40から42のいずれか1項に記載の組成物。
  44. 前記脂質が50モル%であり、前記ヘルパー脂質が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の50モル%である、請求項43に記載の組成物。
  45. さらに第2のヘルパー脂質を含む、請求項1から44のいずれか1項に記載の組成物。
  46. 前記第1および/または第2のヘルパー脂質が、PEG部分、HEG部分、ポリヒドロキシエチルスターチ(ポリHES)部分、およびポリプロピレン部分を含む群から選択される基を含み、前記成分が、好ましくは、約500から1000Da、より好ましくは、約2000から5000Daの分子量を提供する、請求項1から45のいずれか1項に記載の組成物。
  47. 前記PEG部分を含む前記ヘルパー脂質が、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンおよび1,2−ジアルキル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項46に記載の組成物。
  48. 前記ヘルパー脂質の前記PEG部分が、約2,000から5,000Daの分子量、好ましくは2,000Daの分子量を有する、請求項46に記載の組成物。
  49. 組成物が、前記脂質成分としてβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸を、第1のヘルパー脂質として1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンを、および第2のヘルパー脂質として1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−PEG2000を含む、請求項48に記載の組成物。
  50. 前記第2のヘルパー脂質の含有量が、前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約0.05モル%から4.9モル%、好ましくは、約1から2モル%である、請求項45から49のいずれか1項に記載の組成物。
  51. 前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約1から10モル%、より好ましくは1から7.5モル%、および最も好ましくは1から5モル%のPEGとセラミドとの複合体を含む、請求項1から50のいずれか1項に記載の組成物。
  52. 前記セラミドがC8mであり、PEGがPEG2000であり、かつ、PEGとセラミドの複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約1から5モル%である、請求項51に記載の組成物。
  53. 前記セラミドがC8mであり、PEGがPEG5000であり、かつ、PEGとセラミドの前記複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約1から5モル%である、請求項51に記載の組成物。
  54. 前記第1の脂質成分の含有量が、約42.5モル%から50モル%、前記第1のヘルパー脂質の含有量が、約42.5モル%から50モル%であって、前記第1の脂質成分、第1のヘルパー脂質、およびPEGとセラミドとの前記複合体の含有量の合計が100モル%である、請求項50から53のいずれか1項に記載の組成物。
  55. 核酸、好ましくは、機能的な核酸、より好ましくは、二本鎖リボ核酸、および最も好ましくは、RNAi、siRNA、siNA、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群から選択される核酸であって、好ましくは、カチオン性脂質に対するRNAiのモル比が、約0から0.075、好ましくは、約0.02から0.05、およびさらにより好ましくは0.037である核酸をさらに含む、請求項1から54のいずれか1項に記載の組成物。
  56. 前記担体が水性媒体であり、好ましくは、糖含有等張性水溶液であって、前記担体に含有される脂質組成物が分散物として、好ましくは、リポソームおよび/またはリポプレックスの分散物として存在している、請求項1から55のいずれか1項に記載の組成物。
  57. 前記脂質組成物が、約50モル%のβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸、約48から49モル%の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、および約1から2モル%の1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコールを含み、前記担体が水溶液である、請求項1から56のいずれか1項に記載の、好ましくは請求項31に記載の組成物。
  58. 好ましくは請求項1から57のいずれか1項に記載の組成物であるか、または該組成物に含有されるリポプレックスであって、
    c)以下のものからなる正に荷電したリポソーム、
    aa)約50モル%のβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸、好ましくは、(β−(L−アルギニル)−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸)
    ab)約48から49モル%の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE)
    ac)約1から2モル%の1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、N−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩;および
    d)機能的核酸、好ましくはsiRNA
    を含むリポプレックス。
  59. 前記リポプレックスのζ電位が約40から55mV、好ましくは約45から50mVである、請求項58に記載のリポプレックス。
  60. 前記リポプレックスが、QELSによって測定すると、約80から200nm、好ましくは約100から140nm、より好ましくは約110nmから130nmのサイズである、請求項58または59に記載のリポプレックス。
  61. 請求項58から60のいずれかに記載のリポプレックスを含む、請求項1から57のいずれか1項に記載の組成物。
  62. 前記薬剤を製造するための請求項1から57および61のいずれか1項に記載の組成物、または請求項58から60のいずれか1項に記載のリポプレックスの使用。
  63. 前記薬剤が、核酸、好ましくは機能的核酸を、内皮、好ましくは血管内皮に送達するためのものである、請求項62に記載の使用。
  64. 前記薬剤が、血管形成依存性疾患を治療するためのものである、請求項62または63に記載の使用。
  65. 前記疾患はがん疾患、より好ましくは固形腫瘍である、請求項64に記載の使用。
  66. 前記疾患が、腫瘍性疾患を含む群から選択されるが、より好ましくは、前記疾患が、骨がん、乳がん、前立腺がん、消化器官系のがん、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、膵臓がん、下垂体がん、精巣がん、眼窩がん(orbital cancer)、頭頸部がん、中枢神経系のがん、および呼吸器官系のがんを含む群から選択される、請求項63から65のいずれか1項に記載の使用。
  67. 前記薬剤が、1つまたはいくつかの他の治療法と併用して用いられる、請求項62から66のいずれか1項に記載の使用。
  68. 前記治療法が、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、および放射線療法を含む群から選択される、請求項67に記載の使用。
  69. 移動剤(transferring agent)としての請求項1から57および61のいずれか1項に記載の組成物、または請求項58から60のいずれか1項に記載のリポプレックスの使用。
  70. 前記移動剤が核酸を移動させ、前記核酸は、好ましくは、組成物に含有されている核酸であるか、または前記核酸は、好ましくは、リポプレックスの核酸成分である、請求項69に記載の使用。
  71. 前記核酸が機能的核酸であり、好ましくはsiRNAである、請求項70に記載の使用。
  72. 前記移動剤が、内皮、好ましくは血管内皮に特異的である、請求項69から71のいずれか1項に記載の使用。
  73. 前記移動剤が、薬学的活性成分および/または更なる構成成分を細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の中に移動させる、請求項69から72のいずれか1項に記載の使用。
  74. 薬学的活性化合物および/または更なる構成成分を、細胞に、または膜を通過して、好ましくは細胞膜を通過して移動させる方法であって、
    細胞または膜を提供するステップと、
    請求項1から57および61のいずれかに記載の組成物、または請求項58から60のいずれかに記載のリポプレックスであって、前記組成物が、任意で、薬学的活性化合物および/または更なる構成成分を含むものを提供する工程ステップと、
    細胞または膜を、請求項1から57および61のいずれかに記載の組成物、または請求項58から60のいずれかに記載のリポプレックスに接触させるステップと
    を含む方法。
  75. 細胞内および/または膜の向こう側で薬学的活性化合物および/または更なる構成成分を検出するステップをさらに含む、請求項74に記載の方法。
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