JP2009532064A - Nanoelectronic detection of biomolecules using analyte amplification and reporter - Google Patents

Abstract

生体分子の検出法であって、酵素（例えば、ヌクレアーゼ及びポリメラーゼ等）の被検体−誘発作用による標的レポーター及び被検体標的種の増幅法を含む該検出法が開示される。増幅された標的種（例えば、アンプリコン及びレポーター等）は、本発明の観点を有するナノ電子的センサーのいくつかの態様及び別の常套の生体分子検出法によって検出可能である。Biomolecule detection methods are disclosed, including target reporter and analyte target species amplification methods by analyte-induced effects of enzymes (eg, nucleases and polymerases, etc.). Amplified target species (eg, amplicons and reporters, etc.) can be detected by some embodiments of nanoelectronic sensors having other aspects of the invention and other conventional biomolecule detection methods.

Description

本発明は、ナノ電子的センサー装置を用いる生体分子用検出システムに関する。   The present invention relates to a detection system for biomolecules using a nanoelectronic sensor device.

関連出願のクロス・レファレンス
この出願は、米国特許法３５ＵＳＣ第１１９条（ｅ）による下記の米国仮特許出願に基づく優先権を主張する出願であり、これらの出願の明細書に開示された内容も本願明細書の一部を成すものである：
１）米国仮特許出願第６０／９０１５３８号（出願日：２００７年２月１４日、発明の名称：生体分子検出用電気化学的ナノセンサー）、
２）米国仮特許出願第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日、発明の名称：生体分子検出用電気化学的ナノセンサー）、及び
３）米国仮特許出願第６０／７８９０２２号（出願日：２００６年４月４日、発明の名称：被検体増幅とレポーター及びポリヌクレオチドとその他の生体分子のナノ電子的検出）。 Cross-reference of related applications This application claims priority based on the following US provisional patent applications under 35 USC 119 (e) of the US Patent Act 35, and the contents disclosed in the specifications of these applications are also included. Part of this specification:
1) US Provisional Patent Application No. 60/901538 (filing date: February 14, 2007, title of invention: electrochemical nanosensor for biomolecule detection),
2) US Provisional Patent Application No. 60 / 850,217 (Filing Date: October 6, 2006, Title of Invention: Electrochemical Nanosensor for Biomolecule Detection), and 3) US Provisional Patent Application No. 60 / 789,022 ( Application date: April 4, 2006, Title of invention: Analytical amplification and reporter, and nanoelectronic detection of polynucleotides and other biomolecules).

この出願は、特に下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／３１８３５４号（ＷＯ２００６／０７１８９５に対応する）（出願日：２００５年１２月２３日、発明の名称：ＤＮＡ検出とポリヌクレオチド配列の認識のためのナノ電子的センサー装置）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）、
２）米国仮特許出願第６０／７３８６９４号（出願日：２００５年１１月２１日）、
３）米国仮特許出願第６０／７３０９０５号（出願日：２００６年１０月２７日）、
４）米国仮特許出願第６０／６６８８７９号（出願日：２００５年４月５日）、
５）米国仮特許出願第６０／６５７２７５号（出願日：２００５年２月２８日）、
６）米国仮特許出願第６０／６３９９５４号（出願日：２００４年１２月２８日）。 No. 11/318354 (corresponding to WO 2006/071895), which claims priority based on the following US provisional patent application in particular (corresponding to WO 2006/071895), filed on Dec. 23, 2005 Nanoelectronic sensor device for DNA detection and polynucleotide sequence recognition), a continuation-in-part application claiming priority based on the application:
1) US Provisional Patent Application No. 60/748834 (filing date: December 9, 2005),
2) US Provisional Patent Application No. 60/734694 (filing date: November 21, 2005),
3) US Provisional Patent Application No. 60/730905 (Filing Date: October 27, 2006),
4) US Provisional Patent Application No. 60/668879 (filing date: April 5, 2005),
5) US Provisional Patent Application No. 60/657275 (filing date: February 28, 2005),
6) US Provisional Patent Application No. 60/639954 (filing date: December 28, 2004).

この出願は、特に下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／２１２０２６号（ＷＯ２００６／０２４０２３に対応する）（出願日：２００５年８月２４日、発明の名称：ＤＮＡ検出用ナノチューブセンサー装置）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／６２９６０４号（出願日：２００４年１１月１９日）、
２）米国仮特許出願第６０／６０４２９３号（出願日：２００４年８月２４日）。 This application is a US patent application no. 11/1212026 (corresponding to WO 2006/024023) which claims priority based on the following US provisional patent application in particular (filed on August 24, 2005, title of invention: A continuation-in-part application for a DNA detection nanotube sensor device) claiming priority based on the application:
1) US Provisional Patent Application No. 60/629604 (filing date: November 19, 2004),
2) US Provisional Patent Application No. 60/604293 (filing date: August 24, 2004).

この出願は、下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／５８８８４５号（出願日：２００６年１０月２６日、発明の名称：麻酔モニター、キャパシタンス・ナノセンサー及び動的検出サンプリング法）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）、
２）米国仮特許出願第６０／７７３１３８号（出願日：２００６年２月１３日）、
３）米国仮特許出願第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）、
４）米国仮特許出願第６０／７３０９０５号（出願日：２００５年１０月２７日）。 No. 11/588845, filed Oct. 26, 2006, entitled: Anesthesia Monitor, Capacitance Nanosensor and Motion, which claims priority based on the following US Provisional Patent Application: Application that is a continuation-in-part application of the Detective Sampling Method) and claims priority based on the application:
1) US Provisional Patent Application No. 60/850217 (filing date: October 6, 2006),
2) US Provisional Patent Application No. 60/773138 (filing date: February 13, 2006),
3) US Provisional Patent Application No. 60/748834 (filing date: December 9, 2005),
4) US Provisional Patent Application No. 60/730905 (filing date: October 27, 2005).

この出願は、米国仮出願第６０／７００９５３号（出願日：２００５年７月１９日）に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／４８８４６５号（公報：２００７／００４５７５６）（出願日：２００６年７月１８日、発明の名称：懸垂状一体化マイクロヒーターを備えたナノ電子的センサー）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である   This application is based on US Provisional Application No. 11/488465 (Gazette: 2007/0045756) claiming priority based on US Provisional Application No. 60 / 700,553 (Filing Date: July 19, 2005). July 18, 2006, title of invention: nanoelectronic sensor with pendant integrated micro-heater), a continuation-in-part application claiming priority based on the application

この出願の内容は下記の米国特許出願に関連するものであり、これらの出願の開示内容は本願明細書の一部を成すものである。
１）米国特許出願第１０／７０４０６６号（公報：２００４／０１３０７０）（出願日：２００３年１１月７日、発明の名称：生体分子のナノチューブに基づく電子的検出）、
２）米国特許出願第１０／３８８７０１号（特許：第６９０５６５５）（出願日：２００３年３月１４日、発明の名称：ナノ構造装置アレイ用の検出選択性の修正）、
３）米国特許出願第１０／３４５７８３号（公報：２００３／０１３４４３３）（出願日：２００３年１月１６日、発明の名称：機能化ナノ構造を用いる生物化学的試薬の電子的検出）、
４）米国特許出願第１０／２８０２６５号（特許：第６８９４３５９号）（出願日：２００２年１０月２６日、発明の名称：ナノチューブセンサーのための感度調整）、及び
５）米国特許出願第１０／１７７９２９号（ＷＯ ０４／０４０６７１に対応）（出願日：２００２年６月２１日、発明の名称：基体上でのナノチューブの分散増加）。 The contents of this application are related to the following US patent applications, and the disclosure content of these applications forms part of the present specification.
1) US Patent Application No. 10 / 704,066 (Publication: 2004/013070) (Filing date: November 7, 2003, Title of Invention: Electronic detection of biomolecules based on nanotubes),
2) US patent application Ser. No. 10 / 388,701 (patent: 6905655) (filing date: March 14, 2003, title of invention: modification of detection selectivity for nanostructured device arrays),
3) US Patent Application No. 10/345833 (Publication: 2003/0134433) (Filing date: January 16, 2003, Title of Invention: Electronic detection of biochemical reagents using functionalized nanostructures),
4) US patent application Ser. No. 10 / 280,265 (patent: 6894359) (filing date: October 26, 2002, title of invention: sensitivity adjustment for nanotube sensor), and 5) US patent application no. 10 / 177929 (corresponding to WO 04/040671) (filing date: June 21, 2002, title of invention: increased dispersion of nanotubes on the substrate).

従来技術の説明
ポリヌクレオチド中の塩基配列は遺伝情報をコードするので、これらの配列の解読性は生物工学の多くの進歩に寄与している。この研究によって、医療条件に関連する多くの重要な配列が確認されている。例えば、ＢＲＣＡ遺伝子は、通常は乳癌で患う女性の体内に存在する。医療的検査において、このような関連性を利用する目的で、特定の重要な配列が発現するかどうかを調べるために組織試料を走査する多くの技術が開発されている。これらの技術は、コスト高で、遅く、複雑であるために日常的な医療検査に適用するには不適当であるという難点がある。 2. Description of the Prior Art Since base sequences in polynucleotides encode genetic information, the decipherability of these sequences has contributed to many advances in biotechnology. This study identifies a number of important sequences related to medical conditions. For example, the BRCA gene is present in women who usually suffer from breast cancer. Many techniques have been developed to scan tissue samples to see if certain important sequences are expressed in order to take advantage of such associations in medical tests. These techniques have the disadvantage that they are costly, slow, and complex, making them unsuitable for routine medical testing.

一般にこれらの技術は、ポリヌクレオチドがハイブリッドを形成するという傾向に依存する。溶液中の短鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の鎖は、ｓｓＤＮＡ中の各々の塩基と対を形成する反対塩基を含む相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と容易に結合する。この結合の結果、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が形成される。ｄｓＤＮＡは加工処理によってｓｓＤＮＡから分離することができる。従って、特定の標的配列を走査するためには、実験者はプローブ（probe）配列として適当なｃＤＮＡを準備する。標的配列が試料中に存在するときには、標的ｓｓＤＮＡはプローブｓｓＤＮＡとハイブリッドを形成してｄｓＤＮＡを生成する。このハイブリッド形成はいくつかの方法によって検出することができる。   In general, these techniques rely on the tendency of polynucleotides to form hybrids. The strands of short DNA (ssDNA) in solution readily bind to complementary strand DNA (cDNA) containing opposite bases that pair with each base in ssDNA. As a result of this binding, double-stranded DNA (dsDNA) is formed. dsDNA can be separated from ssDNA by processing. Thus, to scan a specific target sequence, the experimenter prepares the appropriate cDNA as a probe sequence. When the target sequence is present in the sample, the target ssDNA hybridizes with the probe ssDNA to generate dsDNA. This hybridization can be detected by several methods.

現在行われている方法は、色素による蛍光−標識化オリゴヌクレオチド、量子ドット（quantum dot）又はオリゴヌクレオチド−改質金ナノ粒子による吸光度増加を利用することによる主として光学的な検出法に注目が集まっている。例えば、ＤＮＡハイブリッド形成の電気化学的検出法は、電極としてナノ構造体を用いておこなってもよい。しかしながら、電気化学的方法は、標識の電気化学的挙動によって左右される。   Current methods are mainly focused on optical detection methods by using fluorescence-labeled oligonucleotides by dyes, quantum dots, or increased absorbance by oligonucleotide-modified gold nanoparticles. ing. For example, an electrochemical detection method for DNA hybridization may be performed using a nanostructure as an electrode. However, the electrochemical method depends on the electrochemical behavior of the label.

この場合の第１の問題点は、このハイブリッド形成を検知するための多くの方法には、ハイブリッド形成前に試料中のｓｓＤＮＡを変性させる過程が含まれるということに起因する。ｓｓＤＮＡに対して蛍光分子を結合させることがしばしばおこなわれている。標識（label）として知られているこのような分子は光学的機器（例えば、顕微鏡及び分光器等）によるｓｓＤＮＡの検知を可能にする。標識化は、ハイブリッド形成後のＤＮＡ試料を検知するために利用されている。標的配列が標識化試料中に存在するときには、標識化されたｓｓＤＮＡは標識化されたｄｓＤＮＡに組み込まれので、該ｄｓＤＮＡは光学的機器を用いて検知することが可能となる。光学的検出法の利用により、上記方法は簡便なものとなるが、ＤＮＡを標識化する化学反応はコスト高で長時間を要する。標識化を必要としない検出法は、日常的な医療検査に対するＤＮＡ走査法の有用性を著しく増大させるであろう。   The first problem in this case is due to the fact that many methods for detecting this hybridization include a process of denaturing ssDNA in the sample before hybridization. Often, fluorescent molecules are bound to ssDNA. Such molecules, known as labels, allow the detection of ssDNA by optical instruments (eg, microscopes, spectrometers, etc.). Labeling is used to detect the DNA sample after hybridization. When the target sequence is present in the labeled sample, the labeled ssDNA is incorporated into the labeled dsDNA, so that the dsDNA can be detected using an optical instrument. The use of the optical detection method makes the above method simple, but the chemical reaction for labeling DNA is expensive and takes a long time. Detection methods that do not require labeling will significantly increase the utility of DNA scanning methods for routine medical testing.

第２の問題点は、伝統的な検出法の感度が低いことに起因する。この種の方法の一部の方法は低濃度のＤＮＡに対して感度を示すが、該方法においては、絶対数として多数のＤＮＡ分子を必要とする。医療的用途においては、通常は僅かな細胞のみが入手できるにすぎないため、試料中に存在する標的配列のＤＮＡ分子は僅かである。この問題は、標的ＤＮＡの量を百万倍増幅させることができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用によって改良されている。しかしながら、標識化法の場合と同様に、ＰＣＲは複雑な化学反応であるために、検査に要するコストが高くなり、また、時間もかかる。   The second problem is due to the low sensitivity of traditional detection methods. Some methods of this type are sensitive to low concentrations of DNA, but they require a large number of DNA molecules as absolute numbers. In medical applications, usually only a few cells are available, so there are only a few target sequence DNA molecules present in the sample. This problem is ameliorated by the use of polymerase chain reaction (PCR), which can amplify the amount of target DNA by a factor of one million. However, as in the case of the labeling method, PCR is a complex chemical reaction, so that the cost required for the test is high and it takes time.

標的被検体を、一般的には光学的検出法又は蛍光検出法を使用して検出するためのシステムにおいてオリゴヌクレオチドを利用する研究が知られている。例えば、次の特許文献（これらの特許文献も本願明細書の一部を構成するものである）を参照されたい：米国出願公開２００６−００４０２８６；「標的被検体のバイオ−バーコードに基づく検出」、及び米国特許第６７５００１６；「オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子とその使用」。しかしながら、これらの方法は、未変性の標的被検体（例えば、非−ＰＣＲ増幅被検体）に応答する増幅反応をもたらさず、また、電子的検出をもたらさない。   Studies are known that utilize oligonucleotides in systems for detecting target analytes, generally using optical or fluorescence detection methods. See, for example, the following patent documents (which are also part of this application): US Application Publication 2006-0040286; "Detection of target analyte based on bio-barcode" And US Pat. No. 6,751,0016; “Oligonucleotide-attached nanoparticles and uses thereof”. However, these methods do not result in an amplification reaction in response to a native target analyte (eg, a non-PCR amplified analyte) and do not provide electronic detection.

未変性の標的被検体に対する増幅応答について検討した研究も知られている。例えば、次の文献を参照されたい（これらの特許文献も本願明細書の一部を構成するものである）：Ｈ．Ｆ．リー、Ｙ．リ、Ａ．Ｗ．ワーク及びＲ．Ｍ．コーン、「ＤＮＡマイクロアレイのエキソヌクレアーゼIII消化によるＤＮＡの酵素的に増幅されたＳＰＲイメージ化検出」、Analytical Chem. 、第７７巻、第５０９６頁〜第５１００頁（２００５年）、及び米国出願公開２００５−００４８５０１：「ＤＮＡの検出又は同定のための方法と装置」。しかしながら、これらの方法は、電子的検出をもたらさない。   Studies are also known that examined the amplification response to native target analytes. For example, see the following documents (these patent documents are also part of the present specification): F. Lee, Y. Li, A. W. Work and R.W. M.M. Korn, “Enzymatically amplified SPR imaging detection of DNA by exonuclease III digestion of DNA microarrays”, Analytical Chem., 77, 5096-5100 (2005), and US Application Publication 2005. -0048501: "Method and apparatus for the detection or identification of DNA". However, these methods do not provide electronic detection.

ＤＮＡと共に他の生体分子は、生物学的プロセス及び医学的な診断と治療に関する科学的理解において重要性が増大している。生体分子、例えば、タンパク質、多糖及びＲＮＡ等を検出する必要性がある。タンパク質のような被検体の検出法に関する研究も知られている。例えば、次の特許文献（該文献も本願明細書の一部を成すものである）を参照されたい：米国出願公開２００６−００１４１７２；「アプタマー−ナノ粒子結合体及び標的被検体を検出するための該結合体の用法」。しかしながら、このような方法も、未変性の標的被検体の標的部位の増幅をもたらさず、また、電子的検出をもたらさない。   Other biomolecules along with DNA are of increasing importance in scientific understanding of biological processes and medical diagnosis and treatment. There is a need to detect biomolecules such as proteins, polysaccharides and RNA. Studies on detection methods for analytes such as proteins are also known. See, for example, the following patent document, which is also a part of this specification: US Application Publication 2006-0014172; “For detecting aptamer-nanoparticle conjugates and target analytes” Usage of the conjugate ". However, such methods also do not result in amplification of the target site of the native target analyte and do not provide electronic detection.

このため、当該分野においては、特定の標的生体分子を高感度で迅速に検知できる強力な技術が明らかに要請されている。このような技術は、ＰＣＲ又はその他の標的被検体の増幅法を使用せず、かつ被検体種の標識化を必要とせずに操作されるべきである。また、この種の技術は増幅された検出反応と電子的検出をもたらすべきである。さらに、この種の技術は、被検体試料の濃縮及び／又は単一化若しくは精製をもたらすだけでなく、感度と選択性を高めることが望ましい。   Therefore, in this field, there is a clear demand for a powerful technique that can detect a specific target biomolecule with high sensitivity and speed. Such techniques should be operated without using PCR or other target analyte amplification methods and without requiring labeling of analyte species. This type of technique should also provide an amplified detection reaction and electronic detection. Furthermore, it is desirable that this type of technique not only results in concentration and / or singulation or purification of the analyte sample, but also increases sensitivity and selectivity.

被検体種の標識化又は増幅の必要性を回避すると共に電子的信号をもたらす方法を提供する顕著な目的は、簡単化された自動化バイオ検出能を迅速かつ低コストの介護時点での診断的用途に対して適用できるようにすることであり、好ましくは、該方法は非実験室的な臨床的又は家庭的な状況下で行ってもよい。   A prominent objective to provide a method for avoiding the need for labeling or amplification of analyte species and providing an electronic signal is to provide a simplified automated biodetection capability for diagnostic applications at a fast and low cost care point Preferably, the method may be performed in non-laboratory clinical or home situations.

本発明の観点を有する装置と方法の付加的な説明と概要は、前記の「関連出願のクロス・レファレンス」において例示した共同発明に係る仮出願及び非仮出願の明細書に記載されており、これらの出願明細書の記載内容も本願明細書の一部を成すものである。本願は、これらの出願明細書の開示内容と記載と共に理解されるべきである。特に、これらの出願明細書には、ナノ電子装置及び標識を使用せずにポリヌクレオチドと他の被検体種を検出して同定する方法の多数の代替的な実施態様が記載されている。   Additional descriptions and summaries of apparatus and methods having aspects of the present invention can be found in the specification of provisional and non-provisional applications related to the joint invention exemplified in the aforementioned “Cross Reference of Related Applications”, The descriptions in these application specifications also form part of the present specification. The present application should be understood in conjunction with the disclosure and description of these application specifications. In particular, these applications describe numerous alternative embodiments of methods for detecting and identifying polynucleotides and other analyte species without the use of nanoelectronic devices and labels.

ナノ電子的検出装置（nanoelectronic detector device）
ナノ構造体（nanostructure）は、センサーとしての用途においては特有の特性を発揮する。即ち、ナノ構造体は実質的に一次元的であって、電子的摂動に対して著しく高い感度を示すと共に、容易に機能化させることができ、また、多くの半導体製造法に適合させることができる。本発明の観点による実施態様においては、表面上に存在する原子によって大きな影響を受ける特性を有するナノ構造体を使用するので、高感度の電子的検出のための基礎がもたらされる。例示的な実施態様においては、好ましくは１又は複数のカーボンナノチューブを含み、より好ましくは１又は複数の単層カーボンナノチューブ（single-walled carbon nanotube；ＳＷＮＴ）を含む。 Nanoelectronic detector device
Nanostructures exhibit unique properties for sensor applications. That is, nanostructures are substantially one-dimensional, exhibit significantly higher sensitivity to electronic perturbations, can be easily functionalized, and can be adapted to many semiconductor manufacturing methods. it can. In embodiments according to aspects of the present invention, nanostructures having properties that are greatly affected by atoms present on the surface are used, thus providing the basis for sensitive electronic detection. In an exemplary embodiment, it preferably includes one or more carbon nanotubes, more preferably one or more single-walled carbon nanotubes (SWNTs).

別の装置の実施態様には、一般的には、標的被検体との相互作用に対して高い感度を示す電子的特性を有する少なくとも１つのナノ構造体（ナノ構造体素子）を具有する素子が含まれていてもよい。１又は複数の導電性素子はナノ構造体素子と連絡していてもよく、これによって、装置の１又は複数の電子的特性であって、被検体の媒体に曝されたときのナノ構造体素子の応答によって影響を受ける電子的特性を測定するための信号を得ることができる。   Another apparatus embodiment generally includes an element comprising at least one nanostructure (nanostructure element) having electronic properties that are highly sensitive to interaction with a target analyte. It may be included. The one or more conductive elements may be in communication with the nanostructure element, whereby the one or more electronic characteristics of the device, the nanostructure element when exposed to the analyte medium A signal can be obtained for measuring the electronic properties affected by the response of.

一般的には、ナノ構造体素子と導体は支持用基体に隣接して配置される。該基体は、一般的には、少なくとも１つの誘電性表面（又は表面コーティング）を含んでおり、これによって装置素子の電気的絶縁がもたらされる。基板は剛直であってもよく、あるいは可撓性であってもよく、あるいは多孔性若しくは非多孔性であってもよい。一般的には平面状又は平坦状であるが、機能的な形態（例えば、管状形態）を有していてもよい。別の多数の基体の化学的組成としては、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、ポリイミド及びポリカーボネート等が例示される。本明細書に記載の多くの実施例において、基体は、酸化ケイ素、ＳｉＯ_２、及びＳｉ_３Ｎ_４等の材料を含む１又は複数の層、フィルム又はコーティングをシリコンウェーハ又はシリコンチップ上に具有する。 Generally, the nanostructure element and the conductor are disposed adjacent to the supporting substrate. The substrate generally includes at least one dielectric surface (or surface coating), which provides electrical isolation of the device elements. The substrate may be rigid, flexible, porous or non-porous. Generally, it is planar or flat, but may have a functional form (for example, a tubular form). Examples of the chemical composition of many other substrates include silicon oxide, silicon nitride, aluminum oxide, polyimide, and polycarbonate. In many embodiments described herein, the substrate comprises one or more layers, films or coatings comprising materials such as silicon oxide, SiO ₂ , and Si ₃ N ₄ on a silicon wafer or silicon chip. .

ナノチューブネットワーク（nanotube network）装置
ナノセンサー装置の１つの実施態様においては、ナノ構造体素子は、複数のナノ構造体、例えば、集合的構造を形成するように配置されるＳＷＮＴ又はその他のナノチューブ等を含んでいてもよい。ナノセンサー装置の多くの好ましい実施態様においては、ナノ構造体素子は、基体又は基体に隣接して配置されて少なくとも１つの導線と連絡するナノチューブがランダムに相互連結されたネットワーク（ナノチューブネットワーク）を含むことが有利である。 Nanotube network device In one embodiment of a nanosensor device, the nanostructure element comprises a plurality of nanostructures, such as SWNTs or other nanotubes arranged to form a collective structure. May be included. In many preferred embodiments of the nanosensor device, the nanostructure element comprises a network (nanotube network) in which nanotubes arranged adjacent to the substrate and in communication with at least one conductor are randomly interconnected (nanotube network). It is advantageous.

ナノチューブネットワークは、伝統的なリソグラフィーを用いる化学蒸着（ＣＶＤ）法、溶剤懸濁沈着法及び真空蒸着法等によって調製してもよい。この点に関しては、下記の文献を参照されたい：米国特許出願第１０／１７７９２９号明細書（該明細書はＷＯ２００４／０４０６７１に対応する）；同第１０／２８０２６５号明細書；同第１０／８４６０７２号明細書；Ｌ．フーら、ナノ・レターズ（２００４年）、第４巻、第１２号、第２５１３頁〜第２５１７頁（「透明な導電性カーボンナノチューブネットワークにおけるパーコレーション」）。これらの文献の開示内容も本明細書の一部を成すものである。   Nanotube networks may be prepared by chemical vapor deposition (CVD) using traditional lithography, solvent suspension deposition, vacuum deposition, and the like. In this regard, reference is made to the following documents: US patent application Ser. No. 10 / 177,929 (corresponding to WO 2004/040671); No. 10/280265; No. 10/846072. Specification; Fu et al., Nano Letters (2004), Vol. 12, No. 12, pp. 2513-2517 (“Percolation in Transparent Conductive Carbon Nanotube Networks”). The disclosures of these documents are also part of this specification.

ナノ構造体素子（例えば、ナノチューブネットワーク）の特性は、１又は複数の接触子（contact）を用いて測定してもよい。接触子は、ナノチューブネットワークのようなナノ構造体素子と電気的に接続するように配置させた導電性素子を含む。例えば、接触子は、基板の表面上へ直接的に配置させてもよく、あるいは、ナノチューブネットワーク上に配置させてもよい。ナノチューブネットワークを流れる電流は、ナノチューブネットワークの特定の領域内において該ネットワークと電気的に接続させた少なくとも２つの接触子を用いて測定してもよい。   The properties of the nanostructure element (eg, nanotube network) may be measured using one or more contacts. The contact includes a conductive element arranged to be electrically connected to a nanostructure element such as a nanotube network. For example, the contacts may be placed directly on the surface of the substrate or may be placed on the nanotube network. The current flowing through the nanotube network may be measured using at least two contacts electrically connected to the network in a particular region of the nanotube network.

トランジスターの実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ゲート電極又は対（counter）電極と呼ばれる付加的な導電性素子が配置される。即ち、該導電性素子は、ナノ構造体素子（例えば、少なくとも１つのナノチューブ）とは電気的に接続しないが、ケート電極とナノ構造体素子との間に電気的キャパシタンスが存在するように配置される。 Transistor Embodiments In some embodiments of the present invention, additional conductive elements, called gate electrodes or counter electrodes, are placed. That is, the conductive element is not electrically connected to the nanostructure element (eg, at least one nanotube), but is disposed such that an electrical capacitance exists between the Kate electrode and the nanostructure element. The

例示的な装置は、トランジスターのチャンネルがナノチューブを含む電界効果トランジスターを具備しているので、該装置はナノチューブ電界効果トランジスター又はＮＴＦＥＴと呼んでもよい。例えば、ゲート電極は、酸化ケイ素の下方の基板内の導電性平面である。あるいは、ゲート電極又は対電極は、ナノ構造体素子に隣接した状態（例えば、下部、上部又は側部に隣接した状態）であって、該素子から電気的に絶縁された状態で配置された導電性層、例えば、可撓性基板上に沈着された導電性ポリマー材料層を含んでいてもよい。ナノチューブの抵抗、インピーダンス、相互コンダクタンス又はその他の特性は、選定されるか又は可変性のゲート電圧の影響下で測定してもよい。   Since the exemplary device comprises a field effect transistor in which the channel of the transistor comprises a nanotube, the device may be referred to as a nanotube field effect transistor or NTFET. For example, the gate electrode is a conductive plane in the substrate below the silicon oxide. Alternatively, the gate electrode or counter electrode is in a state adjacent to the nanostructure element (eg, adjacent to the bottom, top, or side) and is electrically isolated from the element. May include a conductive layer, for example, a conductive polymer material layer deposited on a flexible substrate. Nanotube resistance, impedance, transconductance or other properties may be selected or measured under the influence of a variable gate voltage.

この種のナノチューブ電子装置としては、特に下記の文献に記載されているものが例示される：米国特許出願第１０／６５６８９８号（出願日：２００３年９月５日）及び同第１０／７０４０６６号（出願日：２００３年１１月７日）（該出願は、ＵＳ２００４／０１３２０７０として公開された）。これらの文献の記載内容も本明細書の一部を成すものである。   Examples of this type of nanotube electronic device include those described in the following documents: US Patent Application Nos. 10/656898 (filing date: September 5, 2003) and 10 / 704,066. (Application date: November 7, 2003) (The application was published as US 2004/0132070). The contents of these documents are also part of this specification.

トランジスター装置は、ゲート電圧（例えば、Ｇ／Ｖｇ信号等）の関数としてのチャンネルの相互コンダクタンスを測定するために役立つ。トランジスターは最大のコンダクタンス、即ち、所定範囲のゲート電圧を用いて測定された最も大きなコンダクタンス、及び最少のコンダクタンス、即ち、所定範囲のゲート電圧を有いて測定された最も小さなカンダクタンスを有する。トランジスターは、最大コンダクタンスと最小コンダクタンスとの比であるオン−オフ比を有する。高感度の化学センサーを製造するためには、ナノチューブトランジスターのオン−オフ比は、好ましくは１．２よりも大きな値であり、より好ましくは２よりも大きな値であり、最も好ましくは１０よりも大きな値である。   The transistor device is useful for measuring the transconductance of the channel as a function of gate voltage (eg, G / Vg signal, etc.). The transistor has the largest conductance, i.e. the largest conductance measured with a range of gate voltages, and the smallest conductance, i.e. the smallest conductance measured with a range of gate voltages. The transistor has an on-off ratio that is the ratio of maximum conductance to minimum conductance. In order to produce a highly sensitive chemical sensor, the on-off ratio of the nanotube transistor is preferably greater than 1.2, more preferably greater than 2, and most preferably greater than 10. It is a big value.

被検体の認識
標的種や雑種汚染物等を含む被検体含有媒体と装置素子との相互作用を仲介させるために、ナノ構造体素子（例えば、１又は複数のナノ構造体素子への付着種若しくは付着層又は吸着種若しくは吸着層、基板、及び導体等）に関連して付加的な物質を含めてもよい。このような物質としては、１又は複数の認識層又は分子トランスデューサー（例えば、後述の実施例において説明するｓｓＤＮＡオリゴマープローブ等）、触媒物質、不活性化物質、抑制物質、保護物質、フィルター、被検体吸引剤、濃縮剤及び結合性種等が例示される。この種の物質と素子は、選択性、特異性及び／又は装置の使用特性を改良する機能を果たすことができる。 In order to mediate the interaction between the analyte-containing medium including the recognition target species of the analyte, the hybrid contaminant, etc., and the device element, the nanostructure element (for example, the adhering species to one or a plurality of nanostructure elements or Additional materials may be included in connection with the adhering layer or adsorbing species or adsorbing layer, the substrate, and the conductor. Such substances include one or more recognition layers or molecular transducers (eg ssDNA oligomer probes described in the examples below), catalytic substances, inactivating substances, inhibitory substances, protective substances, filters, coated substances. Examples include sample aspirating agents, concentrating agents, and binding species. Such materials and elements can serve to improve selectivity, specificity and / or usage characteristics of the device.

ポリヌクレオチド種
本発明は、ポリヌクレオチドの特異的な標的配列を検出するための電子センサー装置を提供する。特定の実施態様においては、該センサーは、ポリヌクレオチドと相互作用して検出性素子として作用するナノ構造体素子（例えば、単層及び／又は多層カーボンナノチューブ及び／又は該ナノチューブを含有する相互連結性ネットワーク等）を含有する。以下において詳述する実施例においては、ナノ構造体素子はカーボンナノチューブ、特にランダムに配向したカーボンナノチューブのネットワークを含有する。これらの実施例においては、検出前に、ナノチューブはｓｓＤＮＡプローブ配列の吸着によって改質される。ＤＮＡの標識化は不要である。さらに、本発明は、該センサー装置の使用法を提供する。 Polynucleotide species present invention provides an electronic sensor device for detecting a specific target sequence of the polynucleotide. In certain embodiments, the sensor is a nanostructured element that interacts with a polynucleotide to act as a detectable element (eg, single-walled and / or multi-walled carbon nanotubes and / or interconnectivity containing the nanotubes). Network, etc.). In the examples detailed below, the nanostructure elements contain a network of carbon nanotubes, particularly randomly oriented carbon nanotubes. In these examples, the nanotubes are modified by adsorption of ssDNA probe sequences prior to detection. No labeling of DNA is necessary. Furthermore, the present invention provides a method for using the sensor device.

本明細書で使用する「ＤＮＡ」という用語はポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドとしては、特に限定的ではないが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、メッセンジャーリボ核酸、転移リボ核酸及びペプチド核酸が例示される。ポリヌクレオチドの明確な特徴は、核酸の鎖と塩基の配列であり、各々の塩基は核酸に化学的に結合し、また、各々の塩基は整合性配列（matching sequence）上で適当な塩基と対を形成する。   As used herein, the term “DNA” refers to a polynucleotide. Examples of the polynucleotide include, but are not limited to, deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, messenger ribonucleic acid, transfer ribonucleic acid, and peptide nucleic acid. A distinctive feature of a polynucleotide is the sequence of nucleic acid strands and bases, each base chemically binding to a nucleic acid, and each base paired with an appropriate base on the matching sequence. Form.

当業者であれば、これらの明確な特徴を有するポリヌクレオチドのその他の変形誘導体を調製することができる。従って、「単鎖ＤＮＡ」（以下においては、「ｓｓＤＮＡ」で表示する）はデオキシリボ核酸、リボ核酸又はその他の前記のポリヌクレオチドの単鎖であってもよい。「二重鎖ＤＮＡ」（以下においては、「ｄｓＤＮＡ」で表示する）は上記のいずれかのポリヌクレオチドの二重鎖であってもよい。「相補的ＤＮＡ」（以下においては、「ｃＤＮＡ」で表示する）は、既に言及した単鎖配列に対して相補的な単鎖配列である前記のポリヌクレオチドのいずれの鎖であってもよい。   One skilled in the art can prepare other modified derivatives of polynucleotides having these distinct characteristics. Accordingly, the “single-stranded DNA” (hereinafter referred to as “ssDNA”) may be a single strand of deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid or other such polynucleotides. The “double-stranded DNA” (hereinafter referred to as “dsDNA”) may be a double-stranded DNA of any of the above polynucleotides. The “complementary DNA” (hereinafter referred to as “cDNA”) may be any strand of the aforementioned polynucleotide that is a single-stranded sequence complementary to the single-stranded sequence already mentioned.

特定のセンサー装置中のｓｓＤＮＡは、特定の標的配列のためのｃＤＮＡになるように選択してもよい。標的配列は、センッサー装置によって検出されるべき塩基配列である。標的配列用のｃＤＮＡは、プローブ（probe）配列として知られている。標的配列が特定されたならば、プローブ配列を有する一定量のＤＮＡを入手しなければならない。特定配列を有するＤＮＡの合成及び所定の配列に対して相補的なＤＮＡの合成に関しては種々の技術が知られている。当業者であれば、これらの技術に関する知識を有している。所望の標的配列に対して特異的なプローブを調製するのに適当なｃＤＮＡ又はその他のポリヌクレオチドは、バイオテクノロジー工業に関連する既知の商業的製造業者から一般的に入手することができる。   The ssDNA in a particular sensor device may be selected to be a cDNA for a particular target sequence. The target sequence is a base sequence to be detected by the sensor device. The cDNA for the target sequence is known as the probe sequence. Once the target sequence has been identified, a certain amount of DNA with the probe sequence must be obtained. Various techniques are known for synthesizing DNA having a specific sequence and synthesizing DNA complementary to a predetermined sequence. Those skilled in the art have knowledge of these techniques. CDNA or other polynucleotides suitable for preparing probes specific for the desired target sequence are generally available from known commercial manufacturers associated with the biotechnology industry.

センサー装置は、試料ｓｓＤＮＡを含有する溶液にナノチューブネットワークを接触させることによって使用してもよい。ネットワークは、ハイブリッド形成がおこなわれるのに充分に長い時間にわたって該溶液と接触させるべきである。この接触時間は、試料ＤＮＡの濃度、該溶液の量、室内の温度、溶液のｐＨ、及びその他の可変要因によって左右される。当業者であれば、ＤＮＡのハイブリッド形成に対するこれらの可変要因の効果について精通しており、適当な接触時間、溶液の組成、温度及びその他のハイブリッド形成に関連する条件を過度の実験を伴うことなく選定することができる。   The sensor device may be used by contacting the nanotube network with a solution containing the sample ssDNA. The network should be in contact with the solution for a time long enough for hybridization to occur. This contact time depends on the concentration of the sample DNA, the amount of the solution, the room temperature, the pH of the solution, and other variable factors. Those skilled in the art are familiar with the effects of these variables on DNA hybridization and will determine the appropriate contact time, solution composition, temperature and other conditions associated with hybridization without undue experimentation. Can be selected.

前記の全てのセンサーの実施態様におけるポリヌクレオチドのハイブリッド形成の発生、速度及び特異性が種々の条件に左右されることに留意すべきである。各々のハイブリッド形成過程においては、ｄｓＤＮＡの結合エネルギーは緊縮技術（stringency technique）によって測定することができる。このような測定は、温度を増加させるか、又は緩衝液を、例えば、水酸化ナトリウム等に変更することによっておこなうことができる。   It should be noted that the occurrence, rate and specificity of polynucleotide hybridization in all the sensor embodiments described above depend on various conditions. In each hybridization process, the binding energy of dsDNA can be measured by a stringency technique. Such a measurement can be performed by increasing the temperature or changing the buffer to, for example, sodium hydroxide.

付加的な緊縮対照は、ハイブリッド形成媒体の種々のイオン性成分（例えば、ナトリウムイオン又はマグネシウムイオン等）を含有していてもよい。あるいは、又は、さらに、ハイブリッドの形成前、形成中及び／又は形成後において、センサーの素子（例えば、ナノチューブネットワーク）に電圧を印加することによって、ポリヌクレオチドの挙動に影響を及ぼしてもよい。例えば、ｃＤＮＡのようなポリヌクレオチドはホスフェートに基づく骨格を有しており、該骨格は、一般的にはハイブリッド形成媒体中においてはイオン化されており、局在化された負電荷を保有する。選択的に帯電させたセンサー素子は、例えば、対応する完全に整合化した（matched）プローブの対応するハイブリッドに対してＳＮＰ−不整合化（mismatched）プローブのハイブリッドを不安定化させるために、例えば、インキュベーション中又はすすぎ処理中において、牽引性又は反発性の緊縮因子を付与するために使用してもよい。   Additional stringent controls may contain various ionic components of the hybridization medium, such as sodium ions or magnesium ions. Alternatively, or in addition, the behavior of the polynucleotide may be influenced by applying a voltage to the sensor element (eg, nanotube network) before, during and / or after the formation of the hybrid. For example, polynucleotides such as cDNA have a phosphate-based backbone that is generally ionized in the hybridization medium and carries a localized negative charge. A selectively charged sensor element can be used, for example, to destabilize a hybrid of a SNP-mismatched probe relative to a corresponding hybrid of a corresponding fully matched probe, for example It may be used to impart a traction or rebound stringency factor during incubation or rinsing.

緊縮因子を変化させることによって、完全または不完全な相補的塩基対と鎖との結合を差別化することが可能である。緊縮過程に応答してナノチューブの電気的特性が変化することによって、特に、単一塩基の不整合（ＳＮＰ）の差別化が可能となる。当業者であれば、標的配列の完全なハイブリッド形成と不完全なハイブリッド形成に対する感度の選択度を得るために、本発明によるセンサーの特定の実施態様の操作を適合させるように、ハイブリッド形成の条件を変化させることができる。   By varying the stringency factor, it is possible to differentiate between complete or incomplete complementary base pairs and strand binding. The change in the electrical properties of the nanotubes in response to the stringency process allows in particular differentiation of single base mismatches (SNPs). Those skilled in the art will understand the hybridization conditions to adapt the operation of a particular embodiment of the sensor according to the invention in order to obtain a selectivity of sensitivity to complete and incomplete hybridization of the target sequence. Can be changed.

例えば、特定の対立遺伝子に対して同型のＤＮＡ試料を、該対立遺伝子に対して異型の他の比較試料と区別するためのアッセイにおいては、ハイブリッド形成の緊縮条件を、例えば、温度を変化させることにより調整することによって、同型試料と異型試料との間において明確に異なる装置の測定応答が得られるようにしてもよい。   For example, in an assay to distinguish a DNA sample that is homozygous for a particular allele from other comparative samples that are heterologous to that allele, the stringency conditions for hybridization can vary, for example, by changing the temperature. The measurement response of a device that is clearly different between the same-type sample and the different-type sample may be obtained by adjusting according to.

本発明の観点による各々のセンサーの実施態様においては、これらのセンサーはアレイ（array）（例えば、複数の異なる標的ＤＮＡフラグメントに対して機能化されたトランジスターセンサーのアレイ）として構築させてもよい。これに関しては、下記の文献を参照されたい：米国特許出願第１０／３８８７０１号（特許公報２００３−０１７５１６１）（発明の名称：ナノ構造体装置アレイの検出感度の修正）。この文献の記載内容も本明細書の一部を成すものである。   In each sensor embodiment in accordance with aspects of the invention, these sensors may be constructed as an array (eg, an array of transistor sensors functionalized to a plurality of different target DNA fragments). In this regard, reference is made to the following document: US patent application Ser. No. 10 / 388,701 (Patent Publication 2003-0175161) (Title of Invention: Correction of detection sensitivity of nanostructure device array) The contents of this document are also part of this specification.

電気化学的検出器の実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ナノ構造化素子、例えば、カーボンナノチューブネットワークを含む電極等は、試料中の１種又は複数種の被検体の存在と濃度の測定を可能にするように、本願明細書に記載の被検体標的種及び／又はレポーターの電気化学的相互作用を検出するために使用してもよい。この点に関しては、例えば、本願発明と同時になされた発明に関する次の米国特許出願（発明の名称はいずれも「生体分子検出用電気化学的ナノセンサー」である）の明細書に記載されている検出方法と装置を参照されたい：第６０／９０１５３８号（出願日：２００７年２月１４日）及び第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）。これらの特許出願の明細書に記載内容も本願明細書の一部を成すものである。 Electrochemical Detector Embodiments In some embodiments of the present invention, the nanostructured element, such as an electrode comprising a carbon nanotube network, is present in the presence and concentration of one or more analytes in the sample. May be used to detect the electrochemical interaction of the analyte target species and / or reporters described herein. In this regard, for example, detection described in the specification of the following US patent application relating to the invention made at the same time as the present invention (the name of the invention is “electrochemical nanosensor for biomolecule detection”) See methods and apparatus: 60/901538 (filing date: February 14, 2007) and 60/850217 (filing date: October 6, 2006). The contents described in the specifications of these patent applications also form part of the present specification.

キャパシタンス検出器の実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ナノ構造化容量性素子を含む検出器は、試料中の１種又は複数種の被検体の存在と濃度の測定を可能にするように、本願明細書に記載の被検体標的種及び／又はレポーターの電気化学的相互作用を検出するために使用してもよい。この点に関しては、例えば、本願発明と同時になされた発明（発明の名称：麻酔モニター、キャパシタンスナノセンサー及び動的検出サンプリング法）に関する米国特許出願第１１／５８８８４５号（出願日：２００６年１０月２６日）の明細書に記載されている検出方法と装置を参照されたい。なお、この特許出願は次の米国特許出願に基づく優先権を主張する出願である：第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）、第６０／７７３１３８号（出願日：２００６年２月１３日）、第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）及び第６０／７３０９０５号（出願日：２００５年１０月２７日）。これらの特許出願の明細書に記載内容も本願明細書の一部を成すものである。 Capacitance Detector Embodiments In some embodiments of the invention, a detector comprising a nanostructured capacitive element allows for the determination of the presence and concentration of one or more analytes in a sample. As such, it may be used to detect the electrochemical interaction of the analyte target species and / or reporters described herein. In this regard, for example, US patent application Ser. No. 11 / 588,845 (filing date: October 26, 2006) relating to an invention made simultaneously with the present invention (name of invention: anesthesia monitor, capacitance nanosensor and dynamic detection sampling method). See the detection methods and devices described in the specification of This patent application is an application claiming priority based on the following US patent applications: No. 60/850217 (application date: October 6, 2006), No. 60/773138 (application date: 2006) Feb. 13), 60/74834 (Filing date: December 9, 2005) and No. 60/730905 (Filing date: October 27, 2005). The contents described in the specifications of these patent applications also form part of the present specification.

検出のための代替的な方法、標識、マーカー及び装置
詳細に記載された例示的な実施態様においては、科学的又は光学的に活性な標識又はマーカーに左右されない電子的信号によって検出できるという利点を有するレポーターに焦点があてられているが、本発明の技術的思想を逸脱することなく、別の方法を利用することも可能である。 Alternative Methods for Detection, Labels, Markers, and Apparatus In the exemplary embodiments described in detail, the advantage is that they can be detected by electronic signals that are independent of scientifically or optically active labels or markers. Although the reporter is focused on, other methods can be used without departing from the technical idea of the present invention.

例えば、本願明細書に記載のいずれかの増幅法から誘導されるアンプリコン（amplicon）、種又はレポーターフラグメントは、当該分野において知られている多数の異なるレポーター又は被検体の検出法を実行に移すように設計された特定のマーカー、標識又は検出エンハンサー、例えば、蛍光性マーカー、消光基、質量改変、光学的検出、分光分析、電気泳動的移動度の改変、及びレポーター親和性の改変等を含んでいてもよい。同様に、本発明によるいずれかの増幅法によって誘導されるアンプリコン、種又はレポーターフラグメントは二次的な生体分子反応に関与させることによって、例えば、触媒的効果によるか、又は蛍光性プローブが独立的な酵素的な攻撃若しくは再配置等を受けやすくするように誘発することにより検出可能な効果がもたらされるように設計してもよい。   For example, an amplicon, species or reporter fragment derived from any amplification method described herein implements a number of different reporter or analyte detection methods known in the art. Specific markers, labels or detection enhancers designed to include fluorescent markers, quenching groups, mass modifications, optical detection, spectroscopic analysis, electrophoretic mobility modifications, reporter affinity modifications, etc. You may go out. Similarly, amplicons, species or reporter fragments derived by any amplification method according to the present invention may be involved in secondary biomolecular reactions, for example by catalytic effects or by independent fluorescent probes. It may be designed to produce a detectable effect by triggering it to be susceptible to typical enzymatic attack or rearrangement.

非−ＰＣＲレポーター増幅
本発明の１つの観点によれば、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子、例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等を増幅して放出させた後に、該レポーター分子の量を電子的に検出する方法が提供される。本発明による観点を有する特定の実施態様においては、ポリヌクレオチドに対して特異的な活性を有する酵素は、選択された被検体の存在を表示するレポーター部分であって、本発明による観点を有するナノセンサーの使用によって電子的に検出可能な該レポーター部分の非−ＰＣＲ増幅を達成するために使用してもよい。この種の実施態様は、非循環的増幅を行う態様として記載されてもよい。即ち、該実施態様においては、増幅過程においては、例えば、ＰＣＲの場合のように反応条件を循環的に変化させるための複雑な制御システムは不要である。 Non-PCR Reporter Amplification According to one aspect of the present invention, after amplifying and releasing a reporter molecule, such as a specific DNA oligomer, in response to a very small amount of target analyte, the amount of the reporter molecule A method is provided for electronically detecting. In a particular embodiment having an aspect according to the present invention, the enzyme having specific activity for the polynucleotide is a reporter moiety that indicates the presence of a selected analyte, the nanopart having an aspect according to the present invention. It may be used to achieve non-PCR amplification of the reporter moiety that is electronically detectable by use of a sensor. This type of embodiment may be described as performing an acyclic amplification. That is, in this embodiment, in the amplification process, for example, a complicated control system for cyclically changing the reaction conditions as in the case of PCR is not necessary.

本発明による観点を有する第１の実施態様においては、プローブ集合体は、１種又は複数種のオリゴヌクレオチドプローブが結合した基体、例えば、磁性ビーズ及び滴定ウェル等を具有する。例えば、ビーズ基体は、ビーズ表面上に区分されて別々に機能する複数のオリゴヌクレオチドプローブを保持することによって、複数のプローブ集合体を形成してもよい。各々のこの種のオリゴヌクレオチドプローブは、ナノコード配列部分と捕獲配列部分を含む。ナノコード配列部分は、レポーターオリゴヌクレオチド上の対応する配列に対して相補的になるように選択される。プローブ集合体の調製に際しては、レポーターオリゴヌクレオチドは、適当な条件下においてハイブリッド形成されてナノコード配列となる。捕獲配列部分は、標的被検体ポリヌクレオチド上の対応する配列（標的配列）に対して相補的になるように選択される。捕獲配列とナノコードを有するオリゴヌクレオチドプローブは、既知の方法によって所定の配列を有するように調製した後、既知の方法によって基体、例えば、磁性ビーズの表面又はその他の不動化表面上へ付着させてもよい。   In a first embodiment having aspects according to the present invention, the probe assembly comprises a substrate to which one or more oligonucleotide probes are bound, such as magnetic beads and titration wells. For example, the bead substrate may form a plurality of probe assemblies by holding a plurality of oligonucleotide probes that are partitioned and function separately on the bead surface. Each such oligonucleotide probe includes a nanocode sequence portion and a capture sequence portion. The nanocode sequence portion is selected to be complementary to the corresponding sequence on the reporter oligonucleotide. In preparing the probe assembly, the reporter oligonucleotide is hybridized to the nanocode sequence under appropriate conditions. The capture sequence portion is selected to be complementary to the corresponding sequence (target sequence) on the target analyte polynucleotide. An oligonucleotide probe having a capture sequence and a nanocode is prepared to have a predetermined sequence by a known method, and then attached to a substrate, for example, the surface of a magnetic bead or other immobilization surface by a known method. Also good.

操作に際しては、各々の標的被検体はプローブと結合して被検体／プローブ複合体を形成する。この場合、過剰のプローブが存在してもよい。例えば、磁性ビーズあたり多くのプローブが存在してもよい。特定の実施態様（例えば、磁性ビーズ又はその他の基体を使用する態様）においては、結合した被検体／プローブ複合体を有する基体の不動化によって、該複合体の精製又すすぎが可能となるので、試料又は溶解混合物を単純化することができる。好ましい実施態様においては、すすぎ後に添加されるエキソヌクレアーゼは、被検体／プローブ複合体のプローブ集合体部分の捕獲配列とナノコードのみを分解させ、標的被検体ポリヌクレオチド又はレポーターオリゴヌクレオチド（又はプリスチンプローブ）は分解させないという特異的な活性を有する。エキソヌクレアーゼ活性により、標的被検体ポリヌクレオチドとレポーターオリゴヌクレオチドの両方が放出されるので、（ａ）被検体ポリヌクレオチドは遊離して付加的なプリスチンプローブと反応し、（ｂ）レポーターオリゴヌクレオチドは反応緩衝液中に高濃度で蓄積する。単純な媒体中に蓄積された（増幅された）レポーターオリゴヌクレオチドは、著しい交差反応性をもたらすことなく、本願明細書に記載のような本発明によるナノ電子的検出器によって電子的に検出してもよい。   In operation, each target analyte binds to a probe to form an analyte / probe complex. In this case, an excess of probes may be present. For example, there may be many probes per magnetic bead. In certain embodiments (eg, embodiments using magnetic beads or other substrates), immobilization of the substrate with bound analyte / probe complex allows purification or rinsing of the complex. The sample or lysis mixture can be simplified. In a preferred embodiment, the exonuclease added after rinsing degrades only the capture sequence and the nanocode of the probe assembly portion of the analyte / probe complex, resulting in a target analyte polynucleotide or reporter oligonucleotide (or pristine). (Probe) has a specific activity of not degrading. Since the exonuclease activity releases both the target analyte polynucleotide and the reporter oligonucleotide, (a) the analyte polynucleotide is released and reacts with the additional pristine probe; (b) the reporter oligonucleotide is Accumulate at high concentration in the reaction buffer. Reporter oligonucleotides accumulated (amplified) in a simple medium can be detected electronically by a nanoelectronic detector according to the present invention as described herein without resulting in significant cross-reactivity. Also good.

以下において説明するレポーターの被検体により誘発された放出に関する第１実施態様
における実施例においては、非突出状３’末端（例えば、平滑又は陥凹３’末端）を有する二重鎖ポリヌクレオチドの分解（例えば、ホスフェート主鎖結合の加水分解）に対して特異的な活性を有するエキソヌクレアーゼを使用する。代替的な装置と方法は、「鏡像」の実施例（この場合は、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの３’と５’は逆に配置されており、エキソヌクレアーゼは５’末端特異性を示す）のようなその他のエキソヌクレアーゼ活性を利用するように設計してもよいことも理解されるべきである。さらに別の代替的な装置と方法も、本発明の技術的思想を逸脱することなく適用することができる。 In the examples of the first embodiment relating to analyte-induced release of the reporter described below, degradation of a double-stranded polynucleotide having a non-protruding 3 'end (eg, a blunt or recessed 3' end) Exonucleases with specific activity for (eg, hydrolysis of phosphate backbone bonds) are used. An alternative device and method is that of the “mirror image” example (in this case the 3 ′ and 5 ′ of the polynucleotide and oligonucleotide are reversed and the exonuclease exhibits 5 ′ end specificity) It should also be understood that other exonuclease activities such as these may be designed to be utilized. Still other alternative devices and methods may be applied without departing from the spirit of the invention.

さらにまた別の実施態様においては、５’反応性エキソヌクレアーゼ、及び付着末端エキソヌクレアーゼ等を使用することができ、また、他の不動化表面（例えば、ポリマー又はＳｉ表面、及び他のタイプのビーズ等）、プローブ間の開裂性リンカー、媒体容量の低減化、及びビーズの濾過等の手段等を使用することができる。   In yet another embodiment, 5 ′ reactive exonucleases, sticky end exonucleases, etc. can be used, and other immobilization surfaces (eg, polymer or Si surfaces, and other types of beads) Etc.), means such as a cleavable linker between probes, reduction of the medium volume, and filtration of beads can be used.

別の実施態様においては、選択的なエキソヌクレアーゼ活性が達成されるように選択された条件下においてその他の酵素を使用してもよい。例えば、ヌクレオチドトリホスフェートを奪う媒体中において種々のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ポリメラーゼ活性を犠牲にして「校正（proof-reading）」活性を優先させてヌクレアーゼとして機能させてもよい。   In another embodiment, other enzymes may be used under conditions selected to achieve selective exonuclease activity. For example, various types of DNA polymerases may be used in a medium depriving nucleotide triphosphates to function as nucleases in favor of “proof-reading” activity at the expense of polymerase activity.

別の実施態様においては、プローブの構成要素は、合成塩基類似体を有するポリヌクレオチド、例えばロックされた核酸（例えば、ＬＮＡオリゴマー又は２’−Ｏ、４’−Ｃメチレンブリッジを含む核酸、例えば、シグマ−アルドリッチ社の市販品）を含んでいてもよい。ＬＮＡオリゴマーは、プローブ分子の選択された部位におけるエキソヌクレアーゼ活性を阻止するか又は制限し、ハイブリッド形成された重複部位の安定性を制御してもよい。   In another embodiment, the probe component is a polynucleotide having a synthetic base analog, such as a locked nucleic acid (e.g., a nucleic acid comprising an LNA oligomer or 2'-O, 4'-C methylene bridge, e.g., Sigma-Aldrich commercial product). LNA oligomers may block or limit exonuclease activity at selected sites of the probe molecule and control the stability of hybridized overlapping sites.

さらに別の実施態様においては、タンパク質、多糖若しくはその他の生体分子標的被検体のための抗体複合プローブ及び／又はアプタマーに基づくプローブを使用することによって、非ポリヌクレオチド被検体の検出を可能にしてもよい。   In yet another embodiment, non-polynucleotide analytes can be detected by using antibody conjugate probes and / or aptamer based probes for protein, polysaccharide or other biomolecule target analytes. Good.

好ましくは、本発明の観点を含む例示的な検出法と装置には、センサーの応答、感度及び／又は選択性を増大させるための濃縮過程と単純化過程が含まれていてもよい。プローブは、いずれかの固体状支持体又はオリゴマーの結合のために適した基体へ付着させることによって、分離過程又はすすぎ過程のために結合又は不動化させてもよい。適当な基体用材料としては、特に限定的ではないが、ガラス、プラスチック、ポリエチレン、セルロース、ポリメタクリレート、ラテックス、ゴム、フルオロカーボン樹脂及び金属等が例示される。基体材料の形態は、スライド、ウェル若しくはその他のエンクロジャー（enclosure）、又は微小球若しくはマイクロビーズのような粒子等であってもよい。常磁性被覆物によって、ビーズを磁気的に応答するようにすることができる。共役結合性物質又は錯体形成性物質を使用することによって、オリゴヌクレオチド又はその他のプローブ種を基体、例えば、ビオチン又はビオチン誘導体の結合に適したアビジン又はアビジン誘導体等へ結合させてもよい。   Preferably, exemplary detection methods and devices including aspects of the present invention may include enrichment and simplification processes to increase sensor response, sensitivity and / or selectivity. The probe may be bound or immobilized for a separation or rinsing process by attaching it to a substrate suitable for binding any solid support or oligomer. Suitable substrate materials include, but are not limited to, glass, plastic, polyethylene, cellulose, polymethacrylate, latex, rubber, fluorocarbon resin and metal. The form of the substrate material may be a slide, well or other enclosure, or particles such as microspheres or microbeads. A paramagnetic coating allows the beads to respond magnetically. By using a conjugated or complexing substance, an oligonucleotide or other probe species may be bound to a substrate, such as avidin or avidin derivative suitable for binding biotin or a biotin derivative.

磁性ビーズの共役と分離／不動化のための技術は周知であり、このための構成成分と付属品は市販されている。これに関しては、例えば、インビトロゲン・コーポレーション社（旧名称：ダイナル・ビオテク社）（カールスバード、カリフォルニア州）のホームページ（http://www.invitrogen.com）を参照されたい。また、次の特許文献に記載されている分離方法と装置も参照されたい（これらの特許文献の開示内容も本願明細書の一部を成すものである）：
１）米国出願公開第２００５−０１４７８２２（発明の名称：プロセス）、
２）米国特許第５５１２４３９号（発明の名称：オリゴヌクレオチドが結合した磁性粒子とその使用）、
３）米国特許第６９９４９７１号（発明の名称：生体分子の定量化のための粒子分析アッセイ）、及び
４）米国特許第５８５１７７０号（発明の名称：磁性ビーズ担体を用いるレゾルヴェイス開裂によるミスマッチの検出）。
１ミクロン以下の磁性ビーズを入手することができ、該ビーズは結合性成分、例えば、共有結合したストレプタビジン（例えば、アビジンで処理したオリゴヌクレオチドへ結合させるための結合性成分）及び細菌壁（bacterial wall）タンパク質（例えば、抗体へ結合させるための結合性成分）を用いる前処理に付してもよい。 Techniques for conjugation and separation / immobilization of magnetic beads are well known and components and accessories for this are commercially available. In this regard, for example, refer to the homepage (http://www.invitrogen.com) of Invitrogen Corporation (former name: Dynal Biotech) (Carlsbad, Calif.). See also the separation methods and devices described in the following patent documents (the disclosures of these patent documents are also part of this application):
1) US Application Publication No. 2005-0147822 (Title of Invention: Process),
2) U.S. Pat. No. 5,512,439 (Title of Invention: Magnetic particles bound with oligonucleotide and use thereof)
3) US Pat. No. 6,994,971 (Title of Invention: Particle Analysis Assay for Quantification of Biomolecules), and 4) US Pat. No. 5,851,770 (Title of Invention: Detection of Mismatches by Resolve Cleavage Using Magnetic Bead Supports) .
Magnetic beads of 1 micron or less are available, and the beads include binding components such as covalently bound streptavidin (eg, binding components for binding to avidin-treated oligonucleotides) and bacterial walls. ) It may be subjected to a pretreatment using a protein (for example, a binding component for binding to an antibody).

粒状のプローブ基体に対する別の分離／不動化法、例えば、電気泳動的分離法を使用してもよい。正荷電基（例えば、アミノ基）又は負荷電基（例えば、カルボン酸基）を有するビーズ又は粒子は電場の力によって分離させるか、又は不動化させてもよい。さらに別の態様においては、粒子状又はビーズ状の基体は、反応媒体から濾過によって分離させてもよい。   Alternative separation / immobilization methods for the granular probe substrate may be used, for example, electrophoretic separation methods. Beads or particles having positively charged groups (eg, amino groups) or negatively charged groups (eg, carboxylic acid groups) may be separated or immobilized by the force of an electric field. In yet another embodiment, the particulate or beaded substrate may be separated from the reaction medium by filtration.

試料中の被検体ポリヌクレオチドの検出方法の１つの実施態様においては、該方法は下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む：
（ａ）下記の要素（i）〜（iv）を含む少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給する：
（i）基体；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１つのナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体ポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第１レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第１レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように設計されたプローブポリヌクレオチド；
（ｂ）被検体ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって、下記の成分（i）〜（iii）を含有する重複第１プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、第１プローブ集合体を被検体であるポリヌクレオチドを含有すると推定される試料と接触させる：
（i）第１プローブ集合体；
（ii）少なくとも１種の被検体ポリヌクレオチド；
（iii）遠位へ延びて平滑な遠位の５’−末端（１）又は突出する遠位の５’−末端（２）を形成する被検体ポリヌクレオチド；
（ｃ）第１プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端ストランドの選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｄ）エキソヌクレアーゼを第１プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第１プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端ストランドをエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを第１の重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｅ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出される少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。 In one embodiment of the method for detecting an analyte polynucleotide in a sample, the method comprises the following steps (a) to (e):
(A) providing at least one first probe assembly comprising the following elements (i) to (iv):
(I) substrate;
(Ii) at least one probe polynucleotide comprising an adjacent 5′-terminal nucleotide and a distal 3′-terminal nucleotide, wherein the adjacent 5′-terminal nucleotide binds adjacent to the substrate; The probe polynucleotide comprising a capture nucleotide sequence portion having a nucleotide sequence complementary to at least one nanocode nucleotide sequence portion and a corresponding target nucleotide sequence of the analyte polynucleotide;
(Iii) at least one first reporter polynucleotide having a nucleotide sequence that is complementary to the nanocode sequence of the probe polynucleotide, and forms an overlap with the probe polynucleotide by hybridizing with the nanocode sequence The first reporter polynucleotide;
(Iv) a probe polynucleotide designed such that the capture nucleotide sequence portion and the 3′-terminal nucleotide extend distally from the overlapping portion of the first reporter polynucleotide;
(B) A duplicated first probe / analyte complex containing the following components (i) to (iii) is formed by binding the target nucleotide sequence of the analyte polynucleotide to the capture nucleotide sequence portion of the probe polynucleotide. Contacting the first probe assembly with a sample presumed to contain the analyte polynucleotide under conditions effective to effect:
(I) a first probe assembly;
(Ii) at least one analyte polynucleotide;
(Iii) a subject polynucleotide extending distally to form a smooth distal 5′-end (1) or protruding distal 5′-end (2);
(C) The first probe / analyte complex is a 3′-to-5 ′ exo-comprising specific binding to double-stranded DNA followed by selective hydrolysis of the 3′-terminal strand of the DNA overlap. Contacting with an exonuclease having deoxyribonuclease activity;
(D) effective to bind the exonuclease to the first probe / analyte complex and by hydrolyzing the distal 3′-end strand of the first probe / analyte complex with the exonuclease. Maintaining conditions effective to release the polynucleotide analyte and at least the first reporter polynucleotide from the first overlapping probe / analyte complex;
(E) determining the presence of a polynucleotide analyte in the sample by detecting the presence of at least a first reporter polynucleotide released by hydrolysis with an exonuclease.

試料中の被検体ポリヌクレオチドの検出法の別の実施態様は、直前の節に記載の方法に対して「鏡像法」の関係にある過程を含む。この場合、３’末端と５’末端は該方法の規定の全体にわたって逆転し、該方法は下記の要件（ａ）〜（ｅ）によって規定される：
（ａ）基体は、プローブポリヌクレオチドの隣接位の３’末端に隣接して結合する。
（ｂ）第１プローブ／被検体複合体の遠位の末端はポリヌクレオチド被検体を含み、該被検体は遠位へ延びて平滑な遠位の３’−末端（１）又は突出する遠位の３’−末端（２）を形成する。
（ｃ）エキソヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合した後、ＤＮＡ重複体の５’末端ストランドの選択的加水分解を含む５’−対−３’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）この方法は、プローブ／被検体の５’末端ストランドを加水分解してポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを放出するために有効な条件を維持することを含む。
（ｅ）この方法は、エキソヌクレアーゼによる５’−対−３’加水分解によって放出されるレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定することを含む。 Another embodiment of a method for detecting an analyte polynucleotide in a sample comprises a process that is in a “mirror image” relationship to the method described in the immediately preceding section. In this case, the 3 ′ and 5 ′ ends are reversed throughout the method definition, which method is defined by the following requirements (a)-(e):
(A) The substrate binds adjacent to the adjacent 3 ′ end of the probe polynucleotide.
(B) The distal end of the first probe / analyte complex includes a polynucleotide analyte, the analyte extending distally to a smooth distal 3′-end (1) or protruding distal The 3′-end (2) of
(C) Exonuclease has 5′-to-3 ′ exo-deoxyribonuclease activity that involves selective hydrolysis of the 5 ′ end strand of the DNA overlap after specific binding to double-stranded DNA.
(D) The method comprises maintaining conditions effective to hydrolyze the 5 'terminal strand of the probe / analyte to release the polynucleotide analyte and at least the first reporter polynucleotide.
(E) The method includes measuring the presence of a polynucleotide analyte in a sample by detecting the presence of a reporter polynucleotide released by 5′-to-3 ′ hydrolysis by an exonuclease.

指数関数的な非−ＰＣＲ標的増幅
本発明の１つの観点によれば、希薄な試料又は少量の試料被検体の検出範囲を拡張するために標的被検体ポリヌクレオチド関連種を増幅させる方法が提供される。代替的な増幅方法と装置は下記の要素（１）及び／又は（２）を含んでいてもよい：
（１）同族レポーター。試料中に標的被検体ポリヌクレオチドが存在することを示す検出可能種を、アンプリファイア／試薬複合種からエキソヌクレアーゼ−媒介反応を介して、対応する合成標的オリゴヌクレオチドの被検体による誘発化放出によって増幅させる。この場合、放出された合成標的オリゴヌクレオチドは、標的被検体ポリヌクレオチド配列の一部の検出可能なコピー（同族又は準同族のオリゴヌクレオチド類似体）を含有する。
（２）非同族レポーター。試料中に標的被検体ポリヌクレオチドが存在することを示す検出可能種を、アンプリファイア／試薬複合種からエキソヌクレアーゼ−媒介反応を介して、対応する合成標的オリゴヌクレオチドの被検体による誘発化放出によって増幅させる。この場合、放出された合成標的オリゴヌクレオチドは、標的被検体ポリヌクレオチド配列には厳密には類似しない配列（非同族のオリゴヌクレオチド類似体）を含有する。 Exponential Non-PCR Target Amplification According to one aspect of the present invention, a method is provided for amplifying a target analyte polynucleotide-related species to extend the detection range of dilute or small sample analytes. The An alternative amplification method and apparatus may include the following elements (1) and / or (2):
(1) Family reporter. Detectable species that indicate the presence of a target analyte polynucleotide in a sample are amplified by analyte-induced release of the corresponding synthetic target oligonucleotide from an amplifier / reagent complex species via an exonuclease-mediated reaction Let In this case, the released synthetic target oligonucleotide contains a detectable copy (cognate or quasi-cognate oligonucleotide analog) of a portion of the target analyte polynucleotide sequence.
(2) Non-family reporter. Detectable species that indicate the presence of a target analyte polynucleotide in a sample are amplified by analyte-induced release of the corresponding synthetic target oligonucleotide from an amplifier / reagent complex species via an exonuclease-mediated reaction Let In this case, the released synthetic target oligonucleotide contains a sequence (non-cognate oligonucleotide analog) that is not strictly similar to the target analyte polynucleotide sequence.

以下に記載の増幅方法と装置の第１実施態様の実施例においては、非突出状の３’末端（例えば、平滑又は陥凹３’末端）を有する二重鎖ポリヌクレオチドの分解（例えば、ホスフェート主鎖の結合の加水分解による分解）に対して特異的な活性を有するエキソヌクレアーゼを使用する。別のエキソヌクレアーゼ活性、例えば、「鏡像」の実施例を利用できるように別の装置と方法を設計してもよいことを理解すべきである。この場合の実施例においては、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドにおける３’と５’の配置が逆転し、エキソヌクレアーゼは５’末端特異性を有する。また、本発明の技術的思想を逸脱することなく、さらに別の実施態様も可能である。   In an example of the first embodiment of the amplification method and apparatus described below, degradation (eg, phosphate) of a double-stranded polynucleotide having a non-protruding 3 ′ end (eg, a blunt or recessed 3 ′ end). An exonuclease having a specific activity for hydrolysis of main chain bonds) is used. It should be understood that other devices and methods may be designed to utilize examples of other exonuclease activities, eg, “mirror images”. In this example, the 3 'and 5' positions in the polynucleotide and oligonucleotide are reversed, and the exonuclease has 5 'end specificity. Further, other embodiments are possible without departing from the technical idea of the present invention.

二重標的アンプリファイア
本発明の観点を有する実施態様においては、一重鎖被検体ポリヌクレオチドの２つの異なる部分の配列（便宜上、「標的Ａ」及び「標的Ｂ」で表示する）が選択される。アンプリファイア試薬は、少なくとも下記の２種のアンプリファイアを包含するように配合してもよい：
（１）標的Ｂに対して相補的な第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）及び標的Ａに対して相補的な第２捕獲配列（捕獲Ａ’）を有するオリゴヌクレオチドを含むアンプリファイアＡ。
（２）標的Ａに対して相補的な第１捕獲配列（捕獲Ａ’）及び標的Ｂに対して相補的な第２捕獲配列（捕獲Ｂ’）を有するオリゴヌクレオチドを含むアンプリファイアＢ。 Dual Target Amplifier In an embodiment having aspects of the present invention, sequences of two different portions of a single-stranded analyte polynucleotide (designated “Target A” and “Target B” for convenience) are selected. The amplifier reagent may be formulated to include at least the following two amplifiers:
(1) Amplifier A comprising an oligonucleotide having a first capture sequence complementary to target B (capture B ′) and a second capture sequence complementary to target A (capture A ′).
(2) Amplifier B comprising an oligonucleotide having a first capture sequence complementary to target A (capture A ′) and a second capture sequence complementary to target B (capture B ′).

コンパニオンを含む重複アンプリファイア
試薬中のプリスチンのアンプリファイアＡ及びアンプリファイアＢの各々は重複又は二重鎖形態を含む。この場合、アンプリファイアオリゴヌクレオチドは、非突出状３’末端を欠く複合体を生成するように設計されたコンパニオンオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによって、プリスチン形態におけるエキソヌクレアーゼ活性から保護される。コンパニオンオリゴヌクレオチドは、以下のように、被検体分子の対応する標的配列と類似する配列（合成標的）を含む：
（１）アンプリファイアＡのコンパニオンオリゴヌクレオチドオは、被検体の標的Ａと同一又は類似する合成標的配列（合成標的Ａ''）を含んでおり、該合成標的Ａ'' は、プリスチン試薬中においては、第２捕獲配列（捕獲Ａ’）とハイブリッド形成する。
（２）アンプリファイアＢのコンパニオンオリゴヌクレオチドオは、被検体の標的Ｂと同一又は類似する合成標的配列（合成標的Ｂ''）を含んでおり、該合成標的Ｂ'' は、プリスチン試薬中においては、第２捕獲配列（捕獲Ｂ’）とハイブリッド形成する。 Each of amplifier A and amplifier B of pristin in a duplicate amplifier reagent containing a companion comprises a duplicate or duplex form. In this case, the amplifier oligonucleotide is protected from exonuclease activity in the pristine form by hybridizing with a companion oligonucleotide designed to produce a complex lacking a non-protruding 3 'end. The companion oligonucleotide contains a sequence (synthetic target) similar to the corresponding target sequence of the analyte molecule as follows:
(1) The companion oligonucleotide A of the amplifier A contains a synthetic target sequence (synthetic target A ″) that is the same as or similar to the target A of the analyte, and the synthetic target A ″ Hybridizes with a second capture sequence (capture A ′).
(2) The companion oligonucleotide A of the amplifier B contains a synthetic target sequence (synthetic target B ″) that is the same as or similar to the target B of the analyte, and the synthetic target B ″ Hybridizes with a second capture sequence (capture B ′).

標的とハイブリッド形成するアンプリファイア
アンプリファイアＡ及びアンプリファイアＢの各々は、プリスチン複式形態においては、構成要素である捕獲配列を露出させるような形態を有しているので、該捕獲配列は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成を促進するために有効な条件下において、被検体ポリヌクレオチドの対応する標的配列とハイブリッド形成することによって、対応するアンプリファイア／被検体複合体を生成してもよい。従って、例えば、
（１）アンプリファイアＡの第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）は、被検体の標的配列Ｂと結合し、また、
（２）アンプリファイアＢの第１捕獲配列（捕獲Ａ’）は、被検体の標的配列Ａと結合する。 Since each of the amplifiers A and B that hybridize with the target has a form that exposes a constituent capture sequence in the pristine duplex form, the capture sequence is a polynucleotide. The corresponding amplifier / analyte complex may be generated by hybridizing with the corresponding target sequence of the analyte polynucleotide under conditions effective to promote the hybridization. So, for example,
(1) The first capture sequence (capture B ′) of the amplifier A binds to the target sequence B of the analyte, and
(2) The first capture sequence (capture A ′) of the amplifier B binds to the target sequence A of the subject.

各々のアンプリファイア／被検体複合体の生成には、アンプリファイアＡとアンプリファイアＢの一方又は両方と各々の被検体ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成が含まれていてもよく、この点に留意すべきである。この形成過程は同時に進行させる必要はない。何故ならば、これらのアンプリファイアの種類は、上記の生成過程において、相互に独立して反応するように選定されるからである。   It should be noted that the generation of each amplifier / analyte complex may include hybridization of one or both of amplifier A and amplifier B with each analyte polynucleotide. It is. This formation process need not proceed simultaneously. This is because these amplifier types are selected to react independently of each other in the above generation process.

アンプリファイア／被検体複合体の酵素的分解
これらの酵素的分解におけるいずれの場合においても、標的配列の位置及び／又はアンプリファイアの配置の選択によって、アンプリファイアＡ、アンプリファイアＢ又はこれらの両方を含むアンプリファイア／被検体複合体が各々のアンプリファイアオリゴヌクレオチドの露出した非突出状３’末端を含むようにすることができるので、試薬中に存在するか、又は外部から添加されるエキソヌクレアーゼは、アンプリファイアオリゴヌクレオチドの分解を開始させてもよい。アンプリファイアオリゴヌクレオチドの分解が続行すると、両方の捕獲配列が除去されることによって、以下のようにして、アンプリファイアオリゴヌクレオチドから標的被検体が放出されると共に、合成標的配列を有する対応するコンパニオンオリゴヌクレオチドがアンプリファイアオリゴヌクレオチドから放出される：
（１）アンプリファイア／被検体複合体中のアンプリファイアＡのアンプリファイアオリゴヌクレオチドが分解され、被検体の標的配列Ａが放出されると共に、コンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ａ''が放出される。
（２）アンプリファイア／被検体複合体中のアンプリファイアＢのアンプリファイアオリゴヌクレオチドが分解され、被検体の標的配列Ｂが放出されると共に、コンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ｂ''が放出される。 Enzymatic degradation of the amplifier / analyte complex In any of these enzymatic degradations, depending on the choice of target sequence location and / or amplifier placement, amplifier A, amplifier B or both Since the included amplifier / analyte complex can include an exposed non-protruding 3 ′ end of each amplifier oligonucleotide, the exonuclease present in the reagent or added externally is The degradation of the amplifier oligonucleotide may be initiated. As degradation of the amplifier oligonucleotide continues, both capture sequences are removed, thereby releasing the target analyte from the amplifier oligonucleotide and the corresponding companion oligonucleotide having the synthetic target sequence as follows: Nucleotides are released from the amplifier oligonucleotide:
(1) The amplifier oligonucleotide of the amplifier A in the amplifier / analyte complex is decomposed to release the target sequence A of the analyte and the synthetic target A ″ of the companion oligonucleotide.
(2) The amplifier oligonucleotide of the amplifier B in the amplifier / analyte complex is decomposed to release the target sequence B of the analyte, and the synthetic target B ″ of the companion oligonucleotide is released.

従って、各々の元の被検体分子に対しては、上記の増幅過程によって、元の非分解被検体ポリヌクレオチド分子（元の標的Ａ及び標的Ｂを含む）、アンプリファイア試薬から誘導される２種の単鎖合成標的（合成標的Ａ及び合成標的Ｂ）及び反応を仲介したエキソヌクレアーゼ酵素が放出される。   Therefore, for each original analyte molecule, two kinds of derivatives derived from the original non-degraded analyte polynucleotide molecule (including the original target A and target B) and the amplifier reagent by the above amplification process. Single-stranded synthetic targets (synthetic target A and synthetic target B) and the reaction-mediated exonuclease enzyme are released.

放出された標的のその後の増幅
付加的なプリスチンアンプリファイアＡとアンプリファイアＢ及びエキソヌクレアーゼの存在下においては、各々のこれらの標的配列（合成又は未変性被検体）は、前述のような増幅のさらなる過程に関与してもよい。何故ならば、各々のアンプリファイアは、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成を促進するために有効な条件下においては、未変性標的の場合と同じ効果をもたらす合成標的とハイブリッド形成するように設計されているからである：
（１）プリスチンアンプリファイアＡの第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）は、予め分解されたアンプリファイアＢの放出されたコンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ｂ''と結合して、全てが合成のアンプリファイア／標的複合体を形成し、次いで、該複合体はヌクレアーゼ活性によって分解され、元の合成標的Ｂ''と付加的なコンパニオンオリゴヌクレオチド（合成標的Ａ''を含む）の両方が放出される。
（２）プリスチンアンプリファイアＢの第１捕獲配列（捕獲Ａ’）は、予め分解されたアンプリファイアＡの放出されたコンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ａ''と結合して、全てが合成のアンプリファイア／標的複合体を形成し、次いで、該複合体はヌクレアーゼ活性によって分解され、元の合成標的Ａ''と付加的なコンパニオンオリゴヌクレオチド（合成標的Ｂ''を含む）の両方が放出される。 Subsequent amplification of the released target In the presence of additional Pristin Amplifier A and Amplifier B and exonuclease, each of these target sequences (synthetic or native analyte) is amplified as described above. May be involved in further processing. Because each amplifier is designed to hybridize with a synthetic target that, under conditions effective to promote polynucleotide hybridization, provides the same effect as a native target. Is:
(1) The first capture sequence (capture B ′) of the pristine amplifier A binds to the synthetic target B ″ of the released companion oligonucleotide of the previously decomposed amplifier B, and is completely amplified. Form the target / target complex, which is then degraded by nuclease activity, releasing both the original synthetic target B ″ and additional companion oligonucleotides (including the synthetic target A ″) .
(2) The first capture sequence (capture A ′) of the pristine amplifier B binds to the synthesized target A ″ of the released companion oligonucleotide of the previously decomposed amplifier A, and the synthesis amplification is entirely performed. Form a target complex, which is then degraded by nuclease activity, releasing both the original synthetic target A ″ and additional companion oligonucleotides (including synthetic target B ″) .

増幅の各々の「サイクル」においては、元の標的と対応する新たな標的が生成して放出され、これらの各標的は付加的な増幅現象を誘発することができる。この結果、連続する増幅過程中において、媒体が十分なアンプリファイア試薬とエキソヌクレアーゼを含有する間は、元の被検体ポリヌクレオチドの数は一定に維持される傾向にあり、一方、合成標的Ａ''と合成標的Ｂ''の数は指数関数的に増大する傾向にある。本明細書において使用する「サイクル」という用語は、温度のような環境条件の特定の周期的な変化を意味するのではなく、ＰＣＲにおいて一般的に使用され、また、媒体の条件は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成と酵素的分解活性が同時に連続的に促進されるように選択されて調整される。   In each “cycle” of amplification, a new target corresponding to the original target is generated and released, and each of these targets can trigger additional amplification events. As a result, during a continuous amplification process, while the medium contains sufficient amplifier reagent and exonuclease, the number of original analyte polynucleotides tends to remain constant while the synthetic target A ′ The number of 'and synthetic target B' tends to increase exponentially. As used herein, the term “cycle” does not mean a specific periodic change in environmental conditions such as temperature, but is commonly used in PCR, and the conditions of the medium are defined as polynucleotides Are selected and adjusted so that their hybridization and enzymatic degradation activity are simultaneously and continuously promoted.

多段階アンプリファイア
本発明の観点を有する実施態様には、生体分子のテンプレート種を含有する媒体中へのレポーター種の導入方法であって、該テンプレート種に対して結合親和性を有するプローブ集合体から非−ＰＣＲ／テンプレート−誘発化／酵素活性化によって該レポーター種を放出させることを含み、下記の過程（ａ）〜（ｃ）を任意の操作順で含む該導入方法が含まれる：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給する：
（i）テンプレート種の標的部分に対して選択的な結合親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１プローブストランドを含む；
（ii）プローブストランドの対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチドの重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブストランドと少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブストランドの全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター種を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列がテンプレート種の選択された標的部分の全部又は一部と結合してテンプレート−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計された；
（ｂ）テンプレート種の選択された標的部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１テンプレート−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる：
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１テンプレート−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブストランドが分解され、第１レポーター種がプローブ集合体から放出される。 Multi-stage amplifier An embodiment having aspects of the present invention includes a method for introducing a reporter species into a medium containing a biomolecular template species, the probe assembly having binding affinity for the template species Including the step of releasing the reporter species by non-PCR / template-induced / enzyme activation from and comprising the following steps (a)-(c) in any order of operation:
(A) supplying at least one first probe assembly satisfying the following requirements (i) to (iv):
(I) comprising at least one first probe strand having a capture nucleotide sequence that confers selective binding affinity to a target portion of the template species;
(Ii) comprises at least one first reporter species comprising a binding moiety having a polynucleotide sequence designed to hybridize with the corresponding binding moiety of the probe strand;
(Iii) the first probe assembly includes at least one first probe strand and at least one first reporter species hybridized to include overlapping probe assemblies of polynucleotides;
(Iv) The overlapping probe assembly promotes the action of a selected enzyme having sufficient nuclease activity to degrade all or part of the probe strand to release the first reporter species from the probe assembly. A matched at least one enzyme-the enzyme formed when the capture nucleotide sequence binds to all or part of the selected target portion of the template species to form a template-probe complex- Designed to have a start site;
(B) Conditions effective to promote a reaction that forms a first template-probe complex having an enzyme-starting site by binding a selected target portion of the template species to a capture nucleotide sequence portion of the probe polynucleotide. Below, the medium is brought into contact with at least one first probe assembly:
(C) the first template-probe complex was formed in step (b) by contacting the medium with at least the selected enzyme under conditions effective to promote the nuclease activity of the enzyme at the enzyme-starting site Sometimes the first probe strand is degraded and the first reporter species is released from the probe assembly.

この実施態様の増幅は付加的な過程による多段階を含むようにして行ってもよい。この場合、第１レポーター種は、第１レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第２プローブ集合体から第２レポーター種を少なくとも１つの第２の非ＰＣＲ／テンプレート−誘発／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するように設計されたテンプレート部分を含む。この態様は、第３段階又はより上位の段階を含むようにしてさらなるレポーター種が放出されるように拡張してもよい。   The amplification of this embodiment may be performed to include multiple stages by additional processes. In this case, the first reporter species removes the second reporter species from the second probe assembly having binding affinity for the template portion of the first reporter species with at least one second non-PCR / template-induction / enzyme activity. Including a template portion designed to act as a target template for release in a structured manner. This embodiment may be extended to include additional reporter species by including a third or higher stage.

生体分子検出法においては、多段階増幅法を使用することによって、被検体、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、多糖及びその他の生体分子種を検出してもよい。いくつかの実施態様においては、第１プローブ集合体は、テンプレートの標的配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む（例えば、テンプレートはＤＮＡ鎖を含む）。別の実施態様においては、第１プローブ集合体は、捕獲ヌクレオチド配列としてアプタマーを含み、該アプタマーは、テンプレートの標的部分に対する親和性を有する（例えば、テンプレートはポリペプチド又は多糖の標的部分を有する）。   In the biomolecule detection method, analytes such as polynucleotides, proteins, polysaccharides and other biomolecule species may be detected by using a multistage amplification method. In some embodiments, the first probe assembly comprises a capture nucleotide sequence that is complementary to the target sequence of the template (eg, the template comprises a DNA strand). In another embodiment, the first probe assembly includes an aptamer as a capture nucleotide sequence, the aptamer having an affinity for the target portion of the template (eg, the template has a polypeptide or polysaccharide target portion). .

１つの実施態様においては、生体分子のテンプレート種は試料中の被検体種を含み、第１レポーター種は、プローブ集合体から放出されたときに直接的又は間接的に検出可能なように設計され、下記の過程（ｄ）及び（ｅ）がさらに含まれる：
（ｄ）放出される第１レポーター種を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）第１レポーター種の直接的又は間接的な検出に基づいて、試料中の被検体種の少なくとも存在又は濃度を測定する。 In one embodiment, the biomolecule template species comprises the analyte species in the sample, and the first reporter species is designed to be directly or indirectly detectable when released from the probe assembly. The following steps (d) and (e) are further included:
(D) detecting directly or indirectly the released first reporter species;
(E) measuring at least the presence or concentration of the analyte species in the sample based on direct or indirect detection of the first reporter species.

例えば、第１レポーター種は、第１プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計され（一段階検出）、例えば、検出可能なポリヌクレオチド配列又は検出可能な標識基を有する検出部分を含ませる。同様に、第１レポーター種は、第１プローブ集合体から放出されたときに、別のレポーター種が検出可能な付加的な増幅段階を介して間接的に検出できるようにしてもよい。   For example, the first reporter species is designed to be detected directly when released from the first probe assembly (one-step detection), eg, a detectable polynucleotide sequence or a detectable labeling group. The detection part which has is included. Similarly, the first reporter species may be detected indirectly through an additional amplification step that is detectable by another reporter species when released from the first probe assembly.

ヘアピンプローブ集合体（hairpin probe assembly）
本発明の観点を有するさらに別の実施態様においては、プローブ集合体のレポーター部分と個別の捕獲を省略してもよい。１つの実施態様においては、第１プローブ鎖と第１レポーター種は共線的ポリヌクレオチド鎖を含む。この場合、該共線的ポリヌクレオチド鎖の一部は、テンプレート種の標的部分と関連しないときには自己ハイブリッド形成することによって、選択された酵素による分解から保護されるように設計される。 Hairpin probe assembly
In yet another embodiment having aspects of the invention, the reporter portion and individual capture of the probe assembly may be omitted. In one embodiment, the first probe strand and the first reporter species comprise a collinear polynucleotide strand. In this case, a portion of the collinear polynucleotide strand is designed to be protected from degradation by the selected enzyme by self-hybridizing when not associated with the target portion of the template species.

当業者であれば、以下の好ましい実施態様に関する詳細な説明を考慮することによって、本発明の観点を有する装置と方法についてより完全に理解すると共に、これらの付加的な利点を得ると共に、付加的な目的を実現することができるであろう。   Those of ordinary skill in the art will have a more complete understanding of the apparatus and methods having aspects of the present invention by taking into account the following detailed description of the preferred embodiments, obtain these additional advantages, and provide additional Will be able to achieve this purpose.

添付図面について簡単に説明する。
図１Ａ〜図１Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子（例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等）の量を電子的に検出する該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非直線的又は指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす電子的検出用の該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図３Ａ及び図３Ｂは、図２Ａ〜図２Ｈに示す増幅方法の２つの実施例をまとめて模式的に示すもので、一方の実施例においては２種の被検体標的（二重標的）を使用し、他方の実施例においては１種の被検体標的（単一標的）を使用した。 The attached drawings will be briefly described.
FIGS. 1A-1H are devices and methods having aspects of the present invention in which a reporter molecule is amplified and released in response to a very small amount of a target analyte before the reporter molecule (eg, specific An embodiment of the apparatus and method for electronically detecting the amount of DNA oligomer or the like) is schematically shown.
FIGS. 2A-2H schematically illustrate an embodiment of the apparatus and method for electronic detection that provides non-linear or exponential analyte-response amplification with an aspect of the present invention. Shown in
FIGS. 3A and 3B schematically show two examples of the amplification method shown in FIGS. 2A to 2H collectively. In one example, two analyte targets (dual targets) are used. In the other embodiment, one analyte target (single target) was used.

図３Ｃは、表１及び表２に示すデータをプロットしたグラフであり、単一標的スキームと二重標的スキームを使用することによる合成標的の増加又は増幅を示す。
図４Ａ及び図４Ｂは、レポーターの増幅と精製のための別の装置と方法を模式的に示す。
図５Ａ〜図５Ｅは、本発明の観点を有するさらに別の装置と方法であって、予備的な増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図６Ａ〜図６Ｃは、本発明の観点を有する装置と方法であって、分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす該装置と方法の実施態様を模式的に示す。 FIG. 3C is a graph plotting the data shown in Tables 1 and 2, showing the increase or amplification of the synthetic target by using a single target scheme and a dual target scheme.
4A and 4B schematically illustrate another apparatus and method for reporter amplification and purification.
FIGS. 5A-5E illustrate yet another apparatus and method having aspects of the present invention that provides exponential analyte-response amplification including a preliminary amplification purification process. This is shown schematically.
6A-6C illustrate an apparatus and method having aspects of the present invention that provides exponential analyte-response amplification after removal of exonuclease from an analytical medium. This is shown schematically.

図７Ａ〜図７Ｆは、本発明の観点を有するレポータープローブであって、内部阻害基（該内部阻害基は該基の配列位置におけるエキソヌクレアーゼのプロセッシングを停止させる）を含む該レポータープローブの実施例を模式的に示す。
図８Ａ及び図８Ｂは、本発明の観点を有する装置と方法であって、多重型レポーターとマトリックス検出セルを用いる多種被検体アッセイを含む該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図９Ａ〜図９Ｃは、本発明の観点を有する方法であって、生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する該方法の実施態様を模式的に示す。
図１０ａ〜図１０ｉを含む図１０は、アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を模式的に示す。 7A-7F are examples of reporter probes having aspects of the present invention, comprising an internal inhibitory group (the internal inhibitory group stops exonuclease processing at the sequence position of the group) Is shown schematically.
8A and 8B schematically illustrate an embodiment of the apparatus and method having aspects of the present invention, including a multi-analyte assay using a multiplex reporter and a matrix detection cell.
9A-9C schematically illustrate an embodiment of the method having aspects of the present invention that uses a probe assembly that includes an aptamer moiety for detecting a biomolecule.
FIG. 10, including FIGS. 10a-10i, schematically illustrates an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate amplicons and / or reporter species.

図１１は、図１０に示す方法に対応する実験データをプロットしたグラフである。
図１２Ａ〜図１２Ｃは、アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を模式的に示す。
図１３は、図１２Ａ〜図１２Ｃに示す方法に対応する実験データをプロットしたグラフである。
図１４Ａ〜図１４Ｃは、本発明の観点（例えば、図３Ａ参照）を有する単一標的増幅法であって、蛍光検出法を利用する該増幅法の実施態様を模式的に示す。図１４Ａは、アンプリファイア／被検体複合体の模式図である。図１４Ｂは、当該方法による結果と増幅生成物を示す電気泳動ゲルの写真である。図１４Ｃは、図１４Ｂに示す写真の陰画であり、該陰画は特許図面としては適当な写真再現性画像であって、データをより明確に示している。
図１５Ａ〜図１５Ｃは、「ヘアピン」型のプローブ集合体の実施態様を模式的に示す。 FIG. 11 is a graph plotting experimental data corresponding to the method shown in FIG.
FIGS. 12A-12C schematically illustrate an embodiment of a three-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or a reporter species.
FIG. 13 is a graph plotting experimental data corresponding to the method shown in FIGS. 12A to 12C.
14A to 14C schematically show an embodiment of a single target amplification method having an aspect of the present invention (see, for example, FIG. 3A) and using a fluorescence detection method. FIG. 14A is a schematic diagram of an amplifier / analyte complex. FIG. 14B is a photograph of an electrophoresis gel showing the results of the method and the amplification products. FIG. 14C is a negative image of the photograph shown in FIG. 14B, which is a suitable photographic reproducible image as a patent drawing and shows the data more clearly.
15A-15C schematically illustrate an embodiment of a “hairpin” type probe assembly.

以下においては、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。
本発明は、標的ＤＮＡ配列を検出するナノチューブセンサー装置（nanotube sensor device）を提供する。該装置は、標的ＤＮＡの標識化を必要とせず、標的ＤＮＡの存在に対して電子的に応答する。該装置の実施態様について以下に説明する。 In the following, preferred embodiments of the present invention will be described in detail.
The present invention provides a nanotube sensor device that detects a target DNA sequence. The device does not require labeling of the target DNA and responds electronically to the presence of the target DNA. Embodiments of the apparatus will be described below.

被検体によって誘発されるレポーターの増幅
図１Ａ〜図１Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子（例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等）の量を電子的に検出する該装置と方法の実施態様を模式的に示す。本発明の観点を有する特定の実施態様においては、ポリヌクレオチドに対して特異的な活性を有する酵素を使用することによって、選択される被検体の存在を示すレポーター部分であって、本発明の観点を有するナノセンサーの使用によって電子的に検出可能な該レポーター部分のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によらない増幅を達成してもよい。この種の実施態様は、増幅過程において、例えばＰＣＲの場合のような反応条件を周期的に変化させるための複雑な制御システムを必要としない点で非周期的増幅法として記載してもよい。 Analyte-Induced Reporter Amplification FIGS. 1A-1H are devices and methods having aspects of the present invention, after reporter molecules are amplified and released in response to a very small amount of target analyte. 1 schematically shows an embodiment of the apparatus and method for electronically detecting the amount of the reporter molecule (eg, specific DNA oligomer, etc.). In certain embodiments having aspects of the invention, a reporter moiety that indicates the presence of a selected analyte by using an enzyme having specific activity for a polynucleotide, wherein Non-polymerase chain reaction (PCR) amplification of the reporter moiety that is electronically detectable may be achieved through the use of nanosensors having This type of embodiment may be described as an aperiodic amplification method in that it does not require a complex control system to periodically change the reaction conditions, such as in the case of PCR, in the amplification process.

図１Ａは、試料を捕集して調製する過程１０を模式的に示す図であって、容器１３の内部の溶解緩衝液又は媒体１２を接種して細胞性又はウイルス性物質１４を放出させるための試料アプリケーター（例えば、咽喉用スワブ等）１１が図示される。放出された細胞性又はウイルス性物質は溶解されて試料であるポリヌクレオチド物質１５を放出する。   FIG. 1A schematically shows a process 10 for collecting and preparing a sample, in order to inoculate a lysis buffer or medium 12 inside a container 13 to release a cellular or viral substance 14. A sample applicator (eg, a throat swab, etc.) 11 is shown. The released cellular or viral substance is lysed to release the sample polynucleotide substance 15.

図１Ｂは、溶解された試料媒体を入口２２へ塗布するためのアプリケーター（例えば、ピペット等）２１を具備する流状系２０の内部において試料を処理する装置を模式的に示す。該入口は導管２４のパターン（例えば、微量流体用カートリッジ等）と連絡し、該導管は閉鎖状のセル又は容器２３と連絡する。   FIG. 1B schematically illustrates an apparatus for processing a sample within a flow system 20 that includes an applicator (eg, a pipette) 21 for applying a dissolved sample medium to an inlet 22. The inlet communicates with a pattern of conduits 24 (eg, a microfluidic cartridge, etc.) that communicates with a closed cell or container 23.

図１Ｃ（i）及び図１Ｃ（ii）は、１又は複数のプローブ集合体（probe assembly）３０を保有する容器２３の内部に収容されたポリヌクレオチド物質１５を含有する試料媒体１６を示し、各々のプローブ集合体は基体３２及び該基体に付着した１又は複数の捕獲プローブ３１を具有する。   1C (i) and 1C (ii) show a sample medium 16 containing a polynucleotide material 15 housed inside a container 23 holding one or more probe assemblies 30, each The probe assembly includes a substrate 32 and one or more capture probes 31 attached to the substrate.

図示する実施例に示す基体３２は磁性ビーズを含有するが、その他の粒子状又は非粒子状の捕獲基体（例えば、非磁性粒子、固定プレート、閉鎖壁、及び滴定ウェル等）を使用してもよいことに留意すべきである。例えば、ビーズ状の基体は、複数の別個独立に機能するプローブを該ビーズの表面上に担持してもよく、これによってビーズが中心に位置する多重プローブ集合体が形成される。   The substrate 32 shown in the illustrated embodiment contains magnetic beads, although other particulate or non-particulate capture substrates (eg, non-magnetic particles, fixed plates, closed walls, titration wells, etc.) may be used. It should be noted that it is good. For example, a bead-like substrate may carry a plurality of independently functioning probes on the surface of the bead, thereby forming a multi-probe assembly with the beads centered.

図１Ｃ（ii）は、プローブ集合体３０と標的被検体３３を詳細に示す。標的被検体は、３’末端鎖の端部と５’末端鎖の端部との間の標的ヌクレオチド配列Ｘを有する単一鎖ポリヌクレオチドである。プローブ集合体３０は、例えば、ビオチン−ストレプタビジン結合によって基体３２へ結合した捕獲プローブポリヌクレオチド３４を含有する。あるいは、プローブ３０のようなプローブは、相補的な「サンドウィッチ」型のオリゴヌクレオチド構造、例えば、図４Ｂに関連して後述する相補的な「サンドウィッチ」プローブ７９の構造等によって基体へ結合していてもよい。   FIG. 1C (ii) shows the probe assembly 30 and the target analyte 33 in detail. The target analyte is a single-stranded polynucleotide having a target nucleotide sequence X between the end of the 3 'end strand and the end of the 5' end strand. The probe assembly 30 contains a capture probe polynucleotide 34 bound to a substrate 32 by, for example, biotin-streptavidin binding. Alternatively, a probe such as probe 30 is attached to the substrate by a complementary “sandwich” type oligonucleotide structure, such as the structure of a complementary “sandwich” probe 79 described below in connection with FIG. 4B. Also good.

この実施例においては、プローブポリヌクレオチド３４は近接する５’末端ヌクレオチドに隣接する基体３２に結合し、また、ナノコード配列Ｙと捕獲配列Ｘ’を含む。該捕獲配列は、被検体ポリヌクレオチド３３の標的配列Ｘに対して相補的である。プローブ３１は、相補的配列Ｙ’を有する１又は複数のレポーターオリゴヌクレオチド３５も含み、該相補的配列は、プローブ集合体内においては、プローブポリヌクレオチド３４のナノコード配列Ｙとハイブリッド形成する。図１Ｃ（ii）においては、ナノコード配列Ｙは捕獲配列Ｘ’に関して、基体３２に対して隣接して示されているが、必ずしもこのようにする必要はないことに留意すべきである。   In this example, probe polynucleotide 34 binds to substrate 32 adjacent to the adjacent 5 'terminal nucleotide and also includes nanocode sequence Y and capture sequence X'. The capture sequence is complementary to the target sequence X of the analyte polynucleotide 33. The probe 31 also includes one or more reporter oligonucleotides 35 having a complementary sequence Y 'that hybridizes with the nanocode sequence Y of the probe polynucleotide 34 within the probe assembly. In FIG. 1C (ii), it should be noted that although the nanocode sequence Y is shown adjacent to the substrate 32 with respect to the capture sequence X ', this need not be the case.

選択された捕獲配列とナノコード配列を有するプローブオリゴヌクレオチド３４及びレポーターオリゴヌクレオチド３５は、例えば、市販されている合成セット一式に用いる既知の方法に従って調製してもよい。同様に、指定された塩基を有するビオチニル化オリゴヌクレオチドは市販品として入手することができ、また、基体は、既知の方法により、ストレプタビジンを用いて処理してもよい。ポリヌクレオチドを基体へ付着させる別の適当な方法、例えば、細胞の表面リガンドを用いる方法等は既知である。レポーター３５は、プローブ集合体３０を形成させるために適当な条件下において、ポリヌクレオチド３４とハイブリッド形成させてもよい。   Probe oligonucleotides 34 and reporter oligonucleotides 35 having selected capture and nanocode sequences may be prepared, for example, according to known methods used for a set of commercially available synthetic sets. Similarly, biotinylated oligonucleotides having designated bases are commercially available and the substrate may be treated with streptavidin by known methods. Other suitable methods for attaching a polynucleotide to a substrate are known, such as using cell surface ligands. Reporter 35 may be hybridized with polynucleotide 34 under suitable conditions to form probe assembly 30.

特定の目的のためにより明確に規定しない限り、本明細書においては、「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」という用語は一般的には互換的に使用される。特定の配列の選択される長さは当該分子のハイブリッド形成特性に関連するが、本発明の原理は、本発明の技術的思想を逸脱することなく、広範囲の配列の長さと分子量に対して適用される。文脈又は用法から判断して、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに言及していることが明らかである場合には、このような種（species）は、明確性を失うことなく、「分子」若しくは「種」又は分子の機能、例えば、「被検体（analyte）」又は「レポーター（reporter）」にも関連していてもよい。   As used herein, the terms “polynucleotide” and “oligonucleotide” are generally used interchangeably, unless specifically defined for a specific purpose. While the selected length of a particular sequence is related to the hybridization properties of the molecule, the principles of the present invention apply to a wide range of sequence lengths and molecular weights without departing from the inventive concept of the present invention. Is done. If it is clear from the context or usage that it is clear that it refers to a polynucleotide or oligonucleotide, such species can be referred to as a “molecule” or “species” without loss of clarity. Or it may be related to the function of the molecule, for example "analyte" or "reporter".

この実施例においては、各々のプローブオリゴヌクレオチドはナノコード配列部分と捕獲配列部分を含む。ナノコード配列部分はレポーターオリゴヌクレオチドの対応する配列に対して相補的になるように選択される。プローブ集合体の調製においては、レポーターオリゴヌクレオチドは、適当な条件下において、ナノコード配列とハイブリッド形成する。捕獲配列部分は、標的被検体ポリヌクレオチドの対応する配列（標的配列）に対して相補的になるように選択されて設計される。捕獲配列とナノコード配列を有するプローブオリゴヌクレオチドは既知の方法に従って調製した後、既知の方法によって基体（例えば、磁性ビーズ又はその他の不動化表面等）へ付着させてもよい。   In this example, each probe oligonucleotide includes a nanocode sequence portion and a capture sequence portion. The nanocode sequence portion is selected to be complementary to the corresponding sequence of the reporter oligonucleotide. In preparing probe assemblies, the reporter oligonucleotide hybridizes to the nanocode sequence under appropriate conditions. The capture sequence portion is selected and designed to be complementary to the corresponding sequence (target sequence) of the target analyte polynucleotide. A probe oligonucleotide having a capture sequence and a nanocode sequence may be prepared according to known methods and then attached to a substrate (eg, magnetic beads or other immobilized surface) by known methods.

図１Ｄ（i）及び図１Ｄ（ii）は液状系２０の容器又はセル２３を示す。該液状系内においては、標的被検体ポリヌクレオチド３３はプローブ３１のプローブヌクレオチド３４とハイブリッド形成することによって１又は複数のプローブ／被検体複合体３６を形成する。該プローブ／被検体複合体３６は、被検体３３の標的配列Ｘと少なくとも１つのプローブポリヌクレオチド３４の捕獲配列Ｘ’とのハイブリッド形成によって被検体ポリヌクレオチドへ結合したプローブ集合体３０を含む。図１Ｄ（ii）はプローブ／被検体複合体３６を詳細に示しており、標的被検体３３は、プローブポリヌクレオチド３４の遠位３’末端を超えて重なり合う遠位５’末端を有する。   1D (i) and 1D (ii) show a container or cell 23 of the liquid system 20. In the liquid system, the target analyte polynucleotide 33 is hybridized with the probe nucleotide 34 of the probe 31 to form one or more probe / analyte complexes 36. The probe / analyte complex 36 includes a probe assembly 30 bound to the analyte polynucleotide by hybridization of the target sequence X of the analyte 33 and the capture sequence X ′ of at least one probe polynucleotide 34. FIG. 1D (ii) shows the probe / analyte complex 36 in detail, and the target analyte 33 has a distal 5 'end that overlaps beyond the distal 3' end of the probe polynucleotide 34.

図１Ｅは、１回又は複数回の所望によるすすぎ過程又は洗浄過程が可能となるように不動化又は固定的に配置された１又は複数の基体３２を示す。該すすぎ過程又は洗浄過程においては、未反応種１５を含む試料媒体１６が除去されて反応媒体１７によって置き換えられ、１又は複数のプローブ／被検体複合体３６及び未反応のプローブ又はプローブ集合体が容器２３の内部に残留する。この実施例においては、１又は複数の基体は調整可能な磁石１８によって不動化された磁性ビーズが使用される。   FIG. 1E shows one or more substrates 32 that are immobilized or fixedly arranged to allow one or more desired rinsing or cleaning steps. In the rinsing process or the washing process, the sample medium 16 containing the unreacted species 15 is removed and replaced by the reaction medium 17, and one or a plurality of probe / analyte complexes 36 and unreacted probes or probe assemblies are formed. It remains inside the container 23. In this embodiment, one or more substrates are magnetic beads immobilized by an adjustable magnet 18.

プローブ集合体３０が複数のプローブ３１を含む場合には、複数の被検体３３は、各々のプローブ集合体３０の各プローブ３１と結合してもよい。検出系２０においては、全体として過剰のプローブ３１を有する１又は複数のプローブ集合体３０が存在するようにすることにより、試料中の被検体３３が図１Ｄに示す過程において利用可能な捕獲プローブ３１と効率よく結合するようにすることが有利である。図１Ｅに示すすすぎ／洗浄過程によって非標的ポリヌクレオチド及び最初の試料又は溶解混合物に含まれるその他の汚染物を除去することが有利であり、これによって、検出過程における非特異的結合又は交差反応の可能性又は程度は最小になる。   When the probe assembly 30 includes a plurality of probes 31, the plurality of analytes 33 may be combined with each probe 31 of each probe assembly 30. In the detection system 20, the capture probe 31 that can be used in the process shown in FIG. 1D by the analyte 33 in the sample is obtained by making one or a plurality of probe assemblies 30 having an excess of probes 31 exist. It is advantageous to ensure efficient coupling. It may be advantageous to remove non-target polynucleotides and other contaminants contained in the initial sample or lysis mixture by the rinse / wash process shown in FIG. 1E, so that non-specific binding or cross-reactions in the detection process are eliminated. The possibility or degree is minimized.

図１Ｆ（i）〜図１Ｆ（iii）及び図１Ｇ（i）は、プローブ／被検体複合体をエキソヌクレアーゼ３７で処理する状態を模式的に示す。この実施例においては、エキソヌクレアーゼ３７は、露出した平滑状又は陥凹状（非突出状）の３’末端を有するハイブリッド形成されたポリヌクレオチドの重複鎖の分解（例えば、ホスフェート結合の加水分解）に対して特異的活性を示す。この実施例においては、プローブポリヌクレオチド３４の遠位の非突出状３’末端は漸進的に攻撃されて分解される。好ましい実施態様においては、所望によるすすぎ過程の後に添加されるエキソヌクレアーゼの特異的活性は、被検体／プローブ複合体のプローブ集合体部分のナノコードと捕獲配列のみの分解に作用し、標的被検体ポリヌクレオチド３３又はレポーターオリゴヌクレオチド３５あるいはプリスチン若しくは未反応プローブ３１には作用しない。   1F (i) to FIG. 1F (iii) and FIG. 1G (i) schematically show a state where the probe / analyte complex is treated with exonuclease 37. FIG. In this example, exonuclease 37 is used to degrade overlapping strands of hybridized polynucleotides that have an exposed, blunt or recessed (non-protruding) 3 ′ end (eg, hydrolysis of phosphate bonds). Specific activity is shown. In this example, the distal non-protruding 3 'end of probe polynucleotide 34 is progressively attacked and degraded. In a preferred embodiment, the specific activity of the exonuclease added after the optional rinsing process affects the degradation of only the nanocode and capture sequence of the probe assembly portion of the analyte / probe complex, and the target analyte It does not act on the polynucleotide 33, the reporter oligonucleotide 35, the pristine or the unreacted probe 31.

他の酵素としてのヌクレアーゼは、種類と環境に応じて種々のプロセッシング性（processivity）を示し、連続的な分解過程として図示した好適な態様は、ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチド基質へ拡散するとき又は該基質から拡散するときは不連続的又は挿入的であってもよいことも理解すべきである。同様に、ヌクレアーゼは一次活性と二次活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を有していてもよく、当業者であれば、所望のエキソヌクレアーゼ活性が優先的におこなわれるように濃度と条件を適宜調節できる。   Nucleases as other enzymes exhibit various processivity depending on the type and environment, and the preferred embodiment illustrated as a continuous degradation process is when the nuclease diffuses into or out of the oligonucleotide substrate. It should also be understood that when diffusing, it may be discontinuous or insertional. Similarly, a nuclease may have a primary activity and a secondary activity (for example, endonuclease activity). Those skilled in the art appropriately adjust the concentration and conditions so that a desired exonuclease activity is preferentially performed. Can be adjusted.

前述のように、別の実施態様においては、近位及び遠位の末端鎖端部の順位を逆転させたプローブ（５’末端に対する３’末端）を採用し、非突出状５’重複末端に対して特異的な対応する逆活性を有するエキソヌクレアーゼを適用してもよい。同様に、さらに別の実施態様においては、非特異的活性が調節されるか、又は非干渉的である場合には、特異的なエンドヌクレアーゼ以外の多重活性様式を示す酵素系を使用することができる。例えば、ヌクレオチドホスフェートを含有しない媒体中において種々のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ポリメラーゼ活性を犠牲にして、「校正」活性を優先させてヌクレアーゼとして機能させてもよい。   As described above, in another embodiment, a probe (3 ′ end relative to the 5 ′ end) in which the order of the proximal and distal end ends is reversed is adopted, and the non-protruding 5 ′ overlapping end is used. Alternatively, an exonuclease having a corresponding inverse activity specific for it may be applied. Similarly, in yet another embodiment, an enzyme system that exhibits multiple modes of activity other than a specific endonuclease may be used if non-specific activity is modulated or non-interfering. it can. For example, by using various types of DNA polymerases in media that do not contain nucleotide phosphates, the “proofreading” activity may be prioritized to function as a nuclease at the expense of polymerase activity.

図１Ｆ（iii）は、捕獲配列Ｘ’の脱離によって被検体分子３３が放出されるように進行中のプローブ分子３４の分解過程を示す。
図１Ｇ（i）は、ナノコード配列Ｙの脱離によってレポーター分子３５が放出されたプローブ分子３４の完結した分解を示す。 FIG. 1F (iii) shows the ongoing degradation process of the probe molecule 34 so that the analyte molecule 33 is released by the desorption of the capture sequence X ′.
FIG. 1G (i) shows the complete degradation of the probe molecule 34 from which the reporter molecule 35 has been released by desorption of the nanocode sequence Y.

図１Ｆ（iii）に示す過程において放出された被検体分子３３は媒体１７の内部において自由に拡散し、残存する未反応のプローブ（プリスチン）３１とハイブリッド形成することによって付加的なプローブ／被検体複合体３６を生成する。このようにして事後的に形成される複合体３６もエキソヌクレアーゼの分解作用を受けやすく、付加的なレポーターが放出される。過剰のプローブ３１の生成により、有利な増幅過程がもたらされる。この場合、各々の被検体分子３３は、被検体によって刺激される複数の対応するプローブ３１の分解に起因して複数のレポーター分子を逐次的に放出させる。   The analyte molecule 33 released in the process shown in FIG. 1F (iii) is freely diffused inside the medium 17 and is hybridized with the remaining unreacted probe (pristin) 31, thereby providing an additional probe / analyte. A composite 36 is generated. The complex 36 formed later in this way is also susceptible to the degradation action of exonuclease, and an additional reporter is released. Production of excess probe 31 results in an advantageous amplification process. In this case, each analyte molecule 33 sequentially releases a plurality of reporter molecules due to the degradation of a plurality of corresponding probes 31 stimulated by the analyte.

このようにして、反応緩衝液中においては比較的高濃度のレポーターオリゴヌクレオチドが蓄積され、該レポーターオリゴヌクレオチドは所望によるすすぎ処理によって予め精製するか又は単純化する。この結果、当初は試料中に非常に低濃度で含まれる被検体は、ナノ電子的検出器による顕著な交差反応性を伴うことなく、本明細書に記載のようにして電子的に検出される。   In this way, a relatively high concentration of reporter oligonucleotide is accumulated in the reaction buffer, and the reporter oligonucleotide is pre-purified or simplified by an optional rinse treatment. As a result, analytes initially contained at very low concentrations in the sample are detected electronically as described herein without significant cross-reactivity with the nanoelectronic detector. .

図１Ｇ（ii）は、蓄積したレポーター３５が、本願明細書に記載のようなナノ電子的センサー４０（本願明細書の一部を成す前記の特許出願の明細書に記載のこの種のセンサー及び後述する別の態様のセンサーを参照されたい）を１個又は複数個有する隣接する検出セル２５へ流れる状態を示す。センサー４０は、例えば、レポーター３５の配列の少なくとも一部に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む検出プローブ４１を１個又は複数個具有することによって、レポータープローブ３５に対して感度を示す。あるいは、センサー４０は反応セル２３の内部に含まれていてもよい。   FIG. 1G (ii) shows that the accumulated reporter 35 is a nanoelectronic sensor 40 as described herein (this type of sensor described in the specification of the aforementioned patent application and part of this specification). (Refer to another embodiment of sensor described later) FIG. The sensor 40 exhibits sensitivity to the reporter probe 35 by having one or a plurality of detection probes 41 including an oligonucleotide complementary to at least a part of the sequence of the reporter 35, for example. Alternatively, the sensor 40 may be included in the reaction cell 23.

図１Ｈに示すように、レポーター３５と検出プローブ４１とのハイブリッド形成によって、センサー４０の電子的特性に特異的な検出可能な変化がもたらされ、これに起因して、下記の過程ａ）〜ｄ）を含む測定回路４２の操作によってレポーター３５の存在の測定が可能となる：
ａ）レポーターを検出プローブとハイブリッド形成させる。
ｂ）所望により、反応用緩衝液を、例えば、センサーにおけるヌクレアーゼ活性を抑制するために、測定用緩衝液と交換する。
ｃ）信号（例えば、トランジスター又は容量性特性等）を得る。
ｄ）レポーターを検出する。 As shown in FIG. 1H, the hybridization of the reporter 35 and the detection probe 41 results in a specific detectable change in the electronic properties of the sensor 40, which results in the following steps a) to Measurement of the presence of the reporter 35 is possible by operating the measurement circuit 42 including d):
a) The reporter is hybridized with the detection probe.
b) If desired, the reaction buffer is replaced with a measurement buffer, for example, to suppress nuclease activity in the sensor.
c) Obtain a signal (eg, transistor or capacitive characteristics).
d) Detect the reporter.

所望により、反応媒体１７を除去し（例えば、測定用緩衝液１８と交換する）、次いで、回路４２により信号を得る前に、検出プローブのハイブリッド形成を行う。   If desired, the reaction medium 17 is removed (eg, replaced with the measurement buffer 18), and then the detection probe is hybridized before the signal is obtained by the circuit.

ＰＣＲによらない指数関数的な増幅
図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の観点を有する電子的検出のための方法と装置の実施態様を模式的に示す（多数の別の方法においては共通の観点が含まれる）。この実施態様によれば、被検体に対する応答性の非直線的又は指数関数的な増幅がもたらされる（試料中の被検体の存在に応答して、付加的な非試料標的が得られるか、又は出現し、該標的は、例えば、レポーターの放出の誘発に関与する）。図２Ａ〜図２Ｈに示すような方法は、単独で使用してもよく、あるいは図１Ａ〜図１Ｈに示すような方法、即ち、被検体に対する応答性の直線的増幅（例えば、当初の試料中に存在する標的被検体のみがレポーターの放出の誘発に関与する増幅）をもたらすことによって特徴付けられる方法と組み合わせて使用してもよい。 Exponential amplification without PCR FIGS. 2A-2H schematically illustrate embodiments of methods and apparatus for electronic detection having aspects of the present invention (a common aspect in many other methods). Included). This embodiment results in non-linear or exponential amplification of responsiveness to the analyte (additional non-sample target is obtained in response to the presence of the analyte in the sample, or And the target is involved, for example, in triggering the release of the reporter). The methods as shown in FIGS. 2A-2H may be used alone or as shown in FIGS. 1A-1H, ie, linear amplification of responsiveness to the analyte (eg, in the original sample). May be used in combination with a method characterized by the fact that only the target analyte present in the region results in amplification involved in triggering the release of the reporter.

特定の実施態様においては、被検体に応答して酵素により仲介される初期の反応によって、合成のオリゴヌクレオチド標的（即ち、試料中に存在しない予備調製された天然又は合成されたオリゴヌクレオチド）が放出される。該オリゴヌクレオチド標的は付加的な酵素により仲介される反応に関与し、該反応は別の合成標的をもたらす。合成オリゴヌクレオチド標的は、試料中に被検体ポリヌクレオチドが存在しないときのエキソヌクレアーゼ活性から保護されるような重複形態でもたらされてもよい。   In certain embodiments, an initial reaction mediated by an enzyme in response to an analyte releases a synthetic oligonucleotide target (ie, a pre-prepared natural or synthesized oligonucleotide that is not present in the sample). Is done. The oligonucleotide target participates in an additional enzyme-mediated reaction that results in another synthetic target. Synthetic oligonucleotide targets may be provided in overlapping form such that they are protected from exonuclease activity when no analyte polynucleotide is present in the sample.

一部の実施態様においては、合成標的は、標的被検体の疑似天然配列であってもよい。別の実施態様においては、合成標的は完全な非天然配列であってもよく、あるいは、天然配列と非天然配列との組み合わせ配列であってもよい。反応媒体中においてこの種の標的を非直線的又は指数関数的に増加させる方法を使用することによって、例えば、図１Ａ〜図１Ｈに示す方法によるレポータープローブの放出を誘発させてもよい。   In some embodiments, the synthetic target may be a pseudo-native sequence of the target analyte. In another embodiment, the synthetic target may be a complete non-natural sequence or a combined sequence of natural and non-natural sequences. By using a method of increasing such a target in a reaction medium in a non-linear or exponential manner, the release of the reporter probe may be triggered, for example, by the method shown in FIGS.

「増幅（amplification）」という用語に関しては、本願明細書においては、ＰＣＲにおける該用語の用い方とは幾分異なる意味で使用する。ＰＣＲアッセイ法の実施例においては、配列の新たなコピーがポリメラーゼ活性を介して創製され、プライマーを試料中の被検体と結合させることによって放出が誘発される。本願明細書に記載の本発明の観点を有する方法と装置の実施例においては、選択された標的配列のコピーは予備合成され、アンプリファイア基、例えば、試薬物質として予備配合される。予備合成標的の放出は、アッセイにおいて該試薬物質を使用するときに被検体によって特異的に誘発される。反応媒体中において放出された当該分子の増加は、被検体の存在を表示する増幅信号を事実上発生させる。   As used herein, the term “amplification” is used in a somewhat different sense from the use of the term in PCR. In the PCR assay example, a new copy of the sequence is created via polymerase activity and release is triggered by binding the primer to the analyte in the sample. In embodiments of the method and apparatus having the inventive aspects described herein, a copy of the selected target sequence is pre-synthesized and pre-compounded as an amplifier group, eg, a reagent material. Release of the pre-synthetic target is specifically triggered by the analyte when using the reagent substance in an assay. The increase in the molecule released in the reaction medium effectively generates an amplified signal indicative of the presence of the analyte.

図２Ａは、標的被検体ポリヌクレオチド５０を含む試料媒体を示す。該ポリヌクレオチドは標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む。エキソヌクレアーゼ３７、Ａアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４を含有する混合物を用いて処理した試料が図示される。本願明細書に記載のようなアンプリファイア処理の前に、所望により、試料媒体を精製処理に付してもよいことに留意すべきである。この実施例においては、エキソヌクレアーゼ３７は、図１Ａ〜図１Ｈに示す実施例の場合と同一又は類似する酵素であって、非突出状３’二重鎖末端に対して特異的な活性を示す該酵素であってもよい（上記の方法に類似する３’／５’逆方向法も可能であることに留意すべきである）。被検体５３は２種の重なり合わない選択された配列、即ち、標的Ａと標的Ｂを含む。   FIG. 2A shows a sample medium containing the target analyte polynucleotide 50. The polynucleotide comprises target sequence A (target A) and target sequence B (target B). A sample treated with a mixture containing exonuclease 37, A amplifier 51 and B amplifier 54 is illustrated. It should be noted that the sample media may be subjected to a purification process, if desired, prior to an amplifier process as described herein. In this example, exonuclease 37 is the same or similar enzyme as in the example shown in FIGS. 1A-1H and exhibits specific activity for non-protruding 3 ′ duplex ends. It may be the enzyme (note that a 3 ′ / 5 ′ reverse method similar to the method described above is also possible). The subject 53 includes two non-overlapping selected sequences, target A and target B.

Ａアンプリファイア５１は合成オリゴヌクレオチド５２を含んでおり、該合成オリゴヌクレオチドは、天然の標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ’（捕獲Ｂ’） 及び標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ’（捕獲Ａ’）を有する。   The A amplifier 51 includes a synthetic oligonucleotide 52, which is complementary to the natural target sequence B (target B), sequence B '(capture B') and target sequence A (target A). ) With a complementary sequence A ′ (capture A ′).

Ａアンプリファイア５１は第２オリゴヌクレオチド５３をさらに含んでおり、該第２オリゴヌクレオチドは、天然標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ''（合成標的Ａ''）を有する。第２オリゴヌクレオチド５３はその３’末端に「尾」配列を有するので、該第２オリゴヌクレオチドは突出状３’付着末端（即ち、平滑状又は陥凹状の３’末端を含まない）を有し、その結果、該第２オリゴヌクレオチドは、３’特異的エキソヌクレアーゼ３７に対する攻撃点を形成しない。あるいは、この目的のための「尾」配列の代わりにキャッピング基を既知の方法によって使用してもよい。   The A amplifier 51 further includes a second oligonucleotide 53, which has a sequence A ″ (synthetic target A ″) complementary to the natural target sequence A (target A). . Since the second oligonucleotide 53 has a “tail” sequence at its 3 ′ end, the second oligonucleotide has a protruding 3 ′ sticky end (ie, does not include a blunt or recessed 3 ′ end). As a result, the second oligonucleotide does not form an attack point against the 3′-specific exonuclease 37. Alternatively, capping groups may be used by known methods instead of “tail” sequences for this purpose.

オリゴヌクレオチド５３は、合成標的Ａ''と捕獲Ａ’とのハイブリッド形成によって、オリゴヌクレオチド５２と結合する。Ａアンプリファイア５１もこのように表示されることに留意すべきである。何故ならば、該アンプリファイアは、被検体５０の天然標的配列Ａと同一又は類似する配列（合成標的Ａ''）を発現できるからである。   Oligonucleotide 53 binds to oligonucleotide 52 by hybridization of synthetic target A ″ and capture A ′. It should be noted that the A amplifier 51 is also displayed in this way. This is because the amplifier can express a sequence identical to or similar to the natural target sequence A of the analyte 50 (synthetic target A ″).

逆に、Ｂアンプリファイア５４は合成オリゴヌクレオチド５５を含んでおり、該合成オリゴヌクレオチドは、天然の標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ’（捕獲Ａ’） 及び標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ’（捕獲Ｂ’）を有する。Ｂアンプリファイア５４は第２オリゴヌクレオチド５６をさらに含んでおり、該第２オリゴヌクレオチドは、天然標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ''（合成標的Ｂ''）を有する。第２オリゴヌクレオチド５６はその３’末端に「尾」配列（又はその他のキャッピング基）を有する。オリゴヌクレオチド５６は、合成標的Ｂ''と捕獲Ｂ’とのハイブリッド形成によって、オリゴヌクレオチド５５と結合する。Ｂアンプリファイア５４もこのように表示されることに留意すべきである。何故ならば、該アンプリファイアは、被検体５０の天然標的配列Ｂと同一又は類似する配列（合成標的Ｂ''）を発現できるからである   Conversely, the B amplifier 54 includes a synthetic oligonucleotide 55, which is complementary to the natural target sequence A (target A) with a sequence A ′ (capture A ′) and a target sequence B. It has a sequence B ′ (capture B ′) complementary to (target B). The B amplifier 54 further includes a second oligonucleotide 56, which has a sequence B ″ (synthetic target B ″) that is complementary to the natural target sequence B (target B). . The second oligonucleotide 56 has a “tail” sequence (or other capping group) at its 3 ′ end. Oligonucleotide 56 binds to oligonucleotide 55 by hybridization of synthetic target B ″ and capture B ′. Note that the B amplifier 54 is also displayed in this manner. This is because the amplifier can express a sequence identical to or similar to the natural target sequence B of the analyte 50 (synthetic target B ″).

この文脈において使用される「天然」及び「合成」という用語は、試料中に存在すると推定される標的被検体又は「天然」ポリヌクレオチド及び例示的なアッセイ法を実施するためのアンプリファイア試薬中に含まれる「合成」オリゴヌクレオチドを区別するためにのみ使用されるということに留意すべきである。試料の標的被検体又は「未変性」ポリヌクレオチドは、多くの場合は天然源に起因するが、必ずしもその必要性はない。試薬アンプリファイアとなるオリゴヌクレオチドは合成的に調製する手法が簡便であるが、必ずしもその必要性はない。   As used in this context, the terms “natural” and “synthetic” refer to target analytes or “natural” polynucleotides that are presumed to be present in a sample and amplifier reagents for performing exemplary assays. It should be noted that it is only used to distinguish the “synthetic” oligonucleotides involved. The target analyte or “native” polynucleotide of the sample is often derived from a natural source, but is not necessarily required. An oligonucleotide to be a reagent amplifier has a simple method for synthetic preparation, but it is not always necessary.

図２Ｂは図２Ａの要素を示す。この場合、Ａアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４は被検体５０の標的Ｂ及び標的Ａとそれぞれハイブリッド形成するように反応することによって被検体／アンプリファイア複合体５７を形成する。この態様においては、Ａアンプリファイア５１とＢアンプリファイア５４は単一の被検体分子５０と同時に反応するように図示されているが、必ずしもその必要性はなく、各々のアンプリファイアが関連するように記載されている増幅過程は、各アンプリファイアが他方のアンプリファイアとは無関係に作用するように進行してもよいことに留意すべきである。例えば、各アンプリファイアは別々に被検体分子と結合してもよい。   FIG. 2B shows the elements of FIG. 2A. In this case, the A amplifier 51 and the B amplifier 54 react with the target B and target A of the subject 50 so as to form a hybrid with each other, thereby forming the subject / amplifier complex 57. In this embodiment, the A and B amplifiers 51 and 54 are shown as reacting simultaneously with a single analyte molecule 50, but this is not necessarily so that each amplifier is associated. It should be noted that the described amplification process may proceed so that each amplifier acts independently of the other amplifier. For example, each amplifier may bind to the analyte molecule separately.

図２Ｃは、図２Ｂの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、Ａアンプリファイア５１のオリゴヌクレオチド５２の非突出状３’末端及びＢアンプリファイア５４のオリゴヌクレオチド５５の対応する非突出状３’末端は一対のエキソヌクレアーゼ３７の作用によって分解を開始している（両方の部位における酵素の作用が同時に行われる必要がないことに留意すべきである）。   FIG. 2C shows the analyte / amplifier complex 57 of FIG. 2B. In this case, the non-protruding 3 ′ end of the oligonucleotide 52 of the A amplifier 51 and the corresponding non-protruding 3 ′ end of the oligonucleotide 55 of the B amplifier 54 start to decompose by the action of a pair of exonucleases 37. (It should be noted that the action of the enzyme at both sites does not have to be performed simultaneously).

図２Ｄは、図２Ｃの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７の活性は、オリゴヌクレオチド５２の捕獲Ｂ’配列とオリゴヌクレオチド５５の捕獲Ａ’配列の脱離が行われるように作用し、これによって未変性の被検体であるポリヌクレオチド５０が放出される。   FIG. 2D shows the subject / amplifier complex 57 of FIG. 2C. In this case, the activity of the exonuclease 37 acts so that the capture B ′ sequence of the oligonucleotide 52 and the capture A ′ sequence of the oligonucleotide 55 are desorbed, whereby the polynucleotide 50, which is the native analyte. Is released.

図２Ｅは、図２Ｃの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７の活性は、オリゴヌクレオチド５２の捕獲Ａ’配列とオリゴヌクレオチド５５の捕獲Ｂ’配列の脱離が行われるように作用し、これによって対応するオリゴヌクレオチド５３及び５６が放出され、対応する合成標的Ａ''及び合成標的Ｂ''は単一鎖形態で露出又は発現する。   FIG. 2E shows the subject / amplifier complex 57 of FIG. 2C. In this case, the activity of exonuclease 37 acts so that the capture A ′ sequence of oligonucleotide 52 and the capture B ′ sequence of oligonucleotide 55 are desorbed, thereby releasing the corresponding oligonucleotides 53 and 56. , The corresponding synthetic target A ″ and synthetic target B ″ are exposed or expressed in single chain form.

図２Ｆは図２Ｅの要素を示す。この場合、放出された未変性被検体ポリヌクレオチド５０及び放出された合成標的ＡとＢ（それぞれ対応する標的Ａ''とＢ''を有するオリゴヌクレオチド５３と５６）は付加的なＡアンプリファイア５１とＢアンプリファイア５４と反応し、これによって、付加的なハイブリッド化重複体並びに付加的なアンプリファイア／被検体複合体５７、合成Ａ標的／アンプリファイア複合体５８及び合成Ｂ標的／アンプリファイア複合体５９が形成される。   FIG. 2F shows the elements of FIG. 2E. In this case, the released native analyte polynucleotide 50 and the released synthetic targets A and B (oligonucleotides 53 and 56 with corresponding targets A ″ and B ″ respectively) are added to the additional A amplifier 51. And B amplifier 54, thereby adding additional hybridizing duplicates and additional amplifier / analyte complex 57, synthetic A target / amplifier complex 58 and synthetic B target / amplifier complex. 59 is formed.

図２Ｇは図２Ｆの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７のさらなる活性に起因して、複合体５７、５８及び５９の露出された非突出状３’末端の分解が図２Ｄ〜図２Ｅに示すようにして開始され、これによって、付加的な合成標的ＡとＢ、未変性被検体５０及び先に放出された合成標的ＡとＢが放出される。   FIG. 2G shows the elements of FIG. 2F. In this case, due to the further activity of exonuclease 37, degradation of the exposed non-protruding 3 ′ ends of complexes 57, 58 and 59 is initiated as shown in FIGS. Additional synthetic targets A and B, the native analyte 50 and the previously released synthetic targets A and B are released.

図２Ｈは図２Ｇの要素を示す。この場合、最初に蓄積された未変性被検体５０及び蓄積された合成標的ＡとＢは、一般的には図１Ａ〜図１Ｈに例示した方法に関連して記載したものと一般的に類似する捕獲／レポータープローブ集合体を用いて処理した。この特定の実施例においては、２種の異なるプローブ集合体が使用された。第１プローブ集合体は、未変性被検体５０又は合成標的Ａ（５３）の標的配列Ａに対して特異的なプローブ６０を有する。第２プローブ集合体は、未変性被検体５０又は合成標的Ｂ（５６）の標的配列Ｂに対して特異的なプローブ６１を有する。レポーター分子３５を放出させるための方法と装置が示される。   FIG. 2H shows the elements of FIG. 2G. In this case, the initially accumulated native analyte 50 and the accumulated synthetic targets A and B are generally similar to those described in connection with the method illustrated in FIGS. 1A-1H. Processed with capture / reporter probe assembly. In this particular example, two different probe assemblies were used. The first probe assembly has a probe 60 specific for the native analyte 50 or the target sequence A of the synthetic target A (53). The second probe assembly has a probe 61 specific to the native analyte 50 or the target sequence B of the synthetic target B (56). A method and apparatus for releasing the reporter molecule 35 is shown.

図３Ａ及び図３Ｂは、増幅過程に関する２つの実施例をまとめたものである。一方の実施例は２種の被検体標的を用いた実施例（図２Ａ〜図２Ｈに示す実施例）であり、他方の実施例は単一の被検体標的を用いた別の実施例である。   3A and 3B summarize two examples relating to the amplification process. One example is an example using two analyte targets (the example shown in FIGS. 2A to 2H), and the other example is another example using a single analyte target. .

単一標的
図３Ａは、合成標的の放出を誘発させるために単一の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を模式的に示す。被検体５０は、単一の選択された標的配列部分Ａ（標的Ａ）を有する。アンプリファイア７５は、図２Ａに示すアンプリファイア５１と類似する。但し、この場合には、両方の捕獲配列が標的Ａに対して相補的である。 Single Target FIG. 3A schematically illustrates the results of an amplification method that uses a single analyte capture sequence to trigger the release of a synthetic target. The subject 50 has a single selected target sequence portion A (target A). The amplifier 75 is similar to the amplifier 51 shown in FIG. 2A. However, in this case, both capture sequences are complementary to target A.

第１段階においては、単一の被検体５０は単一のアンプリファイア７５と反応して被検体／アンプリファイア複合体７６を生成する。エキソヌクレアーゼ３７は複合体７６を分解して被検体５０と合成標的Ａ（５３）を放出する。従って、２種の標的が放出される。   In the first stage, a single subject 50 reacts with a single amplifier 75 to produce a subject / amplifier complex 76. The exonuclease 37 decomposes the complex 76 and releases the analyte 50 and the synthetic target A (53). Thus, two targets are released.

第２段階においては、被検体５０と合成標的Ａ（５３）は２つの付加的なアンプリファイア７５と反応して被検体／アンプリファイア複合体７６及び合成標的Ａ／アンプリファイア複合体７７を生成する。エキソヌクレアーゼ３７は両方の複合体７６及び複合体７７を分解して被検体５０と３つの合成標的Ａ（５３）を放出する。従って、４種の標的が放出される。   In the second stage, analyte 50 and synthetic target A (53) react with two additional amplifiers 75 to produce analyte / amplifier complex 76 and synthetic target A / amplifier complex 77. . Exonuclease 37 degrades both complex 76 and complex 77 to release analyte 50 and three synthetic targets A (53). Thus, four targets are released.

各々の標的配列が各々の段階において付加的なアンプリファイアとハイブリッド形成し、その結果、放出される標的の量は指数関数的に増加することが理解される。この方法の５つの段階における結果を以下の表１に示す。   It is understood that each target sequence hybridizes with an additional amplifier at each stage, so that the amount of target released increases exponentially. The results for the five stages of the method are shown in Table 1 below.

二重標的
図３Ａとは対照的に、図３Ｂは、複数の被検体捕獲配列を用いて合成標的の放出を誘発させる増幅方法の結果を模式的に示す。この実施例においては、増幅方法として、図２Ａ〜図２Ｈに示す方法と同じ方法を使用したが、別の方法を使用することも可能である。例えば、標的Ａと標的Ｂは、試料被検体であるポリヌクレオチド中に存在するように選択する必要はなく、補助被検体（co-analyte）の一部になるように選択してもよい。この場合、増幅された標的応答は試料中に共存する両方の補助被検体によって誘発される。この態様は、例えば、陽性の結果が複数のマーカー（例えば、複数のフラグメント又は分子から誘導されるもの）の存在として定義される選択的アッセイにおいて特に有用である。 In contrast to dual target FIG. 3A, FIG. 3B schematically illustrates the results of an amplification method that uses multiple analyte capture sequences to induce release of a synthetic target. In this embodiment, the same method as that shown in FIGS. 2A to 2H is used as the amplification method, but another method can be used. For example, target A and target B need not be selected to be present in the polynucleotide that is the sample analyte, but may be selected to be part of the co-analyte. In this case, the amplified target response is triggered by both auxiliary analytes coexisting in the sample. This aspect is particularly useful in selective assays where, for example, a positive result is defined as the presence of multiple markers (eg, those derived from multiple fragments or molecules).

図２Ａ〜図２Ｈにも記載のように、被検体５０は２つの選択された標的配列部分を含んでおり、該標的配列部分は２種の異なるアンプリファイア（５１及び５４）と反応して複合体５７を生成する。次いで、エキソヌクレアーゼ反応によってこれらのアンプリファイアは分解され、被検体５０（２種の標的）と２種の異なる合成標的（５３及び５６）が放出される。各段階においては、放出された標的配列の重複化（doubling）がもたらされるので、増幅も指数関数的に行われることが理解される。この方法の５つの段階における結果を以下の表２に示す。   As also described in FIGS. 2A-2H, analyte 50 includes two selected target sequence portions that are complexed by reacting with two different amplifiers (51 and 54). A body 57 is generated. These amplifiers are then degraded by an exonuclease reaction, releasing analyte 50 (two targets) and two different synthetic targets (53 and 56). It is understood that at each stage, amplification is also performed exponentially as it results in doubling of the released target sequence. The results for the five stages of the method are shown in Table 2 below.

図３Ｃは、表１と表２のデータをプロットしたグラフであり、単一標的法と二重標的法による合成標的の増加又は増幅を示す。   FIG. 3C is a graph plotting the data of Table 1 and Table 2, showing the increase or amplification of the synthetic target by the single target method and the dual target method.

図４Ａ及び図４Ｂは、レポーターの増幅と精製のための装置と方法を示す。
図４Ａは、一般的には、図２Ｈに図示する要素を示すが、この場合は修飾されたレポータープローブ（６１及び６２）を示す。この実施例においては、該レポータープローブは実質的な基体には結合せず、また、レポーターオリゴヌクレオチド３５の３’末端上にキャッピング基７８を有する。２種の異なるプローブを示す。一方のプローブにおいては、相補的レポーター配列３５''の末端上にキャッピング基が存在し、他方のプローブにおいては、短い尾配列の末端上にキャッピング基が存在する。キャッピング基は、当該分野において知られている多数の適当な種であって、エキソヌクレアーゼの付着及び／又はプロセシングに対して耐性を示す該種から選択されるいずれであってもよい（例えば、ヌクレオチド類似体、及び共有結合した種等）。この種のキャッピング基は、常套のオリゴヌクレオチド合成過程中において簡便に導入することができる。修飾されたレポータープローブは、溶液相中において被検体によって誘発されるレポーターの放出のために使用してもよい。 4A and 4B show an apparatus and method for reporter amplification and purification.
FIG. 4A generally shows the elements illustrated in FIG. 2H, but in this case modified reporter probes (61 and 62). In this example, the reporter probe does not bind to a substantial substrate and has a capping group 78 on the 3 ′ end of the reporter oligonucleotide 35. Two different probes are shown. In one probe there is a capping group on the end of the complementary reporter sequence 35 ″ and in the other probe there is a capping group on the end of the short tail sequence. The capping group may be any suitable species known in the art and selected from such species that are resistant to exonuclease attachment and / or processing (eg, nucleotides). Analogs, and covalently bound species, etc.). This type of capping group can be conveniently introduced during conventional oligonucleotide synthesis processes. Modified reporter probes may be used for reporter-induced reporter release in solution phase.

図４Ｂは、ナノ電子的検出の前に、放出されたレポーター（３５’及び３５''）を精製することによって、検出環境を単純化すると共に感度と選択性を改善する（例えば、ノイズの低減化等）ための本発明の観点を有する方法と装置の別の実施例を示す。検出操作の前に、高分子量のポリヌクレオチドを除去することは有利である。基体は磁性ビーズ又は本願明細書に記載のその他のいずれかの基体を含有している態様が有利である。少なくともレポーター３５’又は３５''に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む１又は複数の「サンドウィッチ型」プローブ７９は、図１Ａ〜図１Ｈに関連して記載したようにして、例えば、ビオチン／ストレプタビジン結合等によって基体へ結合される。レポーター３５’は、短い尾領域をプローブ７９とハイブリッド形成させた状態で図示されている。レポーター３５'は、プローブ（６０及び６１）のナノコードに対して相補的なレポーター配列の少なくとも一部によってハイブリッド形成された状態で図示されている。   FIG. 4B simplifies the detection environment and improves sensitivity and selectivity (eg, noise reduction) by purifying the released reporters (35 ′ and 35 ″) prior to nanoelectronic detection. FIG. 4 shows another embodiment of a method and apparatus having aspects of the present invention. It is advantageous to remove high molecular weight polynucleotides prior to the detection procedure. Advantageously, the substrate contains magnetic beads or any other substrate described herein. One or more “sandwich” probes 79 comprising an oligonucleotide having a sequence complementary to at least the reporter 35 ′ or 35 ″ can be used as described in connection with FIGS. It is bound to the substrate by biotin / streptavidin binding or the like. Reporter 35 'is shown with a short tail region hybridized with probe 79. Reporter 35 'is shown hybridized with at least a portion of the reporter sequence complementary to the nanocode of the probes (60 and 61).

本願明細書に記載のように、基体に結合したレポーター（３５’及び３５''）をすすぎ処理又は洗浄処理に付すことによって、未結合種を含む酵素反応媒体を除去した後、緩衝液で置き換えてもよく、また、該レポーターはナノ電子的検出操作のために、例えば、ビーズの磁気的不動化等によって最適化させてもよい。プローブ７９は、洗浄過程中のレポーターの安定な結合を可能にすると共にその後の検出用レポーターの放出のための簡便な変性を可能にするように選択されるヌクレオチド配列を有していてもよい。   As described herein, the reporter (35 ′ and 35 ″) bound to the substrate is subjected to a rinsing or washing treatment to remove the enzyme reaction medium containing unbound species and then replaced with a buffer. The reporter may also be optimized for nanoelectronic detection operations, such as by magnetic immobilization of beads. Probe 79 may have a nucleotide sequence selected to allow stable binding of the reporter during the washing process and to allow convenient denaturation for subsequent release of the reporter for detection.

図８Ａ及び図８Ｂに関連して後述する多重被検体アッセイとマトリックス検出器の実施態様に留意すべきである。図４Ｂに示すレポーターの精製法においては、レポーター３５の共通の配列部分に対して相補的な「サンドウィッチ型」プローブ７９を用いる態様が簡便である。この場合、該レポーターの配列のその他の部分は複数の被検体の１種に対して特異的である。アッセイ反応においてどのような種類のレポーターが放出されようとも、該レポーターは、マトリックス検出器との接触の前に、集合的に精製処理に付してもよい。   Note the multiple analyte assay and matrix detector embodiments described below in connection with FIGS. 8A and 8B. In the reporter purification method shown in FIG. 4B, an embodiment using a “sandwich type” probe 79 complementary to a common sequence portion of the reporter 35 is simple. In this case, the other part of the reporter sequence is specific for one of the plurality of analytes. Whatever type of reporter is released in the assay reaction, the reporter may be collectively subjected to a purification process prior to contact with the matrix detector.

ＰＣＲによらない標的の指数関数的な増幅とレポーターの累積増幅
図５Ａ〜図５Ｅは、共通の観点を有する多数の別の方法から選択された本発明の観点を有する例示的な方法と装置の実施態様を示す。この実施態様によれば、予備増幅による精製過程を含む被検体に応答する指数関数的な増幅がもたらされる。なお、この実施態様は、図２Ａ〜図２Ｈに示す方法と装置と共通する多くの観点を有しており、また、多くの場合は共通する参照番号が使用されている。図５Ａ〜図５Ｅに示すような方法と装置は独立して使用してもよく、あるいは、本願明細書に記載の別の方法と装置、特に図１Ａ〜図１Ｈによって例示される方法と装置と組み合わせて使用してもよい。 Non-PCR target amplification and reporter cumulative amplification FIGS. 5A-5E illustrate exemplary methods and apparatus having aspects of the present invention selected from a number of alternative methods having a common aspect. An embodiment is shown. This embodiment results in exponential amplification in response to the analyte including a purification process by pre-amplification. This embodiment has many aspects in common with the method and apparatus shown in FIGS. 2A-2H, and in many cases common reference numbers are used. The method and apparatus as shown in FIGS. 5A-5E may be used independently or alternatively, another method and apparatus described herein, particularly the method and apparatus illustrated by FIGS. 1A-1H. You may use it in combination.

初期固定化
図５Ａは、標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む標的被検体ポリヌクレオチド５０、及び種々の試料汚染物（例えば、被検体でないポリヌクレオチド、干渉性酵素、望ましくない化学的成分及び過剰の希釈剤等）を含有する試料媒体を示す。この試料は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が行われるために十分な条件下において、分析系７０と接触させる。該分析系は基体７１及び該基体と、例えばビオチン／ストレプタビジン結合６２によって結合した複数の捕獲プローブ（６０及び６１）を具有する。 Initial Immobilization FIG. 5A shows a target analyte polynucleotide 50 comprising target sequence A (target A) and target sequence B (target B), and various sample contaminants (eg, non-analyte polynucleotides, interfering enzymes, Sample medium containing undesirable chemical components and excess diluent, etc.). This sample is brought into contact with the analytical system 70 under conditions sufficient for polynucleotide hybridization to occur. The analysis system comprises a substrate 71 and a plurality of capture probes (60 and 61) bound to the substrate by, for example, a biotin / streptavidin bond 62.

プローブはＡプローブ（６０）とＢプローブ（６１）を含む。これらのＡプローブ及びＢプローブは、図２Ａ〜図２Ｈに示すプローブ６０及び６１と実質上同一であってもよい。Ａプローブ（６０）は、被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ａに対して相補的な捕獲配列Ａ’を含み、また、Ｂプローブ（６１）は、被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ｂに対して相補的な捕獲配列Ｂ’を含む。好ましくは、特に試料が非常に少量の被検体種を含有する場合には、分析系７０が、試料中に存在する実質的な量の被検体分子５０と結合するために十分な数のＡプローブ（６０）及び／又はＢプローブ（６１）を含むようにし、これによって、希薄試料に対する感度を最大にする。図２Ａにおいて模式的に示される実施態様においては、全ての被検体５０の分子はプローブ６０又はプローブ６１と結合する。過剰のプローブ６０及び６１は以下に記載の段階のために機能する。
１．過剰のＡレポータープローブ及びＢレポータープローブは大部分の被検体分子と結合する。
２．プローブの種類の空間的分離（例えば、ビーズの分離や基体の固定等）によって、アグルチネーション（aglutination）／架橋が回避されると共に被検体Ａの約半分と標的サイトはハイブリッド形成されない状態で残存する。 The probe includes an A probe (60) and a B probe (61). These A and B probes may be substantially the same as the probes 60 and 61 shown in FIGS. 2A-2H. The A probe (60) includes a capture sequence A ′ complementary to the target sequence A of the analyte polynucleotide 50, and the B probe (61) is relative to the target sequence B of the analyte polynucleotide 50. Complementary capture sequence B ′ is included. Preferably, especially when the sample contains a very small amount of analyte species, the analysis system 70 has a sufficient number of A probes to bind to a substantial amount of analyte molecules 50 present in the sample. (60) and / or B probe (61), thereby maximizing sensitivity to dilute samples. In the embodiment schematically shown in FIG. 2A, all analyte 50 molecules bind to probe 60 or probe 61. Excess probes 60 and 61 function for the steps described below.
1. Excess A and B reporter probes bind to most analyte molecules.
2. Spatial separation of probe types (eg, bead separation, substrate immobilization, etc.) avoids aglutination / crosslinking and leaves about half of analyte A and target sites unhybridized. To do.

基体７１は粒状であってもよく（例えば、１又は複数のビーズ等）、あるいは、非粒状であってもよい（例えば、ウェル、プレート及びベルト等）。特定の実施態様においては、基体７１は、多重結合被検体であるポリヌクレオチド５０に対するポテンシャルを低減させるように設計される（被検体は、標的Ａ配列と標的Ｂ配列において対応するプローブ６０及び６１とハイブリッド形成する）。図示する実施例においては、この態様は、１又は複数のＡプローブ（６０）とＢプローブ（６１）に対して異なる領域を提供する右手の区域と左手の区域によって別々に表示されているが、多くの別の態様が可能である。例えば、別の装置は異なる種類のビーズ（例えば、所望によりビーズ分離機構を用いてもよい）、固定プレート又はルーメン帯域、可変性の緊縮条件、及び異なる溶融特性／変性特性等を具有していてもよい。さらに別の実施態様においては、基７１は電子的検出器の素子と一体化されていてもよく（この態様に関しては後述する）、あるいは、該検出器から分離して配設させてもよい。   The substrate 71 may be granular (for example, one or a plurality of beads) or non-granular (for example, wells, plates, belts, etc.). In a particular embodiment, the substrate 71 is designed to reduce the potential for the polynucleotide 50 that is a multi-binding analyte (the analyte has a corresponding probe 60 and 61 in the target A and target B sequences). Hybrid). In the illustrated embodiment, this aspect is represented separately by a right hand area and a left hand area providing different regions for one or more A probes (60) and B probes (61), Many other embodiments are possible. For example, another device has different types of beads (eg, a bead separation mechanism may be used if desired), a fixed plate or lumen zone, variable stringency conditions, and different melt / denaturation characteristics. Also good. In yet another embodiment, the base 71 may be integrated with the elements of the electronic detector (this aspect will be described later) or may be disposed separately from the detector.

精製
図５Ｂは図５Ａの要素を示す。この場合、すすぎ及び／又は洗浄過程が行われ、これによって、過剰の試料媒体と汚染物６３が除去されるが、プローブ６０及び６１によって基体へ結合された被検体５０は保持される（不動化／分離技術を使用することによって、系中に存在する粒子状物質は保持される）。 Purification FIG. 5B shows the elements of FIG. 5A. In this case, a rinsing and / or washing process is performed, which removes excess sample medium and contaminants 63, but retains the analyte 50 bound to the substrate by the probes 60 and 61 (immobilized). / Particulate material present in the system is retained by using a separation technique).

インキュベーション
図５Ｃは図５Ｂの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７（例えば、図２Ａ〜図２Ｈに示すような活性を有するエキソヌクレアーゼ等）及びアンプリファイア重複オリゴヌクレオチド（該オリゴヌクレオチドは、図２Ａに示すＡアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４と実質上同一であってもよい）を含有する緩衝液によって交換されている。 Incubation FIG. 5C shows the elements of FIG. 5B. In this case, an exonuclease 37 (for example, an exonuclease having activity as shown in FIGS. 2A to 2H) and an amplifier overlapping oligonucleotide (the oligonucleotides include the A amplifier 51 and the B amplifier 54 shown in FIG. 2A). And may be substantially the same).

増幅
図５Ｄは図５Ｃの要素を示す。この場合、ハイブリッド形成と酵素活性に対して適した条件下において、Ａアンプリファイア５１、Ｂアンプリファイア５４及びエキソヌクレアーゼ３７は、図２Ｂ〜図２Ｇに記載のようにして、被検体５０とその後の合成標的と反応することによって、合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６を緩衝液媒体中へ放出する。 Amplification FIG. 5D shows the elements of FIG. 5C. In this case, under conditions suitable for hybridization and enzyme activity, the A amplifier 51, the B amplifier 54, and the exonuclease 37 are transferred to the subject 50 and the subsequent samples as shown in FIGS. 2B to 2G. By reacting with the synthetic target, the synthetic A target 53 and the synthetic B target 56 are released into the buffer medium.

図示する実施例においては、合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６は、図５Ａの過程において供給される過剰の複数のプリスチンＡプローブ６０とＢプローブ６１とハイブリッド形成する。あるいは、図５Ｄの過程において、付加的なプローブが提供されてもよい。この反応によって、図２Ｈに記載のようにして、複数の合成標的／プローブ複合体が生成する。特定の実施態様においては、過剰のアンプリファイア５１及び５４が供給され、エキソヌクレアーゼによって仲介される増幅が行われ、これによって十分な量の合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の生成反応が続行され、複数のプローブ６０及びプローブ６１はハイブリッド複合体の形成反応を介してそれぞれ飽和される。   In the illustrated embodiment, the synthetic A target 53 and the synthetic B target 56 hybridize with the excess plurality of pristine A probes 60 and B probes 61 supplied in the process of FIG. 5A. Alternatively, additional probes may be provided in the process of FIG. 5D. This reaction produces a plurality of synthetic target / probe complexes as described in FIG. 2H. In certain embodiments, excess amplifiers 51 and 54 are provided and exonuclease-mediated amplification is performed, which continues the production reaction of sufficient amounts of synthetic A and B targets, The probe 60 and the probe 61 are respectively saturated through a hybrid complex formation reaction.

レポーターの放出
図５Ｅは図５Ｄの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７は、酵素活性に対して適当な条件下において、図２Ｈに記載のようにして、合成標的／プローブ複合体及び未変性被検体／プローブ複合体と反応してプローブ６０と６１を分解させることによって、レポーターオリゴヌクレオチド３５及び標的種を緩衝液媒体中へ放出させる。 Reporter Release FIG. 5E shows the elements of FIG. 5D. In this case, the exonuclease 37 reacts with the synthetic target / probe complex and the native analyte / probe complex to react with the probe 60 under conditions suitable for enzyme activity as shown in FIG. 2H. By decomposing 61, the reporter oligonucleotide 35 and the target species are released into the buffer medium.

図示する実施例においては、エキソヌクレアーゼは全てのプローブを分解させることによって、検出用のレポーターを放出する。存在するポリヌクレオチドの実質的な母集団は未変性被検体及び被検体の存在に応答して放出される種（合成標的及びレポーター）であり、交差反応性は最小限に抑制されるか、又は回避される。レポーターは、検出器の応答に対して、例えば、大きさ又は組成等の点で最適化させることができる。許容される条件下では、図５Ｅに示す反応は、一般的には図５Ｄに示す反応と同時に進行させてもよいということに留意すべきである。あるいは、緊縮調節及びプローブの分離等を利用してこれらの反応過程を分離してもよい。   In the illustrated embodiment, the exonuclease releases a reporter for detection by degrading all probes. A substantial population of polynucleotides present is native analytes and species released in response to the presence of analytes (synthetic targets and reporters) and cross-reactivity is minimized or Avoided. The reporter can be optimized for detector response, for example in terms of size or composition. It should be noted that under acceptable conditions, the reaction shown in FIG. 5E may generally proceed simultaneously with the reaction shown in FIG. 5D. Or you may isolate | separate these reaction processes using stringent regulation and isolation | separation of a probe.

レポーター３５は、図１Ｇ及び図１Ｈに関連して説明したようにして、分離されたナノ電子的検出器４０又は反応領域と連絡する一体化ナノ電子的検出器を介して検出してもよいことに留意すべきである。   The reporter 35 may be detected via an isolated nanoelectronic detector 40 or an integrated nanoelectronic detector in communication with the reaction region as described in connection with FIGS. 1G and 1H. Should be noted.

別の特定の実施態様においては、基体７１は、プローブ６０及び６１の分解を直接的に検出するように設計された１又は複数のナノ電子的検出素子を含んでいてもよい。例えば、基体７１は１又は複数のナノ粒子の領域、例えば、電気接点と連絡するカーボンナノチューブ素子等を含んでいてもよい。例えば、プローブの分解に起因する１又は複数のナノチューブの性質の変化は、本願明細書及び本願明細書に組み込まれた特許出願の実施例Ａ〜Ｉに記載のようにして検出可能である。   In another specific embodiment, the substrate 71 may include one or more nanoelectronic detection elements designed to directly detect the degradation of the probes 60 and 61. For example, the substrate 71 may include one or more nanoparticle regions, such as carbon nanotube elements in communication with electrical contacts. For example, changes in the properties of one or more nanotubes due to probe degradation can be detected as described herein and in Examples A to I of the patent applications incorporated herein.

さらに別の実施態様においては、基体７１は、１又は複数の電極（例えば、間隔を設けて配置された少なくとも１対のソース電極／ドレイン電極）と接触するカーボンナノチューブのようなナノ粒子の連動ネットワークを含む１又は複数の領域を具有する。ナノ粒子のネットワークはウェファー様基体構造材（例えば、ケイ素、ＳｉＯ_２，Ｓｉ_３Ｎ_４、ＰＥＴ及び対電極材等又はこれらの任意の混合物）によって支持されていてもよい。本願明細書に組み込まれた特許出願の明細書には、この種の装置に関する調製例と操作例が記載されている。プローブ６０及び６１の分解（この分解により残存するリガンド部分６２’が脱離する場合がある）によって、適当な回路（図示せず）によって検出可能なナノ粒子素子の電気的、機械的及び／又は電気化学的な環境における少なくとも１つの変化（例えば、対電極に対するナノ粒子のキャパシタンスの変化、及びゲート電極の影響下でのトランジスター特性の変化等）がもたらされる。 In yet another embodiment, the substrate 71 is an interlocking network of nanoparticles such as carbon nanotubes that are in contact with one or more electrodes (eg, at least one pair of spaced apart source / drain electrodes). It has 1 or several area | region containing. The network of nanoparticles may be supported by a wafer-like substrate structure (eg, silicon, SiO ₂ , Si ₃ N ₄ , PET and counter electrode material, etc., or any mixture thereof). In the specification of the patent application incorporated in the present description, preparation examples and operation examples for such an apparatus are described. Disassembly of the probes 60 and 61 (which may result in detachment of the remaining ligand moiety 62 ') may result in electrical, mechanical and / or nanoparticle device detection by an appropriate circuit (not shown). At least one change in the electrochemical environment is brought about, such as a change in the capacitance of the nanoparticles relative to the counter electrode and a change in the transistor properties under the influence of the gate electrode.

後続の酵素除去による増幅
図６Ａ〜図６Ｃは、共通の観点を有する多数の別の方法に含まれる本発明による観点を有する１つの例示的な方法と装置の実施態様を示す。この実施態様によれば、被検体に応答する指数関数的な増幅がもたらされた後、分析媒体からエキソヌクレアーゼが除去される。図示する方法と装置は、図２Ａ〜図２Ｈ及び図５Ａ〜図５Ｅに示す方法と装置と比較した場合、多くの共通の観点を有し、多くの共通の参照番号を伴う。 Amplification by Subsequent Enzyme Removal FIGS. 6A-6C illustrate one exemplary method and apparatus embodiment having aspects according to the present invention that are included in a number of alternative methods having a common aspect. According to this embodiment, the exonuclease is removed from the analysis medium after providing an exponential amplification in response to the analyte. The illustrated method and apparatus have many common aspects and are accompanied by many common reference numbers when compared to the method and apparatus shown in FIGS. 2A-2H and 5A-5E.

エキソヌクレアーゼ増幅
図６Ａは、標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む標的被検体ポリヌクレオチド５０を含有する試料媒体を示す。試料は、一般的には図５Ａ〜図５Ｄに示す過程と同一又は類似するようにして処理することにより、ハイブリッド形成と酵素活性に対して適当な条件下において、被検体５０をＡアンプリファイア５１、Ｂアンプリファイア５４及びエキソヌクレアーゼ３７と反応させ、これによって複数の合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６を緩衝液媒体中へ放出させてもよい。 Exonuclease amplification FIG. 6A shows a sample medium containing a target analyte polynucleotide 50 comprising a target sequence A (target A) and a target sequence B (target B). The sample is generally processed in the same or similar manner as shown in FIGS. 5A to 5D so that the analyte 50 is subjected to the A amplifier 51 under conditions suitable for hybridization and enzyme activity. , React with B amplifier 54 and exonuclease 37, thereby releasing multiple synthetic A targets 53 and synthetic B targets 56 into the buffer medium.

本発明の観点を有するこの別の実施態様においては、エキソヌクレアーゼによって仲介される増幅をおこなうことによって、１又は複数の変性Ａプローブ８１及び／又は８２並びに１又は複数の変性Ｂプローブ８３及び／又は８４を接触させる。これらの変性プローブは保護性３’尾を有しており、該尾は非突出性３’末端（例えば、平滑状又は陥凹状の３’末端）を脱離させることによって、エキソヌクレアーゼ３７の３’二重特異的活性による分解を防止する。このようにして、図５Ｅに示す反応は防止される。図示する実施例においては、過剰のアンプリファイアは、過剰の合成Ａ標的とＢ標的による変性プローブ８１〜８４の飽和を可能にする。   In this alternative embodiment having aspects of the present invention, one or more denatured A probes 81 and / or 82 and one or more denatured B probes 83 and / or by performing exonuclease mediated amplification. 84 is brought into contact. These denatured probes have a protective 3 'tail that removes the non-protruding 3' end (eg, a blunt or recessed 3 'end), thereby removing the 3 of exonuclease 37. 'Prevent degradation due to bispecific activity. In this way, the reaction shown in FIG. 5E is prevented. In the illustrated embodiment, excess amplifier allows saturation of denatured probes 81-84 with excess synthetic A and B targets.

第１の別の態様においては、変性Ａプローブ８１及び変性Ｂプローブ８３は、結合した合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の隣接部分に対してそれぞれ非相補的な保護性３’尾を有しているので、プローブ／標的ハイブリッド複合体においては、保護性尾は単一鎖３’末端部分を有する。第２の別の態様においては、変性Ａプローブ８２及び変性Ｂプローブ８４は、結合した合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の隣接部分に対してそれぞれ相補的な保護性３’尾を有しているので、プローブ／標的ハイブリッド複合体においては、保護性尾は二重鎖３’末端部分を有し、該３’末端部分は各々の合成標的オリゴヌクレオチドの隣接５’末端を超えて突出する（付着３’末端）。   In a first alternative embodiment, the modified A probe 81 and the modified B probe 83 each have a protective 3 ′ tail that is non-complementary to adjacent portions of the bound synthetic A target and synthetic B target, respectively. Thus, in the probe / target hybrid complex, the protective tail has a single-stranded 3 ′ end portion. In a second alternative embodiment, denatured A probe 82 and denatured B probe 84 have protective 3 ′ tails that are complementary to adjacent portions of the bound synthetic A target and synthetic B target, respectively. In the probe / target hybrid complex, the protective tail has a double stranded 3 ′ end portion that protrudes beyond the adjacent 5 ′ end of each synthetic target oligonucleotide (attachment 3). 'End).

精製
図６Ｂは図６Ａの要素を示す。この場合、プローブ／標的複合体が形成された後、すすぎ及び／洗浄過程がおこなわれ（例えば、交換用緩衝液を用いて、基体に結合したプローブ／標的複合体からエキソヌクレアーゼ緩衝液をすすぎ流す）、エキソヌクレアーゼ３７を含む過剰の試薬物質は媒体から除去される。交換された媒体は、図１Ｇに示す過程の場合のように、検出操作のために最適化させてもよい（この場合、酵素活性のために適するようにする必要はない）。 Purification FIG. 6B shows the elements of FIG. 6A. In this case, after the probe / target complex is formed, a rinsing and / or washing process is performed (eg, rinsing the exonuclease buffer from the probe / target complex bound to the substrate using a replacement buffer). ), Excess reagent material including exonuclease 37 is removed from the medium. The exchanged medium may be optimized for the detection operation, as in the case of the process shown in FIG. 1G (in this case it is not necessary to be suitable for the enzyme activity).

プローブの変性
図６Ｃは図６Ｂのプローブ／標的要素及び基体７１を示す。この場合、例えば、熱、電場又は緊縮調節等を利用して変性過程を行うことによってプローブ／標的複合体を変性させ、これによってレポーター分子３５及び／又は合成標的分子５３及び５６を放出させる。緊縮調節とオリゴヌクレオチド配列の設計に応じて、該変性過程を全体的又は選択的に行ってもよいことに留意すべきである。従って、検出器は、レポーター３５、標的５３、標的５６又はこれらの混合物を検出するように最適化させてもよい（別のプローブにおいては、所望によりレポーター３５を省略してもよい）。 Probe Modification FIG. 6C shows the probe / target element and substrate 71 of FIG. 6B. In this case, for example, the probe / target complex is denatured by performing a denaturation process using heat, electric field, stringency regulation or the like, thereby releasing the reporter molecule 35 and / or the synthetic target molecules 53 and 56. It should be noted that the denaturation process may be performed globally or selectively depending on stringency regulation and the design of the oligonucleotide sequence. Thus, the detector may be optimized to detect reporter 35, target 53, target 56 or mixtures thereof (in other probes, reporter 35 may be omitted if desired).

１又は複数のプローブの骨格種８１’、８２’、８３’及び／又は８４’は基体７１に結合した状態にあってもよい（図示する実施例においては、該骨格種は単一鎖オリゴヌクレオチドである）。図５Ｅに示す実施例の場合のように、基体７１は、本願明細書に記載のようなナノ電子的検出器であって、変性状態を直接的に検出するように設計されたナノ電子的検出器を含んでいてもよい（直接的な基体装置の検出）。例えば、直接的な基体装置の検出には、プリスチンプローブ８１〜８４を含む変性現象（試料中には被検体５０は存在しない）（例えば、変性前、変性中及び変性後の比較）及びプローブ／標的複合体を含む変性現象（被検体５０の存在に応答してもたらされる）との間の差異を検出することが含まれていてもよい。同様に、付加的な実施態様においては、このような直接的な基体装置の検出は、遠隔ナノ検出器（例えば、図１Ｈに記載のような）と組み合わせて行ってもよい。   One or more probe backbone species 81 ′, 82 ′, 83 ′ and / or 84 ′ may be attached to the substrate 71 (in the illustrated embodiment, the backbone species is a single-stranded oligonucleotide. Is). As in the embodiment shown in FIG. 5E, the substrate 71 is a nanoelectronic detector as described herein, which is designed to detect a denatured state directly. Can also be included (direct substrate device detection). For example, for direct detection of the substrate apparatus, a denaturation phenomenon (the analyte 50 is not present in the sample) including the pristine probes 81 to 84 (for example, comparison before, during and after denaturation) and probes Detecting a difference between a denaturation phenomenon involving the / target complex (resulting in response to the presence of the analyte 50). Similarly, in additional embodiments, such direct substrate device detection may be performed in combination with a remote nanodetector (eg, as described in FIG. 1H).

内部ヌクレアーゼ耐性ブロック基を有するレポータープローブ
図７Ａ〜図７Ｆは、本発明の観点を有するレポータープローブであって、ブロック基の配列位置におけるエキソヌクレアーゼのプロセシングを停止させる内部ブロック基を含むレポータープローブの実施例を示す。この種のブロック基は当該分野においては既知であって、例えば、天然核酸が共有結合した種の類似体を含んでいてもよい。 Reporter probe view 7A~-7F with an internal nuclease resistant blocking group is a reporter probe having aspects of the present invention, exemplary reporter probe comprising an internal block group to stop the processing of exonuclease in the sequence position of the block group An example is shown. Such blocking groups are known in the art and may include, for example, analogs of a species to which a natural nucleic acid is covalently linked.

ハイブリッド形成プローブ
図７Ａは、プローブ９０が被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ａとハイブリッド形成して被検体／プローブ複合体を生成するように、該プローブ９０を用いて処理した被検体ポリヌクレオチド５０を示す。プローブ９０は、連鎖レポーターオリゴヌクレオチド９１及びコンパニオンオリゴヌクレオチド９２を含む。 Hybridization Probe FIG. 7A shows an analyte polynucleotide 50 treated with the probe 90 such that the probe 90 hybridizes with the target sequence A of the analyte polynucleotide 50 to produce an analyte / probe complex. Show. Probe 90 includes a linked reporter oligonucleotide 91 and a companion oligonucleotide 92.

連鎖レポーターオリゴヌクレオチド９１は、被検体５０の標的Ａの少なくとも一部に対して相補的な近位捕獲配列部分９４、及びコンパニオンオリゴヌクレオチド９２の少なくとも一部に対して相補的な遠位レポーター配列部分９５を含む。捕獲配列９４及びレポーター配列９５は、介在する耐性連結基９３によって連結される。この実施例における「近位」と「遠位」という用語は、３’末端を近位とし、５’末端を遠位とするように任意的に使用するものであり、「鏡像」オリゴヌクレオチド構造においては、３’対５’の意味は逆転する。   Linked reporter oligonucleotide 91 includes a proximal capture sequence portion 94 complementary to at least a portion of target A of analyte 50 and a distal reporter sequence portion complementary to at least a portion of companion oligonucleotide 92 95 is included. Capture sequence 94 and reporter sequence 95 are linked by an intervening resistant linking group 93. The terms “proximal” and “distal” in this example are optionally used to refer to the 3 ′ end as proximal and the 5 ′ end as distal, and the “mirror image” oligonucleotide structure. In, the meaning of 3 'vs. 5' is reversed.

コンパニオンオリゴヌクレオチド９２は、レポーター配列９５の少なくとも一部に対して相補的な近位アンカー配列９６、及び被検体５０の少なくとも一部に対して相補的な遠位捕獲配列９７を含む。   Companion oligonucleotide 92 includes a proximal anchor sequence 96 that is complementary to at least a portion of reporter sequence 95 and a distal capture sequence 97 that is complementary to at least a portion of subject 50.

特定の実施態様においては、連鎖レポーター９１とコンパニオン９２のハイブリッド複合体を含む集合プローブ９０は、例えば試薬溶液中へ導入し、被検体５０を含む試料と反応させてもよい。別の実施態様においては、単一鎖状の連鎖レポーター９１及び単一鎖状コンパニオン９２を供給して被検体５０と接触させてその場で被検体５０と相互にハイブリッド形成させることによって、図７Ａに示すように、被検体／プローブ複合体が生成する。   In a specific embodiment, the assembly probe 90 including the hybrid complex of the chain reporter 91 and the companion 92 may be introduced into, for example, a reagent solution and reacted with a sample including the analyte 50. In another embodiment, a single chain linkage reporter 91 and a single chain companion 92 are provided and brought into contact with the analyte 50 and hybridized to the analyte 50 in-situ in FIG. 7A. As shown, an analyte / probe complex is generated.

プローブの分解
図７Ｂは図７Ａの要素を示す。この場合、非突出状３’末端を有する二重ポリヌクレオチドを分解させる活性を有するエキソヌクレアーゼ３７が更に付加される。エキｓドヌクレアーゼは、捕獲配列９４を含む連鎖レポーター９１の近位部分へ結合して該近位部分分解を開始させる。 Probe Explosion FIG. 7B shows the elements of FIG. 7A. In this case, an exonuclease 37 having an activity of decomposing a double polynucleotide having a non-protruding 3 ′ end is further added. Exonuclease binds to the proximal portion of the linked reporter 91 containing the capture sequence 94 and initiates the proximal partial degradation.

図７Ｃは図７Ｂの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼは連鎖レポーター９１の分解を続行し、連鎖レポーター９１の耐性結合９３に近い部分を除去する。   FIG. 7C shows the elements of FIG. 7B. In this case, the exonuclease continues to degrade the chain reporter 91 and removes the portion of the chain reporter 91 close to the resistant bond 93.

レポーターの放出
図７Ｄは図７Ｃの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７は、耐性結合９３に達すると、プローブ／被検体複合体から離脱し、レポーター配列３５は該酵素の影響を受けない。レポーター配列９５は変性され、コンパニオン９２から離脱する。好ましくは、i）反応媒体の条件（温度、ｐＨ、及びイオン組成等）、及びii）レポーター配列３５とコンパニオンアンカー配列９６の対応する相補的部分の長さとヌクレオチド組成の一方又は両方は、残存するレポーター配列９５が、オリゴヌクレオチド９１の近位部分が分解したときに二重形態として一般的に不安定になるように選択してもよい。あるいは、酵素分解後の反応媒体の条件を調整することによって、二重のレポーター９５の変性を促進してもよい。 Reporter Release FIG. 7D shows the elements of FIG. 7C. In this case, when the exonuclease 37 reaches the resistance binding 93, it is detached from the probe / analyte complex, and the reporter sequence 35 is not affected by the enzyme. The reporter sequence 95 is denatured and leaves the companion 92. Preferably, i) the reaction medium conditions (temperature, pH, ionic composition, etc.), and ii) the length of the corresponding complementary portion of reporter sequence 35 and companion anchor sequence 96 and / or nucleotide composition remain. Reporter sequence 95 may be selected such that it is generally unstable as a dual form when the proximal portion of oligonucleotide 91 is degraded. Alternatively, the denaturation of the double reporter 95 may be promoted by adjusting the conditions of the reaction medium after enzymatic degradation.

特定の実施態様においては、レポーター９５の脱離後、コンパニオン９２は被検体５０に結合した状態を保持するように設計される。別の実施態様においては、コンパニオン９２も変性されて被検体から脱離してもよい。いずれの場合においても、コンパニオン９２は、媒体中の付加的なプリスチンが結合したレポーターオリゴヌクレオチド９１と結合させることによって再循環させ、図７Ａに記載のようにして、付加的なプローブ／被検体複合体を形成させてもよい。   In certain embodiments, the companion 92 is designed to remain bound to the analyte 50 after the reporter 95 is desorbed. In another embodiment, the companion 92 may also be denatured and detached from the subject. In either case, the companion 92 is recycled by binding to the reporter oligonucleotide 91 to which additional pristine is bound in the medium, and the additional probe / analyte complex as described in FIG. 7A. A body may be formed.

精製
図７Ｅは、１又は複数の相補的な「サンドウィッチ型」プローブ７９を用いる所望による精製過程を示す。この場合、基体に結合した１又は複数のプローブオリゴヌクレオチドの各々は、例えば、図４Ｂに記載のように、レポーター配列９５に対して相補的な配列を有する。レポーター９５をプローブ７９へ結合させた後、基体３２のすすぎ／洗浄処理を行うことによって、変性によるレポーター９５の放出の際の試料媒体を非常に単純化させることができる。 Purification FIG. 7E shows an optional purification process using one or more complementary “sandwich” probes 79. In this case, each of the one or more probe oligonucleotides bound to the substrate has a sequence complementary to the reporter sequence 95, for example, as described in FIG. 4B. By binding the reporter 95 to the probe 79 and then rinsing / washing the substrate 32, the sample medium upon release of the reporter 95 by denaturation can be greatly simplified.

検出
図７Ｆは、図１Ｇ〜図１Ｈに関連して記載したような本願発明の観点を有するナノ電子的センサー４２によってレポーター９５を検出する態様を示す。前述のように、本発明による観点を有するレポーターは、常套の光学的方法を含む種々の別の検出手段によって検出してもよい。検出器４２は１又は複数の結合された検出プローブ９８を有しており、該プローブは相補的配列を介してレポーター９５とハイブリッド形成し、これによってセンサーの特性に関して検出可能な変化がもたらされる。例えば、図７Ｅに示す所望による精製過程によるエキソヌクレアーゼ３７の除去又は失活によって、プローブ／レポーター複合体の形態に関連する制約、即ち、センサーに関して遠位の非突出状３’末端が分解されないという制約を排除することができる（センサー４２による迅速な検出によってもこの制約を排除することができる）。あるいは、プローブ９８が、図示するように、遠位の突出状３’末端を有するように設計してもよい。他の検出プローブ９９は遠位の５’末端を有する。図示する実施例においては、耐性結合９３はレポーター９５の３’末端上又は該末端に隣接する位置に存在するので、二重のプローブ／レポーター複合体におけるエンドヌクレアーゼ活性に対して耐性がもたらされる。 Detection FIG. 7F shows an embodiment in which a reporter 95 is detected by a nanoelectronic sensor 42 having aspects of the invention as described in connection with FIGS. 1G-1H. As mentioned above, reporters having aspects according to the present invention may be detected by a variety of other detection means, including conventional optical methods. The detector 42 has one or more coupled detection probes 98 that hybridize with the reporter 95 via a complementary sequence, which results in a detectable change in sensor properties. For example, removal or inactivation of exonuclease 37 by the optional purification process shown in FIG. 7E does not degrade the constraints associated with the morphology of the probe / reporter complex, ie, the distal non-protruding 3 ′ end with respect to the sensor. The restriction can be eliminated (the rapid detection by the sensor 42 can also eliminate this restriction). Alternatively, the probe 98 may be designed to have a distal protruding 3 ′ end, as shown. The other detection probe 99 has a distal 5 ′ end. In the illustrated example, resistance bond 93 is present on or adjacent to the 3 ′ end of reporter 95, thus providing resistance to endonuclease activity in the dual probe / reporter complex.

多重レポーターとマトリックス検出セルを用いる多被検体アッセイ
図８Ａと図８Ｂは、多重レポーターとマトリックス検出セルを用いる多被検体アッセイを含む本発明の観点を有する例示的な方法と装置の実施態様を示す。この方法には、複数のプローブを供給することが含まれる。該プローブは、複数の異なる被検体に対応する検出種（例えば、レポーター等）を増幅して供給するように設計される。 Multi-Analyte Assays Using Multiple Reporters and Matrix Detection Cells FIGS. 8A and 8B illustrate exemplary method and apparatus embodiments having aspects of the invention that include multiple analyte assays using multiple reporters and matrix detection cells. . The method includes providing a plurality of probes. The probe is designed to amplify and supply detection species (eg, reporters etc.) corresponding to a plurality of different analytes.

図８Ａは、多重レポータープローブ及び所望による精製過程と多重アンプリファイアを利用する多被検体アッセイを示すフローチャートである。この実施例においては、レポータープローブ及び想定される被検体１、２、３及び４にそれぞれ対応するアンプリファイアを含有する試薬混合物が配合される。被検体２及び４のみを含有する試料媒体を、ハイブリッド形成と酵素活性を促進するために有効な条件下において、該試薬混合物とエキソヌクレアーゼ３７と接触させる。前述のようにして増幅とレポーターの放出が行われた後、被検体１と２に対応するレポーター及び合成標的が放出される。被検体１と３に対応するアンプリファイア及びレポータープローブは未反応状態に保持される。レポータープローブとアンプリファイア及びすすぎ又は精製過程は本願明細書に記載のいずれかの実施態様（例えば、図１〜図７に記載の実施態様）又は本願発明の技術的思想を逸脱することのないいずれかの類似の実施態様であってもよいことに留意すべきである。   FIG. 8A is a flow chart showing a multi-analyte assay utilizing multiple reporter probes and optional purification processes and multiple amplifiers. In this example, a reagent mixture containing a reporter probe and an amplifier corresponding to each of the assumed analytes 1, 2, 3 and 4 is formulated. A sample medium containing only analytes 2 and 4 is contacted with the reagent mixture and exonuclease 37 under conditions effective to promote hybridization and enzyme activity. After amplification and reporter release as described above, the reporter and synthetic target corresponding to the analytes 1 and 2 are released. The amplifier and reporter probe corresponding to the analytes 1 and 3 are held in an unreacted state. The reporter probe and the amplifier and the rinsing or purification process may be any of the embodiments described herein (for example, the embodiment described in FIGS. 1 to 7) or any of those that do not depart from the technical idea of the present invention. It should be noted that similar embodiments may be used.

図８Ｂは、包囲壁１０１、１又は複数の出入口１０２及びセンサーのマトリックスを具備する検出セル１００を示す。各センサーは、異なる被検体であるレポーター分子に対応する異なる検出感度を有する。図８Ｂにおいては、４つのセンサー４２ａ、４２ｂ、４２ｃ及び４２ｄが図示されている。これらのセンサーには、本願明細書に記載のいずれかのセンサー及び本願明細書に組み入れられる特許出願の明細書に記載のいずれかのセンサーを含んでいてもよいことに留意すべきである。この実施例においては、各センサー４２は基体（例えば、誘電層１０７を有する共通の基体１０６、例えば、シリコンウェファー、ＳｉＯ_２表面層又はポリマーシート等）、基体に隣接して配置されたナノ構造素子１０４（この実施例においては、相互に連絡されたＣＮＴネットワークである）、及び該ナノ構造素子１０４と電気的に接続する少なくとも１つの接点（この実施例においては、相互に組み合わされたソース／ドレイン電極対が図示されている）を具備する。トランジスターの実施例においては、分離したゲート電極を含めてもよく、あるいは、Ｓｉをドープしたウェファーのような基体材料をマトリックス用の共通のゲート電極として使用してもよい。各センサーにおけるナノ構造素子１０４は、アッセイの想定される被検体の１種に対して特異的な異なる認識材料（この実施例においては、被検体１、２、３及び４のそれぞれに対応するレポーターオリゴヌクレオチドから選択される１種に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブである）を用いて感作される。 FIG. 8B shows a detection cell 100 comprising a surrounding wall 101, one or more ports 102 and a matrix of sensors. Each sensor has a different detection sensitivity corresponding to a different analyte reporter molecule. In FIG. 8B, four sensors 42a, 42b, 42c and 42d are shown. It should be noted that these sensors may include any of the sensors described herein and any of the sensors described in the specifications of patent applications incorporated herein. In this embodiment, each sensor 42 is a substrate (eg, a common substrate 106 having a dielectric layer 107, such as a silicon wafer, a SiO ₂ surface layer or a polymer sheet), a nanostructured element disposed adjacent to the substrate. 104 (in this embodiment, an interconnected CNT network) and at least one contact (in this embodiment, a source / drain combined with each other) that electrically connects with the nanostructured element 104 Electrode pairs are shown). In transistor embodiments, a separate gate electrode may be included, or a substrate material such as a Si-doped wafer may be used as a common gate electrode for the matrix. The nanostructure element 104 in each sensor is a different recognition material specific to one of the analytes envisioned for the assay (in this example, a reporter corresponding to each of the analytes 1, 2, 3 and 4). Is an oligonucleotide probe complementary to one selected from oligonucleotides).

検出溶液１０３（この実施例の場合には、図８Ａに示す反応混合物から誘導される精製されたレポーター溶液である）をセル１００に含まれるセンサー４２と接触させる。適当な測定回路（図示せず）によって、対応するレポーターとのハイブリッド形成が発生するセンサー４２ａ〜４２ｄの性質の変化が測定される   The detection solution 103 (in this example, a purified reporter solution derived from the reaction mixture shown in FIG. 8A) is brought into contact with the sensor 42 contained in the cell 100. Appropriate measurement circuitry (not shown) measures changes in the nature of the sensors 42a-42d that cause hybridization with the corresponding reporter.

図示する態様のマトリックスセル１００においては、センサー４２は異なるレポーター分子を検出するように設計されているが、本願発明の技術的思想を逸脱することなく、その他の態様を採用することも可能であることに留意すべきである。例えば、センサーは、合成標的又は被検体の分子に対して感度を示すプローブを含んでいてもよい。   In the illustrated matrix cell 100, the sensor 42 is designed to detect different reporter molecules, but other embodiments can be adopted without departing from the technical idea of the present invention. It should be noted. For example, the sensor may include a probe that is sensitive to a synthetic target or analyte molecule.

アプタマー／レポーター複合体
図９Ａ〜図９Ｃは、本発明の観点を有する１つの例示的な方法であって、生体分子を含む被検体を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を示す。アプタマー／塩基配列複合体は、アプタマー１１２が被検体１１１と結合したときに正角的変化（conformal change）がもたらされるように選択される。図示する実施例においては、アプタマー／レポーター複合体は、例えば、前述のような方法によってビーズ等の基体上へ固定化される。図９Ｂに示すように、プローブ集合体１１０は、塩基配列１１４へ結合された二重形態のレポーター１１３を含む。プローブ１１０は、一般的には本願明細書に記載のいずれかの実施例に示すものと類似する。図示する実施例においては、プローブ１１０は、一般的には図７Ａ〜図７Ｆに示すものと類似し、塩基配列１１４は被検体５０の場合と同様に作用する。塩基配列は、標的被検体１１１に対して特異的な結合能を示すアプタマー配列１１２と接続される。本発明の観点を有する実施態様においては、被検体は、アプタマー又は類似のポリヌクレオチド構造体（例えば、球状タンパク質及び多糖等）に対して特異的な親和性又は反応性を示す多数の物質から選択されるいずれの物質であってもよい。 Aptamer / Reporter Complex FIGS. 9A-9C illustrate one exemplary method having aspects of the present invention, showing a probe assembly that includes an aptamer moiety for detecting an analyte that includes a biomolecule. The aptamer / base sequence complex is selected such that a conformal change is brought about when the aptamer 112 binds to the analyte 111. In the illustrated embodiment, the aptamer / reporter complex is immobilized on a substrate such as a bead, for example, by the method described above. As shown in FIG. 9B, the probe assembly 110 includes a dual form of the reporter 113 bound to the base sequence 114. The probe 110 is generally similar to that shown in any of the embodiments described herein. In the illustrated embodiment, the probe 110 is generally similar to that shown in FIGS. 7A to 7F, and the base sequence 114 acts in the same manner as in the subject 50. The base sequence is connected to an aptamer sequence 112 that exhibits specific binding ability to the target analyte 111. In embodiments having aspects of the invention, the analyte is selected from a number of substances that exhibit specific affinity or reactivity for aptamers or similar polynucleotide structures (eg, globular proteins and polysaccharides). Any substance may be used.

プローブの保護に適合したアプタマー
図９Ａに示すように、アプタマー１１２が被検体１１１と結合しないときには、エンドヌクレアーゼ３７がプローブ１１０を実質上分解させないように該プローブの立体配座は保護される。 Aptamer adapted for probe protection As shown in FIG. 9A, when the aptamer 112 does not bind to the analyte 111 , the conformation of the probe is protected so that the endonuclease 37 does not substantially degrade the probe 110.

アプタマーの被検体への結合とプローブの暴露
図９Ｂに示すように、アプタマー１１２が被検体１１１に結合すると、結合体の立体配座はプローブ１１０をエンドヌクレアーゼ３７へ暴露させるので、該プローブ１１０はエンドヌクレアーゼ３７によって攻撃される。 Aptamer Binding to Analyte and Probe Exposure As shown in FIG. 9B, when aptamer 112 binds to analyte 111, the conformation of the conjugate exposes probe 110 to endonuclease 37, so that probe 110 Attacked by endonuclease 37.

プローブの分解とレポーターの放出
図９Ｃに示すように、酵素３７によってプローブ１１０が分解された後、レポーターが放出されるので、該レポーターは、図１〜図８に示す実施態様に関連して記載した方法によって検出してもよい。 Probe degradation and reporter release As shown in FIG. 9C, the reporter is released after the probe 110 has been degraded by enzyme 37, so that the reporter is described in connection with the embodiment shown in FIGS. You may detect by the method which carried out.

ポリヌクレオチドの検出用ナノ電子的センサー：実施例Ａ〜Ｉ
本発明の観点を有する付加的な実施態様は、共同で発明された米国特許出願第１１／３１８３５４号（出願日：２００５年１２月２３日）の明細書（ＷＯ２００６−０７１８９５参照）及び米国特許出願第１１／２１２０２６号（出願日：２００５年８月２４日）の明細書（ＷＯ２００６−０２４０２３参照）に開示されている実施例Ａ〜Ｉに記載されており、これらの明細書も本願明細書の一部を成すものである。 Nanoelectronic sensors for detection of polynucleotides: Examples AI
Additional embodiments having aspects of the present invention are described in co-invented US patent application Ser. No. 11 / 318,354 (filed on Dec. 23, 2005) (see WO 2006-071895) and US patent application. It is described in Examples A to I disclosed in the specification (see WO2006-024023) of No. 11/12026 (filed date: Aug. 24, 2005), and these specifications are also described in this specification. It is part of it.

多段階的アンプリファイア [指数法則（power-law）増幅]
図１０〜図１３は、本発明の観点を有する実施態様であって、図２及び図３に関連して先に説明した実施態様の場合と多くの関連性と操作手順の点で類似する方法に従って、被検体に応答して酵素で仲介される増幅をもたらす実施態様を示す。この場合、アンプリファイア試薬種の多段階的シリーズが使用される。 Multi-stage amplifier [power-law amplification]
FIGS. 10-13 are embodiments having aspects of the present invention that are similar in many respects and operating procedures to the embodiment described above in connection with FIGS. FIG. 4 illustrates an embodiment that results in enzyme-mediated amplification in response to a subject. In this case, a multi-stage series of amplifier reagent species is used.

図１０〜図１３に示す実施態様においては、初期段階のアンプリファイアの被検体に応答する酵素反応による生成物は、第２段階のアンプリファイアの増幅用基体を形成し、その後の酵素反応において第２増幅生成物がもたらされる。付加的な段階を含めてもよい。   In the embodiment shown in FIGS. 10 to 13, the product of the enzyme reaction that responds to the analyte of the initial stage amplifier forms the amplification base of the second stage amplifier, and in the subsequent enzymatic reaction, Two amplification products are produced. Additional steps may be included.

これらの実施例においては、予め選択された被検体の標的配列Ａを用いるハイブリッド形成を介して、増幅の初期段階のみが被検体の存在によって直接的に誘発される。その後の段階のアンプリファイアは増幅生成物によって誘発される。増幅生成物（誘導鎖又はレポーターフラグメント）の蓄積は、逐次的なアンプリファイア段階の数（ｎ＝２、３、......）に基づく指数法則の関係式に従う。   In these examples, only the initial stage of amplification is directly induced by the presence of the analyte via hybridization using the target sequence A of the preselected analyte. Subsequent amplifiers are triggered by the amplification product. The accumulation of amplification product (guide strand or reporter fragment) follows an exponential law relation based on the number of successive amplifier stages (n = 2, 3,...).

このような多段階的増幅スキームを採用する検出装置を用いてこの種の増幅生成物（レポーター）の一部又は全部を検出することによって、試料中の生体分子被検体の存在又は濃度の測定が可能となる。このような検出においては、本願明細書に記載のいずれかのナノ電子的装置を使用してもよい。   By detecting a part or all of this kind of amplification product (reporter) using a detection apparatus employing such a multi-step amplification scheme, the presence or concentration of a biomolecule analyte in a sample can be measured. It becomes possible. For such detection, any nanoelectronic device described herein may be used.

本発明の観点を例証するために、図１０〜図１３に示す実施例においては、オリゴヌクレオチド複合体と酵素は、３’−エキソヌクレアーゼによる分解が、１つの鎖上に非突出状３’末端を有する二重ＤＮＡ上において選択的に開始されるように設計され、該分解は、非突出状鎖に沿って３’から５’の方向へ進行する。しかしながら、図２及び図３に関連して先に説明した実施例の場合のように、本発明による技術的思想を逸脱することなく、その他の立体配置を採用することも可能であり、また、その他の酵素（例えば、５’エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ等）を使用し、これに応じてアンプリファイア試薬種を設計してもよい。   To illustrate aspects of the present invention, in the examples shown in FIGS. 10-13, the oligonucleotide complex and enzyme are degraded by 3′-exonuclease but are non-protruding 3 ′ ends on one strand. Is designed to be initiated selectively on double DNAs with the progression of 3 ′ to 5 ′ along non-protruding strands. However, other three-dimensional configurations can be adopted without departing from the technical idea of the present invention, as in the case of the embodiment described above with reference to FIGS. Other enzymes (for example, 5 ′ exonuclease and DNA polymerase) may be used and the amplifier reagent species may be designed accordingly.

２段階増幅
例えば、図１０及び図１１は２段階法（ｎ＝２）の実施態様を示す。別の実施態様の場合のように、被検体に応答して最初に行われる酵素仲介反応によって、合成標的（即ち、試料中に存在せず、予め調製されて選択された天然の又は合成されたオリゴヌクレオチド）が放出される。該合成標的は、別の合成鎖又はフラグメントの放出をもたらす付加的な酵素仲介反応に関与する。合成オリゴヌクレオチドは、試料中に被検体ポリヌクレオチドが不存在のときのエキソヌクレアーゼ活性から保護されるように設計された二重形態で供給される。 Two-stage amplification For example, FIGS. 10 and 11 show an embodiment of a two-stage method (n = 2). As in another embodiment, a synthetic target (ie, a natural or synthesized, pre-prepared and selected, not present in the sample, by an enzyme-mediated reaction that is initially performed in response to the analyte. Oligonucleotide) is released. The synthetic target is responsible for additional enzyme-mediated reactions that result in the release of another synthetic strand or fragment. Synthetic oligonucleotides are supplied in a duplex form designed to be protected from exonuclease activity in the absence of analyte polynucleotide in the sample.

初期条件
図１０に示す実施例における第１の図（図１０ａ）は、試料測定の初期状態を示す。この初期状態には下記の要件ａ）〜ｄ）を伴う：
ａ）予め選択された配列Ａを有する被検体ポリヌクレオチド鎖１２０は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が行われるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイアＩを含む試薬／緩衝液へ暴露される。
ｂ）アンプリファイアＩは、捕獲鎖１２１とコンパニオン鎖１２２を含む二重構造を含む。
ｃ）捕獲鎖１２１は、捕獲配列Ａ’（標的Ａの一部又は全部に対して相補的な配列）及び２つの付加的な配列Ｂ’とＣ’を３’から５’の順位で含む。
ｄ）コンパニオン鎖１２２は２つのコンパニオン配列ＣとＢを３’から５’の順序で含む。該配列Ｃ及びＢはそれぞれ捕獲鎖１２１のコンパニオン配列Ｃ’及びＢ’の一部又は全部に対して相補的であって該一部又は全部とハイブリッド形成し、暴露された鎖１２１の捕獲配列Ａ’は残存する。 Initial Conditions A first diagram (FIG. 10a) in the embodiment shown in FIG. 10 shows an initial state of sample measurement. This initial state is accompanied by the following requirements a) to d):
a) A subject polynucleotide strand 120 having a preselected sequence A is exposed to a reagent / buffer containing at least amplifier I under conditions sufficient for polynucleotide hybridization to occur.
b) The amplifier I includes a double structure including a capture strand 121 and a companion strand 122.
c) The capture strand 121 includes a capture sequence A ′ (a sequence complementary to part or all of the target A) and two additional sequences B ′ and C ′ in the order of 3 ′ to 5 ′.
d) Companion strand 122 contains two companion sequences C and B in 3 ′ to 5 ′ order. The sequences C and B are complementary to part or all of the companion sequences C ′ and B ′ of the capture strand 121 and hybridize with part or all of the capture strand A, respectively. 'Remains.

段階１
図１０ｂにおいては、アンプリファイアＩは、鎖１２１の捕獲配列Ａ’と被検体鎖１２０の標的配列Ａとのハイブリッド形成による被検体鎖１２０との二重会合状態で示される。エキソヌクレアーゼ種は必要ないずれかの補因子と共に試薬中へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲配列１２１の３’末端における分解を開始させる。 Stage 1
In FIG. 10 b, amplifier I is shown in a double association state with analyte strand 120 due to hybridization of capture sequence A ′ of strand 121 and target sequence A of analyte strand 120. The exonuclease species initiates degradation at the 3 'end of the capture sequence 121 by adding it to the reagent along with any required cofactors or by being present in the reagent.

図１０ｃにおいては、段階１の酵素分解が完結した状態が示されており、未分解の被検体鎖１２０（原鎖）とコンパニオン鎖１２２（コンパニオンＩ又はＢＣ）は溶液中へ放出される。この時点（段階１の終了時点）においては、１つの原鎖と１つの誘導鎖（例えば、レポーター等）が溶液中に存在する。   In FIG. 10c, the state in which the enzymatic degradation in stage 1 has been completed is shown, and the undegraded analyte strand 120 (primary strand) and companion strand 122 (companion I or BC) are released into the solution. At this point (end of step 1), one primary strand and one derivative strand (eg, reporter etc.) are present in the solution.

段階２
図１０ｄは当該方法の段階２の開始状態を示す。この場合、段階１の生成物（鎖１２０及び鎖１２２）は、試薬／緩衝液媒体中において、付加的なアンプリファイアＩとアンプリファイアII に暴露される。この段階には下記の要件ａ）〜ｃ）が伴う：
ａ）アンプリファイアII は、捕獲鎖１２３とコンパニオン鎖１２２を含む二重構造を含む。
ｂ）捕獲鎖１２３は、捕獲配列Ｃ''（コンパニオン鎖１２２の配列Ｃの一部又は全部に対して相補的な配列）及び付加的な配列Ｂ''を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２４はコンパニオン配列Ｂ'''を含む。該配列は捕獲鎖１２３のコンパニオン配列Ｂ''の一部又は全部に対して相補的であって該一部又は全部とハイブリッド形成し、暴露された鎖１２３の捕獲配列Ｃ''は残存する。 Stage 2
FIG. 10d shows the starting state of stage 2 of the method. In this case, the product of stage 1 (strand 120 and 122) is exposed to additional amplifier I and amplifier II in the reagent / buffer medium. This stage is accompanied by the following requirements a) to c):
a) Amplifier II includes a double structure including a capture strand 123 and a companion strand 122.
b) The capture strand 123 includes a capture sequence C ″ (a sequence complementary to part or all of the sequence C of the companion strand 122) and an additional sequence B ″ in the order of 3 ′ to 5 ′. .
c) The companion strand 124 includes a companion sequence B ′ ″. The sequence is complementary to part or all of the companion sequence B ″ of the capture strand 123 and hybridizes with part or all of it, leaving the exposed capture sequence C ″ of the strand 123.

図１０ｅにおいては、アンプリファイアII は、鎖１２３の捕獲配列Ｃ''とコンパニオン鎖１２２の配列Ｃとのハイブリッド形成によるコンパニオン鎖１２２との二重会合状態で示される。エキソヌクレアーゼ種は必要ないずれかの補因子と共に試薬中へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲配列１２３の３’末端における分解を開始させる。同時に、付加的なアンプリファイアＩは、段階１に関して記載したように、被検体鎖１２０との二重会合状態で示される。   In FIG. 10 e, amplifier II is shown in a double association state with companion strand 122 by hybridization of capture sequence C ″ of strand 123 and sequence C of companion strand 122. The exonuclease species initiates degradation at the 3 'end of the capture sequence 123 by adding it to the reagent along with any required cofactors or by being present in the reagent. At the same time, additional amplifier I is shown in double association with analyte strand 120 as described with respect to stage 1.

図１０ｆにおいては、段階２の酵素分解が完結した状態が示されており、未分解の被検体鎖１２０（原鎖）、２つのコンパニオン鎖１２２（第１誘導鎖と第２誘導鎖）及びコンパニオン鎖１２４（コンパニオンII 又はＢ）は溶液中へ放出される。この時点（段階２の終了時点）においては、１つの原鎖と３つの誘導鎖（例えば、アンプリコン又はレポーター等）が溶液中に存在する。   In FIG. 10f, the state in which the enzymatic degradation in stage 2 has been completed is shown, and the undegraded analyte strand 120 (primary strand), two companion strands 122 (first and second derivative strands), and companion Chain 124 (Companion II or B) is released into the solution. At this point (end of step 2), one primary strand and three derived strands (eg, amplicon or reporter) are present in the solution.

付加的段階（相１及び相２）
図１０ｇは当該方法のその後の段階３の開始状態を示す。段階１の生成物（鎖１２０と鎖１２２）及び段階２の生成物（鎖１２４）は、試薬／緩衝液媒体中において、付加的なアンプリファイアＩ及びアンプリファイアII に暴露される。 Additional steps (Phase 1 and Phase 2)
FIG. 10g shows the starting state of the subsequent stage 3 of the method. Stage 1 products (strands 120 and 122) and stage 2 products (strands 124) are exposed to additional amplifier I and amplifier II in the reagent / buffer medium.

図１０ｈにおいては、アンプリファイアＩは、段階１の被検体鎖１２０との二重会合体として示されており、また、アンプリファイアII は、段階２のコンパニオン鎖１２０との二重会合体として示されている。エキソヌクレアーゼは、被検体の重複部位の捕獲鎖１２０及びコンパニオンＩの各々の重複部位の捕獲鎖１２３の分解を開始させる。   In FIG. 10 h, amplifier I is shown as a double association with stage 1 analyte strand 120, and amplifier II is shown as a double association with stage 2 companion strand 120. Has been. The exonuclease initiates the degradation of the capture strand 120 at the overlap site of the analyte and the capture strand 123 at each overlap site of companion I.

図１０ｉにおいては、酵素的分解は完結しており、また、未分解の被検体鎖１２０、３つのコンパニオン鎖１２２、及び３つのコンパニオン鎖１２４（１つは段階２から得られたものであり、２つは新たに誘導されたものである）は溶液中へ放出される。この時点（段階３の終了時点）においては、１つの原鎖と６つの誘導鎖（例えば、アンプリコン及びレポーター等）が溶液中に存在する。   In FIG. 10i, the enzymatic degradation is complete, and the undegraded analyte strand 120, three companion strands 122, and three companion strands 124 (one from step 2; Two are newly induced) are released into solution. At this point (end of step 3), one primary strand and six derivative strands (eg, amplicon and reporter) are present in the solution.

この方法の６つの相又は段階において得られた結果を以下の表３に示す。

The results obtained in the six phases or stages of the method are shown in Table 3 below.

図１１は、２段階増幅に関する表３の結果をプロットしたグラフを示す。   FIG. 11 shows a graph plotting the results of Table 3 for two-stage amplification.

３段階増幅
別の実施例に関する図１２Ａ〜図１２Ｃ及び図１３は、３段階法（ｎ＝３）の実施態様を示す。この実施態様は、多くの点で、図１１〜図１２に示す２段階の実施例の場合と類似する。簡便化のために、以下においては、各々の増幅段階の操作様式のみについて説明する。この実施態様の基礎となる原理と構成は、前述の関連する記載内容に基づけば明らかになる事項である。前述の実施例の場合のように、特定の前駆体標的及び十分な増幅試薬と酵素が存在する場合には、各段階は同時に進行させてもよいことに留意すべきである。 FIGS. 12A-12C and FIG. 13 for another embodiment with three-stage amplification show an embodiment of a three-stage method (n = 3). This embodiment is similar in many respects to the two-stage embodiment shown in FIGS. For the sake of simplicity, only the operation mode of each amplification stage will be described below. The principle and configuration underlying this embodiment is an obvious matter based on the above-mentioned related description. It should be noted that each step may proceed simultaneously if a specific precursor target and sufficient amplification reagents and enzymes are present, as in the previous examples.

段階１
図１２Ａは、アンプリファイア＃１の漸進的活性（progressive activity）を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃１は、捕獲鎖１２５とコンパニオン鎖１２６を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２５は、捕獲配列Ａ’（該配列は、標的Ａの全部又は一部に対して相補的である）及び３つの付加的配列Ｂ’、Ｃ’及びＤ’を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２６は、３つのコンパニオン配列Ｄ、Ｃ及びＢを３’から５’の順位で含むので、捕獲鎖１２５の捕獲配列Ａ’は暴露される。なお、これらの３つのコンパニオン配列Ｄ、Ｃ及びＢは、それぞれ捕獲鎖１２５のコンパニオン配列Ｄ’、Ｃ’及びＢ’の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）予め選択された配列Ａを有する被検体であるポリヌクレオチドの鎖１２０は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃１を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重被検体／アンプリファイア＃１複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２５の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解の被検体鎖１２０及びコンパニオン鎖１２６（コンパニオン＃１又はＢＣＤ）を溶液中へ放出させる。 Stage 1
FIG. 12A shows three parts connected by arrows indicating the progressive activity of amplifier # 1. This stage includes the following requirements a) to f):
a) Amplifier # 1 has a double structure including a capture strand 125 and a companion strand 126.
b) The capture strand 125 comprises a capture sequence A ′ (which is complementary to all or part of the target A) and three additional sequences B ′, C ′ and D ′ 3 ′ to 5 Include in order of '.
c) Since the companion strand 126 contains three companion sequences D, C and B in the order of 3 ′ to 5 ′, the capture sequence A ′ of the capture strand 125 is exposed. These three companion sequences D, C, and B are complementary to all or part of the companion sequences D ′, C ′, and B ′ of the capture strand 125, respectively, and are hybridized with all or part of them. Form.
d) Polynucleotide strand 120, which is the analyte having the preselected sequence A, is transferred to a reagent / buffer containing at least amplifier # 1 under conditions sufficient for polynucleotide hybridization to occur. Exposed and combined with this to produce a double analyte / amplifier # 1 complex.
e) Degradation at the 3 ′ end of the capture strand 125 is initiated by adding the exonuclease species to the reagent with any necessary cofactors or present in the reagent.
f) The undegraded analyte strand 120 and companion strand 126 (companion # 1 or BCD) are released into the solution by continuing until the enzymatic degradation reaction is complete.

段階２
図１２Ｂは、アンプリファイア＃２の漸進的活性を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃２は、捕獲鎖１２７とコンパニオン鎖１２８を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２７は、捕獲配列Ｃ''（該配列は、鎖１２６の配列Ｃの全部又は一部に対して相補的である）及び２つの付加的配列Ｄ''及びＢ''を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２８は、２つのコンパニオン配列Ｂ'''及びＤ'''を３’から５’の順位で含むので、捕獲鎖１２７の捕獲配列Ｃ''は暴露される。なお、これらの２つのコンパニオン配列Ｂ'''及びＤ'''は、それぞれ捕獲鎖１２７のコンパニオン配列Ｂ''及びＤ''の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）コンパニオン＃１（鎖１２６）は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃２を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重コンパニオン＃１／アンプリファイア＃２複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２７の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解のコンパニオン＃１（１２６）及びコンパニオン鎖１２８（コンパニオン＃２又はＢＤ）を溶液中へ放出させる。 Stage 2
FIG. 12B shows three parts connected by arrows indicating the progressive activity of amplifier # 2. This stage includes the following requirements a) to f):
a) Amplifier # 2 has a double structure including a capture strand 127 and a companion strand 128.
b) Capture strand 127 is composed of a capture sequence C ″ (which is complementary to all or part of sequence C of strand 126) and two additional sequences D ″ and B ″. Include in order of '5'.
c) Since the companion strand 128 contains two companion sequences B ′ ″ and D ′ ″ in the order of 3 ′ to 5 ′, the capture sequence C ″ of the capture strand 127 is exposed. These two companion sequences B ′ ″ and D ′ ″ are complementary to all or part of the companion sequences B ″ and D ″ of the capture strand 127, respectively. Hybridize with the part.
d) Companion # 1 (strand 126) is exposed to and combined with a reagent / buffer containing at least amplifier # 2 under conditions sufficient for polynucleotide hybridization to occur. Create a companion # 1 / amplifier # 2 complex.
e) Initiate degradation at the 3 ′ end of the capture strand 127 by adding the exonuclease species to the reagent with any necessary cofactors or present in the reagent.
f) Release undegraded companion # 1 (126) and companion chain 128 (companion # 2 or BD) into the solution by continuing until the enzymatic degradation reaction is complete.

段階３
図１２Ｃは、アンプリファイア＃３の漸進的活性を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃３は、捕獲鎖１２９とコンパニオン鎖１３０を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２９は、捕獲配列Ｄ^４（該配列は、鎖１２８の配列Ｃ'''の全部又は一部に対して相補的である）及び付加的配列Ｂ^４を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１３０は、コンパニオン配列Ｂ^５含むので、捕獲鎖１２９の捕獲配列Ｄ^４は暴露される。なお、該コンパニオン配列は、捕獲鎖１２９のコンパニオン配列Ｂ^４の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）コンパニオン＃２（鎖１２８）は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃３を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重コンパニオン＃２／アンプリファイア＃３複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２９の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解のコンパニオン＃２（１２６）及びコンパニオン鎖１３０（コンパニオン＃２又はＢ）を溶液中へ放出させる。 Stage 3
FIG. 12C shows three parts connected by arrows indicating the progressive activity of amplifier # 3. This stage includes the following requirements a) to f):
a) Amplifier # 3 has a double structure including capture strand 129 and companion strand 130.
b) Capture strand 129 comprises capture sequence D ⁴ (which is complementary to all or part of sequence C ′ ″ of strand 128) and additional sequence B ⁴ from 3 ′ to 5 ′. Include in rank.
c) Companion chain 130, because it includes companion sequence ^{B 5,} capture sequence ^{D 4} of capture strand 129 is exposed. Note that the companion sequence hybridizes with該全portion or part be complementary to all or a portion of the companion sequence B ⁴ of capture strand 129.
d) Companion # 2 (strand 128) is exposed to and combined with a reagent / buffer containing at least amplifier # 3 under conditions sufficient for polynucleotide hybridization to occur. Create a companion # 2 / amplifier # 3 complex.
e) Initiate degradation at the 3 ′ end of the capture strand 129 by adding an exonuclease species to the reagent with any necessary cofactors or present in the reagent.
f) Release undegraded companion # 2 (126) and companion chain 130 (companion # 2 or B) into the solution by continuing until the enzymatic degradation reaction is complete.

この方法の６つの相又は段階における結果を以下の表４に示す。

The results for the six phases or stages of the method are shown in Table 4 below.

図１３は、３段階増幅に関連する表４のデータをプロットしたグラフを示す。   FIG. 13 shows a graph plotting the data in Table 4 relating to three-stage amplification.

相同配列
本願明細書に記載の実施例（特に図１０〜図１３に示す多段階の実施例）に関しては、１種よりも多くの増幅試薬種中に存在する配列に対応する相同配列の個々の指定は、この種の相同配列がヌクレオチドの長さや配列の点、又は全体的な化学的組成の点で同一であるということを必ず意味するものではないということに留意すべきである。この種の相同配列は同一であってもよいが、多くの点で異なっていてもよい。 Homologous sequences For the examples described herein (especially the multi-step examples shown in FIGS. 10-13), individual homologous sequences corresponding to sequences present in more than one species of amplification reagent. It should be noted that the designation does not necessarily imply that this type of homologous sequence is identical in terms of nucleotide length, sequence, or overall chemical composition. Such homologous sequences may be identical, but may differ in many respects.

例えば、図１２Ｂ及び図１２Ｃにおいては、鎖１２８の配列Ｄ'''は配列Ｄ''（アンプリファイア＃２における鎖１２７）とハイブリッド形成していてもよく、また、配列Ｄ^４（アンプリファイア＃３／コンパニオン＃２複合体における鎖１２９）ともハイブリッド形成していてもよい。このような相同配列は、本発明による方法において個々のハイブリッド形成機能を発揮するために有効な程度の相補的特性を有するように設計してもよい。この場合、配列、長さ又は付加的な化学基の組み込みの点で必ずしも同一でなくてもよい。従って、例えば、配列Ｄ''と配列Ｄ^４は、ハイブリッド形成の異なる完結度を有するように設計してもよく、あるいは、これらの配列は異なる変性特性又はアニーリング緊縮特性を有していてもよい。同様に、配列Ｄ''とＤ^４は、異なる長さ、末端基又は非天然ヌクレオチド等を有するように設計することによって、例えば、所望により酵素活性の開始、停止、特異性又はブロッキング等を調節してもよい。 For example, in FIGS. 12B and 12C, sequence D ′ ″ of strand 128 may hybridize to sequence D ″ (strand 127 in amplifier # 2), and sequence D ⁴ (amplifier # 2). It may also be hybridized with the chain 129) in the 3 / companion # 2 complex. Such homologous sequences may be designed to have a degree of complementary properties that are effective for performing individual hybridization functions in the method according to the invention. In this case, the sequence, the length or the incorporation of additional chemical groups are not necessarily identical. Thus, for example, sequence D ″ and sequence D ⁴ may be designed to have different degrees of hybridization, or these sequences may have different denaturing or annealing stringency properties. . Similarly, D ⁴ and SEQ D '' is adjusted different lengths, by be designed to have a terminal group or a non-natural nucleotide such as, for example, the start of the desired enzymatic activity, stop, specificity or blocking such May be.

別の選択肢においては、アンプリコン又はレポーター種における相同配列（例えば、鎖１２８におけるＢ'''及び鎖１３０におけるＢ^５）は異なる標識、マーカー又はその他の検出能増大特性を有するように設計することによって、例えば、明確で個別的な検出（例えば、定量的増幅の追跡における検出）又は異なる装置若しくは方法による検出を可能にしてもよい。特定の実施態様においては、多重及び／又は定量的検出法を採用することによって、例えば、偽陽性の低減化及び類似被検体間の区別等を可能にしてもよい。 In another option, homologous sequences in amplicons or reporter species (eg, B ′ ″ in strand 128 and B ⁵ in strand 130) are designed to have different labels, markers or other detectability enhancing properties. May allow, for example, clear and individual detection (eg, detection in quantitative amplification tracking) or detection by different devices or methods. In certain embodiments, multiplex and / or quantitative detection methods may be employed to allow, for example, reduction of false positives and discrimination between similar analytes.

実施例：蛍光検出を用いる単一標的増幅
図１４Ａ〜図１４Ｃは、本発明の観点（例えば、図３Ａ参照）を有する単一標的増幅法であって、該方法の１つの過程において蛍光検出法を採用する該単一標的増幅法の実施例を示す。 Example: Single Target Amplification Using Fluorescence Detection FIGS. 14A-14C are single target amplification methods having aspects of the invention (see, eg, FIG. 3A), in one step of the method, fluorescence detection methods The Example of this single target amplification method which employ | adopts is shown.

この実施例においては、増幅捕獲プローブ配列は被検体／アンプリファイア複合体を形成するように設計され、これによって捕獲鎖は、５’＞＞３’エキソヌクレアーゼ活性による分解作用を受ける非突出状５’末端を有するようになる。この実施例で使用した酵素は、５’＞＞３’エキソヌクレアーゼ活性Ｔ７ポリメラーゼである。   In this example, the amplified capture probe sequence is designed to form an analyte / amplifier complex whereby the capture strand is subject to degradation by 5 '>> 3' exonuclease activity. 'Comes to have an end. The enzyme used in this example is 5 '>> 3' exonuclease active T7 polymerase.

前述のように、本発明の観点を有する増幅と検出のいくつかの別の実施態様は、３’−エキソヌクレアーゼ、５’−エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ（例えば、校正又はヌクレアーゼ活性を介するポリメラーゼ等）等を含む種々のヌクレオチド酵素を用いて実施してもよい。例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、本発明による方法を使用して例証されている。同様に、本発明の観点を有する増幅系においては、適当な酵素の開始部位を有する被検体／アンプリファイア複合体を形成するように設計されている場合には、本発明の技術的思想を逸脱することなく、エンドヌクレアーゼ活性を利用してもよい。   As mentioned above, some alternative embodiments of amplification and detection having aspects of the present invention include 3′-exonucleases, 5′-exonucleases and DNA polymerases (eg, polymerases via proofreading or nuclease activity, etc.) You may implement using various nucleotide enzymes including these. For example, T7 DNA polymerase has been exemplified using the method according to the invention. Similarly, an amplification system having an aspect of the present invention departs from the technical idea of the present invention if it is designed to form an analyte / amplifier complex having an appropriate enzyme start site. The endonuclease activity may be utilized without doing so.

図１４Ａは、被検体１４１を含む被検体／アンプリファイア系１４０の構成成分を示す模式図である。該被検体は、標的配列Ａ（この実施例の場合には、約５４個の塩基を有する配列である）、捕獲鎖１４２（この実施例の場合には、約１０２個の塩基を有する鎖である）、相補的配列Ａ’、延長配列Ｂ及びレポーター鎖１４７（この実施例の場合には、約１９個の塩基を有する鎖である）を有する。この実施例におけるアンプリファイア／被検体複合体は約１２１個の塩基対を有する。   FIG. 14A is a schematic diagram showing components of the subject / amplifier system 140 including the subject 141. The analyte is a target sequence A (in this example, a sequence having about 54 bases), a capture strand 142 (in this example, a chain having about 102 bases). A) complementary sequence A ′, extension sequence B and reporter strand 147 (in this example, a strand having about 19 bases). The amplifier / analyte complex in this example has about 121 base pairs.

レポーター鎖１４７は、相補的配列Ｂ’を有する鎖１４３を含む。該相補的配列は、鎖１４２の延長配列Ｂ’と結合すると共に、この実施例においては、常套法によって鎖１４３へ結合されたＦＡＭ蛍光性基１４４も含んでおり、これによって、光学的方法による簡便な検出が可能となる。   Reporter strand 147 includes a strand 143 having a complementary sequence B '. The complementary sequence binds to the extended sequence B ′ of strand 142 and, in this example, also includes a FAM fluorescent group 144 conjugated to strand 143 by conventional methods, thereby optically. Simple detection is possible.

図１４Ｂと図１４Ｃは、当該方法における種々の反応成分の電気泳動的ゲル分離の結果を示す写真である。図１４Ｂは、分離後の電気泳動的ゲルのポジ写真であり、また、図１４Ｃは、図１４Ｂの写真のネガ写真である。図１４Ｂは、特許明細書に添付する図面として適当な再現性のある無彩色スケールの写真画像におけるデータをより明瞭に示す。当該方法に関する実施例においては、比較の目的のために、反応成分又は試薬成分の種々の組み合わせについて試験した。ゲルは、１０個の平行なチャネルを有するように調製した。各々のチャネル内の緩衝液を以下のリストに示す。   14B and 14C are photographs showing the results of electrophoretic gel separation of various reaction components in the method. FIG. 14B is a positive photograph of the electrophoretic gel after separation, and FIG. 14C is a negative photograph of the photograph of FIG. 14B. FIG. 14B more clearly shows the data in a reproducible achromatic scale photographic image suitable as a drawing accompanying the patent specification. In the examples relating to the method, various combinations of reaction components or reagent components were tested for comparison purposes. The gel was prepared to have 10 parallel channels. The buffer in each channel is shown in the list below.

１：約１０個の塩基対（ｂｐ）単位を有するオリゴマーの校正はしご（「明線」で示す成分は１００ｂｐに対応する）
２：被検体オリゴマー１４１（約５４ｂｐ）
３：捕獲配列１４２（約１０２ｂｐ）とハイブリッド形成された被検体１４１
４：配列１４２とハイブリッド形成された被検体１４１（低濃度の酵素を含む）
５：配列１４２とハイブリッド形成された被検体１４１（高濃度の酵素を含む）
６：被検体オリゴマー１４１
７：アンプリファイア／被検体複合体１４５（約１２１ｂｐ）
８：アンプリファイア／被検体複合体１４５（低濃度の酵素を含む）
９：アンプリファイア／被検体複合体１４５（高濃度の酵素を含む）
１０：オリゴマーの校正はしご 1: Calibration ladder of an oligomer having about 10 base pair (bp) units (the component indicated by “bright line” corresponds to 100 bp)
2: Analyte oligomer 141 (about 54 bp)
3: Analyte 141 hybridized with capture sequence 142 (approximately 102 bp)
4: Analyte 141 hybridized with sequence 142 (including low concentration of enzyme)
5: analyte 141 hybridized with sequence 142 (including high concentration of enzyme)
6: Analyte oligomer 141
7: Amplifier / analyte complex 145 (about 121 bp)
8: Amplifier / analyte complex 145 (including low concentration of enzyme)
9: Amplifier / analyte complex 145 (contains high concentration of enzyme)
10: Calibration ladder of oligomer

図１４Ｂと図１４Ｃから理解されるように、酵素による消化生成物であるレポーター１４７は、酵素を含まない複合体に対応するチャネル７の内部においては識別されないが、酵素による消化反応混合物に対応するチャネル８と９の内部における１９量体のレベルにおいては容易に識別される。当業者であれば、酵素の濃度やその他の反応条件を、過度の実験を行うことなく、この種の被検体の簡便で感度と選択性の高い検出を促進するために最適化できることを容易に認識できる。   As can be seen from FIGS. 14B and 14C, the enzyme digestion product reporter 147 is not identified within the channel 7 corresponding to the enzyme-free complex, but corresponds to the enzyme digestion reaction mixture. It is easily identified at the 19-mer level inside channels 8 and 9. One skilled in the art can easily optimize enzyme concentrations and other reaction conditions to facilitate simple, sensitive and selective detection of this type of analyte without undue experimentation. Can be recognized.

ヘアピン型プローブ集合体
本発明の観点を有する別の実施態様においては、プローブ集合体の個々の捕獲部分とレポーター部分を省略してもよい。図１５Ａ〜図１５Ｃは、ヘアピン型プローブ集合体の例を示す。この実施例においては、該プローブ集合体は共線的ポリヌクレオチド鎖１５２を含んでおり、該ポリヌクレオチド鎖は捕獲部分Ａ’（該捕獲部分は、被検体鎖１５１の標的Ａに対して相補的である）とレポーター部分を含む。該レポーター部分は、鎖１５２のいずれかの簡便な部位上に配置されるか、又は該部位に隣接する１又は複数の標識又はその他の検出強化体（例えば、蛍光性マーカー基等）を有していてもよい。この実施例においては、マーカー１５４は鎖１５２の中央部分に配置されているが、その他の部分、例えば３’末端に隣接する部分に配置させてもよい。 Hairpin probe assembly In another embodiment having aspects of the invention, the individual capture and reporter portions of the probe assembly may be omitted. 15A to 15C show examples of hairpin type probe assemblies. In this example, the probe assembly includes a collinear polynucleotide strand 152, which is a capture moiety A ′ (the capture moiety is complementary to target A of analyte strand 151). And a reporter moiety. The reporter moiety is located on any convenient site of chain 152 or has one or more labels or other detection enhancements (eg, fluorescent marker groups, etc.) adjacent to the site. It may be. In this example, the marker 154 is located in the central portion of the chain 152, but may be located in other portions, for example, adjacent to the 3 'end.

図１５Ａに示すように、鎖１５２は少なくとも１つの付加的部分Ａ''を含んでおり、該付加的部分は、テンプレート種１５１の標的部分Ａと会合しないときに部分Ａ’とＡ''が自己ハイブリッド形成することによって、例えば、ヘアピン様の立体構造体を形成するような程度のハイブリッド形成に対する親和性を有するので、選択された酵素による分解から保護される。この実施例においては、ヘアピン形態の鎖１５２は突出状５’末端を有するので、活性開始のためには非突出状５’末端を有する複合体を必要とする酵素１４６（例えば、エンドヌクレアーゼ等）から保護される。   As shown in FIG. 15A, chain 152 includes at least one additional portion A ″ that is not associated with target portion A of template species 151 when portions A ′ and A ″ are present. By self-hybridizing, for example, it has an affinity for hybridization to such an extent that it forms a hairpin-like conformation, thus protecting it from degradation by the selected enzyme. In this example, hairpin-shaped strand 152 has an overhanging 5 'end, so an enzyme 146 that requires a complex with a non-protruding 5' end for initiation of activity (eg, endonuclease etc.) Protected from.

図１５Ｂに示すように、プローブ鎖１５２が標的鎖１５１と会合すると、標的Ａに対するＡ’の親和性は、酵素１４６によって攻撃される非突出状５’末端を有するように鎖１５１と鎖１５２が会合した状態の複合体１５０の生成が有意になるように平衡を移動させる。   As shown in FIG. 15B, when probe strand 152 associates with target strand 151, the affinity of A ′ for target A is such that strand 151 and strand 152 have a non-protruding 5 ′ end that is attacked by enzyme 146. The equilibrium is shifted so that the formation of the associated complex 150 is significant.

図１５Ｃに示すように、酵素分解反応は、短鎖１５２が放出されるまで続行する。次いで、標的１５１はさらなる増幅のために利用される。多段階法においては、放出される鎖１５２’は、適当に設計されたアンプリファイアのためのテンプレートとして利用してもよい。   As shown in FIG. 15C, the enzymatic degradation reaction continues until the short chain 152 is released. The target 151 is then utilized for further amplification. In a multi-step method, the released strand 152 'may be utilized as a template for an appropriately designed amplifier.

以上の記載においては、本発明の好ましい実施態様と方法に関して説明したが、当業者には明らかなように、一定の利点が達成されている。また、本発明の技術的思想の範囲内においてこれらの実施態様の種々の修正、改変及び代替的態様を実行してもよいことは当業者には理解できる事項である。   Although the foregoing description has been made with reference to preferred embodiments and methods of the invention, certain advantages have been achieved, as will be apparent to those skilled in the art. In addition, it will be understood by those skilled in the art that various modifications, alterations, and alternative embodiments of these embodiments may be performed within the scope of the technical idea of the present invention.

非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子の量を電子的に検出する装置と方法に係る模式図であり、試料を捕集して調製する過程を示す。After the reporter molecule has been amplified and released in response to a very small amount of target analyte, it is a schematic diagram relating to an apparatus and method for electronically detecting the amount of the reporter molecule, prepared by collecting the sample Shows the process. 試料媒体を入口へ塗布するためのアプリケーターを具備する液体系の内部において試料を処理する装置の模式図である。FIG. 2 is a schematic view of an apparatus for processing a sample inside a liquid system including an applicator for applying a sample medium to an inlet. プローブ集合体を保有する容器の内部に収容されたポリヌクレオチド物質を含有する試料媒体の模式図である。It is a schematic diagram of the sample medium containing the polynucleotide substance accommodated inside the container holding the probe assembly. プローブ集合体と標的被検体の詳細な模式図である。It is a detailed schematic diagram of a probe assembly and a target analyte. プローブ／被検体複合体を形成する液状系を保有する容器又はセルの模式図である。FIG. 3 is a schematic view of a container or cell holding a liquid system that forms a probe / analyte complex. プローブ／被検体の詳細な模式図である。It is a detailed schematic diagram of a probe / subject. 図１Ｄ（i）に示す容器又はセルの内部において、所望によるすすぎ過程又は洗浄過程が可能となるように、基体が不動化又は固定的に配置された状態を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the state by which the base | substrate was fixed or fixedly arrange | positioned so that the rinsing process or washing | cleaning process by desired could be performed in the inside of the container or cell shown to FIG. 容器又はセルの内部において、プローブ／被検体複合体をエキソヌクレアーゼで処理する状態の模式図である。It is a schematic diagram of a state in which the probe / analyte complex is treated with exonuclease inside the container or cell. プローブ／被検体複合体にエキソヌクレアーゼが作用する状態の詳細な模式図である。It is a detailed schematic diagram of a state in which exonuclease acts on a probe / analyte complex. 捕獲配列の脱離によって被検体分子が放出されるように進行中のプローブ分子の分解過程を示す模式図である。It is a schematic diagram showing the ongoing degradation process of the probe molecule so that the analyte molecule is released by the desorption of the capture sequence. ナノコード配列の脱離によってレポーター分子が放出されたプローブ分子の完結した分解を示す模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram showing complete degradation of a probe molecule from which a reporter molecule has been released by detachment of a nanocode sequence. 蓄積したレポーター分子が、ナノ電子的センサーを具備する隣接する検出セル内へ流れる状態を示す模式図である。It is a schematic diagram showing a state in which the accumulated reporter molecule flows into an adjacent detection cell equipped with a nanoelectronic sensor. レポーター分子と検出プローブとのハイブリッド形成に起因するセンサーの電子的特性の変化に基づいてレポーター分子を検出するための測定系の模式図である。It is a schematic diagram of a measurement system for detecting a reporter molecule based on a change in the electronic characteristics of the sensor resulting from hybridization between the reporter molecule and a detection probe. 標的被検体ポリヌクレオチドを含む試料媒体の模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram of a sample medium containing a target analyte polynucleotide. 図２Ａの構成要素を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the component of FIG. 2A. 図２Ｂに示す被検体／アンプリファイア複合体へエキソヌクレアーゼが作用する状態を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the state in which exonuclease acts on the analyte / amplifier complex shown in FIG. 2B. 図２Ｃに示す被検体／アンプリファ９ア複合体から未変性被検体が放出される状態を示す模式図である。2D is a schematic diagram showing a state in which a native analyte is released from the analyte / amplifier 9a complex shown in FIG. 2C. FIG. 図２Ｃに示す被検体／アンプリファ９ア複合体からオリゴヌクレオチドが放出される状態を示す模式図である。FIG. 2D is a schematic diagram showing a state in which an oligonucleotide is released from the analyte / amplifier 9a complex shown in FIG. 2C. 図２Ｅの構成要素を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the component of FIG. 2E. 図２Ｆの構成要素を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the component of FIG. 2F. 図２Ｇの構成要素を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the component of FIG. 2G. 合成標的の放出を誘発させるために単一の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を示す模式図である。FIG. 6 is a schematic diagram showing the results of an amplification method that uses a single analyte capture sequence to trigger the release of a synthetic target. 合成標的の放出を誘発させるために複数の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を示す模式図である。FIG. 6 is a schematic diagram showing the results of an amplification method that uses multiple analyte capture sequences to trigger the release of a synthetic target. 表１と表２に示すデータを用いて作製したグラフである。It is the graph produced using the data shown in Table 1 and Table 2. レポーターの増幅と精製のための装置と方法に係る模式図であり、基体に結合しない修飾されたレポータープローブが使用される。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method for reporter amplification and purification, in which a modified reporter probe that does not bind to a substrate is used. レポーターの増幅と精製のための装置と方法に係る模式図であり、ナノ電子的検出の前に、放出されたレポーターは精製される。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method for reporter amplification and purification, where the released reporter is purified prior to nanoelectronic detection. 予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、初期固定化段階を示す。FIG. 6 is a schematic diagram of an apparatus and method for providing exponential analyte-response amplification including a preliminary amplification purification process, showing an initial immobilization step. 予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、精製段階を示す。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method for providing exponential analyte-response amplification including a preliminary amplification purification process, illustrating the purification stage. 予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、インキュベーション段階を示す。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method for providing exponential analyte-response amplification including a preliminary amplification purification process, showing an incubation step. 予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、エキソヌクレアーゼ増幅段階を示す。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method for providing exponential analyte-response amplification including a preliminary amplification purification process, showing an exonuclease amplification step. 予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、レポーター放出段階を示す。FIG. 6 is a schematic diagram of an apparatus and method for providing exponential analyte-response amplification including a preliminary amplification purification process, showing a reporter release step. 分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、エキソヌクレアーゼ増幅段階を示す。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method that provides exponential analyte-response amplification after removing exonuclease from an analytical medium, showing an exonuclease amplification step. 分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、精製段階を示す。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method that provides exponential analyte-response amplification after removing exonuclease from an analytical medium, showing a purification step. 分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、プローブ変性段階を示す。FIG. 2 is a schematic diagram of an apparatus and method that provides exponential analyte-response amplification after removing exonuclease from an analytical medium, showing a probe denaturation step. 図７Ａは本発明に係る内部阻害基を含むレポータープローブの模式図である。 図７Ｂは図７Ａの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼがさらに付加される。 図７Ｃは図７Ｂの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼは連鎖レポーターの分解を続行する。 図７Ｄは図７Ｃの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼは、耐性結合に達すると、プローブ／被検体複合体から離脱する。 図７Ｅは相補的なサンドウィッチ型プローブを用いる所望による精製過程に係る模式図である。 図７Ｆはナノ電子的センサーによってレポーターを検出するための装置の模式図である。FIG. 7A is a schematic diagram of a reporter probe containing an internal inhibitory group according to the present invention. FIG. 7B is a schematic diagram showing the components of FIG. 7A, and an exonuclease is further added. FIG. 7C is a schematic showing the components of FIG. 7B, where the exonuclease continues to degrade the chain reporter. FIG. 7D is a schematic diagram showing the components of FIG. 7C, where the exonuclease detaches from the probe / analyte complex when resistant binding is reached. FIG. 7E is a schematic diagram of an optional purification process using a complementary sandwich probe. FIG. 7F is a schematic diagram of an apparatus for detecting a reporter with a nanoelectronic sensor. 多重型レポーターとマトリックスと検出器セルを用いる多種被検体アッセイを含む装置と方法に係る模式図であり、多被検体アッセイのフローチャートを示す。FIG. 5 is a schematic diagram of an apparatus and method including a multi-analyte assay using a multiplex reporter, a matrix, and a detector cell, and shows a multi-analyte assay flowchart. 多種被検体アッセイ用のマトリックス検出セルを示す模式図である。It is a schematic diagram showing a matrix detection cell for multi-analyte assay. 生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、プローブの保護に適合したアプタマーを示す。It is a schematic diagram which concerns on the method of using the probe assembly containing the aptamer part for detecting a biomolecule, and shows the aptamer suitable for protection of a probe. 生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、アプタマーの被検体への結合とプローブの暴露を示す。It is a schematic diagram concerning the method of using the probe assembly containing the aptamer part for detecting a biomolecule, and shows the binding of the aptamer to the analyte and the exposure of the probe. 生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、プローブの分解とレポーターの放出を示す。It is a schematic diagram based on the method of using the probe assembly containing the aptamer part for detecting a biomolecule, and shows decomposition | disassembly of a probe and discharge | release of a reporter. 図１０ａはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、試料測定の初期状態を示す。 図１０ｂはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアＩは被検体鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｃはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階１の酵素分解が完結した状態を示す。FIG. 10a is a schematic showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate amplicons and / or reporter species, showing the initial state of sample measurement. FIG. 10b is a schematic showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or reporter species, with amplifier I shown in double association with the analyte strand. It is. FIG. 10c is a schematic diagram showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or reporter species, showing the state of completion of step 1 of the method. 図１０ｄはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階２の開始状態を示す。 図１０ｅはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアIIはコンパニオン鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｆはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階２の酵素分解が完結した状態を示す。FIG. 10d is a schematic showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or a reporter species, showing the starting state of step 2 of the method. FIG. 10e is a schematic showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or reporter species, with amplifier II shown in a double association state with a companion strand. . FIG. 10f is a schematic diagram illustrating an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or a reporter species, showing the completion of stage 2 enzymatic degradation of the method. 図１０ｇはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階３の開始状態を示す。 図１０ｈはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアＩは被検体鎖との二重会合状態で示され、また、アンプリファイアIIはコンパニオン鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｉはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階３の酵素分解が完結した状態を示す。FIG. 10g is a schematic showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by the target to generate amplicons and / or reporter species, showing the starting state of step 3 of the method. FIG. 10h is a schematic showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or reporter species, with amplifier I shown in double association with the analyte strand. Also, amplifier II is shown in a double association state with a companion chain. FIG. 10i is a schematic showing an embodiment of a two-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or reporter species, showing the state of completion of step 3 of the method. 図１０ａ〜図１０ｉに示す方法に対応する実験データに基づいて作製したグラフである。It is the graph produced based on the experimental data corresponding to the method shown to FIG. アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃１の使用状態を示す。FIG. 6 is a schematic diagram showing an embodiment of a three-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or a reporter species, showing the usage of amplifier # 1. アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃２の使用状態を示す。FIG. 5 is a schematic diagram showing an embodiment of a three-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or reporter species, showing the usage of amplifier # 2. アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃３の使用状態を示す。FIG. 6 is a schematic diagram showing an embodiment of a three-step method of amplification initiated by a target to generate an amplicon and / or reporter species, showing the usage of amplifier # 3. 図１２Ａ〜図１２Ｃに示す方法に対応する実験データに基づいて作製したグラフである。It is the graph produced based on the experimental data corresponding to the method shown to FIG. 12A-FIG. 12C. 図１４Ａは蛍光検出法を利用する単一標的増幅法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア／被検体複合体を示す。 図１４Ｂは蛍光検出法を利用する単一標的増幅法による結果と増幅生成物を示す電気泳動ゲルの写真である。 図１４Ｃは図１４Ｂに示す写真の陰画である。FIG. 14A is a schematic diagram showing an embodiment of a single target amplification method using a fluorescence detection method, and shows an amplifier / analyte complex. FIG. 14B is a photograph of an electrophoresis gel showing the result of the single target amplification method using the fluorescence detection method and the amplification product. FIG. 14C is a negative image of the photograph shown in FIG. 14B. ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、プローブ鎖は少なくとも１つの付加的部分を有する。FIG. 3 is a schematic diagram showing an embodiment of a hairpin type probe assembly, in which the probe strand has at least one additional portion. ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、プローブ鎖は標的鎖と会合する。It is a schematic diagram showing an embodiment of a hairpin type probe assembly, the probe strand is associated with the target strand. ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、酵素分解反応はプローブ鎖が放出されるまで続行する。It is a schematic diagram showing an embodiment of a hairpin type probe assembly, and the enzymatic degradation reaction continues until the probe strand is released.

符号の説明Explanation of symbols

１１ 試料アプリケーター
１２ 溶解緩衝液又は媒体
１３ 容器
１４ ウイルス性物質
１５ ポリヌクレオチド物質
１７ 反応媒体
２０ 液状系
２３ 反応セル
２５ 検出セル
３０ プローブ集合体
３２ 基体
３４ プローブポリヌクレオチド
３５ レポーターオリゴヌクレオチド
３６ プローブ／被検体複合体
３７ エキソヌクレアーゼ
４０ ナノ電子的センサー
４１ 検出プローブ
４２ 回路
５０ 被検体ポリヌクレオチド
５１ Ａアンプリファイア
５２ 合成オリゴヌクレオチド
５３ 第２オリゴヌクレオチド
５４ Ｂアンプリファイア
５７ アンプリファイア／被検体複合体
５８ 合成Ａ標的／アンプリファイア複合体
５９ 合成Ｂ標的／アンプリファイア複合体
６１ レポータープローブ
６２ レポータープローブ
７１ 基体
７６ 被検体／アンプリファイア複合体
７７ 合成標的Ａ／アンプリファイア複合体
７９ サンドウィッチ型プローブ
８１ プロスチンプローブ
９０ プローブ
９１ 連鎖レポーターオリゴヌクレオチド
９２ コンパニオンオリゴヌクレオチド
９５ レポーター配列
９６ コンパニオンアンカー配列
１００ 検出セル
１０４ ナノ構造素子
１０６ 基体
１０７ 誘電層
１１０ プローブ集合体
１１１ 被検体
１１２ アプタマー
１１４ 塩基配列
１２０ 被検体ポリヌクレオチド鎖
１２１ 捕獲鎖
１２２ コンパニオン鎖
１２３ 捕獲鎖
１２４ コンパニオン鎖
１２５ 捕獲鎖
１２６ コンパニオン鎖
１２７ 捕獲鎖
１２８ コンパニオン鎖
１２９ 捕獲鎖
１３０ コンパニオン鎖
１４１ 被検体
１４２ 捕獲鎖
１４７ レポーター鎖
１４４ ＦＡＭ蛍光性基
１５１ 標的鎖
１５２ 共線的ポリヌクレオチド鎖
１５４ マーカー DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 Sample applicator 12 Lysis buffer or medium 13 Container 14 Viral substance 15 Polynucleotide substance 17 Reaction medium 20 Liquid system 23 Reaction cell 25 Detection cell 30 Probe assembly 32 Substrate 34 Probe polynucleotide 35 Reporter oligonucleotide 36 Probe / analyte Complex 37 Exonuclease 40 Nanoelectronic sensor 41 Detection probe 42 Circuit 50 Analyte polynucleotide 51 A amplifier 52 Synthetic oligonucleotide 53 Second oligonucleotide 54 B amplifier 57 Amplifier / analyte complex 58 Synthetic A target / Amplifier complex 59 Synthetic B target / amplifier complex 61 Reporter probe 62 Reporter probe 71 Substrate 76 Analyte / Amplifier Ear Complex 77 Synthetic Target A / Amplifier Complex 79 Sandwich Probe 81 Prostin Probe 90 Probe 91 Linked Reporter Oligonucleotide 92 Companion Oligonucleotide 95 Reporter Sequence 96 Companion Anchor Sequence 100 Detection Cell 104 Nanostructure Element 106 Substrate 107 Dielectric Layer 110 Probe assembly 111 Sample 112 Aptamer 114 Base sequence 120 Sample polynucleotide chain 121 Capture chain 122 Companion chain 123 Capture chain 124 Companion chain 125 Capture chain 126 Companion chain 127 Capture chain 128 Companion chain 129 Capture chain 130 Companion chain 141 Specimen 142 Capture strand 147 Reporter strand 144 FAM fluorescent group 151 Target strand 152 Collinear poly Nucleotide chain 154 Marker

Claims (38)

生体分子のテンプレート種を含有する媒体中へのレポーター種の導入方法であって、該テンプレート種に対して結合親和性を有するプローブ集合体から非−ＰＣＲ／テンプレート−誘発／酵素活性化によって該レポーター種を放出させることを含み、下記の操作過程（ａ）〜（ｃ）を含む該導入方法：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）テンプレート種の標的部分に対して選択的な結合親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１プローブ鎖を含む；
（ii）プローブ鎖の対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチド重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブ鎖と少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブ鎖の全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター種を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列がテンプレート種の選択された標的部分の全部又は一部と結合してテンプレート−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計される；
（ｂ）テンプレート種の選択された標的部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１テンプレート−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる：
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１テンプレート−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブ鎖が分解され、第１レポーター種がプローブ集合体から放出される。 A method of introducing a reporter species into a medium containing a biomolecular template species, wherein the reporter species is non-PCR / template-induced / enzyme activated from a probe assembly having binding affinity for the template species. The method of introduction comprising releasing the seed and comprising the following operational steps (a) to (c):
(A) Supply at least one first probe assembly that satisfies the following requirements (i) to (iv):
(I) comprising at least one first probe strand having a capture nucleotide sequence that confers selective binding affinity to a target portion of the template species;
(Ii) comprises at least one first reporter species comprising a binding moiety having a polynucleotide sequence designed to hybridize with the corresponding binding moiety of the probe strand;
(Iii) the first probe assembly includes at least one first probe strand and at least one first reporter species hybridized to include a polynucleotide overlapping probe assembly;
(Iv) The overlapping probe assembly promotes the action of a selected enzyme having sufficient nuclease activity to degrade all or part of the probe strand to release the first reporter species from the probe assembly. A matched at least one enzyme-the enzyme formed when the capture nucleotide sequence binds to all or part of the selected target portion of the template species to form a template-probe complex- Designed to have a start site;
(B) Conditions effective to promote a reaction that forms a first template-probe complex having an enzyme-starting site by binding a selected target portion of the template species to a capture nucleotide sequence portion of the probe polynucleotide. Below, the medium is brought into contact with at least one first probe assembly:
(C) the first template-probe complex was formed in step (b) by contacting the medium with at least the selected enzyme under conditions effective to promote the nuclease activity of the enzyme at the enzyme-starting site Sometimes the first probe strand is degraded and the first reporter species is released from the probe assembly. 生体分子のテンプレート種が試料中に被検体種を含み、第１レポーター種が、プローブ集合体から放出されたときに直接的又は間接的に検出されるように設計され、下記の過程（ｄ）及び（ｅ）をさらに含む請求項１記載の方法：
（ｄ）放出される第１レポーター種を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）第１レポーター種の直接的又は間接的検出に基づいて、試料中の被検体種の少なくとも存在又は濃度を測定する。 The biomolecule template species includes an analyte species in the sample, and the first reporter species is designed to be detected directly or indirectly when released from the probe assembly, comprising the following step (d) The method of claim 1 further comprising: and (e):
(D) detecting directly or indirectly the released first reporter species;
(E) Measure at least the presence or concentration of the analyte species in the sample based on direct or indirect detection of the first reporter species. 第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計される請求項２記載の方法。   The method of claim 2, wherein the first reporter species is designed to be detected directly when released from the first probe assembly. 第１レポーター種が、少なくとも１つの検出可能なポリヌクレオチド配列又は検出可能な標識基を含む少なくとも１つの検出部分を含む請求項３記載の方法。   4. The method of claim 3, wherein the first reporter species comprises at least one detection moiety comprising at least one detectable polynucleotide sequence or a detectable label group. 第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに間接的に検出されるように設計される請求項２記載の方法。   The method of claim 2, wherein the first reporter species is designed to be indirectly detected when released from the first probe assembly. 第１レポーター種が、第１レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第２プローブ集合体から第２レポーター種を少なくとも１つの第２の非ＰＣＲ／テンプレート−誘導化／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するよう設計されたテンプレート部分を含む請求項５記載の方法。   At least one second non-PCR / template-derivatized / enzyme activation scheme from a second probe assembly in which the first reporter species has binding affinity for the template portion of the first reporter species. 6. The method of claim 5, comprising a template portion designed to act as a target template for release at. 第２レポーター種が、第２プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計される請求項６記載の方法。   7. The method of claim 6, wherein the second reporter species is designed to be detected directly when released from the second probe assembly. 第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに間接的に検出されるような形態を有し、第２レポーター種が、第２レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第３プローブ集合体から第３レポーター種を少なくとも１つの第３の非ＰＣＲ／テンプレート−誘導化／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するような形態を有するテンプレート部分を含む請求項６記載の方法。   The first reporter species has a form such that it is indirectly detected when released from the first probe assembly, and the second reporter species has binding affinity for the template portion of the second reporter species. A template portion having a form to act as a target template for releasing a third reporter species from the third probe assembly having at least one third non-PCR / template-derivatized / enzyme activated mode Item 7. The method according to Item 6. 生体分子テンプレート種が少なくとも非ポリヌクレオチド部分を含み、第１プローブ集合体の捕獲ヌクレオチド配列がアプタマーを含み、選択的結合親和性が、アプタマーと少なくとも非ポリヌクレオチドとの結合相互作用を含む請求項１記載の方法。   The biomolecule template species comprises at least a non-polynucleotide moiety, the capture nucleotide sequence of the first probe assembly comprises an aptamer, and the selective binding affinity comprises a binding interaction between the aptamer and at least a non-polynucleotide. The method described. 生体分子のテンプレート種が少なくともポリヌクレオチド部分を含み、第１プローブ鎖の捕獲ヌクレオチド配列が、相補的ヌクレオチドのハイブリッド形成によってテンプレート種の標的部分に対して選択的結合親和性を付与する請求項１記載の方法。   The template species of the biomolecule includes at least a polynucleotide portion, and the capture nucleotide sequence of the first probe strand confers selective binding affinity for the target portion of the template species by hybridization of complementary nucleotides. the method of. 第１プローブ鎖と第１レポーター種が共直線性ポリヌクレオチド鎖を含み、該共直線性ポリヌクレオチド鎖の複数の部分が、テンプレート種の標的部分と結合せずに選択された酵素による分解から保護されるように自己ハイブリッド形成するような形態を有する請求項１記載の方法。   The first probe strand and the first reporter species comprise a co-linear polynucleotide strand, and multiple portions of the co-linear polynucleotide strand are protected from degradation by a selected enzyme without binding to the target portion of the template species The method of claim 1, wherein the method is configured to self-hybridize. 下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む、試料中の被検体であるポリヌクレオチドの検出方法：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）被検体の選択された標的ヌクレオチド部分に対して選択的なハイブリッド形成親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１ポリヌクレオチドプローブストランド；
（ii）プローブストランドの対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター鎖を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチド重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブ鎖と少なくとも１つの第１レポーターを含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブ鎖の全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター鎖を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列が被検体の標的ヌクレオチド部分の全部又は一部とハイブリッド形成して重複被検体−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計される；
（ｂ）標的ヌクレオチド部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１被検体−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、試料を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる；
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、試料を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１被検体−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブ鎖が分解され、第１レポーター鎖がプローブ集合体から放出される；
（ｄ）放出されたレポーター鎖を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）レポーター鎖の直接的又は間接的検出に基づいて、被検体の少なくとも存在又は濃度を測定する。 A method for detecting a polynucleotide which is an analyte in a sample, comprising the following steps (a) to (e):
(A) Supply at least one first probe assembly that satisfies the following requirements (i) to (iv):
(I) at least one first polynucleotide probe strand having a capture nucleotide sequence that confers selective hybridization affinity for a selected target nucleotide portion of the analyte;
(Ii) comprising at least one first reporter strand comprising a binding moiety having a polynucleotide sequence designed to hybridize with the corresponding binding moiety of the probe strand;
(Iii) the first probe assembly includes at least one first probe strand and at least one first reporter hybridized to include a polynucleotide overlapping probe assembly;
(Iv) The overlapping probe assembly promotes the action of a selected enzyme having sufficient nuclease activity to degrade all or part of the probe strand to release the first reporter strand from the probe assembly. A matched at least one enzyme-starting site formed when the capture nucleotide sequence hybridizes with all or part of the target nucleotide portion of the analyte to form an overlapping analyte-probe complex -Designed to have an initiation site;
(B) a sample under conditions effective to promote a reaction to form a first analyte-probe complex having an enzyme-initiation site by binding the target nucleotide portion to the capture nucleotide sequence portion of the probe polynucleotide; In contact with at least one first probe assembly;
(C) contacting the sample with at least the selected enzyme under conditions effective to promote the nuclease activity of the enzyme at the enzyme-starting site, and a first analyte-probe complex is formed in step (b) The first probe strand is degraded and the first reporter strand is released from the probe assembly;
(D) detecting the released reporter strand directly or indirectly;
(E) Measuring at least the presence or concentration of the analyte based on direct or indirect detection of the reporter strand. 下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む、試料中の被検体であるポリヌクレオチドの検出方法：
（ａ）下記の要素（i）〜（iv）を含む第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）基体；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１種のプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１種のナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体であるポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的はヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第１レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第１レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように配置されたプローブポリヌクレオチド；
（ｂ）被検体であるポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって、下記の成分（i）〜（iii）を含有する重複第１プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、第１プローブ集合体を被検体であるポリヌクレオチドを含有すると推定される試料と接触させる：
（i）第１プローブ集合体；
（ii）少なくとも１種のポリヌクレオチド被検体；
（iii）遠位へ延びて平滑な遠位の５’−末端（１）又は突出する遠位の５’−末端（２）を形成するポリヌクレオチド被検体；
（ｃ）第１プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端鎖の選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｄ）エキソヌクレアーゼを第１プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第１プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端鎖をエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを第１の重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｅ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出される少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。 A method for detecting a polynucleotide which is an analyte in a sample, comprising the following steps (a) to (e):
(A) supplying at least one first probe assembly comprising the following elements (i) to (iv):
(I) substrate;
(Ii) at least one probe polynucleotide comprising an adjacent 5'-terminal nucleotide and a distal 3'-terminal nucleotide, wherein the adjacent 5'-terminal nucleotide binds adjacent to the substrate And a probe polynucleotide comprising a capture nucleotide sequence portion having a nucleotide sequence complementary to at least one nanocode nucleotide sequence portion and a corresponding target nucleotide sequence of the subject polynucleotide;
(Iii) at least one first reporter polynucleotide having a nucleotide sequence that is complementary to the nanocode sequence of the probe polynucleotide and forms an overlap with the probe polynucleotide by hybridizing with the nanocode sequence The first reporter polynucleotide;
(Iv) a probe polynucleotide positioned such that the capture nucleotide sequence portion and the 3′-terminal nucleotide extend distally from the overlapping portion of the first reporter polynucleotide;
(B) A duplicate first probe / analyte complex containing the following components (i) to (iii) by binding a target nucleotide sequence of a polynucleotide that is an analyte to a capture nucleotide sequence portion of the probe polynucleotide Contacting the first probe assembly with a sample presumed to contain the analyte polynucleotide under conditions effective to form:
(I) a first probe assembly;
(Ii) at least one polynucleotide analyte;
(Iii) a polynucleotide analyte extending distally to form a smooth distal 5′-end (1) or protruding distal 5′-end (2);
(C) The first probe / analyte complex is 3′-vs—5 ′ exo-comprising specific binding to double-stranded DNA followed by selective hydrolysis of the 3′-end strand of the DNA overlap. Contacting with an exonuclease having deoxyribonuclease activity;
(D) by being effective for binding the exonuclease to the first probe / analyte complex and hydrolyzing the distal 3′-end strand of the first probe / analyte complex with the exonuclease. Maintaining conditions effective to release the polynucleotide analyte and at least the first reporter polynucleotide from the first overlapping probe / analyte complex;
(E) determining the presence of a polynucleotide analyte in the sample by detecting the presence of at least a first reporter polynucleotide released by hydrolysis with an exonuclease. 下記の過程（ｆ）〜（ｊ）をさらに含む請求項１３記載の方法：
（ｆ）下記の要素（i）〜（iv）を含む第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給する；
（i）第１プローブ集合体の場合と同一の基体（１）又は第１プローブ集合体の場合と異なる基体（２）；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１つのナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体であるポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的はヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第２レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第２レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように配置されたプローブポリヌクレオチド；
（ｇ）過程（ｄ）においてポリヌクレオチド被検体を放出させた後、放出されたポリヌクレオチド被検体の標的ヌクレオチド配列を第２プローブ集合体のプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって第２重複プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、過程（ｄ）で放出されたポリヌクレオチド被検体を含有する試料を第２プローブ集合体と接触させる；
（ｈ）第２プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端鎖の選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｉ）エキソヌクレアーゼを第２プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第２プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端ストランドをエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第２レポーターポリヌクレオチドを第２重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｊ）過程（ｅ）の場合のように、第１重複プローブ／被検体複合体から放出された第１レポーターポリヌクレオチド及び第２重複プローブ／被検体複合体から放出された第２レポーターポリヌクレオチドの少なくとも両方の存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。 The method of claim 13, further comprising the following steps (f) to (j):
(F) supplying at least one second probe assembly including the following elements (i) to (iv);
(I) the same substrate (1) as in the case of the first probe assembly or a substrate (2) different from that in the case of the first probe assembly;
(Ii) at least one probe polynucleotide comprising an adjacent 5′-terminal nucleotide and a distal 3′-terminal nucleotide, wherein the adjacent 5′-terminal nucleotide binds adjacent to the substrate; The probe polynucleotide comprising a capture nucleotide sequence portion having at least one nanocode nucleotide sequence portion and a nucleotide sequence complementary to a corresponding target nucleotide sequence of the analyte polynucleotide;
(Iii) at least one second reporter polynucleotide having a nucleotide sequence that is complementary to the nanocode sequence of the probe polynucleotide and forms an overlap with the probe polynucleotide by hybridizing with the nanocode sequence The second reporter polynucleotide;
(Iv) a probe polynucleotide positioned such that the capture nucleotide sequence portion and the 3′-terminal nucleotide extend distally from the overlapping portion of the second reporter polynucleotide;
(G) After releasing the polynucleotide analyte in step (d), the target nucleotide sequence of the released polynucleotide analyte is combined with the capture nucleotide sequence portion of the probe polynucleotide of the second probe assembly. Contacting a sample containing the polynucleotide analyte released in step (d) with a second probe assembly under conditions effective to form a dual probe / analyte complex;
(H) The second probe / analyte complex is 3′-vs—5 ′ exo-comprising specific binding to double-stranded DNA followed by selective hydrolysis of the 3′-end strand of the DNA overlap. Contacting with an exonuclease having deoxyribonuclease activity;
(I) effective to bind the exonuclease to the second probe / analyte complex and by hydrolyzing the distal 3′-end strand of the second probe / analyte complex with the exonuclease Maintaining conditions effective to release the polynucleotide analyte and at least the second reporter polynucleotide from the second overlapping probe / analyte complex;
(J) a first reporter polynucleotide released from the first overlapping probe / analyte complex and a second reporter polynucleotide released from the second overlapping probe / analyte complex as in step (e) The presence of the polynucleotide analyte in the sample is determined by detecting the presence of at least both of 下記の過程（ｋ）及び（ｌ）をさらに含む請求項１４記載の方法：
（ｋ）過程（ｄ）の後に放出されたレポーターポリヌクレオチドの存在量に比べて、放出されたレポーターポリヌクレオチドの存在量が少なくとも約１桁増加するまで請求項２記載の過程（ｆ）〜（ｉ）の操作を反復することによって、増幅された量の放出レポーターポリヌクレオチドを存在させる；
（ｌ）過程（ｅ）の場合のように、増幅された量の放出レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。 The method of claim 14, further comprising the following steps (k) and (l):
(K) Steps (f) to (f) of Claim 2 until the amount of reporter polynucleotide released is increased by at least about an order of magnitude compared to the amount of reporter polynucleotide released after step (d). The amplified amount of released reporter polynucleotide is present by repeating the procedure of i);
(L) Determine the presence of the polynucleotide analyte in the sample by detecting the presence of an amplified amount of released reporter polynucleotide, as in step (e). 方法が、３’末端と５’末端が請求項１３の定義とは逆転する下記の要件（ａ）〜（ｅ）によって規定される鏡像法である請求項１４記載の方法：
（ａ）基体は、プローブポリヌクレオチドの隣接位の３’末端に隣接して結合する。
（ｂ）第１プローブ／被検体複合体の遠位の末端はポリヌクレオチド被検体を含み、該被検体は遠位へ延びて平滑な遠位の３’−末端（１）又は突出する遠位の３’−末端（２）を形成する。
（ｃ）エキソヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合した後、ＤＮＡ重複体の５’末端鎖の選択的加水分解を含む５’−対−３’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）この方法は、プローブ／被検体の５’末端ストランドを加水分解してポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを放出するために有効な条件を維持することを含む。
（ｅ）この方法は、エキソヌクレアーゼによる５’−対−３’加水分解によって放出されるレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定することを含む。 The method according to claim 14, wherein the method is a mirror image method defined by the following requirements (a) to (e) wherein the 3 'end and the 5' end are reversed from the definition of claim 13:
(A) The substrate binds adjacent to the adjacent 3 ′ end of the probe polynucleotide.
(B) The distal end of the first probe / analyte complex includes a polynucleotide analyte, the analyte extending distally to a smooth distal 3′-end (1) or protruding distal The 3′-end (2) of
(C) Exonuclease has 5′-to-3 ′ exo-deoxyribonuclease activity including selective hydrolysis of the 5 ′ end strand of the DNA overlap after specific binding to double-stranded DNA.
(D) The method comprises maintaining conditions effective to hydrolyze the 5 'terminal strand of the probe / analyte to release the polynucleotide analyte and at least the first reporter polynucleotide.
(E) The method includes measuring the presence of a polynucleotide analyte in a sample by detecting the presence of a reporter polynucleotide released by 5′-to-3 ′ hydrolysis by an exonuclease. 過程（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素（ａ）及び（ｂ）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項１３記載の方法：
（ａ）少なくとも１種の電気的特性を有する少なくとも１つのセンサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、レポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ、並びに
（ｂ）少なくとも１つの電極に接続されると共に、検出プローブと少なくともレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因するセンサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化を測定するような構造を有する電子的測定用回路部品。 The method according to claim 13, wherein the detection of the reporter polynucleotide in step (e) is performed by operating an electronic sensor system comprising the following components (a) and (b):
(A) at least one sensor platform having at least one electrical characteristic comprising the following components (i) to (iv):
(I) substrate,
(Ii) at least one electrode disposed adjacent to the substrate;
(Iii) at least one nanostructured element disposed adjacent to the substrate and electrically connected to the electrode; and (iv) at least one detection probe in functional communication with the nanostructured element. The detection probe comprising a detection polynucleotide having at least one nucleotide sequence complementary to the corresponding nucleotide sequence of the reporter polynucleotide and having a structure that binds to at least the first reporter polynucleotide; and (B) an electronic measuring circuit connected to at least one electrode and having a structure for measuring a change in at least one electrical characteristic of the sensor platform due to the binding of the detection probe and at least the reporter polynucleotide; parts. 過程（ｂ）における第１プローブ／被検体複合体の形成後の下記の過程をさらに含む請求項１３記載の方法：
（ｍ）第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させ、
（ｎ）その後の過程を、試料とは異なる１種又は複数種の媒体中でおこなう。 The method of claim 13, further comprising the following step after formation of the first probe / analyte complex in step (b):
(M) separating the sample from the first probe / analyte complex;
(N) The subsequent process is performed in one or more types of media different from the sample. 過程（ｎ）における試料の分離後の下記の過程（ｏ）をさらに含む請求項１８記載の方法：
（ｏ）過程（ｐ）の前に、第１プローブ／被検体複合体をすすぐ。 The method of claim 18, further comprising the following step (o) after separation of the sample in step (n):
(O) Rinse the first probe / analyte complex prior to step (p). 過程（ａ）における少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給することが複数のプローブ集合体を供給することを含み、
（i）各々のプローブ集合体の基体が、（１）複数のプローブ集合体の別のプローブ集合体と共通の基体であるか、又は（２）複数のプローブ集合体の別のプローブ集合体の基体とは異なる基体であり、
（ii）複数のプローブ集合体が、試料中に存在する被検体であるポリヌクレオチド分子の実質的な量の分子が過程（ｂ）の実施において結合して対応する複数のプローブ／被検体複合体を形成するために十分である。 Providing at least one first probe assembly in step (a) comprises providing a plurality of probe assemblies;
(I) The substrate of each probe assembly is (1) a substrate common to another probe assembly of the plurality of probe assemblies, or (2) another probe assembly of the plurality of probe assemblies. A substrate different from the substrate,
(Ii) A plurality of probe / analyte complexes in which a substantial amount of polynucleotide molecules, which are analytes present in a sample, are combined in the execution of step (b). Is sufficient to form １よりも多い複数のプローブ集合体が共通の基体を含む請求項１８記載の方法。   19. The method of claim 18, wherein more than one probe assembly includes a common substrate. 基体が磁気ビーズを含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該ビーズに磁気的な作用を及ぼすことを含む請求項１８記載の方法。   19. The method of claim 18, wherein the substrate contains magnetic beads and the step of separating the sample from the first probe / analyte complex in step (m) includes magnetically acting on the beads. 基体が荷電種を含む粒子を含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該粒子に電気泳動的な作用を及ぼすことを含む請求項１８記載の方法。   19. The method of claim 18, wherein the substrate contains particles containing charged species, and the step of separating the sample from the first probe / analyte complex in step (m) includes electrophoretic effects on the particles. Method. 基体が選択されたサイズを有する粒子を含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、試料から該粒子を濾過することを含む請求項１８記載の方法。   The method of claim 18, wherein the substrate contains particles having a selected size, and the step of separating the sample from the first probe / analyte complex in step (m) comprises filtering the particles from the sample. . 基体が表面を有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該表面に対して試料を流動させることを含む請求項１８記載の方法。   19. The method of claim 18, wherein the substrate has a surface and the step of separating the sample from the first probe / analyte complex in step (m) comprises flowing the sample against the surface. 表面が微少量な液状収容物の少なくとも一部を含む請求項２５記載の方法。   26. The method of claim 25, wherein the surface comprises at least a portion of a small amount of liquid containment. 第１プローブ集合体が、過程（ｄ）で放出される複数のレポーターポリヌクレオチドを含む請求項１３記載の方法。   14. The method of claim 13, wherein the first probe assembly comprises a plurality of reporter polynucleotides released in step (d). 過程（ｃ）の前に、試料を処理することによって、試料中に含まれるエキソヌクレアーゼを不活性化するか、又は該酵素を除去する過程をさらに含む請求項１３記載の方法。   14. The method of claim 13, further comprising inactivating or removing the exonuclease contained in the sample by treating the sample prior to step (c). 試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）請求項１３に規定された第１プローブ集合体であって、第１型のレポーターポリヌクレオチド及び第１被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第１プローブ集合体を供給し、
（ｂ）請求項１に規定された第２プローブ集合体であって、第２型のレポーターポリヌクレオチド及び第２被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）請求項１記載の過程（ｂ）〜（ｄ）を実行することによって、第１被検体が存在するときには試料中の第１被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第１型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、第２被検体が存在するときには試料中の第２被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第２型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、
（ｄ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第１型のレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することにより、試料中の第１被検ポリヌクレオチドの存在を決定し、
（ｅ）過程（ｄ）における第１型のレポーターポリヌクレオチドの検出とは異なる検出であって、エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第２型のレポーターポリヌクレオチドの存在の検出により、試料中の第２被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。 A method for detecting and distinguishing a plurality of test polynucleotide species in a sample, comprising the following steps (a) to (e):
(A) A first probe assembly as defined in claim 13, wherein the capture is complementary to a target nucleotide sequence specific for a first type reporter polynucleotide and a first test polynucleotide species. Providing the first probe assembly comprising a nucleotide sequence;
(B) a second probe assembly as defined in claim 1, wherein the capture is complementary to a target nucleotide sequence specific for a second type reporter polynucleotide and a second test polynucleotide species. Providing at least one second probe assembly comprising a nucleotide sequence;
(C) performing the steps (b) to (d) according to claim 1, so that when the first analyte is present, the first type of the first analyte in response to the presence of the first analyte polynucleotide species in the sample Releasing a reporter polynucleotide species and, when a second analyte is present, releasing a second type of reporter polynucleotide species in response to the presence of the second analyte polynucleotide species in the sample;
(D) determining the presence of the first test polynucleotide in the sample by detecting the presence of the first type reporter polynucleotide released by hydrolysis with exonuclease;
(E) detection different from the detection of the first type reporter polynucleotide in step (d), wherein the presence of the second type reporter polynucleotide released by hydrolysis with exonuclease is detected in the sample; The presence of the second test polynucleotide is determined. 過程（ｄ）及び（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素１）〜３）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項２９記載の方法：
１）少なくとも１種の電気的特性を有する第１センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第１センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
２）少なくとも１種の電気的特性を有する第２センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第２センサープラットホーム：
（i）基体であって、（１）第１センサープラットホームと共通の基体又は（２）第１センサープラットホームの基体とは異なる基体である該基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
３）第１センサープラットホームと第２センサープラットホームの少なくとも１つの電極に接続されると共に、下記の機能（i）及び（ii）を有するような構造を有する電子的測定用回路部品：
（i）検出プローブと少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第１センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の少なくとも第１測定を行う；
（ii）該第１測定とは異なる第２測定であって、検出プローブと少なくとも第２型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第２センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の第２測定を少なくとも行う。 30. The method of claim 29, wherein the detection of the reporter polynucleotide in steps (d) and (e) is performed by operating an electronic sensor system comprising the following components 1) -3):
1) A first sensor platform having at least one electrical characteristic and comprising the following components (i) to (iv):
(I) substrate,
(Ii) at least one electrode disposed adjacent to the substrate;
(Iii) at least one nanostructured element disposed adjacent to the substrate and electrically connected to the electrode; and (iv) at least one detection probe in functional communication with the nanostructured element. And having at least one nucleotide sequence complementary to the corresponding nucleotide sequence of the first type reporter polynucleotide and having a structure that binds to at least the first type reporter polynucleotide. The detection probe comprising a detection polynucleotide;
2) A second sensor platform having at least one electrical characteristic and comprising the following components (i) to (iv):
(I) a substrate, (1) a substrate common to the first sensor platform, or (2) the substrate different from the substrate of the first sensor platform,
(Ii) at least one electrode disposed adjacent to the substrate;
(Iii) at least one nanostructured element disposed adjacent to the substrate and electrically connected to the electrode; and (iv) at least one detection probe in functional communication with the nanostructured element. And having at least one nucleotide sequence complementary to the corresponding nucleotide sequence of the first type reporter polynucleotide and having a structure that binds to at least the first type reporter polynucleotide. The detection probe comprising a detection polynucleotide;
3) Electronic measurement circuit components connected to at least one electrode of the first sensor platform and the second sensor platform and having a structure having the following functions (i) and (ii):
(I) making at least a first measurement of a change in at least one electrical property of the first sensor platform due to binding of the detection probe to at least a first type reporter polynucleotide;
(Ii) a second measurement different from the first measurement, wherein a second change in at least one electrical property of the second sensor platform due to binding of the detection probe and at least a second type reporter polynucleotide; Take at least a measurement. 試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）請求項１６に規定された第１プローブ集合体であって、第１型のレポーターポリヌクレオチド及び第１被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第１プローブ集合体を供給し、
（ｂ）請求項４に規定された第２プローブ集合体であって、第２型のレポーターポリヌクレオチド及び第２被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）請求項４記載の過程（ｂ）〜（ｄ）を実行することによって、試料中の第１被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第１型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、試料中の第２被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第２型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、
（ｄ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第１型のレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することにより、試料中の第１被検ポリヌクレオチドの存在を決定し、
（ｅ）過程（ｄ）における第１型のレポーターポリヌクレオチドの検出とは異なる検出であって、エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第２型のレポーターポリヌクレオチドの存在の検出により、試料中の第２被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。 A method for detecting and distinguishing a plurality of test polynucleotide species in a sample, comprising the following steps (a) to (e):
(A) a first probe assembly as defined in claim 16, wherein the capture is complementary to a target nucleotide sequence specific for a first type reporter polynucleotide and a first test polynucleotide species. Providing the first probe assembly comprising a nucleotide sequence;
(B) a second probe assembly as defined in claim 4, wherein the capture is complementary to a target nucleotide sequence specific for a second type reporter polynucleotide and a second test polynucleotide species. Providing at least one second probe assembly comprising a nucleotide sequence;
(C) releasing the first type of reporter polynucleotide species in response to the presence of the first test polynucleotide species in the sample by performing steps (b)-(d) of claim 4; Releasing a second type of reporter polynucleotide species in response to the presence of a second test polynucleotide species in the sample;
(D) determining the presence of the first test polynucleotide in the sample by detecting the presence of the first type reporter polynucleotide released by hydrolysis with exonuclease;
(E) detection different from the detection of the first type reporter polynucleotide in step (d), wherein the presence of the second type reporter polynucleotide released by hydrolysis with exonuclease is detected in the sample; The presence of the second test polynucleotide is determined. 過程（ｄ）及び（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素１）〜３）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項３１記載の方法：
（Ａ）少なくとも１種の電気的特性を有する第１センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第１センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
２）少なくとも１種の電気的特性を有する第２センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第２センサープラットホーム：
（i）基体であって、（１）第１センサープラットホームと共通の基体又は（２）第１センサープラットホームの基体とは異なる基体である該基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
３）第１センサープラットホームと第２センサープラットホームの少なくとも１つの電極に接続されると共に、下記の機能（i）及び（ii）を有するような構造を有する電子的測定用回路部品：
（i）検出プローブと少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第１センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の少なくとも第１測定を行う；
（ii）該第１測定とは異なる第２測定であって、検出プローブと少なくとも第２型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第２センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の第２測定を少なくとも行う。 32. The method according to claim 31, wherein the detection of the reporter polynucleotide in steps (d) and (e) is carried out by operating an electronic sensor system comprising the following components 1) to 3):
(A) A first sensor platform having at least one electrical characteristic and comprising the following components (i) to (iv):
(I) substrate,
(Ii) at least one electrode disposed adjacent to the substrate;
(Iii) at least one nanostructured element disposed adjacent to the substrate and electrically connected to the electrode; and (iv) at least one detection probe in functional communication with the nanostructured element. And having at least one nucleotide sequence complementary to the corresponding nucleotide sequence of the first type reporter polynucleotide and having a structure that binds to at least the first type reporter polynucleotide. The detection probe comprising a detection polynucleotide;
2) A second sensor platform having at least one electrical characteristic and comprising the following components (i) to (iv):
(I) a substrate, (1) a substrate common to the first sensor platform, or (2) the substrate different from the substrate of the first sensor platform,
(Ii) at least one electrode disposed adjacent to the substrate;
(Iii) at least one nanostructured element disposed adjacent to the substrate and electrically connected to the electrode; and (iv) at least one detection probe in functional communication with the nanostructured element. And having at least one nucleotide sequence complementary to the corresponding nucleotide sequence of the first type reporter polynucleotide and having a structure that binds to at least the first type reporter polynucleotide. The detection probe comprising a detection polynucleotide;
3) Electronic measurement circuit components connected to at least one electrode of the first sensor platform and the second sensor platform and having a structure having the following functions (i) and (ii):
(I) making at least a first measurement of a change in at least one electrical property of the first sensor platform due to binding of the detection probe to at least a first type reporter polynucleotide;
(Ii) a second measurement different from the first measurement, wherein a second change in at least one electrical property of the second sensor platform due to binding of the detection probe and at least a second type reporter polynucleotide; Take at least a measurement. 試料中の被検ポリヌクレオチドの存在に応答することによって代表的な標的オリゴヌクレオチドを増幅して検出する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）被検ポリヌクレオチドの第１標的配列部分とハイブリッド形成するような構造を有すると共に、第１の代表的な標的オリゴヌクレオチド種を含む第１の重複オリゴヌクレオチドアンプリファイア集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｂ）被検ポリヌクレオチドの第２標的配列部分とハイブリッド形成するような構造を有すると共に、第２の代表的な標的オリゴヌクレオチド種を含む第２の重複オリゴヌクレオチドアンプリファイア集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）配列のハイブリッド形成を促進するために有効な条件下において、第１アンプリファイア集合体と第２アンプリファイア集合体を被検ポリヌクレオチドと接触させることによって、第１アンプリファイア集合体及び第２アンプリファイア集合体の少なくとも一部分をそれぞれ被検ポリヌクレオチドの第１標的配列部分及び第２標的配列部分とハイブリッド形成させることにより、少なくとも１つのアンプリファイア／被検体複合体を形成させ、
（ｄ）ヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、ヌクレアーゼを用いて少なくとも１つのアンプリファイア／被検体複合体を処理することによって、第１及び第２の代表的な標的オリグヌクレオチド種の少なくとも１つを、対応するアンプリファイア集合体とアンプリファイア／被検体複合体から放出させ、
（ｅ）少なくとも放出された代表的な標的オリゴヌクレオチソ種の存在を検出することによって、試料中の被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。 A method of amplifying and detecting a representative target oligonucleotide by responding to the presence of a test polynucleotide in a sample, comprising the following steps (a) to (e):
(A) at least one first overlapping oligonucleotide amplifier assembly having a structure capable of hybridizing with a first target sequence portion of a test polynucleotide and comprising a first representative target oligonucleotide species Supply
(B) at least one second overlapping oligonucleotide amplifier assembly having a structure that hybridizes with the second target sequence portion of the test polynucleotide and comprising a second representative target oligonucleotide species Supply
(C) contacting the first amplifier assembly and the second amplifier assembly with the test polynucleotide under conditions effective to promote hybridization of the sequence; Forming at least one amplifier / analyte complex by hybridizing at least a portion of the two amplifier assemblies with a first target sequence portion and a second target sequence portion, respectively, of the test polynucleotide;
(D) first and second representative target oligonucleotide species by treating the at least one amplifier / analyte complex with the nuclease under conditions effective to promote nuclease activity; At least one of the following from the corresponding amplifier assembly and amplifier / analyte complex;
(E) determining the presence of the test polynucleotide in the sample by detecting the presence of at least the released representative target oligonucleotide species. 下記の特徴１）及び２）を有する請求項３３記載の方法：
１）過程（ａ）における第１アンプリファイアポリヌクレオチド集合体が下記の構成要素（i）及び（ii）を含む：
（i）隣接する５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つの第１アンプリファイアポリヌクレオチドであって、ａ）被検ポリヌクレオチドの対応する標的配列部分（Ｂ）に対して相補的な少なくとも１つの遠位の捕獲配列部分（Ｂ’）、及びｂ）該捕獲配列部分（Ｂ’）とは異なる隣接する捕獲配列部分（Ａ’）であって、被検ポリヌクレオチドの対応する標的配列部分（Ａ）に対して相補的な少なくとも１つの該隣接捕獲配列部分を含む少なくとも１つの該第１アンプリファイアポリヌクレオチド、及び
（ii）隣接する３’−末端ヌクレオチドと遠位の５’−末端ヌクレオチドを含む第１コンパニオンポリヌクレオチドであって、第１アンプリファイアポリヌクレオチドの隣接捕獲配列部分（Ａ’）に対して相補的であると共に該隣接捕獲部分とハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列部分（Ａ''）を含む少なくとも１つの該第１コンパニオンポリヌクレオチド；
２）過程（ｂ）における第２アンプリファイア集合体が下記の構成要素（i）及び（ii）を含む：
（i）隣接する５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む第２アンプリファイアポリヌクレオチドであって、ａ）第１アンプリファイアポリヌクレオチドの捕獲配列部分（Ａ’）の配列を実質的に有する少なくとも１つの遠位の捕獲配列部分、及びｂ）該遠位の捕獲配列部分とは異なる隣接する捕獲配列部分であって、第１アンプリファイアポリヌクレオチドの捕獲配列部分を実質的に含む該隣接捕獲配列部分を含む少なくとも１つの該第２アンプリファイアポリヌクレオチド、及び
（ii）隣接する３’−末端ヌクレオチドと遠位の５’−末端ヌクレオチドを含む第２コンパニオンポリヌクレオチドであって、第２アンプリファイアポリヌクレオチドの隣接捕獲配列部分に対して相補的であると共に該隣接捕獲部分とハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列部分（Ｂ''）を含む少なくとも１つの該第２コンパニオンポリヌクレオチド。 34. A method according to claim 33 having the following features 1) and 2):
1) The first amplifier polynucleotide assembly in step (a) comprises the following components (i) and (ii):
(I) at least one first amplifier polynucleotide comprising an adjacent 5′-terminal nucleotide and a distal 3′-terminal nucleotide, wherein a) against the corresponding target sequence portion (B) of the test polynucleotide And at least one distal capture sequence portion (B ′) that is complementary to and b) an adjacent capture sequence portion (A ′) that is different from the capture sequence portion (B ′), comprising: At least one first amplifier polynucleotide comprising at least one adjacent capture sequence portion complementary to a corresponding target sequence portion (A), and (ii) adjacent 3′-terminal nucleotide and distal 5 '-First companion polynucleotide comprising a terminal nucleotide, complementary to the adjacent capture sequence portion (A') of the first amplifier polynucleotide At least one of the first companion polynucleotide comprising said adjacent capture moiety and at least one target sequence portion hybridizes (A '') with certain;
2) The second amplifier assembly in step (b) includes the following components (i) and (ii):
(I) a second amplifier polynucleotide comprising an adjacent 5′-terminal nucleotide and a distal 3′-terminal nucleotide, wherein a) the sequence of the capture sequence portion (A ′) of the first amplifier polynucleotide is substantially And b) an adjacent capture sequence portion that is different from the distal capture sequence portion and substantially comprises the capture sequence portion of the first amplifier polynucleotide. At least one second amplifier polynucleotide comprising a capture sequence portion; and (ii) a second companion polynucleotide comprising an adjacent 3'-terminal nucleotide and a distal 5'-terminal nucleotide, wherein the second amplifier polynucleotide Complementary to and adjacent to the adjacent capture sequence portion of the nucleotide. At least one of the second companion polynucleotide comprising at least one target sequence portion (B '') to form. 試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別するためのアレイシステムであって、下記の構成要素（ａ）〜（ｄ）を具備する該アレイシステム：
（ａ）レポータープローブ及び／又はアンプリファイアと１種又は複数種の被検体種を含有すると推定される試料とを反応させるために適合した構造を有する反応セル、
（ｂ）レポーター及び／又は合成標的の少なくとも１つを精製するために、該反応セル又は別のセルの内部に配設された少なくとも１つの精製機構、
（ｃ）本願明細書に記載のナノ電子センサーのアレイ又はマトリックスであって、各々のセンサーが、複数の被検体から選択された１種を代表するレポーター又は合成標的に感知する認識材料（例えば、オリゴヌクレオチド相補的オリゴヌクレオチドを含有する検出プローブ）を含む該アレイ又はマトリックス。
（ｄ）試料中に複数の被検体が存在すると推定されたとしても、各々のセンサーに対して得られる信号から測定を行うような構造を有する測定用回路部品。 An array system for detecting and distinguishing a plurality of test polynucleotide species in a sample, the array system comprising the following components (a) to (d):
(A) a reaction cell having a structure adapted for reacting a reporter probe and / or amplifier with a sample presumed to contain one or more analyte species,
(B) at least one purification mechanism disposed within the reaction cell or another cell to purify at least one of the reporter and / or synthetic target;
(C) an array or matrix of nanoelectronic sensors as described herein, wherein each sensor senses a reporter or synthetic target representative of one selected from a plurality of analytes (eg, An array or matrix comprising detection probes containing oligonucleotide complementary oligonucleotides).
(D) A measurement circuit component having a structure in which measurement is performed from a signal obtained for each sensor even if it is estimated that a plurality of analytes are present in the sample. 試料中の被検体を検出する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）選択されたヌクレアーゼを供給し、
（ｂ）被検体の標的部分へ結合するように適合した捕獲オリゴヌクレオチド配列及び被検体を代表するレポーターオリゴヌクレオチド配列を含むプローブ集合体を少なくとも１つ供給し（この場合、レポーターオリゴヌクレオチド配列と捕獲オリゴヌクレオチド配列が二重鎖部分を有する重複形態で供給され、該重複形態が単離においてヌクレアーゼへ提供されたときにヌクレアーゼによる分解に対して比較的高い耐性を示すような構造を有し、また、該重複形態が、捕獲オリゴヌクレオチド配列が被検体の標的部分へ結合して被検体／プローブ複合体を形成する形態中においてヌクレアーゼへ提供されたときにヌクレアーゼによる分解作用を比較的受けやすい構造を有し、さらに、ヌクレアーゼによる分解は、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチド配列が放出されるように十分に行われる）、
（ｃ）被検体の標的部分への捕獲オリゴヌクレオチド配列の結合を促進するために有効な条件下において、プローブ集合体を被検体と接触させることによって、被検体／プローブ複合体を形成させ、
（ｄ）ヌクレアーゼの活性を促進させるために有効な条件下において、被検体／プローブ複合体を被検体とヌクレアーゼと接触させることによって、プローブ集合体の二重鎖部分を分解させ、これによって、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチド配列を放出させ、
（ｅ）少なくとも放出されたレポーターオリゴヌクレオチド配列の存在を検出することによって、試料中の被検体の存在を測定する。 A method for detecting an analyte in a sample, comprising the following steps (a) to (e):
(A) supplying a selected nuclease;
(B) providing at least one probe assembly comprising a capture oligonucleotide sequence adapted to bind to a target portion of the analyte and a reporter oligonucleotide sequence representative of the analyte (in this case, the reporter oligonucleotide sequence and capture The oligonucleotide sequence is provided in an overlapping form having a double-stranded portion, and has a structure that exhibits a relatively high resistance to degradation by a nuclease when the overlapping form is provided to the nuclease in isolation; The overlapping form is relatively susceptible to degradation by the nuclease when provided to the nuclease in a form in which the capture oligonucleotide sequence binds to the target portion of the analyte to form the analyte / probe complex. In addition, nuclease degradation can occur from the analyte / probe complex. Is sufficiently performed so reporter oligonucleotide sequence is released even without),
(C) forming an analyte / probe complex by contacting the probe assembly with the analyte under conditions effective to promote binding of the capture oligonucleotide sequence to the target portion of the analyte;
(D) contacting the analyte / probe complex with the analyte and the nuclease under conditions effective to promote nuclease activity, thereby degrading the duplex portion of the probe assembly, thereby Releasing at least the reporter oligonucleotide sequence from the analyte / probe complex;
(E) determining the presence of the analyte in the sample by detecting the presence of at least the released reporter oligonucleotide sequence. 被検体がポリヌクレオチドを含有し、捕獲配列が、被検体の対応する標的配列に対して相補的な配列を含む請求項３６記載の方法。   38. The method of claim 36, wherein the analyte contains a polynucleotide and the capture sequence comprises a sequence that is complementary to the corresponding target sequence of the analyte. 被検体が非ヌクレオチド生体分子を含有し、捕獲配列が、被検体の標的部分に対して特異的な結合能を有するアプタマーを含み、生体分子へアダプターを結合させる過程には、プローブ集合体の二重鎖部分をヌクレアーゼによる分解作用に付すことによって、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチドを放出させるようにアプタマーを変化させることが含まれる請求項３６記載の方法。   In the process in which the analyte contains a non-nucleotide biomolecule, the capture sequence includes an aptamer having a specific binding ability to the target portion of the analyte, and the adapter is bound to the biomolecule, 37. The method of claim 36, comprising altering the aptamer to release at least a reporter oligonucleotide from the analyte / probe complex by subjecting the heavy chain portion to a nuclease degradation action.

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