JP2009530308A - 免疫が抑制された患者のための免疫療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｔリンパ球減少症、１つ以上の樹状細胞機能欠陥、例えば、リンパ節洞組織球増殖症に関連するもの、および／または１つ以上の単球機能欠陥、例えば、ＮＣＭに対する皮膚試験陰性に関連するものによって特徴づけられる細胞免疫不全を処置するための天然サイトカイン混合物（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）（ＮＣＭ）の組成物を提供する。本発明は、本発明のＮＣＭを用いて、これらの細胞免疫不全を処置する方法を包含する。本発明の組成物および方法は、ガンのような細胞免疫不全に関連する疾患の処置に有用である。また、化学的なインヒビターおよび非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＩＤ）を含む腫瘍誘発性の免疫抑制を逆転させるための組成物および方法も提供される。本発明はまた、ガン患者における処置の転帰を予想するためのＮＣＭを含む診断用皮膚試験も提供する。

Description

発明の背景
１．技術分野
本発明は、細胞免疫不全を処置するための組成物および方法に関する。さらに詳細には、本発明は、Ｔリンパ球減少症、１つ以上の樹状細胞機能欠陥、例えば、リンパ節洞組織球増殖症に関連するもの、および／または１つ以上の単球機能欠陥、例えば、陰性のＣＭＩ（細胞媒介性免疫）皮膚試験に関連するものによって特徴づけられる細胞免疫不全を処置するための組成物および方法に関する。本発明の組成物および方法は、好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８，ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含む、天然サイトカイン混合物（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）（ＮＣＭ）を含み、そしてガンおよび細胞免疫不全によって特徴付けられる他の疾患状態の処置に有用である。

本発明の別の実施形態は、例えば、ガンの処置における、腫瘍誘発性の免疫抑制を逆転させるための組成物および方法に関しており、これは化学インヒビター（ＣＩ）、好ましくは、シクロホスファミド（ＣＹ）および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、好ましくはインドメタシン（ＩＮＤＯ）を含む。腫瘍誘発性の免疫抑制を逆転させるための本発明の組成物および方法は、さらにＮＣＭを含んでもよい。

本発明はまた、診断用の皮膚試験も提供し、この試験は、本発明のＮＣＭを含んでおり、手術に対する応答、全患者生存、再発までの時間および死亡までの時間を含むガン患者における処置転帰を予測する。本発明の方法は、ガン患者に対する皮内へのＮＣＭの投与を包含し、ここでの皮膚試験陰性は、ＮＣＭに対する無応答性を示し、そして手術に対する患者の応答の不全、全患者生存、再発時間および死亡時間を予測する。

２．背景技術
細胞免疫不全とは、身体が有害な抗原から自身を有効に防御できない、免疫応答の不全である。この状態における免疫系は、効率的に無効にされる。このような不全は、例えば、薬物処置による、薬物誘発性であっても、例えば、ＡＩＤＳなどにおけるウイルス誘発性であっても、またはガンのような疾患状態によって誘発されてもよい。実際には、細胞免疫不全は、ガン患者に共通する。身体は腫瘍抗原に対して防御できず、従って腫瘍が増殖することおよび可能性としては転移することを可能にする。

細胞免疫不全は、ガン関連であってもなくても、Ｔ細胞、樹状細胞および／または単球機能欠陥に起因し得る。例えば、１つ以上のＴ細胞機能欠陥は、Ｔリンパ球減少、血中の低Ｔ細胞レベルによって特徴付けられる細胞免疫不全および既存のリンパ球の機能障害が根底にあると考えられる。現在まで、Ｔリンパ球減少を処置する方法は一般に認められては、すなわち臨床的に承認されてはいない。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）の場合には、その状態が先天性であろうと、放射線照射誘発性であろうと、化学療法誘発性であろうと、骨髄移植（胸腺移植を伴う場合とそうでない場合がある）が用いられる。組み換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）は、ＡＩＤＳ患者の可能性のある処置として投与されており、ある程度の効果はあるが、かなりの毒性もある。一般には、高用量のｒｌＬ−２、ｒＩＦＮ−γ、ｒＴＮＦ−αおよび他の単独療法に関連する有効性の限界および有意な毒性は、治療ストラテジーにおけるサイトカインの天然の組み合わせの使用の再考が示唆される。

理想としては、細胞免疫不全、例えば、Ｔリンパ球減少症を処置または克服すること、Ｔ細胞発達および増殖の増強、すなわち、Ｔ細胞再生が所望される。しかし、当該分野では一般に、新規なＴ細胞は成人では生成され得ないままである。例えば、Ｍａｃｋａｌｌらは、小児では一般にＴ細胞を生成する能力を保持しているという事実とは対照的に、成体は新規なＴ細胞を生成できないことを注記している。Ｔリンパ球減少は、ガン患者でしばしばみられるので、Ｍａｃｋａｌｌらは、成体でのガン化学療法および／または放射線療法の後、Ｔ細胞を補充するという試みの問題を考察している。しかし、強い化学療法後の骨髄移植後、新規なＴ細胞が成体で生成され得るといういくつかの証拠がある。

例えば、ガン患者などにおけるＴリンパ球減少を矯正する試みにおいて新規なＴ細胞を生成するために、２つのアプローチが用いられている、１つのアプローチは、ｒＩＬ−２療法であり、既に末梢においてＴ細胞を、すなわち、例えば、血中、リンパ節および脾臓においてＣＤ４５ ＲＯ＋である記憶Ｔ細胞を、増殖しようとする。他のアプローチは、骨髄誘導性の前駆体由来の新規なＴ細胞の胸腺におけるプロセシングを増強する工程を包含する。これは小児では自然に生じるが成人では生じない。これらの新規な細胞は、最近「胸腺移出（ｔｈｙｍｉｃ ｅｍｉｇｒｅｓ）」と呼ばれ、「ナイーブ（ｎａｉｖｅ）」なＴ細胞の表面マーカー、すなわち、ＣＤ４５ ＲＡを有する。本明細書に規定される場合「ナイーブなＴ細胞（ｎａｉｖｅ Ｔ細胞）」という用語は、これらのＴ細胞が抗原に対して曝されていない成体であっても、新規に生成されたＴ細胞に関する。従って、このようなＴ細胞は抗原特異的ではないが、そのＴ細胞上に露出された、腫瘍ペプチドなどの抗原を有する成熟樹状細胞による抗原の提示の際に抗原特異的になり得る。

Ｔリンパ球減少は、Ｔ細胞機能欠陥に起因すると考えられるが、他の細胞免疫不全は、１つ以上の単球または樹状細胞の機能欠陥に由来し得る。単球は、本明細書に規定される場合本質的に、接着性の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と同義であり、骨髄由来マクロファージおよび樹状細胞に対する前駆体である。

単球機能における欠陥は、免疫機能に広範な影響を有し得る。例えば、単球／マクロファージは、細胞媒介性の免疫および炎症の生成に重要な役割を果たすので、単球機能欠陥は、標準的なＣＭＩまたはＤＴＨ試験によって検出される免疫応答のような負のまたは減少した細胞媒介性の免疫応答と相関し得る。従って、単球機能欠陥を矯正することは、例えば、Ｔｈ１細胞増殖性および細胞傷害性の応答を増強することによって、患者において細胞媒介性の免疫応答を促進する。

さらに、樹状細胞（ＤＣ）は、一次免疫応答を確立および制御できる高度に専門化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。未熟なＤＣが末梢組織に存在し、それらは、ＭＨＣＩ／ＩＩ分子の状況内で引き続く提示のために抗原を捕獲およびプロセシングする（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，２０００）。表現型および機能的な変化は、微生物、炎症促進性またはＴ細胞由来刺激、成熟と呼ばれるプロセスとの遭遇の際にＤＣにおいて生じる。一般に、成熟ＤＣは、未熟なＤＣの寛容原性の特性に比較して免疫を誘発することに関連する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００２）。未熟なＤＣに比較した成熟ＤＣの機能的な特徴としては、軽減した食作用活性／細胞内活性およびその後の抗原提示の増大、ＤＣ１抗原の損失およびＣＤ８３抗原発現の獲得、ＭＨＣＩＩ抗原発現の増大、ならびに同時刺激および接着分子、例えばＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ５４の発現の増大が挙げられる（Ｃｅｌｌａ，１９９６；Ｃｅｌｌａ １９９７；Ｓｃｈｎｕｒｒ，２０００；Ｂｅｒｃｈｔｏｉｄ，１９９９）。これらの変化の累積的な結果が、流入領域リンパ器官のＴ細胞領域に遊走する能力を有する成熟ＤＣをもたらし、そこでそれらがナイーブなＴ細胞に遭遇し、抗原および同時刺激分子をＴ細胞に提示する成熟ＤＣが生じ、これが有効な適応的免疫反応を開始する（Ｒａｎｄｏｌｐｈ，２００１；Ｓｏｚｚａｎｉ，１９９８）。

ガン保有宿主におけるＤＣの機能の損傷は、扁平細胞頭頸部癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）（本明細書において以降では「Ｈ＆ＮＳＣＣ」と呼ばれる）、肺、腎細胞、***および結腸直腸の癌（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，１９９７；Ｃｈａｕｘ，１９９６；Ａｌｍａｎｄ，２０００；Ｎｅｓｔｌｅ，１９９７；Ｔａｓ，１９９３；Ｔｈｕｒｎｈｅｒ，１９９６；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，２００２）を含むいくつかのタイプのガンについて確立されている。特徴付けられたＤＣ欠陥によって、Ｔ細胞に対して効率的にかつ首尾よく腫瘍抗原を提示できなくなり、そしてこのような欠陥は、抗原処理機構の成分の下方制御、同時刺激分子の発現の減少および腫瘍に浸潤するＤＣの数の減少を含む種々の方法で特徴付けられ得る（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，２００４；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，１９９７；Ｃｈｏｕｘ，１９９７）。ガン患者はまた、末梢血およびリンパ節における成熟ＤＣの絶対数の減少を示す（Ｈｏｆｆｍａｎｎ，２００２；Ａｌｍａｎｄ，２０００）。腫瘍により共通して分泌される可溶性因子であるＶＥＧＦは、ＤＣにおけるアポトーシスの誘導を増大することが示されており、そしてＨ＆ＮＳＣＣを含む多くの異なるタイプのガンを有する患者の腫瘍組織および末梢血におけるＤＣの数と逆の相関関係にある（Ｌｉｓｓｏｎｉ，２００１；Ｓａｉｔｏ，１９９８；Ｓｍｉｔｈ，２０００）。全体として、ＤＣ機能の欠陥は、現在の免疫療法のストラテジーに負に影響し、そして不成功の臨床的な転帰と相関する。樹状細胞機能的欠陥を矯正することで、成熟樹状細胞の数を増大し、次いでそれが抗原、例えば、腫瘍抗原と相互作用して、患者における細胞媒介性および抗体媒介性の免疫の活性化のために、Ｔ細胞に対してこのような抗原を提示し得る。

例えば、洞組織球増殖症（ＳＨ）は、ガン患者でみられるリンパ節病理であって、腫瘍抗原を取り込んで処理しているが、完全に成熟できず、かつこれらの腫瘍ペプチドをナイーブなＴ細胞に提示する未熟な樹状細胞を含む大組織球のリンパ節における蓄積によって特徴付けられる。ＳＨは、樹状細胞プロセシングにおける欠陥によって生じると考えられる。Ｔ細胞に対する抗原の適切な提示がなければ、これらのＴ細胞は、身体においてそれらの各刺激が通常細胞媒介性および抗体媒介性の免疫をもたらす、Ｔｈ１およびＴｈ２エフェクター細胞を刺激できない。

天然サイトカイン混合物（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）ＮＣＭ（本明細書ではＩＲＸ−２とも呼ばれる）は、高齢の免疫抑制マウスでＴ細胞発達および機能を促進するのに有効であることが、米国特許第５，６９８，１９４号の出願によって以前に示されている。詳細には、ＮＣＭは、胸腺において未熟なＴ細胞の割合を減少させて、成熟Ｔ細胞の割合を増大することが示された。ＮＣＭは、１Ｌ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７を微量に含んだ。

ナイーブなＴ細胞が、成人で生成され得ることも出願人によって最近示されている。ナイーブなＴ細胞の産生を誘導し、そして適切な部位で内因性または外因性の抗原に対してこのナイーブなＴ細胞を曝す１つの方法は、Ｈａｄｄｅｎの米国特許第６，９７７，０７２号に開示されるように、ＮＣＭを低用量シクロホスファミド（ＣＹ）、インドメタシン（ＩＮＤＯ）および亜鉛とともに投与することによって達成され得る。詳細には、ＮＣＭの投与を通じて患者の局所リンパ節で免疫を取り除く（ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）ための方法が開示される。免疫の脱ブロッキング（ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）は、所属リンパ節において未熟樹状細胞の分化および成熟を促進することによって生じ、これによって、得られた成熟樹状細胞によるＴ細胞に対する小ペプチドの提示がＴ細胞の産生を促進することが可能になる。投与されるＮＣＭとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ− １０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。

米国特許第６，９７７，０７２号における出願人のデータによって、本発明のＮＣＭに加えて低用量ＣＹおよびＩＮＤＯが、Ｈ＆ＮＳＣＣを有する患者でＴ細胞前駆体の数およびＴリンパ球のカウントを増大し得ることが示された。Ｈ＆ＮＳＣＣを有する患者のリンパ節はしばしば、Ｔ細胞枯渇および洞組織球増殖症によって識別される。患者のうち９０％より多くが、その処置に応答し、そしてほとんどが、５０％を上回る腫瘍減少であった。予備的なデータによって、Ｈ＆ＮＳＣＣ患者でのＮＣＭによる免疫療法は、未熟なＣＤ８６⁻／８３^＋表現型由来のリンパ節におけるＤＣを活性化および成熟ＣＤ８６^＋／８３^＋ＤＣに変換することが示唆された（Ｈａｄｄｅｎ，２００４）。さらに、ＮＣＭ、ＣＹおよびＩＮＤＯの併用レジメンを用いるこれらのリンパ球減少性のガン患者の処置は、顕著なリンパ球の動員を生じた。分析した場合、これらの患者は、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞（すなわち、ナイーブなＴ細胞）の増大を示した。この併用レジメンは、局所リンパ節での免疫の除去（ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）を示しているが、ＮＣＭ単独、すなわち、ＣＹおよびＩＮＤＯでの処置を伴わないことが、Ｔリンパ球減少によって特徴付けられる細胞免疫不全および／またはリンパ節洞組織球増殖症に関連する樹状細胞機能欠陥を処置し得るか否かを示す、このデータ由来の十分な証拠はなかった。

さらに、現在認められている米国特許出願第１０／６３７，８６９号では、出願人は、本発明のＮＣＭに対する陰性の皮内皮膚試験反応を有するガン患者は臨床的な予後が劣ることを示すデータを示した。しかし、特定数の患者が、ＮＣＭでの処置の際に皮膚試験陰性応答から陽性の反応に変換し、そしてこれらの変換した患者は、改善された臨床的かつ病理学的な応答を示した。ＮＣＭに対する皮膚試験陰性は、患者における単球欠陥を反映し、それによって、細胞媒介性の免疫応答が欠陥し、そしてＮＣＭでの処置は、この機能的欠陥を治療し得ることが示唆された。

従って本発明は、Ｔリンパ球減少症、１つ以上の樹状細胞欠陥、例えばリンパ節洞組織球増殖症に関連するもの、および／または１つ以上の単球機能欠陥、例えば陰性のＮＣＭ皮膚試験に関連するものによって特徴付けられる細胞免疫不全を処置し得るＮＣＭの組成物（ＣＹまたはＩＮＤＯの使用を伴わない）を提供する。本明細書に実証されるとおり、本発明のＮＣＭは、ナイーブなＴ細胞の生成の増大、活性の増大、および樹状細胞の成熟、ならびに活性化の増大および単球／マクロファージの成熟を生じる。

さらに、ガンを有する患者での免疫学的試験は、処置の転帰の予想においては有用性が限られている。多くのタイプの免疫学的研究は、実験に基づいてガンを有する患者での免疫学的欠陥を描写することを補助するが、これらの患者を診断およびモニターするために臨床的に都合よく適用されている試験はわずかである。２つの試験が以下の有用性を証明している。１）リンパ球のカウント、特にＴ細胞およびサブセット、ならびに２）細胞媒介性免疫（ＣＭＩ、遅延型過敏症（ＤＴＨ）とも呼ばれる）の試験としてジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）に対する皮膚反応性。後者の試験は、やっかいであって、免疫および後日のチャレンジを必要とし、そしてもはや臨床的には用いられていない。前者は用いられているが、転帰の予想因子としては強調されない。従って、ガン患者の細胞免疫状態を反映する試験の必要性は大きい。

実際、ＤＴＨまたはＣＭＩの皮膚試験応答を誘発する免疫系の異なる２つ肢がある。すなわち、求心性（入力）肢（ａｆｆｅｒｅｎｔ（ｉｎｐｕｔ）ｌｉｍｂ）および遠心性（出力）肢（ｅｆｆｅｒｅｎｔ（ｏｕｔｐｕｔ）ｌｉｍｂ）である。求心性肢は、抗原または***促進因子（マイトジェン）誘発性Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を包含する。遠心性肢は、サイトカイン誘発性の単球流入、ならびに紅斑および硬結によって測定される炎症をもたらすモノカイン産生を包含する。

１９７０年代には、いくつかのグループがＴ細胞***促進因子であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いる皮膚試験を用いた。ＰＨＡ皮膚試験は、ＤＮＣＢ皮膚試験と同じタイプの情報を得る、すなわち、応答性の患者は、臨床的に健康であり、そして非応答性の患者は健康ではない、と考えられる。しかし、ＰＨＡは応答の両方の肢を刺激し、従って陰性のＰＨＡ皮膚試験は、いくつかの欠陥を反映し得る。すなわち、不十分なＴ細胞、Ｔ細胞の機能抑制、または単球機能の欠陥である。予測的な皮膚試験に用いられ得る他のＴ細胞***促進因子としては、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、例えば、ＯＫＴ３（ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ（登録商標））が挙げられる。

従って、本発明の１つの目標は、遠心性（輸出）肢応答を反映する皮膚試験、すなわち、免疫応答の単球依存性成分を提供することである。従って、ＮＣＭ組成物は、例えば、ガン患者において、処置転帰を予測するための診断皮膚試験としての使用のために提供される。

上記で注記される細胞免疫不全に加えて、ある場合には、Ｔ細胞は、ガン病変によって内因性に抑制される。従って、Ｔ細胞が正常に機能して免疫系を補助し得るようにこの抑制をブロックすることは有利である。これに関して、抗悪性腫瘍薬、シクロホスファミド（ＣＹ）は、高用量では免疫抑制性だが、Ｔサプレッサー細胞を阻害するように機能し、従って、低用量で与えられた場合は、免疫応答を増強することが注記されている（Ｂｅｒｄら；Ｅｈｒｋｅ ＭＪ，２００３）。従って、ＣＹは、免疫抑制の化学的インヒビターとして作用している。ＣＹはガン患者の有効な免疫療法で使用されているが（Ｗｅｂｅｒ Ｊ．，２０００；Ｍｕｒｐｈｙ １９９９；Ｈａｄｄｅｎ，１９９４）、低毒性または無毒性と組み合わせた許容可能な臨床応答を示すデータは現在まで示されていない。さらに、プロスタグランジンは、免疫抑制性であることが公知であるので、プロスタグランジンの合成をブロックする化合物、例えば、非ステロイド系抗炎症剤は、この免疫抑制を阻害するのに有用である。従って、本発明の目標は、例えば、ガン患者において、腫瘍誘発性免疫応答の影響を逆転させるために、化学的インヒビター（ＣＩ）、例えばＣＹを、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と組み合わせて含む組成物を提供することである。
Ｈａｒｔ ＤＮ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ： ｕｎｉｑｕｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｂｌｏｏｄ，９０：３２４５−３２８７（１９８７） Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ Ｐ． Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｄａｎｇｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｆａｍｉｌｙ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２：９９１−１０４５（１９９４） Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＲＭ． Ｔｈｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９：２７１−２９６（１９９１）

発明の要旨
本発明は、Ｔリンパ球減少症、１つ以上の樹状細胞機能欠陥、例えば、リンパ節洞組織球増殖症に関連するもの、および／または１つ以上の単球機能欠陥、例えば、ＮＣＭに対する皮膚試験陰性に関連するものによって特徴づけられる細胞免疫不全を処置するための、ＮＣＭを含む組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ＮＣＭに、好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８，ＩＦＮ−γ（ガンマ）、およびＴＮＦ−α（アルファ）を含む、ＮＣＭに関する。本発明の別の実施形態によれば、ＮＣＭは、さらに、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦを含む。本発明はまた、本発明のＮＣＭを用いて、Ｔリンパ球減少症、１つ以上の樹状細胞機能欠陥、例えば、リンパ節洞組織球増殖症に関連する欠陥、および／または１つ以上の単球機能欠陥、例えば、ＮＣＭに対する皮膚試験陰性に関連する欠陥によって特徴づけられる細胞免疫不全を処置するための方法に関する。

本発明はさらに、例えば、ガンの処置のために、腫瘍誘発性の免疫抑制を逆転させるための有効量の化学インヒビター（ＣＩ）と有効量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とを含む組成物を提供する。このＣＩは、抗悪性腫瘍薬、例えば、アルキル化剤、好ましくは、シクロホスファミド（ＣＹ）、代謝拮抗剤、もしくは抗生物質、または免疫調節剤であってもよい。このＮＳＡＩＤは、インドメタシン（ＩＮＤＯ）、イブプロフェンまたはＣｏｘＩＩインヒビター、例えば、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））およびロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））、またはそれらの組み合わせであってもよい。本発明の組成物は必要に応じて、本発明のＮＣＭを含んでもよい。本発明はまた、本発明のＣＩおよびＮＳＡＩＤ組成物を用いて腫瘍誘発性免疫抑制を逆転させる方法を包含する。

本発明の組成物および方法は、ガンの治療に起因して、またはガン自体の免疫抑制の影響に起因して患者が細胞免疫不全を罹患しているガンの処置に有用であり得る。本発明の化合物および方法はまた、細胞免疫不全、例えば、Ｔリンパ球減少症によって特徴付けられる他の疾患状態、または他の二次的免疫不全、例えば、１つ以上の単球または樹状細胞の機能欠陥によって特徴づけられるものなどの処置に用いられ得る。

本発明の別の実施形態によれば、ＮＣＭを含む組成物は、手術（放射線療法または化学療法のような処置を伴うかまたは伴わない）に対する応答、全患者生存、再発時間および死亡までの時間を含む、ガン患者における処置の転帰を予測するための診断用皮膚試験としての使用のために提供される。本発明のＮＣＭ組成物が、皮内に投与され、そしてＮＣＭに対する応答が決定される方法であって、皮膚試験陰性が、ＮＣＭに対する無応答性を示し、そして化学療法を伴うかまたは伴わない手術に対する患者の応答の不全、全患者生存、再発時間および死亡時間を予測する方法も提供される。

発明の詳細な説明
本発明は、Ｔリンパ球減少症、１つ以上の樹状細胞機能欠陥、例えばリンパ節洞組織球増殖症と関連するもの、および／または１つ以上の単球機能欠陥、例えばＮＣＭに対する皮膚試験陰性と関連する欠陥によって特徴付けられる細胞免疫不全を処置するための、ＮＣＭを含む、好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ（ガンマ）およびＴＮＦ−α（アルファ）を含む組成物に関する。本発明はまた、本発明のＮＣＭを用いて、Ｔリンパ球減少症、１つ以上の樹状細胞機能欠陥、例えばリンパ節洞組織球増殖症に関連するもの、および／または１つ以上の単球欠陥、例えばＮＣＭに対する皮膚試験陰性に関連するものによって特徴付けられる細胞免疫不全を処置する方法に関する。本発明の組成物および方法は、細胞免疫不全、例えば、Ｔリンパ球減少症、リンパ節洞組織球増殖症、ならびに／または単球欠陥および／または樹状細胞の細胞機能欠陥に関連する他の細胞免疫不全を、ガン患者を含む免疫抑制患者において処置するために有用である。

本発明はさらに、腫瘍誘発性の免疫抑制を逆転させるための、有効量の化学インヒビター（ＣＩ）、好ましくはＣＸおよび有効量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、好ましくはＩＮＤＯを含む組成物を提供する。本発明の組成物は必要に応じて本発明のＮＣＭを含んでもよい。本発明はまた、本発明のＣＩおよびＮＳＡＩＤ組成物を用いて、腫瘍誘発性の免疫抑制を逆転させる方法を包含する。これらの組成物および方法は、ガン、または腫瘍誘発性免疫抑制を含む他の疾患を有する患者の処置に有用である。

本発明の別の実施形態によれば、ＮＣＭを含む組成物は、手術に対する応答、全患者生存、再発時間および死亡までの時間を含む、ガン患者における処置転帰を予測するための診断皮膚試験としての用途に提供される。本発明のＮＣＭ組成物が皮内に投与される方法も提供され、そしてＮＣＭに対する応答が決定され、皮膚試験陰性は、ＮＣＭに対する不応答性を示し、そして外科手術（放射線療法の有無）に対する患者の応答の不全、全患者生存、再発時間および死亡までの時間を予測する。本発明の実施形態による組成物および方法は、ガン患者の適切な処置を決定するために有用である。

本明細書において用いる場合、「化学インヒビター（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という用語は、免疫抑制性でなく、そして免疫調節効果を有し、それによって、例えば、免疫抑制／サプレッサー機構を阻害することによって、免疫および／または免疫応答を増大する、化学療法剤（好ましくは低用量で用いられる）を指す。

本明細書において用いる場合、「アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）」という用語は、特定の抗原に対する免疫応答を増強する能力を有する組成物を示す。このような能力は、免疫媒介性の防御の有意な増大によって明らかになる。有効であるには、アジュバントは、抗原の部位またはその部位の近位に送達されなければならない。免疫の増強は代表的には、抗原に対して惹起された抗体の力価における有意な増大（通常は１０倍より大きい）によって明らかになる。細胞性免疫の増強は、陽性の皮膚試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、ＩＦＮ−γもしくはＩＬ−２についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、または腫瘍へのＴ細胞浸潤によって測定され得る（下に記載されるとおり）。

本明細書において用いる場合、「腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、腫瘍に対して免疫応答を誘発し得るタンパク質またはペプチドまたは他の分子を示す。これには、限定はしないが、ＰＳＭＡペプチド、ＭＡＧＥペプチド（Ｓａｈｉｎ，１９９７；Ｗａｎｇ，１９９９）、パピローマウイルスペプチド（Ｅ６およびＥ７）、ＭＡＧＥフラグメント、ＮＹ ＥＳＯ−１または他の類似の抗原を挙げることができる。以前には、これらの抗原は、それらのサイズに基づいて、つまり小さすぎると考えられたため、あるいはそれらがかつて免疫学的特性を欠くと考えられていた（すなわち、それらは、自己抗原とみなされた）ため、患者を処置するのに有効であるとはみなされなかった。。

本明細書において用いる場合、「ＮＣＭ」とは、米国特許第５，６３２，９８３号および同第５，６９８，１９４号に規定されかつ示されるような、天然のサイトカイン混合物を示す。ＮＣＭは、組み換えサイトカインを含んでもよい。要するに、ＮＣＭは、４−アミノキノロン系抗生物質の連続的な存在下で、そして好ましい実施形態ではＰＨＡである、***促進因子の連続的または脈動的な存在とともに調製される。

本発明の１実施形態によれば、Ｔリンパ球減少によって特徴付けられる細胞免疫不全の処置のための組成物および方法が提供される。本実施形態によれば、この目標は、ナイーブなＴ細胞の産生を促進することである。本明細書において用いる場合、「ナイーブな（ｎａｉｅｖｅ）」Ｔ細胞とは、成体においても新たに産生されたＴ細胞であって、抗原に曝されていないＴ細胞である。このようなＴ細胞は非特異的であるが、その上に露出された腫瘍ペプチドのような抗原を有する成熟樹状細胞によって、提示の際には特異的になり得る。米国特許第６，９７７，０７２号では、頭頸部ガンを有する免疫抑制患者への、低用量シクロホスファミドおよびインドメタシンとともにした、ＮＣＭの投与は、これらの患者の血中において、未熟な、ナイーブなＴ細胞（ＣＤ３およびＣＤ４５ ＲＡ抗原を保有する）の増大をもたらすことが、初めて出願人によって示された（例えば、下の実施例１を参照のこと）。これは、成体ヒトが、ナイーブなＴ細胞を生成し得るということの最初の実証の１つである。しかし、ＮＣＭ単独（すなわち、ＣＹおよびＩＮＤＯの投与を伴わない）が、米国特許第６，９７７，０７２号に実証されるように、ＮＣＭ、ＣＹおよびＩＮＤＯの組み合わせの効果を生じ得るか否かは以前には未知であった。

従って、本発明は、ＮＣＭの投与によるＴ細胞リンパ球減少によって特徴付けられる細胞免疫不全を処置するための組成物を提供する。さらに詳細には、本発明のＮＣＭは、６つの重要な成分、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含み、これがナイーブなＴ細胞を生成するように機能する。下の実施例２に提示されるデータが示すとおり、ガン患者に対するＮＣＭのみの投与は、リンパ球カウントの有意な増大を生じ、そして特に、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を増大する。従って、ＮＣＭ単独の投与で、低用量シクロホスファミドおよびインドメタシンと組み合わせたＮＣＭの投与によって以前に得られた所望の効果が達成され得る。

例えば、ガン患者におけるＴリンパ球減少症の処置のための本発明のＮＣＭは、好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを含む。本発明の好ましい実施形態によれば、ＮＣＭは、６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、１５０〜１，２００ｐｃｇ／ｍｌにおよぶ濃度のＩＬ−１；６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、３，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍｌにおよぶ濃度のＩＬ−２；６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍｌにおよぶ濃度のＩＬ−６；６，０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍｌにおよぶ濃度のＩＬ−８；ならびに、それぞれ、２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは、１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍｌにおよぶ濃度のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含む。

組み換えの、天然の、もしくはペグ化サイトカインが用いられてもよく、またはＮＣＭは、組み換え、天然もしくはペグ化のサイトカインの混合物を含んでもよい。このＮＣＭは、他の組み換え、天然もしくはペグ化のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦをさらに含んでもよい。好ましくは、ＩＬ−２当量の４０〜５００単位が用いられる。

本発明の別の実施形態によれば、１つ以上の樹状細胞機能欠陥によって特徴付けられる細胞免疫不全の処置のための組成物が得られる。上で注記されたとおり、樹状細胞は、一次免疫応答を樹立および制御し得る高度に専門化された抗原提示細胞である。例えば、ＤＣは、例えば、末梢組織中で抗原を捕獲して、流入領域二次リンパ器官のＴ細胞領域に遊走し、ここでナイーブなＴ細胞に遭遇して、Ｔ細胞に抗原を提示し、それによって抗原に対する免疫応答を開始する。従って、樹状細胞機能における１つ以上の欠陥は、免疫系に有害な影響を有する。従って、１つ以上の樹状細胞機能欠陥によって特徴付けられる細胞免疫不全を処置するための、ＮＣＭを含む組成物を提供することが本発明の目標である。

本発明の一実施形態によれば、リンパ節洞組織球増殖症によって特徴付けられる細胞免疫不全を処置するための組成物であって、ＮＣＭを含む組成物が提供される。ガン患者において観察されるリンパ節の病理である洞組織球増殖症は、部分的に未熟なＣＤ８３＋、ＣＤ８６− ＤＣの蓄積をともなう、樹状細胞機能欠陥に関連すると考えられる。注記されたとおり、正常な樹状細胞は、感染または免疫の部位で抗原を捕獲し、そして下流のリンパ節に遊走して、ここでこの抗原がナイーブなＴ細胞に提示されて免疫が促進される。ＳＨを有する患者のリンパ節における未熟な樹状細胞は、ナイーブなＴ細胞に対して抗原を効率的に提示できない。従って、本発明の目標は、洞組織球増殖症を、すなわち、例えば、ＳＨを有するガン患者において、樹状細胞成熟の促進によって逆転させることである。

下の実施例３に示されるデータは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６，ｌＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つの重要なサイトカインからなるＮＣＭが、ＤＣ成熟を誘発することを示す。例えば、本発明のＮＣＭは、ＤＣ上で、ＤＣ成熟の重要なマーカーであるＣＤ８３の発現を増大することが示された。さらに詳細には、実施例３に含まれるデータによって、本発明のＮＣＭが、形態学的、表現型的および機能的な基準によって測定した場合、樹状細胞の強力な活性化因子であることが実証される。従って、ＮＣＭは、成熟の指標であるＤＣにおける形態学的変化を促進することが示された。ＮＣＭはまた、ＤＣ細胞表面上のＣＤ１ａ抗原発現を下方制御し、ＤＣ細胞表面上のＣＤ８３およびＭＨＣＩＩ抗原の発現を上方制御し、そしてＤＣ細胞表面上の、Ｔ細胞同時刺激および接着分子、例えば、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）の発現を増大することが示された。さらに、ＮＣＭは、ＤＣの細胞内活性を下方制御し（これは、ＤＣの成熟と一致する）、ＤＣのＴ細胞刺激活性を増強し（ＭＬＲ活性の増大によって実証されるとおり）、そしてＤＣからのＩＬ−１２の産生を増大することが示され、ＩＬ−１２自体が、ナイーブなＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の（Ｔｈ１細胞への）分化ならびに免疫系の細胞成分および食作用性成分の活性化および増殖において必須の因子である。結局、ＮＣＭは、ＤＣのＶＥＧＦ誘発性アポトーシスを減少することが示された。ＮＣＭのこの抗アポトーシス効果は、腫瘍環境内の成熟ＤＣの生存を維持するのに重要な役割を果たし得、これによって、腫瘍抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の長期の抗原提示および活性化が可能になる。

従って、本発明のＮＣＭは、成熟ＤＣの産生を増強する所望の結果を達成するために、単独で、すなわち、前に示唆されているようなＣＹおよびＩＮＤＯでの処置を伴わずに、用いられてもよい。従って、本発明の組成物および方法は、ガン患者で生じるＳＨのような、樹状細胞機能欠陥によって特徴付けられる細胞免疫不全の処置に有用である。このような免疫不全を処置するために投与されるＮＣＭは好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを含む。好ましい実施形態によれば、ＮＣＭは、６つのサイトカインを、先に詳述した濃度範囲で含む。組み換え、天然、またはペグ化のサイトカインが用いられてもよいし、またはＮＣＭは、組み換え、天然、またはペグ化のサイトカインの混合物を含んでもよい。ＮＣＭはさらに、他の組み換え、天然、またはペグ化のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦを含んでもよい。好ましくは、ＩＬ−２当量の４０〜５００単位が用いられる。

本発明の別の実施形態によれば、例えば、患者におけるＮＣＭに対する皮膚試験陰性をもたらす、１つ以上の単球機能欠陥によって特徴付けられる細胞免疫不全の処置のための組成物が提供される。単球は、樹状細胞およびマクロファージの両方に対する前駆体であり、従って、任意の単球機能欠陥は、身体における種々の免疫学的プロセスに負に影響し得る。過去には、ＮＣＭに対する皮膚試験陰性によって、ガン患者における処置に対する臨床応答の乏しさが予測されている。上記のとおり、このような皮膚試験陰性は、単球機能における１つ以上の欠陥を示すと考えられる。以前には、ＮＣＭ、ＣＹおよびＩＮＤＯを組み合わせて処置したＮＣＭ皮膚試験陰性患者の多くが、ＮＣＭ皮膚試験陽性状態に変換されることが示され、このことは、この併用処置が、単球機能欠陥に関連することを示唆している。本明細書において実施例９に提供されるような新規のデータによって、６つの重要なサイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含むＮＣＭ単独、すなわち、ＣＹおよびＩＮＤＯでの処置を伴わないＮＣＭは、この単球機能欠陥を矯正することを担うことが実証される。さらに詳細には、本明細書のデータによって、ＮＣＭ単独で、単球／マクロファージの強力な活性化因子であることが実証される。例えば、ＮＣＭは単球／マクロファージの活性化マーカー、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０を有意に増大する。さらに、ＮＣＭは、ＴＮＦ−αまたはＬＰＳよりも単球／マクロファージの強力な活性化因子であることが示され、そしてＮＣＭは、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の存在下でさえ、細胞を活性化することを継続できた。

従って、本発明の組成物および方法は、単球機能欠陥によって特徴付けられる細胞免疫不全、例えば、ＮＣＭに対する皮膚試験陰性によって特徴付けられる免疫不全の処置に有用である。本発明による単球機能欠陥を処置するために投与されるＮＣＭは好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを含み、そして好ましくは、このサイトカインを上記の濃度範囲で含む。組み換え、天然、またはペグ化のサイトカインが用いられてもよいし、またはＮＣＭはこのようなサイトカインの混合物を含んでもよい。ＮＣＭはさらに、他の組み換え、天然またはペグ化のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦを含んでもよい。好ましくはＩＬ−１２当量の４０〜５００単位が用いられる。

本発明はまた、化学インヒビター（ＣＩ）および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む腫瘍誘発性免疫抑制を逆転させるための組成物および方法を提供する。腫瘍誘発性免疫抑制は、ガン患者における処置の有効性を損なう。Ｔ細胞は、内因性剤によって抑制され得る。免疫抑制を逆転させることは、所望され、そして免疫系が腫瘍細胞を破壊することを可能にする。前に考察されたとおり、抗悪性腫瘍薬ＣＹがＴ細胞抑制をブロックするために投与され得ることが動物モデルによって示されている。しかし、ヒトにおいては今のところ匹敵する首尾よい結果が得られていない。下の実施例４および５によって、ＣＹおよびＮＳＡＩＤのような抗悪性腫瘍薬の組み合わせは相乗的であり、免疫療法の他の形態の影響を増強し得ることが示される。

上記で注記されたとおり、本発明の化学インヒビターは、免疫抑制的でなく（好ましくは低用量で用いられる）、そして、例えば、身体での免疫抑制または抑制機構を阻害することによって、免疫および／または免疫応答を増大するための免疫調節効果を有する、任意の化学療法剤である。好ましい実施形態によれば、ＣＩは抗悪性腫瘍薬であり、これには限定はしないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、および抗生物質が挙げられる。ＣＩはまた、サリドマイドのような免疫調節剤であってもよい。この化学インヒビターはまた、塩または他の複合型であってもよい。

さらなる好ましい実施形態によれば、ＣＩは、アルキル化剤、シクロホスファミドである。アルキル化剤は、あるタイプの抗悪性腫瘍薬であり、極めて反応性であり、そして一般には、ＤＮＡの合成または機能に関与する酵素または基質に対して作用する多機能性の化合物である。一般には、抗悪性腫瘍薬は、細胞***を破壊すること、および活発に増殖している細胞を殺傷することによって増殖を阻害し得る。他の適切なアルキル化剤が本発明において用いられ得る。５つの異なる群のアルキル化剤がある。ナイトロジェン・マスタードとしては、クロラムブシル、クロロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファランおよびウラシル・マスタードが挙げられる。エチレンイミンとしてはチオテパが挙げられる。アルキルスルホネートとしては、ブスルファンが挙げられる。トリアゼンとしては、ダカルバジンおよびテモゾロミドが挙げられる。ニトロソウレアとしては、カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシンが挙げられる。

本発明の化学インヒビターはまた、任意の他の適切な抗悪性腫瘍薬であってもよい。例えば、抗悪性腫瘍薬は、代謝拮抗薬、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、ヒドロキシウレア、イリノテカン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、メトトレキセート、アザチオプリン、クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、チオグアニン、カペシタビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、またはシタラビンであってもよい。

抗悪性腫瘍薬は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの合成を阻害する抗生物質、例えば、塩酸ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、またはエピルビシンであってもよい。

この抗悪性腫瘍薬はさらに、シスプラチン、カルボプラチン、アリトレチノイン（ａｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、アスパラギナーゼ、ペガスパルガーゼ、ミトタン、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、塩酸プロカルバジン、タモキシフェン、トレミフェン、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、テストラクトン、トラスツズマブまたはリツキシマブであってもよい。

ＮＳＡＩＤは好ましくは、インドメタシン（ＩＮＤＯ）であり、これは、ＣｏｘＩおよびＣｏｘＩＩインヒビターの両方である。ＮＳＡＩＤはまた、イブプロフェンであってもまたはＣｏｘＩＩインヒビター、例えば、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））およびロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））、またはその組み合わせであってもよい。

ＣＩおよびＮＳＡＩＤを利用する本発明の組成物および方法は、ガンおよび腫瘍誘発性免疫抑制に関連する他の疾患を処置するために有用である。本発明のＣＩおよびＮＳＡＩＤはまた、本発明のＮＣＭのような、サイトカインと組み合わせて用いられてもよい。ＣＩおよびＮＳＡＩＤの相乗的な効果は、ＮＣＭがもたらす効果に追加する。ＮＣＭは好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを、そして好ましくは上記の濃度で含む。組み換え、天然、ペグ化のサイトカインまたはその組み合わせが用いられてもよく、すなわち、ＮＣＭは、組み換え、天然およびペグ化サイトカインの混合物を含んでもよい。ＮＣＭはさらに、他の組み換え、天然、またはペグ化のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦを含んでもよい。好ましくは、４０〜５００単位のＩＬ−１２当量が用いられる。

本発明のさらに別の実施形態によれば、本発明のＮＣＭは、手術に対する応答、全患者生存、再発時間および死亡までの時間を含む、ガン患者における処置転帰を予測するための診断皮膚試験として用いられ得る。ガンを有する患者での免疫学的試験は、転帰を予測するのにおける有用性は限られていた。上で注記されたとおり、ＰＨＡ皮膚試験は、ガン患者における免疫応答をモニターするために用いられており、すなわち、反応性の患者は、臨床的に良好であり、そして不応答性の患者は臨床的に劣っている。

本発明では、本発明のＮＣＭは、処置転帰を予測するために皮膚試験で用いられる。この皮膚試験は、遠心性の肢応答、すなわち単球依存性成分のみを反映する。米国特許出願第１０／６３７，８６９号および下の実施例５は、本発明のＮＣＭを用いて、ＮＣＭを皮内に投与することによる処置転帰を予測するため、および２４時間内のＮＣＭに対する応答を決定するための診断皮膚試験として考察する。皮膚試験陰性皮膚試験陰性は、ＮＣＭおよび免疫療法に対する不応答性を示しており、そして化学療法の有無による外科手術に対するガン患者の応答の不全を予測する。下に含まれる実施例６および７によって、ＮＣＭ皮膚試験が、ＮＣＭ処置および免疫療法プラス手術±放射線療法に対する応答を予測するだけでなく、全生存、再発時間および死亡までの時間を予測することが実証される。

本発明に従う皮膚試験として投与されるＮＣＭは好ましくは、上記のようなＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを含む。組み換え、天然またはペグ化サイトカインが用いられてもよいし、またはＮＣＭは、このようなサイトカインの混合物を含んでもよい。ＮＣＭはさらに、他の組み換え、天然、またはペグ化のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦを含んでもよい。好ましくは、０．１ｍｌのＮＣＭを、１ｍＬあたりＩＬ−２当量の４０〜５００単位という濃度で用いる。

従って、本発明のＮＣＭは、外科手術に対する応答（放射線療法または化学療法のような処置を伴うかまたは伴わない）、全生存、再発までの時間および死亡までの時間を含むガン患者における処置転帰を予測するための組成物および方法において用いられてもよい。本発明の組成物としては、皮膚試験キットを含むＮＣＭ組成物が挙げられ、このキットは、例えば、ガン患者における処置転帰を予測するための診断皮膚試験における使用のための有効量のＮＣＭを含む。本発明の方法は、本発明のＮＣＭを皮内に投与する工程と、好ましくは２４時間内にＮＣＭに対する応答を決定する工程とを包含し、ここで皮膚試験陰性は、ＮＣＭに対する不応答性を示し、そして化学療法の有無における手術に対する患者の応答の不全、全患者生存、再発までの時間および死亡までの時間を予測する。本発明のこの実施形態に従う組成物および方法は、ガン患者の適切な処置を決定するために有用である。

任意の上記の実施形態について、以下の投与の詳細および／または処置のためのプロトコールが用いられる：
好ましくは、本発明のＮＣＭは、処置されている腫瘍または他の持続性の病変などの病変に対して流入領域リンパ節に流れるリンパ管の周囲に注射される。ガンのような病変に対して局所のリンパ節へ流れるリンパ管への外リンパ投与は重要である。腫瘍周囲注射は、進行してさえ、ほとんど応答を伴わず、従って禁忌である。十（１０）日の注射スキームが適切であり、二十（２０）日の注射プロトコールは臨床的に有効であるが、Ｔｈ１応答を軽減する傾向であり、ガンへのリンパ浸潤によって測定した場合所望のＴｈ２応答よりも低く偏向させる。両側の注射が有効である。根治的頸部廓清術が行われる場合、対側注射が有効である。

本発明の化合物は、手術、放射線療法、化学療法またはそれらの組み合わせの前に投与されても後に投与されてもよい。本発明の化合物は、腫瘍の再発の間に、すなわち、腫瘍が消失したと考えられるかまたは寛解した期間の後に腫瘍増殖が再度生じている期間の間、投与されてもよい。

本発明の化合物（ＮＣＭを含む）は、個々の患者の臨床状態、投与の部位および方法、投与のスケジューリング、患者の年齢、性別および体重を考慮して、外因性または内因性の抗原のいずれかに対して最適の免疫を促進するために投与されかつ投薬される。従って、本明細書における目的のための薬学的に「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、当該分野で公知のとおり、このような考慮によって決定される。この量は、免疫を促進して、例えば、腫瘍減少、腫瘍崩壊、白血球浸潤、遅延性の再発、または生存率の改善、または症状の改善もしくは排除をもたらすのに有効でなければならない。

本発明の方法では、本発明の化合物は、種々の方法で投与され得る。それらは、化合物として、または薬学的に許容される誘導体として投与されてもよく、そして単独で投与されてもまたは活性成分として、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせて投与されてもよいことに注意すべきである。この化合物は、皮内にもしくは皮下に、またはリンパ管周囲にもしくはリンパ管内に、節内にもしくは脾臓内にもしくは筋肉内に、腹腔内におよび胸腔内に投与されてもよい。化合物のインプラントも有用であり得る。処置されるべき患者は、温血動物および、詳細には、ヒトを含む哺乳動物である。薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバントおよびビヒクル、ならびにインプラントキャリアは一般に、本発明の活性成分と反応しない不活性、非毒性の固体または液体の充填剤、希釈剤または封入剤をいう。

用量は、数日間の投与期間中単回投与であっても複数回投与であってもよい。本発明の化合物を投与する場合、これは一般に単位用量の注射型（例えば、溶液、懸濁液またはエマルジョン）で処方される。注射に適切な薬学的処方物としては、滅菌の注射用の溶液または分散液中への再構成のための、滅菌の水溶液または分散液および滅菌の粉末が挙げられる。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、など）、その適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒体であってもよい。

適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そしてサーファクタントの使用によって維持され得る。非水性のビヒクル、例えば、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、ダイズ油、コーン油、ヒマワリ油、またはピーナツ油およびエステル、例えば、ミリスチン酸イソプロピルも、化合物組成物のための溶媒系として用いられ得る。さらに、組成物の安定性、無菌性および等張性を増強する種々の添加物であって、抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝液を含む添加物が添加されてもよい。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証され得る。多くの場合には、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが所望される。注射用の医薬品形態の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかし、本発明によれば、用いられる任意のビヒクル、希釈剤または添加物は、本発明の化合物と適合しなければならない。

滅菌の注射溶液は、本発明を行うのに利用される化合物を、必要な量の適切な溶媒中に、必要に応じて、いくつかの他の成分とともに組み込むことによって調製され得る。

本発明の薬学的処方物は、任意の適合するキャリア、例えば、種々のビヒクル、添加物および希釈液を含む注射用処方物中で患者に投与され得る。または本発明で利用される化合物は、徐放性皮下インプラント、または標的化送達システム、例えばモノクローナル抗体、ベクター化送達、イオントフォレーゼ、ポリマーマトリックス、リポソームおよびマイクロスフェアの形態で患者に非経口的に投与されてもよい。本発明に有用な送達系の例としては、以下に開示されるものが挙げられる。すなわち、米国特許第５，２２５，１８２号、同第５，１６９，３８３号、同第５，１６７，６１６号、同第４，９５９，２１７号、同第４，９２５，６７８号、同第４，４８７，６０３号、同第４，４８６，１９４号、同第４，４４７，２３３号、同第４，４４７，２２４号、同第４，４３９，１９６号、および同第４，４７５，１９６号である。他の多くのこのようなインプラント、送達系、およびモジュールが、当業者に周知である。

上記の考察は、本発明の使用について事実上の基礎を提供する。本明細書に開示される有用性での使用のための本発明の組成物および方法は、以下の非限定的な例および添付の図面によって示され得る。

細胞培養に関連する全工程は、滅菌条件下で行う。本明細書に記載されない細胞免疫学の一般的方法は、細胞免疫学的技術の一般的な引用文献、例えばＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８１）に記載されており、そして当業者に周知であるとおり行う。

天然サイトカイン混合物（Ｎａｔｕｒａｌ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ）（ＮＣＭ）の調製
ＮＣＭ（本明細書においてはＩＲＸ−２とも呼ばれる）とは、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）およびシプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｏｘａｃｉｎ）によるヒト末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）の刺激後、２４時間にわたってＧＭＰの条件下で生じたサイトカインの規定の混合物である。ＰＢＭＣの供給源は、ＦＤＡの認可した血液バンクから購入した、スクリーニングされかつ試験されたバフィーコートである。ＰＨＡ刺激後、***促進因子（マイトジェン）を、遠心分離および洗浄によって除去する。全ての細胞エレメントを遠心分離によって除去して、ＤＮＡを陰イオン交換クロマトグラフィーによって除去する。無細胞の上清を濾過滅菌して、ナノフィルターにかけて、ウイルスを除去させて、ＩＲＸ−２と名付ける。サイトカインのレベルのバイオアッセイおよびＥＬＩＳＡの両方での決定を含むストリンジェントなＱＣ試験によって、ＩＲＸ−２の一貫性を保証する。無菌性、ＤＮＡ、マイコプラズマ、エンドトキシン、ならびにＣＭＶおよびＥＢＶについてのウイルス試験に関する安全性試験も、ＧＭＰプロセスの一部である。ＩＲＸ−２は、種々の臨床トライアルにおいて１５０例を超える患者に安全であり、かつ現在はＦＤＡの承認したＩＮＤのもとで第Ｉ／ＩＩ相試験中である。

さらに詳細には、ＮＣＭは、以下のとおり調製され得る：
複数のＨＩＶ陰性の肝炎ウイルス陰性のドナーからヒト血液のバフィーコート白血球を収集する。別の実施形態では、動物が、獣医学の使用のための細胞供給源であり得る。ドナー由来の細胞をプールして、フィコール・ハイパーク・勾配（ｆｉｃｏｌｌ ｈｙｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に重ねて、リンパ球なしの好中球および赤血球を得る。同じ出発リンパ球集団を生じる、当該分野で公知の別の方法を用いてもよい。

リンパ球を洗浄して、細胞サブセットの選択のために表面活性化細胞培養フラスコ中でＸ−ＶＩＶＯ １０培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に分散する。フラスコ（ＭＩＣＲＯＣＥＬＬＥＣＴＯＲ^ＴＭ Ｔ−２５ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ）は、固定された刺激物質、すなわち、***促進因子（マイトジェン）、例えば、ＰＨＡを含む。刺激薬のための固定プロセスは、フラスコ中での、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）手順、すなわち細胞を分離することのための種々の物質を固定するための製造業者に記載されたとおりである。あるいは、リンパ球は、刺激薬、例えば、ＰＨＡに対して２〜４時間曝され、次いで３回洗浄される。

この細胞を、ＣＯ_２／エアインキュベーター中において、３７℃で８０μｇ／ｍｌのシプロフロキサシン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂ）を含むＸ ＶＩＶＯ−１０培地中で２４〜４８時間インキュベートする。あるいは、ＲＰＭＩ １６４０培地を用いてもよい（Ｗｅｂｂら、１９７３）。ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を添加して、ＨＳＡなしの培地を生成に用いるよりもインターロイキンをさらに安定にしてもよい。一般には、ＨＳＡを０．１〜０．５％で用いる（容積あたりの重さ）。インキュベーション後に、その上清を捨てて、収集する。その上清を４℃〜−７０℃で保管する。

実施例１
低用量のＣＹ（３００ｍｇ／ｍ^２で）、ＩＮＤＯ（２５ｍｇを経口的に毎日３回）、および亜鉛（６５ｍｇの元素の亜鉛を１日に１回硫酸塩として）での処置に加えて、ＮＣＭを用いる頸への局所の外リンパの注射によって、扁平細胞の頭頸部ガン（Ｈ＆ＮＳＣＣ）を有する患者の多くの割合において臨床的な退行が誘導されており（Ｈａｄｄｅｎ，１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ，１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ，２０００；Ｈａｄｄｅｎ，２００３；Ｍｅｎｅｓｉｓ，２００３）、無再発生存の改善で証明されている。全体として、わずかな応答（２５％〜５０％）、腫瘍縮小および病理組織標本における腫瘍の減少を含むと９０％を超える応答が見られ、そのほとんどが５０％を上回る腫瘍減少を有した。

これらの応答は、免疫退行によって媒介されることが推測される。なぜなら、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の両方が、腫瘍に浸潤することが観察されたからである。この治療は、有意な毒性とは関連しなかった。ＮＣＭの組み合わせを用いるリンパ球減少症ガン患者の処置は、顕著なリンパ球動員を生じている。分析すれば、これらの患者は、ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞（すなわち、ナイーブなＴ細胞（下の表１を参照のこと））の増大を示した。さらに、Ｈ＆ＮＳＣＣを有する患者でのＮＣＭの腫瘍内注射または腫瘍周囲の注射は、免疫療法誘発性の腫瘍退行を逆転させるか、または腫瘍の進行を生じた。従って、この腫瘍は、免疫の部位ではない。そうではなく、局所リンパ節の分析によって、局所リンパ節が、想定の腫瘍抗原に対する免疫の部位であることが明らかになった（Ｍｅｎｅｓｅｓ，２００３；図１〜５を参照のこと）。ＮＣＭを用いて処置したこれらの患者では、臨床的には患者の１５％でそして病理学的には最大５０％まで予想されている転移を生じなかった。これらの結果によって、単なる局所免疫ではなく全身的な免疫が誘導されていることが示される。患者は、処置前に０．１ｍｌのＮＣＭに対する皮膚試験で事前試験して、皮膚試験が陽性（２４時間で０．３ｍｍを超える）であったうちの９０％より多くが、堅調な臨床的および病理学的応答を有した。皮膚試験が陰性である患者は、弱いかまたは応答なしであった。このように、皮膚試験によって、良好な応答者を選択する。

これらのＴリンパ球減少症患者においてＴリンパ球のカウント（ＣＤ３）７５２−＞１０２０において大きい増大が観察された（Ｔ細胞カウントは７５２対１６００（正常））。重要な事に、「ナイーブ（ｎａｉｖｅ）」なＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞において対応する増大があった（５３２−＞７８２）。前に言及されたとおり、これらの増大は、特にＮＣＭのような薬物療法を用いた成人で生じるとは一般には考えられない。これらの細胞はおそらく、最近の胸腺移出（ｔｈｙｍｉｃ ｅｍｉｇｒｅｓ）であり、腫瘍抗原のような新規な抗原に対する応答のための大きな新規な能力と考えられる。既存のＣＤ４５ＲＡ陽性細胞は、腫瘍抗原に対して応答しておらず、そして腫瘍誘発性免疫抑制に起因してそのように応答できていないのかもしれない（アネルギー）。

表１：ＮＣＭを用いた、Ｈ＆ＮＳＣＣを有するリンパ球減少症患者の処置は、血中でナイーブなＴ細胞を増大した（＃／ｍｍ）

文献（Ｈａｄｄｅｎ ＪＷ、Ｉｎｔ’ｌ Ｊ ｌｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １１／１２：６２９−６４４，１９９７；Ｈａｄｄｅｎ ＪＷ、Ｉｎｔ’ｌ Ｊ ｌｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ２１：７９〜１０１，１９９９）によって、ガンの２つの主要なタイプであるＳＣＣおよび腺癌の両方について、所属（局所）リンパ節は、洞組織球増殖症、リンパの枯渇およびしばしば腫瘍細胞（ＩＬ−２を含む）に反応し得る腫瘍関連リンパ球の存在を含む、腫瘍に関する異常を反映することが示される。転移を考慮すれば、リンパの枯渇および機能の抑制が生じる。１０例のＨ＆ＮＳＣＣ患者および１０例のコントロールにおける無関係の頸部リンパ節の非公開の分析によって、平均のリンパ節サイズの減少およびＨ＆ＮＳＣＣに関連する洞組織球増殖症の増大が示された（本出願の図１〜図４ＡおよびＢを参照のこと）。

１サイクルのＮＣＭプロトコールでの処置後（Ｈａｄｄｅｎ，１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ，１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ，２０００）、無関係の頸部リンパ節は、図１〜４で示される変化を示した。ＮＣＭで処置していないＨ＆ＮＳＣＣを有する患者の局所リンパ節に比較して、これらの節は、サイズ、Ｔ細胞領域および密度の有意な増大、ならびに胚中心、洞組織球増殖症および充血の数の減少を示した。処置された患者のリンパ節は、全て刺激され、そして増大されたＴ細胞および密度を有するコントロールの節よりも大きかった。従って、これらの節は、正常に回復されないだけでなく、Ｔ細胞優勢の証拠を示し、陽性が既知であれば、Ｈ＆ＮＳＣＣでの生存と相関する（Ｈａｄｄｅｎ，１９９７）。

重要な事に、Ｂ細胞およびＴ細胞領域に関連するリンパ節変化が、Ｔ細胞およびＢ細胞浸潤を反映する腫瘍における変化と相関した場合、高い程度の相関が、Ｔ細胞（ｐ．＜０．０１）およびＢ細胞（＜０．０１）および全体的なリンパ球の存在（ｐ．＜０．００１）について得られた（図５）。次に、これらの変化は、病理学的および臨床的な基準による腫瘍減少と相関した。これらの知見によって、腫瘍反応はリンパ節変化と直接かつ正に相関すること、そして腫瘍反応は、従属変数としてリンパ節変化を反映することが示される。これらの知見を、免疫系が一般にどのように機能するかについての知識（Ｒｏｉｔｔ Ｉ、１９８９）、および後のサイトカイン遺伝子での腫瘍トランスフェクション（Ｍａａｓｓ Ｇ，１９９５）と組み合わせれば、ＮＣＭプロトコールは、まだ特定されていない抗原に対してこれらの患者をリンパ節のレベルで免疫することが示される。自系の腫瘍抗原での免疫を反映するリンパ節変化の証拠で以前に示されたものはない。これによって、本発明は、以前には無効であるかまたは有効性の劣った腫瘍抗原での免疫を、遠位転移の退行を生じるような効力で誘導し得ることが確認される。

実施例２
Ｔリンパ球減少症のＮＣＭによる矯正
以下の実験の目的は、リンパ球減少患者のリンパ球カウント（ＬＣ）に対する、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカイン（１日あたり１１５単位のＩＬ−２当量）を含むＮＣＭの１０日の毎日注射処置の効果を評価することであった。これらの患者は、頭頸部癌のための以前の手術および放射線療法から回復し、そして４４１細胞／ｍｍ^３という平均カウントを有する持続性のリンパ球減少症を有した。ＬＣの正常なレベルは２０００細胞／ｍｍ^３である。この患者は処置の時点でガンはなかった。ＬＣは、０日および１３日で得た。Ｔリンパ球（ＣＤ３＋）およびＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）を、フローサイトメトリーによって評価した。表ＩＩは、５つの対応する患者についてのデータを示す。有意な増大が、ＬＣ、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞について観察された。

表ＩＩ

これらの変化は、リンパ球減少のＡＩＤＳ患者においてかなり高用量のペグ化インターロイキン２（３×１０^６単位の組み換えＩＬ−２）によって得られた変化によく匹敵する（Ｔ．Ｍｅｒｉｇａｎ，私信）が毒性は少ない。それらの変化は、ＡＩＤＳ患者において１日あたり１０×１０^６単位を超えるＩＬ−２の８日の注入で得られた変化より少ない。しかし、後者は費用がかさみ、不便で、有意の毒性を有した（Ｋｏｖａｋｓ，ら、１９９７）。ＮＣＭでのこれらの結果は、ＩＮＤＯおよびＣＹの非存在下で得られ、従って、ＬＣに対するレジメンの効果は、ＮＣＭの効果であり、ＩＮＤＯおよびＣＹの効果ではないことが示される。

実施例３
ガンにおける樹状細胞欠陥のＮＣＭによる矯正
以前の実験では、５例のＮＣＭ−処置したＨ＆ＮＳＣＣ患者および５例の未処置のＨ＆ＮＳＣＣのコントロール患者由来のリンパ節を単離して、細胞の構成を、樹状細胞についての細胞表面マーカーのパネルを用いてフローサイトメトリーによって分析した（すなわち、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、およびＣＤ６８＋）。上で注記されたとおり、洞組織球増殖症とは、未熟な樹状細胞を含む大組織球のリンパ節における蓄積によって特徴付けられる、いく例かのガン患者でみられるリンパ節の病理である。図６Ａで実証されるとおり、ＳＨを有する患者（ＳＨ＋）は、それらのリンパ節にＣＤ６８＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６−ＤＣの蓄積を有するが、顕著なＳＨのない患者は、わずかなＣＤ８３＋細胞しか有さない。しかし、ＮＣＭ処置によって、非処置のガンコントロールに比較して、ＣＤ８６＋（ＣＤ６８＋、ＣＤ８３＋をともなう）の数の５倍の増大を生じ、このことは、「活性化された（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」ＤＣ表現型への変換を示している。コントロールは、ＮＣＭ処置したガン患者に比較して未処置のＨ＆ＮＳＣＣ患者である（図６Ｂを参照のこと）。

洞組織球増殖症は、内因性の腫瘍ペプチドを保有すると推定される部分的に成熟したＤＣの蓄積を示すので、同時刺激性のレセプターＣＤ８６の発現をともなう完全な成熟および活性化は、本発明のＮＣＭの使用を反映して、成熟に対するこの欠陥を矯正し、そしてＴ細胞に対する有効な抗原提示を可能にする。このように本発明のＮＣＭは、洞組織球増殖症を逆転させて、「ナイーブな（ｎａｉｖｅ）」Ｔ細胞の有効な免疫をもたらす。

上で記載されるデータおよびＭｅｎｅｓｅｓら（２００３）に含まれる後続データによって、外リンパのＮＣＭ、低用量のＣＹおよびＩＮＤＯを用いるＨ＆ＮＳＣＣを有する患者の処置が、これおよび他のガンにおけるリンパ節において高頻度に証明された洞組織球増殖症を逆転したということを示した。しかし、このデータからは、上記の薬剤、ＮＣＭ、ＣＹ、および／またはＩＮＤＯがこの欠陥を矯正したということは明らかではなかった。

以下のデータによって、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを含むＮＣＭが、ＣＹおよび／またはＩＮＤＯの非存在下においてＤＣ成熟を誘導するという証拠が示されている。これらの実験で用いられるＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は、いくつかのサイトカイン、好ましくは、上記で考察されるかまたは下の表ＩＩＩに示されるような６つの重要なサイトカインを含む。これらの実験の目的のために、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）濃度は、ＩＲＸ−２に含まれるＴＮＦ−αの濃度として表される。ＴＮＦ−αを含むＩＲＸ−２におけるサイトカインの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定したところ、組み換えＴＮＦ−αの純度は９５％を超える。全ての実験について、滴定を除けば、ＮＣＭを１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。

用いられる培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０％のＦＢＳ（全ての試薬は、Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡから購入した）を補充したＲＰＭＩ １６４０であった。ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦ_１６５は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入した。Ｘ−ＶＩＶＯ １０は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＬＰＳは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。全ての試薬は、内毒素（エンドトキシン）混入について、鋭敏なカブトガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）アッセイ（ＬＡＬアッセイ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いて、製造業者の指示に従って試験して、陰性であることを見出した。全ての溶液は、検出の下限である０．０６ＥＵ／ｍｌ未満を含むことが見出された。さらに、全てのプラスチック類は発熱物質を含まなかった。

これらの実験で用いられるＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）での遠心分離によって健常ドナーの３０ｍｌの白血球富化バフィーコートから得て、そして４２．５〜５０％の界面からの軽密度画分を回収した。その細胞を、培養培地に再懸濁し、そして６ウェルのプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に接着させた。３７℃で２時間後、非接着細胞を洗浄によって除去して、接着細胞（約９０％ ＣＤ１４^＋細胞、すなわち、単球）を、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を補充した３ｍｌの培地中で培養した。

表面マーカー分析のために、以下の蛍光結合体化ｍＡｂ（全て、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた。すなわち、ＣＤ８６−ＰＥ、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ５４−ＡＰＣ、ＣＤ８３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１ａ−ＡＰＣ、ＣＤ４０−ＦＩＴＣおよび適切なアイソタイプコントロールである。ＦＡＣＳを用いて免疫表現型分析を行った。細胞（０．２５×１０^６）を、２％のＦＢＳおよび０．１％のＮａＮ_３（ＦＡＣＳ洗浄緩衝液）を補充したＰＢＳ中で洗浄して、３０分間、室温でＡＰＣ−、ＰＥ−、もしくはＦＩＴＣ−結合体化ｍＡｂとともに、または対応するアイソタイプ適合ｍＡｂとともにインキュベートした。過剰なｍＡｂを、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液中で洗浄によって除去した。結果は、平均蛍光強度または特定の抗原を発現する細胞の割合のいずれかとして表した。蛍光分析は、１０，０００事象の獲得後ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で行って、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で分析した。

図７に実証されるとおり、ＮＣＭ単独（ＣＹおよび／またはＩＮＤＯの存在なし）で、ＤＣ成熟の重要なマーカーであるＣＤ８３抗原を保有するＤＣの数が増大した。さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を、上記のようにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で７日間培養し、次いで漸増量の組み換えＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）またはＮＣＭ（ＩＲＸ−２）のいずれかを用いて刺激した。４８時間後、細胞を洗浄して、フローサイトメトリーによりＣＤ８３発現について分析した。図７は、ＣＤ８３＋細胞における増大によって証明されるとおり、ＮＣＭが誘導性ＤＣ成熟で活性であることを示す。さらに、ＮＣＭは、ＴＮＦ−α単独での等価用量よりもＤＣ成熟を誘導するのに活性であった。図７のデータは、５つの個々の実験の平均−／＋ＳＥＭ（ｐ＜０．０００１，ＡＮＯＶＡによる）として提示する。

このデータによって、ＮＣＭ単独で、ＤＣの成熟を促進し、その成熟の促進はＤＣ成熟に作用することが公知のＮＣＭ混合物に含まれる任意の単一のサイトカインでは説明できない方法であることが示される。例えば、ＰＢＭＣの正常なインビトロ分化には、１００〜５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）および５００〜１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在を要する。これは、ＤＣ系列に方向づけられた比較的未熟な状態である細胞の集団を生成する（低／中度のＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ発現、ＣＤ８３についてヌル）。未希釈クローンのＮＣＭは、検出不能量のＩＬ−４を有し、そしてＤＣのインビトロの分化に必要な濃度よりも１０〜５０倍低い濃度のＧＭ−ＣＳＦ（約１．１ｎｇ／ｍｌ）を含む。従って、ＮＣＭにおける個々のＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦサイトカインは、図７の培養物において生成されたＣＤ８３＋細胞を説明できない。

ＴＮＦ−αは、このような細胞を誘導し得るが、ただし、本発明のＮＣＭに含まれる濃度をかなり上回る濃度でのことである（図７を参照のこと）。例えば、樹状細胞系列に対する最初の関係付け後（インビトロにおいてＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の数日間まで）、病原体（例えば、ＬＰＳ）由来の「危険信号（デンジャー・シグナル）（ｄａｎｇｅｒ ｓｉｇｎａｌ）」の引き続く追加によって、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲの高／強力な発現およびＣＤ８３の存在を含む完全成熟樹状細胞表現型が誘導される。２０〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ−αは、このような病原体由来の危険信号をかなり模倣し得、それによって、同じマーカーの上方制御が生じる。しかし、未希釈のＮＣＭ混合物は、平均でわずか２．８ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αしか有さず、これは、完全なＤＣ成熟に必要なＴＮＦ−αの濃度よりもかなり低い。従って、図７で示される結果によって、この実験で用いられるＴＮＦ−α等価濃度では、ＮＣＭによるＣＤ８３マーカーの誘導は、ＮＣＭ混合物におけるＴＮＦ−αの存在に起因し得ないことが明らかに実証される。

ＤＣが、未熟から成熟の細胞に進行するにつれて、別個の形態学的変化をうけるということは公知であるので、未熟なＤＣをＮＣＭで処置して、ＮＣＭ処置が細胞の形態を変化するか否かを決定した。さらに詳細には、接着性のＰＢＭＣは、上記のように４日間ＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）の存在下で増殖され（この処理は、未熟なＤＣを生じることが公知）、次いで、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で処理されるか、またはコントロールとして未処理のまま残される。３日後、この細胞を、Ｗｒｉｇｈｔ染色および顕微鏡によって可視化した。図８に示されるとおり、ＮＣＭで処理した細胞（図８Ｂ）は、特徴的な細胞突起および成熟ＤＣの運動性を示し、そして継続的に伸長して、その細胞過程およびベールを撤回した。これらの細胞は、未処理のコントロールに比較した場合、大きい不規則な形状の核、多数の小胞、比較的少ない細胞質顆粒、ならびに顕著かつ豊富な細胞突起を有した（図８Ａ）。このように、ＮＣＭ処理によって、代表的な成熟ＤＣ形態学を保有するＤＣが生じた。

さらに、未熟から成熟のＤＣへのプロトタイプの移行は、特定の細胞表面抗原において十分特徴付けられた増大および低下を生じることが公知である。例えば、未熟なＤＣは、高レベルのＣＤ１ａを発現し、そしてサイトカインまたは細菌産物のような刺激との遭遇の際に、このマーカーは下方制御される。従って、ＮＣＭ処置が、ＤＣの活性化および成熟に関連する細胞表面マーカーの獲得または損失を生じるか否かを決定するために、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で処理した接着性ＰＢＭＣ（単球）（上記のような）を７日間増殖し、次いでＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の有無において４８時間インキュベートした。ＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ５４の発現は、フローサイトメトリーによって試験して、平均蛍光強度として表した。

図９のヒストグラムによって実証される場合、未熟なＤＣのＮＣＭ（ＩＲＸ−２）処理（ヒストグラムにおいて実線で示される）は、ＣＤ１ａ発現の下方制御（１４７対６２）、およびＭＨＣＩＩ発現の上方制御（４５５対６６２）を生じた。さらに、ＮＣＭ処理は、細胞サイズの増大、および細かさの低下をもたらした（データ示さず）。未処理のコントロールは、各々のヒストグラムにおいて破線で示される。未処理のＤＣの平均値は、パネルの左上のカドに示している。ＮＣＭで処理されたＤＣのそれぞれの値は、右上のカドに示す。示されるヒストグラムは、代表的な実験からであり、そしてその値は、少なくとも１０の個々の実験の平均の結果に相当する（^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．００２、^＊＊＊＝ｐ＜０．００００５、対応のあるスチューデントｔ検定）。図９にさらに示されるように、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）処理は、同時刺激性の表面分子ＣＤ８６（Ｂ７−２としても公知）（１９３対３９０）、ＣＤ４０（４６対７５）、およびＣＤ５４（細胞内接着分子１またはＩＣＡＭ−１としても公知）（１８４０対３７７９）の発現を増強した。表面マーカー発現におけるこれらの変化の全てが、本発明のＮＣＭがＤＣ活性化の強力なエフェクターであることを示す。

抗原提示細胞としてのそれらの役割と一致して、未熟なＤＣは、高い細胞内活性を有して、抗原を能動的に取り込む。成熟の際、この活性は下方制御され、その際、このＤＣは、抗原プロセシングおよび提示に関与する。生理学的条件下では、ＡＰＣエンドサイトーシスの下方制御は、Ｔ細胞の刺激増強をもたらす表面上のペプチド／ＭＨＣ複合体の増大に関連する。エンドサイトーシスに対するＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の影響を試験するために、ＤＣを漸増量のＮＣＭ（ＩＲＸ−２）とともにインキュベートして、ＦＩＴＣ−デキストランを内部移行させる能力を決定した。さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣ（単球）をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（上記のような）を用いて４日間処理し、次いで、ＴＮＦ−αを（１μｇ／ｍｌで）用いて、または漸増濃度のＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を１ｎｇ／ｍｌの当量までのＴＮＦ−αを用いて刺激した。１８時間後、その細胞を、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加したＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにインキュベートした。その細胞を３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を４回、氷冷ＰＢＳを用いて洗浄し、そして上記のようなフローサイトメトリーによって分析した。

図１０に示されるとおり、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（黒塗りの丸）とともにインキュベートした未熟なＤＣは、エンドサイトーシスを用量依存性の様式で下方制御した。ＴＮＦ−α処理（白ヌキの丸）はＮＣＭで見出された対応する用量で最小の効果を有した。未熟なＤＣの処理は、高い量のＴＮＦ−α（１０〜２５ｎｇ／ｍｌ）で、期待どおり細胞内活性の下方制御を生じた（データ示さず）。図１０のデータは、刺激ＤＣ対未刺激ＤＣの平均蛍光強度の割合として示されており、そして４つの独立した実験の平均−／＋ＳＥＭ（ｐ＜０．００００１，ＡＮＯＶＡによる）である。これらの実験は、本発明のＮＣＭが、ＤＣ成熟の指標であるＤＣの細胞内活性を下方制御することを示す。

次に、ＮＣＭがＤＣのＴ細胞刺激能力を増強する能力を評価した。活性化された成熟ＤＣは、ナイーブなＴ細胞の強力な刺激因子である。ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）処理が、機能的な効果、並びに上で注記されるような表現型および形態学的な変化に変換されることを示すために、ＤＣのＴ細胞刺激能力に対するＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の影響を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）増殖アッセイで評価した。

さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣ（単球）を最初に７日間ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（上記のとおり）を用いて処理し、次いでＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の有無において刺激した。４８時間後、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）処理したＤＣまたは未処理のＤＣを収集して、以下のとおりＭＬＲにおいてアッセイした。すなわち、精製したＤＣを、無関係のドナー由来の１×１０^５個のＴ細胞とともに、１：５、１：１０、１：３０、および１：１００というＤＣ：Ｔ細胞の割合で同時培養した。同種異系のＴ細胞を、ナイロン・ウールカラムでのＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離によってバフィー・コートから精製したＰＢＭＣを流すことによって調製した。そのアッセイは、丸底の９６ウェルプレート中において三連で行った。ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は、ＭＬＲアッセイの間には存在しなかった。ＤＣ−Ｔ細胞の同時培養の５日後、そのウェルをＢｒＤＵを用いて１８時間パルスした。ＢｒＤＵ取り込みは、比色ＢｒＤＵ取り込みアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて測定した。

図１１に示されるとおり、同時培養の２日前にＮＣＭ（ＩＲＸ−２）に曝されたＤＣ（黒塗りの四角）は、未反応のＤＣ（白抜きの丸）よりもＴ細胞増殖応答を誘導するのに強力であり、これによって、ＮＣＭ処理したＤＣが機能的にコンピテントであることが確認された。図１１のデータは、規定される刺激指数（ｏ．ｄ．ＤＣ刺激Ｔ細胞−ｏ．ｄ．ＤＣ単独／ｏ．ｄ．休止しているＴ細胞）−／＋ＳＥＭとして表現され、そして４つの個々の実験の結果の平均である（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡによる）。

同時刺激ではＮＣＭはなく、そしてＴ細胞刺激において観察された増大は、Ｔ細胞に対するＮＣＭの直接の影響ではなく、ＤＣへのＮＣＭの刺激性の影響に起因したということに注意することが重要である。従って、本発明のＮＣＭは、同種異系のＭＬＲ反応における増殖の増強によって示されるとおりＤＣのＴ細胞刺激性活性を増強する。さらに、ＮＣＭは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の発現を増大することが上記で示された。この細胞表面のアクセサリーリガンドは、ＬＦＡ−１を通じたシグナル伝達に関与することが示されており、そしてＴｈ１表現型に向かう偏向を生じる（Ｒｏｇｅｒｓ，２０００）。ガンの設定では、これらの効果の機能的な結果は、ＮＣＭ−処理したＤＣが、Ｔｈ１表現型に向かうＴ細胞応答を分極させ、腫瘍特異的なＣＴＬ活性の活性化を支持し、これによって腫瘍拒絶を促進するということである。

本発明者らのデータでは、ＮＣＭがＤＣからＩＬ−１２の産生を刺激することが実証される。ＩＬ−１２は、感染の間に病原体に応答してＤＣによって分泌される強力なＴｈ１分極サイトカインである。しかし、腫瘍拒絶を媒介することにおけるＤＣの最も重要な役割のうちの１つは、Ｔｈ１偏向した抗腫瘍Ｔ細胞応答を効果的にかつ効率的に刺激することであり、そしてこの応答を指向するのにおける重要なサイトカインの１つはＩＬ−１２である。ＩＬ−１２は、活性化ＤＣによって生成され、そしてナイーブなＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化に関与する必須の因子である。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌し、そしてこれらのサイトカインは、ＩＬ−１２と一緒に、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような、免疫系の細胞および食作用性成分の活性化および増殖を媒介する。

ＮＣＭがＤＣにおけるＩＬ−１２産生を誘導し得るか否かを決定するために、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４培養された単球を、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を用いて１８時間刺激して、細胞内のＩＬ−１２ ｐ７０産生についてアッセイした。さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣを４日間、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（上記のとおり）中で４日間増殖し、次いで、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）またはＬＰＳの有無によって１８時間処理した。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＢＦＡ；１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、最後の４時間の間に添加して、ほとんどのサイトカインをゴルジ複合体中で蓄積させた。細胞を固定して、製造業者の指示に従ってＦｉｘおよびＰｅｒｍ（Ｃａｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて透過化させ、次いでＩＬ−１２ ｐ７０に対するＦＩＴＣ標識ｍＡｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または適切なアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。細胞はフローサイトメトリーによって分析した。

図１２Ａに示されるとおり、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は、平均で４．５％陽性から２２．５％までＩＬ−１２を産生するＤＣの割合を増大した。ＤＣにおけるＩＬ−１２産生の刺激剤であるＬＰＳを、陽性のコントロールとして用いて、ＮＣＭに対する同様のレベルの誘導を得た（２７％±１１）。図１２Ａのデータは、４つの独立した実験の平均であり、ＩＬ−１２−／＋ＳＥＭについて正に染色する細胞の割合として表わされる（ｐ＜０．０５スチューデントのｔ検定）。ＩＬ−１２の細胞内産生の増大が、生物活性ＩＬ−１２の分泌の増大に対応することを確認するために、ＮＣＭ処理したＤＣの上清における生物活性ＩＬ−１２の濃度（上記のようなＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いて最初に４日間培養し、ＮＣとともに４８時間インキュベートした）を、生物活性ｐ７０ヘテロ二量体を検出する市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。従って、図１２Ｂに示されるとおり、ＮＣＭに対する暴露の４８時間後、ＤＣ上清は、コントロール処理のＤＣよりも有意に多いＩＬ−１２を含んだ。図１２Ｂのデータは、６つの独立した実験の平均（−／＋ＳＥＭ）である（ｐ＜０．０５，スチューデントのｔ検定）。

最終的には、本発明者らのデータによって、ＮＣＭがＤＣにおけるＶＥＧＦ−誘発性のアポトーシスを減じることを示した。ＶＥＧＦは、ＤＣ成熟のインヒビターであり、かつ成熟ＤＣにおいてアポトーシスレベルを増大することが示されている。ＮＣＭがＶＥＧＦの効果を軽減できるか否かを決定するために、ＤＣをＩＲＸ−２の有無においてＶＥＧＦで処理し、そしてアポトーシスのレベルをＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ Ｖ結合によって決定した。さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いて７日間処理し、次いで、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の有無において、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（１：３）の有無において、さらに２日間インキュベートした。その細胞を収集して、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ結合緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に再懸濁した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびヨウ化プロピジウムを添加し、そしてその細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。

図１３に示されるとおり、アポトーシスのレベルは、コントロールに比較した場合、ＶＥＧＦ−処理細胞において増大した；しかしＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は、ＶＥＧＦ−処理細胞においてアポトーシスのレベルを低下させた。図１３のデータは、４つの独立した実験の結果であり、かつＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（−／＋ＳＥＭ）について陽性に染色する細胞の割合として表わされる。このデータによって、刺激能力に加えて、ＮＣＭがまた、成熟ＤＣに対する防御効果も有することが示唆される。さらに、欠陥のあるＤＣ機能および数は、腫瘍による異常なＶＥＧＦ発現によって部分的には媒介され得る（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，１９９６ｂ；Ｓａｉｔｏ，１９９９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００４）。腫瘍によるＶＥＧＦ産生は、Ｈ＆ＮＳＣＣ、肺癌、胃癌および骨肉腫を含むいくつかのガンにおける予後不良の予測因子であることが示された（Ｇａｌｌｏ，２００１；Ｋａｙａ，２０００；Ｍｉｙａｋｅ，１９９２；Ｓａｉｔｏ，１９９８；Ｓｍｉｔｈ，２０００）。本明細書において含まれるこのデータによって、ＮＣＭがＤＣのＶＥＧＦ−媒介性アポトーシスを逆転し得、それによって、腫瘍環境内における成熟ＤＣの生存を促進し、そして腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の長期の抗原提示および活性化が可能になることが示される。

ＤＣでの以前の研究では、天然のサイトカイン混合物、例えば、単球順化培地（ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）（ＭＣＭ）、またはＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＰＧＥ_２を含む組み換え炎症性サイトカインの混合物を使用して、エキソビボで生成されたＤＣベースのガンワクチンにおける使用のためにＤＣを成熟させた（Ｒｏｍａｎｉ，１９９６；Ｂｅｎｄｅｒ，１９９６；Ｓｏｒｇ，２００３）。他の研究で用いられるＮＣＭとサイトカイン混合物との間の重要な相違は、この研究で用いられるサイトカインのレベルが、１０〜１００倍低かったということであり、このことは、ＮＣＭの固有のサイトカイン成分の間の有意な相乗作用を示唆している。さらに、これらの他の混合物によって成熟されたＤＣの使用に関して有意な問題がある。例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＰＧＥ_２の存在下で成熟されたＤＣは、ＩＬ−１２の産生が低いかまたは全くなく、そして不適切に活性化される場合、寛容原性であり得る（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００２；Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ，２０００）。さらに、エキソビボで生成された完全成熟のＤＣは、「枯渇され（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）」、そして有効なＴ細胞応答を効率的にプライムできないという懸念がある（Ｋａｌｉｎｓｋｉ，２００１）。エキソビボ方法によって成熟されるＤＣで処理された患者で示される低レベルの臨床応答によって、これらの懸念が支持される（Ｈｏｌｔｌ，２００２；Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｍｅｒ，２００２；Ｔｈｕｒｎｅｒ，１９９９）。

本明細書で提示される証拠によって、ＮＣＭが樹状細胞の強力な活性化因子であることが確認される。Ｔ細胞に対するＮＣＭの公知の効果を組み合わせたこのデータ（Ｈａｄｄｅｎ，１９９５ｂ）によって、ＮＣＭは、ガン患者で見いだされるＡＰＣおよびＴ細胞の欠陥を克服できて、最初の臨床トライアルで見いだされる首尾よい臨床的転帰についての機構的な説明が提供し得ることが示唆される。ＤＣは、ガン関連の免疫療法における主要なプレイヤーとして現在認識されているが、免疫系の単一の要素を個々に操作すること、例えば、腫瘍特異的なＴ細胞ワクチン接種ストラテジーや、腫瘍抗原パルスされたＤＣ単独の再導入は、患者の有意な臨床改善を生じることができないということがますます明らかになってきている（Ｒｉｄｇｗａｙ，２００３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２００４）。さらに有益な処理プランは、いくつかの協調する細胞タイプ、例えば、Ｔ細胞およびＤＣの活性を同時に増強し、これによって腫瘍の種々の免疫抑制ストラテジーによってブロックされるよりも機能的なカスケードが永続化される相互作用および確率の良さを強化することを可能にすることであり得る。この設定では、本発明のＮＣＭは、腫瘍抗原および腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を負荷された両方の内因性ＤＣを刺激するように作用し得、有効な免疫応答および腫瘍拒絶を生じる。これらの結果をまとめると、ＮＣＭは、内因性腫瘍抗原に対する免疫応答を開始するために単独で用いられ得る潜在的に強力な臨床ツールであり、またはガンワクチンモデルにおいて外因性に添加された腫瘍抗原と組み合わせて用いられてもよいことが示唆される。

実施例４
非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の役割
ＩＮＤＯは、シクロオキシゲナーゼＩ＆ＩＩの両方に対して作用する最も強力なＮＳＡＩＤであるが、より大きい胃腸毒性を有する。より新しいＣｏｘＩＩインヒビター、例えば、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））およびロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））は、胃腸毒性が低いと考えられる。わずかな一連の患者において、ＩＮＤＯの代わりのこれらの２つの薬剤の使用で、臨床的かつ病理学的な基準に基づき生存によって測定した場合、応答はより少なくなる。Ｖｉｏｘｘ（登録商標）の場合には、７例の患者全てが、１週の治療の後に胃炎の臨床兆候を有した。頸部癌患者では、イブプロフェンを、ＮＳＡＩＤとして用いて、良好な応答を得た。これらの観察に基づけば、ＩＮＤＯが好ましいが、ＩＮＤＯが耐えられない場合には、Ｃｅｌｅｂｒｅｘまたはイブプロフェンに置き換えられてもよい。経口のプロスタグランジンアナログの有無における、プリロゼック（Ｐｒｉｌｏｓｅｃ）または他のプロトンポンプインヒビターが、胃炎の予防として推奨されるが、ヒスタミンＨ_２ブロッカーは、指示されないと考えられる。

ＣＹと組み合わせたＮＳＡＩＤの役割：
４例の患者では、ＩＮＤＯおよびＣＹ（実施例１で与えられる用量で）と組み合わせて不活性とみなされる（図１４、１５、単位カラムを参照のこと）、ある量のＮＣＭを与えた。生存は観察されなかったが、２例の患者は応答が小さく（５０％より小さいが２５％を超える縮小）、そして全４例が、腫瘍の減少および崩壊を伴う腫瘍標本の中程度の病理学的変化、ならびにリンパの浸潤を示した（下の表ＩＶを参照のこと）。ＩＮＤＯは、いく例かの患者においてはリンパ浸潤および腫瘍減少を増大し得る（Ｐａｎｊｅ，１９８１，およびＨｉｒｓｃｈら，１９８３を参照のこと）が、Ｈ＆ＮＳＣＣにおける有用な治療として臨床的には認められていない。同様に、ＣＹは本明細書で用いられる用量では、Ｈ＆ＮＳＣＣにおいて臨床的に活性とはみなされない。ＩＮＤＯおよびＣＹ単独の活性は、腫瘍応答の大きさおよびタイプにおいては驚くべきとみなされ得る。このデータによって、ＩＮＤＯおよびＣＹは、免疫療法の他の形態での使用のための相乗的な組み合わせであり得ることが示される。

近年、低用量の組み換えＩＬ−２は、Ｈ＆ＮＳＣＣを有する患者で転移の再発を遅らせて、平均生存時間を増大することが報告された（ＤｅＳｔｅｆａｎｉら，２００２，およびＶａｌｅｎｔｅら，１９９０を参照のこと）。以前には、臨床的な応答は観察されず、そして観察された有意な腫瘍変化は少なかった（腫瘍退行なしのリンパ浸潤）。それにもかかわらず、ｒｌＬ−２は、ＣＹおよびＩＮＤＯと作用し得、さらに、臨床的な応答を誘導して、生存を改善し得る。ＮＣＭに存在するサイトカインに対応する他の天然または組み換えのサイトカインは単独で、または組み合わせても、潜在的に活性である。例えば、サイトカインＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８，ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、およびそれらの組み合わせは、天然で用いられても、または組み換え型で用いられてもよい。

表ＩＶ：ＣＹおよびＩＮＤＯ（±ＮＣＭ）

実施例５
予後における皮内皮膚試験の役割
本発明者らは、ＮＣＭに対する皮内試験陰性の患者は、単独の患者を基準とした臨床応答が劣ることを示し得るということを以前に示唆した（Ｈａｄｄｅｎ，１９９４）。本発明者らは、現在、一連の皮膚試験陰性患者を蓄積しており、そして上実施例４にみられるとおり彼らがＣＹおよびＩＮＤＯの組み合わせ（有意のＮＣＭなし）での処置の際に観察される応答と同様の応答を示すことを見出す。従って、１０例の患者が本発明のＮＣＭで皮膚試験陰性を有し（すなわち、ＮＣＭに対して不応答性）、そしてこれらの患者を、上の実施例１に開示されるようにＮＣＭに加えてＣＹおよびＩＮＤＯを用いて引き続き処置した。これらの患者は、全体的な臨床応答が劣っていたが、それにもかかわらず、有意なリンパ浸潤、予想外の腫瘍減少および崩壊、ならびに２０％生存を含むＣＹ＋ＩＮＤＯ処置の明快な臨床的効果を示した（下の表Ｖを参照のこと）。従って、これらの観察によって、ＩＮＤＯおよびＣＹが、ＮＣＭなしで抗腫瘍活性を有するという上記の実施例４の結果が裏付けられる。

重要なことに、これらの結果によってまた、ＮＣＭ皮膚試験陽性は、Ｈ＆ＮＳＣＣ患者における生存の改善に関して明らかな臨床的かつ病理学的な応答を予測するために重要であることが確認される。さらに、皮膚試験陰性によって、放射線療法の有無において手術に対して患者が応答できないことが予測される。従って、ＮＣＭ皮膚試験は、Ｈ＆ＮＳＣＣ患者における臨床的な転帰を予測するために有用に使用され得る。以前には、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）での皮膚試験は、Ｈ＆ＮＳＣＣにおいて予後的意義を示したが、感作を要する面倒な手順のせいで、臨床的に用いられることは中断されている。対照的に、ＮＣＭ皮膚試験は、簡便な２４時間試験を提供する。

興味深いことに、本発明者らの研究における患者は、２群に分けることができる。１群では（表ＶのＢ）、生存者がなく、応答が特に劣っていた。他の群では（表ＶのＡ）、これらの患者は、ＮＣＭ（追加してＣＹおよびＩＮＤＯ）での処理後、ＮＣＭ試験結果陰性から、ＮＣＭ皮膚試験陽性まで変化して、プロトコールどおりの患者と同様の臨床的および病理学的な応答ならびに生存を示した（実施例４の表ＩＶを参照のこと）。

これらの患者の１例が、手術不能とみなされる腫瘍を有し、そして試験結果陰性から陽性に変化することが示され、そしてＮＣＭでの２回目の処置の際、腫瘍の臨床的減少、病理学的応答の増強、および手術後の長期生存（７年を上回る）を示した。従って、ＮＣＭでの皮膚試験陰性患者の事前処置は、奏功率を増大し得る。ＮＣＭに加えてサイモシンα_１も作用することが予測され得る（米国特許出願公開第２００３０１２４１３６号を参照のこと）。ＮＣＭ皮膚試験陰性は、単球機能の欠陥を反映するので、天然または組み換え型の単球活性化サイトカインでの処置は、単独で、またはそれらと組み合わせて有用であると予測される。これらとしては、限定はしないが、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、１Ｌ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２などが挙げられる。ＮＣＭ皮膚試験陰性に関連する単球機能欠陥を矯正するためのＮＣＭの使用に関するデータについては、下の実施例９を参照のこと。

表Ｖ：ＮＣＭ皮膚試験陰性の患者

実施例６
ＮＣＭ皮膚試験は、外科手術±放射線療法の有無における、ＮＣＭ処置に対する応答を予測するだけでなく、ガン患者の全生存、再発時間、および死亡までの時間をも予測する。

Ｈ＆ＮＳＣＣを有する４４例の患者を、頭がい骨基部の注射によって低用量ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を用いる組み合わせの免疫療法を用いて処置し、これにはＨａｄｄｅｎら、１９９４および２００３によって記載されるように、低用量のシクロホスファミド（ＣＹ、３００ｍｇ／Ｍ^２）の注射が先行し、そして毎日の経口のインドメタシン（２５ｍｇ、１日３回）および亜鉛（ＳｔｒｅｓｓＴａｂｓ（登録商標）として）を伴った。ＩＩ〜ＩＶ段階の手術可能なＨ＆ＮＳＣＣを有する３２例のプロトコールどおりの患者を、術前に２１日の処置で処置して、指示があれば、手術後にさらなる放射線療法を与えた。これらの患者は、０．１ｍｌの用量の皮内ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（ＩＬ−２当量の１１〜２０単位を含む）に対して皮膚試験陽性であり、そして試験の際、皮内の０．１ｍｌ用量のＰＨＡ（０．０５μｇ〜０．５μｇ）に対しても皮膚試験陽性であった。１６例のさらなる患者は、ＩＲＸ−２での皮膚試験陰性のためにプロトコール外であり、そして５例は、再発性の進行性の手術不能の疾患を有した。これらの患者のうち４例が、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で皮膚試験陰性に変わり、そしてここで皮膚試験陽性患者とみなされる。さらなる６例の患者が、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）に対して皮膚試験陽性であったが、再発性の手術不能疾患のせいでプロトコール内ではなかった。従って、患者の群は以下であった：
１．３２例のプロトコール内の患者
２．１２例の皮膚試験陰性のプロトコール外の患者
３．１０例の皮膚試験陽性のプロトコール外の患者
これらの患者は、手術される場合は手術の時点で、または複数回のサイクルのＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で処置した場合は最大応答の時点で、免疫療法に対する臨床的応答について、そして２４時間の生存について比較した。臨床応答は、５０％より大きい腫瘍縮小が生じた場合には大きいとみなされ、そして５０％未満の腫瘍収縮であった場合には小さいかまたは応答なしとみなされた（ＭＲ／ＮＲ）。

結果：
プロトコール内の患者３２例のうち、１３例すなわち４２％が大きい応答を有した。ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）皮膚試験陽性であるプロトコール外の患者１０例のうち、７（７０％）が大きい応答を有した。ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）皮膚試験陰性のプロトコール外の患者１２例のうち、大きい応答を有したのは０（０％）であった。後者の２つの群を比較するカイ二乗分析は有意である（ｐ＜０．０００５）。従って、ＮＣＭ皮膚試験陰性は、免疫療法を有する処置に対する大きい応答がないことを予測する。皮膚試験陽性は好ましいが、大きい臨床応答を保証するものではない。

生存に対するこれらの３つの群の結果を、図１５に示す。プロトコール内の皮膚試験群は、２４か月で７８．９７％の全生存を示す。この生存は、手術±放射線療法とＮＣＭ（ＩＲＸ−２）レジメンなしで処置した同じ施設での、部位および段階のマッチしたコントロールの５０％全生存よりも大きい。この皮膚試験陽性のプロトコール外の患者は、中間である。つまり、これらの患者のうち６例が、再発疾患を有した。皮膚試験陰性患者の全てが、他の２群よりも短い疾患なし生存および平均生存時間で死亡した（ｐ＜０．０１）。従って、皮膚試験陰性であれば、生存に対する免疫療法の影響がないだけでなく、生存に対する手術±放射線療法（ＲＴ）の影響もないことが予測される。

外科手術±ＲＴの転帰を予測するための以前の試みでは、重要性として以下が示唆されている。すなわち、もとの腫瘍のサイズ、リンパ節転移、関節外伝播、遠位転移、栄養および免疫の状態（概説については、Ｈａｄｄｅｎ，１９９５を参照のこと）である。まだ、単一の臨床知見も試験も、ＮＣＭ皮膚試験と同じように選択的には臨床の不全を選びだせていない。明らかに、さらに協調した処置がこれらの患者には必要であり、そしてさらに詳細には、ＮＣＭ皮膚試験陰性の背景にある欠陥を逆転させるように設計された処置を必要とする。

全体としては、２３例の患者をＰＨＡについて皮膚試験した。皮膚試験陽性のうち６４％（９／１３）について２年を超える生存が観察されたが、皮膚試験陰性患者では２０％でしかなかった（２／１０）（カイ自乗ｐ＜０．０１）。この系列における３例の患者は、ＰＨＡ皮膚試験については陰性であったが、ＮＣＭについては陽性で、２年より長く生存したのは１例だけであった。

ＰＨＡ皮膚試験は、ＮＣＭ皮膚試験よりも予測性が低いが、それにもかかわらず、予測を評価するためのさらなる指標が得られる。ＰＨＡに対する応答は、Ｔリンパ球の刺激を反映して、ＮＣＭに存在するサイトカインを作成し、ついでこれらのサイトカインの作用が単球を病変に誘引し、これが、遅延型の過敏性皮膚反応（例えば、ツベルクリン反応）を生じる。ＰＨＡは、診断試験としての使用について米国では承認されておらず、この理由は安全性でも有効性でもないが、臨床使用について準備して、米国の食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）の要求する研究を行なっている会社がないせいである。Ｔリンパ球について***促進性である任意の薬剤が、このタイプの皮膚試験反応を生じると期待される。適切な例は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体であり、これはＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ（登録商標）として臨床的に利用可能である。

実施例７
診断のための本発明の他の使用：
歴史的には、Ｈ＆ＮＳＣＣにおいて転帰（陽性または陰性）についての予測因子はすくなかった。すなわち、リンパ球カウント、ＩｇＥおよびＩｇＡのレベルまたは栄養が示唆され、そして言及されるとおり、ＤＮＣＢ皮膚試験が用いられている。化学療法（５ＦＵおよびシスプラチン）については、臨床応答は、ほとんどの患者で手術前に生じるが、平均生存時間および全生存は本質的に影響されない。本実施例で示されるデータによって、本発明の使用が手術後に腫瘍残留がある患者の転移の再発を遅らせ、そして臨床応答の大きさに関する方法で生存を、そして腫瘍減少、崩壊およびリンパ浸潤の量によって評価した場合腫瘍に対する免疫攻撃の強度を増大することが示される。これらの観察によって、生存をさらに改善する本発明の重要な改変が示される。

重篤な免疫不全を有する患者において
低リンパ球カウント、ＮＣＭ皮膚試験が弱いか全くない、洞組織球増殖症および／または病理学的応答の乏しい患者では、ＮＣＭでの再処置および免疫応答のモニタリングが指示される。

臨床応答が小さいかまたは全くない患者において：
これらの患者は高リスクの転移再発を有し、従って、本発明のＮＣＭでの術後処置から理論的に利益を得る。患者で観察される腫瘍拒絶応答については現在利用可能な試験がなく、米国特許第６，４８２，３８９号に記載される三つ組みの試験での追跡試験によって、本発明のＮＣＭでの再処理の頻度を決定することが補助される。

再発性疾患を有する患者において：
本発明のＮＣＭで再処理した患者での２つの完全な応答を含む有意な応答が観察された。これは、天然および組み換えのＩＬ−２での以前の結果と対照的であって、以前の結果では、このような患者は、再処置に応答できなかった。従って、本発明は、患者において疾患の再発を処置するために有用である。

実施例８
放射線療法または化学療法のような他の処置とともに用いる本発明の使用：
ＩＶ段階のＨ＆ＮＳＣＣガンを有する患者は、放射線療法の使用にかかわらず第ＩＩＩ段階の疾患を有する患者に比較して生存が顕著に低下している（１０〜２０％対３０〜５０％）。放射線療法は、長期間にわたってこれらの患者においてＴリンパ球カウントを抑制することが周知である。Ｔ細胞の数および機能に対する放射線療法の陰性の影響にかかわらず、ＩＶ段階の疾患を有する本発明のＮＣＭで処置された患者は、ＩＩＩ段階の疾患を有する患者とおなじように応答した。従って、治療の影響は、ＩＶ段階の患者では比較的大きく、これは、免疫療法およびサイトカイン治療は腫瘍が最小の際によく機能するという現在の教義と反する。本発明のＮＣＭは、放射線療法の影響を増強することも示唆されている。同様に、陰茎のＳＣＣガンを有する４例の患者では、本発明のＮＣＭを用いて、その後に５ＦＵおよびシスプラチンを用いる化学療法、そしてＮＣＭの第二のサイクルを続けた。臨床的な腫瘍減少が、最初の免疫療法および化学療法で観察された。腫瘍（手術由来）の検査によって免疫抑制の持続が示された。本発明のＮＣＭで、続いて５ＦＵおよびシスプラチンでの化学療法で処置されたＨ＆Ｎ ＳＣＣを有する別の患者は同じ結果を示した。これらの観察によって、本発明のＮＣＭは、化学療法とともに用いられ得ることが示される。

実施例９
ＮＣＭ皮膚試験陰性によって特徴付けられる単球機能欠陥の矯正
予後診断における内皮の皮膚試験の役割を、上の実施例５および６で概説した。そのデータによって、ＮＣＭ皮膚試験の陰性、すなわち、増殖性Ｔ細胞応答の欠失が、単球欠陥に相当するということが示された。出願人は、ＮＣＭ、ＩＮＤＯおよびＣＹでの処置が、ある患者ではこの欠陥を逆転させ、この患者では臨床および組織病理学的な応答および生存が増大したということを示した。その時点で、出願人は、単球欠陥の逆転を上記のどの因子が担っていたかを知らなかった。本明細書において出願人は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αという６つのサイトカインを含むＮＣＭが、すなわちそれ自体で（ＣＹの投与もＩＮＤＯの投与もなしで）投与される場合、単球／マクロファージの強力な活性化因子であるということを示すデータを提示する。

さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣを、Ｘ−ＶＩＶＯ １０媒体（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で一晩増殖し、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を（１：３の最終濃度で）用いて２４時間刺激して、フローサイトメトリーによって、活性化マクロファージで代表的には見いだされた種々の活性化マーカーの発現についてアッセイした。コントロールとして、細胞を、ＮＣＭを欠く培地中で２４時間インキュベートした。図１６に実証されるとおり、サイトカインの添加なしに対してＮＣＭでの細胞の処置によって、細胞染色陽性の割合の統計学的な増大（図１６Ａ）、そして単球／マクロファージの全て活性化マーカーであるＨＬＡ−ＣＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０について平均蛍光係数（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）（ＭＦＩ）の増大（図１６Ｂ）が生じた（ｐ＜０．０３）。図１６に示されるデータは、３つの独立した実験／ドナーからの平均値＋／−ＳＥＭに相当する。

さらに、本発明のＮＣＭは、単球をＴＮＦ−αより大きい程度まで活性化することが見出された。さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣを、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（１：３の最終濃度；ほぼ１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α）またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激して、フローサイトメトリーによって活性化マーカーの発現についてアッセイした。図１７に示されるとおり、ＮＣＭは、ＴＮＦ−αよりもＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０の統計学的に大きい発現を誘導した（ｐ＜．０３）。図１７に示されるデータは、３つの独立した実験／ドナーからの平均値＋／−ＳＥＭに相当する。

同様に、中程度（活性化するが最大ではない）の用量でＬＰＳを用いて行った研究によってまた、ＮＣＭは、比較的強力な活性化シグナルであることが示された。さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣを、ＩＬ−１０（５ｎｇ／ｍｌ）の有無において、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（１：３の最終濃度）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて刺激して、フローサイトメトリーによって活性化マーカーの発現についてアッセイした。図１８に示されるとおり、ＮＣＭは、ＬＰＳよりも単球／マクロファージ成熟マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現においてより大きい増大を生じた。さらに、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の存在下で、ＮＣＭは、やはり単球を刺激し得るが、ＬＰＳは刺激できなかった（ｐ＜．０２）。図１８に示されるデータは、３つの独立した実験／ドナーからの平均値＋／−ＳＥＭに相当する。

結局、単球は、その分泌が単球／マクロファージの非特異的な殺傷活性に関連する活性化シグナルに応答してＴＮＦ−αを分泌することが公知である。図１９に示されるデータによって、本発明のＮＣＭが、単球からＴＮＦ−αの産生を刺激して、ＩＬ−１０の免疫抑制効果を克服することが実証される。さらに詳細には、接着性ＰＢＭＣを、ＩＬ−１０（５ｎｇ／ｍｌ）の有無において、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（１：３の最終濃度）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて刺激して、細胞内染色およびフローサイトメトリーによってＴＮＦ−α産生についてアッセイした。図１９に示されるとおり、ＮＣＭは、ＬＰＳまたはコントロールよりもＴＮＦ−αの産生においてより大きい増大を生じた。ＩＬ−１０の存在下で、ＮＣＭは、単球を刺激してＴＮＦ−αを生成し得るが、ＬＰＳはもう刺激できなかった（ｐ＜．０５）。図１９に示されるデータは、５つの独立した実験／ドナーからの平均値＋／−ＳＥＭに相当する。

ＮＣＭ単独で、単球／マクロファージの強力な活性化因子であることが示されているという事実によって、ＮＣＭ処置単独で、ＮＣＭ皮膚試験陰性を有する患者などのガン患者の１つ以上の単球の機能的な欠陥の特徴の矯正を担うという主張が支持される。

本出願を通じて、米国の特許を含む種々の刊行物が、著者および年および特許の番号によって引用される。この刊行物の全引用文献は下に列挙される。これらの刊行物および特許の開示はその全体が、本発明が属する状態をさらに詳細に記載するために本出願中に参照によって援用される。

本発明は、例示的な方式で記載されており、用語は、限定するのではなく説明としての言葉という性質を帯びるものとして用いられているということが理解されるべきである。

明らかに、本発明の多くの修正および変形が、上記の技術に照らして可能である。従って、記載される発明の範囲内であり、本発明は、詳細に記載されるもの以外におこなわれ得ることが理解されるべきである。

（図面の簡単な説明）
本発明の他の利点は、添付の図面と組み合わせて参酌した場合、以下の詳細な説明を参照してさらに良好に理解されるのと同じく、容易に理解される。
図１は、正常なコントロール、ガンのコントロール、またはＨおよびＮＳＣＣを有するＮＣＭ処置した集団におけるリンパ節のサイズを示す棒グラフである。 図２は、Ｔ細胞領域を示す棒グラフであり、そして図２Ｂは、正常なコントロール、ＨおよびＮＳＣＣのコントロールおよびＮＣＭで処置したＨおよびＮＳＣＣ患者における密度を示す。 図３Ａは、Ｂ細胞領域を比較する棒グラフである。 図３Ｂは、３つの処置群における小胞を比較する棒グラフである。 図４Ａは、他の細胞の比較を示す。 図４Ｂは、３つの処置群における洞組織球増殖症の比較を示す。 図５は、節ＢおよびＴ（Ｂ細胞およびＴ細胞）および腫瘍ＢおよびＴフィットプロットを示すグラフである。 図６Ａは、ＳＨ＋ガン患者のリンパ節における部分的に未熟なＣＤ８３＋ＤＣの蓄積を図示する棒グラフである。

図６Ｂは、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）での処置の際のＣＤ８６＋活性化ＤＣの数の増大を示す棒グラフである。
図７は、ＤＣでのＣＤ８３発現の増大によって検出される、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）がＤＣ成熟を誘発することを示しているグラフである。 図８は、サイトスピン調製物における単球由来ＤＣの形態に対するＮＣＭの影響を示す。ＮＣＭで処理した細胞（図８Ｂ）は、細胞突起および大型不定形状の核のような成熟ＤＣの形態学的特徴を示した。 図９は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）とともにインキュベートされたＰＢＭＣによる、ＣＤ１ａ抗原発現の下方制御、ならびにＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）抗原発現の上方制御を示すヒストグラムを含む。これらの変化は、ＮＣＭがＤＣの成熟を刺激することを示す。 図１０は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣ成熟の指標である活性を低下する未熟なＤＣの細胞内活性を減じることを示すグラフである。 図１１は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣのＴ細胞刺激能を増強することを示しているグラフでありその増強体はＤＣの成熟および活性化の指標である。 図１２Ａは、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、細胞内でＩＬ−１２を産生するＤＣの数を増大することを示している棒グラフである。ＩＬ−１２は成熟活性化ＤＣによって産生されるサイトカインである。 図１２Ｂは、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣによって分泌される生理活性ＩＬ−１２の総量を増大することを示している棒グラフである。 図１３は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣにおけるＶＥＧＦ媒介性アポトーシスを軽減することを示している棒グラフであり、このことは、ＤＣ生存に関するＮＣＭの防御効果を示している。 図１４は、ＮＣＭ、ＣＹおよびＩＮＤＯを２４ヶ月用いて処置した患者の生存割合（用量応答）を図示しているグラフであり、ここで「ｘ」は、ＮＣＭのＩＬ−２当量の約１００ＩＵ／ｍＬに等しい。 図１５は、皮膚試験患者、すなわちプロトコール内の患者、皮膚試験陰性のプロトコール外の患者、および皮膚試験陽性のプロトコール外の患者の３つのグラフの２４ヶ月にまたがる疾患特異的な生存を比較している線グラフである。 図１６Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＮＣＭを用いる接着性ＰＢＭＣの処置後、活性マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の組み合わせについて単球／マクロファージ染色陽性の割合の増大を示している２つの棒グラフを含む。 図１６Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＮＣＭを用いる接着性ＰＢＭＣの処置後、活性マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０について平均蛍光強度（ＭＦＩ）における増大を示している一連の棒グラフである。 図１７は、本発明のＮＣＭが単球／マクロファージを活性化する、すなわち、ＴＮＦ−αより大きい程度まで、活性マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の発現を誘導することを実証している棒グラフを含む。 図１８は、本発明のＮＣＭが単球／マクロファージを活性化する、すなわち、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の存在下でさえ、活性マーカー、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、およびＣＤ４０を誘導することを実証している棒グラフを含む。ＮＣＭは、ＩＬ−１０の存在下および非存在下の両方において、ＬＰＳよりも単球／マクロファージの活性化に優れている。 図１９は、本発明のＮＣＭが活性化された単球／マクロファージからのＴＮＦ−αの産生を刺激して、ＩＬ−１０の免疫抑制効果を克服することを実証している棒グラフである。ＮＣＭは、ＬＰＳよりを上回る程度までＴＮＦ−αの産生を刺激した。 図１は、正常なコントロール、ガンのコントロール、またはＨおよびＮＳＣＣを有するＮＣＭ処置した集団におけるリンパ節のサイズを示す棒グラフである。 図２は、Ｔ細胞領域を示す棒グラフであり、そして図２Ｂは、正常なコントロール、ＨおよびＮＳＣＣのコントロールおよびＮＣＭで処置したＨおよびＮＳＣＣ患者における密度を示す。 図３Ａは、Ｂ細胞領域を比較する棒グラフである。 図３Ｂは、３つの処置群における小胞を比較する棒グラフである。 図４Ａは、他の細胞の比較を示す。 図４Ｂは、３つの処置群における洞組織球増殖症の比較を示す。 図５は、節ＢおよびＴ（Ｂ細胞およびＴ細胞）および腫瘍ＢおよびＴフィットプロットを示すグラフである。 図６Ａは、ＳＨ＋ガン患者のリンパ節における部分的に未熟なＣＤ８３＋ＤＣの蓄積を図示する棒グラフである。

図６Ｂは、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）での処置の際のＣＤ８６＋活性化ＤＣの数の増大を示す棒グラフである。
図７は、ＤＣでのＣＤ８３発現の増大によって検出される、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）がＤＣ成熟を誘発することを示しているグラフである。 図８は、サイトスピン調製物における単球由来ＤＣの形態に対するＮＣＭの影響を示す。ＮＣＭで処理した細胞（図８Ｂ）は、細胞突起および大型不定形状の核のような成熟ＤＣの形態学的特徴を示した。 図９は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）とともにインキュベートされたＰＢＭＣによる、ＣＤ１ａ抗原発現の下方制御、ならびにＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）抗原発現の上方制御を示すヒストグラムを含む。これらの変化は、ＮＣＭがＤＣの成熟を刺激することを示す。 図１０は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣ成熟の指標である活性を低下する未熟なＤＣの細胞内活性を減じることを示すグラフである。 図１１は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣのＴ細胞刺激能を増強することを示しているグラフでありその増強体はＤＣの成熟および活性化の指標である。 図１２Ａは、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、細胞内でＩＬ−１２を産生するＤＣの数を増大することを示している棒グラフである。ＩＬ−１２は成熟活性化ＤＣによって産生されるサイトカインである。 図１２Ｂは、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣによって分泌される生理活性ＩＬ−１２の総量を増大することを示している棒グラフである。 図１３は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が、ＤＣにおけるＶＥＧＦ媒介性アポトーシスを軽減することを示している棒グラフであり、このことは、ＤＣ生存に関するＮＣＭの防御効果を示している。 図１４は、ＮＣＭ、ＣＹおよびＩＮＤＯを２４ヶ月用いて処置した患者の生存割合（用量応答）を図示しているグラフであり、ここで「ｘ」は、ＮＣＭのＩＬ−２当量の約１００ＩＵ／ｍＬに等しい。 図１５は、皮膚試験患者、すなわちプロトコール内の患者、皮膚試験陰性のプロトコール外の患者、および皮膚試験陽性のプロトコール外の患者の３つのグラフの２４ヶ月にまたがる疾患特異的な生存を比較している線グラフである。 図１６Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＮＣＭを用いる接着性ＰＢＭＣの処置後、活性マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の組み合わせについて単球／マクロファージ染色陽性の割合の増大を示している２つの棒グラフを含む。 図１６Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＮＣＭを用いる接着性ＰＢＭＣの処置後、活性マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０について平均蛍光強度（ＭＦＩ）における増大を示している一連の棒グラフである。 図１７は、本発明のＮＣＭが単球／マクロファージを活性化する、すなわち、ＴＮＦ−αより大きい程度まで、活性マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の発現を誘導することを実証している棒グラフを含む。 図１８は、本発明のＮＣＭが単球／マクロファージを活性化する、すなわち、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の存在下でさえ、活性マーカー、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、およびＣＤ４０を誘導することを実証している棒グラフを含む。ＮＣＭは、ＩＬ−１０の存在下および非存在下の両方において、ＬＰＳよりも単球／マクロファージの活性化に優れている。 図１９は、本発明のＮＣＭが活性化された単球／マクロファージからのＴＮＦ−αの産生を刺激して、ＩＬ−１０の免疫抑制効果を克服することを実証している棒グラフである。ＮＣＭは、ＬＰＳよりを上回る程度までＴＮＦ−αの産生を刺激した。

Claims (56)

1. サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含む、天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）の組成物であって、該サイトカインが天然に作成されても、組み換え体であっても、または天然に作成されるものおよびその組み換え体の混合物であってもよい、組成物。
2. 前記ＩＬ−１が、約６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−２が、約６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−６が、約６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−８が、約６，０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、かつ前記ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが、約２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＩＬ−１が、約１５０〜１，２００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−２が、約３，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−６が、約３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−８が、約２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、かつ前記ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが、約１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ＮＣＭが、薬学的に受容可能なキャリア中で提供される、請求項１に記載の組成物。
5. サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含む天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）の有効量を含む、細胞免疫不全を処置するための組成物であって、該サイトカインが天然に作成されるか、その組み換え体か、又は天然に作成されるかもしくは組み換え体の混合物である、組成物。
6. 前記ＩＬ−１が、約６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−２が、約６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−６が、約６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−８が、約６，０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、かつ前記ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが、約２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度である、請求項５に記載の組成物。
7. 前記ＩＬ−１が、約１５０〜１，２００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−２が、約３，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−６が、約３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−８が、約２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、かつ前記ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが、約１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度である、請求項５に記載の組成物。
8. 前記ＮＣＭが、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含み、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦが天然に作成されるか、その組み換え体か、または天然に作成されるかもしくは組み換え体の混合物である、請求項５に記載の組成物。
9. 前記細胞免疫不全が、Ｔリンパ球減少症によって特徴付けられるものである、請求項５に記載の組成物。
10. 前記細胞免疫不全が、１つ以上の樹状細胞機能欠陥によって特徴付けられるものである、請求項５に記載の組成物。
11. 前記細胞免疫不全が、リンパ節洞組織球増殖症である、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記細胞免疫不全が、１つ以上の単球機能欠陥によって特徴付けられるものである、請求項５に記載の組成物。
13. 前記細胞免疫不全が、ＮＣＭに対する皮膚試験陰性によって特徴付けられるものである、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記ＮＣＭが４０〜５００単位のＩＬ−２を含む、請求項５に記載の組成物。
15. 有効量の化学インヒビター（ＣＩ）および有効量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む腫瘍誘発性免疫抑制を逆転させるための組成物。
16. 前記ＮＳＡＩＤが、インドメタシン（ＩＮＤＯ）、イブプロフェンおよびＣｏｘＩＩインヒビターまたはその組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記化合インヒビターが抗悪性腫瘍薬である、請求項１５に記載の組成物。
18. 前記抗悪性腫瘍薬がアルキル化剤である、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記アルキル化剤がシクロホスファミドである、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記抗悪性腫瘍薬が代謝拮抗剤である、請求項１７に記載の組成物。
21. 前記抗悪性腫瘍薬が抗生物質である、請求項１７に記載の組成物。
22. 前記化学的インヒビターが、免疫調節剤である、請求項１５に記載の組成物。
23. 有効量の少なくとも１つのサイトカインをさらに含み、該サイトカインが組み換えか、天然か、またはペグ化されている、請求項１５に記載の組成物。
24. 有効量のＮＣＭをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
25. 前記ＮＣＭが、有効量のサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含み、該サイトカインが天然に作成されるか、組み換え体であるか、ペグ化されるか、またはその組み合わせである、請求項２４に記載の組成物。
26. ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含み、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦが天然に作成されるか、組み換え体であるか、ペグ化されるか、またはその組み換え体である、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記ＣＩおよびＮＳＡＩＤが、薬学的に受容可能なキャリア中で提供される、請求項１５に記載の組成物。
28. 細胞免疫不全を処置する方法であって、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αを含む有効量のＮＣＭを投与する工程を包含し、該サイトカインが天然に作成されるか、その組み換え体か、または天然に作成されるかもしくは組み換え体の混合物である、方法。
29. 前記ＩＬ−１が、約６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−２が、約６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−６が、約６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−８が、約６，０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、かつ前記ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが、約２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＩＬ−１が、約１５０〜１，２００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−２が、約３，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−６が、約３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、前記ＩＬ−８が、約２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度であり、かつ前記ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが、約１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍｌの濃度である、請求項２８に記載の方法。
31. 前記ＮＣＭが、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含み、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦが天然に作成されるか、その組み換え体か、または天然に作成されるかもしくは組み換え体の混合物である、請求項２８に記載の方法。
32. 前記投与工程が、ＮＣＭをＩＬ−２当量の４０〜５００単位で投与するものとしてさらに規定される、請求項２８に記載の方法。
33. 前記投与工程が、リンパ節に流れるリンパ管へＮＣＭを両側性に投与するものとしてさらに規定される、請求項２８に記載の方法。
34. 前記投与工程が、ＮＣＭを一側性に投与するものとしてさらに規定される、請求項２８に記載の方法。
35. 前記投与工程が、少なくとも１〜１０日間ＮＣＭを投与するものとしてさらに規定される、請求項２８に記載の方法。
36. 前記投与工程が、最大約２０日間までＮＣＭを投与するものとしてさらに規定される、請求項３５に記載の方法。
37. 前記投与工程が、両側性にかつ約１０日間ＮＣＭを投与するものとしてさらに規定される、請求項２８に記載の方法。
38. 前記投与工程が、腫瘍の再発の間、ＮＣＭを投与するものとしてさらに規定される、請求項２８に記載の方法。
39. 前記細胞免疫不全が、Ｔリンパ球減少によって特徴付けられるものである、請求項２８に記載の方法。
40. 前記細胞免疫不全が、１つ以上の樹状細胞機能的欠陥によって特徴付けられるものである、請求項２８に記載の方法。
41. 前記細胞免疫不全がリンパ節洞組織球増殖症である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記細胞免疫不全が、１つ以上の単球機能欠陥によって特徴付けられるものである、請求項２８に記載の方法。
43. 前記細胞免疫不全が、ＮＣＭに対する皮膚試験陰性によって特徴付けられるものである、請求項４２に記載の方法。
44. 有効量の化学インヒビター（ＣＩ）と有効量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とを投与する工程を包含する、腫瘍誘発性免疫抑制を逆転させる方法。
45. 前記ＮＳＡＩＤがインドメタシン（ＩＮＤＯ）、イブプロフェンおよびＣｏｘＩＩインヒビター、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
46. 前記化合インヒビターが抗悪性腫瘍薬である、請求項４４に記載の方法。
47. 前記抗悪性腫瘍薬がアルキル化剤である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記アルキル化剤がシクロホスファミドである、請求項４７に記載の方法。
49. 前記抗悪性腫瘍薬が代謝拮抗剤である、請求項４６に記載の方法。
50. 前記抗悪性腫瘍薬が抗生物質である、請求項４６に記載の方法。
51. 前記化学インヒビターが免疫調節剤である、請求項４４に記載の方法。
52. 有効量の少なくとも１つのサイトカインを投与する工程をさらに包含し、該サイトカインが組み換え体か、天然か、またはペグ化されている、請求項４４に記載の方法。
53. 有効量のＮＣＭを投与する工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
54. 前記ＮＣＭが、有効量のサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含み、該サイトカインが天然に作成されるか、組み換え体であるか、ペグ化されるか、またはその組み合わせである、請求項５３に記載の方法。
55. 前記ＮＣＭが、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含み、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦが天然に作成されるか、組み換え体であるか、ペグ化されるか、またはその組み合せである、請求項５３に記載の方法。
56. 前記ＮＣＭが、ＩＬ−２当量の４０〜５００単位の濃度で投与される、請求項５３に記載の方法。

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