JP2009529926A - ゲル化複合体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細孔をもちそしてポリマー及びゲル形成のためのゲル形成イオンを含む発泡体を用意し、該イオンとの接触でゲルを形成できるゲル化サイトをもつ可溶性ポリサッカライドを含む液体成分を該発泡体と接触させ、それによって該イオンとの接触で、可溶性ポリサッカライドを含むゲルが該発泡体の細孔内に形成されることを特徴とする複合体の発泡方法及びこの方法でつくられた発泡体とその使用。
Description
例えば、創傷処置、組織工学、組織再生及び細胞固定で使用するのに適した製品を供給するためのニーズが存在する。
一観点においては、本発明は、発泡体及び発泡体の細孔内で、インシツで形成されるゲルを含む複合体を形成するための方法を提供するが、その方法は細孔をもち、ポリマー、好ましくは架橋可能なポリマー、及びゲルを形成するためのゲル形成イオンを含む発泡体を準備し、該イオンとの接触でゲルを形成できるゲル化サイトをもつ可溶性ポリサッカライドを含む液体成分を該発泡体と接触させ、それによって該イオンとの接触で、可溶性ポリサッカライドを含むゲルが該発泡体の細孔内に形成されることを特徴とする複合体の発泡方法である。
更なる観点においては、本発明は本発明の方法に従ってつくられた複合体の使用方法を提供する。
複合体は発泡体構造内で、インシツで生成したゲルを含みそしてゲルは発泡体内に分散する。複合体は特に医療用途、例えば創傷処置、組織工学及び組織再生及び細胞固定において使用するのに好適である。
好ましい態様においては、発泡体は植物又は動物由来のバイオポリマーから形成される。そのような発泡体は、例えば特許文献6、特許文献7、特許文献4又は特許文献5に開示されているような先行技術のプロセスに従ってつくられる。
ポリサッカライドを含む液体成分と反応するためのゲル形成イオンは、発泡体の調製過程で取り込まれるか又は好ましくは液体成分の添加前に発泡体に添加される。ゲル形成イオンは、湿潤発泡体内で混合物の形成前に混合物、好ましくはバイオポリマー混合物内に分散させるか又は形成した発泡体に添加されることによって取り込まれる。所望により、追加のゲル形成イオンは、発泡体と添加されたポリサッカライドを含むゲルを含む複合体に添加される。ゲル形成イオンは、例えば発泡体を、発泡体を溶解させないゲル化イオン溶液で洗浄するか浸漬することによって取り込まれる。過剰の溶液は圧縮によって除去される。
好ましい態様においては、複合体は実質上均一なゲルを含む。
一態様においては、発泡体マトリックスのために使用されるポリマーはゲル形成イオンとゲル化するポリサッカライドを含む。好ましい態様においては、発泡体は、所望により、例えば特許文献7に記載されているような発泡剤を含む架橋したバイオポリマーを含む。
好ましい態様においては、本発明は、a)ポリサッカライド、及び発泡剤及び所望による可塑剤、架橋剤及びpH変性剤の一つ以上を含む水溶液分散物から湿潤発泡体を形成し;b)所望により機械攪拌によって、水溶液分散物から発泡体を混合し;c)i)発泡体を成形し;そしてii)発泡体から架橋した発泡体を形成する工程の一つ以上を所望により実施し;d)連続細孔を含む乾燥発泡体を形成するために発泡体を乾燥し;そして工程a)からd)の一つ以上に、又は工程d)の後でゲル形成イオンを添加することを特徴とする、連続細孔ネットワークと細孔をもち引き続き添加されたポリサッカライド溶液をゲル化させるためのゲル形成イオンを含む乾燥吸収発泡体を形成する方法を提供する。
本発明で使用される発泡体は、好ましくはポリサッカライドである。発泡体を製造するための好適なポリサッカライドの例としては、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩、キトサン及びそれらの混合物を包含する。アルギン酸塩、キトサン及びヒアルロン酸塩が好ましいポリサッカライドである。
発泡体はそれ自身本発明の複合体として同じ用途の製品として使用されてもよい。
別の態様においては、発泡体は可溶性ポリサッカライド中のゲル化サイトに比較してゲル形成イオンの過剰を含む。ゲル形成イオンの少なくともいくつかは、発泡体構造内のゲル形成イオンとの相互作用によってゲル化する可溶性ポリサッカライドの添加前に発泡体中に取り込まれる。
ラミナリアハイパーボリー(幹) 70 14−16
ラミナリアハイパーボリー(葉) 54 11−13
レッソニアトラベキュラータ 66 13−15
マクロシスチスピリフェーラ 39 8− 9
可溶性ポリサッカライドからゲルを製造するために好適な可溶性ポリサッカライドの例としては、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩、キトサン及びそれらの混合物を包含する。アルギン酸塩、キトサン及びヒアルロン酸塩が好ましい可溶性ポリサッカライドである。
本発明の複合体は、新しい組織の成長を導く鋳型を与えそして栄養分を細胞に到達させそして***物を取り除くことを確保する三次元の足場上に播種された細胞を使用して、機能的な組織が作り出される、組織成長及び組織工学において有用である。本発明の複合体は所望の内部成長を容易にしそして調節可能なそして予測可能な方法で分解を経験するように製作することができる。例えば、新しく発達した組織が複合体に広がるとき、複合体は好適に分解しそして新しい組織形成のためのスペースを与える。複合物はまた、複合体が、例えば細胞相互作用分子及び成長因子の放出、例えば骨、神経、皮膚及び軟骨の再生によって移植される領域中で固定された細胞との特定の相互作用を刺激するようにつくられる。その複合体は、所望の幾何形状に基づく細胞の内部成長を助長する成長因子を放出しそして移植のコントロールされた分解は再生された骨組織が加重に耐えることを可能にする。本発明の複合体は、カルシウムイオン又はストロンチウムイオンを、それぞれゲル形成イオンとして使用することによって、細胞増殖を促進するか又は阻害するように設計することができる。
アルブミン
牛のアルブミン、フラクションV、約99%(A−3059)(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
抗生物質−抗真菌剤
抗生物質−抗真菌剤溶液(0710)GIBCO(商標)(インビトロゲン社、グランドアイランド、NY,USA)
C2C12
マウスミオブラストセルライン(ATCC#CRL−1772)
CaCl2
塩化カルシウム二水和物、Ph.Eur.リーデル−デハーエン、ドイツ)
CaCl2
塩化カルシウム二水和物(1.02382.1000)(メルク KgaA,ダームスタット、ドイツ)
CaCO3
エスカール500、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜5.2μm(KSLシュタウブテクニーク、ドイツ)
CaCO3
ヒューバーカル500エリート、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜4.2μm(ヒューバーエンジニアードマテリアルズ、フィンランド)
ヒューバーカル250エリート、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜8.7μm(ヒューバーエンジニアードマテリアルズ、フィンランド)
カルセイン
カルセイン、AM、1mg/ml(C3099)(インビトロゲン、モレキュラープローブズ、USA)
クエン酸塩
クエン酸ナトリウム二水和物、A.C.S試薬(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
FBS
胎児の子牛血清、GIBCO(商標)(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
蛍光デキストラン10kDA
デキストラン、フルオレッセイン、10000 Mw、アニオン性(D−1821)(モレキュラープローブス、オレゴン、USA)
蛍光デキストラン70kDA
デキストラン、フルオレッセイン、70000 Mw、アニオン性(D−1822)(モレキュラープローブス、オレゴン、USA)
グルコノδ−ラクトーン(ロケッテ、イタリー)
グリセリン
グリセリン、Ph.Eur.(VWRプロラボ、ローベン、ベルギー)
成長媒体
コンドロサイトのために変性されたダルベッコーズイーグル媒体(D−MEM)
コンドロサイト
(61695−026)GIBCO(商標)(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)10%熱不活性化したFBS(56℃で20分)、1%抗生物質−抗真菌剤及び1%ピルビン酸ナトリウム添加。
成長媒体
C2C12細胞のために変性されたダルベッコーズイーグル媒体(D−MEM)
C2C12細胞
(D−7777)(シグマケミカルCo.セントルイス、USA)。10%の熱不活性化したFBS(56℃で20分)、3.7g/lのNaHCO3、10ml/lの非−必須アミノ酸、10ml/lのペニシリン−ストレプトマイシン溶液、1.4mg/lのプロマイシン及びMQ−水を添加した。
MDCK細胞(M0643)のための最小必須媒体イーグル(MEM)
MDCK細胞
(シグマケミカルCo.セントルイス、USA)。10%の熱不活性化したFBS(56℃で20分)、10ml/lのペニシリン−ストレプトマイシン溶液、2.2g/lのNaHCO3及びMQ−水を添加した。
GDL
グルコノδ−ラクトーン(ロケッテ、イタリー)
グリセリン
グリセリン、Ph.Eur.(VWRプロラボ、ローベン、ベルギー)
ハンクス
ハンクのバランス塩溶液;NaHCO3で変性;フェノールレッド、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムなし(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
ファーマコート603、置換タイプ2910、ハイプロメローズ USP、(ヒドロキシプロピルメチルセルロース)(信越化学株式会社、日本)
イソトンII
COULTER(商標)ISOTON(商標)II希釈液(ベックマンコウルター、ドイツ)
生/死テストキット
動物細胞の成育可能性/細胞毒性キット(インビトロゲン、モレキュラープローブス、オレゴン、USA)
マンニトール
D−マンニトール98%(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
MDCK
マディンダービーカリーンキドニーセルライン(ATCC#CCL−34)
MQ−水
ミリQ水
塩化ナトリウム、p.a.,(メルク、ドイツ)
NaHCO3
炭酸水素ナトリウム(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
Na2HPO4
燐酸水素二ナトリウム:30427(リーデル−デハーエン、ドイツ)
Na−トリフォスフェート
Na−トリフォスフェートペンタベーシック(T5883−500G)(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
NOVATACH RGD
ペプチド結合したプロノーバアップMVGアルギネート、バッチ:CBIFMC01A02122005,殺菌ろ過し凍結乾燥した。ペプチド配列:GRGDSP.ペプチド:アルギネート比=9.11:1
NOVATACH VAPG
ペプチド結合したプロノーバアップMVGアルギネート、バッチ:CBIFMC02A02122605,殺菌ろ過し凍結乾燥した。ペプチド配列:VAPG.ペプチド:アルギネート比=13.5:1
ペニシリン−ストレプトマイシン溶液(P0781)(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
プロタナール(商標)LF200S
アルギン酸ナトリウム、薬用グレード、粘度(20℃で1wt%水溶液)=302mPas(FMC、フィラデルフィア、USA)
プロノーバアップMVG
アルギン酸ナトリウム、バッチ:701−256−11、粘度(20℃で1wt%水溶液)=385mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバアップLVG
アルギン酸ナトリウム、バッチ:FP−502−04、粘度(20℃で1wt%水溶液)=50mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバSLG100
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度(20℃で1wt%水溶液)=166mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバSLG20
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度(20℃で1wt%水溶液)=37.5mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度(20℃で1wt%水溶液)=9.0mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバSLM20
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度(20℃で1wt%水溶液)=92mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバアップLVG
アルギン酸ナトリウム、粘度(20℃で1wt%水溶液)=25mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバアップLVG
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ:221105、粘度(20℃で1wt%水溶液)=35mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバアップLVG
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ:FP−502−04、粘度(20℃で1wt%水溶液)=50mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバアップLVG
アルギン酸ナトリウム、粘度(20℃で1wt%水溶液)=92mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ:FP−310−01、粘度(20℃で1wt%水溶液)=296mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバアップMVG
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ:FP−312−03、粘度(20℃で1wt%水溶液)=248mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロノーバアップMVG
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ:701−256−11、粘度(20℃で1wt%水溶液)=385mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロタサンCL210(214)
塩化キトサン、バッチ:708−783−01、脱アセチル化:94.5%、pH=5.3、粘度(20℃で1wt%水溶液)=77mPas(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロタサンアップCL213
超高純度塩化キトサン、バッチ:FP−104−02,粘度(20℃で1wt%水溶液)=74mPas、脱アセチル化率=86%(ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー)
プロピジウムイオダイド
(P4170)(シグマケミカルCo.セントルイス、USA)
プロマイシンジヒドロクロライド(P7255)(シグマケミカルCo.セントルイス、USA)
ヒアルロン酸ナトリウム
薬品グレード80、バッチ:17053P、分子量:1.08*106g/モル(紀文フードケミファ社用のノバマトリックス、日本)
ピルビン酸ナトリウム
ピルビン酸ナトリウム100mM溶液(S−8636)(シグマケミカルCo.セントルイス、USA)
ソルビトール
生化学用のD(−)ソルビトール、乾燥、100%(メルク、KGaA、ドイツ)
ソルビトールスペシャル
70%ソルビトール溶液(SPIポリオールズ、USA)
SrCL2
塩化ストロンチウム六水和物99%A.C.S.試薬(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
SrCO3
炭酸ストロンチウム99.9+%(シグマ−アルドリッチケミーGmbH、ドイツ)
テストされた三つの異なった発泡体用の湿式発泡体処方を表1に示す。その処方は、カルシウムイオンがアルギネートのゲル化サイトを飽和させるのに十分なように、炭酸カルシウムを、それぞれ66%、111%及び155%で変化させた。
発泡体パッチを直径3.5cmのペトリ皿中に置きそしてモデル生理溶液(2.5mMのCaCl2 と9mg/mlのNaCl)4mlを添加した。発泡体を、ボーリンCVO120高解像度レオメーターに移す前にこの溶液中に5分間保存した。発泡体を、振動測定の前に、500μmの隙間をもつ鋸歯状プレート間に置いた。0.5Paから50Paのせん断応力を適用して、応力掃引を行った。周波数は1Hzにセットした。それぞれの発泡体パッチに対して掃引を3回行った。線形粘弾性領域で読み取られる弾性率、G’,(G’lin)を表2に示す。テストは二つの異なった温度で行った。添加された生理溶液の温度、掃引過程及び測定過程の温度は20℃か37℃であった。
実施例1の111%飽和発泡体からの乾燥発泡体ディスク(直径約2.1cm)をペトリ皿中に置きそして250μlの1%プロノーバアップLVG(99mPas)を発泡体の頂部表面に室温で60分間添加した。それから、CaCl2の50mM溶液又はSrCl2の50mM溶液のいずれかの4ml中で培養した。5分後は、モデル生体溶液で置き換えた余分なゲル形成イオンを含む溶液であったそして別の5分後は、実施例1で記載されたように測定されたG’linであった。添加された余分のゲル形成イオンを受け取らなかった別のサンプルはアルギネートが添加された60分後に添加されたモデル生体溶液を含んでおり、そしてG’linは膨潤の5分後に測定された。結果を表6に示す。
グリセリン、ソルビトールスペシャル、アルギネート水溶液、及びHPMCを同じボウル中に添加しそして分散物を、ワイヤーブラシを備えたホバートキッチンエイドミキサーで、均一性を確保するために中速度で1分間ブレンドした。100%飽和発泡体の場合は、混合を高速で3分間続けた。GDLを残りの25gの水中に溶解させそして湿潤発泡体中に添加した。分散物は高速でさらに30秒間混合した。100%発泡体の得られた湿潤密度は0.23g/mlであった。200%発泡体の場合は、高速混合時間は、GDL添加前で3.5分で、それからさらに高速混合を15秒間行った。200%発泡体は0.26g/mlの湿潤密度をもっていた。両方の発泡体を、1mm高さでテフロン被覆した成形型中に投入しそして乾燥オーブン中で、80℃で30分間乾燥する前に室温でカバーをしないで保存した。
殺菌したアルギネート(プロノーバSLG100)を細胞成長媒体(MEM)中に溶解させ1%アルギネート溶液とした。このアルギネート溶液とMDCK細胞の懸濁物を成長媒体中でブレンドして、アルギネートの最終濃度0.8%及び200000細胞/mlとした。アルギネート発泡体ディスクを、ウエル(well)サイズにぴったり適合する6個のウエルプレート(Nunclon(商標)、Nalgene Nunc international)内のウエルに移した。アルギネート細胞懸濁物の1.0mlを発泡体のそれぞれに、ピペットで滴下して分配しそしてアルギネート複合体を37℃で20分間培養した。100%及び200%飽和した発泡体中に存在するカルシウムイオンはアルギネート合計量のゲル化サイトの、それぞれ67%及び133%を飽和させるのに十分であった。サンプルの半分はそれから、50mMの塩化カルシウム及び104mMのNaClを含む水溶液約5ml中にそれらを添加することによって、洗浄後処理を与えられた。10分後に、塩溶液を細胞成長媒体で置き換えた。培養20分後に、残ったサンプルに細胞成長媒体を添加した。固定された細胞をもつアルギネート複合体を37℃で保存しそして成長媒体を一週間に3回交換した。増殖及び生育可能性の定量化は固定後の異なった時間後に測定された。固定された細胞は、約8mlの等浸透圧のコハク酸塩溶液(50mMのコハク酸三ナトリウム二水和物と104mMのNaCl)を含む遠心分離管にアルギネート複合体を移すことによって単離した。その管を、複合体が2−10分以内で溶解するまで静かに回転し、そしてそれから13000rpmで5分間遠心分離にかけた。上澄み液を取り去りそして細胞を含むペレットを250mMのマンニトール1.0ml中に再懸濁させた。再懸濁させたペレットの100μl、80μl、及び50μlのそれぞれのサンプルを96個のウエルプレート(Nunclon(商標)、Nalgene Nunc international)内のウエルに移した。それから、マンニトールの0、20μl、及び50μlをそれぞれ添加して(即ち、それぞれのウエルを合計100μlに満たすために)それから生/死試薬のさらに100μlを添加した。生/死試薬は、5mlのマンニトール溶液(250mM)、20μlのエチジウム溶液(2mM)及び5μlのカルセイン溶液(4mM)からつくられた。0−106個の細胞の範囲内で成育しうるそしてエタノール固定した細胞から標準曲線を調製した。
複合体を生/死試薬内に浸漬した後で、蛍光顕微鏡でそれを調べると、洗浄した複合物サンプルはより多い細胞漏れ出しがあることを示した。
殺菌したアルギネート発泡体を、ウエル(well)サイズにぴったり適合する12個のウエルプレート(Nunclon(商標)、Nalgene Nunc international)内のウエルに移した。1%アルギネート溶液(プロノーバSLG20)の300μlを発泡体にピペットで滴下して分配した。発泡体をそれから37℃で20分間培養した。発泡体中に存在するカルシウムイオンは複合体中のアルギネートの合計量を97%飽和させるのに十分であった。成長媒体(D−MEM)を発泡体の三分の一に添加した。等浸透圧のカルシウム溶液(50mMの塩化カルシウム及び250mMのマンニトール)の約2mlを残りの発泡体の半分に添加し、一方残りの発泡体の他の半分は等浸透圧のストロンチウム溶液(50mMの塩化ストロンチウム及び250mMのマンニトール)を受け取った。ゲル化溶液を約2−5分後に成長媒体で置き換えた。固定化された細胞をもつ発泡体を37℃に保ちそして成長媒体を週に3回交換した。
この実施例で使用されたアルギネート発泡体はアルギネートの125%を飽和させるのに十分なカルシウムを添加したものであった。湿式発泡体処方を表14に示す。
4%のキトサン塩を含む水溶液をプロタサンCL20(214)を使用して調製した。77.0gのMQ−水及び14.0gのソルビトール(乾燥)を混合ボウルに添加しそしてボウルをゆっくり混合しながらソルビトールを溶解させた。100gのキトサン溶液、6.0gのグリセリン及び3.0gのHPMCを、同じ混合ボウルに添加した。分散物を、ワイヤーブラシを備えたホバートキッチンエイドミキサーで、中速度で1分間均一性を確保するためにブレンドした。混合を高速で2.5分間続けた。湿潤密度は0.23g/mlと測定された(100ml容器を満たすのに必要な湿潤発泡体の重量から決定した)。湿潤発泡体をテフロンで被覆した2mm及び4mm高さの成形型中に投入しそれから乾燥オーブン中に80℃で、それぞれ30分及び60分置いた。
得られた発泡体は、連続細孔ネットワークをもった柔軟でソフトなものであった。水を発泡体に添加すると、それは直ちに吸収されそして発泡体はかなり膨張した。水和された発泡体はその形状を維持したが、比較的弱くてその湿潤発泡体はひと隅からもちあげて一個を移すことができなかった。水和前の乾燥発泡体を圧縮しても発泡体の吸収速度又は吸収能力にあまり影響を与えなかった。
キトサン発泡体を、中速及び高速での混合時間をそれぞれ1.5分及び4.5分にしたこと以外は、実施例11に記載されたようにして作った。得られた湿潤発泡体密度は0.20g/mlであった。湿潤発泡体を2mm及び4mm深さの型に投入した。それから、Na−トリフォスフェートの100mM溶液を、細かな液滴を与えるように調節されたノズルをもつスプレーボトルに満たした。Na−トリフォスフェート溶液を湿潤発泡体上に、2mm及び4mmに対してそれぞれ約50ml及び100mlをスプレーした。湿潤発泡体はスプレーされた溶液を幾分か吸収したので、添加は、各添加間を1秒以内で数回行った。湿潤発泡体をそれから、乾燥オーブン中で80℃で、2mm及び4mm型に投入された発泡体に対して、それぞれ1時間及び2時間乾燥した。
発泡体ディスク(直径=2.1cm)を、実施例12で示した4mm高さの型に投入された発泡体からコルクボーラーを使用して打ち抜いた。発泡体ディスクをそれから、前の実施例で使用したのと同じレオメーターの鋸歯状プレート上に置いた。ディスクにそれからMQ−水又は1.0%のキトサン溶液(プロタサンアップCL213)の過剰水溶液を添加した。上方のプレート(PP25)を500μmの隙間に下げそしてせん断応力を0.5Paから50Paかけて応力掃引を行った。振動測定を、溶液添加後約3分で開始した。振動数は1Hzに設定した。掃引は各発泡体パッチに対して2回行った。線形粘弾性領域で読まれる弾性率、G’(G’lin)及び位相角を表18に示す。
キトサン発泡体を、異なった発泡体密度を得るために異なった混合時間を使用したこと以外は、実施例10に記載されたようにして調製した。湿潤発泡体を作るための全ての発泡体成分を中速度で1.5分混合した。高速混合を1分間続けると、得られた湿潤密度は0.45g/mlであった。約半分の発泡体を4mm及び2mm高さの型に投入した。それから残りの発泡体をさらに1分間高速で混合した。得られた湿潤密度は0.29g/mlであり、そして発泡体の残りを上述のように投入した。高速での混合時間が第一が45秒で第二が4分45秒であったこと以外は、上記の同じ手順を繰り返した。湿潤密度はそれぞれ0.52g/ml及び0.18g/mlであった。最も高い湿潤密度をもった二つの発泡体は、成形型側の表面で作られた薄いフィルムを得た。これは、発泡体が底部近くで、よりゆっくりと乾燥するときの細孔の合体による。乾燥発泡体密度は4mm高さの型に投入された発泡体から、コルクボーラーを使用して1cmの直径でディスクを打ち抜くことによって決定された。異なった発泡体の密度及びノギスによって測定された厚みを表19に示す。発泡体は、適用応力範囲が0.5Paから18Paであり、そしてそれぞれの発泡体片のために三つの掃引が実施されたこと以外は、実施例10に記載されたのと同じレオメーター設定をもつその弾性率G’linによって特徴付けられた。結果は表19に含まれ、直径1cmをもつ三つの異なった発泡体の最後の二つの掃引の平均値を示している。発泡体片を、レオメーターに移す前に、約5分間2mlのハンク溶液中に保持した。乾燥した発泡体の引っ張り張力は、SMSテキスチャー解析器及びA/TG引っ張りグリップを使用して測定した。破壊するまでに、0.5mm/sで発泡体を引き延ばすのに必要な力が読み取られ、そしてそれが破壊したときの最大力と伸びの距離を表19に示す。発泡体片を、3.15cm長さ、端部で1.75cm幅そして中心で1.25cm幅、狭いところが端部から1cmの寸法となるように小刀を使用して骨形状に切断した。発泡体を、発泡体の中央で破壊を起こさせそしてグリップに付着しているところではないようにしてこの形状に切断した。発泡体の各端部のほぼ0.3cmがそれをグリップに固定するために使用された。
Claims (57)
- 細孔をもちそしてポリマー及びゲル形成のためのゲル形成イオンを含む発泡体を用意し、該イオンとの接触でゲルを形成できるゲル化サイトをもつ可溶性ポリサッカライドを含む液体成分を該発泡体と接触させ、それによって該イオンとの接触で、可溶性ポリサッカライドを含むゲルが該発泡体の細孔内に形成されることを特徴とする複合体の発泡方法。
- 発泡体が殺菌されている請求項1記載の方法。
- ゲル形成イオンの少なくとも一部が、ゲル形成イオンを含む溶液中で発泡体を洗浄するか又は浸漬しそれから過剰の溶液を除去することによって取り込まれる請求項1又は2記載の方法。
- 発泡体がバイオポリマーからなる請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 発泡体が、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩、キトサン及びそれらの混合物から選択されたポリサッカライドからなる請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 発泡体が変性アルギン酸塩からなる請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 発泡体が、少なくとも一つの細胞付着ペプチド配列をもった変性アルギン酸塩からなる請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 発泡体中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩の平均分子量が約10kDaから約500kDaである請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 発泡体中のアルギネートの平均分子量が約50kDaから約300kDaである請求項8記載の方法。
- 発泡体中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩が20%以上のG含量をもつ請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ゲル形成イオンが、可溶性ポリサッカライドのゲル部分の少なくとも10%に相当するモル量で存在する請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- ゲル形成イオンが、可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの5%から250%に相当するモル量で存在する請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- ゲル形成イオンがカルシウムイオンからなり、そしてゲル化イオンが可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの5%から200%に相当するモル量で存在する請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- ゲル形成イオンがストロンチウムイオンからなり、そしてゲル化イオンが可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの少なくとも5%から200%に相当するモル量で存在する請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- ゲル形成イオンがバリウムイオンからなり、そしてゲル化イオンが可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの少なくとも5%から200%に相当するモル量で存在する請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 可溶性ポリサッカライドが可溶性ポリサッカライドを含む該液体の約0.2%から約10%の重量濃度をもつ請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 可溶性ポリサッカライドが可溶性ポリサッカライドを含む該液体の約0.5%から約5%の重量濃度をもつ請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 液体成分中のポリサッカライドがアルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩及びペクチン及びそれらの混合物から選択されたものである請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- ポリサッカライドがアルギン酸塩からなる請求項18記載の方法。
- もし人体内に移植される発泡体/ゲル複合体用に使用されるときは、アルギン酸塩が100EU/g以下のエンドトキシン含量をもつ請求項19記載の方法。
- 可溶性ポリサッカライドが、約4000ダルトンから500000ダルトンの平均分子量をもったアルギン酸塩からなる請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 液体成分中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩が約20%から約80%のG含量をもつ請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 液体成分中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩が少なくとも20%のM含量をもつ請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 該液体成分が約2mPasから約500mPasの粘度をもつ請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 液体成分が約10mPasから約200mPasの粘度をもつ請求項24記載の方法。
- 該液体成分がさらに機能性成分を含む請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 機能性成分が風味剤、芳香剤、粒子、細胞、多細胞集合体、治療剤、組織再生剤、成長因子、及び機能性食品からなる群から選択される請求項26記載の方法。
- 該液体成分が機能性成分に対して不活性であるか機能性成分を安定化させる請求項27記載の方法。
- ポリサッカライドが細胞付着ペプチド配列を含んでいる請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 発泡体の細孔内にゲルをもつ発泡体からなる複合体であって、該複合体が請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって得られることを特徴とする複合体。
- i)発泡体が細孔をもちそして発泡体の少なくとも一部に分布しているゲル形成イオンを含む発泡体;及びii)ポリサッカライドを含むゲルであって、ゲルが発泡体の細孔内に位置しそして発泡体と相互作用していることを特徴とする複合体。
- 細孔をもつ発泡体からなり、発泡体がゲル形成イオンをもち、ポリサッカライドゲルが細孔の少なくともいくつかに存在する複合体。
- 発泡体が、水、生理溶液、可溶性ポリサッカライド溶液からなる群から選択された液体を発泡体重量の1から30倍の重量で吸収し、そしてポリサッカライド溶液が機能性成分を含む請求項30から32のいずれか一項に記載の複合体。
- 複合体の弾性率が0.1kPaから1000kPaである請求項30から33のいずれか一項に記載の複合体。
- 発泡体及び/又はポリサッカライドが低含有量のエンドトキシンをもつ超高純度のポリサッカライドからなる請求項30から34のいずれか一項に記載の複合体。
- ポリサッカライドゲルがさらに機能性成分を含む請求項30から35のいずれか一項に記載の複合体。
- 機能性成分が風味剤、芳香剤、粒子、細胞、多細胞集合体、治療剤、組織再生剤、成長因子、及び機能性食品からなる群から選択される請求項36記載の複合体。
- 機能性成分が細胞からなる請求項37記載の複合体。
- ゲル形成イオンがバリウムイオン、ストロンチウムイオン、又はそれらの混合物を含む請求項38記載の複合体からなる細胞増殖阻害用の複合体。
- ゲル形成イオンがカルシウムイオンを含む請求項37から39のいずれか一項に記載の複合体からなる細胞増殖阻促進用の複合体。
- 発泡体がアルギン酸塩からなり、発泡体がさらに薬学活性剤及び/又は抗粘着剤から選択された機能性成分を含む請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって製造された複合体。
- 請求項37から40のいずれか一項に記載の複合体を、生体細胞に中性な浸透圧に調節したゲル形成イオンを含む溶液で洗浄することを特徴とする複合体中で細胞増殖を促進する方法。
- 洗浄工程が複合体の機械的性質を変性するように、ゲル形成イオンが選択される請求項42記載の方法。
- 複合体を洗浄するために使用される溶液が、約5mMから約200mMの濃度で、カルシウム塩、バリウム塩及びストロンチウム塩から選択された塩を含む請求項42又は43記載の方法。
- 請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって複合体を形成することからなると共に液体成分が細胞を含み、該ポリサッカライドが発泡体の細孔内でゲル化し、ゲル形成イオンがストロンチウムイオンを含むことを特徴とする細胞増殖を阻害する方法。
- 回収剤を含む水溶液を、可溶性サッカライドを含むゲルと接触させ、そこで該水溶液が生体細胞に中性な浸透圧を与えるように調節されていることを特徴とする請求項38記載の複合体から細胞を回収する方法。
- 回収剤がクエン酸ナトリウム又はその他のクエン酸の可溶性塩、EDTAナトリウム又はその他のEDTA可溶性塩、又はヘキサメタフォスフェートを含む請求項46記載の方法。
- インヴィトロの組織培養用途又はインヴィヴォの組織工学用途のための細胞固定及び/又は増殖のためのマトリックスとしての請求項30から41のいずれか一項に記載の複合体の使用。
- 複合体が、人や動物の身体に活性剤のインヴィヴォ徐放性を与えるための治療剤をさらに含む請求項30から41のいずれか一項に記載の複合体の使用。
- 複合体が、インヴィヴォの創傷処置を与えるための創傷処置に使用するための成分をさらに含む請求項30から41のいずれか一項に記載の複合体の使用。
- 組織に発泡体を固定し、該発泡体は連続細孔とゲル形成イオンをもち、可溶性ポリサッカライドを含む溶液を加えそしてポリサッカライドをゲル形成イオンと反応させることによって、請求項30から41のいずれか一項に記載の複合体を該組織へ取り付けるための方法。
- 縫合によって複合体を組織に取り付けることからなる請求項30から41のいずれか一項に記載の複合体の該組織への取り付け方法。
- 請求項1から29のいずれか一項に記載の方法によって製造される複合体を移植しそして、発泡体が細胞成長を確立させる目的で人又は動物の身体内にアルギン酸塩を含むことを特徴とする細胞成長の促進方法。
- 可溶性アルギン酸塩と水を含む液体成分を、ゲル化した、ゲル形成イオンを取り込んだ、連続細孔のアルギン酸塩発泡体に添加し;そして発泡体が液体を吸収しそれによって細孔内でゲルを形成するときに可溶性アルギン酸塩を該ゲル形成イオンと反応させることからなるアルギン酸塩発泡体の細孔内のインシツゲル化を誘引させる方法。
- 組織と隣接した組織間に障壁を与えるように請求項30から41のいずれか一項に記載の複合体を組織に適用することからなる、隣接した組織への組織の付着を防止する方法。
- a)ポリサッカライド、及び発泡剤及び所望による可塑剤、架橋剤及びpH変性剤の一つ以上を含む水溶液分散物から湿潤発泡体を形成し;b)所望により機械攪拌によって、水溶液分散物から発泡体を混合し;c)i)発泡体を成形し;そしてii)発泡体から架橋した発泡体を形成する工程の一つ以上を所望により実施し;d)連続細孔を含む乾燥発泡体を形成するために発泡体を乾燥し;そして工程a)からd)の一つ以上に、又は工程d)の後でゲル形成イオンを添加することを特徴とする、連続細孔ネットワークと細孔をもち引き続き添加されたポリサッカライド溶液をゲル化させるためのゲル形成イオンを含む乾燥吸収発泡体を形成する方法。
- ポリサッカライドがヒアルロン酸塩を含む請求項56記載の方法。
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