JP2009526516A - 呼吸性ウイルス感染を処置するための組成物およびその使用 - Google Patents
呼吸性ウイルス感染を処置するための組成物およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、呼吸性ウイルス感染(特にRSウイルスおよびトリインフルエンザA(H5N1株を含む))におけるウイルス複製に干渉するsiRNA組成物に関連する。本発明は、呼吸性ウイルス感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現を阻害するためのsiRNA組成物の使用、および被験体における呼吸性ウイルス感染の処置における使用のためのsiRNA組成物の使用に、さらに関連する。
呼吸性ウイルス感染は、何世紀にもわたって、ヒトの健康および生命に対する重大な脅威であった。悪名高いエピソードとしては、インフルエンザ株、RSウイルス、および重症急性呼吸性症候群(SARS)によって引き起こされる感染が挙げられる。これらは、世界中で約2〜4千万人の人々を殺傷した1918年の世界的なインフルエンザ汎流行を含む。より近年の年代に、他のインフルエンザ汎流行もまた、存在した。SARSは、2002年に発生し、およそ800人を犠牲にした(2)。
RSウイルス(RSV)感染は、深刻な汎流行性の気道疾患の主要な原因である。約3分の2の乳児が、人生の最初の1年間にRSVに感染し、そして約100%が2歳までに感染している。現在、RSV感染を処置するために利用可能である、特定かつ有効な治療薬は存在しない。
1997年の初めに、トリインフルエンザAの新型株であるH5N1が出現した。ほぼトリ(野生集団および家禽の両方)に限定されていたが、このウイルスは、感染したトリに直接的に接触したヒトにのみ感染するようであった。ヒトにおいて、感染は深刻な疾患を引き起こし、ヒトにおいて重症の呼吸性疾病および死をもたらす(3〜12)。多くの症例および発生が、東南アジアの種々の国において起こった。このトリウイルスのヒトに感染する能力を考慮すると、接触感染性ヒト改変体への突然変異の増大した危険性が存在し、この突然変異は、効率的かつ継続的なヒトからヒトへの伝播による新型インフルエンザ汎流行の出現ならびに大勢の死の危険をもたらす。
RNA干渉(RNAi)は、配列特異的RNA分解プロセスであり、理論的に任意の遺伝子を、ノックダウンするかまたはサイレンシングするための、比較的容易かつ直接的な方法を提供する(17、18、19)。天然に存在するRNA干渉において、二本鎖RNAは、RNase III/ヘリカーゼタンパク質であるDicerによって、低分子干渉(small interfering)RNA(siRNA)分子へと切断される。このsiRNA分子は、2ヌクレオチド(nt)オーバーハング(overhang)を3’末端において有する、19〜23ヌクレオチドのdsRNAである。これらのsiRNAは、RNA誘導型サイレンシング複合体(RNA−induced−silencing−complex:RISC)と呼ばれる多成分リボヌクレアーゼ内に組み込まれる。siRNAの一本の鎖は、RISCに結合したままであり、この複合体を同族の(cognate)RNAへと導き、この同族のRNAは、RISC中のこのガイド因子(guider)ss−siRNAに対して相補的である配列を有する。このsiRNA指向型エンドヌクレアーゼは、このRNAを消化し、それによってこのRNAを不活性化する。近年の研究は、化学的に合成された21〜25−nt siRNAの使用は、哺乳動物細胞においてRNAiの作用を示すことを明らかにし(20)、そしてsiRNAハイブリダイゼーションの(末端におけるかもしくは中央部における)熱力学的安定性は、分子の機能を決定する際に中枢的な役割を果たすことを明らかにしている(21、22)。これらならびにRISC、siRNA分子およびRNAiの他の特徴は、記載されている(23〜28)。
Abbot,A.Nature(2003)424:121〜123 Reynolds,A.ら、Nat.Biotechnology(2004)22:326〜330 Schiwarz,D.S.ら、Cell(2003)115:199〜208 Khvorova,A.ら、Cell(2003)115:209〜216
本発明は、ウイルス病原体(例えば、インフルエンザA H5N1およびRSVを含む、呼吸性ウイルス感染を引き起こすウイルス病原体)のウイルスRNA分子の破壊を通して、ウイルス感染および複製を阻害するための、RNA干渉の使用に関連する組成物および方法を提供する。これらのウイルスは、ヒトおよび他の哺乳動物において重症の呼吸性疾患を引き起こす病原体である。ウイルス複製の阻害は、このウイルスに感染した培養細胞ならびにこのウイルスに感染した被験体において、ウイルス感染と戦う。このウイルス複製の阻害は、その症状の軽減を含む。
(a)第1のヌクレオチド配列と実質的に同一の長さを有し、かつ
(b)第1のヌクレオチド配列に対し実質的に相補的である。この後者の構造(ヘアピンポリヌクレオチドと呼ばれる)において、上記第1のヌクレオチド配列は、上記第2のヌクレオチド配列とハイブリダイズして、その相補的配列が、上記ループ配列によって連結されている、ヘアピンを形成する。
(a)配列番号1〜263から選択される配列、
(b)項目(a)において与えられた配列より長い標的性(targeting)配列であって、この標的性配列は、呼吸性ウイルスのゲノムを標的化し、かつ配列番号1〜263から選択される配列を含む、
(c)配列番号1〜263から選択される配列のフラグメントであって、このフラグメントは、少なくとも15ヌクレオチドの長さでありかつこの選択される配列より長くとも1塩基短い、連続する塩基の配列からなる、フラグメント、
(d)配列番号1〜263から選択される配列と5ヌクレオチドまで異なる配列、または
(e)(a)〜(d)において与えられた任意の配列の相補体。
(a)反応性末端(live reactive end)を含みかつこの配列の第1の末端におけるヌクレオチドに対応するヌクレオチド試薬を提供する工程;
(b)反応性末端を含みかつ該配列の後に続く位置に対応する、さらなるヌクレオチド試薬を添加して、上記工程(a)の反応性末端と反応させ、そして伸長中のポリヌクレオチド配列の長さを1ヌクレオチド増加させる工程、ならびに所望されない産物および過剰な試薬を除去する工程、ならびに
(c)上記配列の第2の末端におけるヌクレオチドに対応する上記ヌクレオチド試薬が添加され、それによって完全なポリヌクレオチドが提供されるまで、工程(b)を繰り返す工程。
本明細書中で記載された全ての特許、特許出願公開、および特許公報は、その全体が、本明細書中で逐語的に示されたのと同様に参考として援用される。本明細書中で記載された全ての技術的刊行物もまた、参考として援用される。
本発明に従って、呼吸性ウイルス標的の遺伝子発現は、RNA干渉によって低減される。ウイルス遺伝子の発現産物は、このウイルス標的の少なくとも1つのセグメントに対して相補的である特異的二本鎖siRNAヌクレオチド配列によって標的化され、このセグメントは、15と30との間の任意の数のヌクレオチドを含むか、または多くの場合、21と25との間の任意の数のヌクレオチドを含む。この標的は、5’非翻訳(UT)領域中、コード配列中、または3’UT領域中に存在し得る。例えば、PCT出願WO00/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO02/16620、およびWO02/29858(各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される)を参照のこと。
標的性ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドおよび標的性配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、自動化DNA合成装置を用いて、標準的合成技術によって調製され得る。オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、周知の化学的プロセスを含み、これらとしては、表面誘導体化粒子へのヌクレオチドホスホルアミダイトの連続的付加(T,BrownおよびDorcas J.S.Brown,Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach,F.Eckstein,編,Oxford University Press,Oxford,pp.1−24(1991)によって記載され、本明細書中で参考として援用される)が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、呼吸性ウイルス病原体に感染した細胞内に侵入する際にRNA干渉現象を引き起こすように意図されるオリゴヌクレオチドを、広く提供する。本発明は、呼吸性ウイルス標的の性質に制限されないが、RSVおよびインフルエンザAのいくつかの株を標的化するオリゴヌクレオチドを強調する。RNA干渉は、適切な二本鎖RNAによって細胞内で起こり、この二本鎖RNAの鎖のうちの1本は、ウイルスの標的遺伝子における配列と同一であるかこれに高度に類似する。一般に、呼吸性ウイルスを標的化するオリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNAであり得るか、または、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含み得る。後者の一例は、デオキシジヌクレオチド配列(例えば、d(TT)、d(UU)、d(TU)、d(UT)および他の可能性のあるジヌクレオチド)で3’末端において終止するRNA配列である。さらなる実施形態において、3’オーバーハングは、上で特定された塩基を有するリボヌクレオチドなどから構成され得る。さらに、このオリゴヌクレオチド薬剤は、一本鎖もしくは二本鎖であり得る。本発明の治療用オリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態は、オリゴリボヌクレオチドであるか、もしくは3’d(TT)末端を有するオリゴリボヌクレオチドであることが予測される。一本鎖標的性ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞への侵入の際、細胞内に存在する内因性酵素活性によって、容易に二本鎖分子に変換される。
RSVについて、ウイルスゲノムの任意の部分が標的化され得るが、理屈からすれば、ウイルス特異的酵素的機能をコードする標的性遺伝子が潜在的siRNA候補を提供するはずである。これらの遺伝子としては、L遺伝子、F遺伝子、G遺伝子およびP遺伝子が挙げられる。ウイルスゲノムの5’末端に位置するL遺伝子は、少量でしか発現されず、従って、有効なRNAiサイレンシングは、少量のRNAiのみを必要とし得る。構造遺伝子もまた、標的化され得る。
(+)鎖mRNA配列内の25ヌクレオチドおよび19ヌクレオチドの長さのsiRNA標的配列が、全ての8つのセグメントで同定されている。この配列は、表5〜表12に示される。siRNA配列は、この8つのセグメントの各々に由来する。各配列についての記載(entry)はまた、5’末端からのmRNAにおける開始ヌクレオチド位置を示す。
本発明のいくつかの実施形態は、2種もしくはそれより多くのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含有する薬学的組成物を提供し、これらのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの各々は、呼吸性ウイルスのゲノムにおける遺伝子を標的化する配列を含む。関連の実施形態は、この組み合わせを用いて細胞を処置する方法、および呼吸性ウイルス感染を処置する方法を提供し、そしてこのような組み合わせ組成物の、呼吸性ウイルス感染を処置することを意図される薬学的組成物の製造における使用を提供する。この組み合わせの個々のポリヌクレオチド成分は、ウイルス病原体のゲノムにおける同じ遺伝子の異なる部分、または異なる遺伝子、あるいは1つの遺伝子および1つより多くの遺伝子のいくつかの部分を、標的化し得る。オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組み合わせを用いる利点は、所定の遺伝子の発現を阻害する利益が、この組み合わせにおいて大きくなることである。多数の標的性配列の使用により、遺伝子のノックダウンもしくはウイルスゲノムのサイレンシングにおいて、より大きな効力が、達成される。ウイルス複製の阻害における増大した効力は、ウイルスゲノムにおける1種より多くの遺伝子を標的化することによって達成される。
本発明の標的性ポリヌクレオチドは、本明細書中で「活性化合物」もしくは「治療薬」と記載される。これらの治療薬は、被験体への投与のために適する薬学的組成物中に組み込まれ得る。
いくつかの実施形態において、本発明のsiRNAポリヌクレオチドは、リポソーム媒介型トランスフェクションによって、例えば市販の試薬もしくは技術(例えば、OligofectamineTM、LipofectAmineTM試薬、LipofectAmine 2000TM(Invitrogen)、ならびにエレクトロポレーションおよび同様の技術)を使用して、培養物中の細胞に送達される。さらに、siRNAポリヌクレオチドは、吸入もしくは気道への点滴注入を介して、動物モデル(例えばげっ歯類もしくは非ヒト霊長類)に送達される。動物モデルでの使用のためのさらなる経路としては、静脈内(IV)、皮下(SC)、および関連の投与の経路が挙げられる。siRNAを含有する薬学的組成物は、siRNAの安定性を保護するか、siRNAの持続時間を延長させるか、siRNA機能を助長するか、または特異的な組織/細胞にsiRNAを標的化させる、さらなる成分を含む。これらの成分としては、種々の生分解性ポリマー、カチオン性ポリマー(例えばポリエチレンイミン)、ヒスチジン−リジン(HK)ポリペプチドのようなカチオン性コポリペプチド(例えば、Mixsonらに対するPCT公開番号WO01/47496、Biomerieuxに対するWO02/096941およびMassachusetts Institute of Technologyに対するWO99/42091を参照)、ペグ化カチオン性ポリペプチド、およびリガンドを組み込んだポリマーなど、正に荷電したポリペプチド、PolyTranポリマー(天然の多糖類、スクレログルカンとしても知られる)、標的性リガンドと結合体化したポリマーからなるナノ粒子(TargeTran改変体)、界面活性剤(Infasurf;Forest Laboratories,Inc.;ONY Inc.)、ならびにカチオン性ポリマー(例えばポリエチレンイミン)が挙げられる。Infasurf(登録商標)(カルファクタント(calfactant))は、気管内点滴注入における使用のための、仔ウシ肺から単離された天然の肺界面活性剤である;これは、リン脂質、中性脂質、ならびに疎水性界面活性剤関連タンパク質Bおよび疎水性界面活性剤関連タンパク質Cを含む。このポリマーは、一次元ポリマーもしくは多次元ポリマーのいずれかであり得、そしてまた、直径20ミクロン未満、20ミクロンと100ミクロンとの間もしくは100ミクロンを超える、ミクロ粒子もしくはナノ粒子であり得る。このポリマーは、特定の組織もしくは細胞のレセプターまたは分子に特異的なリガンド分子を有し得、従って、siRNAの送達を標的化するために使用され得る。siRNAポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソームベースのキャリア(例えば、DOTAP、DOTAP/コレステロール(Qbiogene,Inc.))および他の型の脂質水溶液によって送達される。さらに、低パーセント(5〜10%)のグルコース水溶液およびInfasurfは、siRNAの気道送達のための有効なキャリアである30。
本発明の別の局面は、本発明のsiRNAポリヌクレオチドを有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、連結した別の核酸を輸送可能な核酸分子をいう。ベクターの1つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントを連結し得る、環状二本鎖DNAループをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるDNAセグメントが、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクターは、作動可能に連結した遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において使用される発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、相互交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、ウイルスベクター(例えば、複製欠損型のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス)のような発現ベクターの他の形態を含むことを意図し、これらは、同等の機能をもたらす。
本発明の実施において、ウイルスについてのアッセイは、いくつかの手順によって実施され得る。これらの中でも、非限定の例として、免疫ブロット(ウエスタンブロット)、免疫沈降(I.P.)、および複合型逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)アッセイなどが挙げられる。このような手順は、トランスフェクトされた組織培養物中の溶解物もしくは上清に存在し得る、標的化したmRNAもしくはそのタンパク質産物の合成の減少を測定する。同様に、これらのアッセイは、診断的手順として、感染した動物被験体もしくはヒト被験体から得られた、ホモジナイズした組織サンプル、鼻咽頭洗浄液、分泌液中に存在し得る、標的化したmRNAもしくはそのタンパク質産物の合成の減少を測定するために用いられ得る。
本実施例は、培養物におけるH5N1感染細胞に対するsiRNAの阻害性効果の評価を報告する。
各々、H5N1のNP遺伝子(NP−1およびNP−2;表19、配列番号)遺伝子およびM2遺伝子(M2−1およびM2−2;表19、配列番号)を標的化する2つのsiRNAを、開発した。これらのsiRNA標的配列は、H5N1ウイルスのいくつかの株において保存されている(例えば、gi|47834945_10−1506、gi|8452827_1−1497、gi|13925158_46−1542、gi|61927237_46−1542、gi|59940391_44−>1535、gi|9802277_46−1542)。5’センス鎖においてフルオレセイン標識されているds−siRNAを、Proligo BioTech Ltd(Paris,France)によって化学的に合成した。その抗H5N1効果を、siRNAでトランスフェクトした、H5N1ウイルスに感染したMDCK細胞において検出した(Madin−Darbyイヌ腎臓;ATCC登録番号:CCL−34,Manassas,VA)。H5N1の阻害を、以下に記載されるように、細胞変性効果(CPE)、標準的TCID50(50%組織培養感染用量)プロトコールによる培養培地中に放出されたウイルスの逆滴定、およびリアルタイムRT−PCRを用いる細胞内ウイルスRNAの定量によって、決定した。
MDCK細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS,Invitrogen)含有MEM培地中で培養し、そして維持した。約5000個の細胞を、ウイルス感染および複製アッセイのために、96ウェルプレートの各ウェル中に入れた。細胞を、0.5μlのLipofectamine 2000(Invitrogen,CA)と混合した100nM、50nM、25nMおよび12.5nMのsiRNAでトランスフェクションした。ルシフェラーゼを標的化する無関係のsiRNA(GL2i)、もしくはSARSコロナウイルス(C−1)を標的化するsiRNA、およびトランスフェクト体(transfectant)Lipofectamine 2000のみ(C−2)を、本実験においてネガティブコントロールとして含めた。トランスフェクションの6時間後、この培養培地を除去し、そしてこの細胞を、H5N1ウイルス感染の前にPBSで2回洗浄した。1% FBS含有MEM中に希釈した100μlの100 TCID50 H5N1ウイルス(株:A/HongKong/486/97)7を、トランスフェクトされた細胞に加えた。培養上清および細胞を、それぞれ感染の12時間後、16時間後および24時間後に、放出されたウイルス力価および細胞内ウイルスRNAコピー数の検出のために収集した。感染の24時間後、位相差顕微鏡下でCPEを観察し、そして記録した。この実験を、3連で行い、そして少なくとも3回繰り返した。
Q−RT−PCRを、以下のように実行する。全細胞内RNAを、RNeasy Miniキット(Qiagen,Germany)を製造業者の指示に従って用いて単離した。逆転写実験を、ThermoScript RT−PCRシステム(Invitrogen,CA)を用いるオリゴ−dTプライミングによって実施した。次いで、リアルタイムPCRを、表23に示すプライマーを用いて実施した。
siRNA処理を行ったかまたは行わない培養物中のウイルス力価を、以下のように試験した。簡潔には、感染細胞からの馴化培地を、1% FBS含有MEM中に、10倍の連続工程で希釈した。各希釈物を、標準的TCID50プロトコールに従って細胞を感染させるために使用した。簡潔には、細胞を、96ウェル皿に感染の16時間前に入れた。感染の72時間後、CPEを、位相差顕微鏡下で観察し、そしてCPE陽性(CPE+)細胞を決定した。次いで、TCID50を、以下のように評価した:
siRNA NP−1(表19)処理は、培養培地中のH5N1ウイルス産生(図5、パネルA)および細胞におけるウイルスRNAコピーの複製(図5、パネルB)を、12.5〜100nMの濃度において99%を超えて低下させた。一方、NP−2を標的化するsiRNA(表19)による処理は、100nMの濃度において、細胞培養物中のウイルス増殖の約60%しか阻害しなかった。対照的に、無関係のsiRNA処理コントロール(C−1)およびキャリア処理コントロール(C−2)は、未処理コントロールと比較して、ウイルス増殖を有意に阻害しなかった。
H5N1ゲノム中の種々の遺伝子に対して指向されるsiRNAの組み合わせを、有効な抗H5N1活性を提供するために同定した。この実施例は、このような2つの組み合わせを示す。
この実施例において、種々の呼吸性ウイルス遺伝子を標的化する、同族(cognate)の標的遺伝子をサイレンシングする能力もしくはウイルス複製を阻害する能力において最適に有効なsiRNAおよび最適に有効なsiRNAの組み合わせが、細胞培養物中の実験によって同定される。インビトロで有効なsiRNAは、インビボでさらに試験されそして使用される候補である。
(1)免疫ブロット(ウエスタン)を、細胞溶解物および所定のウイルス抗原に対するRSV特異的抗体もしくはインフルエンザA特異的抗体を用いて実施する。
この実施例において、種々のsiRNA(個々にもしくは組み合わせ)が、動物モデルにおけるRSVもしくはトリインフルエンザH5N1の処置におけるその効力を決定するために試験される。RSV株もしくはインフルエンザH5N1株を、吸入もしくは点滴注入により気道を通して試験動物に感染させるために使用する。siRNAは、同じ経路を通って送達され、そしてRSV感染もしくはインフルエンザH5N1感染の前に、感染と同時に、もしくは感染後に適用される。siRNA送達時間を変えることにより、試験動物におけるRSVもしくはインフルエンザH5N1の複製の阻害、RSVもしくはインフルエンザH5N1によって誘導される病理学の低減、およびRSVもしくはインフルエンザH5N1様の症状の軽減における、siRNAの効力の情報を得ることが可能であり、そしてRSVもしくはインフルエンザH5N1に特異的なsiRNAが、動物における実験的なRSV感染もしくはインフルエンザH5N1感染に対する予防効果もしくは治療効果を示すか否かの情報を得ることが可能である。
本実施例は、非ヒト霊長類における、RSVもしくはインフルエンザH5N1のウイルス複製のsiRNA媒介型阻害の研究を記載する。用量投与の効力および安全性が、本研究の主要な目的である。
Claims (30)
- 長さが200ヌクレオチドもしくはそれより少ないヌクレオチドである、単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、第1のヌクレオチド配列を含み、該第1のヌクレオチド配列は、RSウイルスもしくはインフルエンザAウイルスのゲノムを標的化し、ここで任意のT(チミジン)もしくは任意のU(ウリジン)は、必要に応じて他と置換され得、そしてここで、該第1のヌクレオチド配列は、
(a)長さが15〜30個の任意の数のヌクレオチドである配列、または
(b)(a)に記載の配列の相補体
からなる、ポリヌクレオチド。 - 前記第1のヌクレオチド配列からループ配列によって分離される第2のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドであって、該第2のヌクレオチド配列は、
(a)該第1のヌクレオチド配列と実質的に同一な長さを有し、かつ
(b)該第1のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的である、
ポリヌクレオチド。 - 請求項1または請求項2に記載のポリヌクレオチドであって、前記第1のヌクレオチド配列は、
(a)配列番号1〜263から選択される配列、
(b)項目(a)に記載の配列より長い標的性配列であって、ここで該標的性配列は、呼吸性ウイルスのゲノムを標的化し、そして配列番号1〜263から選択される配列を含む、標的性配列、
(c)配列番号1〜263から選択される配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも15ヌクレオチド長でありかつ該選択される配列より長くとも1塩基短い長さである、連続する塩基の配列からなる、フラグメント
(d)5ヌクレオチドまでが、配列番号1〜263から選択される配列とは異なる配列、または
(e)(a)〜(d)に記載の配列の相補体
からなる、ポリヌクレオチド。 - 請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドであって、前記第1のヌクレオチド配列の長さが、21〜25個の任意の数のヌクレオチドである、ポリヌクレオチド。
- 配列番号1〜263から選択される配列からなる、請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、該選択される配列の3’に結合するジヌクレオチドオーバーハングを含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第1のヌクレオチド配列の3’末端におけるジヌクレオチド配列は、TT、TU、UT、もしくはUUであり、そしてここで、該ジヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはその両方を含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、DNAである、ポリヌクレオチド。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、RNAである、ポリヌクレオチド。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載の第1のポリヌクレオチド鎖、および少なくとも該第1のポリヌクレオチド鎖の該第1のヌクレオチド配列に対して相補的でありかつ該配列にハイブリダイズされる第2のポリヌクレオチド鎖を含む、二本鎖ポリヌクレオチド。
- 請求項1、請求項2またはその両方に記載の複数の標的性ポリヌクレオチドを含む組み合わせであって、ここで、各ポリヌクレオチドは、前記標的ウイルスのゲノムにおける異なった配列を標的化する、組み合わせ。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項12もしくは請求項13に記載のベクターであって、該ベクターは、プラスミド、組換えウイルス、トランスポゾン、もしくは微小染色体である、ベクター。
- 1種もしくはそれより多くの請求項1に記載のポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞。
- 1種もしくはそれより多くの請求項2に記載のポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞。
- 1種もしくはそれより多くの請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチド、またはこれらの混合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物であって、各ポリヌクレオチドは、前記標的ウイルスのゲノムにおける異なった配列を標的化する、薬学的組成物。
- 1種もしくはそれより多くの請求項12もしくは請求項13に記載のベクターまたはその混合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物であって、各ベクターは、前記標的ウイルスのゲノムにおける異なった配列を標的化するポリヌクレオチドを保有する、薬学的組成物。
- 請求項17もしくは請求項18に記載の薬学的組成物であって、前記キャリアは、合成ポリマー、リポソーム、デキストロース、界面活性剤、またはこれらの任意の2種またはそれより多くの組み合わせを含む、薬学的組成物。
- RSウイルスもしくはインフルエンザAウイルスのゲノムを標的化する配列を有する請求項1もしくは請求項2に記載のポリヌクレオチドを合成する方法であって、該方法は、以下:
(a)反応性末端を含み、かつ該配列の第1の末端におけるヌクレオチドに対応する、ヌクレオチド試薬を提供する工程、
(b)反応性末端を含みかつ該配列の後に続く位置に対応する、さらなるヌクレオチド試薬を添加して、該工程(a)の該反応性末端と反応させ、そして伸長中の該ポリヌクレオチド配列の長さを1ヌクレオチド増加させる工程、ならびに所望されない産物および過剰な試薬を除去する工程、ならびに
(c)該配列の第2の末端におけるヌクレオチドに対応する該ヌクレオチド試薬が添加され、それによって完全なポリヌクレオチドが提供されるまで、工程(b)を繰り返す工程
を、包含する、方法。 - 細胞を、RNAインヒビターによってトランスフェクトする方法であって、該方法は、該細胞を、1種もしくはそれより多くの請求項1に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
- 前記細胞は、前記1種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドによって標的化される呼吸性ウイルスを含む、請求項21に記載の方法。
- 細胞を、RNAインヒビターによってトランスフェクトする方法であって、該方法は、該細胞を、1種もしくはそれより多くの請求項2に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
- 前記細胞は、前記1種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドによって標的化される呼吸性ウイルスを含む、請求項23に記載の方法。
- 呼吸性ウイルスに感染した細胞における該ウイルスの複製を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を、1種もしくはそれより多くの請求項1に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含し、ここで、該1種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドは、該ウイルスを標的化する、方法。
- 呼吸性ウイルスに感染した細胞における該ウイルスの複製を阻害する方法であって、該細胞を、1種もしくはそれより多くの請求項2に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含し、ここで、該1種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドは、該ウイルスを標的化する、方法。
- 被験体における呼吸性ウイルスに起因する感染を処置するために有効な薬学的組成物の製造における、該呼吸性ウイルスを標的化する、請求項1に記載のポリヌクレオチドの使用、または2種もしくはそれより多くの該ポリヌクレオチドの混合物の使用。
- 前記被験体は、ヒトである、請求項27に記載の使用。
- 被験体における呼吸性ウイルスに起因する感染を処置するために有効な薬学的組成物の製造における、該呼吸性ウイルスを標的化する、請求項2に記載のポリヌクレオチドの使用、または2種もしくはそれより多くの該ポリヌクレオチドの混合物の使用。
- 前記被験体は、ヒトである、請求項29に記載の使用。
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