JP2009524031A - Test system for analyzing polypeptides and cells that adhere to silicon - Google Patents
Test system for analyzing polypeptides and cells that adhere to silicon Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009524031A JP2009524031A JP2008550689A JP2008550689A JP2009524031A JP 2009524031 A JP2009524031 A JP 2009524031A JP 2008550689 A JP2008550689 A JP 2008550689A JP 2008550689 A JP2008550689 A JP 2008550689A JP 2009524031 A JP2009524031 A JP 2009524031A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- silicon
- polypeptide
- protein
- adhesion
- mammal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
Abstract
本発明は、一般に診断の分野すなわちシリコンに関連したポリペプチドにおける試験系に関する。より正確には、本発明は、その一実施形態ではシリコンに接着するポリペプチドを同定しかつ分析するための試験系に関する。さらに、本発明は、新しく同定されたシリコンに接着するポリペプチドと、例えば哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための試験系におけるかかるタンパク質の各々の使用に関する。 The present invention relates generally to the field of diagnostics, ie test systems in polypeptides related to silicon. More precisely, the present invention relates to a test system for identifying and analyzing polypeptides that in one embodiment adhere to silicon. Furthermore, the present invention relates to newly identified polypeptides that adhere to silicon and the use of each such protein in a test system for detecting response responses to, for example, mammalian silicon.
Description
本発明は、一般に、診断の分野、すなわちシリコンに関連したポリペプチドにおける試験系に関する。より詳細には、本発明は、その一実施形態ではシリコンに接着するポリペプチドを同定しかつ分析するための試験系に関する。さらに、本発明は、新たに同定されたシリコンに接着するポリペプチドと、例えば哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための試験系におけるかかるタンパク質の各々の使用に関する。 The present invention relates generally to the field of diagnostics, ie, test systems in silicon related polypeptides. More particularly, the invention relates to a test system for identifying and analyzing polypeptides that in one embodiment adhere to silicon. In addition, the invention relates to newly identified polypeptides that adhere to silicon and the use of each such protein in a test system for detecting response responses to, for example, mammalian silicon.
「シリコン」としても知られるジメチルシロキサンポリマーは、その生体適合性が仮定されることから医業において最も広範に用いられる無機生体材料である。それは、医療用チュービングシステム、注射器の潤滑剤、バイパス装置および移植蝸牛刺激装置のような能動的な医療器具のコーティングなどの多種多様な用途、ならびに関節置換およびアイレンズから脳室腹腔短絡術およびマンマリー注入に及ぶ受動的注入の作製において用いられる。 Dimethylsiloxane polymers, also known as “silicon”, are the most widely used inorganic biomaterials in the medical industry because of their assumed biocompatibility. It has a wide variety of applications such as medical tubing systems, syringe lubricants, active medical device coatings such as bypass devices and transplanted cochlear stimulators, as well as joint replacement and eye lenses to ventricular abdominal shunts and manmaries. Used in the creation of passive injections that span injections.
しかし、特に長期注入後、様々な局所性および全身性の副作用がシリコンに対する応答反応として報告されている。これらの現象は、例えばシリコンのマンマリー注入（ＳＭＩｓ）を有する女性において［スモーレイ Ｄ．Ｌ．（Ｓｍａｌｌｅｙ Ｄ．Ｌ．）、レビン Ｊ．Ｊ．（Ｌｅｖｉｎｅ Ｊ．Ｊ．）、シャンクリン Ｄ．Ｒ．（Ｓｈａｎｋｌｉｎ Ｄ．Ｒ．）、ホール Ｍ．Ｆ．（Ｈａｌｌ Ｍ．Ｆ．）およびスティーブンス Ｍ．Ｖ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｍ．Ｖ．）「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｉｌｉｃａ ａｍｏｎｇ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．」Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９６、５６７−５７４頁（１９９６年）］、無菌での脳室腹腔短絡術が奏功しない大部分の場合［ゴールドブラム Ｒ．Ｍ．（Ｇｏｌｄｂｌｕｍ Ｒ．Ｍ．）、ペリー Ｒ．Ｐ．（Ｐｅｌｌｅｙ Ｒ．Ｐ）、オドネル Ａ．Ａ．（Ｏ’Ｄｏｎｅｌｌ Ａ．Ａ．）、パイロン Ｄ．（Ｐｙｒｏｎ Ｄ．）およびヘジャーズ Ｊ．Ｐ．（Ｈｅｇｇｅｒｓ Ｊ．Ｐ．）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｅｌａｓｔｏｍｅｒｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｓｈｕｎｔｓ．」Ｌａｎｃｅｔ ３４０、５１０−５１３頁（１９９２年）］、さらに様々なシリコンコーティングされた医療器具を持つ患者において［キンナリ Ｔ．Ｊ．（Ｋｉｎｎａｒｉ Ｔ．Ｊ．）、サロネン Ｅ．Ｍ．（Ｓａｌｏｎｅｎ Ｅ．Ｍ．）およびジェロ Ｊ．（Ｊｅｒｏ Ｊ．）「Ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｃｏａｔｉｎｇ ｏｎ ｔｙｍｐａｎｏｓｔｏｍｙ ｔｕｂｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ ６７、１５７−１６４頁（２００３年）］観察されている。 However, various local and systemic side effects have been reported as response responses to silicon, especially after prolonged infusion. These phenomena have been observed, for example, in women with silicon mammary injections (SMIs) [Smoray D. L. (Smallley D.L.), Levin J.H. J. et al. (Levine JJ), Shanklin D. R. (Shanklin DR), Hall M. F. (Hall MF) and Stevens M.F. V. (Stevens MV) “Lymphocyte response to silica ammon offspring of silicon breast imprint recipients.” Immunobiology 196, 567-574. Goldblum R. M.M. (Goldblum RM), Perry R.M. P. (Pelley RP), O'Donnell A.M. A. (O'Donell AA), Pylon D. (Pyron D.) and Hejars J.M. P. (Heggers JP) “Antibodies to silicon elastomers and reactions to ventricular peritonal shunts.” Lancet 340, 510-513 (1992). J. et al. (Kinnari T.J.), Salonen E. M.M. (Salonen EM) and Jero J.M. (Jero J.) “Durability of the binding in albuming of albuminating tubes.” International Journal of Pediatric Organic 3), 1967.
いわゆる生物のシリコンに対する局所反応は、大きさが変化しうる線維性結合組織被膜の形成によって特徴づけられる［シグロウ Ｗ．（Ｓｉｇｇｅｌｋｏｗ Ｗ．）、ファリディ Ａ．（Ｆａｒｉｄｉ Ａ．）、スピリタス Ｋ．（Ｓｐｉｒｉｔｕｓ Ｋ．）、クリンゲ Ｕ．（Ｋｌｉｎｇｅ Ｕ．）、ラス Ｗ．（Ｒａｔｈ Ｗ．）およびクロスターハルフェン Ｂ．（Ｋｌｏｓｔｅｒｈａｌｆｅｎ Ｂ．）「Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔ ｃｕｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃａｐｓｕｌａｒ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４、１１０１−１１０９頁（２００３年）］。長年にわたり線維症が進行することで、注入に関連する機能障害が誘発される。局所性副作用に続き、全身性の問題が生じることが多く、線維筋痛［バーミューレン Ｒ．Ｃ．（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ Ｒ．Ｃ．）およびショルテ Ｈ．Ｒ．（Ｓｃｈｏｌｔｅ Ｈ．Ｒ．）「Ｒｕｐｔｕｒｅ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｇｅｌ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｐａｉｎ ａｎｄ ｆａｔｉｇｕｅ．」Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ３０、２２６３−２２６７頁（２００３年）；シャンクリン Ｄ．Ｒ．（Ｓｈａｎｋｌｉｎ Ｄ．Ｒ．）、スティーブンス Ｍ．Ｖ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｍ．Ｖ．）、ホール Ｍ．Ｆ．（Ｈａｌｌ Ｍ．Ｆ．）およびスモーレイ Ｄ．Ｌ．（Ｓｍａｌｌｅｙ Ｄ．Ｌ．）「Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６９、１０２−１１８頁（２０００年）］や、リウマチ性疾患および他のタイプの結合組織疾患（ＣＴＤ）［ブリッジス Ａ．Ｊ．（Ｂｒｉｄｇｅｓ Ａ．Ｊ．）、コンレイ Ｃ．（Ｃｏｎｌｅｙ Ｃ．）、ワン Ｇ．（Ｗａｎｇ Ｇ．）、バーンズ Ｄ．Ｅ．（Ｂｕｒｎｓ Ｄ．Ｅ．）およびヴェイジー Ｆ．Ｂ．（Ｖａｓｅｙ Ｆ．Ｂ．）「Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．」Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １１８、９２９−９３６頁（１９９３年）］や、さらに強皮症様の線維化症候群［ヴァルガ Ｊ．（Ｖａｒｇａ Ｊ．）、シューマッハ Ｈ．Ｒ．（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ Ｈ．Ｒ．）およびジメネス Ｓ．Ａ．（Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｓ．Ａ．）「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍａｍｍｏｐｌａｓｔｙ ｗｉｔｈ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｉｍｐｌａｎｔｓ．」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１１、３７７−３８３頁（１９８９年）；アップルトン Ｂ．Ｅ．（Ａｐｐｌｅｔｏｎ Ｂ．Ｅ．）およびリー Ｐ．（Ｌｅｅ Ｐ．）「Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ） ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍａｍｍｏｐｌａｓｔｙ．」Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２０、１０５２−１０５４頁（１９９８年）］と診断されている長期のシリコン注入物を保有する患者に関して報告がなされている。 The so-called local response of living organisms to silicon is characterized by the formation of a fibrous connective tissue capsule that can vary in size [Shiguro W. et al. (Siggelow W.), Faridi A. (Faridi A.), Spiritus K. (Spiritus K.), Klinge U. (Klinge U.), Lass. (Rath W.) and Klosterhalfen B.I. (Klostalfen B.) “Histological Analysis of silicon breast implant components and correlation with capstract structure.” Biomaterials 24, 1103-1109 (2003). The progression of fibrosis over many years induces dysfunction associated with infusion. Systemic problems often occur following local side effects, and fibromyalgia [Vermeulen R. C. (Vermeulen RC) and Scholte H. R. (Scholte HR) “Rupture of silicon gel breast implants and symptoms of pain and fatigue.” The Journal of Rheumatology 30, 2263-2267; R. (Shanklin DR), Stevens M. V. (Stevens M.V.), Hall M.V. F. (Hall M.F.) and Smalley D.M. L. (Smalley D.L.) "Environmental immunogens and T-cell-mediated responses in fibromyalgia:. Evidence for immune dysregulation and determinants of granuloma formation" Experimental and Molecular Pathology 69,102-118, pp. (2000)] and, rheumatic Diseases and other types of connective tissue disease (CTD) [Bridges A. J. et al. (Bridges AJ), Conley C.I. (Conley C.), One G. (Wang G.), Burns D. E. (Burns DE) and V. B. (Vasey FB) “A clinical and immunological evaluation of women with silicon breast implants and systems of rheumetic diseases.” Syndrome [Valga J. (Varga J.), Schumacher H .; R. (Schumacher HR) and Jimenez S. A. (Jimenez SA) "Systemic sclerosis after augmentation mammoplasty with silicon implants." Cancer Research 111, 377-383 (1989); E. (Appleton BE) and Lee P. (Lee P.) "The development of systemic sclerosis (sclerderma) following a augmentation augmentation mammoplasty." ing.
一般に全身性副作用が局所レベルに対する変化を反映すると考えられるが、クロストークなどは明らかにされていない。さらにより重要なことは、ヨーロッパおよび米国の双方における前向きコホート試験では、シリコン注入の効果がＣＴＤまたは他の自己免疫疾患の発症におけるリスク因子として確認することも否定することもできなかった［ヤノウスキー Ｅ．Ｃ．（Ｊａｎｏｗｓｋｙ Ｅ．Ｃ．）、クッパー Ｌ．Ｌ．（Ｋｕｐｐｅｒ Ｌ．Ｌ．）およびハルカ Ｂ．Ｓ．（Ｈｕｌｋａ Ｂ．Ｓ．）「Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ−ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４２、７８１−７９０頁（２０００年）；サンチェス−ゲレーロ Ｊ．（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ Ｊ．）、コルディッツ Ｇ．Ａ．（Ｃｏｌｄｉｔｚ Ｇ．Ａ．）、カールソン Ｅ．Ｗ．（Ｋａｒｌｓｏｎ Ｅ．Ｗ．）、ハンター Ｄ．Ｊ．（Ｈｕｎｔｅｒ Ｄ．Ｊ．）、スパイザー Ｆ．Ｅ．（Ｓｐｅｉｚｅｒ Ｆ．Ｅ．）およびリャン Ｍ．Ｈ．（Ｌｉａｎｇ Ｍ．Ｈ．）「Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ−Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ．」Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３２、１６６６−１６７０頁（１９９５年）］。 In general, systemic side effects are thought to reflect changes to local levels, but crosstalk and the like have not been clarified. Even more importantly, in a prospective cohort study in both Europe and the United States, the effect of silicon injection could not be confirmed or denied as a risk factor in the development of CTD or other autoimmune diseases [Yanowski E . C. (Janowski E.C.), Kuppa L. L. (Kupper L.L.) and Haruka B.I. S. (Hulka B.S.) “Meta-analyses of the relation between silicone breast imprints and the risk of connective-tissue second.” (Sanchez-Guerrero J.), Colditz G. A. (Colditz GA), Carlson E.C. W. (Karlson EW), Hunter D. J. et al. (Hunter DJ), Spyzer F. E. (Speizer FE) and Liang M. H. (Liang MH) "Silicon Breast Implants and the Risk of Connective-Tissue Diseases and Symptoms." N Engl J Med 332, pp. 1666-1670 (1995)].
それに対し、ＳＭＩの保有者における結合組織疾患様の徴候が注入物の除去後に消失したことが示されている［ザズゴルニク Ｊ．（Ｚａｚｇｏｒｎｉｋ Ｊ．）、ピザ Ｈ．（Ｐｉｚａ Ｈ．）、カイザー Ｗ．（Ｋａｉｓｅｒ Ｗ．）、ベッテルハイム Ｐ．（Ｂｅｔｔｅｌｈｅｉｍ Ｐ．）、シュタイナー Ｇ．（Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｇ．）、スモーレン Ｊ．（Ｓｍｏｌｅｎ Ｊ．）、ビーゼンバッハ Ｇ．（Ｂｉｅｓｅｎｂａｃｈ Ｇ．）およびマシェク Ｗ．（Ｍａｓｃｈｅｋ Ｗ．）「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ．」Ｗｉｅｎ．Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１０８、７８１−７８７頁（１９９６年）］。さらに、ＳＭＩ周囲の被膜構造の発生に対して免疫学的機序が寄与することを示すことができた［ウォルフラム Ｄ．（Ｗｏｌｆｒａｍ Ｄ．）、ライナー Ｃ．（Ｒａｉｎｅｒ Ｃ．）、ニダーエッガー Ｈ．（Ｎｉｅｄｅｒｅｇｇｅｒ Ｈ．）、ピザ Ｈ．（Ｐｉｚａ Ｈ．）およびウィック Ｇ．（Ｗｉｃｋ Ｇ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｕｓ ｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ａｒｏｕｎｄ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２３、８１−９１頁（２００４年）］。後者のレポートでは、これらの被膜内で遅延型過敏性反応が生じることが示された。 In contrast, it has been shown that connective tissue disease-like symptoms in SMI holders disappeared after removal of the injection [Zazugornik J. et al. (Zazgornik J.), Pizza H. (Piza H.), Kaiser W. (Kaiser W.), Vettelheim P.M. (Bettelheim P.), Steiner G. (Steiner G.), Smolen J. et al. (Smolen J.), Biesenbach G. (Biesenbach G.) and Machek W. (Maschek W.) “Autoimmune reactions in patents with silicon breast implants.” Wien. Klin. Wochenschr. 108, 781-787 (1996)]. Furthermore, we were able to show that immunological mechanisms contribute to the development of the coating structure around SMI [Wolfram D. et al. (Wolfram D.), liner C.I. (Rainer C.), Nider Egger (Niederegger H.), Pizza H. (Piza H.) and Wick G. (Wick G.) "Cellular and molecular composition of fibrous capsules formed around silicon breast imprints with special focus on local immunity. 23, 81-91 (2004)]. The latter report showed that delayed type hypersensitivity reactions occur within these coatings.
大部分の専門家が、シリコンに対する反応が持続性のある強度の弱い異物反応の１種であるが、それらのプロセスの根底にある機序が正確に知られていないという意見に同意している。シリコンに対する免疫応答の活性化については明らかにされていても、（ｉ）シリコン自体が抗原特性を有するか、（ｉｉ）ハプテンまたは担体として作用するか、（ｉｉｉ）免疫アジュバントを示すか、（ｉｖ）潜在的抗原（ｃｒｙｐｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ）および「改変された自己（ａｌｔｅｒｅｄ ｓｅｌｆ）」の暴露を促進する表面であるか、あるいは（ｖ）周囲組織内でのストレス応答を誘発するかについては定かではない。 Most experts agree that the reaction to silicon is one of persistent and weak foreign body reactions, but the mechanisms underlying those processes are not precisely known . Although it has been clarified about the activation of the immune response against silicon, (i) whether the silicon itself has antigenic properties, (ii) acts as a hapten or carrier, (iii) exhibits an immune adjuvant, (iv) It is unclear whether it is a surface that promotes exposure of potential antigens and “altered self” or (v) induces a stress response in the surrounding tissue.
それがシリコンに対する免疫反応における主要な因子として同定されていても、シリコンの表面上のタンパク質性フィルムの組成物に対する理解は乏しい。それはほぼ注入直後に注入シリコンの表面上で得られる［エルウィング Ｈ．（Ｅｌｗｉｎｇ Ｈ．）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９、３９７−４０６頁（１９９８年）］。フィルムを形成するタンパク質は、注入物と相互作用する最初の細胞である食細胞および線維芽細胞により認識される。 Even though it has been identified as a major factor in the immune response to silicon, there is a poor understanding of the composition of proteinaceous films on the surface of silicon. It is obtained on the surface of the implanted silicon almost immediately after implantation [Ellwing H. et al. (Elwing H.) “Protein abstraction and ellipsis in biomaterial research.” Biomaterials 19, pp. 397-406 (1998)]. The proteins that form the film are recognized by the phagocytes and fibroblasts, the first cells that interact with the injection.
生体系内では、フロー条件、タンパク質の高次構造変化、タンパク質の競合的吸着、ならびに血液凝固および補体活性化における初期効果が、人工表面上でのタンパク質フィルムの形成に強く影響することを力説することは重要である（「フローマン（Ｖｒｏｍａｎ）効果」）［フローマン Ｌ．（Ｖｒｏｍａｎ Ｌ．）、アダムズ Ａ．Ｌ．（Ａｄａｍｓ Ａ．Ｌ．）、フィッシャー Ｇ．Ｃ．（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｇ．Ｃ．）およびムノス Ｐ．Ｃ．（Ｍｕｎｏｚ Ｐ．Ｃ．）「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ，Ｆａｃｔｏｒ−Ｘｉｉ，ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ａｔ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．」Ｂｌｏｏｄ ５５、１５６−１５９頁（１９８０年）］。フィルムが複雑であることから、フィブリノーゲンＤドメインにおけるγ１９０〜２０２の潜在的な免疫原性のあるエピトープが［それらの表面上のＭＡＣ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を通じて］マクロファージを活性化可能であることがこれまで示されているにすぎない［フー Ｗ．Ｊ．（Ｈｕ Ｗ．Ｊ．）、イートン Ｊ．Ｗ．（Ｅａｔｏｎ Ｊ．Ｗ．）、ウガロヴァ Ｔ．Ｐ．（Ｕｇａｒｏｖａ Ｔ．Ｐ．）およびタン Ｌ．（Ｔａｎｇ Ｌ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｏｒｅｉｇｎ ｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｂｌｏｏｄ ９８、１２３１−１２３８頁（２００１年）］。フィブリノーゲンのこのエピトープは、シリコン表面への接着時に限って暴露され、ＳＭＩの局所性副作用において重要な役割を果たす。応答として、活性化されたマクロファージがＴＮＦ−αを産生し、それにより、リンパ球が補充され、線維芽細胞の周囲組織への分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、増殖および移動が誘発される。線維症は、シリコン表面に接着したタンパク質と相互作用するリンパ球、線維芽細胞およびマクロファージにより常に持続される、シリコンに対する慢性炎症反応への周囲組織の応答として発症する。 In biological systems, it is emphasized that flow conditions, protein conformational changes, competitive protein adsorption, and initial effects on blood clotting and complement activation strongly influence the formation of protein films on artificial surfaces. It is important to do (“Vroman effect”) [Flowman L. (Vroman L.), Adams A.M. L. (Adams AL), Fisher G. C. (Fischer GC) and Munos P. C. (Munoz PC) "Interaction of High Molecular-Weight Kininogen, Factor-Xii, and Fibrinogen in Plasma at Interfaces." Blood 55, 156-159 (1980). Due to the complexity of the film, potential immunogenic epitopes of γ190-202 in the fibrinogen D domain can activate macrophages [through MAC-1 (CD11b / CD18) on their surface] Has only been shown so far [Foo W. J. et al. (Hu WJ), Eaton J.M. W. (Eaton JW), Ugarova T. P. (Ugarova TP) and Tan L. (Tang L.) "Molecular basis of biomaterial-foreign body body reactions." Blood 98, 1231-1238 (2001)]. This epitope of fibrinogen is only exposed upon adhesion to the silicon surface and plays an important role in the local side effects of SMI. In response, activated macrophages produce TNF-α, which recruits lymphocytes and induces transdifferentiation of fibroblasts to surrounding tissues, proliferation and migration. Fibrosis develops as a response of surrounding tissue to a chronic inflammatory response to silicon that is always sustained by lymphocytes, fibroblasts and macrophages that interact with proteins attached to the silicon surface.
線維性被膜形成に関する免疫仮説についてのさらなる証拠が、注入物周囲の結合組織被膜の組成物中に見出されうる。被膜形成における免疫組織学的レベルについては、類似の知見を有する極めて多数の研究において検討されている［ウィック Ｇ．（Ｗｉｃｋ Ｇ．）、ワグナー Ｒ．（Ｗａｇｎｅｒ Ｒ．）、クリマ Ｇ．（Ｋｌｉｍａ Ｇ．）およびウィルフリングセダー Ｐ．（Ｗｉｌｆｌｉｎｇｓｅｄｅｒ Ｐ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」カノ Ｋ．（Ｋａｎｏ Ｋ．）、モリ Ｓ．（Ｍｏｒｉ Ｓ．）、スギサキ Ｔ．（Ｓｕｇｉｓａｋｉ Ｔ．）およびトリス Ｍ．（Ｔｏｒｉｓｕ Ｍ．）編 ２３１−２４１頁（東京大学出版会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ Ｐｒｅｓｓ）、東京（Ｔｏｋｙｏ）；１９８７年）ならびにガッビアーニ Ｇ．（Ｇａｂｂｉａｎｉ Ｇ．）、ヒルシェル Ｂ．Ｊ．（Ｈｉｒｓｃｈｅｌ Ｂ．Ｊ．）、リアン Ｇ．Ｂ．（Ｒｙａｎ Ｇ．Ｂ．）、スタトコフ Ｐ．Ｒ．（Ｓｔａｔｋｏｖ Ｐ．Ｒ．）およびマジュノ Ｇ．（Ｍａｊｎｏ Ｇ．）「Ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｓ ａ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｏｒｇａｎ．Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．」Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３５、７１９−７３４頁（１９７２年）］。 Further evidence about the immune hypothesis regarding fibrotic capsule formation can be found in the composition of the connective tissue capsule around the infusion. The immunohistological level in film formation has been examined in a large number of studies with similar findings [Wick G. et al. (Wick G.), Wagner R. (Wagner R.), Klima G. (Klima G.) and Wilfring Seder P. (Wilflingder P.) “Cellular, Molecular and Genetic Approaches to Immunodiagnosis and Immunotherapy” Kano K. (Kano K.), Mori S. (Mori S.), Sugisaki T. (Sugisaki T.) and Tris M. (Torisu M.), pages 231-241 (University of Tokyo Press, Tokyo; 1987) and Gabbani G. (Gabbiani G.), Hillshell B. J. et al. (Hirschel B.J.), Lian G. B. (Ryan GB), Statokov P.M. R. (Statkov PR) and Majuno G. (Majno G.) “Granulation tissue as a construct organ. A study of structure and function.” The Journal of Experimental Medicine, p.
マクロファージおよび線維芽細胞の表現型を有する細胞からなる滑膜様の多層の異形成が注入物に向けて形成されることが示されている。興味深いことに、これらの細胞は、ＳＭＩの表面上に大量の熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）のようなストレスタンパク質も発現する［ウォルフラム Ｄ．（Ｗｏｌｆｒａｍ Ｄ．）、ライナー Ｃ．（Ｒａｉｎｅｒ Ｃ．）、ニダーエッガー Ｈ．（Ｎｉｅｄｅｒｅｇｇｅｒ Ｈ．）、ピザ Ｈ．（Ｐｉｚａ Ｈ．）およびウィック Ｇ．（Ｗｉｃｋ Ｇ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｕｓ ｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ａｒｏｕｎｄ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２３、８１−９１頁（２００４年）］。線維芽細胞の慢性増殖性炎症パターンが原因で、２年を超える注入期間後に密集した膠原線維症が生じている［シグロウ Ｗ．（Ｓｉｇｇｅｌｋｏｗ Ｗ．）、ファリディ Ａ．（Ｆａｒｉｄｉ Ａ．）、クリンゲ Ｕ．（Ｋｌｉｎｇｅ Ｕ．）、ラス Ｗ．（Ｒａｔｈ Ｗ．）およびクロスターハルフェン Ｂ．（Ｋｌｏｓｔｅｒｈａｌｆｅｎ Ｂ．）「Ｋｉ６７，ＨＳＰ７０ ａｎｄ ＴＵＮＥＬ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．」Ｊ Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ １５、１３５５−１３６０頁（２００４年）］。結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の分泌を通じての局所的な線維化プロセスのさらなる刺激が被膜内のγδ−Ｔ−細胞により媒介され［ワーカレマフ Ｇ．（Ｗｏｒｋａｌｅｍａｈｕ Ｇ．）、フォエルスター Ｍ．（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ Ｍ．）、クレーゲル Ｃ．（Ｋｒｏｅｇｅｌ Ｃ．）およびブラウン Ｒ．Ｋ．（Ｂｒａｕｎ Ｒ．Ｋ．）「Ｈｕｍａｎ ｇａｍｍａ ｄｅｌｔａ−Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＩＬ−１５ ａｎｄ ＴＧＦ−ｂｅｔａ １ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｐｈａ ｂｅｔａ−Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．」Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７０、１５３−１５７頁（２００３年）］、それは注入物周囲の結合組織被膜内にも見出された。さらに、マクロファージがγδ−Ｔ−細胞によって産生されるＴＮＦ−αによる正のフィードバックループを介して刺激される。
It has been shown that synovial-like multilayered dysplasia consisting of cells with macrophage and fibroblast phenotypes is formed towards the injectate. Interestingly, these cells also express large amounts of stress proteins such as heat shock protein 60 (HSP60) on the surface of SMI [Wolfram D. et al. (Wolfram D.), liner C.I. (Rainer C.), Nider Egger (Niederegger H.), Pizza H. (Piza H.) and Wick G. (Wick G.) "Cellular and molecular composition of fibrous capsules formed around silicon breast imprints with special focus on local immunity. 23, 81-91 (2004)]. Due to the chronic proliferative inflammation pattern of fibroblasts, dense collagen fibrosis occurs after an infusion period of more than 2 years [Shiguro W. et al. (Siggelow W.), Faridi A. (Faridi A.), Klinge U. (Klinge U.), Lass. (Rath W.) and Klosterhalfen B.I. (Klosterhalfen B.) “Ki67, HSP70 and TUNEL for the specification of testing of silicon breast implants in vivo.” J Mater. Sci. Mater.
注入された原料に対する宿主応答の評価には、細胞および分子レベルの双方での応答に関して系統的で客観的な検討を行う必要がある。ハント（Ｈｕｎｔ）ら［ハント Ｊ．Ａ．（Ｈｕｎｔ Ｊ．Ａ．）、マクローリン Ｐ．Ｊ．（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ Ｐ．Ｊ．）およびフラナガン Ｂ．Ｆ．（Ｆｌａｎａｇａｎ Ｂ．Ｆ．）「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １８（２２）、１４４９−１４５９頁（１９９７年）］は、試薬がまだ使用可能でない場合の技術と、継続的な適用が既存のアプローチを補助するものとして極めて重要であるとされるＤＮＡベースの技術を含む、細胞のマーカーまたは分子を試験するためのツールとしての抗体の発現を意図した現行の技術について記載している。 Evaluating host responses to injected ingredients requires systematic and objective studies of responses at both the cellular and molecular levels. [Hunt J. et al. A. (Hunt JA), Macrolin P.M. J. et al. (McLaughlin P.J.) and Flanagan B.E. F. (Flanagan BF) “Techniques to investigate cellular and molecular interactions in the host response to implied biomaterials. And current applications intended for the expression of antibodies as a tool for testing cellular markers or molecules, including DNA-based techniques where continuous application is considered critical to assist existing approaches It describes the technology.
米国特許第４，０４８，２９８号明細書は固体二重抗体ラジオイムノアッセイ法を開示している。同特許は、抗原自体または例えばタンパク質との反応によって抗原物質に変換されうるハプテンのいずれかでありうる抗原物質の体液含量をアッセイするためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法に関する。本発明は、アッセイで対象とされる体液中に存在すると思われる抗原物質に特異的な第１の抗体が存在する場合の二重抗体ＲＩＡ技術の新しくかつ改善された修飾に関する。しかし、二次抗体は抗原物質または分析物に特異的でないが、第１の抗体に特異的な抗体である。 U.S. Pat. No. 4,048,298 discloses a solid double antibody radioimmunoassay method. The patent relates to a radioimmunoassay (RIA) method for assaying the body fluid content of an antigenic substance, which can be either the antigen itself or a hapten that can be converted to an antigenic substance, for example by reaction with proteins. The present invention relates to a new and improved modification of the double antibody RIA technique in the presence of a first antibody specific for an antigenic substance that is likely to be present in a body fluid to be assayed. However, the secondary antibody is not specific for the antigenic substance or analyte, but is specific for the first antibody.
国際公開第０２／４１０００号パンフレットは、膜結合マトリックスのメタロプロテアーゼに対するイムノアッセイ法について開示している。単純な手順および試薬を用いることで、ＭＴｌ−ＭＭＰを迅速に定量可能であるかまたはＭＴｌ−ＭＭＰの酵素活性を高感度および高精度で測定可能である。すなわち、抗−ＭＴｌ−ＭＭＰ抗体およびそれとともに用いられるべき試薬によりＭＴｌ−ＭＭＰを免疫学的に定量する方法の使用、すなわち、（ｉ）界面活性剤および／または還元剤の使用とともに細胞膜から放出されかつ／または可溶化されているＭＴｌ−ＭＭＰと、（ｉｉ）自ら可溶化されたＭＴｌ−ＭＭＰおよびそれとともに用いられるべき試薬ならびに固相ＭＴｌ−ＭＭＰからなる群から選択されるメンバーを免疫学的に定量する方法の使用により、ＭＴｌ−ＭＭＰを定量するかまたはＭＴｌ−ＭＭＰの酵素活性を測定することが可能になる。さらに、ＭＴｌ−ＭＭＰの発現プロモーターまたは阻害剤およびＭＴｌ−ＭＭＰの活性プロモーターまたは阻害剤がそれによりスクリーニングされうる。それ故、有用な薬剤に関する研究および開発が促進されうる。これらの試薬は癌および癌転移の検査においても有用である。 WO 02/41000 discloses an immunoassay for membrane-bound matrix metalloproteases. By using simple procedures and reagents, MT1-MMP can be rapidly quantified or the enzyme activity of MT1-MMP can be measured with high sensitivity and high accuracy. That is, use of a method for immunologically quantifying MT1-MMP with an anti-MT1-MMP antibody and a reagent to be used therewith, ie, (i) released from the cell membrane with the use of a surfactant and / or a reducing agent. And / or a member selected from the group consisting of MTl-MMP solubilized and (ii) self-solubilized MTl-MMP and reagents to be used with it and solid phase MTl-MMP The use of a quantifying method makes it possible to quantify MTl-MMP or measure the enzymatic activity of MTl-MMP. In addition, MT1-MMP expression promoters or inhibitors and MT1-MMP active promoters or inhibitors can thereby be screened. Therefore, research and development on useful drugs can be facilitated. These reagents are also useful in the examination of cancer and cancer metastasis.
米国特許第５，３８９，５１８号明細書は、あるポリマー上、例えばシリコン上に堆積可能なフィブロネクチンおよびビトロネクチンの特定のドメインに特異的なモノクローナル抗体について記載している。これらの抗体はタンパク質のフィブロネクチンおよびビトロネクチンに結合可能であるとともに生物学的物質として役立ちうる。しかし、フィブロネクチンおよびビトロネクチンのシリコン表面に対する直接的結合については示されていない。 US Pat. No. 5,389,518 describes monoclonal antibodies specific for specific domains of fibronectin and vitronectin that can be deposited on certain polymers, such as silicon. These antibodies can bind to the proteins fibronectin and vitronectin and serve as biological material. However, no direct binding of fibronectin and vitronectin to the silicon surface has been shown.
胸部へのシリコン注入は論争の歴史を有しており、食品医薬品局により使用についてはもはや認められていない。それらはシリコンゲルで充填された柔らかいシリコンゴムの外部被覆からなるものであった。胸部へのシリコン注入に関連する合併症についての事例報告が、強皮症およびリウマチ様症候群などの結合組織障害との関連を含めて極めて多い。 Silicon injection into the chest has a controversial history and is no longer approved for use by the Food and Drug Administration. They consisted of an outer coating of soft silicone rubber filled with silicone gel. There are numerous case reports of complications associated with chest silicon injection, including association with connective tissue disorders such as scleroderma and rheumatoid syndrome.
胸部注入のあらゆるタイプに明白な合併症は、出血および感染などの手術に関連した合併症を含む。注入物の寿命の後半では、主要な合併症は被膜拘縮および注入物の破裂（ｉｍｐｌａｎｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）を含む。しかし、無傷のシリコン注入物の外膜に対して類似の合併症が存在する。 The obvious complications for any type of chest injection include those associated with surgery such as bleeding and infection. In the second half of the infusion life, the major complications include capsule contractures and implant rupture. However, similar complications exist for the outer membrane of intact silicon implants.
いくつかの興味深い事柄が示されているが、これらの合併症の原因は不明のままである。例えば、シリコン注入物内部のゲルは重合形態である。未重合のシリコンが無傷のシリコン膜を通して周囲組織に流出しうる。この未重合のシリコンが被膜拘縮を担う線維化反応を刺激することが理論化されている。シリコンの無傷の膜を通しての流出ならびに注入物の破裂は肉芽腫の形成を伴う。にもかかわらず、無傷の注入物の表面すなわち「真の」表面を被覆する重合シリコンもまた、シリコンの流出を伴わなくても肉芽腫性または線維性の被膜を形成する可能性を有する。 Several interesting things have been shown, but the cause of these complications remains unknown. For example, the gel inside the silicon implant is in a polymerized form. Unpolymerized silicon can flow through the intact silicon film into the surrounding tissue. It has been theorized that this unpolymerized silicon stimulates the fibrotic reaction responsible for the contracture of the film. The outflow of silicon through an intact membrane as well as the rupture of the implant is accompanied by the formation of granuloma. Nevertheless, polymerized silicon that coats the surface of the intact implant, or “true” surface, also has the potential to form a granulomatous or fibrous capsule without silicon spillage.
現在、タンパク質とシリコンの間の相互作用についてはほとんど理解されていない。特定のシリコンであるオクタメチルシクロテトラシロキサン（Ｄ４）がフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンにおける変性および高次構造変化を誘発することが示されているが、免疫原性におけるそれらの関連性についての証拠は全くない［サン Ｌ．（Ｓｕｎ Ｌ．）、アレキサンダー Ｈ．（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｈ．）、ラッタルーロ Ｎ．（Ｌａｔｔａｒｕｌｏ Ｎ．）、ブルメンタール Ｎ．Ｃ．（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ Ｎ．Ｃ．）、リッチ Ｊ．Ｌ．（Ｒｉｃｃｉ Ｊ．Ｌ．）およびチェン Ｇ．（Ｃｈｅｎ Ｇ．）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｙｃｌｉｃ ｓｉｌｉｃｏｎｅ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １８、１５９３−１５９７頁（１９９７年）］。 Currently, little is understood about the interaction between protein and silicon. A specific silicon, octamethylcyclotetrasiloxane (D 4 ), has been shown to induce denaturation and conformational changes in fibrinogen and fibronectin, but there is no evidence for their relevance in immunogenicity [San L. (Sun L.), Alexander H. (Alexander H.), Rattaloro N. (Lattataro N.), Blumenthal N. C. (Blummental NC), Rich J. L. (Ricci JL) and Chen G. (Chen G.) “Protein generation induced by cyclic silicon.” Biomaterials 18, pp. 1593-1597 (1997)].
タヴァッザーニ（Ｔａｖａｚｚａｎｉ）らは、ヒト単球由来のマクロファージのモデルを開発し、シリコンに誘発される炎症の機序について検討した。このモデルを用い、コラーゲンタイプＩとシリコンゲルの間の相互作用が細胞によるＩＬ−Ｉの分泌を誘発することが示された。しかし、コラーゲンのシリコンに対する結合特性については検討されなかった［タヴァッザーニ Ｆ．（Ｔａｖａｚｚａｎｉ Ｆ．）、シン Ｓ．（Ｘｉｎｇ Ｓ．）、ワデル Ｊ．Ｅ．（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｊ．Ｅ．）、スミス Ｄ．（Ｓｍｉｔｈ Ｄ．）およびボイントン Ｅ．Ｌ．（Ｂｏｙｎｔｏｎ Ｅ．Ｌ．） 「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｇｅｌ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．」Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．−Ｐａｒｔ Ａ、７２、２、１６１−１６７頁（２００４年）］。 Tavazzani et al. Developed a model of human monocyte-derived macrophages and investigated the mechanism of silicon-induced inflammation. Using this model, it was shown that the interaction between collagen type I and silicon gel induces IL-I secretion by cells. However, the binding properties of collagen to silicon were not examined [Tavazzani F. et al. (Tavazzani F.), Shin S. (Xing S.), Wadel J. et al. E. (Waddell JE), Smith D. (Smith D.) and Boynton E. L. (Boynton E.L.) “In vitro interaction between silicon gel and human monocycle-macrophages.” Biomed. Mat. Res. -Part A, 72, 2, 161-167 (2004)].
別の試験においては、ウォルフラム（Ｗｏｌｆｒａｍ）ら［ウォルフラム Ｄ．（Ｗｏｌｆｒａｍ Ｄ．）、ライナー Ｃ．（Ｒａｉｎｅｒ Ｃ．）、ニダーエッガー Ｈ．（Ｎｉｅｄｅｒｅｇｇｅｒ Ｈ．）、ピザ Ｈ．（Ｐｉｚａ Ｈ．）およびウィック Ｇ．（Ｗｉｃｋ Ｇ．）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｕｓ ｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ａｒｏｕｎｄ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２３、８１−９１頁（２００４年）によると、シリコンがストリンジェントな局所性のＴ細胞免疫応答を誘発しかつ注入被膜内に位置するタンパク質が数種存在することが示された。これらのタンパク質は、（ａ）膠原性タンパク質の（プロ）コラーゲンタイプＩおよびＩＩＩ、コラーゲンタイプＩＶ、（ｂ）非膠原性タンパク質のテネイシン、フィブロネクチンおよびラミニン、ならびに（ｃ）熱ショックタンパク質６０を含む。しかし、これらのタンパク質のシリコンへの結合を示すデータは全く提供されていない。それに対し、シリコン表面から隔絶された被膜が検討された。筆者らは、例えば予め潜在性を示したエピトープの暴露後での、結果として生ずるタンパク質の免疫原としての機能についてのみ考察している。
In another study, Wolfram et al. [Wolfram D. et al. (Wolfram D.), liner C.I. (Rainer C.), Nider Egger (Niederegger H.), Pizza H. (Piza H.) and Wick G. (Wick G.) "Cellular and molecular composition of fibrous capsules formed around silicon breast imprints with special focus on local immunity. 23, 81-91 (2004) showed that silicon induces a stringent local T cell immune response and there are several proteins located within the infusate capsule. These proteins include (a) the collagenous proteins (pro) collagen types I and III, collagen type IV, (b) the non-collagenous proteins tenascin, fibronectin and laminin, and (c)
バッコヴィッチ（Ｂａｃｋｏｖｉｃ）らは、注入物周囲の被膜形成に関する免疫学的基礎について検討した［Ａ．、オベライター Ｂ．（Ｏｂｅｒｒｅｉｔｅｒ Ｂ．）、デル・フラリ Ｂ．（Ｄｅｌ Ｆｒａｒｉ Ｂ．）、ファン Ｈ．Ｌ．（Ｈｕａｎｇ Ｈ．Ｌ．）、ピザ Ｈ．（Ｐｉｚａ Ｈ．）、ウィック Ｇ．（Ｗｉｃｋ Ｇ．）「Ｊｏｉｎｔ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、２１−２４頁、２００５年９月、キール（Ｋｉｅｌ）、ドイツ ｌｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１０、第６−８号、２００５年］。この試験では、インビボでＳＩを被覆するタンパク質性フィルムが分析されかつ１８３個のスポットからなるタンパク質セットが同定され、それから３種のタンパク質すなわちフィブロネクチン、ビトロネクチンおよび熱ショックタンパク質６０について言及された。さらなる詳細は全く提供されていない。
Backovic et al. Examined the immunological basis for film formation around the infusion [A. Oberiter B. (Oberreiter B.), Del Frari B. (Del Frari B.), Fan H. L. (Huang HL), Pizza H.L. (Piza H.), Wick G. (Wick G.) “Joint Annual Meeting of the German and Scandinavian Society of Immunology”, pages 21-24, September 2005, Kiel, Germany, 2006, No. 210-6. In this study, proteinaceous films covering SI in vivo were analyzed and a protein set consisting of 183 spots was identified, and then three proteins, fibronectin, vitronectin and
上記の進歩にもかかわらず、先行技術にはシリコン接着タンパク質およびタンパク質性フィルムの役割、特に細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質とシリコンとの相互作用をさらに活用するための方法およびデバイスを提供し、かつシリコン表面に接着可能な新規のタンパク質を同定するという需要が依然として存在する。例えば上記のような局所性または全身性副作用を発現させやすく、これらの結果に対するモニター、予防および治療に適する方法の基礎となりうる個人を同定しようとする場合、対象のシリコンに対する反応に内在する機序に関してより十分に理解することは不可欠である。さらにより十分に理解することは、より高い生体適合性を有するシリコンを提供するための重要な役割も果たす。 Despite the above advances, the prior art provides methods and devices to further exploit the role of silicon adhesion proteins and proteinaceous films, particularly the interaction of cells and extracellular matrix (ECM) proteins with silicon. However, there is still a need to identify new proteins that can adhere to silicon surfaces. Mechanisms inherent in the subject's response to silicon when trying to identify individuals who are likely to develop local or systemic side effects such as those described above and can be the basis for methods suitable for monitoring, prevention and treatment of these outcomes It is essential to understand more fully about. An even better understanding also plays an important role in providing silicon with higher biocompatibility.
本発明は、その第１の態様では、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法であって、ａ）哺乳類に由来する、シリコン接着ポリペプチドを含有すると思われる、また場合によりシリコンを含有する試料を取得する、かつ／または提供するステップと、ｂ）前記試料を少なくとも１種のシリコンに接触させるステップと、ｃ）ステップａ）および／またはｂ）からの前記シリコンに接着される前記ポリペプチドを単離する、好ましくは溶出させるステップと、ｄ）前記単離されたシリコン接着ポリペプチドを同定するステップと、を含む、方法を提供する。 The present invention, in its first aspect, is a method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface, comprising: a) a mammal-derived, silicon-adhering polypeptide, and optionally silicon. Obtaining and / or providing a containing sample; b) contacting the sample with at least one silicon; and c) adhering to the silicon from steps a) and / or b). Isolating, preferably eluting the polypeptide, and d) identifying the isolated silicon adhesion polypeptide.
本発明は、そのさらなる態様では、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための試薬キットであって、原料、緩衝液および助剤ならびに本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、試薬キットに関する。 The invention, in a further aspect thereof, is a reagent kit for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface, comprising a raw material, a buffer and an auxiliary agent and a substance for carrying out the method according to the invention, The present invention relates to a reagent kit.
本発明は、そのさらなる態様では、ある方法を介してまたは本発明に記載のキットの使用により同定されるシリコン接着ポリペプチドを提供する。 The invention, in a further aspect thereof, provides a silicon adhesion polypeptide identified through a method or by use of a kit according to the invention.
好ましい一実施形態では、本発明は、本発明によって同定されるポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明によって同定されるシリコンとの結合に干渉する物質、ならびにそれら各々の使用に関する。 In a preferred embodiment, the present invention relates to substances that interfere with the binding of the polypeptides identified by the present invention or silicon adhesion proteins and / or polypeptides to the silicon identified by the present invention, and their respective uses.
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明によって同定されるシリコンとの結合に干渉する物質、ならびに医薬担体を含有する医薬組成物に関する。 In another preferred embodiment, the present invention contains at least one silicon adhesion polypeptide or substance that interferes with the binding of silicon adhesion proteins and / or polypeptides to the silicon identified by the present invention, and a pharmaceutical carrier. The present invention relates to a pharmaceutical composition.
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその機能変異体を提供する。 In another preferred embodiment, the present invention provides a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, or a functional variant thereof.
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載のポリペプチド、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能変異体をコードするヌクレオチド配列、あるいは前記核酸の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。 In yet another preferred embodiment, the present invention provides a polypeptide according to the present invention, in particular a polypeptide having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4. The present invention relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a peptide, or a functional variant thereof, or a complementary nucleotide sequence of the nucleic acid.
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は本発明に記載の核酸を含む組換えベクターを提供する。好ましいさらなる実施形態では、本発明は本発明に記載の核酸またはベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は医療で用いられる、本発明に記載のポリペプチド、核酸またはベクターまたは発現ベクターを提供する。 In yet another preferred embodiment, the present invention relates to nucleic acids that hybridize under stringent conditions with the nucleic acids described in the present invention. In another preferred embodiment, the present invention provides a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the present invention. In a preferred further embodiment, the invention relates to a host cell comprising a nucleic acid or vector or expression vector according to the invention. In a further preferred embodiment, the invention relates to an antibody that immunologically recognizes a polypeptide according to the invention. In another preferred embodiment, the present invention provides a polypeptide, nucleic acid or vector or expression vector according to the present invention for use in medicine.
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能変異体を免疫学的に認識する抗体に関する。 In another preferred embodiment, the present invention immunologically converts a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, or a functional variant thereof. It relates to an antibody to be recognized.
さらなる好ましい一実施形態では、本発明は、有効用量の本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、または本発明に記載の抗体、および医薬的に許容できる担体を含有する医薬組成物に関する。 In a further preferred embodiment, the invention comprises an effective dose of a polypeptide according to the invention, a nucleic acid or vector according to the invention, an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention, or the invention. And a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、または哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応を検出するための本発明に記載の抗体の使用に関する。 In a further preferred embodiment, the invention provides a polypeptide according to the invention, a nucleic acid or vector according to the invention, an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention, or mammalian silicon, in particular medical The present invention relates to the use of the antibody according to the present invention for detecting a response to silicon.
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するためのポリペプチドの使用に関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、脊髄関連タンパク質（Ｍｙｅｌｏｉｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
In yet another preferred embodiment, the present invention relates to the use of a polypeptide for detecting a response response to mammalian silicon, wherein said polypeptide is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, selected from the group consisting of Myeloid related
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を含有すると思われる、診断対象の哺乳類に由来する試料を提供するステップと、ｂ）前記試料中で前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはそれらの前記機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、ｃ）前記哺乳類の前記シリコンに対する応答反応について、前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはそれらの機能変異体の存在または発現における変化から判定するステップと、を含む、方法に関する。 In another preferred embodiment, the present invention is a method for detecting a response response to mammalian silicon, comprising: a) a diagnostic subject that appears to contain at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof Providing a sample from a mammal of: b) detecting a change in the presence or expression of the at least one silicon adhesion polypeptide or the functional variant thereof in the sample; c) the mammal Determining a response response to said silicon from a change in the presence or expression of said at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof.
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、原料、緩衝液、助剤、および本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応を検出するための診断キットに関する。 In a further preferred embodiment, the present invention is for detecting a response response to mammalian silicon, in particular medical silicon, comprising raw materials, buffers, auxiliaries and substances for carrying out the method according to the invention. It relates to a diagnostic kit.
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳類におけるシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応をモニターするための方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコンを前記哺乳類に注入するステップと、ｂ）本発明に記載の方法またはキットを用いて本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドの存在または発現における変化を検出するステップと、場合によりステップｂ）を繰り返すステップと、を含む、方法に関する。 In another preferred embodiment, the present invention is a method for monitoring a response response to silicon, particularly medical silicon, in a mammal, comprising a) injecting at least one silicon into said mammal; b) Detecting a change in the presence or expression of a silicon adhesion polypeptide according to the present invention using the method or kit according to the present invention, and optionally repeating step b).
本発明は、その別の好ましい態様では、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドに干渉する物質をスクリーニングするための方法であって、ａ）シリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉すると思われる物質を提供するステップと、ｂ）シリコン、特に医療用シリコンを提供するステップと、ｃ）シリコン接着ポリペプチドを提供するステップと、ｄ）前記物質の存在下および不在下で前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着性の分析を通じて前記物質の干渉特性を分析するステップと、を含む、方法を提供し、ここで前記物質の存在下および不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着性における変化は、シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質を示唆している。 The invention, in another preferred embodiment thereof, provides a method for screening for substances that interfere with at least one silicon adhesion polypeptide, comprising: a) substances that are believed to interfere with the adhesion properties of the silicon adhesion polypeptide. B) providing silicon, in particular medical silicon, c) providing a silicon adhesion polypeptide, and d) the silicon adhesion polypeptide to the silicon in the presence and absence of the substance. Analyzing the interference properties of the substance through an analysis of adhesion, wherein a change in the adhesion of the silicon adhesion polypeptide to the silicon in the presence and absence of the substance is For the binding of silicon adhesion proteins and / or polypeptides to silicon Suggesting a substance that Wataru.
本発明は、その別の好ましい態様では、細胞のシリコンに対する接着性を検出するための方法であって、ａ）細胞を有する哺乳類の血清または創傷液の試料を提供するステップと、ｂ）シリコンを提供するステップと、ｃ）前記シリコンに接着する前記血清または創傷液に由来する細胞の量または数を分析するステップと、を含む、方法に関する。 The invention, in another preferred embodiment thereof, is a method for detecting adhesion of cells to silicon comprising the steps of: a) providing a sample of mammalian serum or wound fluid having cells; b) And c) analyzing the amount or number of cells derived from the serum or wound fluid that adheres to the silicon.
別の好ましい実施形態では、本発明は、注入シリコンに対する有害反応を被る哺乳類を治療する方法であって、本発明に記載の方法により同定されるシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップを含む、方法を提供する。 In another preferred embodiment, the present invention is a method of treating a mammal that suffers an adverse reaction to injected silicon, wherein the effective amount of the antibody interferes with the adhesive properties of the silicon adhesion polypeptide identified by the method of the present invention. A method is provided comprising the step of administering a substance to said mammal.
別の好ましい実施形態では、本発明は、シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法であって、ａ）本発明により同定されるシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップと、ｂ）前記哺乳類から試料を取得するステップと、ｃ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、を含む、方法を提供する。 In another preferred embodiment, the present invention is a method for monitoring the treatment of a mammal undergoing a responsive response to silicon, a) an effective amount that interferes with the adhesive properties of the silicon adhesion polypeptide identified by the present invention. B) obtaining a sample from the mammal; c) detecting a change in the presence or expression of at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof; Providing a method.
本発明が以下により詳細に記載される前に、本明細書中に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬が変化しうることから本発明がこれらに限定されないことは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語が、あくまで特定の実施形態を記載することを目的とし、本発明の範囲を限定するように意図されることはなく、あくまで添付の特許請求の範囲により限定されることになることも理解されるべきである。他に規定されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明を目的として、本明細書中で挙げられるすべての参考文献はそれら全体が参照により援用される。 Before the present invention is described in more detail below, it is to be understood that the invention is not limited to the particular methodology, protocols, and reagents described herein, as these may vary. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to limit the scope of the present invention, but is only limited by the scope of the appended claims. Should also be understood. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. For the purposes of the present invention, all references cited herein are incorporated by reference in their entirety.
既に概説したように、先行技術には哺乳類のシリコンに対する応答反応において関与するポリペプチドを同定するという需要が存在する。これらのポリペプチドは、免疫応答の主要な活性剤としての役割を果たすと推定され、ここでは注入の失敗につながる線維症に関与している。したがって、それらの組成物およびそれらの堆積のダイナミクスについての詳細な分析が必要である。さらに、これらの同定されるポリペプチドであれば、シリコンに対する応答反応に関連し、診断用のかつ治療可能性のある標的分子として役立ちうる。 As already outlined, there is a need in the prior art to identify polypeptides involved in the response response of mammalian silicon. These polypeptides are presumed to play a role as major activators of the immune response, here involved in fibrosis leading to infusion failures. Therefore, a detailed analysis of their compositions and their deposition dynamics is necessary. In addition, these identified polypeptides can serve as diagnostic and therapeutic target molecules associated with the response to silicon.
本明細書で用いられる「応答反応」という用語は、身体または細胞のシリコン、例えば医療用シリコンに対する生理的反応を意味するものとする。かかる反応は、身体の免疫系を含む免疫反応として現れる可能性があり、かつ局所性（すなわちシリコンとの接触部位またはその近傍）あるいは全身性（すなわち一般に身体、例えば血液、血清または他の液体などの中に見出される）の副作用、例えば注入シリコン、例えば注入ＳＭＩに対する応答として存在しうる［スモーレイ Ｄ．Ｌ．（Ｓｍａｌｌｅｙ Ｄ．Ｌ．）、レビン Ｊ．Ｊ．（Ｌｅｖｉｎｅ Ｊ．Ｊ．）、シャンクリン Ｄ．Ｒ．（Ｓｈａｎｋｌｉｎ Ｄ．Ｒ．）、ホール Ｍ．Ｆ．（Ｈａｌｌ Ｍ．Ｆ．）、およびスティーブンス Ｍ．Ｖ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｍ．Ｖ．）「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｉｌｉｃａ ａｍｏｎｇ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｍｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．」Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９６、５６７−５７４頁（１９９６年）］。局所性および全身性の副作用は、推定上、結合組織の線維性被膜（通常、異物としての肉芽腫の形成を伴う）、線維筋痛、結合組織疾患（例えば炎症）、および強皮症様の線維化症候群の形成をもたらす。シリコン注入に応答して生じる線維化プロセスが他の注入に無関係の線維化疾患におけるモデルであることは注目すべきであり、それについては（ｉ）壊死後性疾患、例えば肝硬変、（ｉｉ）炎症性疾患、例えば関節リウマチ、または（ｉｉｉ）特発性の形態、例えばデュピュイトラン拘縮（Ｄｙｐｕｙｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）および（ｉｖ）一般的な異物反応（例えば注入物に対する反応）といった４つの異なるタイプが知られている。 The term “response response” as used herein is intended to mean a physiological response of body or cells to silicon, such as medical silicon. Such a reaction can appear as an immune response involving the body's immune system, and can be local (ie, at or near the site of contact with the silicon) or systemic (ie, generally the body, such as blood, serum or other fluids) Side effects, such as injected silicon, eg, injected SMI [Smoray D. L. (Smallley D.L.), Levin J.H. J. et al. (Levine JJ), Shanklin D. R. (Shanklin DR), Hall M. F. (Hall MF), and Stevens M.F. V. (Stevens M.V.) “Lymphocyte response to silico ammon offspring of silicon breast imprint recipients.” Immunobiology 196, 567-574 (1996). Local and systemic side effects are presumed to be connective tissue fibrous capsules (usually associated with granuloma formation as a foreign body), fibromyalgia, connective tissue diseases (eg inflammation), and scleroderma-like Leading to the formation of fibrosis syndrome. It should be noted that the fibrotic process that occurs in response to silicon injection is a model in fibrotic diseases unrelated to other injections, including (i) post-necrotic diseases such as cirrhosis, (ii) inflammation Four different types are known, such as sexually transmitted diseases, such as rheumatoid arthritis, or (iii) idiopathic forms, such as Dypuytren's contracture and (iv) general foreign body reaction (eg, response to infusion) It has been.
本明細書で用いられる「過敏症」という用語は、哺乳類のシリコンに対する（過剰な）応答反応、例えば個体の特定のシリコンに応答した有害反応における特定のタイプを示し、一実施形態ではこの個体においてのみ見出されうるのに対し、他の個体であれば各応答（すなわち特定のシリコンに対する個々の応答）を全く示す可能性がないことになる。 As used herein, the term “hypersensitivity” refers to a specific type of (excessive) response response to mammalian silicon, such as an adverse reaction in response to an individual's particular silicon, and in one embodiment in this individual Other individuals will not be able to show any response (ie, an individual response to a particular silicon) at all.
本発明は、その好ましい態様では、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法であって、ａ）哺乳類からシリコン接着ポリペプチドを含有すると思われ、また場合によりシリコンを含有する試料を取得する、かつ／または提供するステップと、ｂ）前記試料を少なくとも１種のシリコンに接触させるステップと、ｃ）ステップａ）および／またはｂ）から前記シリコンに接着される前記ポリペプチドを単離する、好ましくは溶出するステップと、ｄ）前記単離ポリペプチドを同定するステップと、を含む、方法を提供する。好ましくは、ポリペプチドは、ゲル電気泳動、より好ましくは二次元ゲル電気泳動を用いて最初に分離される。好ましくは、このステップの次に当業者に既知の染色手順、好ましくは銀染色が行われる。したがって、染色されたポリペプチドは、ポリペプチドの「スポットパターン」として検出可能となる。このパターンは、あるソフトウェアを用い、例えば対照パターンまたはデータベース、例えば２ＤゲルのＥｘＰａｓｙデータベースと適合されかつ比較される。好ましくは目的のポリペプチドスポットは取り出され、より好ましくは目的のポリペプチドスポットは手で取り出される。次いで、取り出されたポリペプチドスポットは、好ましくは消化され、質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いるペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）による分析に適する断片が得られる。好ましくは、試料はＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳを用いてさらに分析される。より好ましくは、結果はそこで当業者に既知のウエスタンブロット分析を用いて確認される。 The present invention, in its preferred embodiment, is a method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface comprising: a) obtaining a sample containing a silicon-adhesive polypeptide from a mammal and optionally containing silicon. And / or providing; b) contacting the sample with at least one silicon; and c) isolating the polypeptide attached to the silicon from steps a) and / or b). And preferably eluting; and d) identifying the isolated polypeptide. Preferably, the polypeptides are first separated using gel electrophoresis, more preferably two-dimensional gel electrophoresis. Preferably, this step is followed by a staining procedure known to those skilled in the art, preferably silver staining. Thus, the stained polypeptide can be detected as a “spot pattern” of the polypeptide. This pattern is matched and compared using certain software, for example, with a control pattern or database, such as an ExParsy database of 2D gels. Preferably the polypeptide spot of interest is removed, more preferably the polypeptide spot of interest is removed manually. The removed polypeptide spots are then preferably digested to obtain fragments suitable for analysis by mass spectrometry, eg, peptide mass fingerprint (PMF) using MALDI-TOF. Preferably, the sample is further analyzed using LIFT-TOF / TOF MS / MS. More preferably, the results are then confirmed using Western blot analysis known to those skilled in the art.
本明細書で用いられる「接着する」または「接着」という用語は、化合物、例えばポリペプチドが表面、例えばシリコンの表面に強く付着することを示す。この付着は、ポリペプチドとシリコンとの間の共有および非共有結合の双方によりなされうる。 As used herein, the term “adhere” or “adhesion” indicates that a compound, eg, a polypeptide, adheres strongly to a surface, eg, a silicon surface. This attachment can be made both covalently and non-covalently between the polypeptide and silicon.
本発明に記載の「ポリペプチド」という用語は、少なくとも１０個、好ましくは２０〜５０個、より好ましくは３０〜１００個といった所定の長さのアミノ酸鎖のアミノ酸を包含するペプチドまたはタンパク質を意味するものとし、ここでアミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結される。しかし、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能類似体によって置き換えられている、かかるポリペプチドのペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）もまた本発明により包含される。大部分の好ましいポリペプチドは、ポリペプチドのシリコンに対する接着に機能的に関与するかまたは含まれるペプチドの一部である。 The term “polypeptide” according to the present invention means a peptide or protein comprising amino acids of a predetermined length amino acid chain, such as at least 10, preferably 20-50, more preferably 30-100. It is assumed that amino acid residues are linked by covalent peptide bonds. However, peptidomimetics of such polypeptides in which amino acids and / or peptide bonds are replaced by functional analogs are also encompassed by the present invention. Most preferred polypeptides are part of peptides that are functionally involved or included in the adhesion of the polypeptide to silicon.
本明細書で用いられる「シリコン」という用語は、ヒト身体などの生理的環境下で用いられうるすべてのジメチルシロキサンポリマーを包含するものとする。通常、かかるシリコンは、生体適合性（すなわち身体の免疫応答を確実に誘発することが全くないかまたはほとんどない）を示し、また好ましくは高い生理的許容度を有する。かかるシリコンは「医療用シリコン」としても知られる。かかる医療用シリコンは、医療用注入、例えばシリコンのマンマリー注入などにおいて、または医療器具、例えばバイパス注入のためのコーティング剤として用いられうる。本発明に基づく使用に適するかかる医療用シリコンは当業者に既知である。医療用シリコンの好ましい例として、ヌシル（Ｎｕｓｉｌ）社（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ））により提供されるシリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、ＭＥＤ３６０が挙げられる。 As used herein, the term “silicone” is intended to encompass all dimethylsiloxane polymers that can be used in a physiological environment such as the human body. Typically, such silicon exhibits biocompatibility (i.e., does not elicit any or little of the body's immune response) and preferably has a high physiological tolerance. Such silicon is also known as “medical silicon”. Such medical silicon can be used in medical injections, such as silicon marymary injections, or as a coating for medical devices, such as bypass injections. Such medical silicones suitable for use according to the present invention are known to those skilled in the art. Preferred examples of medical silicon include the silicon types MED1511, MED4860, MED4211, and MED360 provided by Nusil (Waldbron, Germany).
本発明の一態様に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、試料は、シリコン、尿、胸膜液または腹水、脳脊髄液、創傷液または血清を網羅するタンパク質性フィルムから選択される。好ましくは、前記試料は、シリコン、血清または創傷液を網羅するタンパク質性フィルムから選択される。好ましくは、前記創傷液はドレナージにより得られる。 In a preferred embodiment of the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to one aspect of the invention, the sample covers silicon, urine, pleural fluid or ascites, cerebrospinal fluid, wound fluid or serum. Selected from proteinaceous films. Preferably, the sample is selected from proteinaceous films covering silicon, serum or wound fluid. Preferably, the wound fluid is obtained by drainage.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、試料はシリコンに対する応答反応を示す哺乳類から得られる。 In a preferred embodiment of the method for identifying polypeptides that adhere to a silicon surface according to the present invention, the sample is obtained from a mammal exhibiting a response response to silicon.
本発明と関連し、哺乳類は好ましくはヒトである。 In the context of the present invention, the mammal is preferably a human.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、試料は、一般に以下のタイプ、すなわち（ｉ）壊死後性疾患、例えば肝硬変症、（ｉｉ）炎症性疾患、例えば関節リウマチ、（ｉｉｉ）特発性の線維化疾患、例えばデュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｙｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、（ｉｖ）異物反応のうちの１つの線維化疾患からなる群から選択される応答反応を示す哺乳類から得られる。かかる疾患により、結合組織の線維性被膜、線維筋痛、結合組織疾患、および強皮症様の線維化症候群の形成がもたらされうる。 In another preferred embodiment in the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention, the sample is generally of the following type: (i) post-necrotic disease, eg cirrhosis, (ii) Selected from the group consisting of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, (iii) idiopathic fibrotic diseases such as Dupuytren's contracture, (iv) one fibrotic disease of foreign body reaction Obtained from mammals that exhibit a response. Such diseases can lead to the formation of a fibrous capsule of connective tissue, fibromyalgia, connective tissue disease, and scleroderma-like fibrosis syndrome.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法のさらなる好ましい実施形態では、結合組織の線維性被膜が免疫反応により形成される。 In a further preferred embodiment of the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention, a fibrous capsule of connective tissue is formed by an immune reaction.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、創傷液または血清が追加のシリコン、好ましくは医療用シリコンとともに提供される。 In a preferred embodiment of the method for identifying polypeptides that adhere to a silicon surface according to the present invention, wound fluid or serum is provided with additional silicon, preferably medical silicon.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、シリコンは未重合状態で提供される。本発明によって用いられる「未重合」という用語は、本質的に重合されないシリコン、例えば医療用シリコンの状態に関する。未重合シリコンは、通常、シリコン注入物（特に胸部注入物）における重合の副産物として生じ、かかる注入物に付随する問題の多くを引き起こすと考えられる。 In a preferred embodiment of the method for identifying polypeptides that adhere to a silicon surface according to the present invention, the silicon is provided in an unpolymerized state. The term “unpolymerized” as used by the present invention relates to the state of silicon that is essentially unpolymerized, such as medical silicon. Unpolymerized silicon usually occurs as a by-product of polymerization in silicon implants (especially breast implants) and is believed to cause many of the problems associated with such implants.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、シリコンは当業者に既知の任意の医療用シリコンであってもよい。好ましくは、シリコンはヌシル（Ｎｕｓｉｌ）社（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ））によって提供されるシリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、およびＭＥＤ３６０からなる群から選択される。 In another preferred embodiment in the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention, the silicon may be any medical silicon known to those skilled in the art. Preferably, the silicon is selected from the group consisting of silicon types MED1511, MED4860, MED4211, and MED360 provided by the company Nusil (Waldbron, Germany).
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、ステップｄ）は当業者に既知の任意の方法を含む。好ましくは、ステップｄ）は、一次元または二次元電気泳動、ウエスタンブロット分析、タンパク質の量および／または存在の測定に適するタンパク質アッセイ、質量分析、修飾、例えば銀染色の分析、高度糖化最終産物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ＡＧＥ）の形成、酸化、抗体アレイ、リガンドアレイ／アッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ、例えばＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイに適する方法から選択される方法を含む。 In another preferred embodiment of the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention, step d) comprises any method known to those skilled in the art. Preferably, step d) comprises one or two-dimensional electrophoresis, Western blot analysis, protein assay suitable for measuring protein quantity and / or presence, mass spectrometry, modification, eg analysis of silver staining, advanced glycation end products ( Suitable for formation of advanced glycation end products (AGE), oxidation, antibody array, ligand array / assay, enzyme immunoassay (EIA, eg, ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), and Luminex assay A method selected from methods.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、方法はステップｅ）に哺乳類におけるシリコンに対する応答反応を検出するためのマーカーポリペプチドとして適切なポリペプチドを同定するステップをさらに含む。好ましくは、外殖されたシリコンを被覆するタンパク質性フィルムから溶出されるタンパク質が創傷液または血清から取得されるシリコン接着タンパク質と比較される。より好ましくは、２つの系から溶出されるタンパク質は一次元および／または二次元ゲル電気泳動により比較される。好ましくは、２つの系に由来するタンパク質が特定の波長で励起されうる異なる蛍光色素で標識されることにより、単一のゲルから別々の画像が得られる。にもかかわらず、放射性検出も行ってもよい。各々の標識は当業者に周知である。好ましくは、タンパク質のスポットパターンは当業者に既知のかかるパターンの分析に適する任意のソフトウェアで分析される。好ましくは、タンパク質のスポットパターンは「Ｄｅｃｙｄｅｒ」ソフトウェア（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で分析される。 In a preferred embodiment of the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention, the method comprises in step e) a polypeptide suitable as a marker polypeptide for detecting a response response to silicon in a mammal. And further comprising an identifying step. Preferably, the protein eluted from the proteinaceous film covering the explanted silicon is compared to the silicon adhesion protein obtained from wound fluid or serum. More preferably, the proteins eluted from the two systems are compared by one-dimensional and / or two-dimensional gel electrophoresis. Preferably, separate images are obtained from a single gel by labeling proteins from the two systems with different fluorescent dyes that can be excited at specific wavelengths. Nevertheless, radioactive detection may also be performed. Each label is well known to those skilled in the art. Preferably, the protein spot pattern is analyzed with any software suitable for the analysis of such patterns known to those skilled in the art. Preferably, the protein spot pattern is analyzed with "Decyder" software (Amersham Biosciences).
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、応答反応は哺乳類におけるシリコンに対する過敏性反応である。 In another preferred embodiment of the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention, the response response is a hypersensitive response to silicon in a mammal.
本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、ステップｅ）は、ｅ’）前記シリコンを被覆するタンパク質性フィルムから同定された前記タンパク質の分離から誘導されるポリペプチドパターンを創傷液または血清から溶出されたシリコン接着ポリペプチドの分離から誘導されるポリペプチドパターンと比較するステップと、ｅ’’）前記パターン内の目的のスポットを選択しかつ分析するステップと、を含む。好ましくは試料間のスポットの容量比がスポット分布全体の２標準偏差を超えた場合、タンパク質の堆積量は異なると考えられ、最も好ましくは容量比が５倍の閾値を超えた場合、スポットは系内にのみ存在するものとして規定される。 In a preferred embodiment of the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention, step e) is derived from the separation of the protein identified from e ′) a proteinaceous film covering the silicon. Comparing the resulting polypeptide pattern with a polypeptide pattern derived from the separation of a silicon adhesion polypeptide eluted from wound fluid or serum, and e '') selecting and analyzing a spot of interest within the pattern Steps. Preferably, if the volume ratio of spots between samples exceeds 2 standard deviations of the overall spot distribution, the amount of protein deposition will be different, most preferably if the volume ratio exceeds a threshold of 5 times, It is defined as existing only within.
ステップａ）での本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法における別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは異なる蛍光色素でさらに標識されるかまたは放射性標識される。好ましくは、蛍光色素は特定の波長で励起可能である。当業者に既知の任意の蛍光色素が用いられる。好ましくは、蛍光色素は、７−アミノアクチノマイシンｄ（７−ＡＡＤ）、アクリジンオレンジ、アレクサ染料、アミノメチルクマリン−アセテート（ＡＭＣＡ）、Ｃｙ−染料、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）−染料、例えば、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３３２５８、「青色」蛍光、５，５’，６，６’テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチル−ベンズイミダゾリルカルボシアニンイオダイド（ＪＣ−Ｉ）、ペリジニン−クロロフィル−タンパク質（ＰｅｒＣＰ）、ヨウ化プロピジウム、ローダミンレッド−Ｘ、フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）、アミノメチルクマリンアセテートスルホニルクロライドローダミン−誘導体（テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ））、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）からなる群から選択される。 In another preferred embodiment in the method for identifying polypeptides that adhere to the silicon surface according to the invention in step a), the polypeptides are further labeled with different fluorescent dyes or radiolabeled. Preferably, the fluorescent dye is excitable at a specific wavelength. Any fluorescent dye known to those skilled in the art is used. Preferably, the fluorescent dye is 7-aminoactinomycin d (7-AAD), acridine orange, Alexa dye, aminomethylcoumarin-acetate (AMCA), Cy-dye such as Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC), Hoechst-dye, eg Hoechst 33342, Hoechst 33258, “blue” fluorescence, 5,5 ′, 6,6 ′ Tetrachloro-1,1 ′, 3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-I), peridinin-chlorophyll-protein (PerCP), propidium iodide, rhodamine red-X, phycoerythrin (R-PE) ),amino Chill coumarin acetate chloride rhodamine - derivatives (Texas Red (Texas-Red)), and is selected from the group consisting of tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC).
ステップｅ’’）における本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法の好ましい実施形態では、ポリペプチドのスポットパターンがシリコンから溶出されるポリペプチド由来のポリペプチドパターン内および創傷液または血清から溶出される分離されたシリコン接着ポリペプチドのポリペプチドにおけるポリペプチドパターン内に存在する全スポットを探索することにより分析される。 In a preferred embodiment of the method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface according to the present invention according to the invention in step e ''), the polypeptide spot pattern is within the polypeptide pattern derived from the polypeptide eluted from the silicon and Analyzed by searching for all spots present in the polypeptide pattern in the polypeptide of the isolated silicon adhesion polypeptide eluted from the wound fluid or serum.
本発明に記載の方法の特定の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。 In certain preferred embodiments of the methods described in this invention, the mammal is a human.
本発明は、そのさらなる態様では、材料、緩衝液および助剤ならびに本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、シリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための試薬キットに関する。 The invention, in a further aspect thereof, relates to a reagent kit for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface, comprising materials, buffers and auxiliaries and substances for carrying out the method according to the invention.
本発明は、そのさらなる態様では、ある方法を通じてまたは本発明に記載のキットを用いることにより同定されるシリコン接着ポリペプチドに関する。 The invention, in a further aspect thereof, relates to a silicon adhesion polypeptide identified through a method or by using a kit according to the invention.
本発明は、そのさらなる態様では、本発明により同定されるポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明により同定されるシリコンに対する結合に干渉する物質、ならびにそれら各々の使用に関する。 The invention, in a further aspect, relates to substances that interfere with the binding of the polypeptides or silicon adhesion proteins and / or polypeptides identified according to the invention to the silicon identified according to the invention, and their respective uses.
本発明は、そのさらなる態様では、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドあるいはシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明により同定されるシリコンに対する結合に干渉する物質、ならびに医薬担体を含有する医薬組成物に関する。 The invention, in a further aspect thereof, comprises a substance that interferes with the binding of at least one silicon adhesion polypeptide or silicon adhesion protein and / or polypeptide to the silicon identified according to the invention, and a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutical carrier About.
本発明は、そのさらなる態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドあるいはその機能変異体に関する。 In a further aspect thereof, the present invention relates to a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, or a functional variant thereof.
本発明の意味では「機能変異体」という用語は、本発明のポリペプチドに機能的に関連する、すなわちシリコンに接着するポリペプチドの共通の構造的または機能的特徴を共有するポリペプチドを意味する。機能変異体の例として、オーソログ、すなわちヒト以外の生物、好ましくは例えばサル、ブタ、マウス、およびラットなどの非ヒト哺乳類に由来する対応するポリペプチドが挙げられる。機能変異体の他の例として、生物の異なる個体内または異なる器官内の遺伝子の異なる対立遺伝子によってコードされるポリペプチドが挙げられる。さらにポリペプチドについても、本発明のポリペプチドに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび／またはこれらのポリペプチド配列から誘導されるＤＮＡ配列に対して約７０％、好ましくは約８０％、特に約９０％、より好ましくは約９５％の配列相同性、特に配列同一性を有する前記用語によって包含されるものとする。付加、転置、置換、欠失、挿入または化学的／物理的修飾および／もしくは交換または約１〜６０個、好ましくは約１〜３０個、および最も好ましくは約１〜１５個のアミノ酸の範囲内にあるポリペプチドの一部が含まれる。したがって、機能変異体は、好ましくは前記ポリペプチドのシリコンに対する接着を担うタンパク質のドメインを包含しうる。 In the sense of the present invention, the term “functional variant” means a polypeptide that is functionally related to the polypeptide of the present invention, ie, shares common structural or functional characteristics of polypeptides that adhere to silicon. . Examples of functional variants include orthologs, ie corresponding polypeptides derived from non-human organisms, preferably non-human mammals such as monkeys, pigs, mice and rats. Other examples of functional variants include polypeptides encoded by different alleles of genes in different individuals or in different organs of an organism. Furthermore, the polypeptide is also about 70%, preferably about 80%, in particular about 90% of the polypeptide having the amino acid sequence described in the polypeptide of the present invention and / or the DNA sequence derived from these polypeptide sequences. %, More preferably about 95% sequence homology, in particular by the term having sequence identity. Additions, transpositions, substitutions, deletions, insertions or chemical / physical modifications and / or exchanges or in the range of about 1-60, preferably about 1-30, and most preferably about 1-15 amino acids A portion of the polypeptide Thus, the functional variant preferably can include a domain of a protein responsible for adhesion of the polypeptide to silicon.
本発明に記載のポリペプチドの好ましい実施形態では、ポリペプチドまたはその機能変異体はシリコンの表面に接着する。 In a preferred embodiment of the polypeptide according to the present invention, the polypeptide or functional variant thereof adheres to the surface of silicon.
本発明に記載のポリペプチドに関する別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは融合タンパク質である。 In another preferred embodiment for the polypeptide according to the invention, the polypeptide is a fusion protein.
本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、ポリペプチドを天然に形成することのない少なくとも２種のポリペプチドからなるかまたはそれらを含む任意のポリペプチドを意味する。ＤＮＡレベルについては、２つ以上のコード配列がインフレームで融合される。融合タンパク質の各部分は、当業者に既知のリンカー（通常はペプチドリンカーまたは化学リンカー）により連結されかつ／または隔絶されうる。 As used herein, “fusion protein” means any polypeptide that consists of or contains at least two polypeptides that do not naturally form a polypeptide. For the DNA level, two or more coding sequences are fused in frame. The portions of the fusion protein can be linked and / or isolated by linkers known to those skilled in the art (usually peptide linkers or chemical linkers).
本発明は、その別の態様では本発明に記載のポリペプチド、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４のいずれか１つにて示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能変異体をコードするヌクレオチド配列あるいは前記核酸の相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。 In another aspect thereof, the present invention relates to a polypeptide according to the present invention, in particular a polypeptide having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4, or The present invention relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the functional variant or a complementary nucleotide sequence of the nucleic acid.
「機能変異体」という用語は、ストリンジェントな条件下で、誘導された参照配列またはその一部とハイブリダイズし、かつ本発明の各ペプチドに対して類似または同一の活性を示すＤＮＡ配列に対して相補的なすべてのＤＮＡ配列を示す。ハイブリダイゼーション条件は当業者に既知であり、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州、６．３．１−６．３．６、１９９１年にて見出されうる。中程度のハイブリダイゼーション条件が、３０℃、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、それに続く５０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの中での洗浄に等価なものとして定義される。高度にストリンジェントな条件は、４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、それに続く６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの中での洗浄に等価なものとして定義される。 The term “functional variant” refers to a DNA sequence that hybridizes under stringent conditions to a derived reference sequence or a portion thereof and that exhibits similar or identical activity against each peptide of the invention. All complementary DNA sequences. Hybridization conditions are known to those skilled in the art and are described in "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 6.3.1-6.3.6, 1991. Can be found in Moderate hybridization conditions are equivalent to hybridization in 30 ° C., 2 × sodium chloride / sodium citrate (SSC), followed by washing in 50 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS. Defined as a thing. Highly stringent conditions are for hybridization in 45 ° C., 6 × sodium chloride / sodium citrate (SSC), followed by washing in 65 ° C., 0.2 × SSC, 0.1% SDS. Defined as equivalent.
本発明に記載の核酸の好ましい実施形態では、核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである。さらに、本発明の核酸分子はゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであり、かつ二本鎖または一本鎖、センス鎖および／またはアンチセンス鎖でありうる。これらの分子のセグメントは本発明の範囲内にあるとも考えられ、かつ例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されうるかまたは１種もしくは複数種の制限エンドヌクレアーゼを用いる処理により生成されうる。リボ核酸（ＲＮＡ）分子はインビトロ転写により生成されうる。 In a preferred embodiment of the nucleic acid according to the present invention, the nucleic acid is DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA or a combination thereof. Furthermore, the nucleic acid molecules of the invention can be genomic DNA, synthetic DNA, or combinations thereof and can be double-stranded or single-stranded, sense strand and / or antisense strand. Segments of these molecules are also considered to be within the scope of the present invention and can be generated, for example, by polymerase chain reaction (PCR) or by treatment with one or more restriction endonucleases. Ribonucleic acid (RNA) molecules can be generated by in vitro transcription.
本発明の核酸分子は自然に存在する配列を有しうるか、または自然に存在するが遺伝子コードの縮重により生じる配列と異なる配列は同じペプチド（例えば配列番号１、２、３または４を有するペプチド）をコードする。さらに、これらの核酸分子はコード配列に限定されることはなく、例えばコード配列から上流または下流に位置する非コード配列の一部または全部を含みうる。 The nucleic acid molecules of the present invention can have naturally occurring sequences, or sequences that are naturally occurring but differ from sequences that result from the degeneracy of the genetic code are the same peptides (eg, peptides having SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 4). ). Furthermore, these nucleic acid molecules are not limited to coding sequences, and can include, for example, some or all of the non-coding sequences located upstream or downstream from the coding sequence.
本発明の核酸分子は、インビトロで（例えばホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）に基づく合成により）合成されうるかまたは細菌または哺乳類の細胞などの細胞から取得されうる。核酸は、ヒトのものでありうるが、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、またはネコから誘導されるものでもありうる。核酸のこれらのタイプの範囲内でのヌクレオチドの組み合わせまたは修飾もまた包含される。 The nucleic acid molecules of the invention can be synthesized in vitro (eg, by synthesis based on phosphoramidites) or can be obtained from cells such as bacterial or mammalian cells. The nucleic acid can be human, but can also be derived from a non-human primate, mouse, rat, guinea pig, cow, sheep, horse, pig, rabbit, dog, or cat. Combinations or modifications of nucleotides within these types of nucleic acids are also encompassed.
さらに、本発明の単離された核酸分子は、例えば天然状態で見出されることがないセグメントを包含しうる。したがって、本発明は、ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）あるいは異種細胞のゲノム（または天然の染色***置と異なる位置での相同細胞のゲノム）に組み込まれる組換え核酸分子を包含する。したがって、組換え核酸分子および使用については以下でさらに考察される。 Furthermore, an isolated nucleic acid molecule of the invention can include segments that are not found, for example, in the natural state. Accordingly, the present invention encompasses recombinant nucleic acid molecules that are integrated into a vector (eg, a plasmid or viral vector) or a heterologous cell genome (or a homologous cell genome at a location different from the natural chromosomal location). Accordingly, recombinant nucleic acid molecules and uses are further discussed below.
さらに、本発明に記載の核酸は、マーカーまたは標識、例えばアフィニティータグ、抗原タグ、蛍光基、消光剤、放射性基、染料、重原子（窒素など）、酵素的に検出可能な基、酵素的に活性のある基などを有しうる。これらのすべてのマーカーまたは標識およびこれらを接着させるための各々の技術は当業者に周知である。 In addition, the nucleic acids described in the present invention may comprise markers or labels, such as affinity tags, antigen tags, fluorescent groups, quenchers, radioactive groups, dyes, heavy atoms (such as nitrogen), enzymatically detectable groups, enzymatically. It may have an active group or the like. All these markers or labels and the respective techniques for attaching them are well known to those skilled in the art.
本発明は、その別の態様では、ストリンジェントな条件下で本発明に記載の核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。 In another of its aspects, the present invention provides a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid described in the present invention.
本発明は、その別の態様では、本発明に記載の核酸を含む組換えベクターに関する。 In another aspect thereof, the present invention relates to a recombinant vector comprising the nucleic acid according to the present invention.
したがって、本発明は、別の実施形態では本発明の核酸分子を含むベクターに関する。かかるベクターは、導入される能力または核酸を細胞に導入する能力を有する。導入された核酸によりコードされるポリペプチドがベクターの導入時に細胞内で発現されることが好ましい。 Accordingly, the invention relates in another embodiment to a vector comprising a nucleic acid molecule of the invention. Such vectors have the ability to be introduced or to introduce nucleic acids into cells. It is preferred that the polypeptide encoded by the introduced nucleic acid is expressed in the cell upon introduction of the vector.
本発明に記載の組換えベクターの好ましい実施形態では、組換えベクターは過剰発現および抑制ベクターの双方を含む組換え発現ベクターである。 In a preferred embodiment of the recombinant vector according to the invention, the recombinant vector is a recombinant expression vector comprising both overexpression and repression vectors.
好ましい実施形態では、本発明のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、哺乳類人工染色体、ノックアウトまたはノックインコンストラクト、ウイルス、特にアデノウイルス、種痘ウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、レンチウイルス（チャン Ｌ．Ｊ．（Ｃｈａｎｇ Ｌ．Ｊ．）およびゲイ Ｅ．Ｅ．（Ｇａｙ Ｅ．Ｅ．）（２０００１年）Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ．１：２３７−２５１頁）、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ、カールソン Ｗ．Ａ．（Ｃａｒｌｅｚｏｎ Ｗ．Ａ．）ら（２０００年）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．）、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、カーター Ｐ．Ｊ．（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｊ．）およびサムルスキー Ｒ．Ｊ．（Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ．Ｊ．）（２０００年）Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．６：１７−２７頁）、リノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フィロウイルスおよびそれらの組換えバージョン（例えば、コビンガー Ｇ．Ｐ．（Ｃｏｂｉｎｇｅｒ Ｇ．Ｐ．）ら（２００１年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２２５−３０頁を参照）、ビロゾーム、「ネーキッド（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡリポソーム、ならびに核酸コーティング粒子、特にゴールドスフィア（ｇｏｌｄ ｓｐｈｅｒｅｓ）を含む。特に好ましいのはウイルスベクター様アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター（リンデマン（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ）ら（１９９７年）ＭｏＩ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６頁およびスプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら（１９９８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８頁）である。リポソームは、例えばリポソーム懸濁液の超音波処理による、通常、カチオン脂質、中性脂質および／またはアニオン脂質からなる小形の単層または多層小胞である。例えば、ＤＮＡはリポソームの表面にイオン化結合されるかまたはリポソーム内部に封入されうる。適切な脂質混合物は、当該技術分野で既知であり、例えばＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオクスプロピル（ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｐｒｏｐｙｌ）−３−トリメチルアンモニウムブロミド）およびＤＰＯＥ（ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン）を含有し、双方とも種々の細胞系において用いられている。 In a preferred embodiment, the vector of the invention comprises a plasmid, phagemid, phage, cosmid, mammalian artificial chromosome, knockout or knock-in construct, virus, in particular adenovirus, vaccination virus, attenuated vaccinia virus, canarypox virus, lentivirus (Chan LJ (Chang LJ) and Gay EE (20001) Curr. GeneTherap. 1: 237-251), herpes viruses, particularly herpes simplex viruses (HSV- I, Carlson WA, et al. (2000) Crit. Rev. Neurobiol.), Baculovirus, retrovirus, adeno-associated virus (AAV, Carter PJ (Carte). PJ) and Samulsky RJ (Samulski RJ) (2000) J. MoI. Med. 6: 17-27), linovirus, human immunodeficiency virus (HIV), filovirus and Recombinant versions thereof (see, for example, Cobinger GP, et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19: 225-30), virosomes, “naked” DNA liposomes, As well as nucleic acid coated particles, particularly gold spheres. Particularly preferred are viral vector-like adenovirus vectors or retroviral vectors (Lindmann et al. (1997) MoI. Med. 3: 466-76 and Springer et al. (1998) Mol. Cell. 2: 549-58). Liposomes are small unilamellar or multilamellar vesicles usually composed of cationic lipids, neutral lipids and / or anionic lipids, for example by sonication of liposome suspensions. For example, the DNA can be ionically bound to the surface of the liposome or encapsulated inside the liposome. Suitable lipid mixtures are known in the art and contain, for example, DOTMA (1,2-dioleoylpropyl-3-trimethylammonium bromide) and DPOE (dioleoylphosphatidyl-ethanolamine), both Both are used in various cell systems.
核酸コーティング粒子は、粒子の細胞への機械的導入を可能にするいわゆる「遺伝子銃」を用い、核酸を細胞に導入するための別の手段である。好ましくは、粒子自体は不活性であり、それ故に好ましい実施形態ではゴールドスフィアからなる。 Nucleic acid coated particles are another means for introducing nucleic acids into cells using so-called “gene guns” that allow the mechanical introduction of particles into cells. Preferably, the particles themselves are inert and therefore in a preferred embodiment consist of gold spheres.
本発明のさらなる態様では、本発明の核酸は原核生物および／または真核宿主細胞における発現を可能にする発現調節配列に作動的に連結される。上述の転写／翻訳調節因子は、限定はされないが、誘導および非誘導プロモーター、構成プロモーター、細胞周期調節プロモーター、代謝調節プロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサーおよび当業者に既知でありかつ遺伝子発現を駆動するかそうでなければ調節する他の因子を含む。かかる調節因子は、限定はされないが、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに類するものにより転写されるプロモーター、例えばｓｎＲＮＡ Ｕ６もしくはｓｃＲＮＡ ７ＳＫ遺伝子に対するプロモーター、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ即初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期もしくは後期プロモーター、ウイルスプロモーターおよび例えばＮＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、ＭＭＴＶもしくはＨＩＶに由来する活性化配列といったような構成的発現を誘導する調節因子を含み、それらは、例えばＣＵＰ−ｌプロモーター、ｔｅｔ−リプレッサー、例えばｔｅｔ−ｏｎもしくはｔｅｔ−ｏｆｆ系、ｌａｃ系、ｔｒｐ系で用いられるもの；組織特異的な発現を誘導する調節因子、例えばｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ＣもしくはサイクリンＡのような細胞周期特異的な発現を誘導する調節因子；またはＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α−もしくはａ−交配因子のプロモーターといったような誘導発現を可能にする。 In a further aspect of the invention, the nucleic acids of the invention are operably linked to expression control sequences that allow expression in prokaryotic and / or eukaryotic host cells. The transcription / translation regulators described above are known, but not limited to, inducible and non-inducible promoters, constitutive promoters, cell cycle regulated promoters, metabolic regulated promoters, enhancers, operators, silencers, repressors and gene expression Including other factors that drive or otherwise adjust. Such regulators include, but are not limited to, promoters transcribed by, for example, those similar to RNA polymerase III, such as promoters for the snRNA U6 or scRNA 7SK gene, cytomegalovirus hCMV immediate early gene, SV40 adenovirus early or late promoter, Viral promoters and regulatory elements that induce constitutive expression such as, for example, activation sequences derived from NBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, MMTV or HIV, such as the CUP-1 promoter, tet- Repressors, such as those used in the tet-on or tet-off, lac, trp systems; regulators that induce tissue-specific expression, such as cdc2, cdc25C or A regulator that induces cell cycle specific expression, such as cyclin A; or TAC system, TRC system, major operator and promoter region of phage A, regulatory region of fd coat protein, promoter for 3-phosphoglycerate kinase, Allows inducible expression such as the promoter of acid phosphatase, as well as the promoter of yeast α- or a-mating factor.
本明細書で用いられる「作動的に連結される」は、発現調節配列が目的のコード配列の発現を有効に調節するように遺伝子コンストラクトに組み込まれることを意味する。 As used herein, “operably linked” means that an expression control sequence is incorporated into a gene construct so as to effectively regulate the expression of the coding sequence of interest.
同様に、本発明の核酸は、追加されるペプチド配列、例えばマーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成しうる。マーカーおよびレポーター遺伝子の例として、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、（β−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃＺ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。当業者は、本発明の実施に関連する多くの標準的手順と同様、有用な追加試薬、例えばマーカーまたはレポーターの機能に役立ちうる追加配列について理解するであろう。一般に、ハイブリッドペプチドは第１の部分および第２の部分を含むことになり、ここで第１の部分はシリコン接着ポリペプチドであり、第２の部分は例えば上記のレポーターまたはＩｇ定常領域もしくはＩｇ定常領域の一部、例えばＩｇＧ２ａ重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。他のハイブリッドであれば、精製および／または検出を容易にする抗原タグまたはＨｉｓタグを含みうる。組換え核酸分子は、異種のシグナル配列に作動的に連結されるシリコン接着ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も有しうる。かかるシグナル配列は、タンパク質を細胞内の異なる区画に誘導する可能性があり、当業者に周知である。好ましいシグナル配列は、生成されるタンパク質の分泌を促進する配列である。 Similarly, the nucleic acids of the invention can form part of a hybrid gene that encodes additional peptide sequences, such as sequences that function as markers or reporters. Examples of marker and reporter genes, beta-lactamase, chloramphenicol acetyltransferase (CAT), adenosine deaminase (ADA), aminoglycoside phosphotransferase (neo r, G418 r), dihydrofolate reductase (DHFR), hygromycin -B -Phosphotransferase (HPH), thymidine kinase (TK), lacZ (encoding β-galactosidase), and xanthine guanine phosphoribosyltransferase (XGPRT). Those skilled in the art will appreciate useful additional reagents, such as markers or reporter sequences that may serve the function of the reporter, as well as many standard procedures related to the practice of the present invention. In general, a hybrid peptide will comprise a first portion and a second portion, where the first portion is a silicon adhesion polypeptide and the second portion is, for example, a reporter or Ig constant region or Ig constant as described above. Part of the region, for example the CH2 and CH3 domains of the IgG2a heavy chain. Other hybrids may include an antigen tag or His tag that facilitates purification and / or detection. The recombinant nucleic acid molecule can also have a polynucleotide sequence encoding a silicon adhesion polypeptide operably linked to a heterologous signal sequence. Such signal sequences can direct proteins to different compartments within the cell and are well known to those skilled in the art. Preferred signal sequences are those that facilitate secretion of the protein produced.
本発明に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを発現させるため、本発明に記載のポリペプチドのｃＤＮＡを、典型的には転写を誘導するための強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および翻訳を開始させるためのリボソーム結合部位を有する発現ベクターにサブクローニングさせる。適切な細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のプロモーターは当該技術分野で周知であり、かつかかる発現系用のキットは市販されている。同様に、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞に対する真核生物の発現系は当該技術分野で周知であり、それも市販されている。真核生物の発現ベクターは、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターでありうる。 In order to express cDNA encoding the polypeptide according to the present invention, the cDNA of the polypeptide according to the present invention typically initiates a strong promoter, transcription / translation terminator, and translation to induce transcription. And subcloning into an expression vector having a ribosome binding site. Suitable bacterial promoters such as E. coli, Bacillus sp. And Salmonella are well known in the art and kits for such expression systems are commercially available. Similarly, eukaryotic expression systems for mammalian cells, yeast, and insect cells are well known in the art and are also commercially available. The eukaryotic expression vector can be, for example, an adenoviral vector, an adeno-associated vector, or a retroviral vector.
発現ベクターは、プロモーターに加え、典型的には、宿主細胞内でのシリコン接着ポリペプチドをコードする核酸の発現に必要なすべての追加成分を有する転写単位または発現カセットを有する。したがって、典型的な発現カセットは、シリコン接着ポリペプチドをコードする核酸配列に作動的に連結されるプロモーター、ならびに転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルを有する。ならびにカセットの追加成分は、例えばエンハンサーを含みうる。発現カセットは、効率的な終結をもたらす構成遺伝子の下流にある転写終結領域も有するものである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られるかまたは異なる遺伝子から得られうる。 In addition to a promoter, an expression vector typically has a transcription unit or expression cassette that has all the additional components necessary for the expression of a nucleic acid encoding a silicon adhesion polypeptide in a host cell. Thus, a typical expression cassette has a promoter operably linked to a nucleic acid sequence encoding a silicon adhesion polypeptide, and signals necessary for efficient polyadenylation of the transcript, ribosome binding site, and translation termination. . As well as additional components of the cassette may include, for example, an enhancer. An expression cassette is also one that has a transcription termination region downstream of the constitutive gene that results in efficient termination. The termination region can be obtained from the same gene as the promoter sequence or from a different gene.
遺伝子情報を細胞に輸送するのに用いられる特定の発現ベクターは特に重要ではない。真核または原核細胞内での発現に用いられる従来ベクターのいずれかが用いられる場合がある。標準の細菌発現ベクターは、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系を含むが、有用に使用可能な当該技術分野で当業者により知られたものが多数存在する。 The particular expression vector used to transport the genetic information into the cell is not particularly important. Any of the conventional vectors used for expression in eukaryotic or prokaryotic cells may be used. Standard bacterial expression vectors include plasmids such as pBR322-based plasmids, pSKF, pET23D, and fusion expression systems such as GST and LacZ, although many are known by those skilled in the art to be useful. Exists.
真核ウイルス由来の調節因子を有する発現ベクターが、典型的には真核発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクターにて用いられる。他の典型的な真核ベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、多角体プロモーター、または真核細胞内での発現に有効であることが示された他のプロモーターの誘導下で、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ．ｓｕｐ．＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ．ｓｕｐ．＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳおよびタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを含む。一部の発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの遺伝子増幅をもたらすマーカーを有する。あるいは、遺伝子増幅を含むことのない高収量の発現系もまた適切である。 Expression vectors having eukaryotic virus-derived regulatory elements are typically used in eukaryotic expression vectors, such as SV40 vectors, papillomavirus vectors, and Epstein-Barr virus-derived vectors. Other typical eukaryotic vectors may be effective for expression in the SV40 early promoter, SV40 late promoter, metallothionein promoter, mouse mammary tumor virus promoter, Rous sarcoma virus promoter, polyhedron promoter, or eukaryotic cells. Under the induction of the other promoters indicated, pMSG, pAV009 / A. sup. +, PMTO10 / A. sup. +, PMAMneo-5, baculovirus pDSVE, pcDNA3.1, pIRES and any other vector that allows expression of the protein. Some expression systems have markers that provide gene amplification such as thymidine kinase, hygromycin B phosphotransferase, and dihydrofolate reductase. Alternatively, high yield expression systems that do not involve gene amplification are also suitable.
発現ベクター内に典型的に含められる因子は、大腸菌内で機能するレプリコン、組換えプラスミドを内在させる細菌の選択を可能にする薬剤耐性をコードする遺伝子、およびプラスミドの非必須領域内の、真核生物の配列の挿入を可能にする固有の制限部位も含む。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重要でなく、当該技術分野で既知の多数の薬剤耐性遺伝子のいずれかが適切である。原核生物の配列は、場合により、それらが必要に応じて真核細胞内でのＤＮＡの複製に干渉することのないように選択される。 Factors typically included in expression vectors include replicons that function in E. coli, genes encoding drug resistance that allow selection of bacteria harboring the recombinant plasmid, and eukaryotics within non-essential regions of the plasmid. It also contains unique restriction sites that allow the insertion of the organism's sequences. The particular drug resistance gene selected is not critical and any of a number of drug resistance genes known in the art are appropriate. Prokaryotic sequences are optionally selected such that they do not interfere with DNA replication in eukaryotic cells as required.
標準の形質移入方法を用いると、大量の受容体を発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫細胞系の作製が可能であり、それは次いで標準技術を用いて精製される。 Using standard transfection methods, it is possible to produce bacterial, mammalian, yeast or insect cell lines that express large quantities of the receptor, which is then purified using standard techniques.
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の方法のいずれかの使用が可能である。これらは、リン酸カルシウムの形質移入、ポリブレン、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む。用いられる特定の遺伝子工学的方法により少なくとも１つの遺伝子が本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドを発現可能な宿主細胞に十分に導入可能であることだけが必要である。 Any of the well-known methods for introducing foreign nucleotide sequences into host cells can be used. These include transfection of calcium phosphate, polybrene, protoplast fusion, electroporation, liposomes, microinjection, plasma vectors, viral vectors, and cloned genomic DNA, cDNA, synthetic DNA or other foreign genetic material into host cells. Including the use of any of the other well-known methods for introducing. It is only necessary that at least one gene be sufficiently transducible into a host cell capable of expressing the silicon adhesion polypeptide according to the invention, depending on the particular genetic engineering method used.
形質移入細胞は、発現ベクターが細胞内に導入された後、シリコン接着ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養可能であり、それは標準の技術を用いて培養物から回収される。例えば、細胞は機械的にまたは沈殿およびクロマトグラフィーステップを施す前の浸透圧衝撃により開烈される可能性があり、その性質および配列は回収されるべき特定の組換え材料に依存することになる。あるいは、組換えペプチドは組換え細胞が培養された培地から回収されうる。 Transfected cells can be cultured under conditions that promote expression of the silicon adhesion polypeptide after the expression vector has been introduced into the cell, which is recovered from the culture using standard techniques. For example, cells can be opened up mechanically or by osmotic shock prior to being subjected to precipitation and chromatography steps, the nature and sequence of which will depend on the particular recombinant material to be recovered. . Alternatively, the recombinant peptide can be recovered from the medium in which the recombinant cells are cultured.
本発明は、その別の態様では、本発明に記載の核酸またはベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の目的のために用いられうる宿主細胞は、限定はされないが、例えば本発明のポリヌクレオチド分子を有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されうる細菌（例えば、大腸菌およびバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの原核細胞、例えば本発明の核酸分子を有する組換え酵母発現ベクターで形質転換されうる単純な真核細胞様酵母（例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ））、例えば本発明の核酸分子を有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染されうる、例えばＨｉ５細胞のＳｆ９のような昆虫細胞系、例えばプラスミドで感染されうるゼノパス卵母細胞、例えば組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染されうるかまたはシリコン接着ポリペプチドの核酸配列を有する組換えプラスミド発現ベクターで形質転換されうる植物細胞系、あるいは例えば哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）か哺乳類ウイルスに由来するもの（例えばアデノウイルス後期プロモーターおよび種痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）かまたは細菌細胞に由来するもの（例えばｔｅｔ−ｏｎおよびｔｅｔ−ｏｆｆ系にて用いられるそれに結合するｔｅｔ−リプレッサー）を有する組換え発現コンストラクトで形質転換されうる哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｗｉ３８、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞）を含む。哺乳類から直接取得され、かつプラスミドベクターが形質移入されるかまたはウイルスベクターで感染される一次または二次細胞も宿主細胞として有用である。本発明の核酸を導入するのに用いられる宿主細胞および各ベクターに応じ、核酸は例えば染色体またはミトコンドリアＤＮＡ内に組み入れ可能であるか、例えばエピソームのような染色体外に維持可能であるか、あるいは細胞内にほんの一時的に含まれうる。 The invention, in another aspect thereof, relates to a host cell comprising a nucleic acid or vector or expression vector according to the invention. Host cells that can be used for the purposes of the present invention include, but are not limited to, bacteria that can be transformed with, for example, a recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA expression vector having a polynucleotide molecule of the present invention (eg, , Prokaryotic cells such as E. coli and B. subtilis, eg, simple eukaryotic cell-like yeasts (eg, Saccharomyces) that can be transformed with a recombinant yeast expression vector having a nucleic acid molecule of the invention and Pichia), eg, Xenopus oocytes that can be infected with an insect cell line, eg, Sf9 of Hi5 cells, eg, a plasmid, that can be infected with a recombinant viral expression vector (eg, baculovirus) having a nucleic acid molecule of the invention. Cells, for example A plant cell line that can be infected with a recombinant viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus (CaMV) or tobacco mosaic virus (TMV)) or transformed with a recombinant plasmid expression vector having a nucleic acid sequence of a silicon adhesion polypeptide, or For example, a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter), a mammalian virus (eg, an adenovirus late promoter and a variola virus 7.5K promoter) or a bacterial cell (eg, tet-on and tet Mammalian cell lines (eg COS, CHO, BHK, HEK29) that can be transformed with a recombinant expression construct having a tet-repressor that binds to it used in the -off system. Include VERO, HeLa, MDCK, WI38, and NIH3T3 cells). Primary or secondary cells obtained directly from mammals and transfected with plasmid vectors or infected with viral vectors are also useful as host cells. Depending on the host cell and each vector used to introduce the nucleic acid of the invention, the nucleic acid can be incorporated into, for example, chromosomal or mitochondrial DNA, or can be maintained extrachromosomally, such as episomes, or cells. Can be included only temporarily.
本発明は、その別の態様では、本発明に記載のポリペプチドおよび／またはタンパク質を免疫学的に認識する抗体を提供する。「抗体」という用語は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体とそれらの結合断片、特にＦｃ断片に加え、いわゆる「一本鎖抗体」（バード Ｒ．Ｅ．（Ｂｉｒｄ Ｒ．Ｅ．）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−６頁）、キメラ抗体、ヒト化抗体、特にＣＤＲ移植抗体、ならびに二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）または四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）（ホリンガー Ｐ．（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．）ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−８頁）を含む。また、例えば本発明のペプチドに特異的に結合するファージディスプレイを含む技術により選択される免疫グロブリン様タンパク質が含まれる。好ましい抗体は、ペプチドのその各受容体に対する結合を担う部分に結合する。 In another aspect thereof, the present invention provides an antibody that immunologically recognizes the polypeptides and / or proteins described in the present invention. The term “antibody” refers to monoclonal and polyclonal antibodies and their binding fragments, in particular Fc fragments, as well as so-called “single chain antibodies” (Bird RE, et al. (1988) Science 242. : 423-6), chimeric antibodies, humanized antibodies, particularly CDR-grafted antibodies, and bispecific or tetraspecific antibodies (Hollinger P. et al. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8). Also included are immunoglobulin-like proteins selected, for example, by techniques including phage display that specifically bind to the peptides of the invention. Preferred antibodies bind to the moiety responsible for binding of the peptide to its respective receptor.
本発明は、別の好ましい実施形態では、配列番号ｌ、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能変異体を免疫学的に認識する抗体に関する。 In another preferred embodiment, the present invention immunologically converts a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, or a functional variant thereof. Recognizing antibodies.
本発明は、その別の態様では、医療用途における本発明に記載のポリペプチド、核酸またはベクター、あるいは発現ベクターに関する。 The invention, in another aspect thereof, relates to a polypeptide, nucleic acid or vector or expression vector according to the invention in medical use.
本発明は、その別の態様では、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、あるいは本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、あるいは本発明に記載の抗体、ならびに医薬的に許容できる担体および／または他の適切な医薬助剤の有効用量を含有する医薬組成物に関する。 In another aspect thereof, the present invention provides a polypeptide according to the present invention, a nucleic acid or vector according to the present invention, an expression vector according to the present invention, a host cell according to the present invention, or a cell according to the present invention. It relates to a pharmaceutical composition comprising an effective dose of the antibody and a pharmaceutically acceptable carrier and / or other suitable pharmaceutical auxiliaries.
例えば本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクターあるいは本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞あるいは本発明に記載の抗体（以下では単に「活性成分」と称される）のうちの少なくとも１つの内容物を有する薬剤の形態での医薬組成物の作製、ならびに本発明に記載のそれらの使用が標準の医薬技術および方法に従って行われる。このため、活性成分は、医薬的に許容できる担体および／または他の適切な医薬助剤とともに異なる徴候および投与の場所にとって適する医学的形態に作製される。 For example, the polypeptide according to the present invention, the nucleic acid or vector according to the present invention or the expression vector according to the present invention, the host cell according to the present invention or the antibody according to the present invention (hereinafter simply referred to as “active ingredient”). The preparation of pharmaceutical compositions in the form of a medicament having the content of at least one of the above and their use according to the present invention is performed according to standard pharmaceutical techniques and methods. Thus, the active ingredient is made up in a medical form suitable for different indications and places of administration with a pharmaceutically acceptable carrier and / or other suitable pharmaceutical auxiliaries.
したがって、医薬組成物は、望ましい放出速度、例えば迅速な発症および／または遅延または持続効果が得られるといった様式で作製されうる。したがって、医薬組成物は、軟膏、ゲル、パッチ、エマルジョン、ローション、フォーム、クリームまたは混合相もしくは両親媒性のエマルジョン系（油／水−水／油−混合相）、リポソーム、トランスフェルソーム、ペーストまたは粉末であってもよい。 Thus, the pharmaceutical composition can be made in a manner that provides the desired release rate, eg, rapid onset and / or delayed or sustained effects. Accordingly, the pharmaceutical composition can be an ointment, gel, patch, emulsion, lotion, foam, cream or mixed phase or amphiphilic emulsion system (oil / water-water / oil-mixed phase), liposome, transfersome, paste Or it may be powder.
本発明によると、「助剤」という用語は、それが活性成分または患者と有害に反応しかつ／または相互作用することのない限り、任意の非毒性の固体または液体充填材、希釈材またはパッケージ材を意味することとする。例えば、液体の生薬助剤は、滅菌水、生理食塩水、砂糖水、エタノールおよび／またはオイルである。例えば、タブレットおよびカプセルを生成するための生薬助剤は、結合剤および充填材を含有しうる。 According to the present invention, the term “auxiliary” means any non-toxic solid or liquid filler, diluent or package as long as it does not adversely react and / or interact with the active ingredient or patient. It shall mean the material. For example, liquid herbal aids are sterile water, saline, sugar water, ethanol and / or oil. For example, herbal aids for making tablets and capsules can contain binders and fillers.
さらに、本発明に記載の活性成分を全身性で用いられる薬剤の形態で用いてもよい。これらは注射可能物質および注入物質に属する非経口剤を含む。注射可能物質は、アンプルの形態でまたはいわゆる既成の注射可能物質、例えば既成の注射器または使い捨て注射器として存在し、さらに穴が密封されたボトルで提供される。注射可能物質の投与を、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態で行ってもよい。特に注射にとって適する形態を、結晶懸濁液、溶液、ナノ粒子またはコロイド分散系、例えばハイドロソルなどとして作製してもよい。 Further, the active ingredient described in the present invention may be used in the form of a drug used systemically. These include parenterals belonging to injectable and infused substances. The injectable material exists in the form of an ampoule or as a so-called ready-made injectable material, for example a ready-made syringe or a disposable syringe, and is provided in a bottle with a sealed hole. Administration of the injectable substance may be in the form of subcutaneous (sc), intramuscular (im), intravenous (iv) or intradermal (ic) application. Forms particularly suitable for injection may be made as crystal suspensions, solutions, nanoparticles or colloidal dispersions such as hydrosols.
さらに注射可能な組成物を、等張性の水性希釈剤で溶解または分散される濃縮物として作製してもよい。注入物を、等張溶液、脂肪エマルジョン、リポソーム組成物、マイクロエマルジョンの形式で調製してもよい。注射可能物質のように、注入組成物についても希釈のための濃縮物の形式で調製してもよい。注射可能な組成物はまた、静止治療ならびに移動治療のいずれにしても、連続注入の形式、例えばミニポンプの形式で適用してもよい。 Additionally, injectable compositions may be made up as a concentrate that is dissolved or dispersed in an isotonic aqueous diluent. Injectables may be prepared in the form of isotonic solutions, fat emulsions, liposome compositions, microemulsions. Like injectables, infusion compositions may also be prepared in the form of concentrates for dilution. Injectable compositions may also be applied in the form of continuous infusion, for example in the form of a minipump, for both stationary and mobile treatments.
本発明に記載の活性成分は、ミクロ担体またはナノ粒子、例えばポリ（メタ）アクリレート、ポリ乳酸塩、ポリグリコール酸塩、ポリアミノ酸またはポリエーテルウレタンをベースとする細かい分散粒子に結合可能である。非経口組成物はまた、例えば「多重単位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｎｉｔ）の原則」に基づいて本発明に記載の活性成分が細かく分割または分散された懸濁形態内にまたは結晶懸濁液として組み込まれる場合、あるいは「単一単位（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ）の原則」に基づいて本発明に記載の活性成分が医薬形態、例えば結果的に注入されるタブレットまたはスティックに封入される場合、デポー製剤に修飾されうる。「単一単位」および「多重単位」の薬剤の場合でのこれらの注入物またはデポー剤は、いわゆる生体分解性ポリマー、例えば乳酸およびグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレートまたは多糖類などよりなることが多い。 The active ingredients according to the invention can be bound to finely dispersed particles based on microcarriers or nanoparticles, such as poly (meth) acrylates, polylactates, polyglycolates, polyamino acids or polyether urethanes. Parenteral compositions can also be incorporated when the active ingredients according to the invention are incorporated into finely divided or dispersed suspension forms or as crystalline suspensions, for example based on the principle of “multiple units”. Alternatively, if the active ingredient according to the present invention is encapsulated in a pharmaceutical form, for example a tablet or stick to be injected as a result, on the basis of the “single unit principle”, it can be modified into a depot preparation. These injections or depots in the case of "single unit" and "multi-unit" drugs are so-called biodegradable polymers such as polyesters of lactic and glycolic acids, polyether urethanes, polyamino acids, poly (meth) Often consists of acrylates or polysaccharides.
非経口剤を作製するための適切な助剤として、アクア・ステリリサータ（ａｑｕａ ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔａ）、ｐＨの値に影響を与える物質、例えば有機および無機の酸と塩基およびそれらの塩など、ｐＨの値を調節するための緩衝物質、等張化剤、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコースおよびフルクトースなど、界面活性剤または界面活性物質およびエマルゲーター（ｅｍｕｌｇａｔｏｒ）、例えばポリオキシエチレンソルビタン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）の部分脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））または例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））など、脂肪油、例えばピーナッツ油、大豆油、およびヒマシ油など、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、イソプロピルミリステートおよび中性油（Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））など、高分子助剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン、溶解度促進添加剤、有機溶媒、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなど、あるいは複合体形成物質、例えばクエン酸塩および尿素など、防腐剤、例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステルおよび安息香酸メチルエステル、ベンジルアルコールなど、抗酸化剤、例えば亜硫酸ナトリウムなど、ならびに安定化剤、例えばＥＤＴＡなどが検討されうる。 Suitable auxiliaries for making parenterals, adjusting the pH value of aqua sterilisata, substances that affect the pH value, such as organic and inorganic acids and bases and their salts Buffer substances, tonicity agents such as sodium chloride, sodium bicarbonate, glucose and fructose, surfactants or surfactants and emulsators such as partial fatty acids of polyoxyethylene sorbitan Synthetic fatty acid esters such as esters (Tween®) or fatty acids such as polyoxyethylene (Cremophor®), fatty oils such as peanut oil, soybean oil, and castor oil Polymeric auxiliaries such as ethyl oleate, isopropyl myristate and neutral oil (Miglyol®) such as gelatin, dextran, polyvinylpyrrolidone, solubility enhancing additives, organic solvents such as propylene glycol, ethanol, N , N-dimethylacetamide, propylene glycol and the like, or complexing substances such as citrate and urea, preservatives such as benzoic acid hydroxypropyl ester and benzoic acid methyl ester, benzyl alcohol and other antioxidants such as sodium sulfite As well as stabilizers such as EDTA may be considered.
懸濁液中に本発明に記載の活性成分の硬化を回避するために増粘剤を添加するかまたは堆積物の混合を保証するためにテンシデを添加するかまたは例えばＥＤＴＡなどの複合体形成剤を添加することが可能である。活性成分複合体が、例えばポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）またはポリエチレングリコールソルビット（ｇｌｙｃｏｌｓｏｒｂｉｔｅ）脂肪酸エステルなどの異なるポリマーを用いて取得されうる。凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅｓ）を生成するため、足場形成剤（ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えばマンニット、デキストラン、スクロース、ヒトアルブミン、乳糖、ＰＶＰまたはゼラチンなどが用いられる。 Add thickeners to avoid hardening of the active ingredient according to the invention in suspension or add tensides to ensure mixing of the deposits or complex formers such as eg EDTA Can be added. The active ingredient complex can be obtained using different polymers such as, for example, polyethylene glycol, polystyrene, carboxymethylcellulose, Pluronics® or polyethylene glycol sorbitol fatty acid esters. Scaffold forming agents such as mannitol, dextran, sucrose, human albumin, lactose, PVP or gelatin are used to produce lyophilisates.
各々に適切な医療形態は、医薬的／物理的技術に基づいて当業者に既知のマニュアルおよび手順に従って作製されうる。 Suitable medical forms for each can be made according to manuals and procedures known to those skilled in the art based on pharmaceutical / physical techniques.
次いで本発明のさらなる態様は、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクターまたは本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞あるいは本発明に記載の抗体、および医薬的に許容できる担体のうちの少なくとも１つの有効用量を含有する、個別に作製される医薬組成物に関する。この医薬組成物は、活性成分が上記の適切な医薬的に許容できる希釈剤または担体物質とともに持続性物質の形態でまたは前駆体として存在すると特徴づけられうる。 A further aspect of the invention then comprises a polypeptide according to the invention, a nucleic acid or vector according to the invention or an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention or an antibody according to the invention, and a medicament. Relates to individually prepared pharmaceutical compositions containing an effective dose of at least one of the pharmaceutically acceptable carriers. This pharmaceutical composition may be characterized in that the active ingredient is present in the form of a long-acting substance or as a precursor together with a suitable pharmaceutically acceptable diluent or carrier substance as described above.
本発明によると、上記の医薬組成物は、経口、直腸または非経口での使用を意図したタブレット、ドラジェ（ｄｒａｇｅｅｓ）、カプセル、液滴、坐剤、注射または注入のための組成物の形態で存在しうる。かかる投与形態およびそれらの作製は当業者に既知である。 According to the present invention, the above pharmaceutical composition is in the form of a tablet, dragees, capsule, droplet, suppository, composition for injection or infusion intended for oral, rectal or parenteral use. Can exist. Such dosage forms and their production are known to those skilled in the art.
本発明は、その別の態様では、哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応、好ましくはヒトのシリコンに対する応答反応を検出するための、本発明に記載のポリペプチド、本発明に記載の核酸またはベクター、または本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、あるいは本発明に記載の抗体の使用に関する。 In another aspect thereof, the present invention provides a polypeptide according to the present invention, a nucleic acid according to the present invention for detecting a response to mammalian silicon, particularly medical silicon, preferably to human silicon. Or the use of a vector, or an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention, or an antibody according to the invention.
本発明は、その別の態様では、哺乳類におけるシリコンに対する下記の応答反応を検出するためのポリペプチドの使用に関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
The present invention, in another aspect thereof, relates to the use of a polypeptide for detecting the following response response to silicon in a mammal, wherein said polypeptide is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, selected from the group consisting of spinal cord-related
異なる哺乳類におけるシリコンに接着するポリペプチドの接着特性が考えられる応答反応の指標であることから、診断方法が、応答反応およびそれに関連した合併症または有害反応を受けやすいポリペプチドを同定することにより確立されうる。したがって、いくつかの候補、例えばシリコン接着ポリペプチドまたはシリコン接着ポリペプチドをコードする核酸、これらのポリペプチドおよび／または核酸を検出するための試験系の選択については、例えばかかるポリペプチドを例えば血清由来のシリコンの表面に接着させることによるかまたは例えばｒｔ−ＰＣＲなどの増幅方法を通じて築かれうる。 A diagnostic method is established by identifying polypeptides that are susceptible to response reactions and associated complications or adverse reactions because the adhesive properties of polypeptides that adhere to silicon in different mammals are indicators of possible response responses Can be done. Thus, for selection of several candidates, for example, silicon adhesion polypeptides or nucleic acids encoding silicon adhesion polypeptides, test systems for detecting these polypeptides and / or nucleic acids, such polypeptides are derived, for example, from serum It can be constructed by adhering to the surface of silicon or through an amplification method such as rt-PCR.
したがって、本発明に記載のポリペプチドは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングのような免疫学的方法を含む当該技術分野で既知の方法を用いて検出可能である。好ましくは、一実施形態では、かかる試験系は、当業者に周知の方法であるＥＬＩＳＡ系に基づくものである。シリコン接着ポリペプチドを測定するために作製されたＥＬＩＳＡ系は実行しやすく、室温で長時間安定である。これらの試験を例えば診療所での「ポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）」試験として用いるため、これであればエンドユーザに発送しやすいことになる。好ましくは、かかる試験系では血清が用いられる。さらに、ＥＬＩＳＡ系は多数の実験室における標準的な方法である。この組み合わせをとることで、現行の臨床ルーチンへの各々の統合が可能となる。 Accordingly, the polypeptides described in the present invention can be detected using methods known in the art including immunological methods such as ELISA or Western blotting. Preferably, in one embodiment, such a test system is based on an ELISA system, a method well known to those skilled in the art. An ELISA system made to measure silicon adhesion polypeptides is easy to perform and is stable for a long time at room temperature. Since these tests are used as “point-of-care” tests at clinics, for example, this makes it easier to ship to end users. Preferably, serum is used in such a test system. Furthermore, the ELISA system is a standard method in many laboratories. This combination allows each integration into the current clinical routine.
本発明は、その別の態様では、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を含有すると思われる、診断対象の哺乳類に由来する試料を提供するステップと、ｂ）前記試料中で前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、ｃ）前記哺乳類の前記シリコンに対する応答反応については少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化から判定するステップと、を含む、方法を提供する。 The invention, in another aspect thereof, is a diagnostic method for detecting a response response to mammalian silicon, comprising: a) a diagnostic that appears to contain at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof Providing a sample derived from a mammal of interest; b) detecting a change in the presence or expression of said at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof in said sample; c) of said mammal Determining a response to the silicon from a change in the presence or expression of at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof.
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、本発明に記載のポリペプチド、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、およびＰＲＯ２６１９からなる群または本発明に記載のシリコン表面に接着するポリペプチドを同定するための方法によって同定されたポリペプチドあるいはそれらの機能変異体から選択される。
In another preferred embodiment of the diagnostic method for detecting a response response to silicon according to the present invention in mammals, the silicon adhesion polypeptide is a polypeptide according to the present invention, spinal cord related
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、ＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体Ｃ１ｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント（Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ）因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａ１、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンからなる群から選択される少なくとも１種の追加のシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドあるいはそれらの機能変異体とともに検出される。
In another preferred embodiment in the diagnostic method for detecting a response response to silicon according to the present invention of a mammal, the silicon adhesion polypeptide is an isotype control, IgG-HRP, IgE-HRP, IGA-HRP, AMBP protein. Precursor, plasma-retinol binding protein, kininogen, eosinophil peroxidase,
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドの免疫グロブリンＧ、Ｃ反応性タンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、補体Ｃ３前駆体、および脊髄関連タンパク質１４またはそれらの機能変異体の存在または発現における変化が検出される。好ましくは、シリコン接着ポリペプチドの免疫グロブリンＧ、Ｃ反応性タンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、補体Ｃ３前駆体、および脊髄関連タンパク質１４またはそれらの機能変異体の存在または発現における変化が検出される。シリコン接着ポリペプチドの免疫グロブリンＧ、Ｃ反応性タンパク質、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、補体Ｃ３前駆体、および脊髄関連タンパク質１４の存在または発現における変化の検出における組み合わせにより、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための感度、特異性、正および負の予測値が増加する。 In a preferred embodiment of the method of diagnosis for detecting a response response to mammalian silicon according to the present invention, the immunoglobulin G, C-reactive protein, fibronectin, collagen I, procollagen III, complement of the silicon adhesion polypeptide Changes in the presence or expression of C3 precursor and spinal cord related protein 14 or functional variants thereof are detected. Preferably, there is a change in the presence or expression of the silicon adhesion polypeptide immunoglobulin G, C-reactive protein, fibronectin, collagen I, procollagen III, complement C3 precursor, and spinal cord related protein 14 or functional variants thereof. Detected. Silicone adhesion polypeptides against mammalian silicon by combining in detection of changes in the presence or expression of immunoglobulin G, C-reactive protein, fibronectin, collagen I, procollagen III, complement C3 precursor, and spinal cord related protein 14 Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values for detecting response reactions are increased.
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法におけるさらなる好ましい実施形態では、前記哺乳類由来の試料は血清および／または創傷液である。 In a further preferred embodiment of the diagnostic method for detecting a response response of a mammal according to the invention to silicon according to the invention, the sample from the mammal is serum and / or wound fluid.
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、試料は医療器具の長期注入およびコーティングに適するシリコンの注入の前または後に回収される。 In another preferred embodiment of the diagnostic method for detecting a response response to silicon according to the present invention of a mammal, the sample is collected before or after long-term injection of medical devices and injection of silicon suitable for coating.
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における好ましい実施形態では、本方法は、対照として第２の試料をさらに含み、ここで前記対照は注入の前または後に同じ哺乳類から取得されるかまたは医療用シリコンを全く注入することのない異なる哺乳類から取得される。 In a preferred embodiment in the method of diagnosis for detecting a response response to mammalian silicon according to the present invention, the method further comprises a second sample as a control, wherein said control is the same before or after injection. Obtained from a mammal or from a different mammal without any medical silicon injection.
シリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を検出することを意図した、哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドまたはその機能変異体を免疫学的に認識するのに適する抗体が用いられる。 In another preferred embodiment in a diagnostic method for detecting a response response to a silicon according to the invention of a mammal intended to detect a silicon adhesion polypeptide or a functional variant thereof, said polypeptide or its function An antibody suitable for immunological recognition of the variant is used.
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法におけるさらなる好ましい実施形態では、ポリペプチドまたはその機能変異体は一次元または二次元ゲル電気泳動および／またはＥＬＩＳＡにより検出される。 In a further preferred embodiment in the method of diagnosis for detecting a response response to mammalian silicon according to the invention, the polypeptide or a functional variant thereof is detected by one-dimensional or two-dimensional gel electrophoresis and / or ELISA. .
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における好ましい実施形態では、本方法は本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する少なくとも１種の核酸の存在または量を検出するステップをさらに含む。 In a preferred embodiment in a method of diagnosis for detecting a response response to a silicon according to the present invention in mammals, the method comprises at least one nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a silicon adhesion polypeptide according to the present invention. The method further includes detecting the presence or amount.
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法における別の好ましい実施形態では、前記核酸はＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはゲル電気泳動により検出される。 In another preferred embodiment of the diagnostic method for detecting a response response to silicon according to the present invention of the mammal, the nucleic acid is detected by PCR, RT-PCR or gel electrophoresis.
哺乳類の本発明に記載のシリコンに対する応答反応を検出するための診断の方法におけるさらなる好ましい実施形態では、前記方法は、ステップａ）およびｂ）の間に前記ポリペプチドの前記シリコンに対する接着を可能にする条件下で前記試料をシリコンと接触させるステップを含むステップａ’）をさらに含む。 In a further preferred embodiment of the diagnostic method for detecting a response response to silicon according to the invention of the mammal, the method allows the adhesion of the polypeptide to the silicon during steps a) and b). Step a ′) comprising the step of contacting said sample with silicon under conditions to
本発明は、その別の態様では、原料、緩衝液、助剤、および本発明に記載の方法を実施するための物質を含む、哺乳類のシリコンに対する応答反応を検出するための診断キットに関する。 The present invention, in another aspect thereof, relates to a diagnostic kit for detecting a response response to mammalian silicon comprising a raw material, a buffer, an auxiliary agent, and a substance for carrying out the method according to the present invention.
本明細書で用いられる「診断キット」という用語は、本発明のポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、または抗体を含むかあるいは本発明の方法によって同定されるかまたは特徴づけられる試薬キットを意味するものとする。好ましくは、試薬キットは、科学的アッセイまたは診断アッセイまたはそれに類するものの実施に必要とされる反応緩衝液、保存溶液および／または残存試薬または原料をさらに含む。さらに、本発明のキットの各部分を、バイアル内またはボトル内で別々にあるいはコンテナ内またはマルチコンテナユニット内で組み合わせて詰め込んでもよい。 As used herein, the term “diagnostic kit” refers to a reagent kit comprising a polypeptide, nucleic acid molecule, vector, host cell, or antibody of the invention or identified or characterized by the methods of the invention. Shall mean. Preferably, the reagent kit further comprises reaction buffers, storage solutions and / or residual reagents or raw materials that are required for the performance of scientific or diagnostic assays or the like. Furthermore, the parts of the kit of the present invention may be packed separately in vials or bottles, or combined in containers or multi-container units.
本発明は、その別の態様では、哺乳類のシリコン、特に医療用シリコンに対する応答反応をモニターするための方法であって、ａ）少なくとも１種のシリコンを前記哺乳類に注入するステップと、ｂ）本発明に記載のシリコン接着ポリペプチドの存在または発現における変化を本発明に記載の方法またはキットを用いて検出するステップと、場合によりステップｂ）を反復するステップと、を含む、方法に関する。 The present invention, in another aspect thereof, is a method for monitoring response responses to mammalian silicon, particularly medical silicon, comprising the steps of a) injecting at least one silicon into said mammal; Detecting a change in the presence or expression of a silicon adhesion polypeptide according to the invention using a method or kit according to the present invention and optionally repeating step b).
本発明は、さらに別の態様では、少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドに干渉する物質をスクリーニングするための方法であって、ａ）シリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉すると思われる物質を提供するステップと、ｂ）シリコン、特に医療用シリコンを提供するステップと、ｃ）シリコン接着ポリペプチドを提供するステップと、ｄ）前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着の分析を通じて前記物質の干渉特性を分析するステップと、を含む、方法に関し、ここで前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着における変化が、シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質を示唆している。 The present invention, in yet another aspect, provides a method for screening a substance that interferes with at least one silicon adhesion polypeptide, comprising: a) a substance that appears to interfere with the adhesive properties of the silicon adhesion polypeptide. B) providing silicon, in particular medical silicon, c) providing a silicon adhesion polypeptide, d) the silicon adhesion polypeptide in the presence or absence of the substance to the silicon Analyzing the interference properties of the substance through an analysis of adhesion, wherein a change in the adhesion of the silicon adhesion polypeptide to the silicon in the presence or absence of the substance is a silicon adhesion protein And / or anything that interferes with the binding of polypeptides to silicon It suggests.
本発明に記載の少なくとも１種のシリコン接着タンパク質ポリペプチドに干渉する活性物質をスクリーニングするための方法の一実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、本発明に記載のポリペプチド、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、ＰＲＯ２６１９、本発明によって同定されるポリペプチド、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、ＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体Ｃ１ｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａ１、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンからなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
In one embodiment of the method for screening for an active substance that interferes with at least one silicon adhesion protein polypeptide according to the present invention, the silicon adhesion polypeptide comprises a polypeptide according to the present invention, spinal cord related
本発明は、その別の態様では、細胞のシリコンに対する接着を検出するための方法であって、ａ）細胞を含有する哺乳類の血清または創傷液の試料を提供するステップと、ｂ）シリコンを提供するステップと、ｃ）前記シリコンに接着する前記血清または創傷液に由来する細胞の量または数を分析するステップと、を含む、方法を提供する。 The invention, in another aspect thereof, is a method for detecting adhesion of cells to silicon comprising the steps of: a) providing a sample of mammalian serum or wound fluid containing the cells; b) providing the silicon And c) analyzing the amount or number of cells derived from the serum or wound fluid that adheres to the silicon.
細胞の本発明に記載のシリコンに対する接着を検出するための方法の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。 In a preferred embodiment of the method for detecting adhesion of cells to silicon according to the present invention, the mammal is a human.
細胞の本発明に記載のシリコンに対する接着を検出するための前記方法の好ましい実施形態では、シリコンは当業者に既知の任意の医療用シリコンでありうる。好ましくは、シリコンはヌシル（Ｎｕｓｉｌ）社（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ））によって提供される医療用シリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、およびＭＥＤ３６０からなる群から選択される。 In a preferred embodiment of said method for detecting adhesion of cells to the silicon according to the invention, the silicon can be any medical silicon known to those skilled in the art. Preferably, the silicon is selected from the group consisting of medical silicon types MED1511, MED4860, MED4211, and MED360 provided by Nusil (Waldbron, Germany).
本発明は、その別の態様では、シリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドの本発明に記載の方法により同定されるシリコンに対する結合に干渉する物質に関する。 The invention, in another aspect thereof, relates to substances that interfere with the binding of silicon adhesion proteins and / or polypeptides to silicon identified by the method according to the invention.
本発明は、そのさらなる態様では、本発明に記載の方法を含む、医薬組成物を生成するための方法、および前記物質を医薬組成物中に調合するための方法を提供する。 The invention, in a further aspect thereof, provides a method for producing a pharmaceutical composition comprising the method according to the invention and a method for formulating said substance into a pharmaceutical composition.
本発明は、そのさらなる態様では、本発明に記載されるかまたは本発明によって生成される物質を含有する医薬組成物に関する。 The invention, in a further aspect thereof, relates to a pharmaceutical composition comprising a substance described in the invention or produced by the invention.
本発明は、その別の態様では、注入シリコンに対する有害反応を被る哺乳類を治療する方法であって、本発明に記載の方法を通じて同定されたシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップを含む、方法を提供する。好ましくは、シリコン接着ポリペプチドに干渉する前記有効量の物質は、当業者に周知の医薬組成物の形態で投与される。 The present invention, in another aspect thereof, is a method of treating a mammal suffering an adverse reaction to injected silicon, wherein the effective amount of the substance interferes with the adhesive properties of the silicon adhesive polypeptide identified through the method of the present invention. Is provided to the mammal. Preferably, the effective amount of substance that interferes with the silicon adhesion polypeptide is administered in the form of pharmaceutical compositions well known to those skilled in the art.
本発明に記載の注入シリコンに対する応答反応を被る哺乳類を治療する方法の好ましい実施形態では、有害反応は珪肺症および／またはシリコンに関連した線維症である。 In a preferred embodiment of the method of treating a mammal subject to a response response to injected silicon according to the present invention, the adverse reaction is silicosis and / or fibrosis associated with silicon.
本発明は、その別の態様では、シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法であって、ａ）本発明によって同定されたシリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉する有効量の物質を前記哺乳類に投与するステップと、ｂ）前記哺乳類から試料を取得するステップと、ｃ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、を含む、方法に関する。 The invention, in another aspect thereof, is a method for monitoring the treatment of a mammal undergoing a responsive response to silicon, comprising a) an effective amount of interfering with the adhesive properties of a silicon adhesion polypeptide identified by the invention. Administering a substance to the mammal; b) obtaining a sample from the mammal; and c) detecting a change in the presence or expression of at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof. Including methods.
本発明に記載の注入シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法における好ましい実施形態では、試料は哺乳類、好ましくはヒトの血清または創傷液である。 In a preferred embodiment in the method for monitoring the treatment of a mammal undergoing a response response to injected silicon according to the present invention, the sample is mammalian, preferably human serum or wound fluid.
本発明に記載の注入シリコンに対する応答反応を被る哺乳類の治療をモニターするための方法における好ましい実施形態では、シリコン接着ポリペプチドは、本発明に記載のポリペプチド、脊髄関連タンパク質８、脊髄関連タンパク質１４、ＨＴ０１８、ＰＲＯ２６１９、本発明によって同定されるポリペプチド、アイソタイプ対照、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ＩｇＥ−ＨＲＰ、およびＩＧＡ−ＨＲＰ、ＡＭＢＰタンパク質前駆体、血漿−レチノール結合タンパク質、キニノゲン、好酸球ペルオキシダーゼ、線維芽細胞成長因子１１、ＴＧＦ−β、インテグリン−β４、Ｔ細胞受容体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、凝固因子Ｖ、α−スペクトリン、単球化学走性タンパク質−２、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、補体Ｃ３、補体Ｃ２、補体Ｃ１ｓ、Ｃ反応性タンパク質、α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体、フォンヴィルブラント因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩ、ラミニン、マトリックスメタロプロテアーゼ２、アポリポタンパク質４、アポリポタンパク質Ａ１、セルロプラスミン、Ｔｈｙｒｅｏｔｙｒｅｉｎ、アルブミン、α２−マクログロブリン前駆体、ハプトグロビン１、αおよびβグロビン鎖、アクチン、ＨＳＰ６０、アポリポタンパク質Ｅ３、補体Ｃ２前駆体、補体Ｃ３前駆体、ヘモグロビン、トランスサイレチンからなる群またはそれらの機能変異体から選択される。
In a preferred embodiment in the method for monitoring the treatment of a mammal undergoing a response response to injected silicon according to the present invention, the silicon adhesion polypeptide is a polypeptide according to the present invention, spinal cord related
ここで本発明は、添付の図面と関連して以下の実施例にてそれらに限定されることなくさらに記載されるものとする。本発明の目的として、本明細書中で言及されるすべての参考文献はそれら全体が参照により援用される。 The invention will now be further described in the following examples, without being limited thereto, in conjunction with the accompanying drawings. For the purposes of the present invention, all references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety.
実施例１：様々なシリコンタイプに対するタンパク質の接着をインビボでスクリーニングするためのインビトロ系の作成
タンパク質の調製および分析の原理を図３に示す。
Example 1: Creation of an in vitro system for in vivo screening of protein adhesion to various silicon types The principle of protein preparation and analysis is shown in FIG.
１．生体外で溶出されるタンパク質
発明者は、美容を理由とする豊胸後に合併症を患う女性から外植されたＳＭＩｓ上に堆積したタンパク質を分析している。１３の外植されたＳＭＩｓを、オーストリア、インスブルック（Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ）のインスブルック医科大学（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ）（ＭＵＩ）、クリニック・フォー・プラスチック・アンド・リコンストラクティブ・サージェリー（Ｃｌｉｎｉｃ ｆｏｒ Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ）から入手した。９つのＳＭＩにゲルおよび４つに生理食塩水を充填した。表面は、１１のＳＭＩは起伏があり、２つは滑らかであった。分析においては無傷の注入物すなわちシリコンの「ゲル流出」を伴わないものについてのみ検討した。それらを手術直後に無菌条件下で取得した。線維性被膜を手術室で除去し、ＳＭＩをプロテアーゼ阻害剤を補充したリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中の実験対象に移した。外植されたＳＭＩをＰＢＳ（３×ｌ５分）および蒸留水（５×１０分）、４℃で洗浄した。洗浄後、タンパク質のいずれかを、２Ｄ電気泳動により分析予定である場合、尿素溶解緩衝液［７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素（双方ともドイツ、バットゾーデン（Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ）のカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手）、３０ｍＭトリス、４％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５］中に溶出させた。ウエスタンブロット分析においては、それらをＳＤＳ緩衝液（２％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ トリスＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ９．０）中に調製した。タンパク質濃度をビシンコニン酸のタンパク質アッセイ（米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））により測定し、タンパク質溶液を分析するまで−２０℃で凍結保存した。
1. Proteins eluted in vitro The inventors have analyzed proteins deposited on SMIs explanted from women suffering from complications after breast augmentation for cosmetic reasons. Thirteen explanted SMIs were collected from Medical University Insbruck (MUI), Clinic for Plastic and Reconstructive Surgery (Insbruck), Clinic for Plastic and Reconstructive Surgery. Obtained from Nine SMIs were filled with gel and four with saline. The surface was undulating with 11 SMIs and 2 smooth. In the analysis, only intact implants, i.e. those without silicon "gel spills" were considered. They were obtained under aseptic conditions immediately after surgery. Fibrous capsules were removed in the operating room and SMI was transferred to experimental subjects in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2) supplemented with protease inhibitors. Explanted SMI was washed at 4 ° C. with PBS (3 × 15 min) and distilled water (5 × 10 min). After washing, if any of the proteins are to be analyzed by 2D electrophoresis, urea lysis buffer [7M urea, 2M thiourea (both obtained from Calbiochem, Bad Soden, Germany), Elution in 30 mM Tris, 4% CHAPS, pH 8.5]. For Western blot analysis, they were prepared in SDS buffer (2% SDS, 100 mM DTT, 50 mM Tris Cl, 10% glycerin, pH 9.0). The protein concentration was measured by the bicinchoninic acid protein assay (Pierce Biotechnology, Rockford, Ill.) And the protein solution was stored frozen at -20 ° C. until analysis.
２．インビトロで溶出されるタンパク質
シリコンタイプＭＥＤ１５１１、ＭＥＤ４８６０、ＭＥＤ４２１１、ＭＥＤ３６０（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ）のヌシル（ＮＵＳＩＬ））が重合において有機溶媒または高温を有しないかまたは必要としないことから、それらを最初に試験した。それらの物理的特徴により、調節され標準化された条件を有する目的で用いる、実験室の研究にて通常用いられるポリスチレン製の平底プレートにそれらが適合した。試験対象のすべてのシリコンタイプが無制限のタイプであり、つまりそれらはシリコンの製造業者（ドイツ、ヴァルトブルン（Ｗａｌｄｂｒｏｏｎ）のヌシル（ＮＵＳＩＬ））により、長期注入物における製造者から認定された。それらはまた。ＳＭＩの製造および医療器具のコーティングにおいて広範に用いられるシリコンタイプを表した。他のシリコンタイプが発明者により将来的に試験されるように企画されており、試験の設計はそれらの化学組成物に基づいて調整されることになる。
2. Proteins eluted in vitro Silicon types MED1511, MED4860, MED4211, MED360 (Waldbron Nusil, Germany) do not have or need organic solvents or high temperatures in the polymerization Tested. Because of their physical characteristics, they fit into polystyrene flat-bottom plates commonly used in laboratory studies that are used for the purpose of having regulated and standardized conditions. All silicon types tested were of the unrestricted type, i.e. they were certified by the manufacturer of silicon (NUSIL, Waldbron, Germany) from manufacturers in long-term implants. They are also. Represented a silicon type widely used in SMI manufacturing and medical device coating. Other silicon types are designed for future testing by the inventor, and the test design will be tailored based on their chemical composition.
６ウェルのポリスチレンプレート（ドイツ、フリッケンハウゼン（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）のグライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））の１ウェルにつき未重合シリコン５ｍｌを添加し、シリコンをプレートの底部上に一様に分布させるため、その直後、プレートをシリコンタイプに応じて様々な時間遠心した（ＭＥＤ１５１１：３００×ｇで１０分；ＭＥＤ４８６０：１０００ｇで６０分；ＭＥＤ４２１１：１５０×ｇで１０分）。シリコンの硬化（３７℃および湿度９８％で３日）後、プレートを２００ミリジュールのＵＶ光（ＧｓＧｅｎｅ ＵＶチャンバー、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））下で１２０秒間滅菌し、管内でタンパク質結合部位の飽和を可能にするため、豊胸手術の２日後に採取した創傷液（ＷＢＦ）とともにインキュベートした。ＷＢＦにプロテアーゼ阻害剤（シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手したペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、最終濃度１μｇ／ｍｌ）を補充し、シリコンコーティングしたプレートとともに４日間インキュベートした。この時間内にシリコンの表面上でタンパク質の堆積が平衡に達する一方、自発的なタンパク質の分解が全く生じなかった。次いで、プレートをＰＢＳ中で洗浄し（１０×ｌ５分）、Ｈ２Ｏを４℃で蒸留し（５×１０分）、上記の生体外でのタンパク質の溶出と同様の方法でタンパク質を溶出した。図３は、インビトロでのタンパク質の吸着および分析におけるモデルを示す。 Immediately afterwards, 5 ml of unpolymerized silicon is added per well of a 6-well polystyrene plate (Greiner, Frickenhausen, Germany) to distribute the silicon evenly on the bottom of the plate. Was centrifuged for various times depending on the silicon type (MED 1511: 10 minutes at 300 × g; MED 4860: 60 minutes at 1000 g; MED 4211: 10 minutes at 150 × g). After curing of the silicon (3 days at 37 ° C. and 98% humidity), the plates were sterilized for 120 seconds under 200 millijoules of UV light (GsGene UV chamber, Biorad, Hercules, Calif.) And placed in a tube. Incubated with wound fluid (WBF) collected 2 days after breast augmentation to allow saturation of protein binding sites. WBF was supplemented with protease inhibitors (pepstatin, leupeptin, aprotinin, final concentration 1 μg / ml obtained from Sigma) and incubated with silicon coated plates for 4 days. Within this time, protein deposition reached equilibrium on the surface of the silicon while no spontaneous protein degradation occurred. The plate was then washed in PBS (10 × 15 min), H 2 O was distilled at 4 ° C. (5 × 10 min), and the protein was eluted in the same manner as the in vitro protein elution described above. . FIG. 3 shows a model for protein adsorption and analysis in vitro.
３．生体外およびインビトロで溶出されたタンパク質の差別的分析
インビトロモデルが生体外の状況に対応するか否かを判定するため、発明者は一次元および二次元ゲル電気泳動により２つの系から溶出したタンパク質を比較した。差別的分析においては、発明者は感度のよい分析ツールを必要とし、それはＤＩＧＥ（商標）（スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｓａｌａ）のアマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））システムを用いる理由である。２つの系から得られるタンパク質を特定の波長で励起可能な異なる蛍光色素で標識した。この実験の設定により、発明者は単一のゲルから３つの別々の画像を取得でき、それによりゲル間のばらつきが大幅に低減され、スポットパターンの統計分析が向上した。タンパク質のスポットパターンを「Ｄｅｃｙｄｅｒ」ソフトウェア（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で分析した。試料間のスポットの容量比がスポット分布全体の２標準偏差を超える場合、タンパク質の堆積量は異なると考えられた。よりストリンジェントには、容量比が５倍の閾値を越える場合、それは生体外系またはインビトロ系のいずれかに限って存在するものとして規定された。このアプローチを用い、発明者はこれまで全部で１８４個のタンパク質スポットを検出した。これらのうちの１６３個のスポットは、両方の系内に同量で存在し、１３個のタンパク質が生体外にてより強力に結合し、５個がインビトロ系で存在し、かつ５個のスポットのみが系のいずれかにおいて特有であった。換言すると、インビボで堆積されたタンパク質の８９％は我々のインビトロ系でも堆積される。発明者は、質量分析を用いてタンパク質の残存する１１％の大部分を同定し、それらが主に細胞内タンパク質を表すことを見出した。これらの実験結果は、インビボで見出されるさらなるタンパク質が外科的処置の結果として周囲の損傷組織から生じることを示唆した。
3. Differential analysis of in vitro and in vitro eluted proteins In order to determine whether an in vitro model corresponds to an in vitro situation, the inventors have analyzed proteins eluted from two systems by one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis Compared. In differential analysis, the inventor needs a sensitive analytical tool, which is why they use the DIGE ™ (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) system. Proteins from the two systems were labeled with different fluorescent dyes that can be excited at specific wavelengths. This experimental setup allowed the inventor to acquire three separate images from a single gel, thereby greatly reducing variability between gels and improving the statistical analysis of spot patterns. Protein spot patterns were analyzed with "Decyder" software (Amersham Biosciences). When the volume ratio of spots between samples exceeded 2 standard deviations of the overall spot distribution, protein deposition was considered different. More stringently, if the volume ratio exceeded the 5-fold threshold, it was defined as existing only in either the in vitro system or the in vitro system. Using this approach, the inventor has so far detected a total of 184 protein spots. Of these, 163 spots are present in equal amounts in both systems, 13 proteins bind more strongly in vitro, 5 are present in the in vitro system, and 5 spots Only was unique in any of the systems. In other words, 89% of the protein deposited in vivo is also deposited in our in vitro system. The inventor has identified the majority of the remaining 11% of the protein using mass spectrometry and found that they mainly represent intracellular proteins. These experimental results suggested that additional proteins found in vivo arise from the surrounding damaged tissue as a result of the surgical procedure.
４．タンパク質の同定
２Ｄ電気泳動
インビトロおよび生体外で溶出したタンパク質を、主として二次元ゲル電気泳動（２Ｄ電気泳動）による分離後に分析した［アンダーソン Ｌ．（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｌ．）およびアンダーソン Ｎ．Ｇ．（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎ．Ｇ．）「Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５４２１−５４２５頁（１９７７年）］。一次元分離においては、タンパク質を尿素溶解緩衝液［７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素（双方ともドイツ、バットゾーデン（Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ）のカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手）、３０ｍＭトリス、４％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５］中に溶解させた。負荷に先立ち、タンパク質全体の２００μｇに再水和緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ ＣＨＡＰＳ、１８ｍＭ ＤＴＥ）を補充し、最終容量を３５０μｌとした。次いで、発明者は溶解緩衝液を添加し、１８ｃｍのＩＰＧストリップｐＩ３〜１１に対してタンパク質を負荷した。全体で５５０００Ｖｈｒｓにおいてタンパク質を泳動した（ＩＰＧｐｈｏｒ、アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。等電点電気泳動後、ストリップ上のタンパク質が減少し（２％ＤＴＴ、１５分）、その結果、アルキル化された（２．５％ ＩＡＡ、１５分）。二次元電気泳動を、１６℃、２０×２４ｃｍ勾配の９〜１６％ポリアクリルアミドゲル内、還元条件下で行った。２Ｄ電気泳動後、ゲルを固定し、ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ）の方法に従って銀染色した［レイ Ｗ．（Ｗｒａｙ Ｗ．）、ブーリカス Ｔ．（Ｂｏｕｌｉｋａｓ Ｔ．）、レイ Ｖ．Ｐ．（Ｗｒａｙ、Ｖ．Ｐ．）、およびハンコック Ｒ．（Ｈａｎｃｏｃｋ Ｒ．） 「Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ．」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１８、１９７−２０３頁（１９８１年）］。
4). Protein Identification 2D Electrophoresis Proteins eluted in vitro and in vitro were analyzed primarily after separation by two-dimensional gel electrophoresis (2D electrophoresis) [Anderson L. et al. (Anderson L.) and Anderson N. G. (Anderson N.G.) "High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5421-5425 (1977)]. In a one-dimensional separation, the protein was dissolved in urea lysis buffer [7 M urea, 2 M thiourea (both obtained from Calbiochem, Bad Soden, Germany), 30 mM Tris, 4% CHAPS, pH 8.5]. Dissolved in. Prior to loading, 200 μg of total protein was supplemented with rehydration buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 18 mM DTE) to a final volume of 350 μl. The inventors then added lysis buffer and loaded the protein against 18 cm IPG strips pI3-11. Proteins were run at a total of 55000 Vhrs (IPGphor, Amersham Biosciences). After isoelectric focusing, the protein on the strip was reduced (2% DTT, 15 minutes) and consequently alkylated (2.5% IAA, 15 minutes). Two-dimensional electrophoresis was performed under reducing conditions in a 9-16% polyacrylamide gel at 16 ° C. and a 20 × 24 cm gradient. After 2D electrophoresis, the gel was fixed and silver stained according to the method of Farmer [Ray W. (Wray W.), Bouricus T. et al. (Boulikas T.), Ray V. P. (Wray, VP), and Hancock R. (Hancock R. "Silver staining of proteins in polyacrylamide gels." Analytical Biochemistry 118, 197-203 (1981)].
パターンマッチングおよび質量分析
銀染色したタンパク質のスポットパターンを一致させ、「Ｍｅｌａｎｉｅ」ソフトウェア（バージョン４、スイス、バーゼル（Ｂａｓｅｌ）のスイス・インスティチュート・オブ・バイオインフォーマティクス（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ））を用いて２ＤゲルのＥｘＰａｓｙデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｈ２ｄ／）と比較した［ヒュー Ｇ．Ｊ．（Ｈｕｇｈｅｓ Ｇ．Ｊ．）、フルティガー Ｓ．（Ｆｒｕｔｉｇｅｒ Ｓ．）、パケット Ｎ．（Ｐａｑｕｅｔ Ｎ．）、ラビエ Ｆ．（Ｒａｖｉｅｒ Ｆ．）、パスカリ Ｃ．（Ｐａｓｑｕａｌｉ Ｃ．）、サンチェス Ｊ．Ｃ．（Ｓａｎｃｈｅｚ Ｊ．Ｃ．）、ジェームス Ｒ．（Ｊａｍｅｓ Ｒ．）、チソット Ｊ．Ｄ．（Ｔｉｓｓｏｔ Ｊ．Ｄ．）、ブジェルクヴィスト Ｂ．（Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ Ｂ．）、およびホホストラッヤ Ｄ．Ｆ．（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ Ｄ．Ｆ．） 「Ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｐ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．」 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３、７０７−７１４頁（１９９２年）］。目的のスポットを手で切り取り、タンパク質をトリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）で消化し、ペプチドを質量分析（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ（商標） ＴＯＦ／ＴＯＦ、ブルカーダルトニクス（マサチューセッツ州ビルリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ））により分析した。
Pattern Matching and Mass Spectrometry Matching spot patterns of silver-stained proteins, “Melanie” software (version 4, Swiss Institute of Bioinformatics, Basel, Switzerland) Was used to compare with the 2D gel ExPassy database (http://us.expasy.org/ch2d/) [Hugh G. J. et al. (Hughes GJ), Flutiger S. (Frutiger S.), packet N. (Paquet N.), Ravier F. (Ravier F.), Pascali C.I. (Pasquali C.), Sanchez J .; C. (Sanchez JC), James R.C. (James R.), Chisot J. et al. D. (Tissot JD), Bjerkvist B.B. (Bjellqvist B.) and Hostalaya D. F. (Hochstrasser DF) "Plasma protein map: an update by microsequencing." Electrophoresis 13, 707-714 (1992)]. The spot of interest is cut out manually, the protein is digested with trypsin (Promega, Mannheim, Germany), and the peptide is mass analyzed (Ultraflex ™ TOF / TOF, Bruker Daltonics (Billerica, Mass.) ) Bruker Daltonics)).
インゲル消化をシェブチェンコ（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ）らの記載のように行った［シェブチェンコ Ａ．（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ Ａ．）、ウィルム Ｍ．（Ｗｉｌｍ Ｍ．）、ヴォルム Ｏ．（Ｖｏｒｍ Ｏ．）、およびマン Ｍ．（Ｍａｎｎ Ｍ．） 「Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ．」 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６８、８５０−８５８頁（１９９６年）］。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦからのペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）によって分析されたこれらの試料を、同じ標的からＬＩＦＴ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳを用いてさらに分析した。１試料当たり最大で３種の前駆体イオンをＭＳ／ＭＳ分析において選択した。ＰＭＦを反射モードで測定した後、ＬＩＦＴモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ測定を行った。ＰＭＦスペクトルを「Ｍａｓｃｏｔ」および「Ｐｒｏｆｏｕｎｄ」ソフトウェアで解釈した。正確な同定のためのカットオフ基準として、「Ｍａｓｃｏｔ」においては６４より高い確率スコア、「Ｐｒｏｆｏｕｎｄ」においては１．６５の確率スコアを用いた。 In-gel digestion was performed as described by Shevchenko et al. (Shevchenko A.), Wilm M. et al. (Wilm M.), Volm O. (Vorm O.), and Mann M. (Mann M.) "Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels." Analytical Chemistry 68, 850-858 (1996)]. These samples analyzed by peptide mass fingerprint (PMF) from MALDI-TOF were further analyzed from the same target using LIFT-TOF / TOF MS / MS. A maximum of three precursor ions per sample were selected for MS / MS analysis. After measuring the PMF in the reflection mode, MALDI-TOF / TOF measurement was performed in the LIFT mode. PMF spectra were interpreted with “Mascot” and “Profound” software. As cut-off criteria for accurate identification, a probability score higher than 64 was used for “Mascot” and a probability score of 1.65 for “Profound”.
ウエスタンブロットによる結果の確認
発明者は、質量分析およびデータベース検索から得られたデータを補い、確認するため、シリコンから溶出されたタンパク質のウエスタンブロットを行った。このため、発明者は、小さい（７×１０ｃｍ）均質の１２％ポリアクリルアミドゲルに負荷されたＳＤＳ緩衝液（２％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ トリスＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ９．０）中に溶出されたタンパク質を用いた。実行後、タンパク質をウェットブロッティング用チャンバー内の１２００ｍＡｈにおけるニトロセルロース膜上にブロットし、５％脱脂乳でブロッキングした。タンパク質の大部分に対する一次抗体ならびに適切な複合体をダコ（ＤＡＫＯ）から入手し、脊髄関連タンパク質（ＭＲＰ）８およびＭＲＰ１４に対するポリクローナルウサギ抗体は、親切にもＤｒ．クラウス・ケルクホフ（Ｄｒ．Ｃｌａｕｓ Ｋｅｒｋｈｏｆｆ）（ドイツ、ミュンスター（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）のインスティチュート・オブ・エクスペリメンタル・ダーマトロジー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ））から贈られたものであり、我々自ら、クローンＩＩ−１３から、親和性クロマトグラフィーで精製したヒトＨＳＰ６０に対するモノクローナル抗体を産生した［シュー Ｑ（Ｘｕ Ｑ．）、シェット Ｇ．（Ｓｃｈｅｔｔ Ｇ．）、ザイツ Ｃ．Ｓ．（Ｓｅｉｔｚ Ｃ．Ｓ．）、フー Ｙ．（Ｈｕ Ｙ．）、グプタ Ｒ．Ｓ．（Ｇｕｐｔａ Ｒ．Ｓ．）、およびウィック Ｇ．（Ｗｉｃｋ Ｇ．） 「Ｓｕｒｆａｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ６０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓｅｄ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．」 Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５、１０７８−１０８５頁（１９９４年）］。すべての抗体希釈物をＰＢＳ中、５％脱脂乳中で調製した。二次抗体のインキュベーション後、膜をＰＢＳで洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に対する化学発光基質を１分間添加した。膜を様々な時間、ＡＧＦＡＸ線フィルムに露光し、キュリックス（Ｃｕｒｒｉｘ）現像機内で現像した。
Confirmation of results by Western blot The inventor performed Western blots of proteins eluted from silicon to supplement and confirm the data obtained from mass spectrometry and database search. For this reason, the inventors eluted in SDS buffer (2% SDS, 100 mM DTT, 50 mM Tris Cl, 10% glycerin, pH 9.0) loaded on a small (7 × 10 cm) homogeneous 12% polyacrylamide gel. Protein was used. After the run, the protein was blotted onto a 1200 mAh nitrocellulose membrane in a wet blotting chamber and blocked with 5% skimmed milk. Primary antibodies against the majority of proteins and appropriate conjugates are obtained from DAKO, and polyclonal rabbit antibodies against spinal cord associated protein (MRP) 8 and MRP14 are kindly available from Dr. Clone II, from Dr. Claus Kerkhoff (Institute of Experimental Dermatology, Münster, Germany) -13 produced a monoclonal antibody against human HSP60 purified by affinity chromatography [Xu Q., Shet G. (Schett G.), Zeitz C.I. S. (Seitz CS), Fu Y. (Hu Y.), Gupta R. S. (Gupta RS), and Wick G. (Wick G.) “Surface stating and cytotoxic activity of heat-
５．同定されているタンパク質
最近まで、以下の４７種のタンパク質が、本発明との関連でシリコンに接着するものとして同定されている。
タンパク質名
アクチン
アルブミン
α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体
α２−マクログロブリン前駆体
ＡＭＢＰタンパク質前駆体
アポリポタンパク質Ａ１
アポリポタンパク質Ｅ３
Ｃ反応性タンパク質
凝固因子Ｖ
コラーゲンＩ
コラーゲンＩＶ
コラーゲンＶＩＩ
補体Ｃ１ｓ
補体Ｃ２前駆体
補体Ｃ３前駆体
好酸球ペルオキシダーゼ
フィブリノーゲン
線維芽細胞成長因子１１
フィブロネクチン
ハプトグロビン１
ヘモグロビン
ＨＳＰ６０
ＨＴ０１８
ＩｇＡ
免疫グロブリンＧ
インテグリンβ４
キニノゲン
ラミニン
マトリックスメタロプロテアーゼ２
単球化学走性タンパク質−２
脊髄関連タンパク質１４
脊髄関連タンパク質８
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ
血漿−レチノール結合タンパク質
ＰＲ０２６１９
プロコラーゲンＩＩＩ
Ｔ細胞受容体
ＴＧＦ−β
トランスサイレチン
ビトロネクチン
フォンヴィルブラント因子
α−スペクトリン
γ−グルタミルトランスフェラーゼ
４種の未知タンパク質
5. Proteins identified Until recently, the following 47 proteins have been identified as adhering to silicon in the context of the present invention.
Protein name actin albumin α1-microglobulin / bikunin precursor α2-macroglobulin precursor AMBP protein precursor apolipoprotein A1
Apolipoprotein E3
C-reactive protein coagulation factor V
Collagen I
Collagen IV
Collagen VII
Complement C1s
Complement C2 precursor complement C3 precursor eosinophil peroxidase fibrinogen
Fibronectin haptoglobin 1
Hemoglobin HSP60
HT018
IgA
Immunoglobulin G
Integrin β4
Kininogen
Monocyte chemotaxis protein-2
Spinal cord related protein 14
Spinal cord related
NADH dehydrogenase plasma-retinol binding protein PR02619
Procollagen III
T cell receptor TGF-β
Transthyretin vitronectin von Willebrand factor α-spectrin γ-glutamyltransferase 4 unknown proteins
さらに、２Ｄインビボ、２ＤインビトロおよびＥＬＩＳＡ（インビトロ）により同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名 登録番号
免疫グロブリンＧ＊ ｇｉ｜４３２１９０５
Ｃ反応性タンパク質＊ ｐ０２７４１
脊髄関連タンパク質８＊ ｐ０５１０９
フィブロネクチン＊ ｐ０２７５１
ビトロネクチン＊ ｐ０４００４
コラーゲンＩ＊ ｇｉ｜４５０２９６１
プロコラーゲンＩＩＩ ｑ５４１Ｐ８
ラミニン＊ ｇｉ｜２７８０４３４６
アクチン＊ ｇｉ｜１５２７７５０３
免疫グロブリンＡ＊ ｇｉ｜８６９９３０７
補体Ｃ３前駆体 ｐ０１０２４
In addition, the following proteins identified by 2D in vivo, 2D in vitro and ELISA (in vitro) are listed along with their GeneBank accession numbers ( * indicates confirmed by Western blot (WB)).
Protein name Registration number Immunoglobulin G * gi | 4321905
C-reactive protein * p02741
Spinal cord related
Fibronectin * p02751
Vitronectin * p04004
Collagen I * gi | 4502961
Procollagen III q541P8
Laminin * gi | 2784346
Actin * gi | 15277503
Immunoglobulin A * gi | 8699307
Complement C3 precursor p01024
２ＤインビボおよびＥＬＩＳＡ（インビトロ）により同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名 登録番号
脊髄関連タンパク質１４ ｐ０６７０２
脊髄関連タンパク質１４ ｐ０６７０２
コラーゲンＩＶ ｇｉ｜１８０７１５
The following proteins identified by 2D in vivo and ELISA (in vitro) are listed along with their GeneBank accession numbers ( * indicates confirmed by Western blot (WB)).
Protein name Registration number Spinal cord related protein 14 p06702
Spinal cord related protein 14 p06702
Collagen IV gi | 180715
２ＤインビトロおよびＥＬＩＳＡ（インビトロ）により同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名 登録番号
コラーゲンＶＩＩ＊ ｇｉ｜６２７４０６
マトリックスメタロプロテアーゼ２＊ ｐ０８２５３
フォンヴィルブラント因子＊ ｐ０４２７５
熱ショックタンパク質６０ ｐ１０８０９
The following proteins identified by 2D in vitro and ELISA (in vitro) are listed along with their GeneBank accession numbers ( * indicates confirmed by Western blot (WB)).
Protein name Registration number Collagen VII * gi | 627406
Von Willebrand factor * p04275
抗体の使用が可能な場合の２Ｄインビボおよび／または２Ｄインビトロにより同定されたがＥＬＩＳＡにより検出されなかった以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名 登録番号
補体Ｃ１ｓ ｐ０９８７１
補体Ｃ２前駆体＊ ｇｉ｜６７６１１
ＴＧＦ−β ｐ０１１３７
Ｔ細胞受容体 ｇｉ｜６２４６５５４８
アルブミン ｇｉ｜２８５９２
インテグリンβ４＊ ｇｉ｜２１３６１２０７
未知タンパク質１ ｇｉ｜３４５３３７７４
未知タンパク質２ ｇｉ｜２１７３９２９８
未知タンパク質３ ｇｉ｜２１７５４７７８
未知タンパク質４ ｇｉ｜７０２０５６９
List the following proteins that were identified by 2D in vivo and / or 2D in vitro but not detected by ELISA with the use of antibodies, along with their GeneBank accession numbers ( * confirmed by Western blot (WB)) Showing).
Protein name Registration number Complement C1s p09871
Complement C2 precursor * gi | 67611
TGF-β p01137
T cell receptor gi | 624465548
Albumin gi | 28592
Integrin β4 * gi | 21361207
Unknown protein 1 gi | 345533774
Unknown protein 3 gi | 21754778
Unknown protein 4 gi | 7020569
抗体を全く使用できない場合の２Ｄインビボおよび／または２Ｄインビトロにより同定された以下のタンパク質をそれらのＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号とともに挙げる（＊はウエスタンブロット（ＷＢ）により確認されたものを示す）。
タンパク質名 登録番号
ハプトグロビン１ ｐ００７３８
アポリポタンパク質Ａ１ ｇｉ｜１７８７７７
トランスサイレチン ｐ０２７６６
α２−マクログロブリン前駆体 ｐ０１０２３
ヘモグロビン ｇｉ｜５５６３５２１９
α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体 ｐ０２７６０
フィブリノーゲン＊ ｐ０２６７１
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ ｇｉ｜５１３８９９９
ＨＴ０１８ ｇｉ｜９９６３８５３
ＡＭＢＰタンパク質前駆体 ｇｉ｜１７９５１９
キニノゲン ｐ０１０４２
血漿−レチノール結合タンパク質 ｇｉ｜１９０８７０
凝固因子Ｖ ｐ１２２５９
ＰＲ０２６１９ ｇｉ｜１１４９３４５９
好酸球ペルオキシダーゼ ｇｉ｜３１１８３
線維芽細胞成長因子１１ ｇｉ｜２０１６０２１５
α−スペクトリン ｇｉ｜１８９０７１
単球化学走性タンパク質−２ ｇｉ｜１９０５８０１
γ−グルタミルトランスフェラーゼ ｇｉ｜３２８２０１４
アポリポタンパク質Ｅ３ ｇｉ｜１４８００９６
The following proteins identified by 2D in vivo and / or 2D in vitro when no antibodies are available are listed along with their GeneBank accession numbers ( * indicates confirmed by Western blot (WB)).
Protein name Registration number Haptoglobin 1 p00738
Apolipoprotein A1 gi | 178777
Transthyretin p02766
α2-macroglobulin precursor p01023
Hemoglobin gi | 556635219
α1-microglobulin / bikunin precursor p02760
Fibrinogen * p02671
NADH dehydrogenase gi | 5138999
HT018 gi | 9966383
AMBP protein precursor gi | 1799519
Kininogen p01042
Plasma-retinol binding protein gi | 190870
Coagulation factor V p12259
PR02619 gi | 11493459
Eosinophil peroxidase gi | 31183
α-spectrin gi | 1899071
Monocyte chemotaxis protein-2 gi | 1905801
γ-glutamyltransferase gi | 3282014
Apolipoprotein E3 gi | 1480096
同定されたシリコン接着タンパク質の分類
本発明により同定されたタンパク質は、それらの生物学的機能に関連して以下のように分類されうる。
１）官能基、炎症
Ｃ反応性タンパク質
補体Ｃ１ｓ
補体Ｃ２前駆体
免疫グロブリンＧ
脊髄関連タンパク質１４
脊髄関連タンパク質８
フォンヴィルブラント因子
ＩｇＡ
インテグリンβ４
補体Ｃ３前駆体
アポリポタンパク質Ａ１
アポリポタンパク質Ｅ３
α１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体
ＨＳＰ６０
ＨＴ０１８
ＰＲ０２６１９
ＡＭＢＰタンパク質前駆体
Ｔ細胞受容体
２）官能基、線維症
凝固因子Ｖ
コラーゲンＩ
コラーゲンＩＶ
フィブロネクチン
ラミニン
コラーゲンＶＩＩ
フィブリノーゲン
線維芽細胞成長因子１１
キニノゲン
マトリックスメタロプロテアーゼ２
プロコラーゲンＩＩＩ
ビトロネクチン
３）官能基、炎症および線維症
ＴＧＦ−β
４）官能基、他
好酸球ペルオキシダーゼ
アクチン
アルブミン
α２−マクログロブリン前駆体
ハプトグロビン１
ヘモグロビン
トランスサイレチン
γ−グルタミルトランスフェラーゼ
単球化学走性タンパク質−２
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ
未知タンパク質１（配列番号１）
未知タンパク質２（配列番号２）
未知タンパク質３（配列番号３）
未知タンパク質４（配列番号４）
５．正常組織と線維化組織の間の識別に適するタンパク質
免疫グロブリンＧ
Ｃ反応性タンパク質
フィブロネクチン
コラーゲンＩ
プロコラーゲンＩＩＩ
補体Ｃ３前駆体
脊髄関連タンパク質１４
Classification of Identified Silicon Adhesion Proteins The proteins identified by the present invention can be classified as follows in relation to their biological function.
1) Functional group, inflammation C-reactive protein complement C1s
Complement C2 precursor immunoglobulin G
Spinal cord related protein 14
Spinal cord related
Von Willebrand factor IgA
Integrin β4
Complement C3 precursor apolipoprotein A1
Apolipoprotein E3
α1-microglobulin / bikunin precursor HSP60
HT018
PR02619
AMBP protein precursor T cell receptor 2) functional group, fibrosis coagulation factor V
Collagen I
Collagen IV
Fibronectin laminin collagen VII
Fibrinogen
Procollagen III
Vitronectin 3) functional groups, inflammation and fibrosis TGF-β
4) Functional group, other eosinophil peroxidase actin albumin α2-macroglobulin precursor haptoglobin 1
Hemoglobin transthyretin γ-glutamyltransferase monocyte chemotaxis protein-2
NADH dehydrogenase unknown protein 1 (SEQ ID NO: 1)
Unknown protein 2 (SEQ ID NO: 2)
Unknown protein 3 (SEQ ID NO: 3)
Unknown protein 4 (SEQ ID NO: 4)
5. Protein immunoglobulin G suitable for discrimination between normal and fibrotic tissue
C-reactive protein fibronectin collagen I
Procollagen III
Complement C3 precursor spinal cord related protein 14
シリコンに特異的に接着するタンパク質の特性
異なる選択された医療用シリコンタイプに生体外およびインビトロの双方で接着することが見出されたタンパク質を表１にまとめる。それらの相対的な存在度は、？：試験なし、０：不在、＋：存在、＋＋：豊富、＋＋＋：極めて豊富のように発現される。
Properties of proteins that specifically adhere to silicon Table 1 summarizes the proteins found to adhere to different selected medical silicon types both in vitro and in vitro. What are their relative abundances? : Not tested, 0: absent, +: present, ++: abundant, +++: expressed as extremely abundant.
タンパク質は、異なるカテゴリー、すなわちアンカータンパク質、一次タンパク質セット、および二次タンパク質セットに分類されうる。最初の２つのカテゴリーのみが他の技術（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）により再確認されている。 Proteins can be divided into different categories: anchor proteins, primary protein sets, and secondary protein sets. Only the first two categories have been reconfirmed by other techniques (Western blot, ELISA).
１．等しく強力な接着性あるタンパク質（アンカータンパク質）
これらのタンパク質は少なくとも「豊富」すなわち＋＋として規定され、試験対象のすべてのシリコンタイプに対して等しく接着性があるものとして存在した。７種の候補をこの群に含めた。それらに記号「＊」を付与する。
1. Equally strong adhesive protein (anchor protein)
These proteins were defined as at least “abundant” or ++ and existed as being equally adherent to all silicon types tested. Seven candidates were included in this group. The symbol “ * ” is given to them.
２．一次タンパク質セット
このセットは２１種のタンパク質からなる。それらは含めるにあたり試験対象のシリコンタイプのすべてにおいて検出される必要があった。３つの下位分類であれば以下のように規定できる。
等しいが接着性の低いタンパク質
１４種のタンパク質がこの下位分類を構成し、それを「存在する」すなわち＋として規定した。それらに記号「▽」を付与する。
差異のあるシリコンタイプへの接着性のあるタンパク質
７種のタンパク質は、シリコンタイプＭＥＤｌ５１１、４８６０、４２１１、および３６０（ヌシル（Ｎｕｓｉｌ））に対する接着において有意な差異を示した。それらはあらゆる接着強度すなわち０、＋、＋＋および＋＋＋の分子を網羅した。それらに記号「■」を付与する。
未分類の接着特性のあるタンパク質
４種のタンパク質からなるこの群では２種のシリコンタイプのみに対して試験した。実験の奏功は接着性のクラス「存在する」（＋）を示した。これまでそれらは下位分類１（等しいが接着性の低いタンパク質）のメンバーである可能性が最も高いと思われる。それらに記号「□」を付与する。
2. Primary protein set This set consists of 21 proteins. They needed to be detected in all silicon types tested for inclusion. Three subclasses can be defined as follows.
Fourteen proteins with equal but poor adhesion constitute this subclass and are defined as “present” or +. The symbol “▽” is given to them.
Proteins with adhesiveness to different silicon types Seven proteins showed significant differences in adhesion to silicon types MEDl511, 4860, 4211, and 360 (Nusil). They covered all adhesion strengths, ie 0, +, ++ and ++ molecules. The symbol “■” is given to them.
Proteins with unclassified adhesive properties In this group of 4 proteins, only 2 silicon types were tested. The success of the experiment showed the adhesion class “present” (+). To date, they appear to be most likely members of subclass 1 (equal but less adhesive proteins). The symbol “□” is given to them.
３．二次タンパク質セット
このセットは１７種のタンパク質から構成された。それらは１つのシリコンタイプのみ（ＭＥＤ１５１１）の上で検出され、質量分析以外の技術によって確認されてはいない。以下の１３種のタンパク質がこのセットにおいて見出された。
ＡＭＢＰタンパク質前駆体
血漿−レチノール結合タンパク質
キニノゲン
好酸球ペルオキシダーゼ
線維芽細胞成長因子１１
ＴＧＦ−β
インテグリン−β４
Ｔ細胞受容体
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ
凝固因子Ｖ
α−スペクトリン
単球化学走性タンパク質−２
γ−グルタミルトランスフェラーゼ
3. Secondary protein set This set consisted of 17 proteins. They are detected on only one silicon type (MED 1511) and have not been confirmed by techniques other than mass spectrometry. The following 13 proteins were found in this set.
AMBP protein precursor plasma-retinol binding protein kininogen eosinophil peroxidase
TGF-β
Integrin-β4
T cell receptor NADH dehydrogenase coagulation factor V
α-spectrin monocyte chemotaxis protein-2
γ-glutamyltransferase
さらに、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の未知タンパク質産物および「マスコット」により同定された仮想的なタンパク質が４種存在した。
登録番号：ｇｉ｜３４５３３７７４；質量：１１３６４２；未知タンパク質産物（配列番号１）
登録番号：ｇｉ｜２１７３９２９８、ｅｍｂ｜ＣＡＤ３８６９６．１；質量：１１７４９０；未知タンパク質産物（配列番号２）
登録番号：ｇｉ｜２１７５４７７８；質量：３８４５３；未知タンパク質産物（配列番号３）
登録番号：ｇｉ｜７０２０５６９；質量：１４００４；未知タンパク質産物（配列番号４）
In addition, there were four types of hypothetical proteins identified by Homo sapiens unknown protein products and “mascots”.
Registration number: gi | 345533774; mass: 113642; unknown protein product (SEQ ID NO: 1)
Accession number: gi | 21379298, emb | CAD386696.1; mass: 117490; unknown protein product (SEQ ID NO: 2)
Registry Number: gi | 21754778; Mass: 38453; Unknown Protein Product (SEQ ID NO: 3)
Accession number: gi | 7020569; mass: 14004; unknown protein product (SEQ ID NO: 4)
新規のタンパク質候補
上記のタンパク質の中に、シリコンに対する過敏症および続発性線維症との関連でこれまで言及していない数種のものが存在した。
１．脊髄関連タンパク質８
２．脊髄関連タンパク質１４
３．ＨＴ０１８
４．ＰＲＯ２６１９
５．登録番号：ｇｉ｜３４５３３７７４；質量：１１３６４２；未知タンパク質産物（配列番号１）
６．登録番号：ｇｉ｜２１７３９２９８、ｅｍｂ｜ＣＡＤ３８６９６．１；質量：１１７４９０；未知タンパク質産物（配列番号２）
７．登録番号：ｇｉ｜２１７５４７７８；質量：３８４５３；未知タンパク質産物（配列番号３）
８．登録番号：ｇｉ｜７０２０５６９；質量：１４００４；未知タンパク質産物（配列番号４）
Novel protein candidates There were several of the above proteins not previously mentioned in the context of hypersensitivity to silicon and secondary fibrosis.
1. Spinal cord related
2. Spinal cord related protein 14
3. HT018
4). PRO2619
5. Registration number: gi | 345533774; mass: 113642; unknown protein product (SEQ ID NO: 1)
6). Accession number: gi | 21379298, emb | CAD386696.1; mass: 117490; unknown protein product (SEQ ID NO: 2)
7). Registry Number: gi | 21754778; Mass: 38453; Unknown Protein Product (SEQ ID NO: 3)
8). Accession number: gi | 7020569; mass: 14004; unknown protein product (SEQ ID NO: 4)
診断試験系
異なる患者におけるタンパク質のシリコンに対する接着における接着特性は、患者が発症しているかもしれない、想定される免疫反応およびそれに続発する線維化反応の指標であることが仮定される。この仮定が正しかった場合、発明者は診断方法を確立できたことになり、それにより線維性合併症になりやすいタンパク質が同定される。したがって、タンパク質分析を行った上で（実施例２および３を参照）、発明者は数種の候補を選択し、血清からシリコンの表面に補充されたこれらタンパク質を検出するための試験系を構築した。
Diagnostic test system It is hypothesized that the adhesion properties of protein to silicon adhesion in different patients is an indicator of the expected immune response and subsequent fibrosis response that the patient may develop. If this assumption was correct, the inventor was able to establish a diagnostic method, thereby identifying proteins prone to fibrotic complications. Thus, after performing protein analysis (see Examples 2 and 3), the inventor selects several candidates and builds a test system to detect these proteins recruited from the serum to the surface of the silicon did.
実際の利点
１）試験プロトコルはＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートに基づく。この試験系は作製しやすく、室温で長時間安定である。これであればエンドユーザへの発送が容易となる。
２）試験系では血清が用いられる。さらに、ＥＬＩＳＡ系は多数の実験室における標準的な方法である。この組み合わせにより、現行の臨床ルーチンへの容易な組込みが可能になる。
Actual advantages 1) The test protocol is based on ELISA microwell plates. This test system is easy to make and is stable at room temperature for a long time. This facilitates shipment to the end user.
2) Serum is used in the test system. Furthermore, the ELISA system is a standard method in many laboratories. This combination allows easy integration into current clinical routines.
技術的詳細
ポリスチレンの９６ウェルの平底マイクロタイタープレートを医療用シリコンタイプ１５１１、４８６０および４２１１でコーティングした。９６ウェルのポリスチレンプレート（ドイツ、フリッケンハウゼン（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）のグライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））の１ウェルにつき未重合シリコン５０μｌを添加し、シリコンをプレートの底部上に一様に分布させるため、その直後、プレートをシリコンタイプに応じて様々な時間遠心した（ＭＥＤ１５１１：３００ｇで１０分；ＭＥＤ４８６０：１０００ｇで６０分；ＭＥＤ４２１１：１５０ｇで１０分）。シリコンの硬化（３７℃および湿度９８％で３日）後、プレートを２００ミリジュールのＵＶ光（ＧｓＧｅｎｅ ＵＶチャンバー、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））下で１２０秒間滅菌した。滅菌後、シリコンコーティングした９６ウェルプレートを、一次的な豊胸手術を受ける前と後の患者由来の血清またはＳＭＩが交換された患者の血清とともにインキュベートした。すべての血清にロイぺプチン、ペプスタチンおよびアプロチニン（プロテアーゼ阻害剤、オーストリア、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）のシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））の１μｇ／ｍｌを補充し、０．２２μｍのフィルタを通して濾過し、１００μｌを無菌条件下で各ウェルに適用した。一部の実験では、適用に先立ち血清をＰＢＳで希釈した。５０時間後、余分なタンパク質をＰＢＳによる４×５分の洗浄で洗い流し、さらにプレート上の結合部位を、室温、ＰＢＳ中の２．５％ ＢＳＡ／０．１％トゥイーン２０で１００分間ブロッキングした。１ウェルにつきブロッキング溶液１５０μｌを適用した。ブロッキング後、様々な抗体をブロッキング溶液中の予め決定された最適な希釈物中に適用した。我々の初期のスクリーニングは２４の抗体からなるものであったが、以下の最適な作動希釈物（表２）中に適用される、我々の現行のリストを１２に削減した。
Technical Details Polystyrene 96-well flat bottom microtiter plates were coated with medical silicon types 1511, 4860 and 4211. Immediately afterwards, 50 μl of unpolymerized silicon is added per well of a 96-well polystyrene plate (Greiner, Frickenhausen, Germany) to distribute the silicon evenly on the bottom of the plate. Was centrifuged for various times depending on the silicon type (MED 1511: 10 minutes at 300 g; MED 4860: 60 minutes at 1000 g; MED 4211: 10 minutes at 150 g). After curing of the silicon (3 days at 37 ° C. and 98% humidity), the plates were sterilized for 120 seconds under 200 millijoules of UV light (GsGene UV chamber, Biorad, Hercules, Calif.). After sterilization, silicon-coated 96-well plates were incubated with serum from patients before or after undergoing primary breast augmentation or from patients with SMI exchanged. All sera are supplemented with 1 μg / ml of leupeptin, pepstatin and aprotinin (protease inhibitors, Sigma-Aldrich, Vienna, Austria), filtered through a 0.22 μm filter, 100 μl Was applied to each well under aseptic conditions. In some experiments, serum was diluted with PBS prior to application. After 50 hours, excess protein was washed away with a 4 × 5 minute wash with PBS, and the binding sites on the plate were blocked with 2.5% BSA / 0.1% Tween 20 in PBS for 100 minutes at room temperature. 150 μl of blocking solution was applied per well. After blocking, various antibodies were applied in a predetermined optimal dilution in blocking solution. Our initial screen consisted of 24 antibodies, but we reduced our current list to 12, applied in the following optimal working dilution (Table 2).
当然のことながら、ここで抗体のこのリストが最終リストでないことを言及することは重要である。それは発明者がシリコンの表面上に形成されるフィルムでのタンパク質分析において得る新たな実験結果によって増加することになる。一次抗体とともにインキュベートした後、プレートをＰＢＳで３×５分洗浄し、ＨＲＰと複合された適切な二次抗体を、室温での振とう下、１００μｌ／ウェルの容量で１２０分間適用した。直接標識した一次抗体とともにインキュベートしたウェルを、ＡＢＴＳの発色ステップまでＰＢＳ中で保持した。ウサギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ、ダコ（ＤＡＫＯ） Ｐ２６０、１：１０００およびブタ抗−ウサギＩｇＧ ＨＲＰ、ダコ（ＤＡＫＯ） Ｐ３９９、１：１０００といった二次抗体を用いた。あらゆる希釈物をブロッキング溶液中で作製した。二次抗体の室温でのインキュベーション後、プレートをＰＢＳ／０．０２％トゥイーン中で３×５分および純粋なＰＢＳ中で２×５分洗浄した。ＨＲＰに対する標準のＡＢＴＳ ＥＬＩＳＡの検出溶液を用い、結果を画像化した。４０分間発色させ、（分光学的測定時のシリコンコーティングの干渉を除外するため）溶液を新しい９６ウェルプレートに移し、吸収を４０５ｎｍで測定した。したがって、我々はタンパク質のシリコンへの接着性を測定するためのＥＬＩＳＡ系を構築している（図１）。 Of course, it is important to mention here that this list of antibodies is not a final list. It will be augmented by new experimental results that the inventors have obtained in protein analysis on films formed on the surface of silicon. After incubation with the primary antibody, the plate was washed 3 × 5 minutes with PBS and the appropriate secondary antibody conjugated with HRP was applied for 120 minutes in a volume of 100 μl / well with shaking at room temperature. Wells incubated with directly labeled primary antibody were kept in PBS until the ABTS color development step. Secondary antibodies such as rabbit anti-mouse IgG HRP, DAKO P260, 1: 1000 and porcine anti-rabbit IgG HRP, DAKO P399, 1: 1000 were used. Every dilution was made in blocking solution. After incubation of the secondary antibody at room temperature, the plates were washed 3 × 5 minutes in PBS / 0.02% Tween and 2 × 5 minutes in pure PBS. The results were imaged using a standard ABTS ELISA detection solution for HRP. Color was developed for 40 minutes, the solution was transferred to a new 96-well plate (to eliminate silicon coating interference during spectroscopic measurements), and absorbance was measured at 405 nm. Therefore, we have constructed an ELISA system for measuring the adhesion of proteins to silicon (Figure 1).
発明者は、異なるブロッキング溶液を滴定することで、何とかバックグラウンドレベルを有意に低下させた。発明者は、タンパク質の存在におけるカットオフをアイソタイプ対照の２倍の吸光度値として定義した。バックグラウンド値は、２桁に及ぶ線形範囲、プローブ測定値の１％未満であった。試験系全体は高度に再現可能であり、堆積したタンパク質の半定量分析を可能にした。この系の主な利点は、多数の患者およびシリコン上に別々に堆積された様々なタンパク質の同時分析が比較的短時間で可能である点である。 The inventor managed to significantly reduce background levels by titrating different blocking solutions. The inventor defined the cutoff in the presence of protein as an absorbance value twice that of the isotype control. The background value was a linear range spanning two orders of magnitude, less than 1% of the probe measurements. The entire test system was highly reproducible, allowing semi-quantitative analysis of the deposited protein. The main advantage of this system is that simultaneous analysis of a large number of patients and various proteins deposited separately on silicon is possible in a relatively short time.
原理の証拠として（図２）、発明者は、患者１０名（線維性合併症を有する５名と有しない５名）、対照７名（年齢および性別が一致）および劇的な全身性の線維性合併症を誘発する液体シリコンの注入（！）を伴う患者１名において１２種のタンパク質候補を試験した。我々は、フィブロネクチン、ＣＲＰおよびＩｇＡの堆積と線維症との有意な正の相関および補体成分Ｃ３およびＩｇＧの堆積との負の相関を見出した。 In proof of principle (FIG. 2), the inventor found that 10 patients (5 with and without fibrotic complications), 7 controls (matched age and gender) and dramatic systemic fibers Twelve protein candidates were tested in one patient with liquid silicon injection (!) That induced sexual complications. We found a significant positive correlation between fibronectin, CRP and IgA deposition and fibrosis and a negative correlation with complement components C3 and IgG deposition.
したがって、発明者は、原理の証拠として様々な患者からのタンパク質の堆積の異なるパターンに注目している。実際、発明者は、さらなる分析を行い、結果を患者の大規模コホートでの注入期間および局所性または全身性の合併症と相関させたかった。このため、発明者は試験系を迅速なスクリーニングおよびより大規模な臨床試験を可能にする３８４ウェル形式に調整している。さらに、分析における制限因子であることが多い血清の量が減少することで、コストが節約されるとともに複製の可能性に起因する再現性が向上する可能性がある。特定のタンパク質に対する一次抗体および適切なＨＲＰと複合した二次抗体を伴う検出系は上記と同様であるが、容量は少なめである（５０μｌ）。４０分間発色させ、（分光学的測定時のシリコンコーティングの干渉を除外するため）溶液を新しい３８４ウェルプレートに移し、「Ｖｉｃｔｏｒ」３８４ウェルプレートの分光光度計（米国ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））上で４０５ｎｍでの吸収を測定した。 Thus, the inventor has focused on different patterns of protein deposition from various patients as proof of principle. In fact, the inventor wanted to perform further analysis and correlate the results with the duration of the infusion in the patient's large cohort and local or systemic complications. For this reason, the inventor has adjusted the test system to a 384-well format that allows for rapid screening and larger clinical trials. Furthermore, reducing the amount of serum that is often a limiting factor in the analysis may save costs and improve reproducibility due to the possibility of replication. A detection system with a primary antibody against a specific protein and a secondary antibody conjugated with the appropriate HRP is similar to the above, but with a smaller volume (50 μl). Develop for 40 minutes, transfer the solution to a new 384 well plate (to exclude silicon coating interference during spectroscopic measurements) and spectrophotometer in “Victor” 384 well plate (Perkin Elmer, Boston, USA) (Perkin Elmer)) was measured for absorption at 405 nm.
無制限の（長期注入として認定された）シリコンタイプについては約２０種のさらなるタイプが存在するが、この分類は医療目的で用いられるシリコンのあらゆる一般的タイプを網羅している。 There are about 20 additional types of unlimited (certified as long-term injection) types, but this classification covers all common types of silicon used for medical purposes.
１．バックグラウンド
シリコンに対して選択された候補よりなる規定のタンパク質アレイの接着特性において差異が、それはシリコンデバイスの結果的な有害作用の発生において観察されるばらつきに関与する可能性があった。この系は、患者のコホートにおける７種のタンパク質の堆積の同時分析を可能にした。それらは実施例１に記載のシリコンの表面上でのプロテオームのスクリーニングから選択された。
1. Differences in the adhesion properties of a defined protein array consisting of candidates selected for background silicon could contribute to the observed variability in the resultant adverse effects of silicon devices. This system allowed simultaneous analysis of the deposition of seven proteins in a patient cohort. They were selected from the proteome screening on the silicon surface described in Example 1.
遡及試験では、このタンパク質アレイの堆積パターンにより線維症を発症した患者と合併症のない患者がうまく区別された（図５）。興味深いことに、対照患者の中で、シリコンに対する応答として線維症を発症する患者に類似した堆積パターンを有する小群も同定された。この群が潜在的リスク、すなわちシリコンに対する強力な線維性の有害反応を受けやすいというリスクの有無を判定するため、フォローアップの前向き試験が現在行われている。 In retrospective studies, the deposition pattern of this protein array made a good distinction between patients who developed fibrosis and those without complications (Figure 5). Interestingly, a subgroup was also identified among the control patients that had a deposition pattern similar to those who developed fibrosis in response to silicon. Follow-up prospective trials are currently being conducted to determine whether this group is at risk, i.e., a risk of a strong fibrotic adverse reaction to silicon.
２．方法
試験においては特に美容目的で豊胸手術をした９０名の女性を含めた。彼女らを、ベイカースコア（Ｂａｋｅｒ Ｓｃｏｒｅ）（ＢＳ）により線維症を有する胸部結合組織の線維症患者（ＢＳ≧３；Ｎ＝４０；年齢中央値５１歳）および広範な線維症を有しない患者（ＢＳ＜３；Ｎ＝５０；年齢中央値４７歳）からなる２群に分けた。
2. Methods The trial included 90 women who had breast augmentation surgery especially for cosmetic purposes. They were compared to patients with fibrosis of the breast connective tissue with fibrosis (BS ≧ 3; N = 40; median age 51 years) and those without extensive fibrosis (BS) according to Baker Score (BS). <3; N = 50; median age 47 years).
下記に挙げる７種の異なるタンパク質の堆積パターンをこのコホート試験で比較した。データを正規化するため、吸収値を公式ｘ’＝ｌｏｇ（ｘ＋ｌ）に従って変換した。コルモゴロフ−スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ）検定による試験によると、変換値は正規分布を有した。これらの実験では、バックグラウンド値はプローブ測定値の１％未満であり、検出の線形範囲は２桁にまで及んでいた。分析の間、線維性が弱い試験項目（ｓｔｕｄｙ ｂｒａｎｃｈ）の内の小群（１８％、ｎ＝９）が線維症を患う患者が有するタンパク質の堆積特性に類似したものを有することが注目された。それらを「修正された対照」の独立群として分類した。この観察を、「Ｔｒｅｅｖｉｅｗ」クラスタリングソフトウェアを用いたデータのクラスタリングにより確認した。ソフトウェアにより、独立群内の対照患者のこれら１８％を線維症を患う患者とともにクラスタリングした。 The seven different protein deposition patterns listed below were compared in this cohort study. In order to normalize the data, the absorption values were converted according to the formula x '= log (x + 1). According to the test by the Kolmogorov-Smirnov test, the conversion values had a normal distribution. In these experiments, the background value was less than 1% of the probe measurement and the linear range of detection extended to two orders of magnitude. During the analysis, it was noted that a small group (18%, n = 9) of the study branches with weak fibrosis had something similar to the protein deposition characteristics of patients with fibrosis. . They were classified as an independent group of “modified controls”. This observation was confirmed by data clustering using “Treeview” clustering software. The software clustered these 18% of the control patients in the independent group with those suffering from fibrosis.
薬剤を試験するための系
選択されたタンパク質候補のシリコンに対する選択接着は、過敏性反応の発生におけるその機能的関連性およびそれに付随する線維性合併症を示唆する。その結果、薬剤の使用によりタンパク質の接着への干渉を意図することができ、それによりシリコン表面への結合前にこれらのタンパク質に対する接着部位が被覆されるかまたは候補が捕捉された。したがって、発明者は、将来の薬剤のスクリーニング用途において以下の試験系を用いることを推奨する。それはポリスチレン３８４−マイクロウェルプレートに基づくものである。シリコンコーティングの原理は２．４．１．２と同様にほぼ一致する。唯一の差異は、各未重合シリコンに対し、１ウェル当たり５０μｌではなく１０μｌが適用された点である。１ウェル当たり適用される血清または任意の他のタンパク質溶液の量もまた有意に少なめであり、１ウェル当たり２０μｌに減少する。すべてのインキュベーション時間は同様のままである。
System for testing drugs Selective adhesion of selected protein candidates to silicon suggests its functional relevance in the development of hypersensitivity reactions and the associated fibrotic complications. As a result, the use of drugs can be intended to interfere with protein adhesion, thereby coating or capturing candidates for adhesion sites for these proteins prior to binding to the silicon surface. Accordingly, the inventors recommend using the following test system for future drug screening applications. It is based on a polystyrene 384-microwell plate. The principle of silicon coating is almost the same as 2.4.1.2. The only difference is that for each unpolymerized silicon, 10 μl was applied instead of 50 μl per well. The amount of serum or any other protein solution applied per well is also significantly lower, reducing to 20 μl per well. All incubation times remain the same.
インビトロでのシリコンに対する細胞接着
細胞接着実験においては、シリコンコーティングされたプレートの同一の系を用いた。上記のように、プレートを様々なシリコンタイプでコーティングし、ＷＢＦまたは血清とともに４日間インキュベートするかまたはしなかった。この期間後、プレートを洗浄し、血清を含有しないＤＭＥＭ培地内の５×１０４個の細胞／ｍｌの懸濁液を１ウェル当たり２ｍｌ添加した。様々な時点で、非接着細胞を軽くピペッティングして除去し、残存細胞を４％ホルムアルデヒド中に固定した。接着細胞の相対数をクリスタルバイオレットアッセイで判定した［ガイリット Ｊ．（Ｇａｉｌｉｔ Ｊ．）、クラルケ Ｃ．（Ｃｌａｒｋｅ Ｃ．）、ニューマン Ｄ．（Ｎｅｗｍａｎ Ｄ．）、トンネセン Ｍ．Ｇ．（Ｔｏｎｎｅｓｅｎ Ｍ．Ｇ．）、モゼッソン Ｍ．Ｗ．（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ Ｍ．Ｗ．）、およびクラーク Ｒ．Ａ．（Ｃｌａｒｋ Ｒ．Ａ．）「Ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｉｎｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｔｏ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ａｔ ＲＧＤ ｓｉｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ３．」Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３２、１１８−１２６頁（１９９７年）］。クリスタルバイオレット溶液を添加し（２％エタノール中、０．２％ ｗ／ｖ）、室温で１０分間インキュベートした。プレートをより大型のビーカー内への浸漬により生水中で２回洗浄した。次いでそれらをペーパータオル上に逆さまにして排出し、１％ ＳＤＳを添加して染色液を可溶化した。プレートをオービタルシェーカー上でウェルの底部に濃い着色領域が全くなく色が一様になるまで撹拌し、各ウェルからの１％ ＳＤＳ溶液の吸光度を、ブランクとして１％ ＳＤＳを用いて５６２ｎｍで読み取った。溶液を古典的な分光測光により測定した。試験全体を６ウェルプレート上で行い、高スループットの用途のために９６ウェル形式に小型化することができた。図４は、線維芽細胞のシリコンコーティングされたプラスチックのウェルに対する接着について示す。
Cell adhesion to silicon in vitro For cell adhesion experiments, the same system of silicon coated plates was used. As described above, the plates were coated with various silicone types and incubated with or without WBF or serum for 4 days. After this period, the plates were washed and 2 ml per well of a suspension of 5 × 10 4 cells / ml in DMEM medium without serum was added. At various time points, non-adherent cells were removed by light pipetting and the remaining cells were fixed in 4% formaldehyde. The relative number of adherent cells was determined by crystal violet assay [Guilit J. et al. (Gailit J.), Clarke C.I. (Clark C.), Newman D. (Newman D.), Tunnelnes M. et al. G. (Tonnesen MG), Mosesson M.G. W. (Mosesson MW), and Clark R. A. (Clark RA) “Human fibroblasts bind directly to fibrinogen at RGD sites through integral alpha (v) beta 3.” Experimental Cell Research 232, 118-126. Crystal violet solution was added (0.2% w / v in 2% ethanol) and incubated for 10 minutes at room temperature. The plate was washed twice in fresh water by immersion in a larger beaker. They were then discharged upside down on a paper towel and 1% SDS was added to solubilize the stain. The plates were agitated on an orbital shaker until there was no dark colored area at the bottom of the wells and the color was uniform, and the absorbance of 1% SDS solution from each well was read at 562 nm using 1% SDS as a blank. . The solution was measured by classical spectrophotometry. The entire test was performed on a 6-well plate and could be miniaturized to a 96-well format for high throughput applications. FIG. 4 shows the adhesion of fibroblasts to silicon coated plastic wells.
Claims (28)
ａ）シリコン接着ポリペプチドを含有すると思われ、かつ場合によりシリコンを含有する試料を哺乳類から取得するステップと、
ｂ）前記試料を少なくとも１種のシリコンに接触させるステップと、
ｃ）ステップａ）および／またはｂ）からの前記シリコンに接着される前記ポリペプチドを単離するステップと、
ｄ）前記単離されたシリコン接着ポリペプチドを同定するステップと、
を含む、方法。 A method for identifying a polypeptide that adheres to a silicon surface, comprising:
a) obtaining a sample from a mammal suspected of containing a silicon adhesion polypeptide and optionally containing silicon;
b) contacting the sample with at least one silicon;
c) isolating the polypeptide attached to the silicon from steps a) and / or b);
d) identifying the isolated silicon adhesion polypeptide;
Including a method.
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。 3. The method of claim 1 or 2, further comprising the step of: e) identifying a polypeptide suitable as a marker polypeptide for detecting a response response to silicon in a mammal.
ｅ’）前記シリコンを被覆する前記タンパク質性フィルムから同定される前記タンパク質の分離から誘導されるポリペプチドパターンを創傷液または血清から溶出されるシリコン接着ポリペプチドの分離から誘導されるポリペプチドパターンと比較するステップと、
ｅ’’）前記パターン内の目的のスポットを選択しかつ分析するステップと、
を含む、請求項３に記載の方法。 Step e)
e ′) a polypeptide pattern derived from the separation of the protein identified from the proteinaceous film covering the silicon and a polypeptide pattern derived from the separation of a silicon adhesion polypeptide eluted from wound fluid or serum; A step of comparing;
e '') selecting and analyzing a target spot in the pattern;
The method of claim 3 comprising:
ａ）少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体を含有すると思われる、診断対象の哺乳類に由来する試料を提供するステップと、
ｂ）前記試料中での前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその前記機能変異体の存在または発現における変化を検出するステップと、
ｃ）前記哺乳類の前記シリコンに対する応答反応について、前記少なくとも１種のシリコン接着ポリペプチドまたはその機能変異体の存在または発現における変化から判定するステップと、
を含む、方法。 A method for detecting a response response to mammalian silicon comprising:
a) providing a sample from a mammal to be diagnosed that is thought to contain at least one silicon adhesion polypeptide or a functional variant thereof;
b) detecting a change in the presence or expression of the at least one silicon adhesion polypeptide or the functional variant thereof in the sample;
c) determining a response response of the mammal to the silicon from a change in the presence or expression of the at least one silicon adhesion polypeptide or functional variant thereof;
Including a method.
ａ）少なくとも１種のシリコンを前記哺乳類内に注入するステップと、
ｂ）請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法を用いて請求項６または請求項７に記載のシリコン接着ポリペプチドの存在または発現における変化を検出するステップと、
ｃ）場合によりステップｂ）を反復するステップと、
を含む、方法。 A method for monitoring the response of a mammal to silicon,
a) injecting at least one silicon into the mammal;
b) detecting a change in the presence or expression of the silicon adhesion polypeptide of claim 6 or claim 7 using the method of any one of claims 10 to 17;
c) optionally repeating step b);
Including a method.
ａ）シリコン接着ポリペプチドの接着特性に干渉すると思われる物質を提供するステップと、
ｂ）シリコンを提供するステップと、
ｃ）シリコン接着ポリペプチドを提供するステップと、
ｄ）前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着の分析により前記物質の干渉特性を分析するステップと、
を含み、
ここで、前記物質の存在下または不在下での前記シリコン接着ポリペプチドの前記シリコンに対する接着における変化がシリコン接着タンパク質および／またはポリペプチドのシリコンに対する結合に干渉する物質について示唆している、方法。 A method for screening for substances that interfere with the binding of silicon adhesion proteins and / or polypeptides to silicon comprising:
a) providing a material that appears to interfere with the adhesive properties of the silicon adhesive polypeptide;
b) providing silicon;
c) providing a silicon adhesion polypeptide;
d) analyzing the interference properties of the substance by analyzing the adhesion of the silicon adhesion polypeptide to the silicon in the presence or absence of the substance;
Including
Wherein the change in adhesion of the silicon adhesion polypeptide to the silicon in the presence or absence of the substance suggests a substance that interferes with the binding of silicon adhesion proteins and / or polypeptides to silicon.
ａ）哺乳類が有する細胞の血清または創傷液の試料を提供するステップと、
ｂ）シリコンを提供するステップと、
ｃ）前記シリコンに接着する前記血清または創傷液から細胞の量および数を分析するステップと、
を含む、方法。 A method for detecting cell adhesion to silicon comprising:
a) providing a sample of serum or wound fluid of cells possessed by a mammal;
b) providing silicon;
c) analyzing the amount and number of cells from the serum or wound fluid adhering to the silicone;
Including a method.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06001053A EP1811297A1 (en) | 2006-01-18 | 2006-01-18 | Test systems for the analysis of polypeptides and cells adhering to silicones |
| US76042606P | 2006-01-20 | 2006-01-20 | |
| PCT/EP2007/000442 WO2007082757A2 (en) | 2006-01-18 | 2007-01-18 | Test systems for the analysis of polypeptides and cells adhering to silicones |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009524031A true JP2009524031A (en) | 2009-06-25 |
Family
ID=38042562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008550689A Pending JP2009524031A (en) | 2006-01-18 | 2007-01-18 | Test system for analyzing polypeptides and cells that adhere to silicon |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2009524031A (en) |
| AU (1) | AU2007207089A1 (en) |
| CA (1) | CA2636353A1 (en) |
| WO (1) | WO2007082757A2 (en) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040234602A1 (en) | 2001-09-21 | 2004-11-25 | Gina Fischer | Polymer release system |
| WO2003024430A1 (en) | 2001-09-21 | 2003-03-27 | Egalet A/S | Morphine polymer release system |
| EP1610767B1 (en) | 2003-03-26 | 2011-01-19 | Egalet A/S | Morphine controlled release system |
| EA022609B1 (en) | 2007-02-12 | 2016-02-29 | А1М Фарма Аб | Use of free fetal haemoglobin as a marker for preeclampsia |
| NZ580972A (en) | 2007-06-04 | 2012-02-24 | Egalet Ltd | Controlled release pharmaceutical compositions for prolonged effect |
| ES2543735T3 (en) * | 2007-10-22 | 2015-08-21 | Becton Dickinson And Company | Medical articles coated with organopolysiloxane containing a protein solution and a non-ionic surfactant |
| CA2751667C (en) | 2009-02-06 | 2016-12-13 | Egalet Ltd. | Immediate release composition resistant to abuse by intake of alcohol |
| BR102014004679B1 (en) * | 2014-02-27 | 2021-04-20 | Fundação Oswaldo Cruz | predictive method for differential diagnosis of meningitis in vitro, use of biomarker proteins, and, kit for differential diagnosis of meningitis to determine whether an individual has bacterial meningitis or viral meningitis |
| CN104193817B (en) * | 2014-09-05 | 2016-09-14 | 桂林英美特生物技术有限公司 | The purifying process of human retinol-binding protein and the preparation technology of polyclonal antibody thereof |
| WO2017137570A1 (en) | 2016-02-10 | 2017-08-17 | Becton Dickinson France | Method to evaluate the stability of a protein-based formulation |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11513802A (en) * | 1995-10-20 | 1999-11-24 | ザ アドミニストレイターズ オブ ザ テューレイン エデュケイショナル ファンド | Method for detecting anti-polymer antibody and diagnostic test kit useful for assisting diagnosis of silicone-related disease (SRD) |
-
2007
- 2007-01-18 AU AU2007207089A patent/AU2007207089A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-18 WO PCT/EP2007/000442 patent/WO2007082757A2/en active Application Filing
- 2007-01-18 CA CA002636353A patent/CA2636353A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-18 JP JP2008550689A patent/JP2009524031A/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11513802A (en) * | 1995-10-20 | 1999-11-24 | ザ アドミニストレイターズ オブ ザ テューレイン エデュケイショナル ファンド | Method for detecting anti-polymer antibody and diagnostic test kit useful for assisting diagnosis of silicone-related disease (SRD) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2636353A1 (en) | 2007-07-26 |
| WO2007082757A3 (en) | 2007-09-20 |
| WO2007082757A2 (en) | 2007-07-26 |
| AU2007207089A1 (en) | 2007-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009524031A (en) | Test system for analyzing polypeptides and cells that adhere to silicon | |
| US6649743B1 (en) | Monoclonal antibody against estrogen stimulated leucine aminopeptidase | |
| AU2014366827A1 (en) | Method of diagnosis and treatment | |
| AU2012219184A1 (en) | Method of diagnosing cancer and diagnosis kit using measurement of NK cell activity | |
| KR20110000548A (en) | Composition and method for diagnosis or detection of gastric cancer | |
| CN111316099A (en) | Proteoliposome-based ZNT8 autoantigen for diagnosis of type 1 diabetes | |
| US20070099245A1 (en) | Assays for neutralizing antibodies | |
| WO2012175602A2 (en) | Elisa for calprotectin | |
| JP5002001B2 (en) | Method for measuring insulin receptor α-subunit | |
| US20110135606A1 (en) | Test systems for the analysis of polypeptides and cells adhering to silicones | |
| Katoh et al. | A novel immunoassay of smooth muscle myosin heavy chain in serum | |
| Ádány et al. | Factor XIII of blood coagulation as a nuclear crosslinking enzyme | |
| JPWO2008001944A1 (en) | Reagent for detecting autoantibody and diagnostic kit for autoimmune disease | |
| JP6667437B2 (en) | Identification of novel polypeptide hormones for maintaining optimal weight and blood glucose | |
| CN1316249C (en) | Enzyme-linked assay kit and producing process thereof | |
| Mándi et al. | Cytokine production and antibodies against heat shock protein 60 in cardiomyopathies of different origins | |
| CN113508300A (en) | Novel biomarkers for human alzheimer's disease | |
| JP2000512123A (en) | Nephropathy-related immunoglobulin G and antibodies therefor | |
| CN103797369B (en) | The assay method of anti-WT1 antibody | |
| CN110325547A (en) | New amyloid protein beta oligomers specific binding molecules | |
| JP2019053068A (en) | Sensitive multiplex immunoassay for soluble fibroblast growth factor receptors | |
| JP2009244125A (en) | Composition for testing nerval disorder, kit and method | |
| JP2003135076A (en) | Collapsin-response mediator protein 1 (crmp-1) | |
| Ropers et al. | Enzyme immunoassay for the measurement of human tenascin-C on the Bayer Immuno 1™ analyzer | |
| JP2010085375A (en) | Method, composition and kit for examining diabetic complication accompanying cell proliferation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100108 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110316 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20110721 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110727 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120110 |