JP2009514877A - siRNAの送達媒体としてのペプチド−ダイザ基質RNA抱合体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
配列番号2は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKKである。
配列番号3は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVDである。
配列番号4は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAPである。
配列番号5は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列AAVLLPVLLPVLLAAPである。
配列番号6は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列VTVLALGALAGVGVGである。
配列番号7は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GALFLGWLGAAGSTMGAである。
配列番号8は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列MGLGLHLLVLAAALQGAである。
配列番号9は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPである。
配列番号10は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKILである。
配列番号11は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列TPPKKKRKVEDPKKKKである。
配列番号12は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RRRRRRRである。
配列番号13は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KLALKLALKALKAALKLAである。
配列番号14は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GLFGAIAGFIENGWEGである。
配列番号15は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列FFGAVIGTIALGVATAである。
配列番号16は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列FLGFLLGVGSAIASGVである。
配列番号17は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GVFVLGFLGFLATAGSである。
配列番号18は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GAAIGLAWIPYFGPAAである。
配列番号19は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMCである。
配列番号20は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVCである。
配列番号21は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVCである。
配列番号22は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列ACSCPNCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFICである。
配列番号23は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLCである。
配列番号24は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVCである。
配列番号25は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVCである。
配列番号26は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFACである。
配列番号27は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRである。
配列番号28は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GKINLKALAALAKKILである。
配列番号29は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RVIRVWFQNKRCKDKKである。
配列番号30は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQである。
配列番号31は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSKである。
配列番号33は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号35は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−AUGGUGUGGGUGAGGAGCACAUGGGUG−3’である。
配列番号36は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT−3’である。
配列番号37は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号41は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列RKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号42は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号43は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号44は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号45は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号46は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号47は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号48は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列SYSVYVYKVLKQである。
配列番号49は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列VYVYKVLKQである。
配列番号50は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列YKVLKQである。
配列番号51は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KVLKQである。
配列番号52は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ペプチドのアミノ酸配列KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQである。
配列番号53は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GCCUGUACCUCAUCUACUCUU−3’である。
配列番号54は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3’−UUCGGACAUGGAGUAGAUGAG−5’である。
配列番号55は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GCCUCUUCUCCUUCCUGAUCGUGdGdC−3’である。
配列番号56は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3’−GUCGGAGAAGAGGAAGGACUAGCACCG−5’である。
配列番号57は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GCCUGCUGCACUUUGGAGUGAUCdGdG−3’である。
配列番号58は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3’−GACGGACGACGUGAAACCUCACUAGCC−5’である。
配列番号59は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT−3’である。
配列番号60は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3’−GUGGGUACACGAGGAGUGGGUGUGGUA−5’である。
配列番号61は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−ACCUCAUCUACUCCCAGGUCCUCdTdT−3’である。
配列番号62は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列3’−CAUGGAGUAGAUGAGGGUCCAGGAGAA−5’である。
配列番号63は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GCCUGUACCUCAUCUACUCCCAGGUCC−3’である。
配列番号64は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GGUCCUGGGAGUAGAUGAGGUACAGGCUU−3’である。
配列番号65は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−AGACAGCGACCAAAAGAAUUCGGdAdU−3’である。
配列番号66は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−AUCCGAAUUCUUUUGGUCGCUGUCUdTdT−3’である。
配列番号67は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−AUGAAGAUCUGUUCCACCAUUGAdAdG−3’である。
配列番号68は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−CUUCAAUGGUGGAACAGAUCUUCAUdTdT−3’である。
配列番号69は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GAUCUGUUCCACCAUUGAAGAACdUdC−3’である。
配列番号70は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GAGUUCUUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT−3’である。
配列番号71は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−UUGAGGAGUGCCUGAUUAAUGAUdCdC−3’である。
配列番号72は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GGAUCAUUAAUCAGGCACUCCUCAAdTdT−3’である。
配列番号73は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG−3’である。
配列番号74は、本明細書で述べるsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列5’−CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT−3’である。
配列番号75は、本明細書の表2に示すsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的な25塩基長のB鎖配列のヌクレオチド配列5’−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG−3’である。
配列番号76は、本明細書の表2に示すsiRNA−ペプチド抱合体を生成するのに適した典型的な27塩基長のA鎖配列のヌクレオチド配列3’−TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC−5’である。
配列番号77乃至132は、本明細書の表2に示すギャップ付きsiRNA−ペプチド抱合体を生成するための典型的なポリヌクレオチドのA鎖、B1鎖、及びB2鎖のヌクレオチド配列である。
配列番号34、38乃至40、133、及び166は、本明細書で述べるニック付きsiRNA−ペプチド抱合体を生成するための典型的なポリヌクレオチドのA鎖、B1鎖、及びB2鎖のヌクレオチド配列である。
本発明の特定の様態では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ヒストンタンパク質、又はそのポリペプチド若しくはペプチド断片、誘導体、類似体、若しくは抱合体である。これらの様態の範囲内において、siNAは、例えばヒストンH1、ヒストンH2A、ヒストンH2B、ヒストンH3、若しくはヒストンH4などの1種類以上のヒストン、又は典型的にはもとのヒストンタンパク質の少なくとも5乃至10個若しくは10乃至20個の連続する残基であるヒストンタンパク質の部分配列を少なくとも含む、それらの1種類以上のポリペプチド断片若しくは誘導体などといった1種類以上の完全長型ヒストンタンパク質、又はヒストンタンパク質の部分配列に少なくとも一部対応するポリペプチドと混合、複合体化、又は抱合している。
1.TATタンパク質導入ドメイン(PTD)(配列番号1)KRRQRRR;
2.ペネトラチン(penetratin)PTD(配列番号2)RQIKIWFQNRRMKWKK;
3.VP22 PTD(配列番号3)DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;
4.カポジFGFシグナル配列(配列番号4)AAVALLPAVLLALLAP;及び(配列番号5)AAVLLPVLLPVLLAAP;
5.ヒトβ3インテグリンシグナル配列(配列番号6)VTVLALGALAGVGVG;
6.gp41融合配列(配列番号7)GALFLGWLGAAGSTMGA;
7.カイマンクロコディルス(caiman crocodylus)のIg(v)軽鎖(配列番号8)MGLGLHLLVLAAALQGA;
8.hCT−誘導性ペプチド(配列番号9)LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;
9.トランスポータン(配列番号10)GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;
10.ロリゴマ(loligomer)(配列番号11)TPPKKKRKVEDPKKKK;
11.アルギニンペプチド(配列番号12)RRRRRRR;並びに
12.両親媒性モデルペプチド(配列番号13)KLALKLALKALKAALKLA;
が挙げられる。
1.インフルエンザHA2(配列番号14)GLFGAIAGFIENGWEG;
2.センダイF1(配列番号15)FFGAVIGTIALGVATA;
3.呼吸器系シンチウムウィルスF1(配列番号16)FLGFLLGVGSAIASGV;
4.HIV gp41(配列番号17)GVFVLGFLGFLATAGS;及び
5.エボラGP2(配列番号18)GAAIGLAWIPYFGPAA;
が挙げられる。本発明のさらに追加的な様態の範囲内では、本発明の方法及び組成物の範囲内において、ポリペプチド−siNA複合体形成を促進、及び/若しくはsiNAの送達を促進するDNA結合ドメイン又はモチーフが取り込まれたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが提供される。ここで言うDNA結合ドメインの典型例としては、以下の表1に示すDNA結合性制御タンパク質及びその他のタンパク質で述べるように、様々な「ジンクフィンガー」ドメインが挙げられる(例えば、Simpsonら,J. Biol. Chem. 278: 28011-28018, 2003を参照)。
**表1に示す配列、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、DrosBtd、DrosSp、CeT22C8.5、及びY4pB1A.4は、本明細書ではそれぞれ配列番号19、20、21、22、23、24、25、及び26と定める。
より詳細な態様では、1又は2種類以上のsiRNA及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを具える混合物、複合体、及び/又は抱合体を、任意にLIPOFECTIN(登録商標)などのカチオン性脂質と組み合わせてもよい(例:混合又は複合体化)。この点で、siRNA単独と複合体化又は抱合されたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、RNAiによるジーンサイレンシングを媒介するのに十分なsiNAの送達をもたらすということが、予想外なことに本発明において開示される。本発明ではさらに、siRNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体又は抱合体は、リポフェクティンなどのカチオン性脂質と混合又は複合体化されると、siNA送達及びジーンサイレンシングを媒介する活性がより高くなることも開示される。
典型的な様態では、本開示は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合し、複合体化し、又は抱合した短鎖干渉核酸(siNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(mRNA)、又は短鎖ヘアピンRNA(shRNA)などの低分子核酸分子を具える組成物を特徴とする。
本明細書で述べる特定の典型的なギャップ付き二重鎖siRNA分子は、25−merのセンスB鎖配列5’−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG−3’(配列番号75)及び27−merのアンチセンスA鎖配列3’−TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC−5’(配列番号76)に基づいている。代替的な典型的なギャップ付き二重鎖siRNA分子は、25−merのアンチセンスB鎖配列5’−GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG−3’(配列番号75)及び27−merのセンスA鎖配列3’−TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC−5’(配列番号76)に基づいている。
以下に示す配列中の「p」は、5’リン酸がB2鎖に結合したRNA鎖内のニックを表す。以下に示す配列中の「*」は、B2鎖に結合した5’リン酸のないRNA鎖内のニックを表す。「p」及び「*」はニックの位置も示す。すべての場合において、A鎖は無処置(ニックなし)であり、A鎖上に見られる隙間はsiRNA分子の正しい配列アラインメント(配列相同性による)を保持するためのものである。以下に示す配列中の「T(太字イタリック体)」は、その位置にリボチミジン(rT)分子が存在することを示す。以下に示す配列中の「T(太字体)」は、その位置にデオキシリボチミジン(dT)分子が存在することを示す。連続鎖、つまりギャップもニックもない鎖には下線を付してある。
1.コントロールdsRNA
2.5’リン酸を持たないニック付きセンス鎖
3.5’リン酸を持つニック付きセンス鎖
4.二本鎖ともにrT分子で完全修飾した、5’リン酸を持つニック付きセンス鎖
5.二本鎖ともにrT分子で完全修飾した、5’リン酸を持たないニック付きセンス鎖
6.アンチセンス鎖をrT分子で完全修飾し、センス鎖は未修飾(コントロール)の、5’リン酸を持たないニック付きアンチセンス鎖
7.アンチセンス鎖をrT分子で完全修飾し、センス鎖は未修飾(コントロール)の、5’リン酸を持つニック付きアンチセンス鎖
8.ID:NickedS−WT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖
9.ID:NickedS−WT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖;B2は5’末端をリン酸エステル化
10.ID:NickedS−RT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖;rTにより完全修飾
11.ID:NickedS−RT:ニック付きセンス鎖を持つ二重鎖;B2は5’末端をリン酸エステル化;rTにより完全修飾
12.ID:NickedA−RT:ニック付きアンチセンス鎖を持つ二重鎖;rTにより完全修飾
13.ID:NickedA−RT:ニック付きアンチセンス鎖を持つ二重鎖;B2は5’末端をリン酸エステル化;rTにより完全修飾
別の様態では、本開示にかかるギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子は、リンカ分子を用いて「閉じる」ことができる。得られた分子は非常により安定となる、すなわちより高いTmを有して宿主細胞内での分解に対する耐性が高まるはずである。
限定されない例において、核酸分子中に化学修飾ヌクレオチドを導入することは、外部から送達された天然RNA分子に固有のインビボでの安定性及び生体利用度の潜在的な限界を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子は血清中の半減期が長くなる傾向にあるため、化学修飾核酸分子を用いることで、ある治療効果のための特定の核酸分子の投与量を抑えることが可能となる。さらに、特定の化学修飾によって、特定の細胞若しくは組織を標的にすること、及び/又は核酸分子の細胞取り込みを高めることにより核酸分子の生体利用度を向上させることができる。従って、化学修飾核酸分子の活性が、例えば全RNA核酸分子等の天然の核酸分子と比較して低下したとしても、分子の安定性及び/又は送達が向上したことにより、修飾核酸分子全体としての活性は天然の核酸分子よりも高めることができる。天然の未修飾siNAとは異なり、化学修飾siNAはヒトのインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限に抑えることもできる。
本開示の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体を用いて、本明細書で述べる若しくは本技術分野で知られる疾患又は状態を治療することができる。特定の疾患又は状態を治療するために、本発明の送達促進ポリペプチド/siNA抱合体を、個別に若しくは一つ以上の化合物と組み合わせて、治療に適した条件下で患者に投与するか又は当業者にとって明らかな他の適切な細胞へ投与するかができる。
使用したプロトコル及び方法
siRNA/ポリペプチド抱合体の合成
ポリペプチド及びRNAは両方とも、標準的固相合成法によって調製される。ポリペプチド及びRNA分子は、特定の部位で官能化してお互いが共有結合できるようにしなければならない。ポリペプチドについては、N−末端が3−マレイミドプロピオン酸で官能化される。しかし、ブロモ部位又はヨードアセチル部位等の他の官能基も機能することが認知されている。RNA分子については、センス鎖の5’末端又はアンチセンス鎖の5’末端が1−O−ジメトキシトリチル−へキシル−ジスルフィドリンカで官能化される。
オリゴCN950asenを、2mLのバッファA(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド)を添加した水0.5mLに溶解した。続いてペプチド(PN0277)を添加して析出物を形成させ、さらに2MのTEAAバッファ1mLを加えて析出物を溶解した。反応が完了した時点で溶媒を減圧留去し、得られた固体をバッファA(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド)中に溶解した。その物質をAmersham Resource Qカラムへローディングし、5カラム分の体積のバッファAを用いて6mL/分で洗浄した。分離は、15カラム分の体積のバッファB(20mMTris−HCl、pH6.8、50%ホルムアミド、1M NaCl)を用い、6mL/分で15から60%の直線勾配を流すことで完了した。精製した抱合体を、slidalyzer透析カセット(3.5K MWCO)を用いてPBSに対して脱塩した。抱合体の量は、λ=260nmでのモル吸光度係数の算出値に基づいて分光測定により定量した。抱合体の純度はRP−HPCLによって確認した。ペプチド抱合体のアンチセンス鎖と、相補的なアンチセンス鎖とを、50mM酢酸カリウム、1mM酢酸マグネシウム、及び15mMのHEPES(pH7.4)中でアニーリングさせ、90℃で2分間加熱し、続いて37℃で1時間インキュベートした。二本鎖RNA抱合体の形成を、非変性(15%)ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色により確認した。
マウス尾線維芽細胞はC57BL/6Jマウス又はtg197hTNF−αトランスジェニックマウスの尾から得た。尾を切り離し、剃刀の刃で切って小片とした。この小片をPBSで3回洗浄した後、0.5mg/mlのコラゲナーゼ、100ユニット/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンと共に37℃で振とう器中でインキュベートして組織を破壊した。次に尾の小片を補助剤(上記の通り)含有DMEM培地中で培養した。9L/lacZ細胞は恒常的にLacZを発現するラット膠肉腫維芽細胞であり、ATCC(#CRL−2200)より入手してこれも補助剤(上記の通り)含有DMEM培地中で培養した。
健康な提供者からのヒトの新鮮血サンプルをGolden West Biologicals社(カリフォルニア州、テメキュラ)より購入した。単球の単離のために、血液サンプルは入手後直ちにPBSにより1:1の比率で希釈した。まず全血から末梢血液単核細胞(PBMC)をFicoll(Amersham社、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)勾配法により単離した。さらにMiltenyiCD14ポジティブ選別キット(MILTENYI BIOTEC GmbH社、ドイツ)を用い、製造元の説明書に従って単球をPBMCから分離した。単球試料の純度は、細胞を抗CD14抗体(BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ)で染色後、フローサイトメトリで評価したところ95%超であった。精製したヒト単球は導入及びノックダウンアッセイの前に、完全培地(上述)中で一晩保持した。
0.1乃至1.0ng/mlのリポ多糖、LPS(Sigma社、ミズーリ州、セントルイス)を細胞培養液に添加して腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の生成を刺激することにより、ヒト単球の活性化を行った。細胞はLPSと共に3時間インキュベートした後に回収し、Quantigeneアッセイ(Genospectra社、カリフォルニア州、フリーモント)を用いて製造元の説明書に従ってmRNAレベルを測定した。導入後のTNF−αレベルの変化は、ELISA(BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ)を用いて製造元のプロトコルに従って測定した。
TNF−αノックダウン実験のために、単球を、OptiMEM(Invitrogen社、米国、カールズバッド)を用いた96ウェルプレート中へ、100K細胞/100μl/ウェルで播種した。ペプチドとsiRNAをOptiMEM中で5分間複合体化させ、次にウシ胎児血清(FBS)を複合体に添加してFBS最終濃度を3%とした。Lipofectamine 2000(Invitrogen社、カリフォルニア州、カールズバッド)による細胞のトランスフェクションについては、製造元のプロトコルに従った。トランスフェクションはすべて、細胞を37℃、5%CO2下で3時間インキュベートし、続いてトランスフェクション試薬を除去し、完全培地を補充して一晩培養することで行った。bDNAアッセイ(Quantigene assay、Genospectra社、カリフォルニア州、フリーモント)は、製造元の説明書に従って行った。ELISAアッセイについては、細胞培地から採取したサンプルをそのまま使用した。トランスジェニックマウスを用いた実験の分析に関しては、血漿サンプルを眼窩採血で採取した全血から分離した。hTNF−αの血漿中レベルを、ELISAにより、1:2の希釈で製造元の説明書(R&D systems社、ミネソタ州、ミネアポリス)に従って定量した。
フローサイトメトリ分析は、Beckman社のCoulter FC500セルアナライザー(カリフォルニア州、フラートン)を用いて行った。装置は、用いた蛍光プローブ(siRNAにはFAM又はCy5、CD14にはFITC又はPE)に合わせて調節した。細胞生存率及び細胞毒性の指標として、ヨウ化プロピジウム(Fluka社、ミズーリ州、セントルイス)及びアネキシンV(BD Biosciences社、カリフォルニア州、サンノゼ)を用いた。
siRNA及びsiRNA/ポリペプチド抱合体をダイザエンドヌクレアーゼ(Stratagene社、カタログ番号240100)と共にインキュベートし、これらが分解されやすいかどうかを調べた。製造元のプロトコルに従った。簡潔に述べると、分解反応は全体積10μLで行い、37℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、分解混合物のサンプル2μLを2×ローディング色素(loading dye)と混合し、尿素含有15%TBE及び15%TBEによる非変性ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動で分析した。
LC−MSは、2.5μm、2.1×50mmのXTerra C18カラム(Waters Corp.社)を用いて65℃で行った。移動相は、100mMヘキサフルオオロイソプロパノール及び7mMトリエチルアミンであり、溶出は100%メタノールで行った。勾配は、40分間で5から16%とした。溶出液はPDA中へ分割し、Waters社のシングル四重極型質量分析器Micromass ZQ ESIを負イオンモードで作動させた。キャピラリー電圧は3.0kV、コーン電圧は45Vであった。脱溶媒は600L/hの窒素中、300℃で行った。イオン源は90℃に維持した。測定用のスキャン速度は1秒あたり1000乃至2000m/zであった。
hTNF−αノックダウン活性のためのスクリーニングされたダイザエンドヌクレアーゼ基質siRNA
本実施例では、hTNF−α遺伝子発現レベルを効果的に低下させるためにスクリーニングされた本発明の典型的siRNAを例示する。hTNF−α遺伝子は、ヒトやその他の哺乳類の対象中で過剰発現すると関節リウマチ(RA)の発症と進行を媒介することが示唆されているため、これを標的とすることは重要である。従って、hTNF−α遺伝子を標的にしてその発現を低下させることは、RAの治療に役立てることができる。
siRNA/ポリペプチド抱合体によるヒト単球中hTNF−α mRNAレベルの効果的な低下
本例は、本発明の典型的なダイザ基質siRNAが、本発明の典型的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合した場合に、hTNF−α mRNAの発現レベルを効果的に低下させたことを示すものである。siRNA/ポリペプチド抱合体のノックダウン活性を以下の表5にまとめた。
PN277
NH2−KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−アミド(配列番号37)
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したsiRNAのダイザエンドヌクレアーゼによるプロセッシング
この実施例は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと抱合したsiRNAが、ダイザエンドヌクレアーゼ(RNaseIII)によって分解されることを示すものである。本例では、実施例3で示した3種類のsiRNA/ポリペプチド抱合体(Qneg、dsCoP277nfR950、及びdsCoP277nfR952)を、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下又は非存在下でインキュベートした。さらに、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのないsiRNA二重鎖N163も、ダイザエンドヌクレアーゼの存在下又は非存在下でインキュベートした。目的は、siRNAがダイザによる分解の標的であるかどうか、及びポリペプチドによるsiRNA RISCのローディング阻害を防ぐために不可欠である、共有結合しているsiRNA二重鎖からのポリペプチドの除去が行われるかどうか、を調べることであった。RISC複合体を阻害すると、標的遺伝子の転写後ジーンサイレンシングを妨げることになる。
PN857
Mal−KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−アミド(配列番号52)
インターフェロン応答を誘起しないダイザ基質siRNA/ポリペプチド抱合体
本実施例は、本発明の典型的なsiRNA/ポリペプチド抱合体が、ヒト単球とインキュベートされた場合にインターフェロン反応を誘起しないことを示すものである。インターフェロン反応性は、siRNAでトランスフェクトされた細胞に起こり得る副作用である。従って、siRNA/ポリペプチドdsCoP277nfR950(アンチセンス鎖結合)及びdsCoP277nfR952(センス鎖結合)がインターフェロン反応を誘起するかどうかを評価するためにインビトロでの実験を行った。Qneg siRNA/ポリペプチド抱合体(CoP840)をネガティブコントロールとし、インターフェロン−1(IFN−1)をポジティブコントロールとした。各抱合体は1nM、10nM、100nM、及び200nMの濃度で実験を行った。インターフェロン反応性のアッセイは分子マーカーMIP1αを用いて行った。予想通り、Qneg siRNA/ポリペプチド抱合体はMIP1αの発現を誘起せず、ポジティブコントロールであるIFN−1は大量のMIP1αの発現を誘起した。抱合体dsCoP277nfR950及びdsCoP277nfR952は、Qneg siRNA/ポリペプチドのネガティブコントロールが誘起したMIP1αのレベルと同等であり、このことはこれらの抱合体が、有効なTNF−αのノックダウン活性を示す濃度(実施例3の表5参照)においてインターフェロン反応を誘起しないことを示している。
24ウェルプレートを用いたベロ細胞トランスフェクション
この実施例は、siRNAを標的細胞へ導入する方法を開示するものである。
血球凝集アッセイ(HAアッセイ)
この例は、ウィルス感染細胞から産生されたウィルスの力価を算出するために用いることができる血球凝集アッセイを開示するものである。
24ウェルプレートによるベロ細胞トランスフェクション/インフェクション力価ノックダウンスクリーンニングアッセイ
本例は、本発明のギャップ又はニックを有する二重鎖siRNAが1又は2種類以上のウィルス標的遺伝子の発現を下方制御することができるかどうかを調べるために用いることができるアッセイを開示するものである。
ノックダウン活性でスクリーニングしたインフルエンザ特異的ダイザエンドヌクレアーゼ基質siRNA
この実施例は、感染したベロ細胞中のインフルエンザウィルス力価の効果的な低下に基づいてスクリーニングした、本明細書で示す典型的なインフルエンザ特異的siRNAを例示するものである。非標的コントロールsiRNAでトランスフェクトした細胞のウィルス力価と比較して、インフルエンザ特異的siRNAでトランスフェクトした細胞のウィルス力価が低下したということの意味は、それが、インフルエンザ特異的siRNA分子が標的ウィルス遺伝子又は標的遺伝子の発現を阻害したことを示すということである。
Claims (67)
- 組成物において:
(a)二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、当該鎖が約25乃至約30ヌクレオチドの同一又は異なる長さを有する分子と;
(b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドであって、アミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を含むペプチドと;
を具える組成物において、前記dsRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 - 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子がsiRNAであることを特徴とする組成物。
- 請求項2に記載の組成物において、前記siRNAが、ヒトTNF−α遺伝子の核酸配列の一部と相同的な核酸配列を含むことを特徴とする組成物。
- 請求項2に記載の組成物において、前記siRNAが、ウィルス遺伝子の核酸配列の一部と相同的な核酸配列を含むことを特徴とする組成物。
- 請求項4に記載の組成物において、前記ウィルス遺伝子の供給源がインフルエンザウィルスであることを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物が更に担体を具えることを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子が、2個のヌクレオチドを含む一本鎖3’アンチセンス鎖オーバハングを更に具えることを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子が、2個のヌクレオチドを含む一本鎖3’センス鎖オーバハングを更に具えることを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子がオーバハングを有しないことを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記鎖が、約25乃至約29ヌクレオチドの同一又は異なる長さを有することを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記dsRNA分子がセンスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖からなり、前記ペプチドが前記アンチセンスRNA鎖の5’末端に抱合されることを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記ペプチドの前記アミノ酸配列が:
KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号33);
KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号42);
VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号43);
AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号44);
KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号45);
KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号46);
KRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号47);
RKESYSVYVYKVLKQ(配列番号41);
SYSVYVYKVLKQ(配列番号48);
VYVYKVLKQ(配列番号49);
YKVLKQ(配列番号50);
KVLKQ(配列番号51);
からなる群から選択されることを特徴とする組成物。 - 請求項1に記載の組成物において、前記ペプチドが動物の細胞と結合する分子と抱合していることを特徴とする組成物。
- TNF−αに関連する炎症を回復させるための請求項1乃至3又は請求項6乃至13のいずれか1項に記載の組成物の使用において、回復する量の前記組成物を動物へ投与するステップを具えることを特徴とする使用。
- 動物のTNF−αに関連する炎症を回復させる薬物の製造における請求項1乃至3又は請求項6乃至13のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 請求項14又は15に記載の使用において、前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする使用。
- 請求項14又は15に記載の使用において、前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする使用。
- 炎症回復のために動物の遺伝子発現を阻害する医薬組成物の使用において、二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を前記動物へ投与するステップを具え、前記医薬組成物が前記dsRNA分子とペプチドを具え、前記dsRNA分子が約25乃至約30の塩基対を具え、前記ペプチドが約5乃至約40個のアミノ酸を具え、かつ、アミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を具え、前記dsRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする使用。
- 炎症回復のために動物の遺伝子発現を阻害する薬物の製造における二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子及びペプチドを具える医薬組成物の使用において、前記dsRNA分子が約25乃至約30の塩基対を具え、前記ペプチドが約5乃至約40個のアミノ酸を具え、かつアミノ酸配列KVLKQ(配列番号51)を具え、前記dsRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする使用。
- 請求項18又は19に記載の使用において、前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする使用。
- 請求項18又は19に記載の使用において、前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする使用。
- インフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させるための請求項1に記載の組成物の使用において、回復する量の前記組成物を動物へ投与するステップを具えることを特徴とする使用。
- 動物のインフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させる薬物の製造における請求項1に記載の組成物の使用。
- 組成物において:
(a)約15乃至約50個のヌクレオチドを具える第1のRNA鎖(A鎖)と、約1乃至約25個のヌクレオチドを具える第2のRNA鎖(B1鎖)と、約1乃至約25個のヌクレオチドを具える第3のRNA鎖(B2鎖)とを具える低分子抑制核酸(siRNA)分子であって:
前記siRNA分子がペプチドと抱合し;
前記B1鎖及び前記B2鎖が、前記A鎖の非オーバラップ領域と各々相補的であり;
第1の二重鎖領域(A:B1)が、前記B1鎖と前記A鎖とをアニーリングすることによって形成され;
第2の二重鎖領域(A:B2)が、前記B2鎖と前記A鎖とをアニーリングすることによって形成された;
低分子抑制核酸(siRNA)分子と;
(b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドであって、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合するペプチドと;
を具えることを特徴とする組成物。 - 前記A:B1二重鎖が、ニック又はギャップによって前記A:B2二重鎖から分離されており、前記ギャップが前記A:B1二重鎖と前記A:B2二重鎖との間に位置するA鎖内の少なくとも一つの不対ヌクレオチドから生ずることを特徴とする請求項24に記載の組成物。
- 前記A鎖、前記B1鎖、及び/若しくは前記B2鎖のいずれか又は両方の3’末端に1又はそれ以上の不対ヌクレオチドを更に具えることを特徴とする請求項25に記載の組成物。
- 前記A鎖が約18ヌクレオチド乃至約40ヌクレオチドであることを特徴とする請求項25乃至26のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記A鎖が約20ヌクレオチド乃至約32ヌクレオチドであることを特徴とする請求項27に記載の組成物。
- 前記A鎖が21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31ヌクレオチドであることを特徴とする請求項28に記載の組成物。
- 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で約15の塩基対乃至約40の塩基対を具えることを特徴とする請求項25乃至26のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で約18の塩基対乃至約35の塩基対を具えることを特徴とする請求項30に記載の組成物。
- 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で約20の塩基対乃至約30の塩基対を具えることを特徴とする請求項31に記載の組成物。
- 前記A:B1二重鎖及び前記A:B2二重鎖が、合計で21、22、23、24、25、26、27、28、又は29の塩基対を具えることを特徴とする請求項32に記載の組成物。
- 前記siRNA分子が、1ヌクレオチド乃至5ヌクレオチドである1又は2個の一本鎖3’オーバハングを具えることを特徴とする請求項26に記載の組成物。
- 前記A鎖がヌクレオチド配列3’TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5’(配列番号76)を具えることを特徴とする請求項25乃至26のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGAUCU3’(配列番号77)を具えることを特徴とする請求項22に記載の組成物。
- 前記B2鎖がヌクレオチド配列5’ACAAUG3’(配列番号90)を具えることを特徴とする請求項25に記載の組成物。
- 前記A:B1二重鎖が、ニックによって前記A:B2二重鎖から分離されていることを特徴とする請求項25に記載の組成物。
- 前記B2鎖が5’ヒドロキシル末端を有することを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGAUCUUAUUU3’(配列番号135)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CUUCGGAGTT3’(配列番号136)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3’(配列番号137)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTT3’(配列番号144)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CTTCGGAGTT3’(配列番号145)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3’(配列番号146)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAA3’(配列番号148)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’ATAAGATCCTT3’(配列番号149)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3’(配列番号147)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGAUCUUAUUU3’(配列番号153)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CUUCGGAGTT3’(配列番号154)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3’(配列番号155)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTT3’(配列番号159)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CTTCGGAGTT3’(配列番号160)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3’(配列番号161)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAA3’(配列番号166)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’ATAAGATCCTT3’(配列番号34)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3’(配列番号165)を具えることを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖が5’リン酸末端であることを特徴とする請求項38に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGAUCUUAUUU3’(配列番号138)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CUUCGGAGTT3’(配列番号139)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3’(配列番号140)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTT3’(配列番号141)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CTTCGGAGTT3’(配列番号142)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3’(配列番号143)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAA3’(配列番号151)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’ATAAGATCCTT3’(配列番号152)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3’(配列番号150)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGAUCUUAUUU3’(配列番号156)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CUUCGGAGTT3’(配列番号157)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3’(配列番号158)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTT3’(配列番号162)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’CTTCGGAGTT3’(配列番号163)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3’(配列番号164)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。
- 前記B1鎖がヌクレオチド配列5’CTCCGAAGAA3’(配列番号39)を具え、前記B2鎖がヌクレオチド配列5’ATAAGATCCTT3’(配列番号40)を具え、前記A鎖がヌクレオチド配列5’GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3’(配列番号38)を具えることを特徴とする請求項46に記載の組成物。
- 組成物において:
(a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3つの鎖を具え;
A:B1B2が合計で約14の塩基対乃至約24の塩基対を具え;
Aがセンス鎖を表し、B1B2がアンチセンス鎖を表し;
Aが約19ヌクレオチド乃至約25ヌクレオチドであり;
B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり;
B1及びB2を合わせた長さが約13ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドである;
siRNA分子と;
(b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと;
を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 - 組成物において:
(a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3つの鎖を具え;
A:B1B2が合計で約16の塩基対乃至約22の塩基対を具え;
Aがセンス鎖を表し、B1B2がアンチセンス鎖を表し;
Aが約19ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドであり;
B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり;
B1及びB2を合わせた長さが約13ヌクレオチド乃至約23ヌクレオチドである;
siRNA分子と;
(b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと;
を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 - 組成物において:
(a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3本の鎖を具え;
A:B1B2が合計で約14の塩基対乃至約24の塩基対を具え;
Aがアンチセンス鎖を表し、B1B2がセンス鎖を表し;
Aが約14ヌクレオチド乃至約24ヌクレオチドであり;
B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり;
B1及びB2を合わせた長さが約18ヌクレオチド乃至約24ヌクレオチドである;
siRNA分子と、
(b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと;
を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 - 組成物において:
(a)低分子抑制核酸(siRNA)分子であって、当該siRNAがA、B1、及びB2(A:B1B2)の3本の鎖を具え;
A:B1B2が合計で約14の塩基対乃至約22の塩基対を具え;
Aがアンチセンス鎖を表し、B1B2がセンス鎖を表し;
Aが約16ヌクレオチド乃至約22ヌクレオチドであり;
B1及びB2が各々個別に約1ヌクレオチド乃至約15ヌクレオチドであり;
B1及びB2を合わせた長さが約18ヌクレオチド乃至約22ヌクレオチドである;
siRNA分子と、
(b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと;
を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 - 組成物において:
(a)請求項24及び請求項53乃至56のいずれか1項に記載のsiRNA分子であって、当該siRNA分子が、レトロウィルス、呼吸器系ウィルス、ヒトメタニューモウィルス、ヒトパラインフルエンザウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群から選択される標的ウィルスの力価を低下させるのに有効であるsiRNA分子と;
(b)約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと;
を具え、前記siRNA分子が前記ペプチドと抱合していることを特徴とする組成物。 - 前記ペプチドが、KRRQRRR(配列番号1)、RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号2)、DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD(配列番号3)、AAVALLPAVLLALLAP(配列番号4)、AAVLLPVLLPVLLAAP(配列番号5)、VTVLALGALAGVGVG(配列番号6)、GALFLGWLGAAGSTMGA(配列番号7)、MGLGLHLLVLAAALQGA(配列番号8)、LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(配列番号9)、GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(配列番号10)、TPPKKKRKVEDPKKKK(配列番号11)、RRRRRRR(配列番号12)、KLALKLALKALKAALKLA(配列番号13)、GLFGAIAGFIENGWEG(配列番号14)、FFGAVIGTIALGVATA(配列番号15)、FLGFLLGVGSAIASGV(配列番号16)、GVFVLGFLGFLATAGS(配列番号17)、GAAIGLAWIPYFGPAA(配列番号18)、ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMC(配列番号19)、ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVC(配列番号20)、ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVC(配列番号21)、ACSCPNCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFIC(配列番号22)、RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLC(配列番号23)、TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVC(配列番号24)、RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVC(配列番号25)、PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFAC(配列番号26)、WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(配列番号27)、GKINLKALAALAKKIL(配列番号28)、RVIRVWFQNKRCKDKK(配列番号29)、GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(配列番号30)、GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(配列番号31)、KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号33)、KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号37)、RKESYSVYVYKVLKQ(配列番号41)、KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号42)、VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号43)、AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号44)、KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号45)、KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号46)、KRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号47)、SYSVYVYKVLKQ(配列番号48)、VYVYKVLKQ(配列番号49)、YKVLKQ(配列番号50)、KVLKQ(配列番号51)、及びKGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(配列番号52)からなる群から選択されるアミノ酸配列を具えることを特徴とする、請求項24及び請求項53乃至56のいずれか1項に記載の組成物。
- 標的ウィルスの力価を低下させるためのsiRNA分子の使用において:
(a)標的遺伝子が標的ウィルス遺伝子であるsiRNA媒介性ジーンサイレンシング用の標的遺伝子を選択するステップと;
(b)前記標的ウィルス遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシング用に適切なsiRNA分子を設計及び/又は合成するステップであって、前記siRNA分子の各々がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記siRNA二重鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現するステップと、
(c)前記siRNAを、約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドに抱合するステップと、
(d)前記siRNA分子を前記標的ウィルス遺伝子を発現する細胞へ投与するステップと;
を具え、前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する標的ウィルスのmRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。 - 標的ウィルス遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングによって標的ウィルスの力価を低下させる薬物を製造するためのsiRNA分子の使用において、前記siRNA分子の各々がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記siRNA二重鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一方に発現し;前記siRNAが約5乃至約40個のアミノ酸を含むペプチドと抱合し;前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する標的ウィルスのmRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。
- 内在性遺伝子の発現を低下させるためのsiRNA分子の使用において:
(a)siRNA媒介性ジーンサイレンシングのための標的遺伝子を選択するステップであって、当該標的遺伝子が内在性遺伝子であるステップと;
(b)前記内在性標的遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングのための適切なギャップ又はニックを有する二重鎖siRNA分子を設計及び/又は合成するステップであって、前記siRNA分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ若しくはニックが前記siRNA分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現するステップと;
(c)前記siRNAを約5乃至約40個のアミノ酸を具えるペプチドと抱合するステップと;
(d)前記siRNA分子を前記内在性標的遺伝子を発現する細胞へ投与するステップと;
を具え、前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する内在性標的mRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする方法。 - 内在性標的遺伝子のsiRNA媒介性ジーンサイレンシングによって内在性遺伝子の発現を低下させる薬物を製造するためのsiRNA分子の使用において、前記siRNA分子がギャップ又はニックを有する二重鎖を具え、前記ギャップ又はニックが前記siRNA分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに発現し;前記siRNAが約5乃至約40個のアミノ酸を含むペプチドと抱合し;前記siRNA分子とペプチドとの抱合体が前記対応する内在性標的mRNAと特異的に結合可能であり、これによって前記細胞内の発現レベルを低下させることを特徴とする使用。
- 医療に使用する、請求項1乃至13又は請求項24乃至58のいずれか1項に記載の組成物。
- TNF−αに関連する炎症を回復させる薬物として使用する、請求項1乃至3又は請求項6乃至13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記炎症が関節炎に生じていることを特徴とする請求項64に記載の組成物。
- 前記炎症が乾癬に生じていることを特徴とする請求項64に記載の組成物。
- インフルエンザウィルスに関連する感染症を回復させる薬物として使用する、請求項1に記載の組成物。
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