JP2009502242A - ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「ポリマーコーティン並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する、2005年7月20日に出願された、シリアルナンバー第60/700,860号を有する米国仮出願;「ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する、2005年9月22日に出願されたシリアルナンバー第60/719,351号を有する米国仮出願;及び「ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法」と題する2006年2月3日に出願されたシリアルナンバー第60/764,849号を有する米国仮出願の利益を主張する。
本発明は、非生分解性アミン提供ポリマーを含むコーティングを有するナノフィブリル構造体と、これらのコーティングを含む表面への細胞の付着を促進するための方法とに関する。本発明はまた、細胞を分化する方法と、これらのコーティングを有する細胞を維持するための方法とに関する。
本発明のいくつかの態様では、本発明のポリマーは、次の式:
−R1R2NR3R4
(式中、R1は下記:
R2は、C1〜C8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり;そして
R3及びR4は、共に上記窒素に結合し、そして個々に、H又はC1〜C6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである)
のペンダント型アミン含有基を含む。
第一に、ペンダント型アミン基及び潜在性反応性基を有するポリマーを含むコーティングを使用することにより、ナノフィブリル構造体に付着面(すなわち、細胞付着性に関する)を供給する非常に有効且つ効率的な方式が供給される。多くの場合には、上記ポリマーを含む液状組成物を、ナノフィブリル構造体に適用し、次いで処理し、それにより上記液状組成物により接触された上記ナノ繊維の一部又は全部の上にポリマー物質のコーティングを生成することができる。いくつかのケースでは、ポリマー物質のコーティングを、上記ナノフィブリル構造体の一部、例えば、上記培養工程の際、細胞が接触する部分に生成させることができる。これは、上記ナノ繊維を生成させるために用いられる物質が、必ずしも必要でないので、経済的に優位でありうる。
例示的なナノフィブリル構造体は、米国特許出願公開第2005/0095695号明細書に記載されている。
本明細書において、用語「ナノ繊維」は、約1000nm以下の直径を含む、ポリマーの細繊維(fine fiber)を意味する。
ナノ繊維は、ポリマーの形成及び堆積を制御するために、電界を用いるエレクトロスピニング方法により製造することができる。電位(electrical potential)を用いてポリマー溶液を注入する。当該電位により、エミッタの先端、例えば、ニードルからポリマー溶液流の放出をもたらす電荷不均衡が生ずる。上記電界内のポリマー噴出物は、接地した基材の方に向かい、その際、溶媒が蒸発して、そして繊維が生成する。得られた単一の連続フィラメントは、支持体上で不織布として集められる。ナノ繊維を製造するためのエレクトロスピニング法は、米国特許第4,650,506号明細書(Barris)及び同6,743,273号明細書(Chungら)に記載されている。
いくつかの態様では、上記ナノ繊維は、ポリマー物質を添加剤組成物と混合することにより生成されうる。上記添加剤組成物は、上記ポリマーのエレクトロスピニングにより当該添加剤を含まないポリマー溶液からエレクトロスピニングしたナノ繊維の集合体と比較して、より数が多い又はパーセンテージが高い薄い繊維を有するナノ繊維の集合体の製造物が生ずるように、上記ポリマーのパッキングに影響を及ぼしうる。ある実施形態では、上記ポリマー溶液は、約0.25%〜約15%w/wの添加剤組成物を含む。別の実施形態では、上記ポリマー溶液は、約1%〜約10%w/wの添加剤組成物を含む。いくつかの実施形態では、上記ポリマーのパッキングに影響を及ぼす添加剤組成物は、生活性分子、例えば、脂質を含む。いくつかの実施形態では、上記脂質は、リソホォスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール及びそれらの混合物からなる群から選択することができる。
縮合ポリマーの例には、ナイロン、例えば、ポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジポアミド及びポリヘキサメチレンドデカンジアミド、並びにポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジメチルシロキサン及びポリエーテルケトンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
上記非生分解性ポリマーは、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、又は上記ポリマーに由来するこれらのアミン基のペンダントの組み合わせを有することができる。
R1R2NR3R4
(式中、R1は、下記:
R2は、C1〜C8の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり;そして
R3及びR4は、両方とも上記窒素に結合し、そして個々に、H又はC1〜C6の直鎖若しくは分岐鎖のアルキルである)
を有する。
上記ポリマーに由来するペンダントと同様に、上記アミン含有基を、次の式:
P−[R1R2NR3R4]
(式中、Pは、上記ポリマー主鎖の一部である)
により表すことができる。
R2は、C2〜C4の直鎖又は分岐鎖のアルキルであり;そして
R3及びR4は、両方とも前記窒素に結合し、そしてそれぞれ、H、CH3又はC2H5である。
上記コーティングを、浸漬コーティング、インソリューション(in−solution)コーティング及びスプレーコーティングを含む任意の好適な方法により生成することができる。
本発明のコーティングされたナノフィブリル構造体はまた、クローン又は少数の細胞をコーティングされた製品容器に接種し、そして培養において、集密状態(confluent state)に到達する前の上記細胞を収穫、分割、又は希釈する前に、より長い期間を可能とする。
感光性ポリマー試薬
I.感光性ポリ(APMA)
感光性ポリ(アミノプロピルメタクリルアミド)(感光性ポリ(APMA)/APO2)の調製を、N−(3−アミノプロピル)メタクリルアミドヒドロクロリド(APMA−HCl)及びN−[3−(4−ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド(BBA−APMA)の共重合により実施した。これらの調製は、米国特許第5,858,653号明細書の、それぞれ、例2及び例3に記載されている。
10μg/mL〜20mg/mLの範囲にわたる上記感光性ポリ(APMA)ポリマーを有する種々のコーティング溶液を、水中で調製した。
感光性コラーゲン、感光性フィブロネクチン及び感光性ラミニンを、米国特許第5,744,515号明細書の例1に記載されるように調製した。
25μg/mL〜300μg/mLの範囲にわたる種々の感光性ラミニンコーティング溶液を、水中で調製した。
感光性フィブロネクチンコーティング溶液を、水中において、25μg/mLに調製した。
感光性コラーゲンコーティング溶液を、0.012NのHCl中において、25μg/mLに調製した。
最初に、減圧下でポリエチレンイミン(PEI;24.2wt.% 固形分;2000kg/モル Mw;BASF Corp.)を乾燥させ、次いで、19mLの90:10(v/v)クロロホルム:メタノール溶液に1.09gのPEIを溶解して、感光性PEIを調製した。次いで、当該PEI溶液を、氷浴中で0℃まで冷却した。溶解すべき62mgのBBA−Cl(4−ベンゾイルベンゾイルクロリド;その調製は、米国特許第5,858,653号明細書に記載されている)を、2.8mLのクロロホルムに添加した。BBA−Cl溶液を冷却し、撹拌しているPEI溶液に添加した。
VI.感光性RGD
感光性RGDを、同一出願人による米国特許第6,121,027号明細書の例1に記載されるように調製した。感光性RGDのコーティング溶液を、水中において、25μg/mLに調製した。
基剤コーティング
上記例1で調製された感光性ポリマー試薬を、平面(複数のウェルのプレート)及び3次元の基剤(高分子量ナノ繊維)上にコーティングした。
コーティングされていないナノ繊維基剤を、対照として使用した。
感光性ポリマーがコーティングされた基剤上のPC12細胞の接着アッセイ
付着性の乏しい細胞(PC12細胞)を、種々の感光性ポリマー基剤上に平面培養する(plate)効果を決定するために、接着アッセイを実施した。ATCC(登録#CRL 1721)から購入したラットPC12(褐色細胞腫)細胞を、10%の馬血清、5%の牛血清、2mMのGlutamax(Invitrogen)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)及び10mMのHEPES(Invitrogen)を含むRPMI培地(Invitrogen)中の、コラーゲンがコーティングされたポリスチレンフラスコ(15μg/mL、Sigma)内で前培養した。細胞を、5%CO2/95%空気加湿チャンバー内で、37℃でインキュベートした。上記培地を、1日おきに交換した。細胞が、80%の密集度に到達したら、当該細胞をトリプシン処理し、そして継代培養した。例2に記載される方法に従ってコーティングされた12個のウェルの基剤に上記細胞を平面培養する前に、これらの培養条件を続けた。
48時間後、上記増殖培地を取り出し、そしてコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖している上記細胞、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維を、Ca++−及びMg++−フリーのPBSを用いて、4回洗浄した。これらの複数回の洗浄により、上記ウェルから、ゆるく結合した又は結合していない細胞を除去した。コーティングされた基剤上で、洗浄により5%の細胞が除去された一方で、コーティングされていない基剤上では、洗浄により70%が除去された。次いで、37℃における加湿されたチャンバー内で、MTTを用いて、2時間の間、細胞をインキュベートした(増殖培地、Sigmaを用いて、1:1に希釈)。MTTを含む培地を取り出し、そして上記細胞を、PBSを用いてさらに洗浄し、フェノールレッドを取り除いた。500μLの染料可溶化剤(0.5mLの0.04NHCl/イソプロピルアルコール及び0.12mLの3%SDS/水の混合物)を添加し、そして上記ウェルを、室温で30分間(又は染料が完全に可溶化するまで)、30rpmでやさしく揺り動かした。当該試料を、96個のウェルの皿に移動し、そして分光光度計(Spectramax,Molecular Devices)内で、570nmにおいて、吸光度を読取った。
感光性ポリマーがコーティングされた表面上のPC12細胞の増殖
PC12細胞を、例3に記載されるように培養した。BrdU取り込みを、コーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維(Synthetic−ECM(商標)、製品番号P609186、Donaldson Co.,MNから市販される)、並びにコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン上で増殖した細胞に関して試験した。一日で、2,5−ブロモデオキシウリジン(BrdU、1μM濃度、Sigma)を、上記培養物に添加し、***細胞の数の測定を可能とした。免疫細胞化学を実施するために、48時間の間、BrdUを細胞に適用し、次いで、抗BrdU抗体を用いて染色した。
種々のコーティングされた表面及びコーティングされていない表面上のPC12細胞の分化
感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないポリスチレン製の12個のウェルのプレート、感光性ポリマーがコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維(Synthetic−ECM(商標)、製品番号P609186、Donaldson Co.,MNから市販される)、PuraMatrix(BD Biosciences)、並びにMatrigel(商標)(BD、Biosciences)上で増殖するPC12細胞の分化を、NGF(神経増殖因子)の存在下で評価した。
試験された他の感光性試薬には、感光性フィブロネクチン、感光性ラミニン、感光性コラーゲン、感光性PEI及び感光性RGDが含まれていた。
よって、上記感光性ポリ(APMA)がコーティングされた表面により、コーティングされていないポリスチレン、コーティングされていないナノ繊維、コラーゲン、PEI及び市販のPuramatrix及びMatrigel(商標)調製物と比較して、PC12細胞が神経細胞に良好に分化した。
図8は、コーティングされていないナノ繊維と比較して、感光性ポリ(APMA)及び感光性ラミニンがコーティングされたナノ繊維上で、PC12細胞が良好に分化することを示す。
図9は、PuraMatrix(商標)及びMatrigel(商標)と比較して、感光性ポリ(APMA)がコーティングされたナノ繊維上で、PC12細胞が良好に分化することを示している。感光性APMAは、ナノ繊維上で、より良好な細胞分化と、より長い神経突起伸張とを、定量的に促進する。
β−IIIチューブリン染色、神経突起形態及び細胞分化の評価を、表2に要約する。
感光性ポリマーがコーティングされた表面上のES−D3細胞の増殖
ATCC(登録番号CRL−1934)に由来するES−D3細胞を、4日間、10%のウシ胎児血清(FCS,Cambrex)及び白血病抑制因子(LIF,10ng/mL,Gibco−BRL)を有するDMEM−F12(Invitrogen)内の懸濁皿(suspension dish)(Nunc)内で、集合体として増殖させた。次いで、上記培地を、NEP基本培地(100μg/mLのトランスフェリン、5μg/mLのインスリン、16μg/mLのプトレシン、20nMのプロゲステロン、30nMの亜セレン酸、1mg/mLのウシ血清アルブミン、B27及びN2添加剤を加えた20ng/mLのbFGFで補ったDMEM−F−12)と称される化学的に規定された培地に交換し、そして上記細胞を、フィブロネクチン(15μg/mL、Sigma)がコーティングされたポリスチレン皿、感光性ポリ(APMA)がコーティングされた及びコーティングされていないナノ繊維(Synthetic−ECM(商標)、製品番号P610304、Donaldson Co.,MN)上に接種した。1日おきに培地を交換し、そして上記細胞を、5%のCO2/95%の空気が加湿されたチャンバー内で37℃に維持した(Mujtaba及びRaoの「Developmental Biology」(1999)214:113〜127)。
感光性ポリ(APMA)がコーティングされた表面を、ES−D3細胞と共に用いた。
ES−D3細胞を、24時間及び48時間のところで分析した。ES−D3細胞を、次のように、ネスチン、未分化の幹細胞のマーカーの存在のために染色した(U.Lendahlらの「Cell」(1990)60:585−95)。4%のパラホルムアルデヒドを用いて、細胞を、室温で20分間固定した。0.1MのPBS、pH7.4を用いてそれらを3回洗浄し、そして室温で2時間の間、0.5%のTriton−X−100(商標)及び5%のヤギ血清を含むPBS内で1:1に希釈されたラットネスチン(ラット401、DSHB)に対する一次抗体を用いてインキュベートした。次いで、細胞を、0.1MのPBSを用いて5分間洗浄し、そして追加の時間、0,5%のTriton−X−100(商標)及び5%のヤギ血清を含むPBS内で希釈された抗マウス第二抗体(1:200,Southern Biotech)を用いてインキュベートし、その後、0.1MのPBSを用いてそれらを3回洗浄し、そして倒立顕微鏡(Leica,DMLA)の下で観察した。BrdUでネスチンを二重に標識付け、そして一次抗体の適切な組み合わせ、次いで交差反応をしない(non−cross reactive)二次抗体の中で細胞を同時にインキュベートして、二重標識実験を実施した。
コーティング面上のES−D3細胞の分化
ネスチン陽性ES−D3細胞を、基本培地(100μg/mLのトランスフェリン、5μg/mLのインスリン、16μg/mLのプトレシン、20nMのプロゲステロン、30nMの亜セレン酸、1mg/mLのウシ血清アルブミン、B27及びN2添加剤を加えた20ng/mLのbFGFで補ったDMEM−F−12)内の感光性ポリ(APMA)がコーティングされたナノ繊維(Synthetic−ECM(商標)、製品番号P609192、Donaldson Co.,MN)上で増殖させた。細胞を誘導して、上記増殖培地からbFGFを取り除き、そしてレチノイン酸(1μM、Sigma)、PDGFBB(10ng/mL、Sigma)、CNTF(10ng/mL、Sigma)、10%血清(FBS、Invitrogen)のいずれかを添加して分化させた(Mujtaba及びRao,上記個所)。誘発剤を毎日添加して6日間培養した後、上記幹細胞は、神経細胞、乏突起神経膠芽細胞及び星状細胞に分化した。上記分化を、上記細胞の基剤を変えることなく達成した。
上記細胞を、4%のパラホルムアルデヒドを用いて20分間固定し、0.1MのPBSで3回洗浄し、そして室温で1時間の間、0.5%のTriton−X−100(商標)及び5%のヤギ血清を含むPBS内の神経細胞用のマーカー、β−IIIチューブリン(1:200、Sigma)を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体(IgG2b、Southern Biotech)を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。
4%のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で10分間、細胞を固定した。0.1MのPBS、pH7.4を用いて、5分間、細胞を3回洗浄した。室温で2時間の間、5%のBSAを含む培地内で、O4(6μg/mL、Chemicon)に対する一次抗体と共に、細胞をインキュベートした。次いで、0.1MのPBS、pH7.4を用いて、5分間、調製物を3回洗浄した。二次抗体と共に細胞をインキュベートし、そしてβ−IIIチューブリンに関して上述のようにさらに処理した。
4%のパラホルムアルデヒドを用いて、室温で20分間、細胞を固定した。0.1MのPBS、pH7.4を用いて、5分間、細胞を3回洗浄した。室温で2時間の間、0.5%のTriton−X−100(商標)及び5%のヤギ血清を含むPBSで、GFAP(1:500、Chemicon)に対する一次抗体と共に、細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、そして抗マウス二次抗体と共にインキュベートし、そしてβ−IIIチューブリンに関して上述したようにさらに処理した。
適切な細胞種への良好な分化は、コーティングされていないナノ繊維及びポリリジン/ラミニンで二重にコーティングされている組織培養プラスチックと比較して、コーティングされたナノ繊維上で得られ、そしてこの分化は、適切な誘発剤を同一の基剤に単に添加するのみで達成される。
図12は、ES−D3細胞が、感光性ポリ(APMA)がコーティングされたナノ繊維上で、タイプI及びタイプIIのGFAP陽性星状細胞に分化することを示す。当該細胞は、コーティングされたナノ繊維上で、より明るいことに留意する。
クローン濃度(clonal density)におけるPC12細胞の増殖
PC12細胞を、35mmウェル内に置いた300個の細胞/32mmナノ繊維ディスク(Synthetic−ECM(商標)、製品番号P609186、Donaldson Co.,MN)において平面培養し、そして一日おきにNGFを添加して、30日間分化させた(例5に記載されるように)。30日後、上記細胞を20分間、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、0.1MのPBSで3回洗浄し、そして室温で1時間の間、0.5%のTriton−X−100(商標)及び5%のヤギ血清を含むPBS内のβ−IIIチューブリン(1:200、Sigma)を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして追加の時間、抗マウス二次抗体(IgG2b、Southern Biotech)を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、そして倒立顕微鏡の下で観察した。単一細胞は、4日の培養後、クローンを生成し始めた。当該クローンは、迅速に増殖し、そして上記コーティング面にしっかりと接着したままであった。
感光性ポリマーコーティング上のPC12細胞の長期間培養
例8に記載されるように培養したPC12細胞を、45日間維持し、そしてβ−IIIチューブリンに関して処理した。図13は、感光性ポリ(APMA)がコーティングされた表面上で増殖する、分化したPC12細胞を示す。30日の培養の後、上記細胞はしっかりしており、そして広範囲な神経突起を示した。
感光性ポリマーコーティング上のES−D3細胞の長期培養
例7に記載されるように培養及び分化したES−D3細胞を、22日の期間にわたって維持し、そしてβ−IIIチューブリン及び神経フィラメント並びにGFAPに関して処理した。図14は、β−IIIチューブリン陽性神経細胞内の幹細胞の成熟を示している。これらの神経細胞のサブセットはまた、神経フィラメント+である。この時点で、培養物内で、むき出しのナノ繊維及びポリ−リジン/ラミニン上で増殖している細胞が上記基剤から離れ始めた一方で、APMAコーティングされたナノ繊維上で増殖している細胞は、上記基剤に硬く接着し、そして成熟した神経細胞を含む突起に分化した。図15は、GFAP+タイプI及びタイプIIの星状細胞への、星状細胞の成熟を示す。上記細胞は、上記表面に堅く接着したままであった一方で、むき出しのナノ繊維及びポリ−リジン/ラミニン上で増殖している細胞は、上記基剤から離れ始めた。
Claims (54)
- (a)ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体;並びに
(b)前記ナノ繊維の少なくとも一部上に生成したコーティング、当該コーティングは、下記を含むポリマーを含む;
(i)少なくとも1種のペンダント型アミン含有基;及び
(ii)前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも1種のペンダント型の潜在性の反応した基:
を含む細胞培養製品。 - 前記ポリマーが非生分解性ポリマーである、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記ポリマーが合成ポリマーである、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記ポリマーが、3−アミノプロピルメタクリルアミド、3−アミノエチルメタクリルアミド及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドから成る群から選択される1種又は2種以上のモノマーを含む、請求項5に記載の細胞培養製品。
- 前記ポリマーが、3−アミノプロピルメタクリルアミド(APMA)を含む、請求項6に記載の細胞培養製品。
- 前記ペンダント型アミン含有基が、前記ポリマーの総モノマーユニットに基づいて、前記ポリマーの50%以上のモル濃度量で存在する、請求項4に記載の細胞培養製品。
- 前記ペンダント型の潜在性の反応した基が、光反応した基を含む、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記光反応した基が、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様複素環並びにそれらの置換された誘導体から成る群から選択される、請求項9に記載の細胞培養製品。
- 前記光反応した基が、前記ポリマー中の総モノマーユニットに基づいて、0.1%〜10%の範囲のモル濃度量で存在する、請求項10に記載の細胞培養製品。
- 前記合成ポリマーが、20kDa〜2000kDaの範囲の分子量を有する、請求項3に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノ繊維が非生分解性ポリマーを含む、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノ繊維が、水溶性ポリマー又は短分子鎖アルコール可溶性ポリマーを含む、請求項13に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノ繊維が架橋剤を含む、請求項14に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノ繊維が、UV処理、加熱、又はその組み合わせにより、前記架橋剤を活性化する段階を含む方法により形成された、請求項15に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノ繊維がポリアミドを含む、請求項13に記載の細胞培養製品。
- 前記ポリアミドが、ナイロンポリマーから成る群から選択される、請求項17に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノ繊維が、2種又は3種以上のナイロンポリマーのブレンドを含む、請求項18に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノ繊維が、50nm〜1000nmの範囲の直径を有する、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノフィブリル構造体が前記ナノ繊維のネットワークを含み、当該ネットワークは、約0.2μm〜10μmの範囲の平均孔サイズを有する、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノフィブリル構造体が、0.1μm〜10μmの範囲の厚みを有する、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノフィブリル構造体が、1mm2〜4×105mm2の範囲の面積を有する、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノフィブリル構造体のための支持体をさらに含む、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 前記支持体が、ハロゲン化した熱可塑性樹脂を含む、請求項24に記載の細胞培養製品。
- 前記支持体がクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項25に記載の細胞培養製品。
- 前記支持体がガラスを含む、請求項24に記載の細胞培養製品。
- 前記支持体が透明である、請求項24に記載の細胞培養製品。
- 前記支持体が可とう性である、請求項24に記載の細胞培養製品。
- 前記ナノフィブリル構造体が、前記支持体上にナノ繊維を配置し、次いで、配置された前記ナノ繊維及び前記支持体を、熱、蒸気又はその組み合わせを用いて処理することにより形成された、請求項24に記載の細胞培養製品。
- 細胞培養容器の細胞培養面に配置させるように適合されている、請求項24に記載の細胞培養製品。
- 前記細胞培養容器が、フラスコ、皿及び複数のウェルのプレートから成る群から選択された、請求項31に記載の細胞培養製品。
- 基剤と接触している細胞をさらに含む、請求項1に記載の細胞培養製品。
- 次の段階を含む細胞培養製品を調製するための方法;
(a)ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体を得る段階、ここで、当該ナノ繊維の少なくとも一部上に、コーティングを生成させ、当該コーティングは、下記を有するポリマーを含み;
(i)少なくとも1種のペンダント型アミン含有基;及び
(ii)前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも1種のペンダント型の潜在性の反応した基:そして
(b)前記ナノフィブリル構造体を、細胞培養容器の細胞培養面上に供給する段階。 - 次の各段階を含む、細胞培養製品を調製するための方法;
(a)ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体を得る段階;
(b)前記ナノ繊維の少なくとも一部上に、コーティング組成物を配置する段階、当該コーティング組成物は、下記を有するポリマーを含む;
(i)少なくとも1種のペンダント型アミン含有基;及び
(ii)少なくとも1種のペンダント型潜在性反応性基;そして
(c)前記ペンダント型潜在性反応性基を活性化し、そして潜在性の反応した基を経由して前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させ、それにより前記ナノ繊維上にコーティングを生成させるために、前記コーティング組成物を処理する段階。 - 前記ポリマーが、10μg/mL〜20mg/mLの範囲で、前記コーティング組成物中に存在する、請求項35に記載の方法。
- 前記潜在性反応性基が光反応性基である、請求項36に記載の方法。
- 前記処理段階が、190nm〜360nmの範囲の紫外線を用いて前記光反応性基を照射することを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記処理段階が、0.1mW/cm2〜20mW/cm2の範囲の紫外線の線量を用いて、前記光反応性基を照射することを含む、請求項38に記載の方法。
- 1種又は2種以上の細胞を、ナノ繊維を含むナノフィブリル構造体と接触させて置く段階を含む、当該1種又は2種以上の細胞を培養する方法であって、
前記ナノ繊維は、当該ナノ繊維の少なくとも一部上に生成したコーティングを含み、
前記コーティングは、下記を有するポリマーを含む;
(i)少なくとも1種のペンダント型アミン含有基;及び
(ii)前記ポリマーを前記ナノ繊維に結合させる、少なくとも1種のペンダント型の潜在性の反応した基。 - 前記細胞の90%が、コーティングされたナノ繊維に接着される、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞が、14日以上の期間、前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類及び昆虫類の細胞から成る群から選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞が体細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記体細胞が幹細胞である、請求項44に記載の方法。
- 前記幹細胞が、1時間〜60日の期間、未分化状態で維持される、請求項45に記載の方法。
- 未分化細胞の生存率が、14日のところで、90%を超えて減っていない、請求項46に記載の方法。
- 幹細胞を分化させるように誘導する段階をさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞が神経前駆細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が神経細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項49に記載の方法。
- 前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が乏突起神経膠芽細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項49に記載の方法。
- 前記神経前駆細胞が、当該神経前駆細胞が星状細胞に分化するために十分な期間及び条件の下で前記ナノフィブリル構造体と接触して置かれる、請求項49に記載の方法。
- 前記神経前駆細胞の30%超が、10日の期間の後に分化させられる、請求項49に記載の方法。
- 乏突起神経膠芽細胞、星状細胞及び神経細胞の前駆物質から成る群から選択される細胞を、ナノフィブリル構造体の少なくとも一部に生成させたコーティングを含む当該ナノフィブリル構造体と接触して置く段階を含む、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞又は神経細胞を生成するための方法であって、
前記コーティングは、下記を有するポリマーを含み;
(i)少なくとも1種のペンダント型アミン含有基;及び
(ii)前記ポリマーを基剤に結合させる、少なくとも1種のペンダント型の潜在性の反応した基;
ここで、前記前駆物質は、当該前駆物質がそれぞれ、乏突起神経膠芽細胞、星状細胞又は神経細胞に分化するために十分な期間及び条件の下に置かれる。
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