JP2009502138A - ＲｈｏＡ遺伝子のＲＮＡｉ調節及びその使用法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＲｈｏＡ遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関し、更に詳細には、化学修飾されたオリゴヌクレオチドによるＲｈｏＡの抑制に関する。

Description

（関連出願）
本出願は、２００５年７月２１日に申請された米国仮出願第６０／７０１，４７０号明細書、２００５年１０月１４日に申請された米国仮出願第６０／７２６，８３８号明細書及び２００５年１２月７日に申請された米国仮出願第６０／７４８，３１６号明細書の利益を主張するものである。これらの優先出願の各々の内容は参照してその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、ＲｈｏＡの発現を調節するための組成物及び方法に関し、更に詳細には、ＲＮＡ干渉を介したオリゴヌクレオチド、例えば、化学修飾されたオリゴヌクレオチドによるＲｈｏＡ ｍＲＮＡ及びＲｈｏＡ蛋白質レベルの抑制に関する。

ＲＮＡ干渉、即ち“ＲＮＡｉ”は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が虫類に導入されると遺伝子発現を阻害しうるという所見を説明するため、Ｆｉｒｅとその共同研究者らによって最初に作り出された用語である（ファイアーら（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ第３９１巻：８０６−８１１ページ（１９９８年））。短鎖ｄｓＲＮＡは脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的転写後サイレンシングを導き、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。

多くのミエリン由来の軸索成長阻害物質が特徴づけられている（閲覧のため、国際公開第１９９９／９９５３９４５４７号パンフレット；米国特許第５，８５８，７０８号明細書；シュワブ（Ｓｃｈｗａｂ），Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．第２１巻：７５５〜７６１ページ（１９９６年）を参照）。軸索伸長に対する阻害活性を有するＣＮＳの白質の幾つかの構成要素であるＮＩ３５，ＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）及びミエリン関連糖蛋白質（ＭＡＧ）も記載されている（国際公開第１９９０／９００５１９１号パンフレット；米国特許第５，６８４，１３３号明細書）。特に、ＲｈｏＡは、それ自体がＲａｓ ＧＴＰアーゼのスーパーファミリーに属するＲｈｏ（Ｒａｓ相同体（Ｒａｓ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ））ＧＴＰアーゼの大ファミリーのメンバーである。全ての真核生物は少なくとも一つのＲｈｏＧＴＰアーゼを含む。進化の過程において、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの数は１生物につき５〜６（酵母）から２０以上（哺乳動物）に増加した（カルノブ、エー．イー．ら（Ｋａｒｎｏｕｂ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．），Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，第８４巻：６１ページ（２００４年））。他のＧＴＰアーゼと同様に、ＲｈｏＡは内因性ＧＴＰアーゼ活性を有し、不活性ＧＤＰ結合状態と活性ＧＴＰ結合状態との間を往来する。インビトロではＧＤＰのＧＴＰへの変換は極めて緩徐に生じ、ＧＤＰをＧＴＰと交換するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）により触媒される。ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質（ＧＡＰ）はＧＴＰのγ−リン酸の加水分解を触媒する（ウィーラー、エー．ピー．（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ａ．Ｐ．），リドレイ、エー．ジェイ．（Ｒｉｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，第３０１巻：４３ページ（２００４年））。第三のセットの調節蛋白質であるグアニンヌクレオチド解離阻害物質（ＧＤＩ）は、不活性ＧＤＰ結合状態にてＧＴＰアーゼをサイトゾルに隔離する。

Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼのＮ末端半分は、ＧＴＰ結合状態とＧＤＰ結合状態との間で構造を変化させるスイッチ１及び２領域と共に、ＧＴＰ結合及び加水分解に関与する大部分のアミノ酸を含む（ビショップ、エー．エル．（Ｂｉｓｈｏｐ，Ａ．Ｌ．），ホール、エー．（Ｈａｌｌ，Ａ．），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，第３４８巻（Ｐｔ．２）：２４１ページ（２０００年））。ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼのＣ末端は、蛋白質の正確な局在に不可欠である。これは保存Ｃ末端システインのプレニル化によって翻訳後修飾され、次に、最後の３個のアミノ酸のメチル化及び蛋白分解除去が生じる（シャオ（Ｓｈａｏ，Ｆ．），ディクソン、ジェイ．イー．（Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．），Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，第５２９巻：７９ページ（２００３年））。プレニル基はＧＴＰアーゼを膜内に固着し、この修飾は細胞増殖、形質転換及び細胞骨格構成に不可欠である（アラル、シーら（Ａｌｌａｌ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７５巻：３１００１ページ（２０００年））。Ｒｈｏ蛋白質のプレニル化はその安定性のために重要だと思われ、プレニル基を合成する酵素の阻害物質はＲｈｏ蛋白質レベル及びその機能の低下を誘発する（スタマタキス、ケー．ら（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，第２７７巻：４９３８９ページ（２００２年））。ＲｈｏＡの場合、プレニル化はゲラニルゲラニル基を付加する。ＲｈｏＡは主に細胞質内又は原形質膜において見出される（アダムソン、ピー．ら（Ａｄａｍｓｏｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，第１１９巻：６１７ページ（１９９２年））。

ＲｈｏＡはｐ７５ＮＴＲの細胞内部分に結合することができ、ｐ７５ＮＴＲ依存的にＮｏｇｏ−Ｒにより活性化され（ワン、ケー．シー．ら（Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，第４２０巻：７４ページ（２００２年））、このようにしてＭＡＧ，Ｎｏｇｏ−６６及びオリゴデンドロサイト−ミエリン糖蛋白質がＲｈｏＡを活性化させる。Ｎｏｇｏ−Ａの中央阻害ドメインであってＮｏｇｏ−６６と異なるＮｉＧ、及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであってミエリンのもう１つの構成要素であるＶｅｒｓｉｃａｎ Ｖ２は、未だ解明されていないＲｈｏＡ活性化の別の経路により、ｐ７５ＮＴＲの非存在下にてＲｈｏＡを活性化することができる（シュバイガイテル、アール．ら（Ｓｃｈｗｅｉｇｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，第２７巻：１６３ページ（２００４年））。活性化の更なる経路が存在する可能性がある。

ＲｈｏＡは中枢神経系（ＣＮＳ）に存在するが末梢神経には存在しない成長抑制機構の一部であり、損傷後のＣＮＳ組織の再生を阻害する。ＲｈｏＡの発現及び活性化の双方は脳及び脊髄損傷にて誘発される（ミューラー、ケー．ら（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，第４巻：３８７ページ（２００５年））。ＲｈｏＡの活性化は、神経成長円錘の破壊、退縮球の形成及び神経突起の消退を惹起する。ＲｈｏＡの不活性化はインビトロにて本来であれば阻害性の基質上の一次ニューロンにおける神経突起の伸長を惹起し、インビボにてラット及びマウスにおいて脊髄損傷後に軸索の再生及び機能回復を促進する（レーマン、エム．エー．ら（Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，第１９巻：７５３７ページ（１９９９年）；ハラ、エム．ら（Ｈａｒａ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，第９３巻：９４ページ（２０００年）；ダーグハム、ピー．ら（Ｄｅｒｇｈａｍ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，第２２巻：６５７０ページ（２００２年））。更に、ＲｈｏＡの不活性化は、脊髄損傷に誘発されるアポトーシスから脊髄の内在細胞を防御することが示されている（デュブリュイ、シー．アイ．ら（Ｄｕｂｒｅｕｉｌ，Ｃ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，第１６２巻：２３３ページ（２００３年））。脊髄損傷後の神経保護処置が機能回復の改善につながるため、これらの所見は臨床的意義を有する（リュー、エックス．ゼット．ら（Ｌｉｕ，Ｘ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，第１７巻：５３９５ページ（１９９７年））。

明らかに、ＲｈｏＡは、例えばＣＮＳ細胞の破壊および／または再生障害を伴う疾患及び病態を対象にした治療的介入戦略の標的となりうる。本発明は、ＲｈｏＡ遺伝子を発現している細胞内のＲｈｏＡ ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルの抑制を惹起する方法及び短鎖ｄｓＲＮＡを含む薬剤を提供することにより、当該技術を進展させる。これらの方法及び薬剤は、例えば、ＲｈｏＡの軸索伸長の阻害を阻止し、その結果、神経の成長及び増殖を刺激することにより、少なくとも部分的にＲｈｏＡに媒介される障害又は病理過程の処置に用いられうる。

本発明は、少なくとも部分的にｉＲＮＡ剤を用いたＲｈｏＡ遺伝子の検討、更に、ＲｈｏＡ部位を標的とするｉＲＮＡ剤の試験に基づく。本発明は、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡレベル、ＲｈｏＡ蛋白質レベルを低下させ、少なくとも部分的にＲｈｏＡに媒介される病理過程を処置する、例えば、対象、例えばヒトのような哺乳動物においてＲｈｏＡの軸索伸長・再生の阻害を阻止するのに有用な組成物及び方法を提供する。

一態様において、本発明は、下記表１に示す物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のセンス鎖配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むセンス鎖と、物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のアンチセンス配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含むｉＲＮＡ剤を提供する。

更なる態様において、本発明は、物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のセンス鎖配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むセンス鎖と、物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のアンチセンス配列の少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含む、細胞内のｒｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡ剤であって、これらの物質とのインキュベーション後にヒト培養細胞に存在するＲｈｏＡ ｍＲＮＡの量を、物質とインキュベートされなかった細胞に対して４０％以上減少させるｉＲＮＡ剤を提供する。

更なる態様において、本発明は、物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質の配列の１つと本質的に同一の少なくとも１６，１７又は１８個のヌクレオチドの配列、但し、それぞれ１鎖につき１，２又は３個以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されているが（例えば、アデノシンがウラシルに置換）、ＲｈｏＡ発現を阻害する能力を本質的に保持している配列を各々が含むセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む、細胞内のｒｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡ剤を提供する。このような物質では、センスおよび／またはアンチセンス鎖配列は、物質番号６５２３，６５２４，６５３０，６６１４，６６５０，６６５６，６６５７，６６６１，６６６２，６７０３，６７１２，６７１３，６７３２，６７５１，６７５６，６７６７，６７６９，６７８７，６７８９，６７９０，６８３２のセンス及びアンチセンス鎖配列から成る群から選択されることが好ましい。

明らかに、上記実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、物質番号６４７７〜６８３６の物質のセンス鎖及びアンチセンス鎖とも同一でありうる。

本発明のｉＲＮＡ剤は修飾、例えばｉＲＮＡ剤が生体試料において上昇した安定性を有するような修飾を含むことができる。例えば、ｉＲＮＡ剤はホスホロチオアート、２’−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート又はヌクレオチドを構成する非天然塩基を含むことができる。上記実施形態のために、ｉＲＮＡ剤はヌクレオチド修飾の存在の可能性にかかわらず、物質番号６４７７〜６８３６の物質の配列の１つを含むとみなされ、即ち２’−Ｏ−メチルグアノシンはそのような比較ではグアノシンとみなされうる。しかし、一定のパターンの修飾が本発明の特に好ましい実施形態である。従って、別の実施形態において、本発明は、センスおよび／またはアンチセンス鎖配列が物質番号ＡＬ−ＤＰ−５９７２，ＡＬ−ＤＰ−５９７３，ＡＬ−ＤＰ−５９７４，ＡＬ−ＤＰ−５９７５，ＡＬ−ＤＰ−５９７６，ＡＬ−ＤＰ−５９７８，ＡＬ−ＤＰ−５９７９，ＡＬ−ＤＰ−５９８１，ＡＬ−ＤＰ−５９８２，ＡＬ−ＤＰ−５９８３，ＡＬ−ＤＰ−５９８４，ＡＬ−ＤＰ−５９８６，ＡＬ−ＤＰ−５９８７，ＡＬ−ＤＰ−５９８８，ＡＬ−ＤＰ−５９８９，ＡＬ−ＤＰ−５９９０，ＡＬ−ＤＰ−５９９１，ＡＬ−ＤＰ−５９９２，ＡＬ−ＤＰ−５９９３，ＡＬ−ＤＰ−５９９４，ＡＬ−ＤＰ−５９９５，ＡＬ−ＤＰ−６１７６，ＡＬ−ＤＰ−６１７７のセンス及びアンチセンス鎖配列から成る群から選択される、細胞内のｒｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡ剤を提供する。

本発明のｉＲＮＡ剤において、アンチセンスＲＮＡ鎖は３０以下のヌクレオチド長となり、ｉＲＮＡ剤の二重鎖領域は１５〜３０ヌクレオチド対長となることができる。
本発明に係る２’−修飾ヌクレオチドは、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ｕａ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ｕｇ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ｃａ−３’）ジヌクレオチド；又は５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ｕｕ−３’）ジヌクレオチドを含みうる。

本発明のｉＲＮＡ剤は下記のように設計されうる。
５’−ｕａ−３’，５’−ｕｕ−３’，５’−ｃａ−３’及び５’−ｕｇ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドがセンス鎖において２’−修飾され、５’−ｕａ−３’及び５’−ｃａ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドがアンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
５’−ｕａ−３’，５’−ｕｕ−３’，５’−ｃａ−３’及び５’−ｕｇ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドが、センス及びアンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
すべてのピリミジンヌクレオチドがセンス鎖において２’−修飾され、５’−ｕａ−３’及び５’−ｃａ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドがアンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
すべてのピリミジンヌクレオチドがセンス鎖において２’−修飾され、５’−ｕａ−３’，５’−ｕｕ−３’，５’−ｃａ−３’及び５’−ｕｇ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドがアンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
センス鎖におけるすべてのピリミジンヌクレオチドが２’−修飾され、アンチセンス鎖ではヌクレオチドが２’−修飾されない。

本発明のｉＲＮＡ剤における２’−修飾は、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）から成る群から選択されうる。

本発明のｉＲＮＡ剤は、１〜４個の不対合ヌクレオチド、好ましくは２又は３個の不対合ヌクレオチドを有するヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’−末端に存在することができる。ｉＲＮＡ剤は、好ましくはｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’−末端に共役結合したコレステロール部分を含むことができる。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は神経細胞又は神経鞘細胞による取込みの標的となる。

本発明は、細胞内のＲｈｏＡ ｍＲＮＡレベルを低下させるための方法を更に提供する。本発明の方法は、細胞内のＲｈｏＡ ｍＲＮＡを選択的に低下させるためにＲＮＡ干渉に関与する細胞機構を利用し、本発明のｉＲＮＡ剤の１つと細胞を接触させるステップから成る。このような方法は細胞に対して直接行うことができ、或いは本発明のｉＲＮＡ剤の１つを哺乳動物の被検体に投与することにより、被検体に対して行うことができる。細胞内のＲｈｏＡ ｍＲＮＡの減少は産生されるＲｈｏＡ蛋白質の量の減少をもたらし、生体においてＲｈｏＡ特異的病理／疾患作用の低下をもたらしえて、例えば、ＲｈｏＡの軸索伸長・再生の阻害を阻止する。

本発明の別の態様では、本発明のｉＲＮＡ剤を投与するステップを含む、少なくとも部分的にＲｈｏＡに媒介される病理過程を有するヒト被験者を処置する方法が提供され、例えば、ｉＲＮＡ剤は物質番号６４７７〜６８３６の任意の１つの物質のセンス鎖配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むセンス鎖と、物質番号６４７７〜６８３６の任意の１つの物質のアンチセンス配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含む。

本発明の上記方法の一実施形態において、病理過程は、好ましくは神経の障害又は損傷の結果としての神経の成長又は伸長の阻害である。別の好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は対象の細胞又は組織内のＲｈｏＡの発現を低減させるのに十分な量にて投与される。対象はヒトであることが好ましい。

別の態様では、本発明は、
ａ）本発明のｉＲＮＡ剤と、
ｂ）医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。

別の実施形態において、本発明は本発明のｉＲＮＡ剤を含む細胞を提供する。
別の実施形態において、本発明は細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、当該方法は、
（ａ）本発明のｉＲＮＡ剤を細胞に導入するステップと、
（ｂ）ＲｈｏＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写の低下を得るのに十分な時間、ステップ（ａ）にて作製された細胞を維持し、これにより細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。

別の実施形態において、本発明は細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供し、前記ベクターは、本発明のｉＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に機能的に結合した調節配列を含む。

別の実施形態において、本発明は上記ベクターを含む細胞を提供する。
本発明の方法及び組成物、例えば方法及びｉＲＮＡ組成物は、本願で述べる任意の用量／製剤及び本願で述べる任意の投与経路で使用されることができる。

本発明の１又はそれ以上の実施形態の詳細は下記に示される。本発明の他の特徴、目的及び利点は下記の説明及び特許請求の範囲から明らかになろう。本出願はあらゆる目的のために、引用されたすべての参考文献、特許及び特許出願を参照してその全体を組み込むものとする。

説明を容易にするため、「ヌクレオチド」又は「リボヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡ剤の１又はそれ以上のモノマーサブユニットに関して本願で用いられることがある。本願における「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語の用法は、修飾ＲＮＡ又はヌクレオチドサロゲートの場合、下記に更に説明するように、１又はそれ以上の位置における修飾ヌクレオチド又はサロゲート置換部分も指すことを理解されよう。

本願で用いられる「ＲＮＡ剤」は非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ又はヌクレオチドサロゲートであり、これらの各々は本願で説明され、或いはＲＮＡ合成技術分野で周知である。多くの修飾ＲＮＡ及びヌクレオシドサロゲートが記載されているが、好ましい例には、非修飾ＲＮＡよりヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性が高いものが含まれる。好ましい例には、２’糖修飾、一本鎖オーバーハング、好ましくは３’一本鎖オーバーハングの修飾又は、特に一本鎖の場合、１つ以上のリン酸基若しくは１つ以上のリン酸基類似体を含む５’−修飾を有するものが含まれる。

本願で用いられる「ｉＲＮＡ剤」（「干渉ＲＮＡ剤」の略語）は、標的遺伝子、例えばＲｈｏＡの発現を抑制することができるＲＮＡ剤である。理論によって限定されることを望まないが、ｉＲＮＡ剤は当該技術分野でＲＮＡｉと称されることもある標的ｍＲＮＡの転写後開裂又は転写前機序又は翻訳前機序を含む多くの機序の１又はそれ以上の機序により作用することができる。ｉＲＮＡ剤は二本鎖ｉＲＮＡ剤とすることができる。

本願で用いられる「ｄｓｉＲＮＡ剤」（「二本鎖ｉＲＮＡ剤」の略語）は、鎖間ハイブリダイゼーションが二重鎖構造の領域を形成することができる、二本以上、好ましくは二本の鎖を含むｉＲＮＡ剤である。本願における「鎖」はヌクレオチド（非天然型又は修飾ヌクレオチドを含む）の隣接配列を指す。二本以上の鎖又は各鎖は別々の分子の一部を形成し、或いは、例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーによって共有結合的に相互結合して１個の分子を形成することができる。少なくとも一本の鎖は、標的ＲＮＡに対して十分に相補的な領域を含むことができる。このような鎖は「アンチセンス鎖」と称される。アンチセンス鎖に相補的な領域を含む剤の第二の鎖は「センス鎖」と称される。しかし、ｄｓｉＲＮＡ剤は少なくとも部分的に自己相補的であって、例えば、二重鎖領域を含むヘアピン又はパンハンドル構造を形成する単一ＲＮＡ分子からも形成されうる。このような場合、「鎖」という用語は同じＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の１つの領域を指す。

哺乳動物細胞において、長鎖ｄｓｉＲＮＡ剤は有害となる頻度が高いインターフェロン応答を誘発しうるが、短鎖ｄｓｉＲＮＡ剤は少なくとも細胞および／または宿主に有害となるほどにインターフェロン応答を惹起しない（マンシェら（Ｍａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：第５２３８巻，１９９２年；リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第１９９巻：４９１ページ，１９９４年；カステリら（Ｃａｓｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８６巻：９６７ページ，（１９９７年）；チェンら（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．），ＲＮＡ第１０巻：１９３４ページ，（２００４年）；ハイデルら（Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．）「動物における裸のｓｉＲＮＡに対するインターフェロン応答の欠如（”Ｌａｃｋ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ ｔｏ ｎａｋｅｄ ｓｉＲＮＡｓ”）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｍ．ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０３８（２００４年１１月２１日））。本発明のｉＲＮＡ剤は、十分に短く正常哺乳動物細胞において有害な非特異的インターフェロン応答を惹起しない分子を含む。従って、ｉＲＮＡ剤を含む組成物（例えば、本願で述べるように製剤化）の対象への投与は、インターフェロン応答を回避すると同時に、対象においてＲｈｏＡ発現細胞におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を低減するのに用いられることができる。十分に短く有害なインターフェロン応答を惹起しない分子は、本願ではｓｉＲＮＡ剤又はｓｉＲＮＡと称される。本願で用いられる「ｓｉＲＮＡ剤」又は「ｓｉＲＮＡ」は、十分に短いためヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘発しないｉＲＮＡ剤、例えばｄｓｉＲＮＡ剤を指し、例えば、６０未満であるが好ましくは５０，４０又は３０未満のヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。

ｄｓｉＲＮＡ剤及びｓｉＲＮＡ剤を含む、本願で述べられる単離されたｉＲＮＡ剤は、例えばＲＮＡ分解により、ＲｈｏＡ核酸の発現の低減を媒介することができる。説明の便宜上、このようなＲＮＡは本願においてサイレンシングされるＲＮＡとも称される。このような核酸は標的遺伝子とも称される。サイレンシングされるＲＮＡは、内在性ＲｈｏＡ遺伝子の遺伝子産物であることが好ましい。

本願で用いられるように、「ＲＮＡｉを媒介する」という表現は標的遺伝子を配列特異的にサイレンシングする物質の能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングする」とは、当該物質と接触していない時に標的遺伝子のある種の産物を含み、および／または発現している細胞が、当該物質と接触していない同様の細胞に対して、当該物質と接触した時、このような遺伝子産物を少なくとも１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％又は９０％減で含み、および／または発現するプロセスをいう。標的遺伝子のこのような産物は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、蛋白質又は調節エレメントでありうる。

本願で用いられるように、「相補的」という用語は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子、例えば、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡとの間に安定した特異的な結合が生じるのに十分な相補性を示すのに用いられる。特異的結合は、特異的結合が所望される条件下、即ち、インビボアッセイ又は治療上の処置の場合の生理学的条件下、或いはインビトロアッセイの場合、アッセイが実施される条件下、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な相補性を必要とする。典型的には、非標的配列は少なくとも４個のヌクレオチドだけ標的配列と異なる。

本願で用いられるように、ｉＲＮＡ剤は、細胞において標的ＲＮＡにコードされた蛋白質の産生を減少させる場合、標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ（例えば、標的ＲｈｏＡ ｍＲＮＡ）に「十分に相補的」である。ｉＲＮＡ剤は標的ＲＮＡに「完全に相補的」ともなることができ、例えば、標的ＲＮＡとｉＲＮＡ剤はアニーリングし、好ましくはワトソン・クリック型塩基対のみでできたハイブリッドを完全な相補性の領域に形成する。「十分に相補的」なｉＲＮＡ剤は、標的ＲｈｏＡ ＲＮＡに完全に相補的な（例えば、少なくとも１０個のヌクレオチドの）内部領域を含みうる。更に、一部の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この場合、単一ヌクレオチドの相違の領域（例えば、７ヌクレオチド以内）に完全な相補性が見出される場合、ｉＲＮＡ剤はＲＮＡｉを媒介するだけである。好ましいｉＲＮＡ剤は表１に示すセンス及びアンチセンス配列に基づき、或いはこれらから成り、或いはこれらを含む。

本願で用いられるように、第二のヌクレオチド配列と比較して第一のヌクレオチド配列に言及して用いられる際の「本質的に同一」とは、第一のヌクレオチド配列が１，２又は３つまでのヌクレオチド置換（例えば、アデノシンがウラシルに置換）を除き、第二のヌクレオチド配列と同一であることをいう。ヌクレオチドの欠失、付加又は置換により、表１のｉＲＮＡ剤の１つと同一ではないがその１つに由来するｉＲＮＡ剤に言及して本願で用いられる、「培養ヒトＲｈｏＡ発現細胞におけるＲｈｏＡ発現を阻害する能力を本質的に保持している」とは、得られたｉＲＮＡ剤がその由来源の表１のｉＲＮＡ剤の阻害活性と２０％以下異なる阻害活性を有する（残存標的ｍＲＮＡの点から）ことをいう。例えば、培養ヒトＲｈｏ−Ａ発現細胞に存在するＲｈｏＡ ｍＲＮＡの量を７０％低下させる表１のｉＲＮＡ剤に由来するｉＲＮＡ剤は、培養ヒトＲｈｏＡ発現細胞におけるＲｈｏＡ発現を阻害する能力を本質的に保持しているとみなされるために、それ自体が培養ヒトＲｈｏＡ発現細胞に存在するＲｈｏＡ ｍＲＮＡの量を少なくとも５０％低下させうる。任意で、本発明のｉＲＮＡ剤は培養ヒトＲｈｏＡ発現細胞に存在するＲｈｏＡ ｍＲＮＡの量を少なくとも５０％又は少なくとも４０％低下させうる。

本願で用いられるように、「対象」はＲｈｏＡ蛋白質発現に媒介される障害に対する処置を受ける哺乳動物を指す。対象はウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ又は霊長動物のような任意の哺乳動物でよい。好ましい実施形態において、対象はヒトである。

ｉＲＮＡ剤の設計及び選択
本願で用いられるように、「ＲｈｏＡ発現と関連する障害」は、（１）ＲｈｏＡ ｍＲＮＡおよび／または蛋白質の存在に部分的に媒介され、（２）そのアウトカムが、存在するＲｈｏＡ ｍＲＮＡおよび／または蛋白質のレベルを低下させることによって影響を及ぼされうる、任意の生体又は病理状態を指す。ＲｈｏＡ発現と関連する特異的障害は下記に示され、主に軸索の伸長及び再生の阻害におけるＲｈｏＡの作用の原因に基づく。

本発明は、ＲｈｏＡを標的とするｉＲＮＡ剤の設計、合成及び生成並びにｉＲＮＡ剤とのインキュベーション後の培養細胞におけるインビトロでのＲｈｏＡ遺伝子のサイレンシングの実証並びにその結果生じるＲｈｏＡ特異的効果に基づく。

ｉＲＮＡ剤は、配列情報及び所望の特性に基づき合理的に設計されうる。例えば、ｉＲＮＡ剤は候補二重鎖の相対融解温度に従って設計されうる。一般的に、二重鎖はアンチセンス鎖の５’末端においてアンチセンス鎖の３’末端より低い融解温度を有するものである。

候補ｉＲＮＡ剤は、例えば、標的遺伝子として機能する遺伝子の遺伝子歩行分析を行うことにより設計されることもできる。転写領域の全て又は一部に対応する、重複し、隣接し、或いは近接配置された候補物質を生成し、試験することができる。各ｉＲＮＡ剤は標的遺伝子の発現を抑制する能力を試験し、評価することができる（下記「候補ｉＲＮＡ剤の評価」参照）。

本出願において、ヒト、ラット及びマウスの既知のＲｈｏＡ配列並びに他の既知のＲｈｏＡ配列を用いて、ＲｈｏＡを標的とする、見込みのあるｉＲＮＡ剤が設計された。上述の表１に示す標的配列は、ラット及びマウスにおける対応配列との完全な相同性を示すヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡ配列の領域から選択された。従って、ｓｉＲＮＡ剤、物質番号６４７７〜６８３６はこれら３種間の交差反応性を示すはずである。得られた結果に基づき、本発明は、培養ヒトＲｈｏＡ発現細胞及び対象におけるＲｈｏＡをサイレンシングするｉＲＮＡ剤を提供する。

表１はＲｈｏＡを標的とする例示的ｉＲＮＡ剤を示す。

これらの結果に基づき、本発明は、物質番号６４７７〜６８３６によって表１に示される物質のセンス鎖配列の少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを有するセンス鎖と、物質番号６４７７〜６８３６によって表１に示される物質のアンチセンス鎖配列の少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含むｉＲＮＡ剤を具体的に提供する。

表１に示すｉＲＮＡ剤は、標的配列に相補的な、或いは標的配列と同一の１９ヌクレオチド長＋３’−ＴＴオーバーハングの二本鎖から成る。本発明は、これらの物質由来の１５隣接ヌクレオチドを含む物質を提供する。しかし、これらの長さは至適である可能性があるが、ｉＲＮＡ剤はこれらの長さに限定されるものではない。一定の長さ範囲内では効力は鎖長というよりもヌクレオチド配列の機能であるため、より短く、或いはより長いｉＲＮＡ剤が同様に効果的でありうることは当業者には周知のことである。例えば、ヤングら（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ第９９巻：９９４２−９９４７ページ（２００２年））は２１〜３０塩基対長のｉＲＮＡ剤に対する同様の有効性を実証した。他には約１５塩基対長まで減じたｉＲＮＡ剤による遺伝子の効果的なサイレンシングを示している者もいる（バイロムら（Ｂｙｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．）「ＲＮアーゼＩＩＩにより生成されたｓｉＲＮＡカクテルによるＲＮＡｉの誘発（”Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＲＮＡｉ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ”）」、Ｔｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ １０（１），アンビオン、インク．（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）［米国テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）］。

従って、物質番号６４７７〜６８３６によって表１に示される配列の１つに由来するｉＲＮＡ剤を生成するため、物質番号６４７７〜６８３６によって表１に示される配列から１５〜２２ヌクレオチドの部分配列を選択することが可能であるとともに本発明により企図される。或いは、好ましいが必須ではなく、付加ヌクレオチドが標的遺伝子、例えばＲｈｏＡのそれぞれの配列に相補的となるように、物質番号６４７７〜６８３６によって表１に示される配列の１つ又はこれらの物質の１つに由来する１５隣接ヌクレオチドを含む物質に１つ又は複数のヌクレオチドを付加しうる。例えば、物質の１つに由来する最初の１５ヌクレオチドをＲｈｏＡ ｍＲＮＡに見出される５’からのこれらの配列の８ヌクレオチドと結合し、センス及びアンチセンス鎖において２３ヌクレオチドを有する物質を得ることができる。このようにして得られるｉＲＮＡ剤は、培養ヒトＲｈｏＡ発現細胞においてＲｈｏＡ発現を阻害する能力を本質的に保持するという条件下、すべて本発明のｉＲＮＡ剤に含まれる。

ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は１４，１５，１６ １７，１８，１９，２５，２９，４０又は５０ヌクレオチド長と同等であり、或いは少なくとも１４，１５，１６ １７，１８，１９，２５，２９，４０又は５０ヌクレオチド長であるべきである。アンチセンス鎖は６０，５０，４０又は３０ヌクレオチド長と同等であり、或いは６０，５０，４０又は３０ヌクレオチド長未満であるべきである。好ましい範囲は１５〜３０，１７〜２５，１９〜２３及び１９〜２１ヌクレオチド長である。

ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は１４，１５，１６ １７，１８，１９，２５，２９，４０又は５０ヌクレオチド長と同等であり、或いは少なくとも１４，１５，１６ １７，１８，１９，２５，２９，４０又は５０ヌクレオチド長であるべきである。センス鎖は６０，５０，４０又は３０ヌクレオチド長と同等であり、或いは６０，５０，４０又は３０ヌクレオチド長未満であるべきである。好ましい範囲は１５〜３０，１７〜２５，１９〜２３及び１９〜２１ヌクレオチド長である。

ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は１５，１６ １７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２９，４０又は５０ヌクレオチド対長と同等であり、或いは少なくとも１５，１６ １７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２９，４０又は５０ヌクレオチド対長であるべきである。二本鎖部分は６０，５０，４０又は３０ヌクレオチド対長と同等であり、或いは６０，５０，４０又は３０ヌクレオチド対長未満であるべきである。好ましい範囲は１５〜３０，１７〜２５，１９〜２３及び１９〜２１ヌクレオチド対長である。

通常、本発明のｉＲＮＡ剤は、それぞれのＲｈｏＡ遺伝子に十分に相補的な領域を含み、ヌクレオチドの点から十分な長さであるため、ｉＲＮＡ剤又はその断片はＲｈｏＡ遺伝子の抑制を媒介することができる。物質番号６４７７〜６８３６下の表１のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖のリボヌクレオチド部分は、それぞれＲｈｏＡ遺伝子のｍＲＮＡ配列に完全に相補的であり、それらのセンス鎖のリボヌクレオチド部分は、単一オーバーハング設計のｉＲＮＡ剤におけるアンチセンス鎖上の２個の３’−末端ヌクレオチドを除き、それぞれのアンチセンス鎖のリボヌクレオチド部分に完全に相補的である。しかし、ｉＲＮＡ剤と標的との間に完全な相補性が存在する必要はないが、対応関係は、ｉＲＮＡ剤又はその分解産物が、例えば、ＲＮＡｉによるＲｈｏＡ ｍＲＮＡの開裂により配列特異的サイレンシングを導くことを可能にするほどに十分でなければならない。

従って、本発明のｉＲＮＡ剤は、物質番号６４７７〜６８３６下の表１の配列の１つと下記のように本質的に同一の少なくとも１６，１７又は１８個のヌクレオチドの配列、但し、それぞれ１鎖につき１，２又は３個以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されているが（例えば、アデノシンがウラシルに置換）、それぞれ培養ヒトＲｈｏ発現細胞におけるＲｈｏＡ発現を阻害する能力を本質的に保持している配列を各々が含むセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む物質を含む。従って、これらの物質は、物質番号６４７７〜６８３６下の表１の配列の１つと同一の少なくとも１５個のヌクレオチドを有するが、標的ＲｈｏＡ ｍＲＮＡ配列に関する、或いはセンスとアンチセンス鎖の間の１，２又は３つの塩基ミスマッチが導入される。特にアンチセンス鎖における標的ＲｈｏＡ ｍＲＮＡ配列へのミスマッチは末端領域で最も許容され、存在する場合、１つの末端領域又は複数の末端領域に存在することが好ましく、例えば、５’および／または３’末端の６，５，４若しくは３ヌクレオチド内、最も好ましくはセンス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の３’末端の６，５，４若しくは３ヌクレオチド内に存在する。センス鎖は分子の総体的な二本鎖特性を維持するため、アンチセンス鎖と十分に相補的である必要があるのみである。

ｉＲＮＡ剤が分子の一端又は両端に一本鎖又は非対合領域を含むように、センス及びアンチセンス鎖が選択されることが好ましい。従って、ｉＲＮＡ剤は、好ましくは対合してオーバーハング、例えば、１つ又は２つの５’又は３’オーバーハングであるが好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つの３’オーバーハングを含むセンス及びアンチセンス鎖を含む。大部分の実施形態では１つの３’オーバーハングを含む。好ましいｓｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の一端又は両端において、１〜４、好ましくは２又は３ヌクレオチド長の一本鎖オーバーハング、好ましくは３’オーバーハングを有する。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖より長いことの結果又は同じ長さの二本の鎖がねじれていることの結果でありうる。オーバーハングを形成する不対合ヌクレオチドはリボヌクレオチドでありえて、或いはデオキシリボヌクレオチド、好ましくはチミジンでありうる。５’−末端はリン酸化されることが好ましい。

二重領域の好ましい長さは１５〜３０であり、最も好ましくは１８，１９，２０，２１，２２及び２３ヌクレオチド長であり、例えば、上述のｓｉＲＮＡ剤の範囲内である。ｓｉＲＮＡ剤は長さ及び構造において、長鎖ｄｓＲＮＡ由来のダイサー加工された天然産物に類似しうる。ｓｉＲＮＡ剤の二本の鎖が連結、例えば、共有結合で連結した実施形態も含まれる。必要な二本鎖領域及び好ましくは３’オーバーハングを付与するヘアピン又は、他の一本鎖構造も本発明の範囲内である。

候補ｉＲＮＡ剤の評価
候補ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子の発現を抑制する能力について評価されることができる。例えば、候補ｉＲＮＡ剤を供し、内因的に、或いはＲｈｏＡ蛋白質が発現可能な構造体でトランスフェクションされたために、標的遺伝子、例えばＲｈｏＡ遺伝子を発現する細胞と接触させることができる。候補ｉＲＮＡ剤との接触前後の標的遺伝子の発現レベルを、例えば、ｍＲＮＡ又は蛋白質レベルで比較することができる。標的遺伝子から発現されたＲＮＡ又は蛋白質の量がｉＲＮＡ剤との接触後に減少していると判定された場合、ｉＲＮＡ剤は標的遺伝子の発現を抑制すると結論づけることができる。細胞内の標的ＲｈｏＡ ＲＮＡ又はＲｈｏＡ蛋白質のレベルは、所望の任意の方法により求めることができる。例えば、標的ＲＮＡのレベルはノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を加えた逆転写又はＲＮアーゼ保護アッセイにより求めることができる。蛋白質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット分析又は免疫蛍光法により求められることができる。好ましくは、アッセイでは、例えば、ｉＲＮＡ剤の神経細胞成長を促進する能力を評価することにより、機能レベルでＲｈｏＡ発現を阻害するｉＲＮＡ剤の能力、例えば、本来であれば阻害性の基質、例えば、ミエリンを含む基質上での軸索成長の回復も試験する。

安定性試験、修飾及びｉＲＮＡ剤の再試験
候補ｉＲＮＡ剤は、安定性、例えばｉＲＮＡ剤が対象の体内に導入された時のように、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して評価されることができる。修飾、特に切断、例えば、対象の体内に見出される成分による切断を受けやすい部位を同定するための方法を用いることができる。

切断を受けやすい部位が同定された時、更なるｉＲＮＡ剤を設計し、および／または合成することができ、例えば、切断部位上への２’−修飾、例えば２’−Ｏ−メチル基の導入により、切断可能性のある部位は切断に対して抵抗性となる。この更なるｉＲＮＡ剤は安定性について再試験されることができ、ｉＲＮＡ剤が所望の安定性を示すことが見出されるまで、このプロセスを繰り返しうる。

インビボ試験
ＲｈｏＡ遺伝子発現を阻害することが可能であると同定されたｉＲＮＡ剤は、動物モデルにおいて（例えば、マウス又はラットのような哺乳動物において）インビボにて機能性について試験されることができる。例えば、ｉＲＮＡ剤を動物に投与し、その生体内分布、安定性並びにＲｈｏＡ遺伝子発現を阻害し、或いは少なくとも部分的にＲｈｏＡに媒介される生体又は病理過程を低減する能力に関し、ｉＲＮＡ剤を評価することができる。

ｉＲＮＡ剤を、標的組織、例えば脊髄に、また、脊髄損傷モデルの場合には脊髄損傷部位に、注射などによって直接投与することができる。ｉＲＮＡ剤はヒトに投与される場合と同様に動物モデルに投与されることが好ましい。

ｉＲＮＡ剤はその細胞内分布についても評価されることができる。その評価はｉＲＮＡ剤が細胞内に取り込まれたかを判定されることを含みうる。その評価はｉＲＮＡ剤の安定性（例えば、半減期）を判定されることも含みうる。インビボでのｉＲＮＡ剤の評価は、追跡可能なマーカー（例えば、フルオレセインのような蛍光マーカー；^３５Ｓ，^３２Ｐ，^３３Ｐ若しくは^３Ｈのような放射性標識；金粒子；又は免疫組織化学検査用の抗原粒子）に接合したｉＲＮＡ剤を用いることにより容易にすることができる。

ｉＲＮＡ剤は、ＲｈｏＡ遺伝子発現を抑制する能力に関して評価されることができる。インビボでのＲｈｏＡ遺伝子発現のレベルは、例えば、原位置のハイブリダイゼーションにより、或いはｉＲＮＡ剤への曝露前後の組織からのＲＮＡの単離により測定されることができる。組織を採取するために動物を殺処分する必要がある場合、未処置対照動物を比較のために用いる。ＲｈｏＡ ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、分枝ＤＮＡアッセイ又はＲＮＡアーゼ保護アッセイを含むがこれらに限定されない任意の所望の方法により検出されることができる。或いは、又は更に、ＲｈｏＡ遺伝子発現は、ｉＲＮＡ剤で処理した組織抽出物のウェスタンブロット分析を行うことによりモニタリングされることができる。

動物モデルを用いて一定の所望の効果（例えば、ＥＣ_５０又はＥＤ_５０）を得るのに必要な濃度を確定することができる。このような動物モデルは、ヒト遺伝子、例えば標的ヒトＲｈｏＡ ＲＮＡを産生する遺伝子を発現するトランスジェニック動物を含むことができる。別の実施形態において、試験用組成物には、動物モデルにおける標的ＲｈｏＡ ＲＮＡとヒトにおける標的ＲｈｏＡ ＲＮＡとの間に保存された配列に、少なくとも内部領域において相補的なｉＲＮＡ剤が含まれる。

ｉＲＮＡの化学的性質
本願で述べられるのは単離ｉＲＮＡ剤、例えば、ＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡｉを媒介するｄｓＲＮＡ剤である。

本願で述べられるＲＮＡは、他の点では非修飾のＲＮＡ及び、例えば有効性を改善するために修飾されたＲＮＡ及びヌクレオシドサロゲートのポリマーを含む。非修飾ＲＮＡは、核酸の構成要素、即ち、糖、塩基及びリン酸部分が天然に生じるもの、好ましくはヒトの体内で天然に生じるものと同じか、或いは本質的に同じ分子を指す。当該技術では稀或いは稀有であるが天然に生じるＲＮＡを修飾ＲＮＡと称しており、例えば、リンバッハら（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２２巻：２１８３−２１９６ページ（１９９４年）を参照されたい。このような稀或いは稀有なＲＮＡは修飾ＲＮＡと称されることが多く（その理由は明らかにこれらが典型的に転写後修飾の結果であるためである）、本願で用いられるように非修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本願で用いられる修飾ＲＮＡは、１つ又はそれ以上の核酸の構成要素、即ち、糖、塩基及びリン酸部分が天然に生じるものと異なり、好ましくはヒトの体内で生じるものと異なる分子を指す。これらは修飾“ＲＮＡ”と称されるが、当然のことながら修飾のためにＲＮＡではない分子を含む。ヌクレオシドサロゲートはリボリン酸（ｒｉｂｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）骨格が非リボリン酸構造体に置換された分子であり、非リボリン酸構造体は、例えばリボリン酸骨格の非帯電模倣体のように、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格にみられるものと実質的に同様になるように、塩基が正確な空間関係に提示されることを可能にする。上記の例を本願で述べる。

本願で述べられる修飾は、例えばｉＲＮＡ剤のように、本願で述べられる任意の二本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡ様分子に組み入れることができる。ｉＲＮＡ剤のアンチセンス及びセンス鎖の一方又は両方を修飾することは望ましいといえる。核酸はサブユニットのポリマー又はモノマーであるため、下記の修飾の多くは核酸内で反復される位置で生じ、例えば、塩基又はリン酸部分又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾となる。場合により、修飾は核酸におけるすべての対象位置で生じるが、多くの場合、また、実際にはほとんどの場合、そのようなことはない。例として、修飾は、３’又は５’末端位置でのみ生ずることができ、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２，３，４，５又は１０ヌクレオチドにおいてのみ生ずることができる。修飾は二本鎖領域、一本鎖領域又はその両方で生ずることができる。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオアート修飾は、一方又は両方の末端でのみ生ずることができ、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２，３，４，５又は１０ヌクレオチドにおいてのみ生ずることができ、或いは二本鎖及び一本鎖領域、特に末端において生ずることができる。同様に、修飾はセンス鎖、アンチセンス鎖又はその両方において生ずることができる。場合により、センス鎖とアンチセンス鎖は同修飾又は同種類の修飾を有するが、別の場合には、センス鎖とアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えば、場合により、一本鎖、例えばセンス鎖のみを修飾することが望ましい
ｉＲＮＡへの修飾の導入の２つの主たる目的は、生体内環境における分解に対する安定性と、薬理特性、例えば薬力学特性の向上であり、これについては更に下記に述べる。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基又は骨格に対する他の好適な修飾が、２００４年１月１６日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３号に述べられている。ｉＲＮＡ剤は非天然型塩基、例えば、２００４年４月１６日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２号に述べられているような塩基を含むことができる。ｉＲＮＡ剤は非炭水化物環状担体分子のような非天然型糖を含むことができる。ｉＲＮＡ剤において用いられる非天然型糖の例示的な特徴が、２００３年４月１６日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９号に述べられている。

ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性を高めるのに有用なヌクレオチド間結合（例えば、キラルホスホロチオアート結合）を含むことができる。加えて、或いは選択的に、ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性を高めるためのリボース模倣体を含むことができる。ヌクレアーゼ耐性を高めるための例示的なヌクレオチド間結合及びリボース模倣体が、２００４年３月８日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に述べられている。

ｉＲＮＡ剤はオリゴヌクレオチド合成のためのリガンド結合モノマーサブユニット及びモノマーを含むことができる。例示的なモノマーが２００４年８月１０日に申請された共同所有米国出願第１０／９１６，１８５号明細書に述べられている。

ｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に述べられているようなＺＸＹ構造を有することができる。
ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分と複合体を形成することができる。ｉＲＮＡ剤と共に用いられる例示的な両親媒性部分が、２００４年３月８日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に述べられている。

別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤はモジュール複合体を特徴づける送達物質と複合体を形成することができる。この複合体は、（ａ）縮合物質（例えば、例えばイオン相互作用又は静電的相互作用により核酸を誘引、例えば結合することが可能な物質）；（ｂ）融合誘導物質（例えば、融合することおよび／または細胞膜を通って輸送されることが可能な物質）；並びに（ｃ）特定の細胞型に結合する標的基、例えば細胞又は組織標的物質、例えばレクチン、糖蛋白質、脂質又は蛋白質、例えば抗体、の１つ以上（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つすべて）に結合した担体物質を含むことができる。送達物質と複合体を形成するｉＲＮＡ剤が、２００４年３月８日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に述べられている。

ｉＲＮＡ剤は、例えば、ｉＲＮＡ二重鎖のセンス配列とアンチセンス配列との間のように、非標準型対合を有することができる。非標準型ｉＲＮＡ剤の例示的な特徴が、２００４年３月８日に申請された共同所有ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に述べられている。

ヌクレアーゼ耐性の亢進
ｉＲＮＡ剤、例えば、ＲｈｏＡを標的とするｉＲＮＡ剤は亢進したヌクレアーゼ耐性を有することができる。裸のＲＮＡは、細胞質、血液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）のような生体媒質に遍在するエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼのような核酸分解酵素の好餌となることが多い。速やかな分解はｓｉＲＮＡの標的遺伝子の発現を阻害する能力を大幅に妨げることができる。核酸分解に対する脆弱性は、ｓｉＲＮＡのある種のヌクレオチドを化学的に修飾することにより大幅に低減することができる。しかし、ｓｉＲＮＡを安定化させるために修飾を加えることは、その活性とのトレードオフを表すこともあり、安定化させる修飾は毒性作用さえももたらすことができる。従って、なおも所望レベルの安定性を付与する最少の修飾を導入することが望ましい。通常、センス鎖における修飾はｓｉＲＮＡの活性に対する影響が少ない。

従って、２００４年５月４日に申請された共同所有米国出願第６０／５５９，９１７号明細書、２００４年５月２７日に申請された共同所有米国出願第６０／５７４，７４４号明細書及び２００５年５月２７日に申請された共同所有国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３１に述べられているように、エンドヌクレアーゼによる核酸分解に対するｓｉＲＮＡの安定性を高めるため、特に易分解性位置において限定数のヌクレオチドのみを修飾することが有益である。ピリミジンヌクレオチド、具体的には５’−ｕａ−３’配列コンテクスト、５’−ｕｇ−３’配列コンテクスト、５’−ｃａ−３’配列コンテクスト、５’−ｕｕ−３’配列コンテクスト又は５’−ｃｃ−３’配列コンテクストにおける５’ヌクレオチドが、ほぼその順で特に分解作用を受けやすいことを見出した。配列コンテクスト５’−ｕａ−３’及び５’−ｃａ−３’のすべての発生或いは５’−ｕａ−３’，５’−ｃａ−３’及び５’−ｕｕ−３’のすべての発生或いは５’−ｕａ−３’，５’−ｃａ−３’，５’−ｕｕ−３’及び５’−ｕｇ−３’のすべての発生における５’−末端（ｍｏｓｔ）ピリミジンが、両鎖において２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのような２’−修飾ヌクレオチドに置換された時、本出願人らの研究所により十分に安定した高活性のｓｉＲＮＡが得られた。或いは、センス鎖におけるすべてのピリミジンヌクレオチド並びにアンチセンス鎖における配列コンテクスト５’−ｕａ−３’及び５’−ｃａ−３’のすべての発生における５’−末端（ｍｏｓｔ）ピリミジンを２’−修飾することにより、活性及び安定性の点で良好な結果が得られた。センス鎖におけるすべてのピリミジンヌクレオチド並びにアンチセンス鎖における配列コンテクスト５’−ｕａ−３’，５’−ｃａ−３’，５’−ｕｕ−３’及び５’−ｕｇ−３’のすべての発生における５’−末端（ｍｏｓｔ）ピリミジンを２’−修飾することが必要な場合もあった。ｉＲＮＡ剤は少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５個のこのようなジヌクレオチドを含むことができる。

２’−修飾ヌクレオチドは、例えば、２’−修飾リボースユニットを含むことが好ましく、例えば、２’−ヒドロキシル基（ＯＨ）は多くの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾され、或いは置換されうる。

「オキシ」−２’ヒドロキシル基の修飾の例には、アルコキシ又はアリルオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋により、同じリボース糖の４’炭素に結合した「固定」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミノ、ポリアミノ）が含まれる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）のみを含むオリゴヌクレオチド、（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３，ＰＥＧ誘導体）が、強固なホスホロチオアート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目に値する。

「デオキシ」修飾は、水素（即ち、デオキシリボース糖であり、これらは部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分に特に関連する）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ又はアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；並びに任意に、例えばアミノ官能基に置換されうるアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含む。

好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ_３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル及び２’−フルオロである。
オリゴヌクレオチド骨格にフラノース糖を含めることも、エンドヌクレアーゼ的切断を低減することができる。ｉＲＮＡ剤は、３’カチオン基を含むことにより、或いは３’−３’結合により３’−末端においてヌクレオチドを転置することにより、更に修飾することができる。別の代替例では、３’−末端はアミノアルキル基で遮断することができ、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴとなる。他の３’接合体は３’−５’エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。理論によって限定されることはないが、ナプロキセン又はイブプロフェンのような３’接合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’−末端に結合するのを立体的に遮断することにより、エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。小アルキル鎖、アリール基又は複素環接合体又は修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコース等）でも３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。

核酸分解切断を、リン酸リンカー修飾、例えば、ホスホロチオアート結合の導入によっても阻害することができる。従って、好ましいｉＲＮＡ剤は、通常は酸素によって占められる非架橋位置においてヘテロ原子を有する特定のキラル型の修飾リン酸基のために濃縮され、或いは純粋なヌクレオチド二量体を含む。ヘテロ原子はＳ，Ｓｅ，Ｎｒ_２又はＢｒ_３でよい。ヘテロ原子がＳの場合、濃縮され、或いはキラル的に純粋なＳｐ結合が好ましい。濃縮とは少なくとも７０，８０，９０，９５又は９９％の好ましい形態である。修飾リン酸基結合は、特にｉＲＮＡ剤の５’−又は３’−末端位置、好ましくは５’−末端位置近傍に導入される時、エキソヌクレアーゼ的切断を阻害するのに効果的である。

５’接合体も５’−３’エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。理論によって限定されないが、ナプロキセン又はイブプロフェンのような５’接合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合するのを立体的に遮断することにより、エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。小アルキル鎖、アリール基又は複素環接合体又は修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコース等）でも３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。

ｉＲＮＡ剤は、二重ｉＲＮＡ剤が少なくとも一端に一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む時、上昇したヌクレアーゼ耐性を有することができる。好ましい実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは１〜４、好ましくは２〜３の不対合ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、末端ヌクレオチド対に直接隣接する一本鎖オーバーハングの不対合ヌクレオチドはプリン塩基を有し、末端ヌクレオチド対はＧ−Ｃ対であり、或いは最後の４つの相補的対合の少なくとも２つがＧ−Ｃ対である。更なる実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは１又は２つの不対合ヌクレオチドを有しえて、例示的実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングはアンチセンス鎖の３’−末端に存在する。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、２−ｎｔオーバーハング５’−ＧＣ−３’が形成されるように、アンチセンス鎖の３’−末端にモチーフ５’−ＣＧＣ−３’を含む。

従って、ｉＲＮＡ剤は、対象の体内に見出される、例えばヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる分解を阻害するために修飾を含む。これらのモノマーは本願でＮＲＭ、即ち、ヌクレアーゼ耐性促進モノマーと称され、対応する修飾はＮＲＭ修飾と称される。多くの場合、これらの修飾はｉＲＮＡ剤の他の特性、例えば、蛋白質、例えば輸送蛋白質、例えば血清アルブミン又はＲＩＳＣのメンバーと相互作用する能力或いは第一及び第二の配列の互いに二重鎖を形成又は別の配列、例えば標的分子と二重鎖を形成する能力も調節する。

１又はそれ以上の異なるＮＲＭ修飾をｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤の配列に導入することができる。ＮＲＭ修飾は配列又はｉＲＮＡ剤において２回以上用いることができる。
ＮＲＭ修飾は末端のみに配置可能なものと任意の位置でよいものとを含む。一部のＮＲＭ修飾はハイブリダイゼーションを阻害しうるため、末端領域でのみ用いることが好ましく、特にアンチセンス鎖における対象配列又は遺伝子を標的とする配列の切断部位又は切断領域において用いないことが好ましい。ＮＲＭ修飾はセンス鎖においては任意の位置で用いることができるが、但し、ｄｓｉＲＮＡ剤の二本鎖間の十分なハイブリダイゼーションが維持されるものとする。一部の実施形態において、標的外れのサイレンシングを最小化できるため、ＮＲＭをセンス鎖の切断部位又は切断領域に配置することが望ましい。

多くの場合、ＮＲＭ修飾はセンス鎖において構成されるか、又はアンチセンス鎖において構成されるに依存し、異なって分配される。アンチセンス鎖の場合、エンドヌクレアーゼ切断に干渉し、或いはエンドヌクレアーゼ切断を阻害する修飾は、ＲＩＳＣ媒介性切断を受ける領域、例えば、切断部位又は切断領域に挿入されるべきではない（エルバシールら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．），Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．第１５巻：１８８ページ（２００１年））に記載のとおりであり、これは参照して本願に組み込まれる）。標的の切断は、２０又は２１ｎｔアンチセンス鎖のほぼ中央又はアンチセンス鎖と相補的な標的ｍＲＮＡ上の第一のヌクレオチドの約１０又は１１ヌクレオチド上流にて生じる。本願で用いるように、切断部位は標的又はこれにハイブリダイズするｉＲＮＡ剤鎖上の切断部位のいずれかの側におけるヌクレオチドを指す。標的領域とは、いずれかの方向における、切断部位の１，２又は３ヌクレオチド内のヌクレオチドのことである。

このような修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の末端領域、例えば、末端位置又は末端の２，３，４若しくは５位置に導入することができる。
連結リガンド
薬理特性を含むｉＲＮＡ剤の特性は、例えば、リガンド、例えば連結リガンドの導入により影響を受け、調整されうる。

多種多様な構成要素、例えばリガンドを、ｉＲＮＡ剤、例えばリガンド接合モノマーサブユニットの担体に連結することができる。リガンド接合モノマーサブユニットのコンテクストにおいて、例を下記に説明しているが、これは好ましいというだけのことであり、構成要素は他の位置においてｉＲＮＡ剤に結合されうる。

好ましい部分はリガンドであり、リガンドは、好ましくは共有結合的に、介在テザーを通じて直接又は間接に担体に結合される。好ましい実施形態において、リガンドは介在テザーを通じて担体と結合する。リガンド又は連結リガンドは、リガンド接合モノマーが成長鎖に組み込まれる時、リガンド接合モノマー上に存在しうる。一部の実施形態において、リガンドは、「前駆体」リガンド接合モノマーサブユニットが成長鎖に組み込まれた後、「前駆体」リガンド接合モノマーサブユニットに組み込まれうる。例えば、アミノ末端テザー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２を有するモノマーは成長センス鎖又はアンチセンス鎖に組み込まれうる。引き続いての処理において、即ち、前駆体モノマーサブユニットの鎖への組み込み後、求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドは、その後、リガンドの求電子基を前駆体リガンド接合モノマーサブユニットテザーの末端求核基と結合することにより、前駆体リガンド接合モノマーに結合することができる。

好ましい実施形態において、リガンドはそれが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的又は存続期間を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種に比し、選択された標的、例えば分子、細胞又は細胞型、区画、例えば細胞又は器官区画、組織、器官或いは体内の領域に対する亢進した親和性を付与する。

好ましいリガンドは輸送、ハイブリダイゼーション及び特異性を向上させることができ、生成される天然型若しくは修飾オリゴリボヌクレオチド又は本願で述べられるモノマーの任意の組合せを含む高分子および／または天然型若しくは修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させうる。

一般的に、リガンドは、例えば取込みを亢進するための治療的修飾；例えば分布をモニタリングするための診断化合物又はレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性付与部分；並びに天然型又は稀有な核酸塩基を含むことができる。一般例には、親油性分子、脂質、レクチン、ステロイド（例えば、ウバオール、ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ、ジオスゲニン）、テルペン（例えばトリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール（ｅｐｉｆｒｉｅｄｅｌａｎｏｌ）誘導化リトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）、蛋白質、蛋白質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン及びペプチド模倣体が含まれる。

リガンドは、天然型又は組換え又は合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸となりうる。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−解糖コポリマー、ジビニルエチル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー又はポリホスファジンが含まれる。ポリアミン類の例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド擬似ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン成分、例えばカチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩又はアルファ螺旋ペプチドが含まれる。

リガンドは、標的基、例えば細胞又は組織標的剤、例えばチロトロピン、メラノトロピン、界面活性蛋白質Ａ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸又はＲＧＤペプチド若しくはＲＧＤペプチド模倣体も含みうる。

リガンドは、蛋白質、例えば糖蛋白質、リポ蛋白質、例えば低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）又はアルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はペプチド、例えばｃｏ−リガンドに対する特異的親和性を有する分子又は抗体、例えば癌細胞、内皮細胞若しくは骨細胞のような特定の細胞型に結合する抗体とすることができる。リガンドはホルモン及びホルモン受容体も含みうる。リガンドは、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース又は多価フコースのような非ペプチド種を含むこともできる。リガンドは、例えばリポ多糖体、Ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子又はＮＦ−κＢの活性化因子とすることができる。

リガンドは、例えば細胞骨格を破壊することにより、例えば細胞の微小管、ミクロフィラメントおよび／または中間フィラメントを破壊することにより、ｉＲＮＡ剤の細胞への取込みを高めることが可能なサブスタンス、例えば薬剤でよい。薬剤は、例えばタクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ、ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ Ａ、ファロイジン、スウィンホライドＡ（ｓｗｉｎｈｏｌｉｄｅ Ａ）、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）又はｍｙｏｓｅｒｖｉｎでよい。

一態様において、リガンドは脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は血清蛋白質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば肝臓の実質細胞を含む肝臓組織、への接合体の分布を可能にする。ＨＳＡに結合することが可能な他の分子もリガンドとして用いることができる。例えば、ｎｅｐｒｏｘｉｎ又はアスピリンを用いることができる。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）接合体の分解に対する耐性を高め、（ｂ）標的又は標的細胞若しくは細胞膜への輸送を向上させ、および／または（ｃ）血清蛋白、例えばＨＳＡへの結合を調整するのに用いることができる。

脂質ベースのリガンドは接合体の標的組織への結合を調節、例えば制御するために用いることができる。例えば、ＨＳＡにより強固に結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的とする可能性が少なく、従って、体内から除去されにくい。ＨＳＡにより弱く結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して接合体を標的とするために用いることができる。

好ましい実施形態において、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。脂質ベースのリガンドは、接合体が好ましくは非腎臓組織に分布されるように、十分な親和性をもってＨＳＡに結合することが好ましい。しかし、ＨＳＡ−リガンド結合が転換しないほどに親和性が強くないことが好ましい。

別の態様において、リガンドは、成分、例えばビタミン又は栄養素であり、これは標的細胞、例えば増殖細胞に取り込まれる。これらは、例えば悪性型又は非悪性型の不要な細胞増殖、例えば癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンにはビタミンＡ，Ｅ及びＫが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は癌細胞に取り込まれる他のビタミン若しくは栄養素が含まれる。

別の態様において、リガンドは細胞透過剤、好ましくは螺旋細胞透過剤である。細胞透過剤は両親媒性であることが好ましい。好ましい細胞透過剤はｔａｔ又はアンテナペディアのようなペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、修飾することができ、これにはペプチジル模倣体、インバートマー（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチド若しくは擬似ペプチド結合及びＤ−アミノ酸の使用が含まれる。螺旋細胞透過剤はα螺旋剤であることが好ましく、親油性及び疎油性相を有することが好ましい。

５’−リン酸修飾
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は５’リン酸化され、或いは５’第一末端においてホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングに適合する修飾が含まれる。好適な修飾には、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化又は非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）及び任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオアート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオアート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’），５’−ホスホロチオアート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；並びに酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸及び三リン酸の任意の付加的組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’，（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’），５’−アルキルホスホナート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−，（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−），５’−アルキルエーテルホスホナート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−），エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が含まれる。

センス鎖はセンス鎖を不活性化し、活性ＲＩＳＣの形成を阻止するために修飾することができ、これにより、標的外れの作用を低減する可能性がある。これは、センス鎖の５’−リン酸化を阻止する修飾により、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドによる修飾により可能となる（ニッカネンら（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．），「ＲＮＡ干渉経路におけるＡＴＰ必要条件及び小干渉ＲＮＡ構造（ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ）」Ｃｅｌｌ第１０７巻，３０９−３２１ページ（２００１年）を参照）。リン酸化を阻止する他の修飾も用いることができ、例えば、単にＯ−ＭＥではなくＨで５’−ＯＨを置換する。或いは、巨大基（ｌａｒｇｅ ｂｕｌｋｙ ｇｒｏｕｐ）を５’−リン酸に付加し、ホスホジエステル結合に変えうる。

ｉＲＮＡ剤の細胞への輸送
理論によって限定されることを望まないが、コレステロール接合ｉＲＮＡ剤とリポ蛋白質のある種の構成成分（例えば、コレステロール、コレステリルエステル、リン脂質）との化学的類似性は、血中におけるｉＲＮＡ剤のリポ蛋白質（例えば、ＬＤＬ，ＨＤＬ）との結合および／またはコレステロールに対する親和性を有する細胞成分、例えばコレステロール輸送経路の成分とのｉＲＮＡ剤の相互作用をもたらしうる。リポ蛋白質及びその成分は、種々の能動的及び受動的輸送メカニズム、例えば、限定されずに、ＬＤＬ−受容体結合ＬＤＬのエンドサイトーシス、スカベンジャー受容体Ａとの相互作用を通じた酸化又は修飾ＬＤＬのエンドサイトーシス、肝臓におけるスカベンジャー受容体Ｂ１媒介性のＨＤＬコレステロールの取込み、ピノサイトーシス又はＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送蛋白質、例えば、ＡＢＣ−Ａ１，ＡＢＣ−Ｇ１又はＡＢＣ−Ｇ４によるコレステロールの膜横断輸送によって、細胞により取り込まれ、処理される。従って、コレステロール接合ｉＲＮＡ剤は、このような輸送メカニズムを有する細胞、例えば肝細胞による取込みを促進しうる。このようにして、本発明は、このような成分（例えば、コレステロール）に対する天然リガンドをｉＲＮＡ剤に接合することにより、或いは成分（例えば、ＬＤＬ，ＨＤＬ）に対する天然リガンドに結合するｉＲＮＡ剤に化学的成分（例えば、コレステロール）を接合することにより、ある種の細胞表面部分、例えば受容体を発現している細胞に対してｉＲＮＡ剤を標的とするための根拠及び一般的方法を提供する。

他の実施形態
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、例えば細胞内に送達される外因性ＤＮＡテンプレートから、インビボにて細胞内に生成されうる。例えば、ＤＮＡテンプレートはベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして用いられることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静注、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号明細書）により、或いは定位的注射（例えば、チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ第９１巻：３０５４−３０５７ページ（１９９４年）を参照）により、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができ、或いは遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含むことができる。ＤＮＡテンプレートは、例えば２つの転写ユニットを含むことができ、その１つはｉＲＮＡ剤の上部鎖を含む転写物を生成し、もう１つはｉＲＮＡ剤の下部鎖を含む転写物を生成する。テンプレートが転写されると、ｉＲＮＡ剤が生成され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤断片に処理される。

製剤化
本願で述べられるｉＲＮＡ剤は、対象への投与のために製剤化されることができる。
説明を容易にするため、このセクションにおける製剤、組成物及び方法は、主に非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかし、これらの製剤、組成物及び方法は他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤について実施することができ、このような実施は本発明の範囲内にあることを理解する必要がある。

製剤化ｉＲＮＡ剤組成物は様々な状態をとりうる。一部の例では、組成物は少なくとも部分的に結晶質、均一に結晶質および／または無水である（例えば、８０，５０，３０，２０又は１０％未満の水分）。別の例では、ｉＲＮＡ剤は水性相、例えば水分を含む溶液中にある。

水性相又は結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えばリポソーム（特に水性相で）又は粒子（例えば、結晶性組成物に適切でありうるような微粒子）に取り込まれうる。一般的に、ｉＲＮＡ剤組成物は目的とする投与法に適合する態様にて製剤化される。

ｉＲＮＡ剤調製物は、別の物質、例えば別の治療剤又はｉＲＮＡ剤を安定化する物質、例えばｉＲＮＡ剤と複合してｉＲＮＰを形成する蛋白質と組み合わせて製剤化されることができる。更に他の物質には、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ^２＋のような二価カチオンを除去するため）、塩類、ＲＮアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎのような広特異性ＲＮアーゼ阻害剤）などが含まれる。

一実施形態において、ｉＲＮＡ剤調製物は２以上のｉＲＮＡ剤、例えば同じ遺伝子又は異なる対立遺伝子に関して、或いは異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介しうる２以上のｉＲＮＡ剤を含む。このような調製物は少なくとも３，５，１０，２０，５０又は１００以上の異なるｉＲＮＡ剤種を含むことができる。このようなｉＲＮＡ剤は同等数の異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介することができる。

このような調製物における２以上のｉＲＮＡ剤が同じ遺伝子を標的とする場合、これらは非重複及び非隣接標的配列を有することができ、或いは標的配列は重複又は隣接することができる。

ＲｈｏＡ発現に関連する障害
ＲｈｏＡを標的とするｉＲＮＡ剤、例えば本願で述べられるｉＲＮＡ剤は、対象、例えばＲｈｏＡ遺伝子発現に関連する疾患若しくは障害を有し、又は発症するリスクを有するヒトを処置し、或いはＲｈｏＡに媒介される生体プロセスが不要な場合の対象を処置するために用いられることができる。Ｎｏｇｏ−Ｌ，ＲｈｏＡ及びＮｏｇｏ−Ｒが軸索の成長及び伸長の阻害に加わるため、本発明のｉＲＮＡ剤は、この阻害を転換し、神経／軸索の成長及び伸長をもたらすために用いられる。このような処置は、脊髄損傷又は末梢神経死（例えば、ＣＮＳの転移癌、例えば膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫のような神経膠腫を原因とする）のような神経系に対する損傷を処置するのに有用であり、髄膜腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、脈絡叢乳頭腫、肉腫も本明細書で述べるｉＲＮＡ剤により処置することができる。他の適応には中枢神経系の疾患が含まれ、これには、脳脊髄炎、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、海綿状脳症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ギラン・バレー症候群、前脊髄動脈症候群及び統合失調症が含まれるが、これらに限定されない。

例えば、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤は、脊髄損傷を有する対象或いは神経の成長及び伸長により少なくとも部分的に改善することが可能な別の病理状態を有する対象を処置するために用いられることができる。このような用途では、本発明のｉＲＮＡ剤は、神経損傷部位又はＲｈｏＡの阻害作用が転換されることが所望される部位に局所的に投与されることが好ましい。ｉＲＮＡ剤の投与はＲｈｏＡ蛋白質の減少を引き起こし、軸索の伸長及び成長のＮｏｇｏ媒介性阻害の転換をもたらす。

処置方法及び送達経路
ｉＲＮＡ剤、例えばＲｈｏＡを標的とするｉＲＮＡ剤を含む組成物は、作用部位への局所送達又は対象への全身送達を成すため、様々な経路により対象に送達されうる。例示的な経路には、処置部位への直接注射、髄腔内、実質、静脈内、経鼻、経口及び点眼送達が含まれる。本発明のｉＲＮＡ剤を投与する好ましい手段は処置部位への直接注射又は注入による。

ｉＲＮＡ剤は、投与に好適な医薬組成物に組み込まれることができる。例えば、組成物は１種以上のｉＲＮＡ剤と医薬的に許容可能な担体とを含むことができる。本願で用いられるように、「医薬的に許容可能な担体」という表現は、薬剤投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌及び抗真菌剤、等張性吸収遅延剤などを含むものとする。医薬的に活性化した物質に対してこのような媒質及び作用物質を用いることは当該技術分野で周知である。従来の媒質又は作用物質が活性化合物に適合しない場合を除き、組成物におけるその使用は企図される。補助的活性化合物を組成物に組み込むことも可能である。

本発明の医薬組成物は、局所又は全身処置が所望されるか、また、処置部位に依存し、多くの方法で投与されうる。投与は局所的（点眼、鼻内、経皮）、経口又は非経口でよい。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は髄腔内若しくは脳室内投与が含まれる。

送達経路は患者の障害に依存することができる。通例、本発明のｉＲＮＡ剤の送達は対象への全身送達を成すために行われる。これを達成する１つの好ましい手段は非経口投与による。特に好ましい実施形態において、脊髄損傷部位のような神経損傷部位への医薬組成物の直接適用により、処置が成される。非経口投与の製剤は、これもまた緩衝剤、希釈剤や他の添加剤を含みうる滅菌水溶液を含むことができる。静注では溶質の総濃度は調製物が等張性となるように調節される必要がある。

前述の小干渉ＲＮＡベクターを用いて、本発明は、神経系及び又は／脳における標的位置への干渉ＲＮＡの送達のためのデバイス、システム及び方法も提供する。送達の想定経路は、本発明のｄｓＲＮＡを含む少量の流体を局所神経又は局所脳組織に注入するための手段を付与する、埋め込まれた髄腔内又は実質内留置カテーテルを用いることによるものである。これらのカテーテルの近位端は、患者のからだ又は頭蓋に外科的に固定された、埋め込まれた髄腔内又は脳内アクセスポート或いは患者の胴部に位置する、埋め込まれた薬剤ポンプに結合されることができる。

或いは、埋め込み型ポンプのような埋め込み型送達デバイスを用いることができる。本発明の範囲内の送達デバイスの例には８５０６型治験医療機器（メドトロニック社製［米国ミネソタ州ミネアポリス］）が含まれ、これは体内又は頭蓋に皮下移植可能であり、治療剤が神経又は脳に送達されうるアクセスポートを付与する。送達は定位的に埋め込まれたポリウレタンカテーテルを通して行われる。８５０６型のアクセスポートと機能することが可能な２つの型のカテーテルには、米国特許第６，０９３，１８０号明細書に開示され、参照して本願に組み込まれる、脳内室への送達用のメドトロニック社製の８７７０型脳室カテーテルと、米国特許出願第０９／５４０，４４４号明細書及び第０９／６２５，７５１号明細書に開示され、参照して本願に組み込まれる、脳組織そのものへの送達（即ち、実質内送達）用のメドトロニック社製のＩＰＡＩカテーテルが含まれる。後者のカテーテルは、治療剤をカテーテル経路に沿って複数の部位に送達するために、その遠位端に複数のアウトレットを有する。前述のデバイスに加えて、本発明による小干渉ＲＮＡベクターの送達は多種多様なデバイスを用いて成すことができ、これには米国特許第５，７３５，８１４号明細書，第５，８１４，０１４号明細書及び第６，０４２，５７９号明細書が含まれるがこれらに限定されず、これらはすべて参照して本願に組み込まれる。本発明の教示を用いて、これらや他のデバイス及びシステムが本発明に従って疼痛処置のために小干渉ＲＮＡベクターの送達に好適でありうることを、当業者は認識するであろう。

このような一実施形態において、当該方法はからだ又は脳の外側にポンプを埋め込むステップを更に含み、ポンプはカテーテルの近位端に結合され、ポンプを操作し、カテーテルの排出部を通じて少なくとも１つの小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡベクターの所定用量を送達する。更なる実施形態では、前記体又は脳の外側のポンプに対する少なくとも１つの小干渉ＲＮＡ又は小干渉ＲＮＡベクターの供給を定期的に更新する更なるステップを含む。

従って、本発明は、米国特許第５，７３５，８１４号明細書及び第６，０４２，５７９号明細書に教示されているような埋め込み型ポンプ及びカテーテルを用いて、更に米国特許第５，８１４，０１４号明細書に教示されているような、神経又は脳に送達される小干渉ＲＮＡベクターの量を調節するために注入システムの一部としてセンサーを用いた、小干渉ＲＮＡベクターの送達を含む。本発明の方法に従って他のデバイス及びシステムを用いることができ、例えば、米国特許出願第０９／８７２，６９８号明細書（２００１年６月１日に申請）及び第０９／８６４，６４６号明細書（２００１年５月２３日に申請）に開示されているデバイス及びシステムであり、これらは参照して本願に組み込まれる。

ポンプ又はカテーテルのアウトレットは、脊髄又は他の神経の損傷部位近傍のように、医薬組成物の所望の作用部位に近接して配置されることが好ましい。
投与は対象又は別の者、例えば介護者により提供することができる。介護者はヒトにケアを提供することに関与する任意の実在でよく、例えば、病院、ホスピス、診療所、外来診療所；医師、看護師又は他の施術者のような医療従事者；或いは配偶者又は親のような保護者である。薬剤は測定量又は計量を送達するディスペンサーにて供することができる。

「治療有効量」という用語は、期待される生理反応を与えるために処置される対象において所望レベルの薬剤を与えるのに必要な組成物に存在する量である。
「生理学的有効量」という用語は、所望の緩和又は治療効果を与えるために対象に送達される量である。

「医薬的に許容可能な担体」という用語は、肺に対する重大な有害毒性作用なしに担体が肺に取り込まれることが可能であるこという。
「共投与」という用語は、２以上の薬剤、特に２以上のｉＲＮＡ剤を対象に投与することを指す。薬剤は単一の医薬組成物に含有され、同時に投与することが可能であり、或いは薬剤は別々の製剤に含有され、連続的に対象に投与することが可能である。２剤を対象において同時に検出することが可能であるなら、２剤は共投与されるといわれる。一実施形態において、Ｎｏｇｏ−Ｌ，ＲｈｏＡ及びＮｏｇｏ−Ｒ ｉＲＮＡ剤が共投与される。

担体として有用な医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような安定化剤、炭水化物、アミノ酸及びポリペプチドのような充填剤；ｐＨ調整剤又は緩衝剤；塩化ナトリウムのような塩類などが含まれる。これらの担体は結晶形又は非晶形でよく、或いはこの２つの混合物でよい。

特に価値のある充填剤には相溶性の炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸又はこれらの組合せが含まれる。好適な炭水化物には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、トレハロースなどの二糖；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン；及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが含まれる。好ましい炭水化物群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース マルトデキストリン及びマンニトールが含まれる。好適なポリペプチドにはアスパルテームが含まれる。アミノ酸にはアラニン及びグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。

好適なｐＨ調整剤又は緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどのような有機性の酸及び塩基から調製される有機塩が含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい。

用量 ｉＲＮＡ剤は、約７５ｍｇ未満／ｋｇ体重又は約７０，６０，５０，４０，３０，２０，１０，５，２，１，０．５，０．１，０．０５，０．０１，０．００５，０．００１若しくは０．０００５ｍｇ未満／ｋｇ体重で、２００ｎｍｏｌ未満のｉＲＮＡ剤／ｋｇ体重（例えば、約４．４×１０１６の複製）又は１５００，７５０，３００，１５０，７５，１５，７．５，１．５，０．７５，０．１５，０．０７５，０．０１５，０．００７５，０．００１５，０．０００７５，０．０００１５ｎｍｏｌ未満のｉＲＮＡ剤／ｋｇ体重の単位用量で投与することができる。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内又は筋肉内、髄腔内、或いは器官に直接）、吸入用量又は局所適用により投与することができる。

ｉＲＮＡ剤の器官への直接送達（例えば、肝臓へ直接）は、約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ／器官又は好ましくは約０．０００１〜０．００１ｍｇ／器官、約０．０３〜３．０ｍｇ／器官、約０．１〜３．０ｍｇ／眼若しくは約０．３〜３．０ｍｇ／器官の用量とすることができる。

用量は疾患又は障害を処置し、或いは予防するのに有効な量となりうる。
一実施形態において、単位用量は１日１回より低頻度で、例えば、２，４，８又は３０日毎より少なく投与される。別の実施形態において、単位用量は頻度をもって投与されない（例えば、規則的な頻度でない）。例えば、単位用量は単回で投与されうる。ｉＲＮＡ剤組成物の投与後、ｉＲＮＡ剤媒介性サイレンシングが数日間持続するため、多くの場合、１日１回未満の頻度又は場合により、全治療レジメンで１回のみで組成物を投与することが可能である。

一実施形態において、対象は、初期用量並びに１又はそれ以上の維持用量のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤又はｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することが可能な比較的大きいｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤をコードするＤＮＡ、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤又はｓｉＲＮＡ剤又はその前駆体）を投与される。通常、維持用量は初期用量より少なく、例えば、初期用量より半分少ない。維持レジメンは、０．０１〜７５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、例えば、７０，６０，５０，４０，３０，２０，１０，５，２，１，０．５，０．１，０．０５，０．０１，０．００５，０．００１又は０．０００５ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で対象を処置することを含む。維持用量は５，１０又は３０日毎に１回以下で投与されることが好ましい。更に、治療レジメンは特定の疾患の性状、重症度及び患者の全体的な状態に依存して異なる期間、継続しうる。好ましい実施形態において、用量は１日１回以下、例えば、２４，３６，４８時間以上毎に１回以下、例えば、５又は８日毎に１回以下、投与されうる。治療後、患者は状態の変化及び病態の症状の緩和についてモニタリングされうる。化合物の用量は、患者が現行の用量レベルに有意に応答しない場合には増量され、或いは用量は、病態の症状の緩和が認められる場合、病態が消失した場合、又は望ましくない副作用が認められる場合には減量されうる。

有効量は、具体的な状況下で望ましく、或いは適切であるとみなされるように、単回投与又は２回以上の投与にて投与されうる。反復又は頻回注入を容易にすることが所望される場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、槽内又は包内）又はレザバーが望ましい場合もある。

良好な治療後、病態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましいことがあり、この場合、本発明の化合物は０．００１ｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量にて投与される（米国特許第６，１０７，０９４号明細書を参照）。

ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害を処置又は予防するのに有効であり、或いはヒトにおける生理状態を調整するのに十分な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度又は量は、物質に求められるパラメータ並びに投与法、例えば、経鼻、口腔内、肺内又は髄腔内若しくは神経損傷部位のような局所投与に依存する。例えば、局所用製剤は刺激又は炎症を避けるため、幾つかの成分の濃度がはるかに低くてよい。

ある種の要因が対象を効果的に処置するのに必要な用量に影響を及ぼすことができ、これには疾患又は障害の重症度、過去の治療、対象の全般的健康および／または年齢や他に存在する疾患が含まれるがこれらに限定されない。治療に用いられるｓｉＲＮＡのようなｉＲＮＡ剤の有効量は、特定の治療の経過にわたり増加又は減少しうるということも理解されよう。投与量の変更は診断アッセイの結果から生じ、或いはその結果から明らかとなる。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後、対象をモニタリングすることができる。モニタリングからの情報に基づき、追加量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することができる。

投与は処置対象の病態の重症度及び応答性に依存し、治療過程は数日から数ヶ月或いは治癒がもたらされ、又は病態の減弱が得られるまで継続する。至適投与計画は、患者の体内における薬剤の蓄積又は局所、例えば神経損傷部位、例えば脊髄損傷部位に投与される時の適用部位における薬剤の蓄積の測定から計算することができる。当業者であれば、至適用量、投与法及び反復率を容易に決定することができる。至適用量は、個々の化合物の相対的効力に依存して異なりえて、通常、上記のようにインビトロ及びインビボでの動物モデルにおいて有効であると見出されるＥＣ５０に基づいて推定することができる。

本発明は、以下の実施例により更に説明されるが、更に限定するものとみなされるべきではない。

正式名称を用いて以下に核酸配列を表し、具体的には表２の省略形となる。

（試薬源）
本願で試薬源が具体的に示されない場合、このような試薬は分子生物学での適用に標準的な品質／純度にて分子生物学用の試薬の任意の供給元から得られる。

実施例１：配列の選択
マウス及びラットＲｈｏＡ ｍＲＮＡにおけるそれぞれの配列に対する完全な相同性を有するヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡの配列内の領域を同定するため、配列アラインメントを行った（ヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡ：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６６４；マウスＲｈｏＡ ｍＲＮＡ：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６８０２；ラットＲｈｏＡ ｍＲＮＡ：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５７１３２）。このようにして同定した相同領域内で、ヒトに存在する他のｍＲＮＡ配列に対する、このような配列を含むｓｉＲＮＡの交差反応の可能性のＢＬＡＳＴによる更なる比較により、１９ヌクレオチドの可能性のあるすべての隣接配列を検討した。任意の他のヒトｍＲＮＡ又はゲノム配列に対する３以上のミスマッチを有する配列のみを選択した。得られた１９ｎｔ配列のセットを、表１に示す二重オーバーハングｉＲＮＡ剤のセンス鎖リボヌクレオチド配列に表す。

生体媒質における試験に対するｓｉＲＮＡの安定性、特にエンド−及びエキソヌクレアーゼによる核酸分解作用に対する安定性を最大限にするため、センス鎖ではすべてのシチジン及びウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル基を含み、また、アンチセンス鎖では５’−ｃａ−３’又は５’−ｕａ−３’の配列コンテクストに現れるすべてのシチジン及びウリジンが２’−Ｏ−メチル基を含むように、ｓｉＲＮＡを合成した。

同じ目的で、３’−末端５’−ＴＴ−３’基チミジン間にオスホロチオアート結合を導入した。ｓｉＲＮＡのインビボ活性に関連する血清及び他の生体媒質中の最も活性の高いエキソヌクレアーゼは、ｓｉＲＮＡ鎖３’−５’を分解することにより作用するという経験をした。アンチセンス鎖における末位から二番目の２ヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチル−５’−オスホロチオアート修飾ヌクレオチドで置換することが有益であり、十分であることが多いということが判明した（例えば、２３ヌクレオチドアンチセンス鎖の５’〜３’を計算し、２１及び２２位のヌクレオチド）；末位から二番目のヌクレオチドのみを修飾し、或いは５’−オスホロチオアート修飾ヌクレオチドのみを用いて、或いはその両方で十分である場合もある。センス鎖は同様に保護されえて、および／またはホスホジエステル又はオスホロチオアートジエステルを通じて連結リガンドに３’接合されうる。

上記のように選択した配列に加えて、アフメッド、ゼット．ら（（Ａｈｍｅｄ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第２８巻：５０９−２３ページ（２００５年））の著者らが用いた４つのｓｉＲＮＡに対応する４つのｓｉＲＮＡを合成した。ＡＬ−ＤＰ−５８５０は上記アフメッド、ゼット．ら（Ａｈｍｅｄ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．）のＲＨＯ−Ａ１に対応し、ＡＬ−ＤＰ−５８５１は上記アフメッド、ゼット．ら（Ａｈｍｅｄ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．）のＲＨＯ−Ａ２に、ＡＬ−ＤＰ−５８５２はＲＨＯ−Ａ５に、ＡＬ−ＤＰ−５８５３はＲＨＯ−Ａ４に対応する。

実施例２：ｓｉＲＮＡの合成
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），アプレラードイッチュラント社（Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）［ドイツ、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）］と、固相担体として制御多孔性ガラス（ＣＰＧ，５００Ａ，グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）［米国バージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）］）を用いて、１μモルの尺度で固相合成により一本鎖ＲＮＡを生成した。それぞれ対応するホスホルアミダイト及び２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトを用いて（プロリゴビオヒェミー社（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ））［ドイツ、ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｕｇ）］、固相合成によりＲＮＡ及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡを生成した。ビューケージ、エス．エル．ら（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（Ｅｄｒｓ．），ジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）［米国ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］における核酸化学の現行プロトコルに記載されているような標準ヌクレオチドホスホルアミダイト化学を用いて、これらの構成単位をオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ヨード酸化溶剤をアセトニトリル（１％）中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（クルアケム社（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ）［英国グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）］）に置き換えることにより、オスホロチオアート結合を導入した。更なる補助試薬をマリンクロットベーカー社（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ）［ドイツ、グリースハイム（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ）］から入手した。

所定の手順に従って粗オリゴリボヌクレオチドのアニオン交換ＨＰＬＣによる脱保護及び精製を行った。分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ、ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ［ドイツ、ウンターシュライスハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ）］）を用いて、２６０ｎｍの波長にてそれぞれのＲＮＡ溶液のＵＶ吸収により、収量及び濃度を求めた。アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中、相補鎖の等モル溶液を混合して二本鎖ＲＮＡを生成し、８５〜９０℃で３分、水槽中で加熱し、３〜４時間にわたり室温まで冷却した。使用するまで精製ＲＮＡ溶液を−２０℃で保存した。

上記合成法の結果、上記のように合成したオリゴヌクレオチドはすべて５’−末端（ｍｏｓｔ）ヌクレオチド上にリン酸基を含まない。
図１に示すように、コレステロールをｓｉＲＮＡに３’接合した。これらの３’−コレステロール−コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの合成のために、適切に修飾された固相担体をＲＮＡ合成のために用いた。固相担体は次のように調製した。
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ

水（５０ｍＬ）中のエチルグリシナートヒドロクロリド（３２．１９ｇ，０．２３モル）の撹拌氷***液に、水酸化ナトリウムの４．７Ｍ溶液（５０ｍＬ）を加えた。次に、アクリル酸エチル（２３．１ｇ，０．２３モル）を加え、ＴＬＣ（１９時間）により反応の完了を確認するまで、この混合物を室温で撹拌した。１９時間後、これをジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分離した。無水硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、濾過し、蒸発させた。残留物を蒸留し、ＡＡ（２８．８ｇ，６１％）を得た。
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン（ｆｌｕｏｒｅｎ）−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ

Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ，２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｄｅ）を０℃で溶液に加えた。次に、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシラート（５ｇ，２４．６ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温にし、更に６時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の完了を確認した。反応混合物を真空内で濃縮し、ジイソプロピルウレアを沈殿させるために酢酸エチルに加えた。懸濁液を濾過した。濾過物を５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。硫酸ナトリウム上で混合有機層を乾燥して濃縮し、粗生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを生成した。
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ，２１．３ｍｍｏｌ）を、０℃でジメチルホルムアミド中、２０％ピペリジンに溶解した。この溶液を１時間、撹拌し続けた。反応混合物を真空内で濃縮し、残留水を加え、酢酸エチルで生成物を抽出した。塩酸塩に変換することにより粗生成物を精製した。
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎ）−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣの塩酸塩（４．７ｇ，１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに取り込んだ。懸濁液を０℃まで氷冷した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ，５．２ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）を加えた。生成した溶液にコレステリルクロロホルマート（６．６７５ｇ，１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製した（１０．３ｇ，９２％）。
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎ）−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ

カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの乾燥トルエンの中にスラリー化した。混合液を、氷上で０℃まで冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤをゆっくり、攪拌しながら、２０分以内に加えた。添加中、温度は５℃より低く保った。攪拌を０℃で３０分間続けてから１ｍＬの氷酢酸を加え、続いて直ぐ４０ｍｌの水に溶解した４ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｈ_２Ｏを加えた。得られた混合液をそれぞれ１００ｍＬのジクロロメタンを用いて２回抽出し、一つにまとめた有機抽出物をそれぞれ１０ｍＬのリン酸緩衝液を用いて２回洗浄、乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。残留物を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却してから３回に分けて、ｐＨ９．５の冷した５０ｍＬの炭酸緩衝液を用いて抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調節し、５回に分けて４０ｍＬのクロロホルムで抽出し、一つにまとめてから乾燥、蒸発させて残留物を得た。残留物を２５％エチル酢酸／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、１．９のｂ−ケトエステルを得た（３９％）。
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ

メタノール（２ｍＬ）を１時間かけて、還流中のｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素ホウ化ナトリウム（０．２２６ｇ，６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）混合液に滴下して加えた。還流温度で１時間攪拌を続けた。室温まで冷却した後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混合液を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。一つにまとめた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮して生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）で精製した（８９％）。
［６−｛３−ビスー（４−ヒドロキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ

ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ，１．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）と一緒に真空により蒸発させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ，２．１３ｍｍｏｌ）を攪拌しながら加えた。反応は室温で一晩行った。反応はメタノールを加えて止めた。反応混合液を真空で濃縮し、残留物にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。有機層を１Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリムで乾かし、濾過して濃縮した。残留ピリジンは、トルエンと共に蒸発させて除いた。粗生成物はクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３中で０．５）（１．７５ｇ，９５％）で精製した。
スクシン酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ

化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．１５０ｇ，１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ，０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空において、４０℃で一晩乾燥した。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ，０．４４０ｍＬ，３．１５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温、アルゴン雰囲気中で１６時間攪拌した。次に溶液をジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷したクエン酸水溶液（５重量％，３０ｍＬ）および水（２Ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリムで乾燥し、濃縮して乾燥した。残留物をそのまま次の段階に用いた。
コレステロール誘導化ＣＰＧ ＡＩ

コハク酸ＡＨ（０．２５４ｇ，０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２，３ｍＬ）の混合液に溶解した。この溶液にＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ，０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２５ｍＬ）溶液、２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ，０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロエタン（３：１，１．２５ｍＬ）を連続して加えた。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ，０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．６ｍｌ）溶液を加えた。反応混合液は明るいオレンジ色に変わった。溶液をリストアクション攪拌機を用いて短時間（５分間）攪拌した。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ，６１ｍｍ／ｇ）を加えた。懸濁液を２時間攪拌した。ＣＰＧを焼結フィルターを通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルを用いて連続的に洗浄した。未反応のアミノ基は、酸性の無水／ピリジンを用いてマスクした。ＣＰＧの負荷能力は、ＵＶ測定を行って測定した（３７ｍＭ／ｇ）
コレステロール接合ＲＮＡ鎖の合成および構造を図１に示す。

活性スクリーニングのために、表３に掲載されたｓｉＲＮＡを合成した。

実施例３：ｓｉＲＮＡ活性試験
表３に示したｉＲＮＡ剤のヒトＲｈｏＡの発現を阻害する能力を、発現構築物から各遺伝子産物が発現されているヒト細胞株、または各遺伝子産物を構成的に発現している細胞株で試験した。ｉＲＮＡ剤は、例えばトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって細胞内にトランスフェクションされ、細胞に一定時間、例えば２４時間作用させることができ、ＲｈｏＡの発現レベルは細胞溶解物中のＲｈｏＡのｍＲＮＡ濃度を測定することによって決定した。次にこれらの発現レベルを、同等であるがｉＲＮＡ剤を加えることなしに処理した細胞のＲｈｏＡ発現レベルと、またはハウスキーピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ）の発現レベルと比較し、それによって表３に示されたｉＲＮＡ剤のヒトＲｈｏＡの発現を阻害する能力を評価した。

ＲｈｏＡ発現阻害のスクリーニング
トランスフェクションの１日前に、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞（セロミクス社（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）［米国ペンシルベニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）］を、９６ウエルコラーゲンコーティングプレート（グライナーバイオワン社（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ ＧｍｂＨ）［ドイツ、フリッケンハオゼ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）］に、１００μｌの増殖培地（ＲＰＭＩ １６４０，１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、１００ｕペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、バイオクロム社（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）［ドイツ、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）］に１．５×１０^４細胞／ウエルの割合で接種した。トランスフェクションは三重でおこなった。各ウエルについて、０．５μｌのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ）［ドイツ、カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）］を１２μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）と混合し、室温で１５分間インキュベーションした。ウエル当たり５μＭのｓｉＲＮＡのアニーリング緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）の溶液２μｌを１０．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、これとリポフェクタミン２０００−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合液とを合わせて再度１５分間室温でインキュベーションした。このインキュベーションの間に細胞から増殖培地を取り除き、７５μｌ／ウエルの新鮮な培地と交換した。２５μｌのｓｉＲＮＡ−リポフェクタミン２０００複合物を加え、１００μｌのインキュベーション体積での全体濃度を１００ｎＭにし、加湿インキュベータ（ヘレウス社（Ｈｅｒａｅｕｓ ＧｍｂＨ）［ドイツ、ハーナウ（Ｈａｎａｕ）］内で細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベーションした。

細胞溶解物中のｍＲＮＡのレベルを、市販の分岐ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ｂＤＮＡ−ｋｉｔ、ジオスペクトラ社（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ））［米国カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）］を用いて定量化した。細胞を、増殖培地を５０μｌ追加し、７５μｌのＬｙｓｉｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ｂＤＮＡ−ｋｉｔ付属）を各ウエルに加えて集め、５３℃で３０分間溶解した。溶解物５０μｌを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ 製造元の「ｂＤＮＡ−ｋｉｔアッセイに関するプロトコルに従って、ラットのＲｈｏＡおよびｒＧＡＰＤＨに特異的なプローブ（プローブの配列は表４および表５に示す）とインキュベーションした。最後に化学発光をＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））［ドイツ、ヴィースバーデン（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）］を用いてＲＬＵ単位（相対光単位）で測定し、各ウエルについてＲｈｏＡプローブで得た結果をそれぞれのＧＡＰＤＨ地について標準化した。モック（Ｍｏｃｋ）トランスフェクション細胞（ｓｉＲＮＡを加える以外は同じプロトコル通りの細胞）をコントロールとし、ｍＲＮＡレベルの比較に用いた。

スクリーニングで有効とされたｓｉＲＮＡは、用量反応曲線を確立し、ＩＣ_５０濃度（遺伝子発現の５０％阻害が観察される濃度）を計算することで特徴付けを行った。用量反応評価については、トランスフェクションを次の濃度で行った：５μＭのｓｉＲＮＡ保存溶液をアニーリング緩衝液で連続希釈して１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ，１．２ｎＭ，０．４ｎＭ、１３７ｐＭ，４６ｐＭ，１５ｐＭ，５ｐＭ、およびモック（ｓｉＲＮＡなし）の溶液を得て、上記プロトコルに従って希釈保存液２μｌを用いた。ＩＣ５０は、次のパラメータを用いて、コンピュータソフトウエアＸ１ｆｉｔを利用したフカーブフィッティングによって決定した：投与反応１サイト、４パラメータロジスティクモデル、ｆｉｔ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（（１０∧Ｃ）／ｘ）∧Ｄ））））、ｉｎｖ＝（（１０∧Ｃ）／（（（（Ｂ−Ａ）／（ｙ−Ａ））−１）∧（１／Ｄ）））、ｒｅｓ＝（ｙ−ｆｉｔ）。

表６には、選択された薬剤の物質番号、薬剤のセンス鎖の最も５’側のヌクレオチドに対応するヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドの位置（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１６６４）、１００ｎＭ濃度の薬剤で処理した細胞に残っている全ＲｈｏＡ ｍＲＮＡのコントロールの％で表した量、およびＩＣ_５０値が記載されている。

まとめると、薬剤ＡＬ−ＤＰ−５９７９、ＡＬ−ＤＰ−５９９０、ＡＬ−ＤＰ−５９８８、ＡＬ−ＤＰ−５９８１、ＡＬ−ＤＰ−５９８２、ＡＬ−ＤＰ−５９８６、ＡＬ−ＤＰ−５９８９、ＡＬ−ＤＰ−６１７６、およびＡＬ−ＤＰ−６１７７は、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡの発現を８０％以上低下させることができ、ＡＬ−ＤＰ−５９７３、ＡＬ−ＤＰ−５９８７、ＡＬ−ＤＰ−５９９４、ＡＬ−ＤＰ−５９９５、ＡＬ−ＤＰ−５９７６、ＡＬ−ＤＰ−５９８４、およびＡＬ−ＤＰ−５９７２は、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡの発現を７０％以上低下させることができ、ＡＬ−ＤＰ−５９９３、ＡＬ−ＤＰ−５９７５、およびＡＬ−ＤＰ−５９８３はＲｈｏＡ ｍＲＮＡの発現を６０％以上低下させることができ、ＡＬ−ＤＰ−５９７４はＲｈｏＡ ｍＲＮＡの発現を５０％以上低下させることができ、ＡＬ−ＤＰ−５９９１、ＡＬ−ＤＰ−５９９２、およびＡＬ−ＤＰ−５９７８はＲｈｏＡ ｍＲＮＡの発現を４０％以上低下させることができた。ＡＬ−ＤＰ−６１７６およびＡＬ−ＤＰ−６１７７の高い活性は、コレステリル成分が活性を大きく失わずにｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に接合できることを示している。ＡＬ−ＤＰ−６１７６およびＡＬ−ＤＰ−６１７７は、センス鎖上に３’接合コレステリルがあること以外を除いてそれぞれＡＬ−ＤＰ−５９７３およびＡＬ−ＤＰ−５９８７と同一である。

実施例４：安定性試験
それらが意図する生理学的な応用に最も関係する生物学的マトリックス、即ち脳脊髄液（ＣＳＦ）中でのｓｉＲＮＡの安定性を検証するために、我々はこの媒体中でのｓｉＲＮＡの分解半減期を決定する方法を確立した。この方法は、ｓｉＲＮＡをＣＳＦとインキュベーションし、続いてＣＳＦサンプルをプロテイナーゼＫ処理し、ＣＳＦサンプル成分をＨＰＬＣで分離することを含む。

以下の例はインビトロでｓｉＲＮＡと接触したＣＳＦサンプルの分析を示す。しかしながら、この方法は生体外の生物サンプル、即ちインビボでｓｉＲＮＡと接触した被験体から得たサンプルにも等しく適用できる。

ウシＣＳＦは、月齢６ヶ月のウシ（Ｂｏｓ ｂｏｖｉｓ）から得た（ジェイ．リハーゲ教授（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｊ．Ｒｅｈａｇｅ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）［ドイツ、ハノーバー（Ｈａｎｎｏｖｅｒ）］。ブタＣＳＦは、月齢３〜４ヶ月３匹の健康な乳離れしたばかりのブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（エム．ヴェント教授（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｍ．Ｗｅｎｄｔ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ［ドイツ、ハノーバー（Ｈａｎｎｏｖｅｒ）］）からプールした。ラットＣＳＦは、体重１７５〜２００ｇの２０匹のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［フランス、ラルブレール（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ Ｃｅｄｅｘ）］）からプールした。プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）は、ｐｅＱＬａｂ（カタログ番号０４−１０７５［ドイツ、エルランゲン（Ｅｒｌａｎｇｅｎ）］）から得て、脱イオン水（１８．２ｍΩ）で１：１に希釈しプロテイナーゼＫの最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにした。プロテイナーゼＫ緩衝液（４．０ｍｌのＴＲＩＳ−ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ７．５、１．０ｍｌのＥＤＴＡ ０．５Ｍ、１．２ｍｌのＮａＣｌ ５Ｍ、４．０ｍｌのＳＤＳ １０％）は新たに調製し、沈殿を避けるために使用時まで５０℃に保った。

４０ｍｅｒのポリ（Ｌ−ｄＴ）、即ち（Ｌ−ｄＴ）_４０はノックソンファーマ社（Ｎｏｘｘｏｎ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ）［ドイツ、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）］から得て、内部標準物質として用いた。核酸のＬ−エナンチオマーのポリマーは、核酸溶解分解に対し極めて高い安定性を示すが（クラスマン エスら（Ｋｌｕｓｓｍａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．第１４巻：１１１２ページ（１９９６年））、それ以外は天然産のＲ−エナンチオマーからなる核酸に極めて近い性質を示す。

ｓｉＲＮＡインキュベーションサンプルのプロテイナーゼＫ処理
５０μＭの各ｓｉＲＮＡのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ、シグマ アルドリッチヒェミー社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）［ドイツ、タウフキルヘン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）］）溶液６μｌを５４μｌのＣＳＦと３７℃で３０分間、１、２、４、８、１６、２４、または４８時間インキュベーションした。ｓｉＲＮＡ−分解を終了させるために、それぞれのインキュベーション時間が終了した直後にプロテイナーゼＫ緩衝液２５μｌをインキュベーションサンプルに加え、混合液を５秒間高速で攪拌し（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２，カタログ番号ＳＩ０２５６，サイエンティフィックインダストリーズ社（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）［米国ニューヨーク州ボヘミア（Ｂｏｈｅｍｉａ）］）、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を８μｌ添加してから５秒間攪拌し、最後に混合液をサーモミキサーの中、４２℃、１０５０ｒｐｍで２０分間インキュベーションした。

５０μＭの（Ｌ−ｄＴ）_４０溶液（２５０ｐｍｏｌｅ）５μＬを内部標準物質として各ウエルに加え、溶液を５秒間攪拌し、チューブを１分間小型遠心分離器にかけて遠心分離し、壁内面に付いている滴を全て底に落とした。溶液を９６ウエルのＣａｐｔｉｖａ ０．２μｍフィルタープレート［ドイツ、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）］（カタログ番号Ａ５９６０００２）に移して、２１９００ｒｃｆで４５分間遠心分離して濾過した。

インキュベーション・ウェルを４７．５μｌの脱イオン水（１８．２ｍΩ）で洗浄し、洗浄液をキャプティバ・フィルター・ユニット（Ｃａｐｔｉｖａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）で２１９００ｒｃｆ、１５分間にわたり濾過し、この洗浄ステップを繰り返した。理論的全容量２００μｌのうちの約１８０μｌが平均して２回目の洗浄ステップ後に回収された。

複数のｓｉＲＮＡ一本鎖を互いに分離するとともに分解産物からそれらを分離するためのイオン交換クロマトグラフィーによる分離：
インライン脱気装置、自動サンプリング装置、カラム・オーブン、および固定波長ＵＶ検出器（ダイオネクス社（Ｄｉｏｎｅｘ ＧｍｂＨ）［ドイツ、イドシュタイン（Ｉｄｓｔｅｉｎ）］）を備えたダイオネックス・バイオＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣ）ＨＰＬＣシステムを、変性条件下で用いた。標準実行パラメータは以下の通りである。

カラム：Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡ−Ｐａｃ１００；４×２５０ｍｍ
温度：７５℃
溶離液Ａ：１０ｍＭ ＮａＣｌＯ_４、２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％アセトニトリル、ｐＨ＝８．０
溶離液Ｂ：８００ｍＭ ＮａＣｌＯ_４、２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％アセトニトリル、ｐＨ＝８．０
検出：＠２６０ｎｍ
勾配：０〜１分：１０％Ｂ
１〜１１分：１０％ −＞ ３５％Ｂ
１１〜１２分：３５％Ｂ −＞ １００％Ｂ
１２〜１４分：１００％Ｂ −＞ １０％Ｂ
１４〜１６分：カラム再平衡化のための１０％Ｂ
注入量：２０μｌ
ｓｉＲＮＡの２本の鎖を分離することが期待通りに行われなかった場合または１本の鎖とともに分解フラグメントが一緒に溶離された場合には、クロマトグラフィーのパラメータの調整を、温度、ｐＨ、ＮａＢｒによるＮａＣｌＯ_４の置換、アセトニトリルの濃度の変更によって、および／またはセンスもしくはアンチセンス鎖由来のピークの分離定量を可能にする分離が達成されるまでの溶離液勾配の勾配を調整することによって行う。

完全長鎖のピーク面積は、機器（Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ６．６；ダイオネクス社（Ｄｉｏｎｅｘ ＧｍｂＨ）［ドイツ、イドシュタイン（Ｉｄｓｔｅｉｎ）］）の製造元から提供されたソフトウェアを用いてＵＶ検出器シグナルの積分によって得られた。

データ分析：
積分されたセンス鎖、アンチセンス鎖、及び内部ピーク面積を全ての試料及び正規化対照について得た。

濾過及び洗浄ステップでの液体損失からなる補正率ＣＦを、理論上の内部標準ピーク面積に対する実験上の内部標準ピーク面積の比を計算することによって、試料毎に測定した。理論上の内部標準ピーク面積を、例えば、ＨＰＬＣカラム上に（Ｌ−ｄＴ）_４０の５０μＭ溶液の段階希釈を各々５０μｌ注入することにより得た内部標準の較正曲線から得られ、また希釈系列由来のピーク面積に適合する線形最小二乗によって得られた等式による２５ｐｍｏｌ（Ｌ−ｄＴ）_４０に対応する理論ピーク面積の計算によって得られる。センスおよびアンチセンス鎖のピーク面積に適用される補正率ＣＦを下記のようにして得る。

ＣＦ＝ピーク面積_{ｉｎｔＳｔｄ}（理論値）／ピーク面積_{ｉｎｔＳｔｄ}（試料）
この処置は、異なる試料のピーク面積を比較することができるように、フィルターを２回洗浄することで、実質的に完全な回収が混合濾過液状態で達成され、フィルターに保持された洗浄水の可変的な量が補正されると仮定する。

時点ごとにセンスおよびアンチセンス鎖のピークについて得られたピーク面積を補正率ＣＦで乗算することで、正規化ピーク面積（ＮＰＡ_{ｓｅｎｓｅ，ｔ}、ＮＰＡ_{ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，ｔ}）を得る。

ＮＰＡ_{ｓｅｎｓｅ ｏｒ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，ｔ}＝（ピーク面積_{ｓｅｎｓｅ ｏｒ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，ｔ}）×ＣＦ
時間ｔでのセンスおよびアンチセンス鎖についての残留完全長産物の相対量（％ＦＬＰ）を得るために、時間ｔ＝０分（ＮＰＡ_{ｓｅｎｓｅ，ｔ＝０}、ＮＰＡ_{ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，ｔ＝０}）での各鎖の正規化ピーク面積を１００％として設定し、他の時点のＮＰＡをこれらの値によって割る。

％ＦＬＰ_{ｔ＝１，２，３．．．ｎ}＝（ＮＰＡｔ＝１，２，３．．．ｎ／ＮＰＡ_ｔ＝０）＊１００
ｓｉＲＮＡをアニーリング緩衝液のみでインキュベートした対照試料から得られた値を、本方法の精度の対照として用いることが可能である。両鎖の％ＦＬＰは、インキュベーション時間に関係なく許容誤差範囲内で、１００％近傍に位置しなければならない。

次に、ｌｎ（％ＦＬＰ）対時間のプロット、すなわち下記に適合する線形最小二乗の勾配から、一次速度方程式を仮定して、各々の鎖に関して分解半減期ｔ_１／２を計算する。
ｔ_１／２＝ｌｎ（０，５）／勾配
ラット、ウシ、およびブタＣＳＦでのＮｏｇｏＬおよびＲｈｏＡに特異的なｓｉＲＮＡの安定性
表７は、各々の培地で４８時間インキュベートした後のブタ、ラット、およびウシＣＳＦならびにＰＢＳに存在する完全長二本鎖ＲＮＡの相対量の選択ｓｉＲＮＡに関する測定結果を示す。また、いくつかのｓｉＲＮＡについてセンスおよびアンチセンス鎖の分解半減期を別々に測定した。

表７から明らかなように、分解の影響を受けやすい選択部位内のｓｉＲＮＡの修飾は、活性および安定性に関して優れた特性を持つ薬剤をもたらし得る。例えば、ＡＬ−ＤＰ−５８７１、ＡＬ−ＤＰ−５９３８、ＡＬ−ＤＰ−５９６３、ＡＬ−ＤＰ−５９７３、ＡＬ−ＤＰ−５９７９、ＡＬ−ＤＰ−５９８１、ＡＬ−ＤＰ−５９８６、ＡＬ−ＤＰ−５９８７、ＡＬ−ＤＰ−５９８９、およびＡＬ−ＤＰ−５９９０の全ては、各々の標的遺伝子に対する阻害が上記した生体外アッセイで７０％を上回り、４８時間にわたるブタＣＳＦによるインキュベーション後の残存完全長二本鎖が７０％を上回る。しかし、ラットＣＳＦがブタまたはウシＣＳＦよりもｓｉＲＮＡに対してより攻撃的であるといういくつかの兆候がある。

実施例５：ラット後根神経節（ＤＲＧ）初代培養細胞におけるＲｈｏＡ発現の阻害
ＲｈｏＡ発現の阻害を、上記したようにＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ１細胞を用いて得られる結果を確認するために、ラット後根神経節（ＤＲＧ）初代培養細胞で評価した。

ＤＲＧ細胞を生後３〜６日目にＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離した。ラットを解剖し、１．３ｍｌ（０．２８Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｍｌ）リベラーゼ精製酵素ブレンド（Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ）ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）含有Ｓ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カルスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）］）を添加して３７℃で３５分間インキュベートすることにより解離させて単細胞にした。細胞懸濁液を組織培養プレートに前播種して非神経性細胞を除去した。次に神経を、５０ｎｇ／ｍｌマウス神経成長因子２．５Ｓ（ＮＧＦ；プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）［米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）］）が追加された５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、熱処理不活性化）および５％馬血清（熱処理不活性化）（両方とも、Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カルスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）］）を含むグルタミン（Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カルスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）］）含有Ｆ１２−ＨＡＭ培地中の組織培養バイオコート（Ｂｉｏｃｏａｔ）（商標）ＰＤＬポリＤリジン／ラミニン９６穴プレート（米国マサチューセッツ州ベッドフォード、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種し、トランスフェクションまで加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ_２に保った。

ｒｈｏＡ特異的ｓｉＲＮＡ（物質番号ＡＬ−ＤＰ−５９８７）を、濃度２００ｎＭ、ＤＲＧ培地中で試験した。この際、トランス・メッセンジャー（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ）（商標）トランスフェクション試薬（カタログ番号３０１５２５、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）［ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）］）を用い、この試薬は脂質製剤、特異的ＲＮＡ濃縮試薬（ＥｎｈａｎｃｅｒＲ（商標））に基づいており、ｓｉＲＮＡ保持ＲＮＡ濃縮緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＥＣ−Ｒ（商標））：エンハンサーＲ（商標）比（μｇ：μｌ）は一定して１：２であり、さらにｓｉＲＮＡ：ＴｒａｎｓＭｅｓｅｎｇｅｒ（登録商標）比（μｇ：μｌ）は一定して１：１２である。

ＤＲＧを２４時間後平板培養でトランスフェクトさせた。各ウェルに関して、０．５２μｌエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）Ｒ（商標）を最初に１３．６８μｌバッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）ＥＣ−Ｒ（商標）と最初に混合した。２５μＭのＡＬＤＰ−５９８７溶液（０．２６μｌ）を含むアニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）０．８μｌまたはアニーリング緩衝液（ｓｉＲＮＡフリー対照）０．８μｌを添加し、混合物をＲＴで５分間にわたりインキュベートした。３．１２μｌ ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（商標）トランスフェクション試薬を６．８８μｌのバッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）ＥＣ−Ｒ（商標）で希釈し、混合物に添加し、この混合物をさらに１０分間、室温でインキュベートすることで、トランスフェクション複合体を形成させた。５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦ２．５Ｓ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）［米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）］）を追加したグルタミン（Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カルスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）］）を含む７５μｌ血清フリーＦ１２−ＨＡＭ培地と、１：５０Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カルスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）］）をトランスフェクション複合体に添加し、穏やかに上下にピペッティングすることによって完全に混合させた。成長培地をＤＲＧ細胞から除去し、９０μｌの上記トランスフェクション複合体混合物を細胞に添加した。加湿インキュベーター中５％ＣＯ_２、３７℃での８時間インキュベーション後、上清を細胞から除去し、５％ＦＢＳ、５％馬血清（両方とも、Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カルスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）］）、５０ｎｇ／ｍｌマウスＮＧＦ２．５Ｓ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）［米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）］）、および１：１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カルスバド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）］）を追加したグルタミンを含む新鮮Ｆ１２−ＨＡＭ培地を添加し、細胞を加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ_２でさらに１６時間インキュベートし、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡを定量した。

ＲｈｏＡ ｍＲＮＡレベルの測定は、製造元のプロトコルに従って、クアンチジーン（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ）（商標）ｂＤＮＡキット（米国フレモント、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を用いておこなった。手短に言うと、上清をＤＲＧ細胞から除去し、該細胞の溶解を、１５０μｌの溶解作用試薬（Ｌｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）（溶解混合物１容量プラス培地２容量）を添加し、５２℃で３０分間にわたりインキュベートすることによって、おこなった。ライセート４０μｌを、表４および表５に示したラットＲｈｏＡおよびラットＧＡＰＤＨに特異的なプローブ・セットとともに５２℃、４０分間にわたりインキュベートした。化学発光の読み取りは、相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）として、Ｖｉｃｔｏｒ^２−Ｌｉｇｈｔ（商標）（パーキンエルマーライフアンドアナリティカルサイエンス社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）［米国マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）］）上でおこなった。ＲｈｏＡのＲＬＵをウエル毎にＧＡＰＤＨのＲＬＵに対して正規化した。次に、正規化ＲｈｏＡ／ＧＡＰＤＨ比をｓｉＲＮＡフリー対照（１００％として設定）と比較した。

いくつかの独立した実験では、ＡＬ−ＤＰ−５９８７処理したＤＲＧ初代細胞では、ｓｉＲＮＡフリー対照で見出されたＲｈｏＡ ｍＲＮＡの２０〜２５％まで一貫して、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡが減少した。

コレステロールと共役結合したＲＮＡ鎖の合成及び構造を示す概略図である。球体は固相（制御多孔性ガラス、ＣＰＧ）を表す。

Claims (25)

1. 物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のセンス鎖配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むセンス鎖と、物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のアンチセンス配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含む、細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡ剤。
2. 物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のセンス鎖配列と僅かに１，２又は３個のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むセンス鎖と、物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質のアンチセンス配列の少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含む、細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡ剤であって、これらの物質とのインキュベーション後に培養ヒト細胞に存在するＲｈｏＡ ｍＲＮＡの量を、前記物質とインキュベートされなかった細胞に対して４０％以上減少させるｉＲＮＡ剤。
3. 物質番号６４７７〜６８３６から成る群から選択される任意の１つの物質の配列の１つと本質的に同一の少なくとも１６，１７又は１８個のヌクレオチドの配列、但し、それぞれ１鎖につき１，２又は３個以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されているが（例えば、アデノシンがウラシルに置換）、ＲｈｏＡ発現を阻害する能力を本質的に保持している配列を各々が含むセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む、細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡ剤。
4. 前記センスおよびアンチセンス鎖配列の少なくとも一方が、物質番号６５２３，６５２４，６５３０，６６１４，６６５０，６６５６，６６５７，６６６１，６６６２，６７０３，６７１２，６７１３，６７３２，６７５１，６７５６，６７６７，６７６９，６７８７，６７８９，６７９０，６８３２のセンス及びアンチセンス鎖配列から成る群から選択される、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
5. 前記センスおよびアンチセンス鎖配列の少なくとも一方が、物質番号ＡＬ−ＤＰ−５９７２，ＡＬ−ＤＰ−５９７３，ＡＬ−ＤＰ−５９７４，ＡＬ−ＤＰ−５９７５，ＡＬ−ＤＰ−５９７６，ＡＬ−ＤＰ−５９７８，ＡＬ−ＤＰ−５９７９，ＡＬ−ＤＰ−５９８１，ＡＬ−ＤＰ−５９８２，ＡＬ−ＤＰ−５９８３，ＡＬ−ＤＰ−５９８４，ＡＬ−ＤＰ−５９８６，ＡＬ−ＤＰ−５９８７，ＡＬ−ＤＰ−５９８８，ＡＬ−ＤＰ−５９８９，ＡＬ−ＤＰ−５９９０，ＡＬ−ＤＰ−５９９１，ＡＬ−ＤＰ−５９９２，ＡＬ−ＤＰ−５９９３，ＡＬ−ＤＰ−５９９４，ＡＬ−ＤＰ−５９９５，ＡＬ−ＤＰ−６１７６，ＡＬ−ＤＰ−６１７７のセンス及びアンチセンス鎖配列から成る群から選択される、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
6. 前記アンチセンスＲＮＡ鎖が３０以下のヌクレオチド長であり、前記ｉＲＮＡ剤の二重鎖領域が１５〜３０ヌクレオチド対長である、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
7. ｉＲＮＡ剤が生体試料において上昇した安定性を有するように修飾される、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
8. 前記修飾が、ホスホロチオアート、２’−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート又はヌクレオチドを構成する非天然型塩基である、請求項７に記載のｉＲＮＡ剤。
9. ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ｕａ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ｕｇ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ｃａ−３’）ジヌクレオチド；又は５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ｕｕ−３’）ジヌクレオチドを含む、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
10. ５’−ｕａ−３’，５’−ｕｕ−３’，５’−ｃａ−３’及び５’−ｕｇ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドが前記センス鎖において２’−修飾され、５’−ｕａ−３’及び５’−ｃａ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドが前記アンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
    ５’−ｕａ−３’，５’−ｕｕ−３’，５’−ｃａ−３’及び５’−ｕｇ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドが前記センス及びアンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
    すべてのピリミジンヌクレオチドが前記センス鎖において２’−修飾され、５’−ｕａ−３’及び５’−ｃａ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドが前記アンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
    すべてのピリミジンヌクレオチドが前記センス鎖において２’−修飾され、５’−ｕａ−３’，５’−ｕｕ−３’，５’−ｃａ−３’及び５’−ｕｇ−３’モチーフにおけるすべての５’−ヌクレオチドが前記アンチセンス鎖において２’−修飾され、或いは、
    前記センス鎖におけるすべてのピリミジンヌクレオチドが２’−修飾され、前記アンチセンス鎖ではヌクレオチドが２’−修飾されない、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
11. 前記２’−修飾が、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）から成る群から選択される、請求項８から請求項１０のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
12. １〜４個の不対合ヌクレオチドを有するヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
13. コレステロール部分を含む、請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
14. 前記コレステロール部分が前記ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端に接合している、請求項１３に記載のｉＲＮＡ剤。
15. 前記ｉＲＮＡ剤が神経細胞又は神経鞘細胞による取込みの標的となる、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
16. 請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を対象に投与するステップを含む、部分的にＲｈｏＡに媒介される病理過程を有する対象を処置する方法。
17. 前記病理過程が神経の成長又は伸長の阻害である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記病理過程が、神経の障害又は損傷の結果としての神経の成長又は伸長の阻害である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ｉＲＮＡ剤が、前記対象の細胞又は組織内のＲｈｏＡの発現を低減するのに十分な量にて投与される、請求項１６から請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記対象がヒトである、請求項１６から請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ａ）請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤と、
    ｂ）医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
22. 請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を含む細胞。
23. 細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、
    （ａ）請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を細胞に導入するステップと、
    （ｂ）ＲｈｏＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写の低下を得るのに十分な時間、ステップ（ａ）にて作製された細胞を維持し、これにより細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するステップとを含む方法。
24. 細胞内のＲｈｏＡ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に機能的に結合した調節配列を含むベクター。
25. 請求項２４に記載のベクターを含む細胞。

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