JP2009502112A - Methods for diagnosing and treating renal cell carcinoma - Google Patents

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Abstract

腎細胞癌（RCC）を検出および診断するための客観的な方法を本明細書に記載する。一つの態様において、本診断法は、RCC細胞と正常細胞とを識別するRCC関連遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む。本発明は、腎細胞癌の処置において有用な治療剤をスクリーニングする方法、腎細胞癌を処置する方法、および腎細胞癌に対するワクチンを被験者に接種する方法をさらに提供する。An objective method for detecting and diagnosing renal cell carcinoma (RCC) is described herein. In one embodiment, the diagnostic method comprises determining the expression level of an RCC-related gene that distinguishes RCC cells from normal cells. The present invention further provides methods of screening for therapeutic agents useful in the treatment of renal cell carcinoma, methods of treating renal cell carcinoma, and methods of inoculating a subject with a vaccine against renal cell carcinoma.

Description

発明の分野
本発明は、腎細胞癌を診断および処置する方法に関する。なお本出願は、その内容が参照により全体として本明細書に組み入れられる、2005年7月28日に提出された米国特許仮出願第60/703,640号、および2006年5月11日に提出された第60/799,960号の恩典を主張する。 The present invention relates to methods for diagnosing and treating renal cell carcinoma. This application was filed on May 28, 2005, and US provisional application 60 / 703,640 filed July 28, 2005, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. Claim the benefit of No. 60 / 799,960.

発明の背景
腎細胞癌（RCC）は、尿生殖器系の3番目に多い悪性疾患であり、全てのヒト悪性疾患の2〜3％を占める。現在のところ、限局したRCC腫瘍に関しては外科的切除が最も有効な処置であるが、進行期RCCを有する患者に関しては満足のゆく処置は得られていない。RCCに関するいくつかの治療は、約20％の効奏率を達成したが、重度の有害反応がしばしば起こり、患者の予後は全体的に改善されていないように思われる（Ljungberg B, et al., (1999) B J U Int. 84: 405-11; Levy DA, et al. (1998) J Urol 159: 1163-7）。腫瘍の病期は最も参考となる予後因子であると考えられているが、腎臓癌発生の基礎となる分子メカニズムに関してはほとんどわかっていない。 Background of the invention Renal cell carcinoma (RCC) is the third most common malignancy in the genitourinary system, accounting for 2-3% of all human malignancies. At present, surgical resection is the most effective treatment for localized RCC tumors, but no satisfactory treatment is available for patients with advanced RCC. Some treatments for RCC have achieved an efficacy rate of approximately 20%, but severe adverse reactions often occur and the patient's prognosis does not seem to improve overall (Ljungberg B, et al. (1999) BJU Int. 84: 405-11; Levy DA, et al. (1998) J Urol 159: 1163-7). Although tumor stage is considered the most helpful prognostic factor, little is known about the molecular mechanisms underlying kidney cancer development.

RCC腫瘍は、明細胞（80％）、乳頭（約10％）、嫌色素性（＜5％）、または顆粒状、紡錘状、もしくは嚢胞関連癌（5〜15％）といった組織学的特色に基づいて特徴付けられる。これらの組織学的サブタイプはそれぞれ、独自の臨床挙動を示し、明細胞および顆粒型は、より激しい臨床表現型を示す傾向がある。本研究では、最も主要な型である明細胞癌を選択した。具体的には、本発明者らは、そのような腫瘍における大規模な遺伝子発現プロファイル分析を行った。他のグループによって報告された類似の研究から、予後的目的のために、またはRCCの分類のために有用となる可能性があるいくつかの遺伝子が既に同定されている（Takahashi M, et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 9754-9；Young AN, et al. (2001) Am J Pathol. 158: 1639-51；Skubitz KM & Skubitz AP. (2002) J Lab Clin Med 140: 52-64；Takahashi M, et al. (2003) Oncogene 22: 6810-8；Higgins JP, et al. (2003) Am J Pathol 162: 925-32）。腎臓癌の遺伝子発現プロファイルに関するいくつかの研究により、診断マーカーまたは予後プロファイルとしての候補となる可能性がある遺伝子が発見された。しかし、腫瘍塊に由来するこれらのデータは、RCC細胞が様々な細胞成分を含む固体の塊として存在することから、腎臓癌発生の際に生じる発現の変化を適切に反映することができない。したがって、これまでに公表されたRCCの発現プロファイルは、不均一なプロファイルを反映する可能性がある。   RCC tumors are characterized by histological features such as clear cells (80%), papillae (approximately 10%), chromophore (<5%), or granular, spindle, or cyst-related cancers (5-15%) Characterized based on. Each of these histological subtypes exhibits its own clinical behavior, and clear cell and granule types tend to exhibit a more intense clinical phenotype. In this study, the most major type, clear cell carcinoma, was selected. Specifically, we performed a large-scale gene expression profile analysis in such tumors. Similar genes reported by other groups have already identified several genes that may be useful for prognostic purposes or for the classification of RCC (Takahashi M, et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 9754-9; Young AN, et al. (2001) Am J Pathol. 158: 1639-51; Skubitz KM & Skubitz AP. (2002) J Lab Clin Med 140: 52- 64; Takahashi M, et al. (2003) Oncogene 22: 6810-8; Higgins JP, et al. (2003) Am J Pathol 162: 925-32). Several studies on renal cancer gene expression profiles have discovered genes that may be candidates for diagnostic markers or prognostic profiles. However, these data derived from the tumor mass cannot adequately reflect the changes in expression that occur during the development of kidney cancer because RCC cells exist as solid masses containing various cellular components. Thus, published RCC expression profiles may reflect a heterogeneous profile.

cDNAマイクロアレイ技術により、正常細胞および悪性細胞における包括的な遺伝子発現プロファイルを発見すること、ならびに悪性細胞における遺伝子発現を対応する正常細胞と比較することが可能になった（Okabe et al., (2001) Cancer Res 61:2129-37；Kitahara et al., (2001) Cancer Res 61 : 3544-9；Lin et al., (2002) Oncogene 21 :4120-8；Hasegawa et al., (2002) Cancer Res 62:7012-7）。このアプローチは、癌細胞の複雑な性質の解明、および発癌機構の理解を可能にする。腫瘍において脱制御される遺伝子を同定することによって、個々の癌のより精密で正確な診断を得ることができ、新規治療標的を開発することができる（Bienz and Clevers, (2000) Cell 103:311-20）。ゲノム全体での観点から腫瘍の基礎となるメカニズムを明らかにするため、そして新規治療薬の開発や診断のための標的分子を発見するために、本発明者らは、遺伝子23040個のcDNAマイクロアレイを用いていくつかの腫瘍細胞の発現プロファイルを解析した（Okabe et al., (2001) Cancer Res 61:2129-37; Kitahara et al., (2001) Cancer Res 61:3544-9; Lin et al., (2002) Oncogene 21:4120-8; Hasegawa et al., (2002) Cancer Res 62:7012-7）。   cDNA microarray technology has made it possible to discover comprehensive gene expression profiles in normal and malignant cells and to compare gene expression in malignant cells with the corresponding normal cells (Okabe et al., (2001 ) Cancer Res 61: 2129-37; Kitahara et al., (2001) Cancer Res 61: 3544-9; Lin et al., (2002) Oncogene 21: 4120-8; Hasegawa et al., (2002) Cancer Res 62: 7012-7). This approach allows the elucidation of the complex nature of cancer cells and the understanding of carcinogenic mechanisms. By identifying genes that are deregulated in tumors, a more accurate and accurate diagnosis of individual cancers can be obtained and new therapeutic targets can be developed (Bienz and Clevers, (2000) Cell 103: 311 -20). In order to elucidate the underlying mechanisms of tumors from a genome-wide perspective, and to discover target molecules for the development and diagnosis of new therapeutics, we have constructed a cDNA microarray of 23040 genes. Was used to analyze the expression profile of several tumor cells (Okabe et al., (2001) Cancer Res 61: 2129-37; Kitahara et al., (2001) Cancer Res 61: 3544-9; Lin et al. (2002) Oncogene 21: 4120-8; Hasegawa et al., (2002) Cancer Res 62: 7012-7).

発癌メカニズムを解明するように計画された研究により、ある種の抗腫瘍薬の分子標的の同定が既に促進されている。例えば、その活性化が翻訳後ファルネシル化に依存するRasに関連した増殖シグナル伝達経路を阻害するように当初開発された、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI)は、動物モデルにおいてRas依存性腫瘍の処置に有効であることが実証されている(Sun J., et al., (1998) Oncogene.;16:1467-73)。抗癌剤と、癌原遺伝子受容体HER2/neuに拮抗することを目的とした抗HER2モノクローナル抗体、トラスツズマブを併用したヒト臨床試験では、乳癌患者の臨床応答および総生存率の改善が達成されている(Molina MA., et al., (2001) Cancer Res. ;61:4744-9)。bcr-abl融合タンパク質を選択的に不活化するチロシンキナーゼ阻害剤STI-571は、bcr-ablチロシンキナーゼの構成的活性化が白血球の形質転換において重要な役割を果たしている慢性骨髄性白血病を処置するためにようやく開発されてきている。これらの種類の薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を抑制するように設計されている(O'Dwyer ME & Druker BJ. (2000) Curr Opin Oncol.;12:594-7)。したがって、癌細胞において一般にアップレギュレートされる遺伝子産物が、新規抗癌剤を開発するための有力な標的となり得ることは明白である。   Studies designed to elucidate the mechanisms of carcinogenesis have already facilitated the identification of molecular targets for certain antitumor drugs. For example, a farnesyltransferase inhibitor (FTI), originally developed to inhibit the Ras-related growth signaling pathways whose activation depends on post-translational farnesylation, has been used to treat Ras-dependent tumors in animal models. It has been proven effective (Sun J., et al., (1998) Oncogene .; 16: 1467-73). In human clinical trials combining anticancer drugs and anti-HER2 monoclonal antibody, trastuzumab, which aims to antagonize proto-oncogene receptor HER2 / neu, clinical response and overall survival of breast cancer patients have been improved ( Molina MA., Et al., (2001) Cancer Res .; 61: 4744-9). STI-571, a tyrosine kinase inhibitor that selectively inactivates bcr-abl fusion proteins, treats chronic myeloid leukemia where constitutive activation of bcr-abl tyrosine kinase plays an important role in leukocyte transformation It has finally been developed. These types of drugs are designed to suppress the carcinogenic activity of certain gene products (O'Dwyer ME & Druker BJ. (2000) Curr Opin Oncol .; 12: 594-7). Thus, it is clear that gene products that are generally up-regulated in cancer cells can be potential targets for developing new anticancer agents.

CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が、MHCクラスI分子上に提示された腫瘍関連抗原(TAA)に由来するエピトープペプチドを認識して、腫瘍細胞を溶解することがさらに実証されている。TAAの最初の例としてMAGEファミリーが発見されて以来、免疫学的アプローチを用いて他の多くのTAAが発見されている（Boon. (1993) Int J Cancer 54: 177-80; Boon and van der Bruggen. (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen et al., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52）。新たに発見されたTAAのいくつかについては、現在、免疫療法の標的として臨床開発が行われている。これまでに発見されたTAAには、MAGE((van der Bruggen et al., (1991) Science 254: 1643-7)、gp100(Kawakami et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52)、SART(Shichijo et al., (1998) J Exp Med 187: 277-88)、およびNY-ESO-1(Chen et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8)が含まれる。一方、腫瘍細胞において特異的に過剰発現されることが実証されている遺伝子産物は、細胞性免疫応答を誘導する標的として認識されることが示されている。そのような遺伝子産物には、p53(Umano et al., (2001) Brit J Cancer 84: 1052-7)、HER2/neu(Tanaka et al., (2001) Brit J Cancer 84: 94-9)、CEA(Nukaya et al., (1999) Int J Cancer 80: 92-7)などが含まれる。   It has further been demonstrated that CD8 + cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize epitope peptides derived from tumor associated antigens (TAA) presented on MHC class I molecules and lyse tumor cells. Since the discovery of the MAGE family as the first example of TAA, many other TAAs have been discovered using immunological approaches (Boon. (1993) Int J Cancer 54: 177-80; Boon and van der Bruggen. (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen et al., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52). Several newly discovered TAAs are currently in clinical development as targets for immunotherapy. TAA discovered so far includes MAGE ((van der Bruggen et al., (1991) Science 254: 1643-7), gp100 (Kawakami et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52). , SART (Shichijo et al., (1998) J Exp Med 187: 277-88), and NY-ESO-1 (Chen et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8) On the other hand, gene products that have been demonstrated to be specifically overexpressed in tumor cells have been shown to be recognized as targets that induce cellular immune responses, including: p53 (Umano et al., (2001) Brit J Cancer 84: 1052-7), HER2 / neu (Tanaka et al., (2001) Brit J Cancer 84: 94-9), CEA (Nukaya et al., ( 1999) Int J Cancer 80: 92-7).

TAAに関する基礎および臨床研究における著しい進歩にも関わらず(Rosenberg et al., (1998) Nature Med 4: 321-7; Mukherji et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82; Hu et al., (1996) Cancer Res 56: 2479-83)、例えば結腸直腸癌などの腺癌の処置に現在利用できるのは、ごく限られた数の候補TAAのみである。癌細胞において大量に発現され、さらにその発現が癌細胞に限定されるTAAは、免疫療法の標的として有望な候補となると考えられる。さらに、強力で特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新規TAAが同定されれば、様々なタイプの癌におけるペプチドワクチン法の臨床応用を促進すると期待される(Boon and van der Bruggen, (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen et al., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52; Shichijo et al., (1998) J Exp Med 187: 277-88; Chen et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8; Harris, (1996) J Natl Cancer Inst 88: 1442-55; Butterfield et al., (1999) Cancer Res 59: 3134-42; Vissers et al., (1999) Cancer Res 59: 5554-9; van der Burg et al., (1996) J Immunol 156: 3308-14; Tanaka et al., (1997) Cancer Res 57: 4465-8; Fujie et al., (1999) Int J Cancer 80: 169-72; Kikuchi et al., (1999) Int J Cancer 81: 459-66; Oiso et al., (1999) Int J Cancer 81: 387-94)。   Despite significant progress in basic and clinical research on TAA (Rosenberg et al., (1998) Nature Med 4: 321-7; Mukherji et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82; Hu et al., (1996) Cancer Res 56: 2479-83), for example, only a limited number of candidate TAAs are currently available for the treatment of adenocarcinoma such as colorectal cancer. TAA, which is expressed in large amounts in cancer cells and whose expression is limited to cancer cells, is considered to be a promising candidate as a target for immunotherapy. Furthermore, the identification of novel TAAs that induce potent and specific anti-tumor immune responses is expected to facilitate the clinical application of peptide vaccine methods in various types of cancer (Boon and van der Bruggen, (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen et al., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami et al., (1994 ) J Exp Med 180: 347-52; Shichijo et al., (1998) J Exp Med 187: 277-88; Chen et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8; Harris, (1996 ) J Natl Cancer Inst 88: 1442-55; Butterfield et al., (1999) Cancer Res 59: 3134-42; Vissers et al., (1999) Cancer Res 59: 5554-9; van der Burg et al., (1996) J Immunol 156: 3308-14; Tanaka et al., (1997) Cancer Res 57: 4465-8; Fujie et al., (1999) Int J Cancer 80: 169-72; Kikuchi et al., ( 1999) Int J Cancer 81: 459-66; Oiso et al., (1999) Int J Cancer 81: 387-94).

特定の健常ドナー由来の末梢血単核細胞（PBMC）がペプチド刺激を受けると、ペプチドに反応して著しいレベルのIFN-γを産生するが、51Cr放出アッセイによるとHLA-A24またはHLA-A0201拘束的な様式で腫瘍細胞に対して細胞障害性を及ぼすことはほとんどないと繰り返し報告されている（Kawano et al., (2000) Cancer Res 60: 3550-8; Nishizaka et al., (2000) Cancer Res 60: 4830-7; Tamura et al., (2001) Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001)）。しかしながら、HLA-A24およびHLA-A0201はいずれも、白人集団と同様に日本人集団においても一般的なHLA対立遺伝子である（Date et al., (1996) Tissue Antigens 47: 93-101; Kondo et al., (1995) J Immunol 155: 4307-12; Kubo et al., (1994) J Immunol 152: 3913-24; Imanishi et al., (1992) Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065; Williams et al., (1997) Tissue Antigen 49: 129-33）。したがって、これらのHLAによって提示された癌の抗原ペプチドは、日本人および白人の癌の処置に特に有用な可能性がある。さらに、インビトロでの低親和性CTLの誘導は通常は高濃度でのペプチドの使用に起因することが公知であり、これにより抗原提示細胞(APC)上で高レベルの特異的ペプチド/MHC複合体が生成され、これらのCTLが効率的に活性化されることになる（Alexander-Miller et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7）。 Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from certain healthy donors, when subjected to peptide stimulation, produce significant levels of IFN-γ in response to the peptide, but according to 51 Cr release assays, HLA-A24 or HLA-A0201 It has been repeatedly reported that it has little cytotoxicity against tumor cells in a restrictive manner (Kawano et al., (2000) Cancer Res 60: 3550-8; Nishizaka et al., (2000) Cancer Res 60: 4830-7; Tamura et al., (2001) Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001)). However, both HLA-A24 and HLA-A0201 are common HLA alleles in the Japanese population as well as the Caucasian population (Date et al., (1996) Tissue Antigens 47: 93-101; Kondo et al. al., (1995) J Immunol 155: 4307-12; Kubo et al., (1994) J Immunol 152: 3913-24; Imanishi et al., (1992) Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press , Oxford, 1065; Williams et al., (1997) Tissue Antigen 49: 129-33). Therefore, the cancer antigenic peptides presented by these HLAs may be particularly useful in the treatment of Japanese and Caucasian cancers. Furthermore, induction of low affinity CTL in vitro is usually due to the use of peptides at high concentrations, which results in high levels of specific peptide / MHC complexes on antigen presenting cells (APC) Are produced and these CTLs are efficiently activated (Alexander-Miller et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7).

このため、癌に関係する発癌機構の解明、および新規抗癌剤を開発するための可能性のある標的の同定を目的とした取り組みとして、腎癌細胞の精製集団における遺伝子発現パターンの大規模解析を、27,436種の遺伝子を提示するcDNAマイクロアレイを用いて行った。より具体的には、cDNAマイクロアレイおよびレーザービームマイクロダイセクションの組み合わせを用いて、腎細胞癌の外科的検体15例の正確なゲノム全域にわたる発現プロファイルを調べた。本明細書で詳細に考察する所見から、これらの同定された遺伝子が腫瘍細胞の成長増殖に重要な役割を果たしている可能性があり、したがってこれらが抗癌薬の開発のための有望な標的であることが示唆される。   For this reason, large-scale analysis of gene expression patterns in purified populations of renal cancer cells was undertaken with the aim of elucidating the mechanisms of cancer-related carcinogenesis and identifying potential targets for developing new anticancer drugs. A cDNA microarray displaying 27,436 genes was used. More specifically, a combination of cDNA microarray and laser beam microdissection was used to examine the exact genome-wide expression profile of 15 surgical specimens of renal cell carcinoma. From the findings discussed in detail herein, these identified genes may play an important role in the growth and proliferation of tumor cells and are therefore promising targets for the development of anticancer drugs. It is suggested that there is.

発明の概要
本発明は、腎細胞癌（RCC）と相関する遺伝子発現のパターンの発見に関する。腎細胞癌で差次的に発現される遺伝子は本明細書で、「RCC核酸」または「RCCポリヌクレオチド」と集合的に呼ばれ、また対応する、コードされたポリペプチドは「RCCポリペプチド」または「RCCタンパク質」と呼ばれる。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to the discovery of gene expression patterns that correlate with renal cell carcinoma (RCC). Genes that are differentially expressed in renal cell carcinoma are collectively referred to herein as “RCC nucleic acids” or “RCC polynucleotides” and the corresponding encoded polypeptides are “RCC polypeptides”. Or called “RCC protein”.

腎臓癌発生に関係する分子メカニズムの特徴付けのために、本発明者らは、ヒト遺伝子27,436個を表すcDNAマイクロアレイと、レーザーマイクロビームマイクロダイセクション（LMM）とを組み合わせて用いることにより、正常腎皮質と比較して腎細胞癌（RCC）の外科的検体15例のゲノム全域にわたる遺伝子発現プロファイルを分析した。本発明者らは、腎細胞癌において一般的にアップレギュレートされた遺伝子251個および腎細胞癌においてダウンレギュレートされた遺伝子721個を同定した。アップレギュレートされた遺伝子の中で、その機能が現在わかっていない遺伝子は74個であったが、一方で、機能がわかっていない189個の遺伝子は、腎細胞癌において一般的にダウンレギュレートされていると同定された。代表的な候補遺伝子19個による半定量的RT-PCR実験の結果は、本発明者らのマイクロアレイ分析が信頼できることを支持した。これらのデータは、その産物がRCCの処置に関する分子標的として役立つ可能性がある候補遺伝子を発見するために有用な情報を提供するはずである。   To characterize the molecular mechanisms involved in kidney cancer development, we have used a combination of a cDNA microarray representing 27,436 human genes and a laser microbeam microdissection (LMM) to normal kidney. Genome-wide gene expression profiles of 15 surgical specimens of renal cell carcinoma (RCC) compared to the cortex were analyzed. We have identified 251 genes that are generally upregulated in renal cell carcinoma and 721 genes that are downregulated in renal cell carcinoma. Among the up-regulated genes, 74 genes whose function is currently unknown are known, while 189 genes whose function is unknown are generally down-regulated in renal cell carcinoma Has been identified. The results of semi-quantitative RT-PCR experiments with 19 representative candidate genes supported the reliability of our microarray analysis. These data should provide useful information to discover candidate genes whose products may serve as molecular targets for the treatment of RCC.

したがって、本発明は、組織試料のような患者に由来する生体試料におけるRCC関連遺伝子の発現レベルを決定することによって、対象における腎細胞癌を診断または腎細胞癌に対する素因を決定する方法を提供する。本明細書において、「RCC関連遺伝子」という用語は、正常細胞と比較してRCC細胞において異なる発現レベルを特徴とする遺伝子を指す。正常細胞とは、正常腎組織から得られる細胞である。本発明の文脈において、RCC関連遺伝子は、RCC 1〜972と番号がつけられた遺伝子の一つまたは複数である。遺伝子の正常対照レベルと比較して遺伝子発現レベルが変化（たとえば、増加または減少）すれば、対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。   Accordingly, the present invention provides a method for diagnosing or predisposing for renal cell carcinoma in a subject by determining the expression level of an RCC-related gene in a biological sample derived from a patient, such as a tissue sample. . As used herein, the term “RCC-related gene” refers to a gene characterized by a different expression level in RCC cells compared to normal cells. Normal cells are cells obtained from normal kidney tissue. In the context of the present invention, the RCC-related gene is one or more of the genes numbered RCC 1-972. A change in gene expression level (eg, increase or decrease) relative to the normal control level of the gene indicates that the subject is suffering from or at risk of developing RCC.

本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出されるタンパク質発現レベルを指し、正常対照レベルおよびRCC対照レベルの両方を含む。対照レベルは、単一の参照集団に由来する単一の発現パターンであってもよく、複数の発現パターンに由来する単一の発現パターンであってもよい。例えば対照レベルは、過去に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースの場合がある。「正常対照レベル」とは、正常な健常個体において、またはRCCに罹患していないことが判明している個体の集団において検出される遺伝子の発現レベルを指す。正常個体とは、腎細胞癌の臨床症状を有さない個体のことである。これに対して、「RCC対照レベル」とは、RCCに罹患した集団で見出されるRCC関連遺伝子の発現プロファイルを指す。   In the context of the present invention, the phrase “control level” refers to the level of protein expression detected in a control sample and includes both normal and RCC control levels. The control level may be a single expression pattern derived from a single reference population or a single expression pattern derived from multiple expression patterns. For example, the control level may be a database of expression patterns from previously tested cells. “Normal control level” refers to the expression level of a gene detected in a normal healthy individual or in a population of individuals known to be free of RCC. A normal individual is an individual who does not have clinical symptoms of renal cell carcinoma. In contrast, “RCC control level” refers to the expression profile of RCC-related genes found in a population affected by RCC.

正常対照レベルと比較して、被験試料中で検出されるRCC 1〜251と番号付けされた遺伝子のうち1つ又は複数の発現レベルが増加していることにより、(試料を採取した)対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。一方、被験試料中に検出されるRCC 252〜972と番号付けされた遺伝子のうち1つ又は複数の発現レベルが正常対照レベルと比較して低下していることにより、該対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。   The subject (from which the sample was taken) is identified by an increase in the expression level of one or more of the genes numbered RCC 1-251 detected in the test sample compared to the normal control level. It is shown to have or be at risk for developing RCC. On the other hand, the subject suffers from RCC because the expression level of one or more of the genes numbered RCC 252-272 detected in the test sample is reduced compared to the normal control level. Or are at risk of developing it.

または、試料における一群のRCC関連遺伝子の発現を、同じ一群の遺伝子のRCC対照レベルと比較することができる。試料における発現とRCC対照における発現との間の類似性により、（試料を採取した）対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。   Alternatively, the expression of a group of RCC-related genes in a sample can be compared to the RCC control level of the same group of genes. The similarity between expression in the sample and expression in the RCC control indicates that the subject (with the sample taken) is suffering from or at risk of developing RCC.

本発明によれば、対照レベルと比較して遺伝子発現が10％、25％、または50％上昇または低下している場合に、遺伝子発現レベルは「変化している」とみなされる。または同様に、対照レベルと比較して、1倍、2倍、5倍またはそれ以上増加または減少した場合に、遺伝子発現は変化しているとみなされうる。例えばアレイ上で、RCC関連遺伝子プローブと患者由来の組織試料の遺伝子転写物とのハイブリダイゼーションを検出することによって、発現が判定される。   According to the present invention, a gene expression level is considered “altered” when gene expression is increased or decreased by 10%, 25%, or 50% compared to a control level. Or similarly, gene expression can be considered altered when it is increased or decreased by 1 fold, 2 fold, 5 fold or more compared to a control level. Expression is determined, for example, by detecting hybridization of the RCC-related gene probe with a gene transcript of a patient-derived tissue sample on the array.

本発明の文脈において、患者由来の組織試料とは、被験対象から、例えば、RCCを有することが判明しているかその疑いがある患者から得られる任意の組織である。例えば、組織は上皮細胞を含み得る。より具体的には、組織は、腎細胞癌（RCC）由来の上皮細胞であり得る。   In the context of the present invention, a patient-derived tissue sample is any tissue obtained from a subject, for example, from a patient known or suspected of having RCC. For example, the tissue can include epithelial cells. More specifically, the tissue can be epithelial cells from renal cell carcinoma (RCC).

本発明はまた、二つまたはそれより多いRCC 1〜972の遺伝子発現レベルで構成されるRCC参照発現プロファイルを提供する。またはRCC参照発現プロファイルは、二つまたはそれより多いRCC 1〜251またはRCC 252〜972で構成されてもよい。   The present invention also provides an RCC reference expression profile composed of two or more RCC 1-972 gene expression levels. Alternatively, the RCC reference expression profile may consist of two or more RCC 1-251 or RCC 252-972.

本発明はさらに、RCC関連遺伝子を発現する被験細胞を被験作用物質に接触させる段階、およびRCC関連遺伝子の発現レベルもしくは活性、またはその遺伝子産物の活性を決定する段階によって、RCC関連遺伝子、たとえばRCC 1〜972の発現または活性を阻害または増強する作用物質を同定する方法を提供する。被験細胞は、腎細胞癌から得られた上皮細胞のような上皮細胞であってもよい。遺伝子の対照レベルと比較して、アップレギュレートされたRCC関連遺伝子（たとえば、RCC 1〜251）の発現レベル、またはその遺伝子産物の活性が減少すれば、被験作用物質が、RCC関連遺伝子の阻害剤であること、およびRCCの症状を軽減させるために用いられる可能性があることが示される。または、遺伝子の対照レベルと比較してダウンレギュレートされたRCC関連遺伝子（たとえば、RCC 252〜972）の発現レベルもしくは活性、またはその遺伝子産物の活性が増加すれば、該被験作用物質が、RCC関連遺伝子の発現または機能の増強物質であり、RCCの症状を軽減させるために用いられる可能性があることが示される。   The present invention further includes contacting a test cell that expresses an RCC-related gene with a test agent, and determining the expression level or activity of the RCC-related gene, or the activity of its gene product, such as an RCC-related gene, such as an RCC. Methods of identifying agents that inhibit or enhance expression or activity from 1 to 972 are provided. The test cell may be an epithelial cell such as an epithelial cell obtained from renal cell carcinoma. If the expression level of an up-regulated RCC-related gene (eg, RCC 1-251) or the activity of its gene product is reduced compared to the control level of the gene, the test agent will inhibit the RCC-related gene. It is indicated that it is an agent and may be used to reduce the symptoms of RCC. Alternatively, if the expression level or activity of a down-regulated RCC-related gene (eg, RCC 252 to 972) or the activity of its gene product is increased compared to the control level of the gene, the test agent is RCC It is indicated that it is a substance that enhances the expression or function of related genes and may be used to reduce the symptoms of RCC.

本発明はまた、一つまたは複数のRCC核酸またはRCCポリペプチドに結合する検出試薬を含むキットを提供する。一つまたは複数のRCC核酸に結合する核酸のアレイも同様に提供される。   The invention also provides a kit comprising a detection reagent that binds to one or more RCC nucleic acids or RCC polypeptides. An array of nucleic acids that binds to one or more RCC nucleic acids is also provided.

本発明の治療法には、対象にアンチセンス組成物を投与する段階を含む、該対象における腎細胞癌を処置または予防する方法が含まれる。本発明の文脈において、アンチセンス組成物は特異的標的遺伝子の発現を低減させる。たとえば、アンチセンス組成物は、RCC 1〜251からなる群より選択されるアップレギュレートされたRCC関連遺伝子配列と相補的なヌクレオチドを含んでもよい。または、本発明には、低分子干渉RNA（siRNA）組成物を対象に投与する段階が含まれてもよい。本発明の文脈において、siRNA組成物は、アップレギュレートされたRCC関連遺伝子、たとえばRCC 1〜251からなる群より選択される核酸、特にC6700V2 (RCC 81)、B7032N (RCC 126)、およびB9320 (RCC173)の発現を低減させる。   Therapeutic methods of the present invention include methods for treating or preventing renal cell carcinoma in a subject comprising administering to the subject an antisense composition. In the context of the present invention, the antisense composition reduces the expression of a specific target gene. For example, the antisense composition may comprise a nucleotide that is complementary to an upregulated RCC-related gene sequence selected from the group consisting of RCC 1-251. Alternatively, the present invention may include administering a small interfering RNA (siRNA) composition to the subject. In the context of the present invention, the siRNA composition is an upregulated RCC-related gene, for example a nucleic acid selected from the group consisting of RCC 1-251, in particular C6700V2 (RCC 81), B7032N (RCC 126), and B9320 ( RCC173) expression is reduced.

なおもう一つの方法において、対象における腎細胞癌の処置または予防は、リボザイム組成物を該対象に投与することによって行ってもよい。したがって、本発明は、アップレギュレートされたRCC関連遺伝子（たとえば、RCC 1〜251）の発現を低減させる核酸特異的リボザイム組成物を含む。本発明の他の治療法には、本明細書において開示されたダウンレギュレートされたRCC関連遺伝子（たとえば、RCC 252〜972）の一つもしくは複数の発現、またはこれらの遺伝子の一つもしくは複数によってコードされるポリペプチドの活性を増加させる化合物を対象に投与する方法が含まれる。   In yet another method, treatment or prevention of renal cell carcinoma in a subject may be performed by administering a ribozyme composition to the subject. Accordingly, the present invention includes nucleic acid-specific ribozyme compositions that reduce the expression of upregulated RCC-related genes (eg, RCC 1-251). Other therapies of the invention include expression of one or more of the down-regulated RCC-related genes disclosed herein (eg, RCC 252-272), or one or more of these genes A method of administering to a subject a compound that increases the activity of a polypeptide encoded by

本発明はまた、ワクチンおよびワクチン接種方法も含む。例えば、対象におけるRCCを処置または予防する方法は、RCC1〜251からなる群より選択されるRCC核酸にコードされるRCCポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫活性断片を含むワクチンを対象に投与する段階を含んでもよい。本発明の文脈において、免疫活性断片とは、完全長の天然タンパク質よりも長さは短いものの、完全長タンパク質によって誘導される免疫応答に類似した免疫応答を誘導する、ポリペプチドである。例えば、免疫活性断片とは、少なくとも8残基長であり、かつT細胞またはB細胞のような免疫細胞を刺激し得ることが好ましい。免疫細胞の刺激は、細胞増殖、サイトカイン（例えば、IL-2）の生成、または抗体の産生を検出することによって測定可能である。   The invention also includes vaccines and vaccination methods. For example, a method for treating or preventing RCC in a subject comprises administering to the subject a vaccine comprising an RCC polypeptide encoded by an RCC nucleic acid selected from the group consisting of RCC 1-251, or an immunoactive fragment of such a polypeptide. May include the step of: In the context of the present invention, an immunologically active fragment is a polypeptide that induces an immune response that is shorter in length than the full-length native protein, but is similar to the immune response induced by the full-length protein. For example, an immunologically active fragment is preferably at least 8 residues long and can stimulate immune cells such as T cells or B cells. Immune cell stimulation can be measured by detecting cell proliferation, cytokine (eg, IL-2) production, or antibody production.

本発明はまた、C6700、B7032N、またはB9320の発現の阻害が、腎細胞癌に関係する細胞成長を含む、様々な癌細胞の細胞成長を阻害するために有効であるという驚くべき発見にも基づいている。本出願において記述される本発明は、部分的にこの発見に基づいている。   The present invention is also based on the surprising discovery that inhibition of C6700, B7032N, or B9320 expression is effective to inhibit cell growth of a variety of cancer cells, including those associated with renal cell carcinoma. ing. The invention described in this application is based in part on this discovery.

本発明はまた、細胞成長を阻害する方法も提供する。本方法において、C6700、B7032N、またはB9320の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）を含む組成物に細胞を接触させる段階を含む方法が提供される。本発明はまた、対象における腫瘍細胞成長を阻害するための方法も提供する。そのような方法には、C6700、B7032N、およびB9320から選択される配列と特異的にハイブリダイズする低分子干渉RNA（siRNA）を含む組成物を対象に投与する段階が含まれる。もう一つの局面において、本発明は、生物試料の細胞におけるC6700、B7032N、およびB9320遺伝子の一つまたは複数の発現を阻害するための方法を提供する。遺伝子の発現は、関心対象遺伝子（たとえば、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子）の発現を阻害するために十分な量の二本鎖リボ核酸（RNA）分子を細胞に導入することによって阻害される可能性がある。   The present invention also provides a method of inhibiting cell growth. In this method, a method is provided comprising contacting a cell with a composition comprising a small interfering RNA (siRNA) that inhibits expression of C6700, B7032N, or B9320. The present invention also provides a method for inhibiting tumor cell growth in a subject. Such methods include administering to a subject a composition comprising a small interfering RNA (siRNA) that specifically hybridizes with a sequence selected from C6700, B7032N, and B9320. In another aspect, the present invention provides a method for inhibiting the expression of one or more of the C6700, B7032N, and B9320 genes in cells of a biological sample. Gene expression can be inhibited by introducing sufficient amounts of double-stranded ribonucleic acid (RNA) molecules into the cell to inhibit the expression of the gene of interest (eg, C6700, B7032N, or B9320 gene) There is sex.

本発明のもう一つの局面は、核酸配列およびベクターを含む産物と共に、たとえば本発明の方法を実行するために有効なそれらを含む組成物に関する。該産物において、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、C6700、B7032N、およびB9320遺伝子の一つまたは複数の発現を阻害するsiRNA分子が提供される。そのような分子において、C6700、B7032N、またはB9320標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であるセンス鎖と、センス鎖に対して相補的であるリボヌクレオチド配列であるアンチセンス鎖とで構成される分子である。分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とは、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。   Another aspect of the present invention relates to a composition comprising nucleic acid sequences and a product comprising the vector, including, for example, those effective to carry out the methods of the present invention. In the product, siRNA molecules are provided that inhibit expression of one or more of the C6700, B7032N, and B9320 genes when introduced into a cell that expresses the target gene. In such a molecule, a molecule composed of a sense strand that is a ribonucleotide sequence corresponding to a C6700, B7032N, or B9320 target sequence and an antisense strand that is a ribonucleotide sequence that is complementary to the sense strand. is there. The sense strand and the antisense strand of the molecule hybridize to each other to form a double-stranded molecule.

本発明はまた、細胞成長を阻害する方法を提供する。細胞成長は、C6700、B7032N、またはB9320の低分子干渉RNA（siRNA）の組成物に細胞を接触させることによって阻害される可能性がある。細胞はさらに、トランスフェクション増強物質に接触させてもよい。細胞は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで提供されてもよい。対象は好ましくは哺乳動物、たとえばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。細胞は、腎細胞のような尿生殖器系であってもよい。または、細胞は、癌腫細胞または腺癌細胞のような腫瘍細胞（すなわち、癌細胞）であってもよい。たとえば、細胞は、腎細胞癌であってもよく、より詳しくは明細胞であってもよい。本発明の文脈において、「細胞成長を阻害する」という句は、処置細胞が、無処置細胞と比較してより低い速度で増殖する、または生存率の減少を有することを意味する。細胞成長は、当技術分野で公知の増殖アッセイによって測定されうる。   The present invention also provides a method of inhibiting cell growth. Cell growth may be inhibited by contacting the cells with a composition of C6700, B7032N, or B9320 small interfering RNA (siRNA). The cell may further be contacted with a transfection enhancing agent. The cell may be provided in vitro, in vivo, or ex vivo. The subject is preferably a mammal, such as a human, non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, or cow. The cell may be a urogenital system such as a kidney cell. Alternatively, the cells may be tumor cells (ie, cancer cells) such as carcinoma cells or adenocarcinoma cells. For example, the cell may be renal cell carcinoma, more specifically a clear cell. In the context of the present invention, the phrase “inhibits cell growth” means that treated cells proliferate at a lower rate or have reduced viability compared to untreated cells. Cell growth can be measured by proliferation assays known in the art.

本発明はさらに、腎細胞癌の候補診断マーカーとして役立つのみならず、診断のための新しい戦略および有効な抗癌剤を開発するための可能性がある有望な標的として役立つ新規転写変異体C6700V2を提供する。好ましい態様において、C6700V2ポリペプチドには、SEQ ID NO:65のオープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸1151個（SEQ ID NO:66）のタンパク質が含まれる。   The present invention further provides a novel transcriptional variant C6700V2 that not only serves as a candidate diagnostic marker for renal cell carcinoma but also serves as a promising target for developing new strategies and effective anticancer agents for diagnosis . In a preferred embodiment, the C6700V2 polypeptide comprises a 1151 amino acid (SEQ ID NO: 66) protein encoded by the open reading frame of SEQ ID NO: 65.

特に定める場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したのと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に用いることはできるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全文が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合は、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のためのものであり、制限を意図するものではない。   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

本明細書に記載された方法の一つの長所は、腎細胞癌の明白な臨床症状を検出する前に疾患が同定されることである。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるだろう。   One advantage of the methods described herein is that the disease is identified prior to detecting overt clinical symptoms of renal cell carcinoma. Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and the appended claims.

発明の詳細な説明
本明細書で用いる「1つの」、「ある」および「その」という用語は、特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION As used herein, the terms “a”, “a” and “the” mean “at least one” unless otherwise specified.

通常、RCC細胞は様々な細胞成分を含む固形塊として存在するために、正常腎細胞と比較した、腫瘍塊を利用することによるRCCの遺伝子発現解析は、ゆがめられる。このように、結果には「ノイズデータ（noisy data）」が含まれる。したがって、純粋な細胞集団を単離する方法である、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法（LCM）、またはレーザーマイクロビームマイクロダイセクション法（LMM）を用いて、特定の癌細胞と正常上皮細胞とを得た（Kitahara et al., (2001) Cancer Res, 61: 3544-9; Gjerdrum et al., (2001) J Mol Diagn, 3: 105-10）。   Since RCC cells usually exist as solid masses containing various cellular components, gene expression analysis of RCC by using tumor masses compared to normal kidney cells is distorted. Thus, the result includes “noisy data”. Therefore, specific cancer cells and normal epithelial cells are obtained using the laser capture microdissection method (LCM) or laser microbeam microdissection method (LMM), which is a method for isolating a pure cell population. (Kitahara et al., (2001) Cancer Res, 61: 3544-9; Gjerdrum et al., (2001) J Mol Diagn, 3: 105-10).

本発明は、RCC患者から得た上皮細胞と腎細胞との間で多数の核酸の発現パターンが変化しているという発見に、部分的に基づく。遺伝子発現の差異は統合型cDNAマイクロアレイシステムによって同定された。   The present invention is based in part on the discovery that the expression pattern of many nucleic acids is altered between epithelial cells and renal cells obtained from RCC patients. Differences in gene expression were identified by an integrated cDNA microarray system.

15例のRCCからの癌細胞の遺伝子発現プロファイルを、レーザーマイクロダイセクション法とともに、27,648遺伝子を提示するcDNAマイクロアレイを用いて解析した。レーザーマイクロダイセクション法によって純粋に選択した、診断された患者由来の癌細胞と正常腎細胞との発現パターンを比較することによって、251遺伝子が、RCC細胞において共通してアップレギュレートされていると同定され、721遺伝子が、RCC細胞において共通してダウンレギュレートされていると同定された。さらに、患者の血清中または尿中の癌関連タンパク質を検出する能力を有する候補分子マーカーの選別を行い、ヒトRCCにおけるシグナル抑制戦略の開発のための標的となる可能性のあるものがいくつか発見された。   The gene expression profiles of cancer cells from 15 RCCs were analyzed using a laser microdissection method and a cDNA microarray displaying 27,648 genes. 251 genes are commonly up-regulated in RCC cells by comparing the expression patterns of cancer cells derived from diagnosed patients and normal kidney cells purely selected by laser microdissection method Identified and identified 721 genes are commonly down-regulated in RCC cells. In addition, we screened candidate molecular markers that have the ability to detect cancer-related proteins in the serum or urine of patients and found some potential targets for the development of signal suppression strategies in human RCC It was.

本明細書において同定された、差次的に発現される遺伝子には、RCCマーカーおよびRCC遺伝子標的としての診断上の有用性が見出され、その発現は、RCC症状の処置または軽減のために改変されうる。   The differentially expressed genes identified herein find diagnostic utility as RCC markers and RCC gene targets, whose expression is for treatment or alleviation of RCC symptoms Can be modified.

RCC患者において発現レベルが変化した（すなわち、上昇または低下した）遺伝子は、表4〜5にまとめられており、本明細書において「RCC関連遺伝子」、「RCC核酸」、または「RCCポリヌクレオチド」と総称され、対応するコードされるポリペプチドは「RCCポリペプチド」または「RCCタンパク質」と呼ばれる。特記されない限り、「RCC」とは、本明細書に開示した任意の配列を指す。(例えばRCC 1〜972)。以前に記載された遺伝子は、データベースのアクセッション番号とともに示す。   Genes with altered expression levels (ie, increased or decreased) in RCC patients are summarized in Tables 4-5 and are referred to herein as “RCC-related genes”, “RCC nucleic acids”, or “RCC polynucleotides”. And the corresponding encoded polypeptides are referred to as “RCC polypeptides” or “RCC proteins”. Unless otherwise specified, “RCC” refers to any sequence disclosed herein. (Eg RCC 1-972). Previously described genes are shown along with database accession numbers.

細胞の試料における種々の遺伝子の発現を測定することにより、RCCを診断することができる。同様に、種々の物質に応答したこれらの遺伝子の発現を測定することにより、RCCを処置するための物質を同定することができる。   RCC can be diagnosed by measuring the expression of various genes in a sample of cells. Similarly, substances for treating RCC can be identified by measuring the expression of these genes in response to various substances.

本発明は、表4〜5に列挙したRCC配列の少なくとも一つの発現を、最大で全発現を決定する（例えば、測定する）段階を含む。公知の配列に関するGenBank（商標）データベースの項目によって提供される配列情報を使用し、当業者に周知の技術を用いて、RCC関連遺伝子の検出および測定を行うことができる。例えば、RCC配列に対応する配列データベース登録情報中の配列を用いて、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション分析においてRCC関連遺伝子に対応するRNA配列を検出するためのプローブを構築することができる。典型的に、プローブには、参照配列の少なくとも10、20、50、100、または200ヌクレオチドが含まれる。別の例としては、配列を用いて、例えば、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応などの、増幅に基づいた検出法におけるRCC核酸を特異的に増幅するためのプライマーを構築することができる。   The present invention includes determining (eg, measuring) the expression of at least one of the RCC sequences listed in Tables 4-5 at a maximum. Using the sequence information provided by the GenBank ™ database entries for known sequences, RCC-related genes can be detected and measured using techniques well known to those skilled in the art. For example, a probe for detecting an RNA sequence corresponding to an RCC-related gene in, for example, Northern blot hybridization analysis can be constructed using the sequence in the sequence database registration information corresponding to the RCC sequence. Typically, a probe includes at least 10, 20, 50, 100, or 200 nucleotides of a reference sequence. As another example, the sequences can be used to construct primers for specifically amplifying RCC nucleic acids in amplification-based detection methods such as, for example, reverse transcription-based polymerase chain reaction.

次いで、被験細胞集団、例えば患者由来の組織試料における、1つまたは複数のRCC関連遺伝子の発現レベルを、参照集団における同じ遺伝子の発現レベルと比較する。参照細胞集団は、比較するパラメータが既知である1つまたは複数の細胞、すなわち腎細胞癌細胞(例えば、RCC細胞)または正常腎皮質細胞(例えば、非RCC細胞)を含む。   The expression level of one or more RCC-related genes in a test cell population, eg, a patient-derived tissue sample, is then compared to the expression level of the same gene in a reference population. The reference cell population includes one or more cells with known parameters to be compared, ie renal cell carcinoma cells (eg, RCC cells) or normal renal cortical cells (eg, non-RCC cells).

被験細胞集団における遺伝子発現のパターンが、参照細胞集団と比較してRCCまたはそれに対する素因を示すか否かは、参照細胞集団の組成に依存する。例えば、参照細胞集団が非RCC細胞から構成されている場合には、被験細胞集団と参照細胞集団との間で遺伝子発現パターンに類似性があることにより、被験細胞集団が非RCCであると示される。反対に、参照細胞集団がRCC細胞から構成される場合、被験細胞集団と参照細胞集団との間で遺伝子発現プロファイルに類似性があることにより、被験細胞集団がRCC細胞を含むことが示される。   Whether the pattern of gene expression in the test cell population is predisposed to or relative to RCC as compared to the reference cell population depends on the composition of the reference cell population. For example, if the reference cell population is composed of non-RCC cells, the similarity of the gene expression pattern between the test cell population and the reference cell population indicates that the test cell population is non-RCC. It is. Conversely, if the reference cell population is composed of RCC cells, a similarity in gene expression profile between the test cell population and the reference cell population indicates that the test cell population contains RCC cells.

被験細胞集団におけるRCCマーカー遺伝子の発現レベルは、それと参照細胞集団における対応するRCCマーカー遺伝子の発現レベルとの相違が、1.0倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10.0倍、またはそれ以上を上回って変動する場合、「変化した」とみなされる。   The difference between the expression level of the RCC marker gene in the test cell population and the expression level of the corresponding RCC marker gene in the reference cell population exceeds 1.0, 1.5, 2.0, 5.0, 10.0, or more. Are considered “changed”.

被験細胞集団と参照細胞集団との間の差次的な遺伝子発現は、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化することができる。例えば、対照核酸は、細胞の癌状態または非癌状態に応じて差がないことが知られている核酸である。対照核酸の発現レベルは、被験集団および参照集団におけるシグナルレベルを標準化するのに用いることができる。対照遺伝子の例には、例えば、β-アクチン、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質P1が非制限的に含まれる。   Differential gene expression between a test cell population and a reference cell population can be normalized to a control nucleic acid, such as a housekeeping gene. For example, the control nucleic acid is a nucleic acid that is known not to differ depending on the cancerous or non-cancerous state of the cell. The expression level of the control nucleic acid can be used to normalize the signal level in the test population and the reference population. Examples of control genes include, for example, but are not limited to β-actin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, and ribosomal protein P1.

被験細胞集団を、複数の参照細胞集団と比較することができる。複数の参照集団のそれぞれは、公知のパラメータが異なってもよい。したがって、例えばRCC細胞を含むことが判明している第1の参照細胞集団、および、例えば非RCC細胞（正常細胞）を含むことが判明している第2の参照集団と、被験細胞集団を比較してもよい。被験細胞は、RCC細胞を含むことが判明しているか、またはそれが疑われる対象由来の組織型もしくは細胞試料中に含まれてもよい。   A test cell population can be compared to multiple reference cell populations. Each of the plurality of reference populations may have different known parameters. Thus, for example, compare the test cell population with a first reference cell population known to contain RCC cells and a second reference population known to contain non-RCC cells (normal cells), for example. May be. The test cell may be included in a tissue type or cell sample from a subject that is known or suspected to contain RCC cells.

被験細胞は、体組織または体液、例えば、生体液（例えば、血液、痰、または尿など）から得られる。例えば、被験細胞を腎組織から精製してもよい。好ましくは、被験細胞集団は上皮細胞を含む。好ましくは、上皮細胞は、腎細胞癌であることが判明しているか、またはそれが疑われる組織由来である。   The test cell is obtained from a body tissue or fluid, for example, a biological fluid (eg, blood, sputum, or urine). For example, the test cell may be purified from kidney tissue. Preferably, the test cell population includes epithelial cells. Preferably, the epithelial cells are derived from a tissue that has been found or suspected to be renal cell carcinoma.

参照細胞集団における細胞は、被験細胞の組織型と類似した組織型に由来すべきである。任意で、参照細胞集団は、細胞株、例えば、RCC細胞株（すなわち、陽性対照）または正常非RCC細胞株（すなわち、陰性対照）である。または、対照細胞集団は、アッセイされるパラメータまたは条件に関して公知である細胞由来の分子情報のデータベースに由来してもよい。   The cells in the reference cell population should be derived from a tissue type similar to that of the test cell. Optionally, the reference cell population is a cell line, eg, an RCC cell line (ie, a positive control) or a normal non-RCC cell line (ie, a negative control). Alternatively, the control cell population may be derived from a database of molecular information from cells that are known for the parameter or condition being assayed.

対象は好ましくは哺乳類である。例示的な哺乳類には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシが含まれるが、それらに限定されない。   The subject is preferably a mammal. Exemplary mammals include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, or cows.

本明細書に開示された遺伝子の発現は、当技術分野で公知の方法を用いて、タンパク質または核酸のレベルで決定できる。例えば、これらの核酸配列の一つまたは複数を特異的に認識するプローブを用いるノーザンハイブリダイゼーション解析を用いて、遺伝子発現を決定することができる。または、遺伝子発現は、例えば、差次的に発現される遺伝子配列に特異的なプライマーを用いて、逆転写に基づくPCRアッセイ法により測定することもできる。発現はまた、タンパク質レベルで、すなわち本明細書に記載の遺伝子によってコードされるポリペプチドのレベルで測定することによって、またはその生物活性を測定することによって、決定してもよい。このような方法は当技術分野で周知であり、例えば、遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体を利用するイムノアッセイ法が非制限的に含まれる。遺伝子にコードされるタンパク質の生物活性は一般に周知である。   Expression of the genes disclosed herein can be determined at the protein or nucleic acid level using methods known in the art. For example, gene expression can be determined using Northern hybridization analysis using probes that specifically recognize one or more of these nucleic acid sequences. Alternatively, gene expression can be measured, for example, by a PCR assay based on reverse transcription using primers specific for differentially expressed gene sequences. Expression may also be determined by measuring at the protein level, i.e., at the level of the polypeptide encoded by the gene described herein, or by measuring its biological activity. Such methods are well known in the art and include, but are not limited to, immunoassay methods that utilize antibodies to proteins encoded by genes. The biological activity of a protein encoded by a gene is generally well known.

本明細書で使用する「生物」という用語は、少なくとも1つの細胞からなる任意の生き物を意味する。生物は、例えば、真核単細胞のような単純なものでもよく、または例えば、ヒトを含む哺乳動物のような複雑なものでもよい。   As used herein, the term “organism” means any living organism that consists of at least one cell. The organism may be as simple as, for example, a eukaryotic single cell, or as complex as, for example, a mammal including a human.

本明細書で使用する「生物試料」という用語は、生物全体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分のサブセット(例えば、体液(血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血(amniotic cord blood)、尿、膣液、および***が挙げられるが、これに限定されない))を意味する。「生物試料」という用語は、さらに、生物全体またはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製されたホモジネート、溶解産物、抽出物、細胞培養物、または組織培養物、あるいはその画分または一部を意味する。最後に、「生物試料」という用語は、同様に、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含む、生物を増殖させる栄養培地またはゲルなどの培地を意味しうる。   As used herein, the term `` biological sample '' refers to a whole organism or a subset of its tissues, cells, or components (e.g., bodily fluids (blood, mucus, lymph, synovial fluid, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, Umbilical cord blood, urine, vaginal fluid, and semen). The term “biological sample” further refers to a homogenate, lysate, extract, cell culture, or tissue culture, or a fraction or one thereof, prepared from a whole organism or a subset of its cells, tissues, or components. Part. Finally, the term “biological sample” can also mean a medium such as a nutrient medium or gel for growing an organism that contains cellular components such as proteins or nucleic acid molecules.

腎細胞癌の診断
本発明の文脈において、RCCは、被験細胞集団（すなわち、患者由来の生物試料）からの一つまたは複数のRCC核酸配列の発現レベルを測定することによって診断される。好ましくは、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば腎組織から得られる細胞を含む。遺伝子発現を、血液または、尿などの他の体液から測定することもできる。タンパク質レベルを測定するために、他の生物試料を使用することも可能である。例えば、診断するべき対象由来の血液または血清中のタンパク質レベルを、イムノアッセイ法または他の従来の生物学的アッセイ法により測定することができる。 Diagnosing Renal Cell Carcinoma In the context of the present invention, RCC is diagnosed by measuring the expression level of one or more RCC nucleic acid sequences from a test cell population (ie, a patient-derived biological sample). Preferably, the test cell population comprises epithelial cells, eg cells obtained from renal tissue. Gene expression can also be measured from blood or other body fluids such as urine. Other biological samples can also be used to measure protein levels. For example, protein levels in blood or serum from a subject to be diagnosed can be measured by immunoassay or other conventional biological assay.

1つまたは複数のRCC関連遺伝子、例えばRCC 1〜972の発現を、被験細胞試料または生物試料において測定し、アッセイした1つまたは複数の特定のRCC関連遺伝子に関連する正常対照発現レベルと比較する。正常対照レベルとは、RCCに罹患していないことが判明している集団において典型的に見出されるRCC関連遺伝子の発現プロファイルである。患者由来の組織試料における一つまたは複数のRCC関連遺伝子の発現レベルに変化（すなわち上昇または低下）があることにより、対象がRCCに罹患しているかその発症リスクを有することが示される。例えば、被験集団における1つまたは複数のアップレギュレートされたRCC遺伝子すなわちRCC 1〜251の発現が、正常対照レベルと比較して増加していることにより、その対象がRCCに罹患しているか、またはその発症リスクを有することが示される。逆に、1つまたは複数のダウンレギュレートされた遺伝子すなわちRCC 252〜972の被験集団における発現が、正常対照レベルと比較して減少していることにより、その対象がRCCに罹患しているかまたはそのリスクを有することが示される。   Expression of one or more RCC-related genes, such as RCC 1-972, is measured in a test cell sample or biological sample and compared to a normal control expression level associated with one or more specific RCC-related genes assayed . A normal control level is the expression profile of an RCC-related gene typically found in a population known to be free of RCC. A change (ie, an increase or decrease) in the expression level of one or more RCC-related genes in a patient-derived tissue sample indicates that the subject is suffering from or at risk of developing RCC. For example, whether the subject is suffering from RCC because the expression of one or more up-regulated RCC genes or RCC 1-251 in the test population is increased compared to normal control levels, Or is shown to be at risk of developing it. Conversely, the expression of one or more down-regulated genes, or RCC 252 to 972, in the test population is reduced compared to the normal control level, thereby causing the subject to suffer from RCC or It is shown to have that risk.

正常対照レベルと比較して、被験集団におけるRCC関連遺伝子の一つまたは複数が変化すれば、対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。たとえば、RCC関連遺伝子（RCC 1〜251、RCC 252〜972、またはRCC 1〜972）のパネルの少なくとも1％、5％、25％、50％、60％、80％、90％またはそれより多くの変化は、対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することを示している。   A change in one or more of the RCC-related genes in the test population compared to the normal control level indicates that the subject is suffering from or at risk for developing RCC. For example, at least 1%, 5%, 25%, 50%, 60%, 80%, 90% or more of a panel of RCC-related genes (RCC 1-251, RCC 252-972, or RCC 1-972) A change in indicates that the subject has or is at risk of developing RCC.

生物試料におけるRCC関連遺伝子の発現レベルは、RCC関連遺伝子によってコードされるタンパク質に対応するmRNAを定量することによって推定することができる。mRNAの定量法は当業者に公知である。たとえば、RCC関連遺伝子に対応するmRNAレベルは、ノーザンブロッティングまたはRT-PCRによって推定することができる。RCC関連遺伝子のヌクレオチド配列は公知であることから、いかなる当業者も、RCC関連遺伝子を定量するためのプローブまたはプライマーを設計することができる。たとえば、例示的なC6700V2特異的プライマーセットは、SEQ ID NO:38および12のヌクレオチド配列に記載される。または、C6700V1およびC6700V2の双方を、共通のヌクレオチド配列にアニールするプライマーセットを用いて増幅してもよい。そのようなプライマーセットの増幅産物に変異体特異的領域（すなわち、エキソン21の欠失）が含まれる場合、増幅産物は配列の長さに基づいて互いに異なる可能性がある。たとえば、SEQ ID NO:83および84のヌクレオチド配列のプライマーを、双方の変異体に関するプライマーセットとして用いてもよい。さらに、増幅産物はまた、変異体特異的プローブを用いて検出してもよい。   The expression level of the RCC-related gene in the biological sample can be estimated by quantifying mRNA corresponding to the protein encoded by the RCC-related gene. Methods for quantifying mRNA are known to those skilled in the art. For example, mRNA levels corresponding to RCC-related genes can be estimated by Northern blotting or RT-PCR. Since the nucleotide sequence of an RCC-related gene is known, any person skilled in the art can design a probe or primer for quantifying the RCC-related gene. For example, an exemplary C6700V2-specific primer set is set forth in the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 38 and 12. Alternatively, both C6700V1 and C6700V2 may be amplified using a primer set that anneals to a common nucleotide sequence. If the amplification product of such a primer set includes a mutant specific region (ie, exon 21 deletion), the amplification products may differ from each other based on the length of the sequence. For example, primers with nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 83 and 84 may be used as primer sets for both variants. In addition, amplification products may also be detected using mutant specific probes.

さらに、RCC関連遺伝子の発現レベルは、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または量に基づいて分析することができる。RCC関連遺伝子によってコードされるタンパク質の量を決定するための方法を以下に記述する。たとえば、イムノアッセイ法を用いて生物材料におけるそのようなタンパク質の存在を決定してもよい。先に言及したように、マーカー遺伝子（すなわち、RCC関連遺伝子）が腎臓癌患者の試料において発現される限り、任意の生物材料を、タンパク質またはその活性を決定するための生物試料として用いることができる。たとえば、腎尿細管は適した生物試料の例である。しかし、血液および尿のような体液もまた分析してもよい。一方、分析されるタンパク質の活性に従ってRCC関連遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を決定するために適した方法を選択することができる。   Furthermore, the expression level of the RCC-related gene can be analyzed based on the activity or amount of the protein encoded by the gene. A method for determining the amount of protein encoded by an RCC-related gene is described below. For example, immunoassay methods may be used to determine the presence of such proteins in biological materials. As mentioned above, any biological material can be used as a biological sample to determine a protein or its activity, so long as the marker gene (ie, RCC-related gene) is expressed in the sample of a renal cancer patient. . For example, renal tubules are an example of a suitable biological sample. However, body fluids such as blood and urine may also be analyzed. On the other hand, a suitable method can be selected for determining the activity of the protein encoded by the RCC-related gene according to the activity of the protein being analyzed.

生物試料におけるRCC関連遺伝子の発現レベルを推定して、正常試料（たとえば、非疾患対象に由来する試料）におけるレベルと比較してもよい。そのような比較により、遺伝子の発現レベルが正常試料のレベルより高い（表4において示されるRCC関連遺伝子、すなわち1〜251）または低い（表5において示されるRCC関連遺伝子、すなわち252〜972）ことが示される場合、対象はRCCに罹患していると判断される。正常対象および診断される対象からの生物試料におけるRCC関連遺伝子の発現レベルは、同時に決定してもよい。または、発現レベルの正常範囲は、対照群から予め採取した試料における遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法によって決定することができる。対象の試料を比較することによって得られた結果を正常範囲と比較する；結果が正常範囲内に入らない場合、対象はRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有すると判断される。   The expression level of the RCC-related gene in the biological sample may be estimated and compared to the level in a normal sample (eg, a sample derived from a non-diseased subject). Such a comparison indicates that the level of gene expression is higher (RCC-related genes shown in Table 4, ie 1-251) or lower (RCC-related genes shown in Table 5, ie 252-972) than the level of normal samples. Is indicated, the subject is considered to have RCC. The expression level of RCC-related genes in biological samples from normal and diagnosed subjects may be determined simultaneously. Alternatively, the normal range of expression levels can be determined by statistical methods based on results obtained by analyzing gene expression levels in samples previously taken from the control group. Compare the results obtained by comparing the subject's samples to the normal range; if the results do not fall within the normal range, the subject is determined to have or be at risk for developing RCC.

本発明の文脈において、RCCのような細胞増殖性疾患を診断するための診断物質もまた提供される。本発明の診断物質の例には、RCC関連遺伝子のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合する化合物が含まれる。好ましくは、RCC関連遺伝子のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはRCC関連遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合する抗体を、そのような化合物として用いる。RCCを診断する本発明の方法はまた、対象におけるRCCの処置の有効性を査定するために用いてもよい。本方法に従って、被験細胞集団のような生物試料は、RCCに関する処置を受けている対象から得られる。査定法は、RCCを診断する従来の方法に従って行うことができる。   In the context of the present invention, diagnostic materials for diagnosing cell proliferative diseases such as RCC are also provided. Examples of the diagnostic substance of the present invention include compounds that bind to a polynucleotide or polypeptide of an RCC-related gene. Preferably, an oligonucleotide that hybridizes to a polynucleotide of an RCC-related gene or an antibody that binds to a polypeptide encoded by the RCC-related gene is used as such a compound. The methods of the invention for diagnosing RCC may also be used to assess the effectiveness of treatment for RCC in a subject. In accordance with this method, a biological sample, such as a test cell population, is obtained from a subject undergoing treatment for RCC. Assessment methods can be performed according to conventional methods of diagnosing RCC.

望ましいならば、生物試料は、処置前、処置中、および/または処置後の様々な時点で対象から得られる。次に、生物試料におけるRCC関連遺伝子の発現レベルを決定し、例えば、そのRCCの状態が判明している細胞（すなわち、癌細胞または非癌細胞）を含む参照細胞集団に由来する対照レベルと比較する。対照レベルは、処置に供されなかった生物試料を対象に決定される。   If desired, the biological sample is obtained from the subject at various time points before, during, and / or after treatment. Next, determine the expression level of the RCC-related gene in the biological sample and compare it to a control level derived from a reference cell population that includes, for example, cells whose RCC status is known (ie cancer cells or non-cancer cells) To do. The control level is determined for a biological sample that has not been subjected to treatment.

対照レベルが癌細胞を含まない生物試料に由来する場合には、対象由来の生物試料において発現レベルと対照レベルとの間に類似性があることによって、関心対象の処置が有効であることが示される。しかし、対象に由来する生物試料中のRCC関連遺伝子の発現レベルと対照レベルとの差異によって、臨床転帰または予後がそれほど望ましくないことが示される。   If the control level is derived from a biological sample that does not contain cancer cells, the similarity between the expression level and the control level in the subject-derived biological sample indicates that the treatment of interest is effective. It is. However, the difference between the expression level of the RCC-related gene in a biological sample from the subject and the control level indicates that clinical outcome or prognosis is less desirable.

RCC関連遺伝子発現を阻害または増強する作用物質の同定
RCC関連遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する作用物質は、アップレギュレートされたRCC関連遺伝子を発現する被験細胞集団と被験作用物質とを接触させ、その後、RCC関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することによって、同定することができる。作用物質の存在下において、対照レベルと比較して（または該被験作用物質の非存在下における発現レベルもしくは活性レベルと比較して）RCC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルが低下していることにより、該作用物質が、アップレギュレートされたRCC関連遺伝子の阻害物質であって、かつしたがってこれがRCCの発症又は進行を阻害するのに有用であると証明されうることが、示される。 Identification of agents that inhibit or enhance RCC-related gene expression
An agent that inhibits the expression of an RCC-related gene or the activity of its gene product is obtained by contacting a test agent with a test cell population that expresses an up-regulated RCC-related gene, and then the expression level of the RCC-related gene or By determining the activity, it can be identified. In the presence of the agent, the expression level of the RCC-related gene or the activity level of its gene product is reduced compared to the control level (or compared to the expression level or activity level in the absence of the test agent). Indicates that the agent is an upregulated inhibitor of an RCC-related gene, and thus can prove useful in inhibiting the onset or progression of RCC .

または、ダウンレギュレートされたRCC関連遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を増強する作用物質を、RCC関連遺伝子を発現する被験細胞集団を被験作用物質と接触させ、その後ダウンレギュレートされたRCC関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することによって、同定することができる。RCC関連遺伝子の対照発現レベルまたは活性と比較して（または該被験作用物質の非存在下におけるレベルと比較して）RCC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルが上昇していることにより、該被験作用物質が、ダウンレギュレートされたRCC関連遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を増大させることが、示される。   Alternatively, an agent that enhances the expression of a down-regulated RCC-related gene or the activity of its gene product is contacted with a test agent that expresses the RCC-related gene, followed by a down-regulated RCC-related gene. It can be identified by determining the expression level or activity of the gene. Increased expression level of RCC-related gene or activity level of its gene product compared to control expression level or activity of RCC-related gene (or compared to the level in the absence of the test agent) The test agent is shown to increase the expression of a down-regulated RCC-related gene or the activity of its gene product.

被験細胞集団は、RCC関連遺伝子を発現する任意の細胞であってよい。例えば、被験細胞集団は、腎組織由来の細胞などの上皮細胞を含み得る。さらに、被験細胞は腺癌細胞由来の不死化細胞株であってもよい。または、被験細胞は、RCC関連遺伝子をトランスフェクトされた細胞、またはレポーター遺伝子と機能的に結合したRCC関連遺伝子由来の調節配列（例えば、プロモーター配列）をトランスフェクトされた細胞であってもよい。   The test cell population may be any cell that expresses an RCC-related gene. For example, the test cell population can include epithelial cells such as cells derived from renal tissue. Further, the test cell may be an immortalized cell line derived from an adenocarcinoma cell. Alternatively, the test cell may be a cell transfected with an RCC-related gene, or a cell transfected with a regulatory sequence (eg, a promoter sequence) derived from an RCC-related gene operably linked to a reporter gene.

対象におけるRCC処置の有効性の評価：
本明細書で同定された、差次的に発現されるRCC関連遺伝子は、RCC処置の経過のモニタリングも可能にする。本方法において、RCCに対する処置を受ける対象から被験細胞集団が提供される。望ましいならば、処置前、処置中、および/または処置後の様々な時点で、被験細胞集団を対象から入手する。続いて、細胞集団における1つまたは複数のRCC関連遺伝子の発現を決定し、RCCの状態が判明している細胞を含む参照細胞集団と比較する。本発明の文脈において、参照細胞は、その処置を受けるべきではない。 Assessment of the effectiveness of RCC treatment in subjects:
The differentially expressed RCC-related genes identified herein also allow monitoring of the course of RCC treatment. In this method, a test cell population is provided from a subject undergoing treatment for RCC. If desired, test cell populations are obtained from the subject before, during, and / or after treatment. Subsequently, the expression of one or more RCC-related genes in the cell population is determined and compared to a reference cell population comprising cells with known RCC status. In the context of the present invention, the reference cell should not be treated.

参照細胞集団がRCC細胞を含まない場合、被験細胞集団と参照細胞集団におけるRCC関連遺伝子の発現が類似することは、関心対象の処置が有効であることを示す。しかし、被験集団と正常対照参照細胞集団においてRCC関連遺伝子の発現に違いがあることは、臨床的な成果または予後がそれほど好ましくないことを示す。同様に、参照細胞集団がRCC細胞を含む場合には、被験細胞集団と参照細胞集団におけるRCC関連遺伝子の発現に差があることにより、関心対象の処置が有効であることが示されるが、一方で、被験集団および正常対照参照細胞集団におけるRCC関連遺伝子の発現が類似することは、臨床的な成果または予後がそれほど好ましくないことを示す。   If the reference cell population does not contain RCC cells, similar expression of RCC-related genes in the test cell population and the reference cell population indicates that the treatment of interest is effective. However, differences in the expression of RCC-related genes in the test population and the normal control reference cell population indicate less favorable clinical outcome or prognosis. Similarly, if the reference cell population includes RCC cells, a difference in the expression of RCC-related genes in the test cell population and the reference cell population indicates that the treatment of interest is effective. Thus, similar expression of RCC-related genes in the test population and the normal control reference cell population indicates less favorable clinical outcome or prognosis.

さらに、処置後に得られた対象由来の生物試料において測定された1つまたは複数のRCC関連遺伝子の発現レベル（すなわち、処置後レベル）を、処置開始前に得られた対象由来の生物試料において測定された1つまたは複数のRCC関連遺伝子の発現レベル（すなわち、処置前レベル）と比較することもできる。RCC関連遺伝子がアップレギュレートされる遺伝子である場合、処置後試料において発現レベルが低下していることによって関心対象の処置が有効であることが示されており、一方、処置後試料において発現レベルが上昇しているまたは維持されていることにより、臨床的な成果または予後がそれほど好ましくないことが示されている。反対に、RCC関連遺伝子がダウンレギュレートされる遺伝子である場合、処置後試料において発現レベルが上昇していることによって関心対象の処置が有効であることが示されうり、一方、処置後試料において発現レベルが上昇しているまたは維持されていることにより、臨床的な成果または予後がそれほど好ましくないことが示されうる。本明細書で使用される「有効な」という用語は、処置が、対象における、病理学的にアップレギュレートされる遺伝子の発現低下、病理学的にダウンレギュレートされる遺伝子の発現上昇、または、対象における腎細胞癌の大きさ、罹患率、もしくは転移能の低下をもたらすことを指す。関心対象の処置を予防的に適用する場合、「有効である」とは、該処置が腎細胞癌の形成を遅らせるかもしくは予防すること、または、臨床的なRCCの症状を遅らせるか、予防するか、もしくは軽減することを意味する。腎細胞癌の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行われ得る。   Further, the level of expression of one or more RCC-related genes (ie, post-treatment levels) measured in a subject-derived biological sample obtained after treatment is measured in the subject-derived biological sample obtained prior to the start of treatment. It can also be compared to the expression level of one or more RCC-related genes (ie pre-treatment levels). If the RCC-related gene is a gene that is up-regulated, a reduced expression level in the post-treatment sample indicates that the treatment of interest is effective, whereas the expression level in the post-treatment sample Is elevated or maintained, indicating that clinical outcome or prognosis is less favorable. Conversely, if the RCC-related gene is a down-regulated gene, an increased expression level in the post-treatment sample may indicate that the treatment of interest is effective, whereas in the post-treatment sample An elevated or maintained expression level can indicate that clinical outcome or prognosis is less favorable. As used herein, the term “effective” refers to a decrease in the expression of a pathologically upregulated gene, an increased expression of a pathologically downregulated gene in a subject, or , Refers to a reduction in the size, morbidity, or metastatic potential of renal cell carcinoma in a subject. When the treatment of interest is applied prophylactically, “effective” means that the treatment delays or prevents the formation of renal cell carcinoma or delays or prevents clinical RCC symptoms Or it means to reduce. Assessment of renal cell carcinoma can be performed using standard clinical protocols.

有効性は、RCCを診断または処置するための任意の既知の方法に関連して決定されうる。例えば、症候性の異常、例えば、体重減少、腹痛、背部痛、食欲不振、悪心、嘔吐、および全身倦怠感、衰弱、ならびに黄疸を特定することによって、RCCを診断することができる。   Efficacy can be determined in connection with any known method for diagnosing or treating RCC. For example, RCC can be diagnosed by identifying symptomatic abnormalities such as weight loss, abdominal pain, back pain, loss of appetite, nausea, vomiting, and general malaise, weakness, and jaundice.

特定の個体におけるRCC処置のための治療剤の選択：
個体の遺伝子構成における違いは、様々な薬物を代謝するそれらの相対的能力における違いをもたらしうる。対象において代謝され抗RCC剤として作用する作用物質は、対象の細胞において、癌状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非癌状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって顕在化しうる。したがって、本明細書に開示された差次的に発現するRCC関連遺伝子によって、選択された対象由来の被験細胞集団において、治療効果があるまたは予防効果があると推定されるRCC阻害物質を試験し、作用物質が対象において適したRCC阻害物質であるか否かを決定することが可能になる。 Selection of therapeutic agents for RCC treatment in specific individuals:
Differences in an individual's genetic makeup can lead to differences in their relative ability to metabolize various drugs. An agent that is metabolized in a subject and acts as an anti-RCC agent can be manifested in the subject's cells by inducing a change from a gene expression pattern characteristic of a cancer state to a gene expression pattern characteristic of a non-cancerous state . Therefore, the differentially expressed RCC-related genes disclosed herein are used to test RCC inhibitors that are presumed to have a therapeutic or prophylactic effect in a test cell population derived from a selected subject. It will be possible to determine whether the agent is a suitable RCC inhibitor in the subject.

特定の対象に適したRCC阻害物質を同定するために、該対象由来の被験細胞集団を治療薬に曝露し、1つまたは複数のRCC 1〜972遺伝子の発現を測定する。   To identify an RCC inhibitor suitable for a particular subject, a test cell population from the subject is exposed to a therapeutic agent and the expression of one or more RCC 1-972 genes is measured.

本発明の文脈において、被験細胞集団は、RCC関連遺伝子を発現するRCC細胞を含みうる。好ましくは、被験細胞は上皮細胞である。例えば、被験細胞集団を候補作用物質の存在下でインキュベートすることができ、被験試料の遺伝子発現パターンを測定して、一つまたは複数の参照プロファイル、例えばRCC参照発現プロファイルまたは非RCC参照発現プロファイルと比較することができる。   In the context of the present invention, the test cell population may comprise RCC cells that express an RCC-related gene. Preferably, the test cell is an epithelial cell. For example, a test cell population can be incubated in the presence of a candidate agent, and the gene expression pattern of the test sample can be measured to determine one or more reference profiles, such as an RCC reference expression profile or a non-RCC reference expression profile. Can be compared.

RCCを含む参照細胞集団と比較して、被験細胞集団において、アップレギュレートされたRCC遺伝子すなわちRCC 1〜251の一つもしくは複数の発現が減少するか、または、ダウンレギュレートされたRCC遺伝子すなわちRCC 252〜972の一つもしくは複数の発現が増加することは、作用物質が治療効果のあることを示している。   Compared to a reference cell population comprising RCC, the expression of one or more of an up-regulated RCC gene or RCC 1-251 is reduced or a down-regulated RCC gene or An increase in the expression of one or more of RCC 252 to 972 indicates that the agent is therapeutic.

本発明の文脈において、被験作用物質は任意の化合物または組成物であってよい。本発明の文脈における使用に適した例示的な被験作用物質には、免疫調節物質が含まれるがこれに限定されない。   In the context of the present invention, the test agent may be any compound or composition. Exemplary test agents suitable for use in the context of the present invention include, but are not limited to, immunomodulators.

治療剤を同定するためのスクリーニングアッセイ法：
本明細書に開示された、差次的に発現するRCC関連遺伝子を、RCCを処置するための候補治療薬を同定するために用いることもできる。本発明の方法は、候補治療薬が、RCC状態に特徴的なRCC 1〜972などの1つまたは複数のRCC関連遺伝子の発現プロファイルを、RCC状態に特徴的な遺伝子発現パターンへと変換できるか否かを判定するために、候補治療薬をスクリーニングする段階を含む。 Screening assays to identify therapeutic agents:
The differentially expressed RCC-related genes disclosed herein can also be used to identify candidate therapeutics for treating RCC. The method of the present invention is capable of converting the expression profile of one or more RCC-related genes, such as RCC 1-972 characteristic of RCC status, into a gene expression pattern characteristic of RCC status. Screening for candidate therapeutics to determine whether or not.

本発明において、RCC 1〜972はRCCの処置または予防のための治療薬のスクリーニングに有用である。   In the present invention, RCC 1 to 972 are useful for screening therapeutic agents for the treatment or prevention of RCC.

本方法において、細胞を1つまたは複数の被験作用物質に（逐次的にまたは組み合わせて）曝露し、細胞におけるRCC 1〜972の1つまたは複数の発現を測定する。被験集団においてアッセイしたRCC関連遺伝子の発現プロファイルを、被験作用物質に曝露されていない参照細胞集団における同じRCC関連遺伝子の発現レベルと比較する。   In this method, cells are exposed to one or more test agents (sequentially or in combination) and the expression of one or more of RCC 1-972 in the cells is measured. The expression profile of the RCC-related gene assayed in the test population is compared to the expression level of the same RCC-related gene in a reference cell population that has not been exposed to the test agent.

低発現される（under-expressed）遺伝子の発現を刺激し得るか、または過剰発現される遺伝子の発現を抑制し得る作用物質は、臨床的に有益な可能性を有する。このような作用物質はさらに、動物または被験対象においてRCCの発症及び進行を予防する能力に関して試験され得る。   Agents that can stimulate the expression of under-expressed genes or suppress the expression of over-expressed genes have the potential for clinical benefit. Such agents can be further tested for the ability to prevent the onset and progression of RCC in an animal or test subject.

さらなる態様において、本発明は、RCCの処置において有望な標的である候補作用物質をスクリーニングする方法を提供する。以上で詳述したように、マーカー遺伝子の発現レベルまたはそれらの遺伝子産物の活性を制御することにより、RCCの発症および進行を制御することができる。このため、RCCの処置において有望な標的となる候補作用物質を、そのような発現レベルおよびその活性を癌状態または非癌状態の指標として用いるスクリーニング方法によって同定することができる。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
(a) 被験化合物を、RCC 1〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
(b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および
(c) ポリペプチドに結合する被験化合物を選択する段階。 In a further embodiment, the present invention provides a method of screening candidate agents that are promising targets in the treatment of RCC. As detailed above, the onset and progression of RCC can be controlled by controlling the expression level of marker genes or the activity of their gene products. Thus, candidate agents that are promising targets in the treatment of RCC can be identified by screening methods that use such expression levels and their activity as indicators of cancerous or non-cancerous conditions. In the context of the present invention, such screening may include, for example, the following steps:
(a) contacting the test compound with a polypeptide encoded by a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 1-972;
(b) detecting the binding activity between the polypeptide and the test compound; and
(c) selecting a test compound that binds to the polypeptide.

スクリーニングに用いるマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドは、組換えポリペプチドでも天然のタンパク質でもよく、またはそれらの部分ペプチドでもよい。被験化合物と接触させるポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質でありうる。   The polypeptide encoded by the marker gene used for screening may be a recombinant polypeptide, a natural protein, or a partial peptide thereof. The polypeptide to be contacted with the test compound can be, for example, a purified polypeptide, a soluble protein, a form bound to a carrier, or a fusion protein fused to another polypeptide.

例えばマーカー遺伝子にコードされるポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニング法として、当業者に既知の多数の方法を使用することができる。そのようなスクリーニングを、例えば免疫沈降法によって、具体的には以下の様式で実施することができる。マーカー遺伝子は、外来遺伝子のための発現ベクターに遺伝子を挿入することによって、宿主（たとえば動物）細胞等において発現され、その例には、pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGSおよびpCD8が含まれるがこれらに限定されるわけではない。発現のために用いられるプロモーターは、たとえばSV40初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), (1982) Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141）、EF-αプロモーター（Kim et al., (1990) Gene 91: 217-23）、CAG プロモーター（Niwa et al., (1991) Gene 108: 193-9）、RSV LTRプロモーター（Cullen, (1987) Methods in Enzymology 152: 684-704）、SRαプロモーター（Takebe et al., (1988) Mol Cell Biol 8: 466-72）、CMV前初期プロモーター（Seed and Aruffo, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9）、SV40後期プロモーター（Gheysen and Fiers, (1982) J Mol Appl Genet 1 : 385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., (1989)Mol Cell Biol 9: 946-58）、HSV TKプロモーター等が含まれる、一般的に用いることができる任意のプロモーターであってもよい。発現される外来遺伝子の宿主細胞への導入は、たとえば電気穿孔法（Chu et al., (1987) Nucleic Acids Res 15: 1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, (1987) Mol Cell Biol 7: 2745-52）、DEAEデキストラン法（Lopata et al., (1984) Nucleic Acids Res 12: 5707-17；Sussman and Milman, (1984) Mol Cell Biol 4: 1641-3）、リポフェクション法（Derijard B, (1994) Cell 76: 1025-37；Lamb et al., (1993) Nature Genetics 5: 22-30；Rabindran et al., (1993) Science 259: 230-4）等の任意の方法に従って行うことができる。マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかにされているモノクローナル抗体のエピトープを該ポリペプチドのN末端またはC末端に導入することによって、該モノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を含む融合タンパク質として発現されうる。市販のエピトープ-抗体系を用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。マルチクローニングサイトを利用して、例えばβ-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などとの融合タンパク質を発現可能なベクターが市販されている。   For example, many methods known to those skilled in the art can be used as a screening method for a protein that binds to a polypeptide encoded by a marker gene. Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation, specifically in the following manner. Marker genes are expressed in host (eg animal) cells etc. by inserting the gene into an expression vector for a foreign gene, examples of which include pSV2neo, pcDNA I, pcDNA3.1, pCAGGS and pCD8 Is not limited to these. Promoters used for expression include, for example, the SV40 early promoter (Rigby in Williamson (ed.), (1982) Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141), the EF-α promoter (Kim et al ., (1990) Gene 91: 217-23), CAG promoter (Niwa et al., (1991) Gene 108: 193-9), RSV LTR promoter (Cullen, (1987) Methods in Enzymology 152: 684-704) SRα promoter (Takebe et al., (1988) Mol Cell Biol 8: 466-72), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9), SV40 late promoter ( Gheysen and Fiers, (1982) J Mol Appl Genet 1: 385-94), adenovirus late promoter (Kaufman et al., (1989) Mol Cell Biol 9: 946-58), HSV TK promoter, etc. Any promoter that can be used automatically may be used. For example, electroporation (Chu et al., (1987) Nucleic Acids Res 15: 1311-26), calcium phosphate method (Chen and Okayama, (1987) Mol Cell Biol 7 : 2745-52), DEAE dextran method (Lopata et al., (1984) Nucleic Acids Res 12: 5707-17; Sussman and Milman, (1984) Mol Cell Biol 4: 1641-3), lipofection method (Derijard B, (1994) Cell 76: 1025-37; Lamb et al., (1993) Nature Genetics 5: 22-30; Rabindran et al., (1993) Science 259: 230-4) it can. The polypeptide encoded by the marker gene contains a recognition site (epitope) of the monoclonal antibody by introducing an epitope of the monoclonal antibody whose specificity has been clarified into the N-terminus or C-terminus of the polypeptide. It can be expressed as a fusion protein. A commercially available epitope-antibody system can be used (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). Vectors that can express a fusion protein with, for example, β-galactosidase, maltose binding protein, glutathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP) and the like using a multicloning site are commercially available.

融合によってポリペプチドの特性を変化させないように、数個から1ダースのアミノ酸からなる小型エピトープだけを導入することによって調製された融合タンパク質も、本明細書において意図されている。ポリヒスチジン（Hisタグ）、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7遺伝子10タンパク質（T7タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSVタグ）、Eタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープ、およびそれらを認識するモノクローナル抗体を、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドと結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ-抗体系として用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。   Also contemplated herein are fusion proteins prepared by introducing only small epitopes consisting of a few to a dozen amino acids so that the properties of the polypeptide are not altered by the fusion. Polyhistidine (His tag), influenza agglutinin HA, human c-myc, FLAG, vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-GP), T7 gene 10 protein (T7 tag), human herpes simplex virus glycoprotein (HSV tag) , Epitopes such as E-tags (epitopes on monoclonal phage), and monoclonal antibodies that recognize them can be used as epitope-antibody systems for screening proteins that bind to the polypeptide encoded by the marker gene ( Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).

免疫沈降においては、適切な界面活性剤を用いて調製した細胞可溶化物にこれらの抗体を添加することにより、免疫複合体を形成させる。免疫複合体は、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチド、ポリペプチドとの結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記のエピトープに対する抗体に加えて、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドに対する抗体を用いて免疫沈降を行うこともでき、これらの抗体は任意で上記のように調製される。   In immunoprecipitation, an immune complex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant. The immune complex consists of a polypeptide encoded by a marker gene, a polypeptide capable of binding to the polypeptide, and an antibody. In addition to antibodies against the above epitopes, immunoprecipitation can also be performed using antibodies against the polypeptide encoded by the marker gene, and these antibodies are optionally prepared as described above.

例えば、抗体がマウスのIgG抗体の場合は、プロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースによって、免疫複合体を沈殿させることができる。マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドを、GSTなどのエピトープとの融合タンパク質として調製するならば、これらのエピトープに特異的に結合する物質（グルタチオン-セファロース4Bなど）を用いて、ポリペプチドに対する抗体の使用と同じ様式で免疫複合体を形成させることができる。   For example, if the antibody is a mouse IgG antibody, the immune complex can be precipitated with protein A sepharose or protein G sepharose. If the polypeptide encoded by the marker gene is prepared as a fusion protein with an epitope such as GST, a substance that specifically binds to these epitopes (such as glutathione-sepharose 4B) is used to produce an antibody against the polypeptide. Immune complexes can be formed in the same manner as used.

免疫沈降は、例えば、文献中に記載された方法に倣ってまたは従って行うことができる（Harlow and Lane, (1988) Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York）。   Immunoprecipitation can be performed, for example, following or following methods described in the literature (Harlow and Lane, (1988) Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York).

SDS-PAGEは一般的に、免疫沈降タンパク質の解析に使用されており、結合状態のタンパク質を、適切な濃度のゲルを用いて、タンパク質の分子量によって解析することができる。マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドと結合したタンパク質をクーマシー染色または銀染色などの一般的な染色法によって検出することは困難であるため、タンパク質に関する検出感度は、放射性同位体である35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培地中で細胞を培養し、細胞内のタンパク質を標識して、その後タンパク質を検出することによって、改善することができる。タンパク質の分子量が明らかであれば、標的タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製することが可能であり、その配列を決定することができる。 SDS-PAGE is generally used for analysis of immunoprecipitated proteins, and bound proteins can be analyzed by the molecular weight of the protein using an appropriate concentration of gel. Since it is difficult to detect proteins bound to the polypeptide encoded by the marker gene by common staining methods such as Coomassie staining or silver staining, the detection sensitivity for proteins is the radioisotope 35 S-methionine. Alternatively, it can be improved by culturing the cells in a medium containing 35 S-cysteine, labeling the protein in the cell, and then detecting the protein. If the molecular weight of the protein is clear, the target protein can be purified directly from an SDS-polyacrylamide gel and its sequence can be determined.

マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドと結合するタンパク質のスクリーニングのための方法として、例えば、ウエスト-ウエスタンブロット分析（Skolnik et al., (1991) Cell 65: 83-90）を用いることができる。具体的には、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドに結合するタンパク質は、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが予想される細胞、組織、器官（例えば精巣および卵巣などの組織）、または培養細胞（例えばCaki-1、Caki-2、786-O、A704、OS-RC-2、TUHR14TKB、およびA498）に由来するcDNAライブラリーをファージベクター（例えばZAP）を用いて調製し、タンパク質をLBアガロース上で発現させ、発現したタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識されたポリペプチドを上記フィルターと反応させ、該マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを、標識に従って検出することによって、得ることができる。マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することにより、または、該マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体、もしくは該マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドと融合したペプチドやポリペプチド（例えば、GST）を利用することにより、標識されうる。放射性同位元素または蛍光などを用いる方法を使用することもできる。   As a method for screening a protein that binds to a polypeptide encoded by a marker gene, for example, West-Western blot analysis (Skolnik et al., (1991) Cell 65: 83-90) can be used. Specifically, the protein that binds to the polypeptide encoded by the marker gene is a cell, tissue, organ (eg, testis and ovary) that is expected to express the protein that binds to the polypeptide encoded by the marker gene. A cDNA library derived from cultured cells (eg, Caki-1, Caki-2, 786-O, A704, OS-RC-2, TUHR14TKB, and A498) using a phage vector (eg, ZAP) Prepare and express the protein on LB agarose, immobilize the expressed protein on the filter, react the purified and labeled polypeptide with the filter, and bind the protein bound to the polypeptide encoded by the marker gene Expressing plaques can be obtained by detecting according to the label. The polypeptide encoded by the marker gene is an antibody that specifically binds to the polypeptide encoded by the marker gene by utilizing the binding between biotin and avidin, or the polypeptide encoded by the marker gene. It can be labeled by using a peptide or polypeptide (eg, GST) fused with the peptide. A method using a radioisotope or fluorescence can also be used.

または、本発明のスクリーニング法の別の態様において、細胞を利用する2-ハイブリッド系を用いることもできる（「MATCHMAKER 2-ハイブリッド系」「哺乳動物MATCHMAKER 2-ハイブリッドアッセイキット」「MATCHMAKER 1-ハイブリッド系」（Clontech）；「HybriZAP 2-ハイブリッドベクター系」（Stratagene）；参考文献 “Dalton and Treisman, (1992) Cell 68: 597-612.", “Fields and Sternglanz, (1994) Trends Genet 10: 286-92."）。   Alternatively, in another embodiment of the screening method of the present invention, a two-hybrid system using cells can be used (“MATCHMAKER 2-hybrid system”, “Mammal MATCHMAKER 2-hybrid assay kit”, “MATCHMAKER 1-hybrid system”). (Clontech); "HybriZAP 2-hybrid vector system" (Stratagene); References "Dalton and Treisman, (1992) Cell 68: 597-612.", "Fields and Sternglanz, (1994) Trends Genet 10: 286- 92. ").

2-ハイブリッド系では、本発明のポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて、酵母細胞で発現させる。ライブラリーが発現した場合にVP16またはGAL4転写活性化領域と融合されるように、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現すると予想される細胞から、cDNAライブラリーを調製する。続いてcDNAライブラリーを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリーに由来するcDNAを単離する（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を酵母細胞で発現させる場合には、この2つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出されるようになる）。cDNAにコードされるタンパク質は、上記のように単離されたcDNAを大腸菌（E. coli）に導入し、該タンパク質を発現させることで調製できる。   In the two-hybrid system, the polypeptide of the present invention is fused to the SRF-binding region or GAL4-binding region and expressed in yeast cells. A cDNA library is prepared from cells that are expected to express a protein that binds to a polypeptide of the invention so that it is fused to the VP16 or GAL4 transcriptional activation region when the library is expressed. Subsequently, the cDNA library is introduced into the above yeast cell, and the cDNA derived from the library is isolated from the detected positive clone (when the protein that binds to the polypeptide of the present invention is expressed in the yeast cell, The combination of these two activates the reporter gene and allows positive clones to be detected). A protein encoded by cDNA can be prepared by introducing the cDNA isolated as described above into E. coli and expressing the protein.

レポーター遺伝子の例としては、これらに限定されるわけではないが、HIS3遺伝子のほかに、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。   Examples of reporter genes include, but are not limited to, Ade2 gene, lacZ gene, CAT gene, luciferase gene, etc. in addition to HIS3 gene.

また、マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化してもよく、その後、該マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合できるタンパク質を含む被験化合物をカラムに対して適用する。本明細書における被験化合物には例えば、細胞抽出物や細胞溶解物などがある。被験化合物をロードした後にカラムを洗浄し、ポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。   In addition, a compound that binds to a polypeptide encoded by a marker gene can be screened using affinity chromatography. For example, a polypeptide encoded by a marker gene may be immobilized on a carrier of an affinity column, and then a test compound containing a protein that can bind to the polypeptide encoded by the marker gene is applied to the column. Examples of the test compound in the present specification include a cell extract and a cell lysate. After loading the test compound, the column can be washed to prepare a compound bound to the polypeptide.

被験化合物がタンパク質の場合は、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、この配列を元にオリゴDNAを合成し、オリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリーをスクリーニングして、該タンパク質をコードするDNAを得る。   When the test compound is a protein, the amino acid sequence of the obtained protein is analyzed, an oligo DNA is synthesized based on this sequence, a cDNA library is screened using the oligo DNA as a probe, and the protein is encoded. Get DNA.

表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサーを、本発明における結合状態の化合物を検出または定量する手段として使用することができる。このようなバイオセンサーを用いると、標識を行うことなく、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、本発明のポリペプチドと被験化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、BIAcore、ファルマシア）。このため、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いて、マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドと被験化合物との結合を評価することが可能である。   A biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or quantifying the bound compound in the present invention. When such a biosensor is used, the interaction between the polypeptide of the present invention and the test compound can be observed in real time as a surface plasmon resonance signal using only a very small amount of polypeptide without labeling. (For example, BIAcore, Pharmacia). Therefore, it is possible to evaluate the binding between the polypeptide encoded by the marker gene and the test compound using a biosensor such as BIAcore.

マーカー遺伝子によってコードされる固定されたポリペプチドを、合成化学化合物、または天然物バンクもしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、およびタンパク質のみならず、タンパク質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）に結合する化学化合物を単離するために、コンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを用いるスクリーニング法（Wrighton et al., (1996) Science 273: 458-64; Verdine, (1996) Nature 384: 11-13）は、当業者に周知である。   Methods for screening molecules that bind when an immobilized polypeptide encoded by a marker gene is exposed to synthetic chemical compounds, or natural product banks or random phage peptide display libraries, and proteins as well as proteins (agonists and High-throughput screening methods based on combinatorial chemistry techniques to isolate chemical compounds that bind to antagonists (including antagonists) (Wrighton et al., (1996) Science 273: 458-64; Verdine, (1996) Nature 384 : 11-13) is well known to those skilled in the art.

または、本発明は、以下の段階を含む、マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いてRCCを処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する：
(a) 被験化合物を、RCC 1〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
(b) 段階（a）のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
(c) RCC 1〜251からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を、被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して抑制する化合物、または、RCC 252〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を、被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して高める化合物を選択する段階。 Alternatively, the present invention provides a method of screening a compound for treating or preventing RCC using a polypeptide encoded by a marker gene comprising the following steps:
(a) contacting the test compound with a polypeptide encoded by a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 1-972;
(b) detecting the biological activity of the polypeptide of step (a); and
(c) a compound that inhibits the biological activity of a polypeptide encoded by a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 1-251 as compared to the biological activity detected in the absence of the test compound, or RCC Selecting a compound that enhances the biological activity of a polypeptide encoded by a polynucleotide selected from the group consisting of 252-972 as compared to the biological activity detected in the absence of the test compound.

本発明のスクリーニング法に用いるためのポリペプチドは、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列を用いて組換えタンパク質として得ることができる。マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を保持する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。マーカー遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質に関する情報に基づいて、当業者は、該ポリペプチドの任意の生物活性をスクリーニングのための指標として選択でき、選択した生物活性を分析するために任意の適切な測定法を選択することができる。   A polypeptide for use in the screening method of the present invention can be obtained as a recombinant protein using the nucleotide sequence of a marker gene. Any polypeptide can be used for screening as long as it retains the biological activity of the polypeptide encoded by the marker gene. Based on information about the marker gene and the protein encoded thereby, one of skill in the art can select any biological activity of the polypeptide as an indicator for screening, and any suitable for analyzing the selected biological activity. A measurement method can be selected.

本スクリーニング法によって単離される化合物は、マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を活性化する分子を意味する。同様に、「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を意味する。さらに、本スクリーニング法によって単離される化合物は、マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドと分子（DNAおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用の阻害物質または刺激物質の候補である。   The compound isolated by this screening method is a candidate agonist or antagonist of the polypeptide encoded by the marker gene. The term “agonist” refers to a molecule that activates its function by binding to a polypeptide. Similarly, the term “antagonist” means a molecule that inhibits its function by binding to a polypeptide. Furthermore, the compounds isolated by this screening method are candidates for inhibitors or stimulators of in vivo interactions between the polypeptide encoded by the marker gene and molecules (including DNA and proteins).

本方法において検出されるべき生物活性が細胞増殖である場合には、実施例に記載したように、例えば、マーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を調製し、細胞を被験化合物の存在下で培養して、細胞増殖の速度を決定し、細胞周期などを測定することにより、さらにはコロニー形成活性を測定することにより、検出することができる。   If the biological activity to be detected in this method is cell proliferation, as described in the Examples, for example, a cell expressing a polypeptide encoded by a marker gene is prepared, and the cell is present in the presence of the test compound. It can be detected by culturing the cells under reduced pressure, determining the rate of cell growth, measuring the cell cycle, etc., and further measuring the colony forming activity.

さらなる態様において、本発明は、RCCの処置または予防のための化合物のスクリーニング法を提供する。先に詳細に考察したように、マーカー遺伝子の発現レベルを制御することによって、RCCの発症および進行を制御することができる。このため、RCCの処置または予防に用いられうる化合物を、マーカー遺伝子の発現レベルを指標として用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
(a) 候補化合物を1つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞と接触させる段階であって、該1つまたは複数のマーカー遺伝子がRCC 1〜972からなる群より選択される段階；および
(b) RCC 1〜251からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させる候補化合物、またはRCC 252〜972からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる候補化合物を選択する段階。 In a further aspect, the present invention provides a method for screening compounds for the treatment or prevention of RCC. As discussed in detail above, the onset and progression of RCC can be controlled by controlling the expression level of the marker gene. Therefore, a compound that can be used for the treatment or prevention of RCC can be identified by screening using the expression level of the marker gene as an index. In the context of the present invention, such screening may include, for example, the following steps:
(a) contacting a candidate compound with a cell expressing one or more marker genes, wherein the one or more marker genes are selected from the group consisting of RCC 1-972; and
(b) a candidate compound that decreases the expression level of one or more marker genes selected from the group consisting of RCC 1-251, or one or more marker genes selected from the group consisting of RCC 252-972 Selecting candidate compounds that increase expression levels.

マーカー遺伝子を発現する細胞には、たとえばRCCから確立された細胞株が含まれ；そのような細胞は本発明の上記のスクリーニングのために用いることができる（たとえば、Caki-1、Caki-2、786-O、A704、OS-RC-2、TUHRl4TKBおよびA498）。発現レベルは、当業者に周知の方法によって推定することができる。スクリーニング法において、一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低減または増強する化合物は、RCCの処置または予防において用いるための候補作用物質である。   Cells that express the marker gene include, for example, cell lines established from RCC; such cells can be used for the above screening of the present invention (eg, Caki-1, Caki-2, 786-O, A704, OS-RC-2, TUHRl4TKB and A498). The expression level can be estimated by methods well known to those skilled in the art. A compound that reduces or enhances the expression level of one or more marker genes in a screening method is a candidate agent for use in the treatment or prevention of RCC.

または、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含み得る：
(a) RCC 1〜972からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と候補化合物を接触させる段階；
(b) 該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
(c) 被験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、該マーカー遺伝子がRCC 1〜251からなる群より選択されるアップレギュレートされたマーカー遺伝子である場合には該レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる候補化合物を、または、該マーカー遺伝子がRCC 252〜972からなる群より選択されるダウンレギュレートされたマーカー遺伝子である場合には該レポーター遺伝子の発現レベルを高める化合物を、選択する段階。 Alternatively, the screening method of the present invention may comprise the following steps:
(a) Cells and candidates into which a vector containing a transcriptional regulatory region of one or more marker genes selected from the group consisting of RCC 1 to 972 and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region is introduced Contacting the compound;
(b) measuring the expression or activity of the reporter gene; and
(c) when the marker gene is an up-regulated marker gene selected from the group consisting of RCC 1-251 compared to the level detected in the absence of the test compound, the reporter gene A candidate compound that decreases the level of expression or activity, or a compound that increases the expression level of the reporter gene when the marker gene is a down-regulated marker gene selected from the group consisting of RCC 252-272 The stage of selecting.

適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。本発明のスクリーニング法に適したレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写調節領域を用いることによって調製されうる。マーカー遺伝子の転写調節領域が当業者に既知の場合は、以前の配列情報を用いることによって、レポーター構築物を調製できる。マーカー遺伝子の転写調節領域がまだ同定されていない場合、該マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいて、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントをゲノムライブラリから単離することができる。   Suitable reporter genes and host cells are well known in the art. A reporter construct suitable for the screening method of the present invention can be prepared by using a transcriptional regulatory region of a marker gene. If the transcriptional regulatory region of the marker gene is known to those skilled in the art, reporter constructs can be prepared by using previous sequence information. If the transcriptional regulatory region of the marker gene has not yet been identified, a nucleotide segment containing the transcriptional regulatory region can be isolated from the genomic library based on the nucleotide sequence information of the marker gene.

タンパク質を結合させるために用いうる支持体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖類、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれる；上記の材料から作製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）を用いることが好ましい。ビーズを使用する場合は、ビーズをカラムに詰めてもよい。   Examples of supports that can be used to bind proteins include insoluble polysaccharides such as agarose, cellulose, and dextran, and synthetic resins such as polyacrylamide, polystyrene, and silicone; made from the materials described above It is preferable to use commercially available beads and plates (for example, multiwell plates, biosensor chips, etc.). If beads are used, the beads may be packed into a column.

タンパク質の支持体への結合は、化学結合や物理吸着などの常用の方法によって実施することができる。または、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して、タンパク質を支持体に結合させてもよい。さらに、アビジンおよびビオチンを利用して、タンパク質を支持体に結合させることもできる。   The protein can be bound to the support by a conventional method such as chemical bonding or physical adsorption. Alternatively, the protein may be bound to the support through an antibody that specifically recognizes the protein. In addition, avidin and biotin can be used to bind the protein to the support.

タンパク質間の結合は緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液の例にはリン酸緩衝液及びTris緩衝液が含まれるがこれらに限定されるわけではない。しかしながら、タンパク質間の結合を阻害しない任意の緩衝液が適切である。   Binding between proteins is preferably performed in a buffer solution, and examples of the buffer solution include, but are not limited to, a phosphate buffer solution and a Tris buffer solution. However, any buffer that does not inhibit binding between proteins is suitable.

本発明において、表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサーを、結合したタンパク質の検出または定量のための手段として用いることができる。このようなバイオセンサーを用いると、標識を行うことなく、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、タンパク質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、BIAcore、Pharmacia）。   In the present invention, a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or quantifying the bound protein. Using such a biosensor, it is possible to observe the interaction between proteins in real time as a surface plasmon resonance signal using only a very small amount of polypeptide without labeling (for example, BIAcore, Pharmacia). .

または、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドを標識してもよく、結合したタンパク質の標識を用いて、結合したタンパク質の検出または測定を行うことができる。具体的には、タンパク質の一方をあらかじめ標識した後に、標識したタンパク質を被験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、洗浄後、結合したタンパク質を標識によって検出または測定する。   Alternatively, the polypeptide encoded by the marker gene may be labeled, and the bound protein can be detected or measured using the bound protein label. Specifically, after labeling one of the proteins in advance, the labeled protein is brought into contact with the other protein in the presence of the test compound, and after washing, the bound protein is detected or measured with the label.

本方法におけるタンパク質の標識のために、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびβ-グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン）、およびビオチン/アビジンなどの標識物質を用いることができる。タンパク質を放射性同位体で標識する場合には、検出または測定を液体シンチレーションによって行うことができる。または、酵素で標識したタンパク質は、呈色などの基質の酵素的変化を検出するために酵素基質を添加して、吸光光度計で検出または測定することもできる。さらに、標識として蛍光物質を使用する場合は、結合状態のタンパク質を蛍光光度計を用いて検出または測定することができる。 For labeling proteins in this method, radioisotopes (eg 3 H, 14 C, 32 P, 33 P, 35 S, 125 I, 131 I), enzymes (eg alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β -Galactosidase and β-glucosidase), fluorescent substances (eg fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine), and labeling substances such as biotin / avidin can be used. When a protein is labeled with a radioisotope, detection or measurement can be performed by liquid scintillation. Alternatively, a protein labeled with an enzyme can be detected or measured with an absorptiometer by adding an enzyme substrate in order to detect an enzymatic change of the substrate such as coloration. Furthermore, when a fluorescent substance is used as a label, the bound protein can be detected or measured using a fluorometer.

本スクリーニング法の文脈において抗体を使用する場合、上述の標識物質の1つを用いて抗体を標識し、該標識物質に基づいて検出または測定することが好ましい。または、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドまたはアクチンに対する抗体を、標識物質で標識した二次抗体によって検出されるべき一次抗体として用いてもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質と結合した抗体は、プロテインGカラムまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定することもできる。   When using an antibody in the context of this screening method, it is preferable to label the antibody with one of the labeling substances described above and detect or measure based on the labeling substance. Alternatively, a polypeptide encoded by a marker gene or an antibody against actin may be used as a primary antibody to be detected by a secondary antibody labeled with a labeling substance. Furthermore, the antibody bound to the protein in the screening of the present invention can be detected or measured using a protein G column or protein A column.

任意の被験化合物（例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質もしくは未精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物、および天然化合物）を、本発明のスクリーニング法に使用することができる。本発明の文脈において、被験化合物は、（1）生物学的ライブラリー、（2）空間的に位置指定可能な（spatially addressable）平行固相もしくは液相ライブラリー、（3）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、（4）「1ビーズ-1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、および（5）アフィニティークロマトグラフィー選択を利用した合成ライブラリー法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の4種類のアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または小分子ライブラリーに適用可能である（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリーの合成法の例は当技術分野において見出すことができる(DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233-51)。化合物のライブラリーは、溶液中に（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照されたい）、またはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、および同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Deｖｌin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号）に提示されうる。   Any test compound (e.g., cell extract, cell culture supernatant, fermented microbial product, marine organism extract, plant extract, purified or unpurified protein, peptide, non-peptide compound, synthetic micromolecular compound, and Natural compounds) can be used in the screening methods of the present invention. In the context of the present invention, test compounds require (1) biological libraries, (2) spatially addressable parallel solid phase or liquid phase libraries, and (3) deconvolution integration. And (4) a “one-bead one-compound” library method, and (5) a synthetic library method utilizing affinity chromatography selection. Can be obtained using any of a number of approaches in the known combinatorial library method. Biological library methods using affinity chromatography selection are limited to peptide libraries, but the other four approaches are applicable to peptide libraries of compounds, non-peptide oligomer libraries, or small molecule libraries (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67). Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. 1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51). Compound libraries can be in solution (see Houghten (1992) Bio / Techniques 13: 412-21), or beads (Lam (1991) Nature 354: 82-4), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-6), bacteria (US Pat. No. 5,223,409), spores (US Pat. Nos. 5,571,698, 5,403,484, and 5,223,409), plasmids (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 1865-9), or phage (Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; US Patent Application No. 2002103360).

本発明のスクリーニング法によって単離された化合物は、それに起因する疾患、例えば、RCCなどの細胞増殖性疾患の処置または予防を目的として、マーカー遺伝子にコードされるポリペプチドの活性を阻害または刺激する薬剤開発のための候補である。本発明のスクリーニング法によって得られる化合物の構造の一部が付加、欠失および/または置換によって変換された化合物は、本発明のスクリーニング法によって得られる化合物として含まれる。   The compound isolated by the screening method of the present invention inhibits or stimulates the activity of the polypeptide encoded by the marker gene for the purpose of treating or preventing a disease caused thereby, for example, a cell proliferative disease such as RCC. Candidate for drug development. A compound obtained by converting a part of the structure of the compound obtained by the screening method of the present invention by addition, deletion and / or substitution is included as a compound obtained by the screening method of the present invention.

RCCを処置または予防するための薬学的組成物：
本発明は、本発明の上述のスクリーニング法によって選択される任意の化合物を含む、腎細胞癌の処置または予防のための組成物を提供する。 Pharmaceutical compositions for treating or preventing RCC:
The present invention provides a composition for the treatment or prevention of renal cell carcinoma comprising any compound selected by the above-described screening method of the present invention.

本発明の方法によって単離された化合物をヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーのような他の哺乳類のための薬剤として投与する場合、単離された化合物を直接投与してもよく、または既知の薬学的調製法を用いて投与剤形に調製してもよい。例えば、必要に応じて、薬物を、糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口摂取するか、または水もしくは任意の他の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液の注射剤形で非経口摂取することができる。例えば、化合物を、薬学的に許容される担体または媒体と共に、具体的には滅菌水、生理食塩液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香料、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤などと共に、一般的に許容される投薬実施に必要な単位投与剤形で混合することができる。このような調製物に含まれる活性成分の量によって、指示範囲内の適した用量を得ることができる。   Administration of compounds isolated by the methods of the invention as drugs for humans and other mammals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, monkeys, baboons, and chimpanzees If so, the isolated compound may be administered directly, or may be prepared in a dosage form using known pharmaceutical preparation methods. For example, if desired, the drug is taken orally as sugar-coated tablets, capsules, elixirs, and microcapsules, or in a sterile solution or suspension with water or any other pharmaceutically acceptable liquid It can be taken parenterally in injectable form. For example, the compound together with a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle, specifically sterile water, saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavor, excipient, It can be mixed with vehicles, preservatives, binders and the like in the unit dosage forms necessary for generally acceptable dosing. Depending on the amount of active ingredient contained in such preparations, a suitable dose within the indicated range can be obtained.

錠剤およびカプセル剤に混合することができる添加剤の例には、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような結合剤；結晶セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチンおよびアルギン酸のような膨張剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料；ならびにペパーミント、アカモノ油、およびチェリーのような着香料が含まれるがそれらに限定されない。単位投与剤形がカプセル剤である場合、油などの液体担体が上記の成分にさらに含まれ得る。注射用滅菌組成物は、注射に適した蒸留水などのビヒクルを用いる通常の薬物の実施に従って製剤化することができる。   Examples of additives that can be mixed into tablets and capsules include binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth, and gum arabic; excipients such as crystalline cellulose; swelling such as corn starch, gelatin and alginic acid Agents; lubricants such as magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, or saccharin; and flavorings such as peppermint, red mono oil, and cherry. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oil can be further included in the above ingredients. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional drug practice using vehicles such as distilled water suitable for injection.

生理食塩水、グルコース、ならびに、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウム等のアジュバントを含むその他の等張液を、注射用の水溶液として用いることができる。これらは、例えば、エタノールのようなアルコール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような多価アルコール；ならびにポリソルベート80(商標)およびHCO-50のような非イオン性界面活性剤などの、適切な溶解剤と共に用いることができる。   Saline, glucose, and other isotonic solutions containing adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride can be used as an aqueous solution for injection. These include, for example, suitable solubilizers such as alcohols such as ethanol; polyhydric alcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; and nonionic surfactants such as polysorbate 80 ™ and HCO-50. Can be used.

ゴマ油または大豆油は、油脂性液体として用いることができ、溶解剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと共に用いてもよく、かつ、リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液のような緩衝液；塩酸プロカインのような鎮痛剤；ベンジルアルコールおよびフェノールのような安定化剤、ならびに/または抗酸化剤と共に製剤化してもよい。調製された注射剤を適切なアンプルに充填してもよい。   Sesame oil or soybean oil can be used as an oleaginous liquid, may be used with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizer, and buffers such as phosphate buffer and sodium acetate buffer; procaine hydrochloride May be formulated with analgesics such as: stabilizers such as benzyl alcohol and phenol, and / or antioxidants. The prepared injection may be filled into a suitable ampoule.

当業者に周知の方法を用いて、本発明の薬学的組成物を、例えば動脈内、静脈内、もしくは経皮注射として、または、鼻腔内、筋肉内、もしくは経口投与として患者に投与することができる。投与の用量および方法は、患者の体重および年齢ならびに投与法に応じて変動するが、当業者は、適切な投与法を日常的に選択することができる。化合物がDNAにコードされ得る場合、DNAを遺伝子治療用ベクターに挿入し、次に、治療を行うためにベクターを患者に投与することができる。投与の用量および方法は、患者の体重、年齢、および症状に応じて変動するが、当業者はそれらを適切に選択することができる。   Using methods well known to those skilled in the art, the pharmaceutical compositions of the invention may be administered to a patient, for example, as intraarterial, intravenous, or transdermal injection, or as intranasal, intramuscular, or oral administration. it can. The dosage and method of administration will vary depending on the weight and age of the patient and the method of administration, but one skilled in the art can routinely select an appropriate method of administration. If the compound can be encoded in DNA, the DNA can be inserted into a gene therapy vector and the vector can then be administered to a patient for treatment. The dosage and method of administration will vary depending on the patient's weight, age, and symptoms, but those skilled in the art can appropriately select them.

例えば、本発明のタンパク質に結合してその活性を調節する化合物の用量は、症状に依存するが、一般的に、正常な成人（体重60 kg）に経口投与する場合、1日あたり約0.1 mg〜約100 mg、好ましくは1日あたり約1.0 mg〜約50 mg、より好ましくは1日あたり約1.0 mg〜約20 mgである。   For example, the dose of a compound that binds to a protein of the invention and modulates its activity depends on the symptoms, but is generally about 0.1 mg per day when administered orally to a normal adult (60 kg body weight). To about 100 mg, preferably about 1.0 mg to about 50 mg per day, more preferably about 1.0 mg to about 20 mg per day.

正常な成人（体重60 kg）に注射剤形で化合物を非経口投与する場合、患者、標的臓器、症状および投与法によって多少の差があるが、1日あたり約0.01 mg〜約30 mg、好ましくは1日あたり約0.1〜約20 mg、およびより好ましくは1日あたり約0.1〜約10 mgの用量を静脈内注射することが都合がよい。他の動物の場合にも、適切な投与量は、体重60 kgに変換して日常的に算出され得る。   When administering the compound parenterally to normal adults (body weight 60 kg) in an injection form, there are some differences depending on the patient, target organ, symptoms and administration method, but about 0.01 mg to about 30 mg per day, preferably Is conveniently injected intravenously at a dose of about 0.1 to about 20 mg per day, and more preferably about 0.1 to about 10 mg per day. For other animals, an appropriate dosage can be calculated routinely by converting to a body weight of 60 kg.

腎細胞癌を有する対象の予後評価：
本発明はまた、RCCを有する対象の予後を評価する方法も提供し、該方法は、被験細胞集団における一つまたは複数のRCC関連遺伝子の発現を、全疾患病期にわたる患者から得られた参照細胞集団における同じRCC関連遺伝子の発現と比較する段階を含む。被験細胞集団と参照細胞集団における一つもしくは複数のRCC関連遺伝子の遺伝子発現を比較することによって、または対象に由来する被験細胞集団における経時的な遺伝子発現パターンを比較することによって、対象の予後を評価することができる。 Prognostic assessment of subjects with renal cell carcinoma:
The present invention also provides a method for assessing the prognosis of a subject with RCC, wherein the method obtains expression of one or more RCC-related genes in a test cell population from patients across all disease stages. Comparing to the expression of the same RCC-related gene in the cell population. By comparing the gene expression of one or more RCC-related genes in the test cell population and the reference cell population, or by comparing the gene expression pattern over time in the test cell population derived from the subject, the prognosis of the subject Can be evaluated.

例えば、RCC 252〜972などのダウンレギュレートされるRCC関連遺伝子の一つもしくは複数の発現が正常対照と比較して減少すること、またはRCC 1〜251などのアップレギュレートされるRCC関連遺伝子のうち一つもしくは複数の発現が正常対照と比較して増大することは、予後がそれほど好ましくないことを意味する。反対に、RCC関連遺伝子(例えばRCC 1〜972)のうちの一つまたは複数の発現が正常対照と類似していることは、対象の予後が比較的好ましいことを意味する。好ましくは、被験者の予後は、RCC 1〜972の発現プロファイルを比較することによって評価することができる。   For example, the expression of one or more of the down-regulated RCC-related genes such as RCC 252 to 972 is reduced compared to normal controls, or the up-regulated RCC-related genes such as RCC 1-251 Increased expression of one or more compared to normal controls means less prognosis. Conversely, the expression of one or more of the RCC-related genes (eg, RCC 1-972) being similar to the normal control means that the subject's prognosis is relatively favorable. Preferably, the prognosis of a subject can be assessed by comparing the expression profiles of RCC 1-972.

キット：
本発明はまた、RCC検出用試薬、例えば、1つもしくは複数のRCC核酸と特異的に結合するかそれらを識別する核酸（RCC核酸の一部に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列など）、または、RCC核酸によってコードされるタンパク質と結合する抗体も含む。検出用試薬は、キットの形態で共に包装され得る。例えば、検出用試薬、例えば核酸または抗体(固体マトリクスに結合されるか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬とは個別に包装される)、対照試薬(陽性および/または陰性)、および/または検出可能な標識は、個別の容器に包装され得る。アッセイを行うための説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROMなど)もまた、キットに含まれ得る。キットのアッセイ形式は、当技術分野においていずれも既知であるノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAであってもよい。 kit:
The present invention also provides an RCC detection reagent, such as a nucleic acid that specifically binds to or distinguishes one or more RCC nucleic acids (such as an oligonucleotide sequence complementary to a portion of the RCC nucleic acid), or Also included are antibodies that bind to the protein encoded by the RCC nucleic acid. The detection reagents can be packaged together in the form of a kit. For example, detection reagents such as nucleic acids or antibodies (bound to a solid matrix or packaged separately from reagents for binding them to the matrix), control reagents (positive and / or negative), and / or Alternatively, the detectable label can be packaged in a separate container. Instructions (eg, written, tape, VCR, CD-ROM, etc.) for performing the assay may also be included in the kit. The assay format of the kit may be a Northern hybridization or a sandwich ELISA, all known in the art.

例えば、少なくとも1つのRCC検出部位を形成するために、RCC検出用試薬を多孔性ストリップなどの固体マトリクス上に固定化できる。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが1つの核酸を含む複数の部位を含んでもよい。検査ストリップは、陰性対照および/または陽性対照に対する部位を含む場合もある。または、対照部位を検査ストリップとは別のストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位が異なる量の固定化核酸を含んでもよく、すなわち、第1の検出部位ではより多い量で、以後の部位ではより少ない量で含んでもよい。被験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するRCC量の定量的指標が得られる。検出部位は、任意の適した検出可能な形態として構成されうり、典型的には検査ストリップの幅全体にわたる棒状またはドット状の形態である。   For example, an RCC detection reagent can be immobilized on a solid matrix such as a porous strip to form at least one RCC detection site. The measurement region or detection region of the porous strip may include a plurality of sites each containing one nucleic acid. The test strip may include sites for negative and / or positive controls. Alternatively, the control site may be located on a separate strip from the test strip. Optionally, different detection sites may contain different amounts of immobilized nucleic acid, ie, a greater amount at the first detection site and a lesser amount at subsequent sites. When a test sample is added, the number of sites presenting a detectable signal provides a quantitative indicator of the amount of RCC present in the sample. The detection site may be configured as any suitable detectable form, typically in the form of a rod or dot that spans the entire width of the test strip.

または、キットは、一つまたは複数の核酸の核酸基質アレイを含みうる。アレイ上の核酸は、RCC 1〜972で表される1つまたは複数の核酸配列を特異的に識別する。RCC 1〜972で表される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40もしくは50種またはそれ以上の発現を、アレイ検査ストリップまたはチップに対する結合レベルによって同定する。基板アレイは、例えば固体基板上、例えば参照として本明細書にその内容全体が組み入れられる米国特許第5,744,305号に記載される「チップ」上に存在しうる。   Alternatively, the kit can include a nucleic acid substrate array of one or more nucleic acids. The nucleic acids on the array specifically identify one or more nucleic acid sequences represented by RCC 1-972. Expression of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40 or 50 or more of nucleic acids represented by RCC 1-972, array test strip or chip Identified by the level of binding to. The substrate array can be present, for example, on a solid substrate, eg, a “chip” as described in US Pat. No. 5,744,305, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

アレイおよび複数性：
本発明にはまた、一つまたは複数の核酸の核酸基質アレイも含まれる。アレイ上の核酸は、RCC 1〜972で表される核酸配列の1つまたは複数に特異的に対応する。RCC 1〜972で表される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40もしくは50種またはそれ以上の発現レベルは、アレイに対する核酸結合を検出することによって同定されうる。 Arrays and pluralities:
The invention also includes a nucleic acid substrate array of one or more nucleic acids. The nucleic acids on the array specifically correspond to one or more of the nucleic acid sequences represented by RCC 1-972. Expression levels of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40 or 50 or more of the nucleic acids represented by RCC 1-972 are nucleic acid binding to the array Can be identified by detecting.

本発明にはまた、単離された複数の核酸（すなわち、二つまたはそれ以上の核酸の混合物）が含まれる。核酸は、液相で存在してもよく、または、例えばニトロセルロースメンブレンのような固相支持体に固定された、固相で存在してもよい。この複数物には、RCC 1〜972で表される核酸の1つまたは複数が含まれる。様々な態様において、複数物には、RCC 1〜972で表される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50種またはそれ以上が含まれる。   The invention also includes a plurality of isolated nucleic acids (ie, a mixture of two or more nucleic acids). The nucleic acid may be present in the liquid phase or may be present in a solid phase, for example immobilized on a solid support such as a nitrocellulose membrane. The plurality includes one or more of the nucleic acids represented by RCC 1-972. In various embodiments, the plurality includes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40, or 50 species of nucleic acids represented by RCC 1-972 or More than that included.

腎細胞癌を阻害する方法：
本発明はさらに、RCC 1〜251の1つもしくは複数の発現（またはその遺伝子産物の活性）を低下させることにより、またはRCC 252〜972の1つもしくは複数の発現（またはその遺伝子産物の活性）を上昇させることにより、対象におけるRCCの症状を処置または緩和するための方法も提供する。RCCを有するまたはその発症リスクがある（または感受性がある）対象に対して、適切な治療化合物を予防的または治療的に投与することができる。標準的な臨床的方法を用いて、または、RCC 1〜972の1つもしくは複数の異常な発現レベル（または対応する遺伝子産物の異常な活性レベル）を検出することにより、そのような対象を同定することができる。適切な治療薬には、細胞周期調節、細胞増殖、およびタンパク質キナーゼ活性の阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。 Methods for inhibiting renal cell carcinoma:
The invention further reduces the expression of one or more of RCC 1-251 (or the activity of its gene product) or the expression of one or more of RCC 252-972 (or the activity of its gene product). Also provided are methods for treating or alleviating symptoms of RCC in a subject by raising Appropriate therapeutic compounds can be administered prophylactically or therapeutically to subjects with or at risk for (or susceptible to) RCC. Identify such subjects using standard clinical methods or by detecting one or more abnormal expression levels of RCC 1-972 (or abnormal activity levels of the corresponding gene product) can do. Suitable therapeutic agents include, but are not limited to, inhibitors of cell cycle regulation, cell proliferation, and protein kinase activity.

本発明の治療法は、RCC細胞が由来する同じ種類の組織の正常細胞と比較して、RCC細胞において発現が低下している遺伝子（「ダウンレギュレートされる」または「低発現される」遺伝子）の一つまたは複数の遺伝子産物の発現、機能、またはその両方を増大させる段階を含みうる。これらの方法において、被験者において過小発現されている遺伝子の一つまたは複数の量を増加させる化合物の有効量によって、被験者を処置する。投与は、全身投与または局所投与とすることができる。適した治療用化合物には、これらに限定されるわけではないが、低発現される遺伝子のポリペプチド産物、その生物活性断片、ならびに、低発現される遺伝子をコードしかつRCC細胞における発現を可能にする発現制御エレメントを有する核酸；例えば、RCC細胞にとって内因性であるこのような遺伝子の発現レベルを増大させる（すなわち、低発現される遺伝子の一つまたは複数の発現をアップレギュレートする）作用物質が含まれる。そのような化合物の投与は、対象の腎細胞において異常に低発現される1つまたは複数の遺伝子の影響に対抗し、かつ対象の臨床状態を改善する。   The therapeutic method of the present invention comprises a gene ("down-regulated" or "under-expressed") whose expression is decreased in RCC cells compared to normal cells of the same type of tissue from which RCC cells are derived. ) To increase the expression, function, or both of one or more gene products. In these methods, the subject is treated with an effective amount of a compound that increases the amount of one or more of the genes that are underexpressed in the subject. Administration can be systemic or local. Suitable therapeutic compounds include, but are not limited to, the polypeptide product of a low-expressed gene, its biologically active fragment, and the low-expressed gene encoding and expression in RCC cells A nucleic acid having an expression control element that: e.g., increases the expression level of such a gene that is endogenous to RCC cells (i.e., upregulates the expression of one or more of the underexpressed genes) Contains substances. Administration of such compounds counteracts the effects of one or more genes that are abnormally under-expressed in the subject's renal cells and improves the subject's clinical status.

または、本発明の治療法は、RCC細胞において発現が異常に増大している遺伝子（「アップレギュレートされる」または「過剰発現される」遺伝子）の一つまたは複数の遺伝子産物の発現、機能、またはその両方を減少させる段階を含みうる。発現は、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって阻害することができる。例えば、過剰発現される1つまたは複数の遺伝子の発現を阻害するまたはそれに拮抗する核酸、例えば、過剰発現される1つまたは複数の遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNAを、対象に投与することによって、発現を阻害することができる。   Alternatively, the therapeutic methods of the present invention may provide for the expression, function, or function of one or more gene products of a gene whose expression is abnormally increased in RCC cells (a gene that is “upregulated” or “overexpressed”). , Or both. Expression can be inhibited by any of several methods known in the art. For example, nucleic acids that inhibit or antagonize the expression of one or more genes that are overexpressed, e.g., antisense oligonucleotides or small interfering RNAs that interfere with the expression of one or more genes that are overexpressed The expression can be inhibited by administering to a subject.

アンチセンス核酸：
上記のように、RCC 1〜251のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸を、RCC 1〜251の発現レベルを低下させるために用いることができる。腎細胞癌においてアップレギュレートされるRCC 1〜251に対応するアンチセンス核酸は、腎細胞癌の処置のために有用である。具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、RCC 1〜251またはそれに対応するmRNAに結合して、それにより遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつ／またはRCC 1〜251にコードされるタンパク質の発現を阻害して、それによりタンパク質の機能を阻害することによって、作用しうる。本明細書において用いられる「アンチセンス核酸」という用語は、アンチセンス核酸が標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列と完全に相補的であるヌクレオチドおよび一つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの双方を含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、連続した少なくとも15ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。相同性の決定には、当技術分野において公知のアルゴリズムを使用することができる。 Antisense nucleic acid:
As described above, an antisense nucleic acid corresponding to the nucleotide sequence of RCC 1-251 can be used to reduce the expression level of RCC 1-251. Antisense nucleic acids corresponding to RCC 1-251 that are upregulated in renal cell carcinoma are useful for the treatment of renal cell carcinoma. Specifically, the antisense nucleic acids of the invention bind to RCC 1-251 or its corresponding mRNA, thereby inhibiting gene transcription or translation, promoting mRNA degradation, and / or RCC 1 It can act by inhibiting the expression of the protein encoded by ~ 251, thereby inhibiting the function of the protein. As used herein, the term “antisense nucleic acid” refers to a nucleotide and one or more nucleotides that are perfectly complementary to a target sequence, so long as the antisense nucleic acid can specifically hybridize to the target sequence. Including both nucleotides with the following mismatches. For example, the antisense nucleic acids of the invention comprise at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% over a length of at least 15 consecutive nucleotides. Polynucleotides having homology or higher are included. Algorithms known in the art can be used to determine homology.

本発明のアンチセンス核酸は、RCC関連マーカー遺伝子にコードされるタンパク質を産生する細胞に対して、これらのタンパク質をコードするDNAまたはmRNAと結合し、その転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進して、タンパク質の発現を阻害することにより作用し、その結果、タンパク質の機能を阻害する。   The antisense nucleic acid of the present invention binds to DNA or mRNA encoding these proteins to cells that produce proteins encoded by RCC-related marker genes, inhibits transcription or translation thereof, and inhibits mRNA degradation. Promotes and acts by inhibiting the expression of the protein, thereby inhibiting the function of the protein.

本発明のアンチセンス核酸は、該核酸に対して不活性の適切な基剤と混合することにより、リニメント剤または湿布剤などの外用製剤の形にすることができる。   The antisense nucleic acid of the present invention can be made into a form of external preparation such as a liniment or a poultice by mixing with an appropriate base inert to the nucleic acid.

同じく、必要に応じて、賦形剤、等張剤、溶解補助剤、安定剤、保存料、鎮痛薬などを添加することにより、本発明のアンチセンス核酸を、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻薬、および凍結乾燥製剤として製剤化することもできる。これらは以下の公知の方法によって調製することができる。   Similarly, by adding excipients, isotonic agents, solubilizers, stabilizers, preservatives, analgesics, etc. as necessary, the antisense nucleic acid of the present invention is converted into tablets, powders, granules, capsules. It can also be formulated as an agent, liposome capsule, injection, solution, nasal drop, and lyophilized preparation. These can be prepared by the following known methods.

本発明のアンチセンス核酸は、罹患部位に直接塗布することにより、または、それが罹患部位に到達するように血管内に注入することにより、患者に投与することができる。アンチセンスを含む溶媒を使用することで、持続性および膜透過性を高めることもできる。その例には、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。   The antisense nucleic acid of the invention can be administered to a patient by applying directly to the affected area or by injecting it into the blood vessel so that it reaches the affected area. Persistence and membrane permeability can also be increased by using a solvent containing antisense. Examples include, but are not limited to, liposomes, poly-L-lysine, lipids, cholesterol, lipofectin or derivatives thereof.

本発明のアンチセンス核酸の投与量は、患者の状態に従って適切に調整でき、かつ所望の量で用いることができる。例えば0.1 mg/kg〜100 mg/kg、好ましくは0.1 mg/kg〜50 mg/kgの用量範囲で投与することができる。   The dosage of the antisense nucleic acid of the present invention can be appropriately adjusted according to the patient's condition, and can be used in a desired amount. For example, it can be administered at a dose range of 0.1 mg / kg to 100 mg / kg, preferably 0.1 mg / kg to 50 mg / kg.

本発明のアンチセンス核酸は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、かつそのため、本発明のタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。さらに、発現阻害剤、例えば本発明のアンチセンス核酸は、それらが本発明のタンパク質の生物活性を阻害できるという点において有用である。   The antisense nucleic acid of the present invention inhibits the expression of the protein of the present invention and is therefore useful for suppressing the biological activity of the protein of the present invention. Furthermore, expression inhibitors, such as the antisense nucleic acids of the present invention, are useful in that they can inhibit the biological activity of the proteins of the present invention.

本発明のアンチセンス核酸には、修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、チオエート型オリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与してもよい。   The antisense nucleic acid of the present invention includes a modified oligonucleotide. For example, a thioate-type oligonucleotide may be used to confer nuclease resistance to the oligonucleotide.

マーカー遺伝子に対するsiRNAを用いて、マーカー遺伝子の発現レベルを低減させることができる。本明細書において、「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を防止する二本鎖RNA分子を指す。DNAが、そこからRNAが転写される鋳型となる技術を含む、細胞にsiRNAを導入する標準的な技術を用いる。siRNAには、センスRCC 1-251、たとえばC6700（RCC 81）、B7032N（RCC126）、もしくはB9320（RCC173）核酸配列、アンチセンスRCC 1-251、たとえば C6700、B7032N、もしくはB9320核酸配列、またはその双方が含まれる。siRNAは、二つの相補的分子で構成されてもよく、または単一の転写物が標的遺伝子からのセンス配列および相補的アンチセンス配列の双方を有する（たとえば、ヘアピン）ように、いくつかの態様において、マイクロRNA（miRNA）の産生に至るように構築してもよい。   The siRNA against the marker gene can be used to reduce the expression level of the marker gene. As used herein, the term “siRNA” refers to a double-stranded RNA molecule that prevents translation of a target mRNA. Standard techniques for introducing siRNA into cells are used, including techniques in which DNA serves as a template from which RNA is transcribed. siRNA includes sense RCC 1-251, eg, C6700 (RCC 81), B7032N (RCC126), or B9320 (RCC173) nucleic acid sequence, antisense RCC 1-251, eg, C6700, B7032N, or B9320 nucleic acid sequence, or both Is included. The siRNA may be composed of two complementary molecules, or in some embodiments, such that a single transcript has both a sense sequence and a complementary antisense sequence from the target gene (eg, a hairpin). In this case, it may be constructed so as to lead to the production of microRNA (miRNA).

標的細胞におけるRCC 1〜251の一つに対応する転写物に対するsiRNAの結合によって、細胞によるタンパク質産生の低減が起こる。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然に存在する転写物と同じ長さであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが75、50、25ヌクレオチド未満である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが19〜25ヌクレオチドである。   Binding of the siRNA to a transcript corresponding to one of RCC 1-251 in the target cell results in a reduction in protein production by the cell. The length of the oligonucleotide is at least 10 nucleotides and may be the same length as the naturally occurring transcript. Preferably, the oligonucleotide is less than 75, 50, 25 nucleotides in length. More preferably, the oligonucleotide is 19-25 nucleotides in length.

本方法はまた、C6700、B7032N、またはB9320の発現が、たとえば細胞の悪性形質転換の結果としてアップレギュレートされている細胞における遺伝子発現を変更するためにも用いられる。標的細胞におけるC6700、B7032N、またはB9320転写物に対するsiRNAの結合により、細胞によるC6700、B7032N、またはB9320産生の低減が起こる。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも約10ヌクレオチドであり、天然に存在するC6700、B7032N、またはB9320転写物と同じ長さであってもよい。本発明において、siRNAの標的配列は、C6700V2のヌクレオチド配列から選択されてもよい。ヌクレオチド配列のほとんどはC6700の2つの変異体、すなわちV1およびV2のあいだで共有される。したがって、一つの変異体を抑制するための有効なsiRNAはまた、もう一つの変異体も抑制する可能性がある。このように、C6700V1およびC6700V2の双方を抑制するsiRNAは、癌を処置または予防するために用いられる可能性がある。あるいは、C6700V2特異的siRNAもまた、癌を処置または予防するために用いられる可能性がある。哺乳動物細胞においてC6700発現を阻害するC6700のsiRNAオリゴヌクレオチドの例には、標的配列、たとえばC6700V1およびC6700V2の双方を抑制する可能性があるSEQ ID NO:43、47、または81のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明において、siRNAの標的配列は、B7032Nのヌクレオチド配列から選択されてもよい。たとえば、B7032Nに関する標的配列としてSEQ ID NO:106のヌクレオチドを含むsiRNAオリゴヌクレオチド。本発明において、siRNAの標的配列は、B9320V2のヌクレオチド配列から選択されてもよい。ヌクレオチド配列のほとんどはB9320の二つの変異体、すなわちV1およびV2において共有されている。したがって、一つの変異体を抑制するために有効なsiRNAはまた、もう一つの変異体も抑制する可能性がある。このように、B9320V1およびB9320V2の双方を抑制するsiRNAは、癌を処置または予防するために用いられる可能性がある。あるいは、B9320V2特異的siRNAもまた、癌を処置または予防するために用いられる可能性がある。哺乳動物細胞においてB9320発現を阻害するB9320のsiRNAオリゴヌクレオチドの例には、標的配列、たとえばB9320V2を抑制する可能性があるSEQ ID NO:110のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。   The method is also used to alter gene expression in cells in which expression of C6700, B7032N, or B9320 is upregulated, for example, as a result of malignant transformation of the cells. Binding of the siRNA to the C6700, B7032N, or B9320 transcript in the target cell results in a reduction of C6700, B7032N, or B9320 production by the cell. The length of the oligonucleotide is at least about 10 nucleotides and may be as long as the naturally occurring C6700, B7032N, or B9320 transcript. In the present invention, the target sequence of siRNA may be selected from the nucleotide sequence of C6700V2. Most of the nucleotide sequence is shared between two variants of C6700, namely V1 and V2. Thus, an effective siRNA for suppressing one variant may also suppress another variant. Thus, siRNAs that suppress both C6700V1 and C6700V2 may be used to treat or prevent cancer. Alternatively, C6700V2-specific siRNA may also be used to treat or prevent cancer. Examples of C6700 siRNA oligonucleotides that inhibit C6700 expression in mammalian cells include oligos comprising nucleotides of SEQ ID NO: 43, 47, or 81 that may suppress target sequences such as both C6700V1 and C6700V2. Nucleotides are included. In the present invention, the target sequence of siRNA may be selected from the nucleotide sequence of B7032N. For example, an siRNA oligonucleotide comprising the nucleotide of SEQ ID NO: 106 as a target sequence for B7032N. In the present invention, the target sequence of siRNA may be selected from the nucleotide sequence of B9320V2. Most of the nucleotide sequence is shared in two variants of B9320, namely V1 and V2. Thus, an siRNA that is effective to suppress one variant may also suppress another variant. Thus, siRNAs that suppress both B9320V1 and B9320V2 may be used to treat or prevent cancer. Alternatively, B9320V2-specific siRNA may also be used to treat or prevent cancer. Examples of B9320 siRNA oligonucleotides that inhibit B9320 expression in mammalian cells include oligonucleotides comprising the nucleotide of SEQ ID NO: 110 that may suppress the target sequence, eg, B9320V2.

標的細胞における遺伝子発現を阻害する能力を有する適切な二本鎖RNAを設計する方法は周知である。(例えば、全体が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,506,559号を参照のこと)。例えば、siRNAを設計するためのコンピュータープログラムを、Ambionのウェブサイト(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)から入手することができる。Ambion, Inc.から入手可能なコンピュータープログラムは、以下のプロトコールに基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。   Methods for designing suitable double stranded RNA having the ability to inhibit gene expression in target cells are well known. (See, eg, US Pat. No. 6,506,559, which is incorporated herein by reference in its entirety). For example, a computer program for designing siRNA can be obtained from the Ambion website (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). A computer program available from Ambion, Inc. selects nucleotide sequences for siRNA synthesis based on the following protocol.

siRNA標的部位の選択
1.転写物のAUG開始コドンから開始して、下流にあるAAジヌクレオチド配列をスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlら（1999）、Genes Dev 13: 3191-7は、5'および3'非翻訳領域（UTR）および開始コドン近傍（75塩基以内）の領域は、調節タンパク質結合部位が豊富である可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計することを推奨していない。UTR-結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2.潜在的な標的部位と適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)とを比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する全ての標的配列を検討から除外する。BLAST（Altschul SF, et al., (1997) Nucleic Acids Res.;25:3389-402; (1990) J Mol Biol.;215:403-10）の使用が示唆されており、これは、NCBIサーバ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において見出される。
3.合成に適した標的配列を選択する。遺伝子の長さに応じていくつかの標的配列を選択して評価することが典型的である。 siRNA target site selection
1. Scan downstream AA dinucleotide sequences starting from the AUG start codon of the transcript. Record the occurrence of individual AA and 3 ′ adjacent 19 nucleotides as potential siRNA target sites. Tuschl et al. (1999), Genes Dev 13: 3191-7, suggests that the 5 'and 3' untranslated regions (UTR) and the region near the start codon (within 75 bases) may be rich in regulatory protein binding sites. Because of this, it is not recommended to design siRNAs for these. UTR-binding proteins and / or translation initiation complexes can interfere with the binding of the siRNA endonuclease complex.
2. Compare potential target sites with appropriate genomic databases (human, mouse, rat, etc.) and exclude all target sequences that have significant homology with other coding sequences from consideration. The use of BLAST (Altschul SF, et al., (1997) Nucleic Acids Res.; 25: 3389-402; (1990) J Mol Biol.; 215: 403-10) has been suggested, (Www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
3. Select a target sequence suitable for synthesis. It is typical to select and evaluate several target sequences depending on the length of the gene.

例えばSEQ ID NO: 43、47、81、106、または110のヌクレオチドなどの標的配列の核酸配列を含む単離された核酸分子、および、SEQ ID NO: 43、47、81、106、または110のヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸分子もまた、本発明に含まれる。本明細書で使用される「単離された核酸」という用語は、元々の環境（例えば、天然のものであれば自然環境）から取り出された核酸を指し、従ってこれは、その天然の状態から人工的に変化させられた核酸である。本発明において、単離された核酸は、DNA、RNA、およびそれらの誘導体を含む。単離された核酸がRNAまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列内の塩基「t」は「u」に置換されなければならない。本明細書において使用される「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン-クリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、2つの核酸もしくは化合物の間の物理的もしくは化学的な相互作用、または会合した核酸もしくは化合物もしくはそれらの組み合わせを意味する。相補的な核酸配列は適切な条件下でハイブリダイズして、ミスマッチをほとんどまたは全く含まない、安定した二重鎖を形成する。本発明の目的において、5またはそれ以下のミスマッチを含む2つの配列は相補的とみなされる。   An isolated nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of the target sequence, such as, for example, the nucleotides of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110; and of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110 Nucleic acid molecules complementary to the nucleic acid sequence of nucleotides are also included in the present invention. As used herein, the term “isolated nucleic acid” refers to a nucleic acid that has been removed from its original environment (eg, the natural environment if it is naturally occurring), and thus is from its natural state. It is an artificially altered nucleic acid. In the present invention, isolated nucleic acids include DNA, RNA, and derivatives thereof. If the isolated nucleic acid is RNA or a derivative thereof, the base “t” in the nucleotide sequence must be replaced with “u”. As used herein, the term “complementary” refers to Watson-Crick or Hoogsteen-type base pairing between nucleotide units of a nucleic acid molecule, and the term “binding” refers to two nucleic acids or It means a physical or chemical interaction between compounds, or an associated nucleic acid or compound or a combination thereof. Complementary nucleic acid sequences hybridize under appropriate conditions to form stable duplexes with little or no mismatch. For the purposes of the present invention, two sequences containing 5 or fewer mismatches are considered complementary.

本発明の文脈において、本発明の単離ヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションにより二本鎖ヌクレオチドまたはヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい態様において、そのような二本鎖は、10個のマッチ毎にわずか1個のミスマッチを含むに過ぎない。二本鎖の鎖が完全に相補的である、特に好ましい態様において、そのような二本鎖はミスマッチを含まない。核酸分子は好ましくは、C6700に関して長さが4725もしくは4494ヌクレオチド未満、B7032Nに関して長さが3503ヌクレオチド未満、またはB9320に関して長さが2539もしくは3427ヌクレオチド未満である。たとえば、核酸分子は、長さが約500、約200、または約75ヌクレオチド未満である。また、本明細書に記述の核酸の一つまたは複数を含むベクター、およびベクターを含む細胞も本発明に含まれる。本発明の単離核酸は、C6700、B7032N、もしくはB9320に対するsiRNAにとって、またはsiRNAをコードするDNAにとって有用である。siRNAまたはそのコードDNAに関する核酸を用いる場合、センス鎖は好ましくは約19ヌクレオチドより長く、より好ましくは21ヌクレオチドより長い。   In the context of the present invention, the sense and antisense strands of the isolated nucleotides of the present invention can form double stranded nucleotides or hairpin loop structures by hybridization. In a preferred embodiment, such a duplex contains only 1 mismatch for every 10 matches. In particularly preferred embodiments where the double stranded strands are completely complementary, such duplexes do not contain mismatches. The nucleic acid molecule is preferably less than 4725 or 4494 nucleotides in length for C6700, less than 3503 nucleotides in length for B7032N, or less than 2539 or 3427 nucleotides in length for B9320. For example, the nucleic acid molecule is less than about 500, about 200, or about 75 nucleotides in length. Also included in the invention are vectors containing one or more of the nucleic acids described herein, and cells containing the vectors. The isolated nucleic acids of the invention are useful for siRNA against C6700, B7032N, or B9320, or for DNA encoding siRNA. When using nucleic acids related to siRNA or its coding DNA, the sense strand is preferably longer than about 19 nucleotides, more preferably longer than 21 nucleotides.

本発明は、転写変異体C6700V2が、非癌性腎細胞と比較して腎細胞癌（RCC）において過剰発現されているという発見に部分的に基づいている。C6700は、異なる二つの転写変異体を有する。C6700V1またはV2のcDNAは長さが4725または4494ヌクレオチドである。C6700V1またはV2の核酸およびポリペプチド配列はそれぞれ、SEQ ID NO:63および64、または65および66において示される。配列データはまた、以下のアクセッション番号によって入手可能である。
C6700V1：AY358124
C6700V2：BC077726 The present invention is based in part on the discovery that the transcriptional variant C6700V2 is overexpressed in renal cell carcinoma (RCC) compared to non-cancerous renal cells. C6700 has two different transcriptional variants. The C6700V1 or V2 cDNA is 4725 or 4494 nucleotides in length. The nucleic acid and polypeptide sequences of C6700V1 or V2 are shown in SEQ ID NOs: 63 and 64, or 65 and 66, respectively. Sequence data is also available by the following accession numbers.
C6700V1: AY358124
C6700V2: BC077726

SEQ ID NO:43、47、または81のsiRNAのトランスフェクションにより、RCC細胞株の成長阻害が起こった。Semaドメイン、7個のトロンボスポンジンリピート（1型および1型様）、膜貫通ドメイン（TM）および短い細胞質ドメイン（セマフォリン5B）であるSEMA5Bを示すC6700は、染色体3p21.1上に存在した。SEMA5Bのようなセマフォリンタンパク質ファミリーメンバーは、神経発生の際の軸索誘導に関係している（Adams, et al., (1996) Mech. Dev. 57: 33-45）。C6700は、RT-PCRおよびノーザンブロット分析により、腎近位尿細管上皮細胞と比較して、RCC細胞株8個（ACHN、769-P、RXF-631L、TUHRl0TKB、Caki-1、Caki-2、786-O、およびA-498）の中でRCC細胞株3個（A704、OS-RC-2、およびTUHR14TKB）においてアップレギュレートされた（図2bおよび3、右のパネル）。C6700は、C6700V1およびC6700V2にそれぞれ対応するエキソン23個からなる異なる二つの転写変異体を有する（図8a）。本明細書において、V2変異体はRCC細胞において特異的に過剰発現されることが発見された（図8b）。   Transfection of siRNA with SEQ ID NO: 43, 47, or 81 resulted in growth inhibition of the RCC cell line. C6700 representing SEMA domain, 7 thrombospondin repeats (type 1 and type 1 like), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain (semaphorin 5B) were present on chromosome 3p21.1 . Semaphorin protein family members such as SEMA5B have been implicated in axon guidance during neurogenesis (Adams, et al., (1996) Mech. Dev. 57: 33-45). C6700 was analyzed by RT-PCR and Northern blot analysis, compared to renal proximal tubule epithelial cells. 786-O and A-498) were up-regulated in three RCC cell lines (A704, OS-RC-2, and TUHR14TKB) (Figures 2b and 3, right panel). C6700 has two different transcription variants consisting of 23 exons corresponding to C6700V1 and C6700V2, respectively (FIG. 8a). Herein, it was discovered that V2 mutants are specifically overexpressed in RCC cells (FIG. 8b).

本発明は、B7032Nが、非癌性細胞と比較して腎細胞癌（RCC）において過剰発現されているという発見に部分的に基づいている。B7032Nは、長さが3503ヌクレオチドである。B7032Nの核酸およびポリペプチド配列をSEQ ID NO:112および113に示す。配列データはまた、以下のアクセッション番号によって入手可能である。
NM_004567 The present invention is based in part on the discovery that B7032N is overexpressed in renal cell carcinoma (RCC) compared to non-cancerous cells. B7032N is 3503 nucleotides in length. The nucleic acid and polypeptide sequences for B7032N are shown in SEQ ID NOs: 112 and 113. Sequence data is also available by the following accession numbers.
NM_004567

SEQ ID NO:106のsiRNAのトランスフェクションにより、RCC細胞株の成長阻害が起こった。PFKFB4（5-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼ4）遺伝子を示すB7032Nは、半定量的RT-PCR分析により、RCC臨床症例（図2a）と共にRCC細胞株（データ非呈示）においてアップレギュレートされるが、その発現は、試験した正常な重要臓器のいずれにおいても検出不可能であった。次に行ったノーザンブロット分析により、約3.5 kb B7032N転写物が膀胱癌細胞株11例中2例においてアップレギュレートされるが、精巣および膵臓を除き正常臓器では発現されないことが確認された（図6）。   Transfection of the siRNA of SEQ ID NO: 106 resulted in growth inhibition of the RCC cell line. B7032N, which represents the PFKFB4 (5-phosphofructo-2-kinase / fructose-2,6-bisphosphatase 4) gene, was analyzed by semi-quantitative RT-PCR analysis along with the RCC cell line (data not shown). ), But its expression was not detectable in any of the normal vital organs tested. Next, Northern blot analysis confirmed that the approximately 3.5 kb B7032N transcript was up-regulated in 2 of 11 bladder cancer cell lines, but not expressed in normal organs except the testis and pancreas (Fig. 6).

本発明は、転写変異体B9320V2が非癌性腎細胞と比較して腎細胞癌（RCC）において過剰発現されるという発見に部分的に基づいている。B9320は、異なる二つの転写変異体を有する。B9320V1またはV2のcDNAは、長さが2539または3427ヌクレオチドである。B9320V1またはV2の核酸およびポリペプチド配列はそれぞれ、SEQ ID NO:115および116、または118および119において示される。配列データはまた、以下のアクセッション番号によって入手可能である。
B9320V1：BC034014
B9320V2：NM_153350 The present invention is based in part on the discovery that the transcriptional variant B9320V2 is overexpressed in renal cell carcinoma (RCC) compared to non-cancerous renal cells. B9320 has two different transcriptional variants. The B9320V1 or V2 cDNA is 2539 or 3427 nucleotides in length. The nucleic acid and polypeptide sequences for B9320V1 or V2 are shown in SEQ ID NOs: 115 and 116, or 118 and 119, respectively. Sequence data is also available by the following accession numbers.
B9320V1: BC034014
B9320V2: NM_153350

SEQ ID NO:110のsiRNAのトランスフェクションにより、RCC細胞株の成長阻害が起こった。FBXL16（Fボックスロイシンリッチリピートタンパク質16）遺伝子を示すB9320は、半定量的RT-PCR分析により、RCC臨床症例（図2a）のみならずRCC細胞株（データ非呈示）においてアップレギュレートされるが、その発現は、試験した正常な重要臓器のいずれにおいても検出不可能であった。次に行ったノーザンブロット分析から、二つのB9320転写物のおよそB9320V1（2.4 kb）およびB9320V2（4 kb）が、膀胱癌細胞株4例中2例において有意にアップレギュレートされたことが確認された。B9320V1転写物は腎臓および甲状腺において発現されたが、B9320V2転写物は脳、精巣、脊髄、および膵臓を除き正常臓器では発現されなかった（図7）。   Transfection of the siRNA of SEQ ID NO: 110 resulted in growth inhibition of the RCC cell line. B9320, which represents the FBXL16 (F-box leucine-rich repeat protein 16) gene, is up-regulated in RCC cell lines (data not shown) as well as in RCC clinical cases (Figure 2a) by semi-quantitative RT-PCR analysis Its expression was undetectable in any of the normal vital organs tested. A subsequent Northern blot analysis confirmed that approximately B9320V1 (2.4 kb) and B9320V2 (4 kb) of the two B9320 transcripts were significantly upregulated in 2 of 4 bladder cancer cell lines. It was. B9320V1 transcript was expressed in kidney and thyroid, whereas B9320V2 transcript was not expressed in normal organs except brain, testis, spinal cord, and pancreas (FIG. 7).

siRNA組成物の構造：
本発明は、C6700、B7032N、またはB9320の発現を阻害することによって細胞成長、すなわち癌細胞成長を阻害することに関する。C6700、B7032N、またはB9320の発現は、たとえば、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子を特異的に標的とする低分子干渉RNA（siRNA）によって阻害される。C6700、B7032N、またはB9320標的には、たとえば、SEQ ID NO:43、47、81、106、または110のヌクレオチドが含まれる。 Structure of siRNA composition:
The present invention relates to inhibiting cell growth, ie cancer cell growth, by inhibiting the expression of C6700, B7032N, or B9320. C6700, B7032N, or B9320 expression is inhibited, for example, by small interfering RNA (siRNA) that specifically targets the C6700, B7032N, or B9320 gene. C6700, B7032N, or B9320 targets include, for example, the nucleotides of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110.

非哺乳動物細胞において、二本鎖RNA（dsRNA）は、遺伝子発現に対して強力かつ特異的なサイレンシング効果を発揮することが示されており、これはRNA干渉（RNAi）と呼ばれている（Sharp PA. (1999) Genes Dev.;13:139-41）。dsRNAは、RNアーゼIIIモチーフを含む酵素によって低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる20〜23ヌクレオチドのdsRNAにプロセシングされる。siRNAは、多成分ヌクレアーゼ複合体によって相補的mRNAを特異的に標的とする（Hammond SM, et al., (2000) Nature.;404:293-6；Hannon GJ. (2002) Nature.;418:244-51）。哺乳動物細胞において、相補的ヌクレオチド19個およびチミジンまたはウリジンの3'末端非相補性二量体を有する20または21量体dsRNAからなるsiRNAは、遺伝子発現において全体的な変化を誘導することなく、遺伝子特異的ノックダウン効果を有することが示されている（Elbashir SM, et al., (2001) Nature.;411:494-8）。さらに、低分子核RNA（snRNA）U6またはポリメラーゼIII H1-RNAプロモーターを含むプラスミドは、そのような低分子RNA動員III型クラスのRNAポリメラーゼIIIを有効に産生し、このようにその標的mRNAを構成的に抑制することができる。Miyagishi M and Taira K. (2002) Nat Biotechnol.;20:497-500.；Brummelkamp TR, et al., (2002) Science. 296:550-3）。   In non-mammalian cells, double-stranded RNA (dsRNA) has been shown to exert a powerful and specific silencing effect on gene expression, called RNA interference (RNAi) (Sharp PA. (1999) Genes Dev .; 13: 139-41). dsRNA is processed into 20-23 nucleotide dsRNA called small interfering RNA (siRNA) by an enzyme containing RNase III motif. siRNAs specifically target complementary mRNAs by multicomponent nuclease complexes (Hammond SM, et al., (2000) Nature .; 404: 293-6; Hannon GJ. (2002) Nature .; 418: 244-51). In mammalian cells, siRNAs consisting of 20 or 21-mer dsRNAs with 19 complementary nucleotides and 3 'terminal non-complementary dimers of thymidine or uridine do not induce global changes in gene expression, It has been shown to have a gene-specific knockdown effect (Elbashir SM, et al., (2001) Nature .; 411: 494-8). In addition, plasmids containing small nuclear RNA (snRNA) U6 or polymerase III H1-RNA promoters effectively produce such small RNA mobilization type III class RNA polymerase III and thus constitute their target mRNA Can be suppressed. Miyagishi M and Taira K. (2002) Nat Biotechnol .; 20: 497-500 .; Brummelkamp TR, et al., (2002) Science. 296: 550-3).

本発明の文脈において、細胞の成長は、C6700、B7032N、またはB9320のsiRNAを含む組成物に細胞を接触させることによって阻害してもよい。細胞は、さらにトランスフェクション物質に接触させる。適したトランスフェクション物質は当技術分野において公知である。細胞成長の阻害は、細胞が、組成物に曝露されていない細胞と比較してより低い速度で増殖する、または生存率の減少を有することを意味する。細胞の成長は、MTT細胞増殖アッセイのような、当技術分野において公知の方法によって測定される。   In the context of the present invention, cell growth may be inhibited by contacting the cells with a composition comprising a C6700, B7032N, or B9320 siRNA. The cell is further contacted with a transfection agent. Suitable transfection agents are known in the art. Inhibition of cell growth means that the cells proliferate at a lower rate or have a reduced viability compared to cells not exposed to the composition. Cell growth is measured by methods known in the art, such as the MTT cell proliferation assay.

C6700、B7032N、またはB9320のsiRNAは、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子配列の単一の標的に向けられる可能性がある。または、siRNAは、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子配列の複数の標的に向けられる可能性がある。たとえば、組成物は、C6700、B7032N、またはB9320の二つ、三つ、四つ、五つ、またはそれより多い標的配列に向けられるC6700、B7032N、またはB9320のsiRNAを含んでもよい。C6700、B7032N、またはB9320標的配列とは、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子の一部と同一であるヌクレオチド配列を意味する。標的配列には、ヒトC6700、B7032N、またはB9320遺伝子の5'非翻訳（UT）領域、オープンリーディングフレーム（ORF）、または3'非翻訳領域が含まれうる。または、siRNAは、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子発現の上流または下流の調節物質と相補的な核酸配列である。上流および下流の調節物質の例には、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子プロモーターに結合する転写因子、C6700、B7032N、またはB9320ポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、C6700、B7032N、またはB9320プロモーターまたはエンハンサーが含まれる。標的mRNAとハイブリダイズするC6700、B7032N、またはB9320のsiRNAは、通常一本鎖のmRNA転写物と会合して、それによって翻訳を干渉して、このようにタンパク質の発現を干渉することによって、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子によってコードされるC6700、B7032N、またはB9320ポリペプチド産物の産生を減少または阻害する。したがって、本発明のsiRNA分子は、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子に由来するmRNAまたはcDNAにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする能力によって定義され得る。本発明の目的において、「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、2つの核酸分子が「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下でハイブリダイズする能力を指すために用いられる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、核酸分子が、典型的には核酸の複合体混合物中にあるその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とは検出し得る程度にはハイブリダイズしないと考えられる条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境では異なると考えられる。配列が長くなればなるほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, (1993) Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度pHでの特定の配列についての熱融解温度(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、平衡状態で標的に相補的なプローブの50%が標的配列にハイブリダイズする（規定のイオン強度、pH、および核酸濃度における）温度である（Tmにおいて標的配列が過剰に存在するので、プローブの50%が平衡状態に占められる）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成されうる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的な、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下でありうる：50℃での0.2×SSCおよび0.1％SDSによる洗浄を伴う、50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でのインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃でのインキュベーション。   C6700, B7032N, or B9320 siRNAs may be directed to a single target of the C6700, B7032N, or B9320 gene sequence. Alternatively, siRNA may be directed to multiple targets of C6700, B7032N, or B9320 gene sequences. For example, the composition may include C6700, B7032N, or B9320 siRNA directed to two, three, four, five, or more target sequences of C6700, B7032N, or B9320. A C6700, B7032N, or B9320 target sequence refers to a nucleotide sequence that is identical to a portion of a C6700, B7032N, or B9320 gene. Target sequences can include the 5 ′ untranslated (UT) region, open reading frame (ORF), or 3 ′ untranslated region of the human C6700, B7032N, or B9320 gene. Alternatively, the siRNA is a nucleic acid sequence that is complementary to a regulator upstream or downstream of C6700, B7032N, or B9320 gene expression. Examples of upstream and downstream regulators include transcription factors that bind to the C6700, B7032N, or B9320 gene promoter, kinases or phosphatases that interact with C6700, B7032N, or B9320 polypeptides, C6700, B7032N, or B9320 promoters or enhancers. Is included. The C6700, B7032N, or B9320 siRNA that hybridizes to the target mRNA usually associates with the single-stranded mRNA transcript, thereby interfering with translation and thus interfering with protein expression. Reduces or inhibits the production of the C6700, B7032N, or B9320 polypeptide product encoded by the B7032N, or B9320 gene. Thus, siRNA molecules of the invention can be defined by their ability to specifically hybridize under stringent conditions to mRNA or cDNA derived from the C6700, B7032N, or B9320 gene. For the purposes of the present invention, the terms “hybridize” or “specifically hybridize” are used to refer to the ability of two nucleic acid molecules to hybridize under “stringent hybridization conditions”. The phrase “stringent hybridization conditions” refers to a nucleic acid molecule that hybridizes to its target sequence, typically in a complex mixture of nucleic acids, but is detectable to other sequences. It refers to conditions that are considered not to soy. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. The longer the sequence, the more specifically it hybridizes at higher temperatures. Extensive guidance on nucleic acid hybridization can be found in Tijssen, (1993) Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”. Generally, stringent conditions are selected to be about 5-10 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength pH. Tm is the temperature (at a defined ionic strength, pH, and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe complementary to the target at equilibrium will hybridize to the target sequence (because there is an excess of target sequence at Tm) 50% of the probes are in equilibrium). Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide. For selective or specific hybridization, a positive signal is at least twice background, preferably 10 times background hybridization. Exemplary stringent hybridization conditions may be as follows: incubation at 50 ° C., 50% formamide, 5 × SSC, and 1% SDS at 42 ° C. with a wash with 0.2 × SSC and 0.1% SDS , Or 5 × SSC, 1% SDS, 65 ° C. incubation.

好ましくは、本発明のsiRNAは、約500ヌクレオチド長未満、約200ヌクレオチド長未満、約100ヌクレオチド長未満、約50ヌクレオチド長未満、または約25ヌクレオチド長未満である。好ましくは、siRNAは約19〜約25ヌクレオチド長である。C6700、B7032N、またはB9320 siRNAの作製のための核酸配列の例には、標的配列としてのSEQ ID NO: 43、47、81、106、または110のヌクレオチドの配列がそれぞれ含まれる。さらに、siRNAの阻害活性を上昇させるために、標的配列のアンチセンス鎖の3'末端にヌクレオチド「u」を付加することができる。付加される「u」の数は少なくとも約2個であり、一般的には約2個から約10個であり、好ましくは約2個から約5個である。付加された「u」は、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端で一本鎖を形成する。   Preferably, the siRNA of the invention is less than about 500 nucleotides in length, less than about 200 nucleotides in length, less than about 100 nucleotides in length, less than about 50 nucleotides in length, or less than about 25 nucleotides in length. Preferably, the siRNA is about 19 to about 25 nucleotides in length. Examples of nucleic acid sequences for production of C6700, B7032N, or B9320 siRNA include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110, respectively, as the target sequence. Furthermore, in order to increase the inhibitory activity of siRNA, nucleotide “u” can be added to the 3 ′ end of the antisense strand of the target sequence. The number of “u” added is at least about 2, generally from about 2 to about 10, and preferably from about 2 to about 5. The added “u” forms a single strand at the 3 ′ end of the antisense strand of the siRNA.

細胞は、C6700V2の転写変異体としてのC6700遺伝子、B7032N、またはB9320を発現するか過剰発現する、任意の細胞である。細胞は、腎細胞などの上皮細胞である。または、細胞は、癌腫、腺癌、芽腫、白血病、骨髄腫、または肉腫などの腫瘍細胞である。細胞は、腎細胞癌である。   The cell is any cell that expresses or overexpresses the C6700 gene, B7032N, or B9320 as a transcriptional variant of C6700V2. The cell is an epithelial cell such as a kidney cell. Alternatively, the cell is a tumor cell such as a carcinoma, adenocarcinoma, blastoma, leukemia, myeloma, or sarcoma. The cell is renal cell carcinoma.

C6700、B7032N、またはB9320のsiRNAは、mRNA転写物と結合できる形態で、細胞内に直接導入することができる。または、C6700、B7032N、またはB9320のsiRNAをコードするDNAを、ベクター中に含めてもよい。   C6700, B7032N, or B9320 siRNA can be introduced directly into cells in a form that can bind to mRNA transcripts. Alternatively, DNA encoding siRNA of C6700, B7032N, or B9320 may be included in the vector.

ベクターは、例えば、C6700、B7032N、またはB9320標的配列を、C6700、B7032N、またはB9320配列に隣接する機能的に連結された調節配列を有する発現ベクター中に、（DNA分子の転写により）両鎖の発現が可能になるような様式でクローニングすることによって作製される（Lee, N.S., et al., (2002) Nature Biotechnology 20 : 500-5）。C6700、B7032N、またはB9320 mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子を第1のプロモーター（例えば、クローニングされたDNAの3'側のプロモーター配列）によって転写させ、C6700、B7032N、またはB9320 mRNAに対してセンス鎖であるRNA分子を第2のプロモーター（例えば、クローニングされたDNAの5'側のプロモーター配列）によって転写させる。センス鎖およびアンチセンス鎖をインビボでハイブリダイズさせて、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子のサイレンシングのためのsiRNA構築物を作製する。あるいは、2つの構築物を利用してsiRNA構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製することができる。クローニングされたC6700、B7032N、またはB9320は、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を有するような、例えばヘアピンなどの二次構造を有する構築物をコードすることができる。   The vector is, for example, a C6700, B7032N, or B9320 target sequence, in an expression vector having a functionally linked regulatory sequence adjacent to the C6700, B7032N, or B9320 sequence (by transcription of the DNA molecule). It is produced by cloning in a manner that allows expression (Lee, NS, et al., (2002) Nature Biotechnology 20: 500-5). An RNA molecule that is antisense to C6700, B7032N, or B9320 mRNA is transcribed by a first promoter (eg, a promoter sequence 3 ′ of the cloned DNA) and against C6700, B7032N, or B9320 mRNA The RNA molecule that is the sense strand is transcribed by a second promoter (for example, a promoter sequence on the 5 ′ side of the cloned DNA). The sense and antisense strands are hybridized in vivo to create siRNA constructs for silencing the C6700, B7032N, or B9320 gene. Alternatively, two constructs can be utilized to generate the sense and antisense strands of the siRNA construct. The cloned C6700, B7032N, or B9320 encodes a construct with a secondary structure, such as a hairpin, such that a single transcript has both sense and complementary antisense sequences from the target gene Can do.

ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列をセンス配列とアンチセンス配列の間に配置してもよい。したがって、本発明はまた、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有するsiRNAを提供し、式中、[A]は、C6700、B7032N、またはB9320由来のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列に対応するリボヌクレオチド配列である。好ましい態様において、[A]は、SEQ ID NO: 43、47、81、106、または110のヌクレオチドからなる群より選択される配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、
[B]は、3個から23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、
[A']は、[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である。 In order to form a hairpin loop structure, a loop sequence consisting of an arbitrary nucleotide sequence may be arranged between the sense sequence and the antisense sequence. Thus, the present invention also provides a general formula
5 '-[A]-[B]-[A']-3 '
Wherein [A] is a ribonucleotide sequence corresponding to a sequence that specifically hybridizes to mRNA or cDNA derived from C6700, B7032N, or B9320. In a preferred embodiment, [A] is a ribonucleotide sequence corresponding to a sequence selected from the group consisting of the nucleotides of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110;
[B] is a ribonucleotide sequence consisting of 3 to 23 nucleotides,
[A ′] is a ribonucleotide sequence consisting of the complementary sequence of [A].

領域[A]は[A']にハイブリダイズし、次いで、領域[B]からなるループが形成される。ループ配列は、好ましくは、約3〜約23ヌクレオチド長でありうる。ループ配列は、例えば、以下の配列からなる群より選択することができる(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列もまた、活性siRNAを提供する(Jacque, JM., et al., (2002) Nature 418: 435-8)。
CCC、CCACC、またはCCACACC：Jacque, JM., et al., (2002) Nature, 418: 435-8
UUCG：Lee, NS., et al., (2002) Nature Biotechnology 20: 500-5. Fruscoloni, P., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 1639-44
UUCAAGAGA：Dykxhoorn, DM., et al., (2003) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67 Region [A] hybridizes to [A ′], and then a loop consisting of region [B] is formed. The loop sequence can preferably be about 3 to about 23 nucleotides in length. The loop sequence can be selected, for example, from the group consisting of the following sequences (http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html). In addition, a loop sequence consisting of 23 nucleotides also provides active siRNA (Jacque, JM., Et al., (2002) Nature 418: 435-8).
CCC, CCACC, or CCACACC: Jacque, JM., Et al., (2002) Nature, 418: 435-8
UUCG: Lee, NS., Et al., (2002) Nature Biotechnology 20: 500-5. Fruscoloni, P., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 1639-44
UUCAAGAGA: Dykxhoorn, DM., Et al., (2003) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67

例えば、本発明のヘアピンループ構造を有する好ましいsiRNAを以下に示す。以下の構造では、ループ配列を、CCC、UUCG、CCACC、CCACACC、およびUUCAAGAGAからなる群より選択することができる。好ましいループ構造はUUCAAGAGA（DNAでは「ttcaagaga」）である。
CTACCTCTTCAGACTCAGC-[B]-GCTGAGTCTGAAGAGGTAG（SEQ ID NO: 43の標的配列に対して）
CCATGTGAGCACTTGGATG-[B]-CATCCAAGTGCTCACATGG（SEQ ID NO: 47の標的配列に対して）
GCAGCAACGTTGCAGCACA-[B]-TGTGCTGCAACGTTGCTGC（SEQ ID NO: 81の標的配列に対して）
GAGGACAATCCAGACGGCT-[B]-AGCCGTCTGGATTGTCCTC（SEQ ID NO: 106の標的配列に対して）
GGAGCTCTACAACGTGCTG-[B]-CAGCACGTTGTAGAGCTCC（SEQ ID NO: 110の標的配列に対して） For example, preferable siRNAs having the hairpin loop structure of the present invention are shown below. In the following structure, the loop sequence can be selected from the group consisting of CCC, UUCG, CCACC, CCACACC, and UUCAAGAGA. A preferred loop structure is UUCAAGAGA (“ttcaagaga” in DNA).
CTACCTCTTCAGACTCAGC- [B] -GCTGAGTCTGAAGAGGTAG (for the target sequence of SEQ ID NO: 43)
CCATGTGAGCACTTGGATG- [B] -CATCCAAGTGCTCACATGG (for the target sequence of SEQ ID NO: 47)
GCAGCAACGTTGCAGCACA- [B] -TGTGCTGCAACGTTGCTGC (for the target sequence of SEQ ID NO: 81)
GAGGACAATCCAGACGGCT- [B] -AGCCGTCTGGATTGTCCTC (for the target sequence of SEQ ID NO: 106)
GGAGCTCTACAACGTGCTG- [B] -CAGCACGTTGTAGAGCTCC (for the target sequence of SEQ ID NO: 110)

C6700、B7032N、またはB9320配列に隣接する調節配列は、その発現が独立して調節される、または一時的もしくは空間的に調節されうるように、同じまたは異なりうる。siRNAは、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子鋳型を、たとえば低分子核RNA（snRNA）U6からのRNAポリメラーゼIII転写単位、またはヒトH1 RNAプロモーターを含むベクターにクローニングすることによって細胞内で転写されてもよい。ベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強物質を用いることができる。FuGENE（Roche Diagnostics）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）、Oligofectamine（Invitrogen）、およびNucleofector（Wako pure Chemical）は、トランスフェクション増強物質として有用である。   The regulatory sequences flanking the C6700, B7032N, or B9320 sequence can be the same or different so that their expression can be independently regulated or can be temporally or spatially regulated. siRNA can also be transcribed intracellularly by cloning the C6700, B7032N, or B9320 gene template into a vector containing, for example, the RNA polymerase III transcription unit from small nuclear RNA (snRNA) U6, or the human H1 RNA promoter. Good. To introduce the vector into the cell, a transfection enhancing substance can be used. FuGENE (Roche Diagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen), and Nucleofector (Wako pure Chemical) are useful as transfection enhancers.

オリゴヌクレオチド、およびC6700、B7032N、またはB9320 mRNAの様々な部分と相補的なオリゴヌクレオチドを、インビトロで、標準的な方法に従って腫瘍細胞（たとえば、腎細胞癌（RCC）細胞株のような腎細胞株を用いて）においてC6700、B7032N、またはB9320の産生をそれぞれ減少させる能力に関して試験した。候補組成物の非存在下で培養した細胞と比較して候補siRNA組成物に接触させた細胞におけるC6700、B7032N、またはB9320遺伝子産物の低減は、C6700、B7032N、もしくはB9320の特異的抗体または他の検出戦略を用いて検出することができる。次に、インビトロ細胞ベースアッセイまたはインビトロ無細胞アッセイにおいてC6700、B7032N、またはB9320の産生を減少させる配列を、細胞成長に及ぼすその阻害効果に関して試験する。インビトロ細胞ベースアッセイにおいて細胞成長を阻害する配列をインビボでラットまたはマウスにおいて試験して、C6700、B7032N、またはB9320産生の減少および悪性新生物を有する動物における腫瘍細胞成長の減少を確認する。   Oligonucleotides and oligonucleotides complementary to various parts of C6700, B7032N, or B9320 mRNA in vitro according to standard methods in tumor cells (eg renal cell lines such as renal cell carcinoma (RCC) cell lines) Were tested for the ability to reduce the production of C6700, B7032N, or B9320, respectively. Reduction of the C6700, B7032N, or B9320 gene product in cells contacted with the candidate siRNA composition as compared to cells cultured in the absence of the candidate composition is a C6700, B7032N, or B9320 specific antibody or other It can be detected using a detection strategy. Next, sequences that reduce the production of C6700, B7032N, or B9320 in in vitro cell-based assays or in vitro cell-free assays are tested for their inhibitory effects on cell growth. Sequences that inhibit cell growth in an in vitro cell-based assay are tested in vivo in rats or mice to confirm a decrease in C6700, B7032N, or B9320 production and a decrease in tumor cell growth in animals with malignant neoplasms.

悪性腫瘍を処置する方法：
C6700、B7032N、またはB9320を過剰発現するという特徴を有する腫瘍を有する患者は、C6700、B7032N、またはB9320のsiRNAを投与することによって処置してもよい。siRNA治療は、たとえば腎細胞癌（RCC）に罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者におけるC6700、B7032N、またはB9320の発現を阻害するために用いてもよい。そのような患者は、特定の腫瘍タイプに関する標準的な方法によって同定してもよい。腎細胞癌（RCC）は、たとえばCT、MRI、ERCP、MRCP、コンピューター断層撮影、または超音波によって診断してもよい。処置によって、アップレギュレートされた遺伝子の発現の低減、または対象における腫瘍の大きさ、広がり、もしくは転移能の減少のような臨床的利益が引き起こされれば、処置は有効であると見なされる。処置を予防的に適用する場合、「有効な」とは、処置が腫瘍の形成を遅らせるもしくは予防する、または腫瘍の臨床症状を予防もしくは軽減することを意味する。有効性は、特定の腫瘍タイプを診断または処置するための任意の公知の方法に関連して決定される。 Methods for treating malignant tumors:
Patients with tumors characterized by overexpression of C6700, B7032N, or B9320 may be treated by administering C6700, B7032N, or B9320 siRNA. siRNA therapy may be used, for example, to inhibit the expression of C6700, B7032N, or B9320 in patients suffering from or at risk for developing renal cell carcinoma (RCC). Such patients may be identified by standard methods for specific tumor types. Renal cell carcinoma (RCC) may be diagnosed by, for example, CT, MRI, ERCP, MRCP, computed tomography, or ultrasound. A treatment is considered effective if the treatment causes a clinical benefit, such as a reduction in the expression of an up-regulated gene, or a reduction in tumor size, spread, or metastatic potential in the subject. When the treatment is applied prophylactically, “effective” means that the treatment delays or prevents the formation of the tumor or prevents or reduces the clinical symptoms of the tumor. Efficacy is determined in connection with any known method for diagnosing or treating a particular tumor type.

siRNA治療は、本発明のsiRNAをコードする標準的なベクター、および／または合成siRNA分子を送達することによるような遺伝子送達系によって、siRNAを患者に投与することによって行ってもよい。典型的に、合成siRNA分子は、インビボでヌクレアーゼ分解を予防するために化学的に安定化される。化学的に安定化されたRNA分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。典型的に、そのような分子には、リボヌクレアーゼの作用を予防する改変骨格およびヌクレオチドが含まれる。その他の修飾も可能であり、例えば、コレステロールと結合させたsiRNAは、改良された薬理学的特性を示す（Song et al., (2003) Nature Med. 9:347-51）。適切な遺伝子送達システムとしては、リポソーム、受容体媒介送達システム、またはウイルスベクター(例えば、特に、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)を挙げることができる。   siRNA therapy may be performed by administering the siRNA to the patient by a standard vector encoding the siRNA of the invention and / or gene delivery system such as by delivering a synthetic siRNA molecule. Typically, synthetic siRNA molecules are chemically stabilized to prevent nuclease degradation in vivo. Methods for preparing chemically stabilized RNA molecules are well known in the art. Typically, such molecules include modified backbones and nucleotides that prevent the action of ribonucleases. Other modifications are possible, for example, siRNA conjugated to cholesterol shows improved pharmacological properties (Song et al., (2003) Nature Med. 9: 347-51). Suitable gene delivery systems can include liposomes, receptor-mediated delivery systems, or viral vectors (eg, particularly herpes viruses, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses).

治療用核酸組成物は、薬学的に許容される担体中に製剤化されうる。治療用組成物は上述の遺伝子送達システムを含んでもよい。薬学的に許容される担体は、動物への投与に適した、生物学的に適合するビヒクル（例えば生理食塩水）である。化合物の治療的有効量とは、処置された動物における、アップレギュレートされる遺伝子産物の産生の減少、細胞成長（例えば増殖）の減少、または、腫瘍成長の減少などの、医学的に望ましい結果を生じることが可能な量である。   The therapeutic nucleic acid composition can be formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. The therapeutic composition may comprise the gene delivery system described above. A pharmaceutically acceptable carrier is a biologically compatible vehicle (eg, saline) suitable for administration to animals. A therapeutically effective amount of a compound is a medically desirable result, such as decreased production of an upregulated gene product, decreased cell growth (eg, proliferation), or decreased tumor growth in a treated animal. Is an amount that can produce

静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内の送達経路を介する非経口投与を用いて、C6700、B7032N、またはB9320のsiRNA組成物を送達してもよい。腎細胞癌の処置に関しては、腎動脈の直接注入が特に好ましい。   Parenteral administration via intravenous, subcutaneous, intramuscular, and intraperitoneal delivery routes may be used to deliver C6700, B7032N, or B9320 siRNA compositions. For the treatment of renal cell carcinoma, direct injection of the renal artery is particularly preferred.

任意の患者への投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の核酸、性別、投与時間および経路、身体全体の健康、ならびに同時に投与されている他の薬物などの多くの要因に左右される。核酸の静脈内投与のための用量は、核酸分子約106〜1022コピーである。 Dosage to any patient is such as patient size, body surface area, age, specific nucleic acid to be administered, sex, administration time and route, overall health, and other drugs being administered at the same time It depends on many factors. The dose for intravenous administration of nucleic acids is about 10 6 to 10 22 copies of the nucleic acid molecule.

本発明のポリヌクレオチドは、筋肉または皮膚などの組織の間質腔への注射、循環または体腔への導入、または吸入もしくはガス注入などの、標準的な方法によって投与されうる。ポリヌクレオチドは一般に、注射されるか、またはさもなくば、薬学的に許容される液体担体（例えば、水溶性または部分的に水溶性の液体担体）と共に動物に送達される。ポリヌクレオチドはさらに、リポソーム（例えば、陽イオン性または陰イオン性のリポソーム）と結合させることができる。本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターなどの、標的細胞による発現に必要な遺伝情報を含む。   The polynucleotides of the invention can be administered by standard methods, such as injection into the interstitial space of tissues such as muscle or skin, introduction into the circulation or body cavity, or inhalation or insufflation. The polynucleotide is generally injected or otherwise delivered to the animal along with a pharmaceutically acceptable liquid carrier (eg, a water-soluble or partially water-soluble liquid carrier). The polynucleotide can further be bound to liposomes (eg, cationic or anionic liposomes). The polynucleotide of the present invention contains genetic information necessary for expression by a target cell, such as a promoter.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、かつしたがって、本発明のポリペプチドの生物活性を抑制するのに有用である。同様に、発現阻害剤、例えば本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、それらが本発明のポリペプチドの生物活性を阻害できるという点において有用である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は、腎細胞癌を処置するのに有用である。   The antisense oligonucleotides or siRNAs of the invention are useful for inhibiting the expression of the polypeptides of the invention and, therefore, for suppressing the biological activity of the polypeptides of the invention. Similarly, expression inhibitors, such as the antisense oligonucleotides or siRNAs of the invention are useful in that they can inhibit the biological activity of the polypeptides of the invention. Accordingly, a composition comprising an antisense oligonucleotide or siRNA of the present invention is useful for treating renal cell carcinoma.

または、RCCにおいて過剰発現された遺伝子の一つまたは複数の遺伝子産物の機能は、該遺伝子産物に結合する化合物、またはさもなければ該遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって阻害されうる。例えば、化合物は、過剰発現された遺伝子産物の1つまたは複数に結合する抗体であってもよい。   Alternatively, the function of one or more gene products of a gene overexpressed in RCC can be inhibited by administering a compound that binds to the gene product or otherwise inhibits the function of the gene product. . For example, the compound may be an antibody that binds to one or more of the overexpressed gene products.

本発明では、抗体、特にアップレギュレートされたマーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体、またはそのような抗体の断片の使用に言及する。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗体を合成するために用いられる抗原（すなわちアップレギュレートされたマーカー遺伝子の遺伝子産物）と、またはそれに近縁の抗原のみと相互作用する（すなわち結合する）、特異的構造を有する免疫グロブリン分子を指す。さらに抗体は、それがマーカー遺伝子にコードされるタンパク質の一つまたは複数に結合する限り、抗体断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、または、HおよびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Fv（scFv）であってもよい(Huston J. S. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：5879-83)。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインやペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co MS. et al., (1994) J. Immunol. 152:2968-76; Better M. and Horwitz AH. (1989) Methods Enzymol. 178:476-96; Pluckthun A. and Skerra A. (1989) Methods Enzymol. 178:497-515; Lamoyi E. (1986) Methods Enzymol. 121:652-63; Rousseaux J. et al., (1986) Methods Enzymol. 121:663-9; Bird RE. and Walker BW. (1991) Trends Biotechnol. 9:132-7を参照されたい)。 The present invention refers to the use of antibodies, particularly antibodies to proteins encoded by up-regulated marker genes, or fragments of such antibodies. As used herein, the term “antibody” interacts only with the antigen used to synthesize the antibody (ie, the gene product of an up-regulated marker gene) or with closely related antigens (ie, Refers to an immunoglobulin molecule having a specific structure. Furthermore, the antibody may be an antibody fragment or a modified antibody so long as it binds to one or more of the proteins encoded by the marker gene. For example, an antibody fragment may be Fab, F (ab ′) 2 , Fv, or a single chain Fv (scFv) in which Fv fragments from H and L chains are linked by a suitable linker (Huston JS et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83). More specifically, an antibody fragment can be prepared by treating an antibody with an enzyme such as papain or pepsin. Alternatively, a gene encoding the antibody fragment can be constructed, inserted into an expression vector, and expressed in an appropriate host cell (eg, Co MS. Et al., (1994) J. Immunol. 152: 2968- 76; Better M. and Horwitz AH. (1989) Methods Enzymol. 178: 476-96; Pluckthun A. and Skerra A. (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi E. (1986) Methods Enzymol. 121 : 652-63; Rousseaux J. et al., (1986) Methods Enzymol. 121: 663-9; Bird RE. And Walker BW. (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-7).

抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することにより得られる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。   Antibodies can be modified by conjugation with various molecules such as polyethylene glycol (PEG). The present invention provides such modified antibodies. The modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody. These modification methods are routine in the art.

または、抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域ならびにヒト抗体に由来する定常領域を有するキメラ抗体、または、非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR）、および定常領域を有するヒト化抗体を含んでもよい。そのような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。   Alternatively, the antibody may be a chimeric antibody having a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody, or a complementarity determining region (CDR) derived from a non-human antibody, or a framework region derived from a human antibody. (FR) and humanized antibodies with constant regions may also be included. Such antibodies can be prepared using known techniques.

癌細胞において起こる特異的な分子変化に対する癌治療は、進行乳癌を処置するためのトラスツズマブ（ハーセプチン）、慢性骨髄性白血病のためのイマチニブメチレート（グリーベック）、非小細胞肺癌（NSCLC）のためのゲフィチニブ（イレッサ）、ならびにB細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫のためのリツキシマブ（抗CD20 mAb）のような抗癌剤の臨床開発および規制認可によって確認されている(Ciardiello F and Tortora G. (2001) Clin Cancer Res.;7:2958-70. Review.; Slamon DJ, et al., (2001) N Engl J Med.;344:783-92; Rehwald U, et al., (2003) Blood.;101:420-4; Fang G, et al., (2000) Blood, 96, 2246-53)。これらの薬物は、形質転換した細胞のみを標的とすることから、臨床的に有効であり、従来の抗癌剤より許容性が良好である。したがって、そのような薬剤は、癌患者の生存および生活の質を改善するのみならず、分子標的癌治療の考え方が正当であることを証明している。さらに、標的化された薬物は、それと共に使用した場合の標準的化学療法の効果を増大させる（Gianni L. (2002) Oncology, 63 Suppl 1, 47-56; Klejman A, et al., (2002) Oncogene, 21, 5868-76）。したがって、将来の癌治療はおそらく、従来の薬剤を血管新生および浸潤性のような腫瘍細胞の様々な特徴をねらった標的特異的薬剤と併用することを含むであろう。   Cancer therapies for specific molecular changes that occur in cancer cells are for trastuzumab (Herceptin) for treating advanced breast cancer, imatinib methylate (Gleevec) for chronic myeloid leukemia, non-small cell lung cancer (NSCLC) Confirmed by clinical development and regulatory approval of anticancer agents such as gefitinib (Iressa) and rituximab (anti-CD20 mAb) for B-cell and mantle cell lymphoma (Ciardiello F and Tortora G. (2001) Clin Cancer Res.; 7: 2958-70. Review .; Slamon DJ, et al., (2001) N Engl J Med.; 344: 783-92; Rehwald U, et al., (2003) Blood.; 101: 420 -4; Fang G, et al., (2000) Blood, 96, 2246-53). Since these drugs target only transformed cells, they are clinically effective and better tolerated than conventional anticancer agents. Thus, such drugs not only improve the survival and quality of life of cancer patients, but also prove that the idea of molecular targeted cancer treatment is justified. In addition, targeted drugs increase the efficacy of standard chemotherapy when used with it (Gianni L. (2002) Oncology, 63 Suppl 1, 47-56; Klejman A, et al., (2002 ) Oncogene, 21, 5868-76). Thus, future cancer treatments will likely involve combining conventional drugs with target-specific drugs that target various characteristics of tumor cells such as angiogenesis and invasiveness.

これらの調節法は、エクスビボもしくはインビトロで行うことができ（例えば、細胞を物質とともに培養することにより）、またはインビボで行うこともできる（例えば、物質を対象に投与することにより）。これらの方法は、差次的に発現する遺伝子の異常な発現またはそれら遺伝子産物の異常な活性を相殺する治療として、タンパク質もしくはタンパク質の組み合わせ、または核酸分子もしくは核酸分子の組み合わせを投与する段階を含む。   These modulation methods can be performed ex vivo or in vitro (eg, by culturing cells with the substance) or in vivo (eg, by administering the substance to a subject). These methods include administering a protein or a combination of proteins, or a nucleic acid molecule or a combination of nucleic acid molecules as a treatment that counteracts the abnormal expression of differentially expressed genes or the abnormal activity of their gene products. .

（疾患または障害に罹患していない者と比較して）遺伝子および遺伝子産物の発現レベルまたは生物活性それぞれが上昇していることを特徴とする疾患および障害は、過剰発現される一つまたは複数の遺伝子の活性に拮抗する（すなわち、それを低下させるまたは阻害する）治療剤によって処置されうる。活性に拮抗する治療剤は、治療的または予防的に投与することができる。   Diseases and disorders characterized by elevated levels of expression and biological activity of genes and gene products, respectively (as compared to those not afflicted with the disease or disorder), are one or more overexpressed It can be treated with a therapeutic agent that antagonizes (ie, reduces or inhibits) the activity of the gene. A therapeutic agent that antagonizes activity can be administered therapeutically or prophylactically.

したがって、本発明の文脈において利用されうる治療剤には、例えば以下が含まれる：（i）RCC関連遺伝子のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片もしくは相同体；（ii）過剰発現される遺伝子または遺伝子産物に対する抗体；（iii）過剰発現されるまたは低発現される1つまたは複数の遺伝子をコードする核酸；（iv）アンチセンス核酸、または「機能欠損」である核酸（すなわち、1つまたは複数の過剰発現される遺伝子の核酸内部への非相同的挿入のため）；（v）低分子干渉RNA（siRNA）；または（vi）調節物質（すなわち、過剰発現/低発現されるポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、阻害物質、アゴニスト、アンタゴニスト）。機能不全アンチセンス分子は、相同組換えによってポリペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するために利用される(例えば、Capecchi, (1989) Science 244: 1288-92を参照されたい)。   Thus, therapeutic agents that can be utilized in the context of the present invention include, for example: (i) a polypeptide of an RCC-related gene, or an analog, derivative, fragment or homologue thereof; (ii) overexpressed An antibody against a gene or gene product; (iii) a nucleic acid encoding one or more genes that are overexpressed or underexpressed; (iv) an antisense nucleic acid, or a nucleic acid that is “deficient in function” (ie, one Or for non-homologous insertion of multiple overexpressed genes into nucleic acids); (v) small interfering RNA (siRNA); or (vi) regulators (ie, overexpressed / underexpressed polypeptides) Inhibitors, agonists, antagonists) that alter the interaction between and its binding partner. A dysfunctional antisense molecule is utilized to “knock out” the endogenous function of a polypeptide by homologous recombination (see, eg, Capecchi, (1989) Science 244: 1288-92).

（疾患または障害を有さない者と比較して）レベルまたは生物活性それぞれが減少していることを特徴とする疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち活性に対するアゴニストである）治療剤によって処置されうる。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で投与されうる。利用可能な治療剤には、ポリペプチド（またはその類似体、誘導体、断片もしくは相同体）、または、生物学的利用能を増加させるアゴニストが含まれるが、これらに限定されない。   Diseases and disorders characterized by decreased levels or biological activity (compared to those without disease or disorder), respectively, are treated with therapeutic agents that increase activity (ie are agonists of activity). Can be done. A therapeutic agent that upregulates activity can be administered in a therapeutic or prophylactic manner. Available therapeutic agents include, but are not limited to, polypeptides (or analogs, derivatives, fragments or homologues thereof) or agonists that increase bioavailability.

レベルの上昇または低下は、（例えば生検組織から）患者の組織試料を採取してこれをRNAまたはペプチドのレベル、発現されたペプチド（または発現が変化した遺伝子のmRNA）の構造および/または活性に関してインビトロでアッセイすることにより、ペプチドおよび/またはRNAを定量することによって、容易に検出することができる。当技術分野において周知の方法には、免疫学的分析（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等)、および/またはmRNAの発現を検出するためのハイブリダイゼーション分析（例えば、ノーザン分析、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等）が含まれるが、これらに限定されない。   Increased or decreased levels can be obtained by taking a patient tissue sample (eg, from a biopsy tissue) and using it for RNA or peptide level, expressed peptide (or mRNA of a gene with altered expression) structure and / or activity. Can be readily detected by quantifying peptides and / or RNA. Methods well known in the art include immunological analysis (eg, Western blot analysis, post-immunoprecipitation sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, immunocytochemistry, etc.), and / or mRNA expression. Hybridization analysis for detection (eg, Northern analysis, dot blot, in situ hybridization, etc.) is included, but is not limited to these.

予防的投与は、疾患または障害の出現が妨げられるかまたはその進行が遅れるように、疾患の明瞭な臨床症状が現れる前に行う。   Prophylactic administration occurs before the manifestation of clear clinical symptoms of the disease so that the appearance of the disease or disorder is prevented or slowed down.

本発明の治療法は、細胞と、差次的に発現する遺伝子の遺伝子産物の活性のうち一つまたは複数を調節する作用物質とを接触させる段階を含んでもよい。タンパク質活性を調節する作用物質の例には、核酸もしくはタンパク質、これらのタンパク質の天然同族リガンド、ペプチド、ペプチド模倣物、またはその他の小分子が含まれるが、これらに限定されない。例えば、適切な作用物質は、差次的に低発現される一つまたは複数の遺伝子のタンパク質活性のうち一つまたは複数を刺激しうる。   The therapeutic methods of the present invention may include contacting the cell with an agent that modulates one or more of the gene product activities of the differentially expressed genes. Examples of agents that modulate protein activity include, but are not limited to, nucleic acids or proteins, natural cognate ligands of these proteins, peptides, peptidomimetics, or other small molecules. For example, a suitable agent can stimulate one or more of the protein activities of one or more genes that are differentially underexpressed.

本発明はまた、対象における腎細胞癌を処置または予防する方法にも関し、該方法は、RCC 1〜251（すなわちアップレギュレートされるRCC遺伝子）からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを該対象に投与する段階を含む。ポリペプチドの投与により、対象において抗腫瘍免疫が誘導される。抗腫瘍免疫を誘導するためには、それを必要とする対象に、RCC 1〜251からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを投与する。ポリペプチドまたはその免疫活性断片はRCCに対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはその断片を、T細胞受容体（TCR）と結合した形態で、または、マクロファージ、樹状細胞（DC）もしくはB細胞などの抗原提示細胞（APC）によって提示された形態で投与することもできる。DCの抗原提示能力は強いため、APCの中でもDCの使用が最も好ましい。   The present invention also relates to a method for treating or preventing renal cell carcinoma in a subject, which method is encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of RCC 1-251 (ie, an upregulated RCC gene). Administering to the subject a vaccine comprising a polypeptide, an immunologically active fragment of such a polypeptide, or a polynucleotide encoding such a polypeptide or fragment. Administration of the polypeptide induces anti-tumor immunity in the subject. In order to induce anti-tumor immunity, a subject in need thereof is treated with a polypeptide encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of RCC 1-251, an immunoactive fragment of such a polypeptide, or Or a polynucleotide encoding the polypeptide or fragment thereof. The polypeptide or immunologically active fragment thereof is useful as a vaccine against RCC. In some cases, the protein or fragment thereof is in a form bound to a T cell receptor (TCR) or presented by an antigen presenting cell (APC) such as a macrophage, dendritic cell (DC) or B cell. It can also be administered. Since DC has a strong antigen-presenting ability, DC is most preferable among APCs.

本発明において、RCCに対するワクチンとは、動物に接種すると抗腫瘍免疫を誘導する能力を有する物質を指す。本発明によると、RCC 1〜251にコードされるポリペプチドまたはその断片は、RCC 1〜251を発現するRCC細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導する可能性のあるHLA-A24またはHLA-A*0201拘束性エピトープペプチドであることが示唆された。このように、本発明はまた、ポリペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法も含む。一般に、抗腫瘍免疫は以下のような免疫応答を含む：
-腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
-腫瘍を認識する抗体の誘導、および
-抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。 In the present invention, a vaccine against RCC refers to a substance having the ability to induce anti-tumor immunity when inoculated into an animal. According to the present invention, a polypeptide encoded by RCC 1-251 or a fragment thereof is HLA-A24 or a fragment that may induce a strong and specific immune response against RCC cells expressing RCC 1-251. It was suggested that this is an HLA-A * 0201 restricted epitope peptide. Thus, the present invention also includes a method of inducing anti-tumor immunity using a polypeptide. In general, anti-tumor immunity includes the following immune responses:
-Induction of cytotoxic lymphocytes against the tumor,
-Induction of antibodies that recognize tumors, and
-Induction of anti-tumor cytokine production.

したがって、あるタンパク質が、動物への接種時にこれらの免疫応答のいずれか一つを誘導する場合、そのタンパク質は、抗腫瘍免疫誘導効果を有すると判定される。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、そのタンパク質に対する宿主における免疫系の応答をインビボまたはインビトロで観察することによって検出できる。   Thus, if a protein induces any one of these immune responses upon inoculation to an animal, it is determined that the protein has an anti-tumor immunity inducing effect. Induction of anti-tumor immunity by a protein can be detected by observing in vivo or in vitro the response of the immune system in the host to the protein.

例えば、細胞傷害性Tリンパ球の誘導を検出する方法は周知である。特に、生体内に入る外来物質は、抗原提示細胞(APC)の作用によってT細胞およびB細胞に提示される。APCによって提示された抗原に対して抗原特異的な様式で応答するT細胞は、該抗原による刺激によって細胞障害性T細胞（または細胞障害性Tリンパ球；CTL）に分化した後、増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、あるペプチドによるCTL誘導は、APCによってペプチドをT細胞に提示し、CTLの誘導を検出することによって、評価することができる。さらに、APCは、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果を有する。またCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は抗腫瘍免疫性においても重要なので、これらの細胞の活性化効果を指標として用いることによって、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用を評価することができる。   For example, a method for detecting the induction of cytotoxic T lymphocytes is well known. In particular, foreign substances entering the living body are presented to T cells and B cells by the action of antigen presenting cells (APC). T cells that respond to an antigen presented by APC in an antigen-specific manner are differentiated into cytotoxic T cells (or cytotoxic T lymphocytes; CTLs) by stimulation with the antigen, and then proliferate ( This is called T cell activation). Therefore, CTL induction by a certain peptide can be evaluated by presenting the peptide to T cells by APC and detecting the induction of CTL. Furthermore, APC has the effect of activating CD4 + T cells, CD8 + T cells, macrophages, eosinophils, and NK cells. Since CD4 + T cells and CD8 + T cells are also important in antitumor immunity, the antitumor immunity inducing action of peptides can be evaluated by using the activation effect of these cells as an index.

樹状細胞（DC）をAPCとして用いてCTLの誘導作用を評価する方法は、当技術分野で周知である。DCは、APCの中で最も強いCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法において、被験ポリペプチドを最初にDCに接触させ、その後このDCにT細胞を接触させる。DCとの接触後に対象の細胞に対して細胞傷害作用を有するT細胞が検出されることは、該被験ポリペプチドが細胞傷害性T細胞を誘導する活性を有することを示す。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば51Cr標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いることによって、検出できる。あるいは、3H-チミジンの取り込み活性またはLDH（ラクトースデヒドロゲナーゼ）の放出を指標として用いることによって腫瘍細胞損傷の程度を評価する方法も周知である。 A method for evaluating the inducing action of CTL using dendritic cells (DC) as APC is well known in the art. DC is a representative APC having the strongest CTL inducing action among APCs. In this method, the test polypeptide is first contacted with DC, and then this DC is contacted with T cells. The detection of T cells having a cytotoxic effect on target cells after contact with DC indicates that the test polypeptide has an activity of inducing cytotoxic T cells. The activity of CTL against tumor can be detected, for example, by using lysis of 51 Cr-labeled tumor cells as an indicator. Alternatively, a method for evaluating the degree of tumor cell damage by using 3 H-thymidine uptake activity or LDH (lactose dehydrogenase) release as an index is also well known.

DCのほかに、末梢血単核球（PBMC）をAPCとして使用することもできる。GM-CSFおよびIL-4の存在下でPBMCを培養することによってCTLの誘導が増大することが報告されている。同様に、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下でPBMCを培養することによってCTLが誘導されることも示されている。   In addition to DC, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) can also be used as APC. It has been reported that culturing PBMC in the presence of GM-CSF and IL-4 increases the induction of CTL. Similarly, it has been shown that CTL is induced by culturing PBMC in the presence of keyhole limpet hemocyanin (KLH) and IL-7.

これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された被験ポリペプチドは、DC活性化効果およびその後のCTL誘導活性を有するポリペプチドであると見なされる。したがって、腫瘍細胞に対してCTLを誘導するポリペプチドは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドとの接触によって腫瘍に対するCTLの誘導能を獲得したAPCも、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチド抗原の提示によって細胞障害性を獲得したCTLも、腫瘍に対するワクチンとして用いることができる。APCおよびCTLによる抗腫瘍免疫を用いた、腫瘍に対するそのような治療法は、細胞性免疫療法と呼ばれる。   A test polypeptide confirmed to have CTL-inducing activity by these methods is considered to be a polypeptide having a DC activation effect and a subsequent CTL-inducing activity. Therefore, polypeptides that induce CTL against tumor cells are useful as vaccines against tumors. Furthermore, APCs that have acquired the ability to induce CTLs against tumors by contact with polypeptides are also useful as vaccines against tumors. Furthermore, CTLs that have acquired cytotoxicity due to presentation of polypeptide antigens by APC can also be used as vaccines against tumors. Such a treatment for tumors using anti-tumor immunity with APC and CTL is called cellular immunotherapy.

一般に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組み合わせてそれらをDCに接触させることによって、CTL誘導効率が上昇することが知られている。したがって、DCをタンパク質断片で刺激する場合、複数種類の断片の混合物を用いることが有利である。   In general, when using polypeptides for cellular immunotherapy, it is known that the efficiency of CTL induction is increased by combining a plurality of polypeptides having different structures and bringing them into contact with DC. Therefore, when stimulating DC with protein fragments, it is advantageous to use a mixture of multiple types of fragments.

または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することで確認できる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が該ポリペプチドで免疫した実験動物において誘導される場合、および腫瘍細胞の増殖がそれらの抗体によって抑制される場合、該ポリペプチドは、抗腫瘍免疫の誘導能を有すると見なされる。   Alternatively, the induction of anti-tumor immunity by the polypeptide can be confirmed by observing the induction of antibody production against the tumor. For example, when an antibody against a polypeptide is induced in an experimental animal immunized with the polypeptide, and when growth of tumor cells is suppressed by the antibody, the polypeptide has the ability to induce anti-tumor immunity. Considered.

抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することによって誘導され、かつ抗腫瘍免疫の誘導によりRCCの処置および予防が可能になる。癌の治療または癌の発症の予防には、癌性細胞の増殖の阻害、癌の退縮、および癌の発生抑制のような段階のいずれかが含まれる。同様に、癌を有する個体の死亡率または疾病率の低下、血液中の腫瘍マーカーレベルの低下、癌に伴う検出可能な症状の軽減なども、癌の処置または予防に含まれる。このような治療効果および予防効果は、統計的に有意であることが好ましい。例えば、細胞増殖性疾患に対するワクチンの治療効果または予防効果をワクチン投与を行わない対照と比較する観察において、5％またはそれ未満は有意水準である。例えば、スチューデントt検定、マン-ホイットニーのU検定、またはANOVAを統計解析に用いることができる。   Anti-tumor immunity is induced by administering the vaccine of the present invention, and induction of anti-tumor immunity enables treatment and prevention of RCC. Treatment of cancer or prevention of cancer development includes any of stages such as inhibition of cancerous cell growth, cancer regression, and suppression of cancer development. Similarly, reduction of mortality or morbidity in individuals with cancer, reduction of tumor marker levels in blood, reduction of detectable symptoms associated with cancer, etc. are also included in the treatment or prevention of cancer. Such therapeutic and prophylactic effects are preferably statistically significant. For example, 5% or less is a significant level in observations comparing the therapeutic or prophylactic effect of vaccines against cell proliferative diseases with controls that do not receive vaccines. For example, Student's t test, Mann-Whitney U test, or ANOVA can be used for statistical analysis.

免疫活性を有する上記のタンパク質または該タンパク質をコードするベクターを、アジュバントと併用してもよい。アジュバントとは、免疫活性を有するタンパク質と同時に（または連続的に）投与した場合、該タンパク質に対する免疫応答を増大させる化合物を意味する。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等が含まれるがこれらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適切に組み合わせることができる。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩液、リン酸緩衝液、培養液等が含まれるが、それらに限定されない。さらに、必要に応じて、ワクチンは、安定化剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤等を含んでもよい。ワクチンは、全身投与または局所投与され得る。ワクチン投与には、単回投与、または複数回の追加投与が含まれうる。   The above-mentioned protein having immunological activity or a vector encoding the protein may be used in combination with an adjuvant. An adjuvant refers to a compound that, when administered simultaneously (or sequentially) with a protein having immune activity, increases the immune response to the protein. Examples of adjuvants include, but are not limited to, cholera toxin, salmonella toxin, alum and the like. Furthermore, the vaccine of the present invention can be appropriately combined with a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of such carriers include, but are not limited to, sterilized water, physiological saline, phosphate buffer, culture fluid, and the like. Furthermore, if necessary, the vaccine may contain a stabilizer, a suspending agent, a preservative, a surfactant and the like. The vaccine can be administered systemically or locally. Vaccine administration can include a single dose or multiple additional doses.

本発明のワクチンとしてAPCまたはCTLを用いる場合、例えばエクスビボ法によって腫瘍を処置または予防することができる。より具体的には、処置または予防を受けている対象のPBMCを採取し、細胞をエクスビボでポリペプチドに接触させ、APCまたはCTLの誘導後に、細胞を該対象に投与してもよい。またAPCは、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでPBMCに導入することによって誘導することもできる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、投与前にクローニングすることができる。標的細胞を障害する活性が高い細胞をクローニングして増殖させることによって、細胞免疫療法を、より効果的に実施することができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLを、該細胞が由来する個体に対してのみならず、他の個体由来の類似のタイプの腫瘍に対する細胞免疫療法のために用いてもよい。   When APC or CTL is used as the vaccine of the present invention, a tumor can be treated or prevented by, for example, an ex vivo method. More specifically, PBMCs of a subject undergoing treatment or prevention may be collected, the cells may be contacted with the polypeptide ex vivo, and the cells may be administered to the subject after induction of APC or CTL. APC can also be induced by introducing a vector encoding a polypeptide into PBMCs ex vivo. In vitro induced APCs or CTLs can be cloned prior to administration. Cell immunotherapy can be performed more effectively by cloning and proliferating cells with high activity that damage target cells. Furthermore, APCs and CTLs isolated in this way may be used for cellular immunotherapy against similar types of tumors from other individuals as well as individuals from which the cells are derived.

さらに、本発明のポリペプチドの薬学的有効量を含む、癌のような細胞増殖性疾患を処置または予防するための薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、抗腫瘍免疫を惹起するために用いてもよい。   Further provided is a pharmaceutical composition for treating or preventing a cell proliferative disease, such as cancer, comprising a pharmaceutically effective amount of the polypeptide of the present invention. The pharmaceutical composition may be used to elicit anti-tumor immunity.

RCCまたは悪性RCCを阻害するための薬学的組成物：
本発明の文脈において、適切な製剤には、経口、直腸内、鼻腔内、局所（口腔内および舌下を含む）、膣内、もしくは非経口（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）投与に適した製剤、または吸入もしくはガス注入による投与に適した製剤が含まれる。静脈内投与が好ましい。製剤は任意で、個別の用量単位に包装される。 Pharmaceutical compositions for inhibiting RCC or malignant RCC:
In the context of the present invention, suitable formulations include oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sublingual), vaginal, or parenteral (including intramuscular, subcutaneous, and intravenous) administration. Or formulations suitable for administration by inhalation or insufflation. Intravenous administration is preferred. The formulation is optionally packaged in individual dosage units.

経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれ所定量の活性成分を含む、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれる。適切な製剤にはまた、粉剤、顆粒剤、溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。活性成分は、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、結合剤、増量剤、潤滑剤、崩壊剤および／または湿潤剤のような従来の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、任意で1つもしくは複数の製剤成分を用いて、圧縮または成形により作製することができる。圧縮錠は、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤および/または分散剤と混合した活性成分を、適切な機械の内部で、粉剤または顆粒剤のような自由流動形状で圧縮することによって、調製されうる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適切な機械の内部で成形することによって、作製されうる。錠剤は、当技術分野で周知の方法にしたがって被覆することができる。経口液体調製物は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳液、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形態であってもよく、または、使用前に水もしくは他の適したビヒクルで構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含みうる）、および/または保存剤のような従来の添加剤を含んでもよい。錠剤は任意で、活性成分の遅延放出または制御放出を提供するように調製してもよい。錠剤の包装は、毎月1回服用されるべき1個の錠剤を含んでよい。   Pharmaceutical formulations suitable for oral administration include capsules, cachets or tablets each containing a predetermined amount of the active ingredient. Suitable formulations also include powders, granules, solutions, suspensions, and emulsions. The active ingredient may be administered as a bolus, electuary or paste. Tablets and capsules for oral administration may contain conventional excipients such as binders, fillers, lubricants, disintegrants and / or wetting agents. A tablet may be made by compression or molding, optionally with one or more pharmaceutical ingredients. Compressed tablets are free of active ingredients, optionally mixed with binders, lubricants, inert diluents, lubricants, surfactants and / or dispersants, such as powders or granules, within a suitable machine. It can be prepared by compressing in fluid form. Molded tablets may be made by molding in a suitable machine a mixture of the powdered compound moistened with an inert liquid diluent. The tablets can be coated according to methods well known in the art. Oral liquid preparations may be in the form of, for example, aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups, or elixirs, or for constitution with water or other suitable vehicle prior to use. It may be provided as a dry product. Such liquid preparations may contain conventional additives such as suspending agents, emulsifying agents, non-aqueous vehicles (which may include edible oils), and / or preservatives. Tablets may optionally be prepared to provide delayed or controlled release of the active ingredient. Tablet packaging may include one tablet to be taken once a month.

非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、制菌剤、および該製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性の滅菌注射剤、ならびに、懸濁剤および/または濃化剤を含んでもよい水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器中に、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に提供されてもよく、かつ、使用直前に滅菌液体担体（例えば生理食塩水や注射用水）を添加すればよいだけの凍結乾燥条件で貯蔵されてもよい。または、製剤を持続注入用に提供することができる。即時調合注射溶液および懸濁液は、既に説明した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。   Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injections that may contain antioxidants, buffers, antibacterial agents, and solutes that render the formulation isotonic with the blood of the intended recipient. As well as aqueous and non-aqueous sterile suspensions that may contain suspending agents and / or thickeners. The formulation may be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as in sealed ampoules and vials, and if a sterile liquid carrier (eg, saline or water for injection) is added just prior to use. It may be stored under as good lyophilization conditions. Alternatively, the formulation can be provided for continuous infusion. Extemporaneous injection solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules, and tablets of the kind previously described.

直腸投与に適した製剤には、カカオバターまたはポリエチレングリコールのような標準的な担体を含む坐剤が含まれる。口内、例えば口腔内または舌下への局所投与に適した製剤には、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントのような着香基剤に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアカシアのような基剤に活性成分を含む香錠が含まれる。鼻腔内投与の場合、本発明の化合物を液体スプレー、分散性の粉末、または点鼻剤の形態で用いてもよい。点鼻剤は、一つまたは複数の分散剤、溶解剤、および/または懸濁剤を含んでもよい水性または非水性の基剤と共に製剤化されうる。   Formulations suitable for rectal administration include suppositories containing standard carriers such as cocoa butter or polyethylene glycol. Formulations suitable for topical administration in the mouth, eg, buccal or sublingual, include sucrose and a lozenge containing the active ingredient in a flavoring base such as acacia or tragacanth and gelatin and glycerin or sucrose and acacia. Such bases include pastilles containing the active ingredient. For intranasal administration, the compounds of the invention may be used in the form of liquid sprays, dispersible powders, or nasal drops. Nasal drops may be formulated with an aqueous or non-aqueous base which may contain one or more dispersing agents, solubilizing agents, and / or suspending agents.

吸入投与の場合、吹入器、ネブライザー、加圧パック、または、エアロゾルスプレーを送達する他の従来の手段によって、本発明の化合物を都合よく送達することができる。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、または他の適切なガスなどの適切な噴射剤を含んでもよい。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するバルブを提供することで決定することができる。   For inhalation administration, the compounds of the invention can be conveniently delivered by insufflator, nebulizer, pressurized pack, or other conventional means of delivering an aerosol spray. The pressurized pack may include a suitable propellant such as dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide, or other suitable gas. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve that delivers a fixed amount.

あるいは、吸入またはガス注入による投与の場合、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば該化合物と乳糖またはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物の形状をとってもよい。粉末組成物は、単位投与剤形で、例えば、吸入器または注入器によって粉末が投与され得るカプセル剤、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックの形状で、提供されてもよい。   Alternatively, for administration by inhalation or insufflation, the compounds may take the form of a dry powder composition, for example a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch. The powder composition may be provided in unit dosage form, for example in the form of a capsule, cartridge, gelatin or blister pack in which the powder can be administered by inhaler or insufflator.

その他の製剤には、治療薬を放出する、移植可能な装置および粘着性パッチなどが含まれる。   Other formulations include implantable devices and adhesive patches that release therapeutic agents.

望ましい場合、活性成分が徐放性となるように適合化させた上記の製剤を使用することができる。薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤および／または保存剤のような他の活性成分を含んでもよい。   If desired, the above formulations adapted to provide sustained release of the active ingredient can be used. The pharmaceutical composition may also contain other active ingredients such as antibacterial agents, immunosuppressive agents and / or preservatives.

上記で特に言及した成分の他に、本発明の製剤には、当該製剤のタイプに関して当技術分野において従来的な他の作用物質が含まれていてもよいと理解すべきである。例えば経口投与に適した製剤は着香料を含んでいてもよい。   In addition to the ingredients specifically mentioned above, it should be understood that the formulations of the present invention may include other agents conventional in the art with respect to the type of formulation. For example, formulations suitable for oral administration may contain flavoring agents.

好ましい単位投与製剤は、下記に引用される、有効量またはその適切な一部の活性成分を含む製剤である。   Preferred unit dosage formulations are those containing an effective amount, or an appropriate portion thereof, as quoted below.

上記の条件のそれぞれに関して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、約0.1〜約250 mg/kg/日の用量範囲で、経口でまたは注射によって投与され得る。成人の用量範囲は一般に、約5 mg〜約17.5 g/日であり、好ましくは約5 mg〜約10 g/日であり、最も好ましくは約100 mg〜約3 g/日である。個別の単位で提供される錠剤または他の単位投与剤形は、便宜上、該投与量でまたはその複数回投与量として有効性を示すような量、例えば約5 mg〜約500 mg、通常は約100 mg〜約500 mgを含む単位量を含む。   For each of the above conditions, compositions, such as polypeptides and organic compounds, can be administered orally or by injection at a dose range of about 0.1 to about 250 mg / kg / day. The adult dose range is generally about 5 mg to about 17.5 g / day, preferably about 5 mg to about 10 g / day, and most preferably about 100 mg to about 3 g / day. Tablets or other unit dosage forms provided in discrete units may conveniently be in an amount that will be effective at that dose or as multiple doses thereof, such as from about 5 mg to about 500 mg, usually about Includes unit doses from 100 mg to about 500 mg.

使用される用量は、対象の年齢および性別、処置される正確な疾患、およびその重篤度を含む、いくつかの要因に左右される。投与経路もまた、条件およびその重篤度によって変動しうる。いずれにしても、適切で最適な投与量は、当業者により、上述の要因を考慮した上で慣行的に計算され得る。   The dose used will depend on several factors, including the age and sex of the subject, the precise disease being treated, and its severity. The route of administration can also vary depending on the condition and its severity. In any event, an appropriate and optimal dose can be routinely calculated by one skilled in the art taking into account the factors discussed above.

さらに本発明のいくつかの局面を以下の実施例に記載しているが、これらは、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することを意図したものではない。以下の実施例は、RCC細胞において差次的に発現する遺伝子の同定および特徴決定についての説明である。   Furthermore, some aspects of the invention are described in the following examples, which are not intended to limit the scope of the invention described in the appended claims. The following examples are illustrative of the identification and characterization of genes that are differentially expressed in RCC cells.

レーザーマイクロダイセクションによって純粋に選択された明細胞RCC細胞および正常腎皮質細胞を用いた腎細胞癌の遺伝子発現プロファイルのゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイ分析：
腫瘍マーカーおよび治療的介入のための標的は、遺伝子27,648個を表すcDNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを分析することによって同定した。腎細胞癌は、様々な細胞成分を含む固体の塊として存在する。したがって、癌細胞をレーザーマイクロビームマイクロダイセクション（LMM）によって腎細胞癌15例から精製した。遺伝子発現プロファイルを調べて、正常な精製腎皮質細胞のプロファイルと比較した。これらの細胞集団は、これにより均一となった（95％より高く精製された細胞）。その結果、遺伝子251個が、腎細胞癌細胞において一般的にアップレギュレートされていると同定された。これらのアップレギュレートされた遺伝子の中には、RCCにおいて過剰発現されていると既に報告されていたCyclin-D1（CCND1）が含まれた（Hedberg Y., et al., (1999) Int. J. Cancer, 84: 268-72, 1999）この遺伝子は、本発明において、参考となるRCC症例15例中9例において過剰発現された。遺伝子721個は、腎細胞癌細胞において一般的にダウンレギュレートされていると同定された。 Genome-wide cDNA microarray analysis of gene expression profiles of renal cell carcinoma using clear cell RCC cells and normal renal cortical cells purely selected by laser microdissection:
Tumor markers and targets for therapeutic intervention were identified by analyzing gene expression profiles using a cDNA microarray representing 27,648 genes. Renal cell carcinoma exists as a solid mass containing various cellular components. Therefore, cancer cells were purified from 15 cases of renal cell carcinoma by laser microbeam microdissection (LMM). Gene expression profiles were examined and compared with those of normal purified renal cortical cells. These cell populations were thereby homogenized (cells purified to greater than 95%). As a result, 251 genes were identified as being generally upregulated in renal cell carcinoma cells. Among these up-regulated genes was Cyclin-D1 (CCND1), which was previously reported to be overexpressed in RCC (Hedberg Y., et al., (1999) Int. J. Cancer, 84: 268-72, 1999) This gene was overexpressed in 9 of the 15 RCC cases that served as reference in the present invention. 721 genes were identified as being generally down-regulated in renal cell carcinoma cells.

本発明は、初期の方法の限界の多くを克服している。したがって、本発明の遺伝子発現プロファイルは、非常に正確な癌の基準を構成する。第一に、様々な細胞成分が正常組織のみならず癌組織に存在することから、臨床試料を用いるマイクロアレイ分析は、これまで難しいことが証明されている。特に、腎細胞癌は様々な細胞成分を含む固形塊として存在するという特徴を有する。したがって、腎細胞癌塊および正常腎皮質細胞を用いる遺伝子発現プロファイルの分析は、腎細胞癌に関係する遺伝子の有意な増加または減少を隠す可能性がある、試験される組織において混合された細胞によって有意に影響を受ける。したがって、本発明においては、LMMシステムを用いて、外科標本から癌および正常上皮細胞を非常に高い純度（95％またはそれ以上）まで精製した。LMMによって単一の細胞でさえも微小切除することが可能であるため、この技術は、腎細胞癌標本の正確なマイクロアレイ解析にとって重要である。   The present invention overcomes many of the limitations of the initial method. Thus, the gene expression profiles of the present invention constitute a very accurate cancer criterion. First, microarray analysis using clinical samples has proven difficult to date because various cellular components are present in cancer tissue as well as normal tissue. In particular, renal cell carcinoma has a feature that it exists as a solid mass containing various cell components. Thus, analysis of gene expression profiles using renal cell carcinoma masses and normal renal cortical cells can be performed by cells mixed in the tissue being tested, which may mask significant increases or decreases in genes associated with renal cell carcinoma. Significantly affected. Therefore, in the present invention, the LMM system was used to purify cancer and normal epithelial cells from surgical specimens to very high purity (95% or better). This technique is important for accurate microarray analysis of renal cell carcinoma specimens because even single cells can be microdissected by LMM.

癌細胞および正常腎皮質細胞を注意深く精製して、その後RNAを単離し、cDNAマイクロアレイ解析を行うことによって、その発現が共通してアップレギュレートされた遺伝子251個が得られた（50％を超える癌症例において発現データを得ることができかつその発現比（Cy5/Cy3強度比）が5.0を上回る遺伝子；症例の33〜50％において計算できかつ症例の全てにおいて5.0を上回る発現比を示した遺伝子も評価した）。   Careful purification of cancer cells and normal renal cortical cells followed by RNA isolation and cDNA microarray analysis yielded 251 genes whose expression was commonly up-regulated (greater than 50%) Genes whose expression data can be obtained in cancer cases and whose expression ratio (Cy5 / Cy3 intensity ratio) exceeds 5.0; genes that can be calculated in 33-50% of cases and that have an expression ratio above 5.0 in all cases Was also evaluated).

本明細書において得られかつ記載されたプロファイルは、高度に精製された癌性細胞（腎細胞癌）の集団を解析し、最も関連する正常対照、すなわち正常腎皮質細胞の高度に精製された集団と比較することによって得られたので、初期のプロファイルと比較して改善を示す。初期の方法およびプロファイルは、初期のプロファイルの精度および信頼性を減少させる混入細胞の割合が高いことによって妨害された。本発明のプロファイルは、大規模な腎細胞癌に関する最初の正確なゲノム全体の遺伝子発現プロファイルである。これらのデータは、腎細胞癌を処置するための治療的調節のための分子標的、および癌または前癌状態の早期の正確な診断のための特異的新規腫瘍マーカーを同定する。   The profile obtained and described herein analyzes a highly purified population of cancerous cells (renal cell carcinoma) and the most relevant normal control, ie a highly purified population of normal renal cortical cells As compared to the initial profile, it shows an improvement. Early methods and profiles were hampered by the high percentage of contaminating cells that reduced the accuracy and reliability of the initial profile. The profile of the present invention is the first accurate genome-wide gene expression profile for large-scale renal cell carcinoma. These data identify molecular targets for therapeutic modulation to treat renal cell carcinoma and specific novel tumor markers for early accurate diagnosis of cancer or precancerous conditions.

特に定める場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したのと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全文が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合は、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のみを目的としており、制限を意図するものではない。   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

実施例
材料および方法：
さらに本発明を以下の実施例において説明するが、これは、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するものではない。 Example
Materials and methods:
The invention will be further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the appended claims.

患部組織から得た組織および正常組織を、発現に差のある遺伝子、または疾患状態、例えばRCCを同定するために評価した。アッセイ法は以下のように実施した。   Tissues obtained from affected tissues and normal tissues were evaluated to identify genes with differential expression or disease states, such as RCC. The assay was performed as follows.

患者、組織試料および細胞株
全ての患者がインフォームドコンセントを受け、インフォームドコンセントを得た患者15人（男性9人および女性6人；pT1 10例、pT2 2例、およびpT3 3例を含む明細胞腎細胞癌；平均年齢61.3歳、範囲36〜75歳）から腎細胞癌を得た（表１）。カルテから臨床情報を得て、それぞれの腫瘍を、病理学者が組織病理学的サブタイプおよび悪性度に従って診断した。各患者の臨床病期を、日本泌尿器学会の腎細胞癌に関する臨床病理研究のための一般規則に従って判断した。試料は全て、直ちに凍結して-80℃で保存した。腎細胞癌（Caki-1、Caki-2、786-O、A498、ACHN、769-P、A704、RXF-631L、OS-RC-2、TUHR10TKB、およびTUHRl4TKB）細胞に由来する細胞株および腎近位尿細管上皮細胞（RPTEC）を、10％ウシ胎児血清および1％抗生物質／抗真菌剤溶液を添加した適当な培地において単層で成長させ、5％CO2を含む空気中で37℃で維持した。 All patients, tissue samples and cell lines received informed consent and 15 patients with informed consent (9 males and 6 females; pT1 10 cases, pT2 2 cases, and pT3 3 cases) Renal cell carcinoma was obtained from cell renal cell carcinoma; mean age 61.3 years, range 36-75 years (Table 1). Obtaining clinical information from the medical records, each tumor was diagnosed by a pathologist according to histopathological subtype and grade. The clinical stage of each patient was determined according to the general rules for clinical pathology studies on renal cell carcinoma of the Japanese Urological Association. All samples were immediately frozen and stored at -80 ° C. Cell lines derived from renal cell carcinoma (Caki-1, Caki-2, 786-O, A498, ACHN, 769-P, A704, RXF-631L, OS-RC-2, TUHR10TKB, and TUHRl4TKB) Peripheral tubular epithelial cells (RPTEC) are grown in monolayers in an appropriate medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic / antimycotic solution at 37 ° C. in air containing 5% CO 2. Maintained.

（表１）RCC患者の臨床病理学的特色

Figure 2009502112
(Table 1) Clinicopathological features of RCC patients
Figure 2009502112

組織試料およびLMM
試料はTissueTek OCT媒質（Sakura）中に包埋し、使用時まで-80℃で保存した。凍結標本をクリオスタットで連続的に切片化して8μmの切片とし、解析する領域を規定するためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。癌細胞と非癌細胞の交差汚染を避けるために、EZ Cut LMM System（SL Microtest GmbH）を製造元のプロトコールにいくつかの修正を加えて用いることによって、これら2つの集団を調製した。貯蔵工程および組織採取の間の影響を最小化するために、癌組織を同じ手順によって慎重に取り扱った。RNAの質を調べるために、各症例の残りの組織から抽出した全RNAを変性アガロースゲル中で電気泳動し、リボソームRNAバンドの存在によってそれらの質を確認した。 Tissue samples and LMM
Samples were embedded in TissueTek OCT medium (Sakura) and stored at −80 ° C. until use. Frozen specimens were serially sectioned with a cryostat into 8 μm sections and stained with hematoxylin and eosin to define the area to be analyzed. To avoid cross-contamination of cancer and non-cancer cells, these two populations were prepared by using the EZ Cut LMM System (SL Microtest GmbH) with some modifications to the manufacturer's protocol. To minimize the impact between the storage process and tissue collection, cancer tissue was handled carefully by the same procedure. To examine RNA quality, total RNA extracted from the remaining tissues of each case was electrophoresed in a denaturing agarose gel and their quality was confirmed by the presence of ribosomal RNA bands.

RNA抽出およびT7に基づくRNA増幅
レーザーで捕捉した細胞の各集団から全RNAを抽出し、350μlのRLT可溶化緩衝液（QIAGEN）に入れた。抽出したRNAを、30単位のDNase I（QIAGEN）により室温で30分間処理した。70℃において10分間失活させた後に、製造元の推奨に従ってRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用い、RNAを精製した。DNase Iで処理したRNAの全てを、Ampliscribe T7 Transcription Kit （Epicentre Technologies）を用いた、T7に基づく増幅に供した。2回の増幅により、各試料に関して41.5〜163.4μgの増幅RNA（aRNA）が得られたが、一方、本発明者らが11例の腎臓癌患者由来の正常腎皮質からRNAを増幅した場合には、合計477.0μgが得られた。癌性細胞および正常腎皮質細胞にそれぞれ由来するaRNAの2.5μgアリコートを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTP（Amersham Biosciences）の存在下で逆転写させた。 Total RNA was extracted from each population of cells captured with RNA extraction and RNA amplification laser based on T7 and placed in 350 μl RLT solubilization buffer (QIAGEN). The extracted RNA was treated with 30 units of DNase I (QIAGEN) for 30 minutes at room temperature. After inactivation at 70 ° C. for 10 minutes, RNA was purified using RNeasy Mini Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's recommendations. All of the RNA treated with DNase I was subjected to T7-based amplification using the Ampliscribe T7 Transcription Kit (Epicentre Technologies). Two rounds of amplification resulted in 41.5-163.4 μg of amplified RNA (aRNA) for each sample, while we amplified RNA from normal kidney cortex from 11 kidney cancer patients. A total of 477.0 μg was obtained. 2.5 μg aliquots of aRNA from cancerous cells and normal renal cortical cells, respectively, were reverse transcribed in the presence of Cy5-dCTP and Cy3-dCTP (Amersham Biosciences), respectively.

cDNAマイクロアレイ
スライドガラス上にスポットするためのcDNAを得るために、本発明者らは、以前に記載された通り、各遺伝子に対してRT-PCRを行った（Kitahara O, et al., (2001) Cancer Res;61:3544-9）。高密度Microarray Spotter Lucidea（GE Healthcare, Amersham Biosciences）を用いてPCR産物をタイプVIIスライドガラス（GE Healthcare, Amersham Biosciences, Buckinghamshire UK）上にスポットした；9,216遺伝子を1枚のスライドガラス上に2通りスポットした。3種類の異なるスライドセット（計27,648遺伝子のスポット）を調製した；そのそれぞれに、同じ52種類のハウスキーピング遺伝子および2種類の陰性対照遺伝子も含めた。cDNAプローブは、以前に記載された様式でaRNAから調製した（Okabe H, et al., (2001) Cancer Res;61:2129-37）。ハイブリダイゼーション実験のために、各癌組織からおよび対照から増幅したRNA（aRNA）7.5μgを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTP（GE Healthcare, Amersham Biosciences）の存在下で逆転写させた。ハイブリダイゼーション、洗浄、及びシグナルの検出は、以前に記載された様式で実施した（Okabe H, et al., (2001) Cancer Res;61:2129-37）。 In order to obtain cDNA for spotting on cDNA microarray slides, we performed RT-PCR for each gene as previously described (Kitahara O, et al., (2001 ) Cancer Res; 61: 3544-9). PCR products were spotted on type VII glass slides (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Buckinghamshire UK) using a high-density Microarray Spotter Lucidea (GE Healthcare, Amersham Biosciences); 9,216 genes were spotted in duplicate on one glass slide did. Three different slide sets (a total of 27,648 gene spots) were prepared; each included the same 52 housekeeping genes and two negative control genes. cDNA probes were prepared from aRNA in the manner previously described (Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61: 2129-37). For hybridization experiments, 7.5 μg of RNA (aRNA) amplified from each cancer tissue and from controls was reverse transcribed in the presence of Cy5-dCTP and Cy3-dCTP (GE Healthcare, Amersham Biosciences), respectively. Hybridization, washing, and signal detection were performed in the manner previously described (Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61: 2129-37).

ハイブリダイゼーションおよびデータの収集
全てのプロセスを自動スライドプロセッサ（Amersham Biosciences）で実施したことを除き、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、以前に記述されたプロトコールに従って行った（Ono K., et al., (2000) Cancer Res, 60: 5007-11）。 Hybridization and data collection Except that all processes were performed with an automated slide processor (Amersham Biosciences), hybridization and washing were performed according to previously described protocols (Ono K., et al., (2000 ) Cancer Res, 60: 5007-11).

スポット27,648個からのCy3およびCy5のシグナル強度を定量して、ArrayVisionソフトウェア（Imaging Research, Inc., St. Catharines, Ontario, Canada）を用いてバックグラウンドを差し引くことによって解析した。続いて、各標的スポットに関するCy5（腫瘍）およびCy3（対照）の蛍光強度を、アレイ上の52個のハウスキーピング遺伝子の平均Cy3/Cy5比が1と等しくなるように調整した。低シグナル強度に由来するデータの信頼性は低いため、本発明者らは、以前記載されたように（Ono, K., et al., (2000) Cancer Res, 60: 5007-11）各スライドに対してカットオフ値を規定し、Cy3色素およびCy5色素の両方でカットオフ値よりも低いシグナル強度が得られた場合、その遺伝子を以降の分析から除外した。他の遺伝子に関して、本発明者らは、各試料の生データを用いてCy5/Cy3比を算出した。   The signal intensity of Cy3 and Cy5 from 27,648 spots was quantified and analyzed by subtracting the background using ArrayVision software (Imaging Research, Inc., St. Catharines, Ontario, Canada). Subsequently, the fluorescence intensity of Cy5 (tumor) and Cy3 (control) for each target spot was adjusted so that the average Cy3 / Cy5 ratio of 52 housekeeping genes on the array was equal to 1. Because the data derived from low signal intensity is unreliable, we performed each slide as previously described (Ono, K., et al., (2000) Cancer Res, 60: 5007-11). A cutoff value was defined for, and if both Cy3 and Cy5 dyes gave a signal intensity lower than the cutoff value, the gene was excluded from further analysis. For other genes, we calculated the Cy5 / Cy3 ratio using the raw data for each sample.

RCCにおいて共通してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子の同定
各遺伝子の相対的発現比（Cy5/Cy3強度比）を、4つのカテゴリーのいずれかに分類した：(A)アップレギュレートされた（発現比が＞5.0）；(B)ダウンレギュレートされた（発現比が＜0.2）；(C)変化なし（発現比が0.2〜5.0の間）；および(D)発現されず（またはわずかな発現はあるが検出用カットオフレベル未満）。これらのカテゴリーを用いて、試料間で発現比の変化が共通している遺伝子のセットを検出した。各群において共通してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる候補遺伝子を検出するために、27,648遺伝子の全体的な発現パターンをまずスクリーニングして、分類された群の50％超に存在しかつ発現比が＞5.0または＜0.2である遺伝子を選択した。 Identification of genes that are commonly up- or down-regulated in RCC The relative expression ratio (Cy5 / Cy3 intensity ratio) of each gene was classified into one of four categories: (A) Up-regulated (Expression ratio>5.0); (B) down-regulated (expression ratio <0.2); (C) unchanged (expression ratio between 0.2 and 5.0); and (D) not expressed (or Slight expression but below the detection cutoff level). These categories were used to detect a set of genes with common changes in expression ratio between samples. To detect candidate genes that are commonly up-regulated or down-regulated in each group, the overall expression pattern of 27,648 genes was first screened to be present and expressed in more than 50% of the classified groups Genes with a ratio> 5.0 or <0.2 were selected.

半定量RT-PCR
19のアップレギュレートされた遺伝子を選択し、半定量的RT-PCR実験を適用することによってそれらの発現レベルを調べた。各試料からのaRNAの1μgのアリコートを、ランダムプライマーおよびSuperscript II（Life Technologies, Inc.）を用いて一本鎖cDNAへと逆転写した。各cDNA混合物を、表2に示したプライマーセットを用いた次のPCR増幅のために希釈した。本マイクロアレイデータにおけるCy5/Cy3の変動が最も小さかったので、各遺伝子の発現を標準化するために、52種類のハウスキーピング遺伝子の中から、ファルネシル-ジホスフェートファルネシルトランスフェラーゼ1（FDFT1）を内部対照として選択した。産物の強度が確実に増幅の直線相（linear phase）に入るように、PCR反応のサイクル数を最適化した。 Semi-quantitative RT-PCR
Nineteen up-regulated genes were selected and their expression levels were examined by applying semi-quantitative RT-PCR experiments. A 1 μg aliquot of aRNA from each sample was reverse transcribed into single stranded cDNA using random primers and Superscript II (Life Technologies, Inc.). Each cDNA mixture was diluted for subsequent PCR amplification using the primer sets shown in Table 2. Since the variation of Cy5 / Cy3 in this microarray data was the smallest, farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1 (FDFT1) was selected from 52 housekeeping genes as an internal control to normalize the expression of each gene did. The number of cycles in the PCR reaction was optimized to ensure that the product intensity entered the linear phase of amplification.

（表２）半定量的RT-PCRのためのプライマー配列

Figure 2009502112
(Table 2) Primer sequences for semi-quantitative RT-PCR
Figure 2009502112

C6700は2つの異なる転写産物を有するので、以下のプライマーを用いて半定量的RT-PCRを実施して、どちらの変異体がRCC細胞内で過剰発現しているかを確認した：
C6700FV1 5'-GTCCCCACTGCTTTGAGATG-3' (SEQ ID NO: 37)、
C6700RV1 5'-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3' (SEQ ID NO: 12)；
C6700FV2 5'-GACTGTGCAGGGTTCAATCTC-3' (SEQ ID NO: 38)、
C6700RV2 5'-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3' (SEQ ID NO: 12)；
内部対照用のβ2-ミクログロブリン（β2MG）
5'-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3' (SEQ ID NO: 39)、
5'-TCACATGGTTCACACGGCAG-3' (SEQ ID NO: 40) 。 Since C6700 has two different transcripts, semi-quantitative RT-PCR was performed using the following primers to determine which mutant was overexpressed in RCC cells:
C6700FV1 5'-GTCCCCACTGCTTTGAGATG-3 '(SEQ ID NO: 37),
C6700RV1 5'-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3 '(SEQ ID NO: 12);
C6700FV2 5'-GACTGTGCAGGGTTCAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 38),
C6700RV2 5'-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3 '(SEQ ID NO: 12);
Β2-microglobulin (β2MG) for internal control
5'-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3 '(SEQ ID NO: 39),
5'-TCACATGGTTCACACGGCAG-3 '(SEQ ID NO: 40).

RCC細胞（786-O、A704、OS-RC-2、およびTUHR14TKB）におけるC6700V1およびC6700V2の発現レベルを調べるために、以下のプライマーセットを用いてRT-PCT実験を実施した：
5'-CTGGAAACAGCAGCCAGAG-3' (SEQ ID NO: 83) および5'-CAGTGCTGGCAAGACAGGTA-3' (SEQ ID NO: 84)。
産物の強度が確実に増幅の対数期内に入るように、PCR反応をサイクル数について最適化した。 To examine the expression levels of C6700V1 and C6700V2 in RCC cells (786-O, A704, OS-RC-2, and TUHR14TKB), RT-PCT experiments were performed using the following primer sets:
5'-CTGGAAACAGCAGCCAGAG-3 '(SEQ ID NO: 83) and 5'-CAGTGCTGGCAAGACAGGTA-3' (SEQ ID NO: 84).
The PCR reaction was optimized for cycle number to ensure product intensity was within the log phase of amplification.

B9320変異体の転写産物の発現レベルをRT-PCRによって更に確認するために、以下のプライマーセットを使用した：
変異体1: 5'-GGAGTGGGAACCGCAGAAC-3' (SEQ ID NO: 90) および
5'-GACCCCCACCTTCAAATCAC-3' (SEQ ID NO: 91)；
変異体2: 5'-GCTCGTGCTCGACAGGTGTGTA-3' (SEQ ID NO: 92) および
5'-CAGGTCATGGCCGGGTTC-3' (SEQ ID NO: 93)。
産物の強度が確実に増幅の対数期内に入るように、PCR反応をサイクル数について最適化した。 To further confirm the expression level of the transcript of the B9320 mutant by RT-PCR, the following primer set was used:
Variant 1: 5'-GGAGTGGGAACCGCAGAAC-3 '(SEQ ID NO: 90) and
5'-GACCCCCACCTTCAAATCAC-3 '(SEQ ID NO: 91);
Variant 2: 5'-GCTCGTGCTCGACAGGTGTGTA-3 '(SEQ ID NO: 92) and
5'-CAGGTCATGGCCGGGTTC-3 '(SEQ ID NO: 93).
The PCR reaction was optimized for cycle number to ensure product intensity was within the log phase of amplification.

ノーザンブロット分析
Micro-FastTrack（Invitrogen）を用いて腎細胞癌細胞株4例およびRPTEC細胞から単離した各mRNA、およびヒト正常組織ポリA(+)RNA（Clontech, Palo Alto, California）、心臓、肝臓、肺、腎臓、脳、および精巣の1μgのアリコットを1％変性アガロースゲルにおいて分離して、ナイロンメンブレンに転写した。このノーザンブロットおよびヒト多組織ノーザンブロット（Clontech, Palo Alto, CA）をまた、RT-PCRによって候補遺伝子の[α32P]-dCTP標識増幅産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は、供給元の推奨に従って実施した。ブロットを強化スクリーンによって-80℃で14日間オートラジオグラフを行った。特異的プローブは、表3に示される特異的プライマーセットを用いてPCRによって調製した。 Northern blot analysis
Each mRNA isolated from 4 renal cell carcinoma cell lines and RPTEC cells using Micro-FastTrack (Invitrogen), and human normal tissue poly A (+) RNA (Clontech, Palo Alto, California), heart, liver, lung 1 μg aliquots of kidney, brain, and testis were separated on a 1% denaturing agarose gel and transferred to a nylon membrane. This Northern blot and human multi-tissue Northern blot (Clontech, Palo Alto, Calif.) Were also hybridized with [α 32 P] -dCTP labeled amplification products of candidate genes by RT-PCR. Prehybridization, hybridization, and washing were performed according to the supplier's recommendations. Blots were autoradiographed at -80 ° C for 14 days with an intensifying screen. Specific probes were prepared by PCR using the specific primer sets shown in Table 3.

（表３）ノーザンプローブのためのプライマーの配列

Figure 2009502112
(Table 3) Primer sequence for Northern probe
Figure 2009502112

発現ベクターの構築
B7032NおよびB9320のオープンリーディングフレームの配列を、以下のプライマーによってKOD-Plus DNAポリメラーゼ（Toyobo, Osaka, Japan）を用いたPCRによって得た：B7032N-フォワード5'-AACGAATTCATGGCGTCCCCACGGGA-3'（SEQ ID NO: 97）（下線部はEcoRI制限酵素部位を示す）、および5'-CAACTCGAGCTGGTGAGCAGGCACCGTG-3'（SEQ ID NO: 98）（下線部はXhoI制限酵素部位を示す）、ならびにB9320-フォワード5'- CAAGAATTCATGTCGAGCCCGGGCATC-3'（SEQ ID NO:99）、および5'- GCTGAATTCACCTCAATGACGAGGCAGCGG-3'（SEQ ID NO, 100）（下線部はEcoR I制限酵素部位を示す）。B7032NのPCR産物を、pCAGGSsnH3F発現ベクターのEcoR IおよびXhoI部位に挿入した。B9320のPCR産物をpCAGGSsnH3F発現ベクターのEcoRI部位に挿入した。これらの構築物のDNA配列をDNAシークエンシングによって確認した。 Construction of expression vector
B7032N and B9320 open reading frame sequences were obtained by PCR using KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo, Osaka, Japan) with the following primers: B7032N-forward 5'-AACGAATTCATGGCGTCCCCACGGGA-3 '(SEQ ID NO: 97) (underlined EcoRI restriction enzyme site), and 5'-CAACTCGAGCTGGTGAGCAGGCACCGTG-3 '(SEQ ID NO: 98) (underlined XhoI restriction enzyme site), and B9320-forward 5'-CAAGAATTCATGTCGAGCCCGGGCATC- 3 ′ (SEQ ID NO: 99), and 5′-GCTGAATTCACCTCAATGACGAGGCAGCGG-3 ′ (SEQ ID NO, 100) (underlined indicates EcoR I restriction enzyme site). The B7032N PCR product was inserted into the EcoR I and XhoI sites of the pCAGGSsnH3F expression vector. The B9320 PCR product was inserted into the EcoRI site of the pCAGGSsnH3F expression vector. The DNA sequence of these constructs was confirmed by DNA sequencing.

免疫細胞化学分析
外因性の発現に関して、COS7細胞を5×104個/ウェルで播種した。24時間後および48時間後、FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche）を用いて製造元の説明書に従って、細胞を、pCAGGS-HA-B7032NまたはpCAGGS- HA-B9320 1 mgでCOS7細胞に一過性にトランスフェクトした。次に、細胞を4％パラホルムアルデヒドを含むPBS(-)によって4℃で15分間固定して、0.1％トリトンX-100を含むPBSによって4℃で2.5分間透過性にした。次に、細胞を3％BSAのPBS(-)溶液で4℃で12時間覆って、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックした。次に、B7032N-HAトランスフェクトCOS7細胞およびB9320-HAトランスフェクトCOS7細胞を、1：1000倍希釈のラット抗-HA抗体（SANTA CRUZ）と共にインキュベートした。PBS(-)によって洗浄後、トランスフェクト細胞を、1：3000倍希釈のAlexaFluro 488共役抗ラット二次抗体（Molecular Probe）によって染色した。核を4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドールジヒドロクロリド（DAPI）によって対比染色した。TCS SP2 AOBS顕微鏡（Leica, Tokyo, Japan）において蛍光画像を得た。 Immunocytochemical analysis COS7 cells were seeded at 5 × 10 4 cells / well for exogenous expression. After 24 and 48 hours, cells are transiently transfected into COS7 cells with 1 mg pCAGGS-HA-B7032N or pCAGGS-HA-B9320 using FuGENE 6 transfection reagent (Roche) according to the manufacturer's instructions. I did it. Cells were then fixed with PBS (−) containing 4% paraformaldehyde for 15 minutes at 4 ° C. and permeabilized with PBS containing 0.1% Triton X-100 for 2.5 minutes at 4 ° C. The cells were then covered with 3% BSA in PBS (−) for 12 hours at 4 ° C. to block nonspecific hybridization. Next, B7032N-HA transfected COS7 cells and B9320-HA transfected COS7 cells were incubated with a 1: 1000 dilution of rat anti-HA antibody (SANTA CRUZ). After washing with PBS (−), the transfected cells were stained with AlexaFluro 488 conjugated anti-rat secondary antibody (Molecular Probe) diluted 1: 3000. Nuclei were counterstained with 4 ′, 6′-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Fluorescence images were obtained with a TCS SP2 AOBS microscope (Leica, Tokyo, Japan).

ウェスタンブロット分析
B7032Nタンパク質およびB9320タンパク質を先に記述したようにそれぞれ、pCAGGS-nHA発現ベクターを用いてCOS7細胞へのトランスフェクションによって外因性に発現させた。全細胞溶解物をトランスフェクションのそれぞれ、24時間後および48時間後に回収した。トランスフェクトした細胞を溶解緩衝液（50 mmol/Lトリス（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L CHAPS、および0.1％プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII（Calbiochem）において溶解した。ホモジナイゼーションの後、細胞溶解物を氷上で30分インキュベートして14,000 rpmで15分間遠心して、上清のみを細胞片から分離した。総タンパク質の量をタンパク質アッセイキット（Bio-Rad, Hercules, CA）によって推定した後、タンパク質をSDS-試料緩衝液と共に混合して、沸騰させてから10％SDS-PAGEゲルにローディングした。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースメンブレン（GE Healthcare）にブロットした。タンパク質を含むメンブレンをブロッキング溶液によってブロックして、外因性のB7032Nタンパク質およびB9320タンパク質を検出するために、ラット抗HAモノクローナル抗体（SANTA CRUZ）と共にインキュベートした。最後に、メンブレンをHRP共役ラット二次抗体と共にインキュベートして、タンパク質バンドをECL検出試薬（GE Healthcare）によって可視化した。 Western blot analysis
B7032N protein and B9320 protein were exogenously expressed by transfection into COS7 cells, respectively, using the pCAGGS-nHA expression vector as described above. Total cell lysates were collected 24 and 48 hours after transfection, respectively. Transfected cells were lysed in lysis buffer (50 mmol / L Tris (pH 7.5), 150 mmol / L NaCl, 10 mmol / L CHAPS, and 0.1% protease inhibitor cocktail set III (Calbiochem). Homogenization. After that, the cell lysate was incubated on ice for 30 minutes, centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes, and only the supernatant was separated from the cell debris.The amount of total protein was determined by protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA). After estimation, the protein was mixed with SDS-sample buffer, boiled and loaded onto a 10% SDS-PAGE gel, and after electrophoresis, the protein was blotted onto a nitrocellulose membrane (GE Healthcare). Rat anti-HA monoclonal to block the membrane with blocking solution and detect exogenous B7032N and B9320 proteins Incubated with null antibody (SANTA CRUZ) Finally, the membrane was incubated with HRP-conjugated rat secondary antibody and the protein bands were visualized by ECL detection reagent (GE Healthcare).

PFKFB4を安定に発現するNIH3T3細胞の確立
B7032N発現ベクター、B9320発現ベクター、または偽ベクターを上記のようにFUGENE6を用いてNIH3T3細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を0.9 mg/mlゲネチシン（G418）（Invitrogen）を含む培養培地においてインキュベートした。クローンNIH3T3細胞を限界希釈によってサブクローニングした。HA-タグB7032NまたはHA-タグB9320の発現を、抗HAモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析によって査定した。最終的にいくつかのクローンを確立してB7032N-NIH3T3またはB9320-NIH3T3と命名した。B7032NまたはB9320の成長促進効果を調べるために、独立した四つのB7032N-NIH3T3細胞（B7032N-A、-B、-C、および-D）および独立した三つの偽-NIH3T3細胞（Mock-A、-B、および-C）、または独立した四つのB9320-NIH3T3細胞（B9320-1、-2、-3）、独立した三つのMock-NIH3T3細胞（Mock-1、-2、および-3）各5×103個を播種して、細胞の数を、Cell counting kit-8（同仁化学研究所、熊本、日本）によって、製造元の説明書に従って5日間毎日計数した。これらの実験は3度ずつ行った。 Establishment of NIH3T3 cells stably expressing PFKFB4
B7032N expression vector, B9320 expression vector, or mock vector was transfected into NIH3T3 cells using FUGENE6 as described above. Transfected cells were incubated in culture medium containing 0.9 mg / ml geneticin (G418) (Invitrogen). Clone NIH3T3 cells were subcloned by limiting dilution. The expression of HA-tag B7032N or HA-tag B9320 was assessed by Western blot analysis using anti-HA monoclonal antibodies. Finally several clones were established and named B7032N-NIH3T3 or B9320-NIH3T3. To examine the growth-promoting effect of B7032N or B9320, four independent B7032N-NIH3T3 cells (B7032N-A, -B, -C, and -D) and three independent pseudo-NIH3T3 cells (Mock-A,- B and -C), or four independent B9320-NIH3T3 cells (B9320-1, -2, -3), three independent Mock-NIH3T3 cells (Mock-1, -2, and -3) each 5 × 10 3 cells were seeded, and the number of cells was counted daily for 5 days by Cell counting kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) according to the manufacturer's instructions. These experiments were performed three times.

psiU6X3.0を用いたC6700、B7032N、およびB9320特異的siRNA発現ベクターの構築
ベクターに基づくRNAiシステムを、先の報告（WO2004076623；Shimokawa T, et al. Cancer Res. 2003;63:6116-20）に従って、C6700に関してpsiU6BX siRNA発現ベクターを用いて、ならびにB7032NおよびB9320に関してPsiH1BX siRNA発現ベクターを用いて確立した。C6700、B7032N、およびB9320に対するsiRNA発現ベクター（psiU6BX-C6700、psiHlBX-B7032N、またはpsiHlBX-B9320）を、表6における二本鎖オリゴヌクレオチドの、psiU6BXベクターのBbsI部位へのクローニングによって調製した。対照プラスミドpsiU6BX-Mock、Luc、Scramble、およびEGFPは、psiU6BX 3.0ベクターのBbsI部位に二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることによって調製した。 Construction of C6700, B7032N, and B9320-specific siRNA expression vectors using psiU6X3.0 An RNAi system based on a vector has been described according to previous reports (WO2004076623; Shimokawa T, et al. Cancer Res. 2003; 63: 6116-20). Established using the psiU6BX siRNA expression vector for C6700 and the PsiH1BX siRNA expression vector for B7032N and B9320. SiRNA expression vectors for C6700, B7032N, and B9320 (psiU6BX-C6700, psiHlBX-B7032N, or psiHlBX-B9320) were prepared by cloning the double-stranded oligonucleotides in Table 6 into the BbsI site of the psiU6BX vector. Control plasmids psiU6BX-Mock, Luc, Scramble, and EGFP were prepared by cloning a double stranded oligonucleotide into the BbsI site of the psiU6BX 3.0 vector.

C6700、B7032N、およびB9320の遺伝子サイレンシング効果
C6700に関してヒトRCC細胞株OS-RC-2、B7032Nに関してRXF-631LおよびA498、B9320に関してCaki-2およびA498を、10 cm培養皿（1×106個/皿）に播種して、FuGENE6試薬（Roche）を用いてLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて、供給元の推奨に従って、陰性対照としてのpsiU6BX-Mock、Luc、Scramble、およびEGFP、psiU6BX-C6700、psiU6BX-B7032N、ならびにpsiU6BX-B9320をトランスフェクトした。各構築物のトランスフェクション後10日目に細胞から総RNAを抽出した後、siRNAのノックダウン効果を、先に記述したようにC6700の共通領域に関する特異的プライマーを用いる半定量的RT-PCRによって確認した。トランスフェクトしたOS-RC-2細胞を、0.7 mg/mlネオマイシン（ゲネチシン；Gibco BRL Carlsbad, CA）を含む培地において選択した。次に、ゲネチシン選択の5日後に総RNAを細胞から抽出した後、以下の特異的プライマーセットを用いる半定量的RT-PCRによってsiRNAのノックダウン効果を試験した。
内部対照としての、フォワード 5'-AACTTAGAGGTGGGGAGCAG-3'（SEQ ID NO:85）及び
リバース 5'-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3'（SEQ ID NO:86）、ならびに、
C6700に対する、5'-TGACCTGTGCTTAGAAGTCCTTT-3'（SEQ ID NO:11）及び
5'-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3'（SEQ ID NO:12）；
B7032Nに対する、フォワード 5'-CGGTGGTCTCTCATCCTTGT-3'（SEQ ID NO:101）及び
リバース 5'-GCAACTCCTAACTCCCCTCTGTA-3'（SEQ ID NO:87）；
B9320に対するフォワード 5'-GCCTCGAGGTTATGCTTGAA-3'（SEQ ID NO:102）及び
リバース 5'-ATGCAGTCACTCACGCTCAG-3'（SEQ ID NO:103）
3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイにおいて、供給元のプロトコールに従って、トランスフェクションの7または14日後にCell-counting kit-8（同仁化学研究所、熊本、日本）を用いて細胞生存率を評価した。21日間インキュベートした後、これらの細胞を4％パラホルムアルデヒドによって固定して、コロニー形成アッセイのためにギムザ溶液によって染色した。 Gene silencing effect of C6700, B7032N, and B9320
Seed human RCC cell line OS-RC-2 for C6700, RXF-631L and A498 for B7032N, Caki-2 and A498 for B9320 in a 10 cm culture dish (1 × 10 6 cells / dish), and FuGENE6 reagent ( Roche) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) to transfect psiU6BX-Mock, Luc, Scramble, and EGFP, psiU6BX-C6700, psiU6BX-B7032N, and psiU6BX-B9320 as negative controls according to the supplier's recommendations did. After extracting total RNA from cells 10 days after transfection of each construct, the siRNA knockdown effect was confirmed by semi-quantitative RT-PCR using specific primers for the common region of C6700 as described above did. Transfected OS-RC-2 cells were selected in medium containing 0.7 mg / ml neomycin (Geneticin; Gibco BRL Carlsbad, CA). Next, 5 days after selection of geneticin, total RNA was extracted from the cells, and then the knockdown effect of siRNA was tested by semi-quantitative RT-PCR using the following specific primer set.
Forward 5′-AACTTAGAGGTGGGGAGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 85) and reverse 5′-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3 ′ (SEQ ID NO: 86) as internal controls, and
5'-TGACCTGTGCTTAGAAGTCCTTT-3 '(SEQ ID NO: 11) and C6700
5'-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3 '(SEQ ID NO: 12);
Forward 5'-CGGTGGTCTCTCATCCTTGT-3 '(SEQ ID NO: 101) and reverse 5'-GCAACTCCTAACTCCCCTCTGTA-3' (SEQ ID NO: 87) against B7032N;
Forward 5'-GCCTCGAGGTTATGCTTGAA-3 '(SEQ ID NO: 102) and reverse 5'-ATGCAGTCACTCACGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 103) for B9320
In the 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, Cell-counting kit-8 (7 or 14 days after transfection, according to the supplier's protocol) Cell viability was evaluated using Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan. After 21 days of incubation, these cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with Giemsa solution for colony formation assay.

結果
RCCにおいて一般的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子の同定
周囲の非癌性細胞、または非正常細胞の混入を防止するために、レーザーマイクロビームマイクロダイセクションを行って、腫瘍塊における癌細胞のみ、および正常腎皮質細胞に由来する細胞のみを選択した。図1において示すように、RCCの代表的な例を各臨床標本から顕微解剖した。これによって、本発明者らはその後の遺伝子発現プロファイルをより正確に得ることができる。 result
Identification of genes that are generally up- or down-regulated in RCC To prevent contamination with surrounding non-cancerous or non-normal cells, laser microbeam microdissection is performed to detect cancer in the tumor mass. Only cells and only cells derived from normal renal cortical cells were selected. As shown in FIG. 1, a representative example of RCC was microdissected from each clinical specimen. As a result, the present inventors can obtain a subsequent gene expression profile more accurately.

RCCの癌発生の基礎となるメカニズムを解明するために、RCCにおいて一般的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子をまず調べた。RCC 15例における遺伝子発現プロファイルにより、共通に変化した発現を有する遺伝子972個が同定され；参考となる症例の50％より多くにおいて発現比＞5.0が明らかになった遺伝子251個（材料および方法を参照されたい）（表4）が同定され、一方、正常腎皮質細胞と比較してRCC細胞においてその発現が0.2未満まで低減された遺伝子は721個であった（表5）。これらのアップレギュレートされた遺伝子の中に、RCCにおいて過剰発現されていると既に報告されているCyclin-D1（CCND1）（Hedberg Y., et al, (1999) Int. J. Cancer, 84: 268-72）が含まれた。この遺伝子は、本発明において参考となるRCC症例15例中9例において過剰発現された。これらのアップレギュレートされた遺伝子の中で、遺伝子182個の生物学的機能は、既にある程度公知であった。それらの中で、HIG2（Hypoxia inducible gene 2）、NNMT（Nicotinamide N-methyltransferase）、IGFBP3（Insulin-like growth factor binding protein 3）、VEGF（Vascular endothelial growth factor）、およびVWF（Von Willebrand factor）は既に、腎腫瘍形成に関係する遺伝子であると報告されており（Togashi A, et al, (2005)Cancer Res.;65:4817-26；Yao M, et al, (2005) J Pathol.;205:377-87；Cheung CW, et al., (2004) Kidney Int.;65:1272-9；Staehler M, et al., (2005) Curr Drug Targets.;6:835-46；Braybrooke JP, et al., (2000) Clin Cancer Res.;6:4697-704）、本発明者らのマイクロアレイデータの品質が高いことを支持している。アップレギュレートされた遺伝子は、シグナル伝達経路に関連する遺伝子（ADORA3、EDA2R）、または様々な代謝経路に関係する遺伝子（SCD、ENPP3）、輸送系に関係する遺伝子（SLC1A3、ABCG1）、血管新生に関係する遺伝子（VEGF）、アポトーシスに関係する遺伝子（FTS）、および細胞接着に関係する遺伝子（CDH2）を含む、多様な機能を表した。特に、アップレギュレートされた遺伝子の92個は、正常皮質細胞より10倍より高いレベルで発現され、たとえばADORA3（アデノシンA3受容体）、SLC1A3（溶質キャリア ファミリー1 メンバー3）、およびSTC2（スタニオカルシン2）は、参考となる症例の90％より多くにおいて10倍より高くアップレギュレートされた。これらのダウンレギュレートされた遺伝子の中で、遺伝子532個は、ある程度機能的に特徴付けられている。それらには、WT1（ウィルムス腫瘍1）、CDKNIC（サイクリン依存キナーゼインヒビター1C）、およびGAS1（増殖停止特異的1）が含まれ、これらは、成長抑制またはアポトーシスにおけるその役割を意味する（Niu Z, et al., (2005) J Urol;174:1460-2；Kikuchi T, et al., (2002) Oncogene. ;21:2741-9；Watanabe H, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci U S A.;95:1392-7; Evdokiou A & Cowled PA. (1998) Int J Cancer.;75 :568-77）。特に、WT1およびCDKN1Cは、RCC症例15例全てにおいて有意にダウンレギュレートされ、GAS1もまた、15例中14例において有意にダウンレギュレートされ、それらの遺伝子のダウンレギュレーションがRCC腫瘍発生に関連する可能性があることを示している。   To elucidate the mechanisms underlying RCC cancer development, we first looked at genes that are generally up- or down-regulated in RCC. Gene expression profiles in 15 RCCs identified 972 genes with commonly altered expression; 251 genes with an expression ratio> 5.0 in more than 50% of the reference cases (materials and methods (Table 4) was identified, while 721 genes had their expression reduced to less than 0.2 in RCC cells compared to normal renal cortical cells (Table 5). Among these upregulated genes, Cyclin-D1 (CCND1), which has already been reported to be overexpressed in RCC (Hedberg Y., et al, (1999) Int. J. Cancer, 84: 268-72). This gene was overexpressed in 9 out of 15 RCC cases that served as a reference in the present invention. Among these up-regulated genes, the biological function of 182 genes was already known to some extent. Among them, HIG2 (Hypoxia inducible gene 2), NNMT (Nicotinamide N-methyltransferase), IGFBP3 (Insulin-like growth factor binding protein 3), VEGF (Vascular endothelial growth factor), and VWF (Von Willebrand factor) are already Have been reported to be a gene involved in renal tumorigenesis (Togashi A, et al, (2005) Cancer Res .; 65: 4817-26; Yao M, et al, (2005) J Pathol .; 205: Cheung CW, et al., (2004) Kidney Int .; 65: 1272-9; Staehler M, et al., (2005) Curr Drug Targets .; 6: 835-46; Braybrooke JP, et al , (2000) Clin Cancer Res .; 6: 4697-704), supporting the high quality of our microarray data. Up-regulated genes include genes related to signal transduction pathways (ADORA3, EDA2R), genes related to various metabolic pathways (SCD, ENPP3), genes related to transport systems (SLC1A3, ABCG1), angiogenesis A variety of functions were expressed, including genes related to VEGF (VEGF), genes related to apoptosis (FTS), and genes related to cell adhesion (CDH2). In particular, 92 of the up-regulated genes are expressed at 10-fold higher levels than normal cortical cells, eg ADORA3 (adenosine A3 receptor), SLC1A3 (solute carrier family 1 member 3), and STC2 (stanniocalcin 2) ) Was upregulated more than 10 times in more than 90% of the reference cases. Of these down-regulated genes, 532 genes have been functionally characterized to some extent. They include WT1 (Wilms tumor 1), CDKNIC (cyclin dependent kinase inhibitor 1C), and GAS1 (growth arrest specific 1), which imply their role in growth inhibition or apoptosis (Niu Z, et al., (2005) J Urol; 174: 1460-2; Kikuchi T, et al., (2002) Oncogene.; 21: 2741-9; Watanabe H, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci US A.; 95: 1392-7; Evdokiou A & Cowled PA. (1998) Int J Cancer.; 75: 568-77). In particular, WT1 and CDKN1C are significantly down-regulated in all 15 RCC cases, GAS1 is also significantly down-regulated in 14 of 15 cases, and down-regulation of those genes is associated with RCC tumor development It indicates that there is a possibility.

（表４）RCCにおいてアップレギュレートされた遺伝子

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Table 4: Genes up-regulated in RCC
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（表５）RCCにおいてダウンレギュレートされた遺伝子

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(Table 5) Genes down-regulated in RCC
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半定量的RT-PCRおよびノーザンブロット分析による選択された遺伝子の確認
cDNAマイクロアレイ分析によって得られた発現データの信頼性を確認するために、明細胞RCCを有する参考となる症例において有意にアップレギュレートされた遺伝子21個（アクセッション番号NM_018092、AA632745、NM_007250、W86513、BC077726、AA156409、W57613、CR749811、AW972553、AL832896、AK021778、AK026403、AK025204、NM_000677、AF070609、AI290343、AA442590、NM_000552、BC000234、BC034014、およびNM_004567）について半定量的RT-PCR実験を行った。これらの遺伝子の中で、遺伝子13個（アクセッション番号NM_018092、AA632745、NM_007250、W86513、BC077726、AA156409、W57613、CR749811、AW972553、AL832896、AK021778、AK026403、またはAK025204）は、正常対照としての腎近位尿細管上皮細胞（RPTEC）と比較して、四つのRCC細胞株Caki-1、Caki-2、786-O、およびA498においてアップレギュレートされることが確認された。それらの中で遺伝子8個は、RCC細胞株においてもアップレギュレートされた（図2a）。これらの結果は、試験した症例の大多数においてマイクロアレイ分析の結果と非常に一致した。特に、C6700は、RPTECと比較して8個の細胞株ACHN、769-P、RXF-631L、TUHR10TKB、Caki-1、Caki-2、786-O、およびA-498の中で3個、すなわちA704、OS-RC-2、およびTUHR14TKBにおいてアップレギュレートされることが確認された（図2b）。 Confirmation of selected genes by semi-quantitative RT-PCR and Northern blot analysis
To confirm the reliability of the expression data obtained by cDNA microarray analysis, 21 genes (accession numbers NM_018092, AA632745, NM_007250, W86513, significantly up-regulated in reference cases with clear cell RCC, Semi-quantitative RT-PCR experiments were performed on BC077726, AA156409, W57613, CR749811, AW972553, AL832896, AK021778, AK026403, AK025204, NM_000677, AF070609, AI290343, AA442590, NM_000552, BC000234, BC034014, and NM_004567). Of these genes, 13 genes (accession numbers NM_018092, AA632745, NM_007250, W86513, BC077726, AA156409, W57613, CR749811, AW972553, AL832896, AK021778, AK026403, or AK025204) are proximal to the kidney as normal controls Compared to tubular epithelial cells (RPTEC), it was confirmed to be upregulated in four RCC cell lines Caki-1, Caki-2, 786-O, and A498. Among them, 8 genes were up-regulated in the RCC cell line (Fig. 2a). These results were very consistent with the results of microarray analysis in the majority of cases tested. In particular, C6700 has 3 of 8 cell lines ACHN, 769-P, RXF-631L, TUHR10TKB, Caki-1, Caki-2, 786-O and A-498 compared to RPTEC, namely It was confirmed to be upregulated in A704, OS-RC-2, and TUHR14TKB (FIG. 2b).

これらの候補遺伝子の発現パターンをさらに試験するために、複数のヒト組織およびRCC細胞株について、それぞれのcDNA断片をプローブとして用いてノーザンブロット分析を行った（材料および方法を参照されたい）。候補遺伝子の中で、セマフォリン5B、SEMA5Bに対して設計されたC6700（Genbankアクセッション番号：BC077726）は、胎児脳および胎児腎臓を除く正常ヒト組織に限って発現された（図3左のパネル）。さらに、C6700のcDNA断片をプローブとして用いてRCC細胞株についてノーザンブロット分析を行った（材料および方法を参照されたい）。C6700の発現は、RCC細胞株11例中3例においてアップレギュレートされた（図3、右のパネル）。次に、USCSデータベースにより、ABI遺伝子ファミリー メンバー3（NESH）結合タンパク質(ABI3BP）に対して設計されたF5749（Genbankアクセッション：AK025204）が、染色体3q12に存在し、かつエキソン11個からなる3545塩基の転写物およびエキソン35個からなる4533塩基の転写物を有することが明らかとなった。多重ノーザンブロット分析により、3545塩基の転写物が特異的プローブを用いてもいかなる種の正常ヒト組織においても発現されなかったが（図4a）、約2.0、4.5、および7.5 kb転写物は、3545塩基および4533塩基転写物の共通の配列をプローブとして用いて、正常ヒト組織において広く発現されることが観察された（図4b）。理論的タンパク質MGC38937と類似のLOC339977に対して設計されたC8919（Genbankアクセッション番号：CR749811）は、染色体4q11に転写物と共に存在し、エキソン4個からなる長さが3348塩基である。約3.4 kbの転写物は、多重ノーザンブロット分析によって骨格筋に限って非常に弱く発現された（図5）。PFKFB4（6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼ4）遺伝子（Genbankアクセッション番号NM_004567）に対して設計されたB7032Nは、その約3.5 kbのPFKFB4転写物が膀胱癌細胞株11例中2例においてアップレギュレートされたが、精巣および膵臓を除き正常臓器では発現されなかった（図6）。FBXLl6（Fボックスロイシンリッチリピートタンパク質16）遺伝子（V1に関してGenbankアクセッション番号BC034014、およびV2に関してNM_153350）に対して設計されたB9320は、二つのFBXL16転写物の約4 kb（V1）および2.4 kb（V2）が、膀胱癌細胞株4例中2例において有意にアップレギュレートされた。2.4 kb転写物は腎臓および甲状腺において発現されたが、4 kb転写物は、脳、精巣、脊髄および膵臓を除き正常臓器では発現されなかった（図7）。   To further examine the expression patterns of these candidate genes, Northern blot analysis was performed on multiple human tissues and RCC cell lines using the respective cDNA fragments as probes (see Materials and Methods). Among candidate genes, C6700 (Genbank accession number: BC077726) designed for semaphorin 5B and SEMA5B was expressed only in normal human tissues excluding fetal brain and fetal kidney (Figure 3, left panel). ). In addition, Northern blot analysis was performed on the RCC cell line using the C6700 cDNA fragment as a probe (see Materials and Methods). C6700 expression was up-regulated in 3 of 11 RCC cell lines (Figure 3, right panel). Next, according to the USCS database, F5749 (Genbank accession: AK025204) designed for ABI gene family member 3 (NESH) binding protein (ABI3BP) is present on chromosome 3q12 and 3545 bases consisting of 11 exons. And a transcript of 4533 bases consisting of 35 exons and 35 exons. Multiple Northern blot analysis revealed that a 3545 base transcript was not expressed in any kind of normal human tissue using a specific probe (FIG. 4a), but the approximately 2.0, 4.5, and 7.5 kb transcripts were It was observed that it was widely expressed in normal human tissues using a common sequence of base and 4533 base transcripts as a probe (FIG. 4b). C8919 (Genbank accession number: CR749811) designed for LOC339977, similar to the theoretical protein MGC38937, is present on chromosome 4q11 with transcripts and is 3348 bases in length consisting of 4 exons. The approximately 3.4 kb transcript was expressed very weakly only in skeletal muscle by multiple Northern blot analysis (FIG. 5). B7032N designed for the PFKFB4 (6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2,6-bisphosphatase 4) gene (Genbank accession number NM_004567) is an approximately 3.5 kb PFKFB4 transcript in bladder cancer cell lines It was up-regulated in 2 out of 11 cases but was not expressed in normal organs except the testis and pancreas (FIG. 6). Designed for the FBXLl6 (F-box leucine rich repeat protein 16) gene (Genbank accession number BC034014 for V1 and NM_153350 for V2), B9320 is approximately 4 kb (V1) and 2.4 kb (2 kb) of the two FBXL16 transcripts. V2) was significantly upregulated in 2 out of 4 bladder cancer cell lines. The 2.4 kb transcript was expressed in kidney and thyroid, whereas the 4 kb transcript was not expressed in normal organs except the brain, testis, spinal cord and pancreas (FIG. 7).

B7032Nの特徴をさらに試験するために、B7032Nの発現およびB7032N遺伝子産物の細胞内局在を哺乳動物細胞において試験した。最初に、B7032Nタンパク質を発現するプラスミド（pCAGGS-B7032N-HA）をCOS7細胞に一過性にトランスフェクトして、ウェスタンブロット分析を行ったところ、外因性のB7032Nがトランスフェクションの24時間後および48時間後の双方において予想される大きさのバンドとして発現された（図10a）。さらに、免疫細胞化学染色により、トランスフェクトした細胞の全てにおいて細胞質に外因性に局在することが示された（図10b）。   To further test the characteristics of B7032N, the expression of B7032N and the subcellular localization of the B7032N gene product were tested in mammalian cells. First, a B7032N protein-expressing plasmid (pCAGGS-B7032N-HA) was transiently transfected into COS7 cells and subjected to Western blot analysis. Exogenous B7032N was detected 24 hours after transfection and 48 hours after transfection. It was expressed as a band of the expected size both after time (Figure 10a). Furthermore, immunocytochemical staining showed that it was exogenously localized in the cytoplasm in all transfected cells (FIG. 10b).

B9320の特徴をさらに調べるために、B9320の発現およびB9320遺伝子産物の細胞内局在を哺乳動物細胞において調べた。最初にB9320タンパク質を発現するプラスミド（pCAGGS-B9320-HA）をCOS7細胞に一過性にトランスフェクトして、ウェスタンブロット分析により、外因性のB9320がトランスフェクションの24時間後および48時間後の双方において単一のバンドとして発現されることが明らかとなった（図13a）。さらに、免疫細胞化学染色により、トランスフェクト細胞の全てにおいて細胞質に外因性に局在することが示された（図13b）。   To further characterize B9320, the expression of B9320 and the subcellular localization of the B9320 gene product was examined in mammalian cells. First, a B9320 protein-expressing plasmid (pCAGGS-B9320-HA) was transiently transfected into COS7 cells, and Western blot analysis showed that exogenous B9320 was both 24 and 48 hours post-transfection. It was revealed that it was expressed as a single band in (Fig. 13a). Furthermore, immunocytochemical staining showed that it was exogenously localized in the cytoplasm in all of the transfected cells (FIG. 13b).

C6700のゲノム構造
C6700の全cDNA配列を得るために、RCC細胞株、すなわちOS-RC-2またはC704を鋳型として用いてRT-PCRを行った。セマフォリン5B、SEMA5Bに対して設計されたC6700は、染色体3p21.1に存在した。 Genomic structure of C6700
In order to obtain the entire cDNA sequence of C6700, RT-PCR was performed using the RCC cell line, ie OS-RC-2 or C704, as a template. C6700 designed for semaphorin 5B, SEMA5B, was present on chromosome 3p21.1.

C6700は、C6700V1およびC6700V2にそれぞれ対応するエキソン23個からなる異なる二つの転写変異体を有する（図8a）。V2のエキソン1、16、および20には代わりの変異が存在し、他の残りのエキソンは双方の変異体に対して共通であり、V2では最後のエキソン内に新規の終始コドンを生成したが、V1の終始コドンはエキソン22内である。V2変異体のエキソン1として32 bpからなる新規エキソンを生成した。V2のエキソン16は、3'末端でV1のそれより3 bp長く、V2のエキソン20もまた、5'末端でV1のそれより3 bp長かった。さらに、エキソン21は、3'末端でV2のそれより131 bp短かった。C6700V1およびC6700V2変異体の完全長のcDNA配列はそれぞれ、4725および4494ヌクレオチドからなる。これらの変異体のORFはそれぞれのエキソン1内で始まる。最終的にV1およびV2の転写物はそれぞれ、アミノ酸1093個および1152個をコードする。RCC細胞株におけるそれぞれの変異体の発現パターンをさらに確認するために、各変異体に対して認識されるプライマーセットを用いて半定量的RT-PCRを行った（図8bを参照されたい）。その結果、V2変異体は、RCC細胞において特異的に過剰発現されることが発見された（図8b）。したがって、C6700V2に関してさらなる機能的分析を行った。   C6700 has two different transcription variants consisting of 23 exons corresponding to C6700V1 and C6700V2, respectively (FIG. 8a). There are alternative mutations in exon 1, 16, and 20 of V2, the other remaining exons are common to both variants, while V2 generated a new stop codon in the last exon. , The stop codon of V1 is within exon 22. A new exon consisting of 32 bp was generated as exon 1 of the V2 mutant. Exon 16 of V2 was 3 bp longer than that of V1 at the 3 ′ end, and exon 20 of V2 was also 3 bp longer than that of V1 at the 5 ′ end. In addition, exon 21 was 131 bp shorter than that of V2 at the 3 ′ end. The full length cDNA sequences of C6700V1 and C6700V2 variants consist of 4725 and 4494 nucleotides, respectively. These mutant ORFs begin within each exon 1. Finally, the V1 and V2 transcripts encode 1093 and 1152 amino acids, respectively. To further confirm the expression pattern of each mutant in the RCC cell line, semi-quantitative RT-PCR was performed using the primer set recognized for each mutant (see FIG. 8b). As a result, it was discovered that the V2 mutant was specifically overexpressed in RCC cells (FIG. 8b). Therefore, further functional analysis was performed on C6700V2.

C6700、B7032N、およびB9320の発現を低減させるように設計された低分子干渉RNA（siRNA）の成長阻害効果
C6700、B7032N、およびB9320の成長促進役割を査定するために、内因性のC6700、B7032N、およびB9320の発現を、C6700に関して、C6700の過剰発現を示した細胞を含むRCC細胞株OS-RC-2、B7032Nに関して、B7032Nの過剰発現を示したRXF-631LおよびA498、ならびにB9320に関してB9320の過剰発現を示したCaki-2およびA498において、哺乳動物のベクターに基づくRNA干渉（RNAi）技術によってノックダウンした（材料および方法を参照されたい）。C6700、B7032N、およびB9320の発現レベルを半定量的RT-PCR実験によって調べた。 Growth inhibitory effects of small interfering RNA (siRNA) designed to reduce C6700, B7032N, and B9320 expression
To assess the growth-promoting role of C6700, B7032N, and B9320, the expression of endogenous C6700, B7032N, and B9320, the RCC cell line OS-RC-2 containing cells that showed C6700 overexpression with respect to C6700 In RXF-631L and A498, which showed overexpression of B7032N with respect to B7032N, and Caki-2 and A498, which showed overexpression of B9320 with respect to B9320, were knocked down by mammalian vector-based RNA interference (RNAi) technology (See Materials and Methods). The expression levels of C6700, B7032N, and B9320 were examined by semi-quantitative RT-PCR experiments.

図9aに示すように、C6700特異的siRNA（si1、si6、およびsi-#2）は、四つの対照siRNA構築物（psiU6BX-Luciferase、Scramble、EGFP、およびMock）と比較してC6700の発現を抑制した。試験したsiRNA構築物において、si-#2は、対照siRNA（si-Scrambleおよびsi-Mock）と比較してSEMA5B mRNAの発現を有効に低減させた（図9a）。si-#2を処置した細胞に関して、コロニー数（図9c）およびMTTアッセイによって測定した生存細胞数の有意な減少が観察された（図9b）。SEMA5B-siRNA（si-#2）による標的以外の効果の可能性を除外するために、3-bp置換を有するsiRNAの二つの型を生成した。いずれも、OS-RC-2細胞におけるSEMA5B発現を抑制しないことが発見された（データ非呈示）。これらの知見は、C6700が、RCCの細胞生存および／または成長において有意な機能を有することを示唆する。   As shown in Figure 9a, C6700-specific siRNA (si1, si6, and si- # 2) repressed C6700 expression compared to four control siRNA constructs (psiU6BX-Luciferase, Scramble, EGFP, and Mock) did. In the siRNA constructs tested, si- # 2 effectively reduced SEMA5B mRNA expression compared to control siRNAs (si-Scramble and si-Mock) (FIG. 9a). For cells treated with si- # 2, a significant decrease in the number of colonies (FIG. 9c) and the number of viable cells as measured by MTT assay was observed (FIG. 9b). To rule out possible off-target effects with SEMA5B-siRNA (si- # 2), two types of siRNA with 3-bp substitution were generated. None were found to suppress SEMA5B expression in OS-RC-2 cells (data not shown). These findings suggest that C6700 has a significant function in RCC cell survival and / or growth.

図11に示すように、B7032N（-si#4）は、対照siRNA構築物（si-Scramble）と比較してこの遺伝子の発現を抑制した（図11a、11b）。これらのsiRNA構築物を用いるコロニー形成およびMTTアッセイから、PFKFB4-si#4の導入がRXF-631L（図11a）およびA498（図11b）細胞の成長を抑制することが示された。B7032Nの成長促進効果をさらに確認するために、外因性のB7032Nを安定に発現するNIH3T3-由来細胞（B7032N-A、-B、-C、および-D細胞）を確立した。ウェスタンブロット分析により、四つの誘導クローンにおいて外因性のB7032Nタンパク質が高レベルであることが示された（図12a）。その後のMTTアッセイから、四つの誘導細胞株、すなわちB7032N-A、-B、-C、および-D細胞が、偽プラスミドをトランスフェクトした細胞（Mock-A、-B、および-C細胞）よりかなり速く成長することが示され（図12b）、B7032N発現が細胞成長を促進する可能性があることを示した。これらの知見は、RCCの発症に関するB7032Nの腫瘍発生的役割を暗示する。   As shown in FIG. 11, B7032N (-si # 4) suppressed the expression of this gene compared to the control siRNA construct (si-Scramble) (FIGS. 11a and 11b). Colony formation and MTT assays using these siRNA constructs indicated that introduction of PFKFB4-si # 4 suppressed the growth of RXF-631L (FIG. 11a) and A498 (FIG. 11b) cells. In order to further confirm the growth promoting effect of B7032N, NIH3T3-derived cells (B7032N-A, -B, -C, and -D cells) that stably express exogenous B7032N were established. Western blot analysis showed high levels of exogenous B7032N protein in the four derived clones (FIG. 12a). From subsequent MTT assays, four derived cell lines, namely B7032N-A, -B, -C, and -D cells, from cells transfected with the pseudoplasmid (Mock-A, -B, and -C cells) It was shown to grow fairly fast (FIG. 12b), indicating that B7032N expression may promote cell growth. These findings imply an oncogenic role for B7032N in the development of RCC.

図14に示すように、B9320（si#2）は、対照si-RNA構築物（si-Scramble）と比較してこの遺伝子の発現を有意に抑制した（図14）。これらのsiRNA構築物を用いたコロニー形成およびMTTアッセイは、FBXL16-特異的siRNAの導入がCaki-2（図14a）およびA498（図14b）細胞の成長を抑制することを示した。B9320の成長促進効果をさらに確認するために、外因性のB9320を安定に発現するNIH3T3由来細胞（FBXL 16-1、-2、-3、および-4細胞）を確立した。ウェスタンブロット分析により、四つの誘導クローンにおいて外因性のB9320タンパク質が高レベルであることが示された（図15a）。その後のMTTアッセイから、四つの誘導細胞株、すなわちFBXL16-1、-2、-3、および-4細胞が、偽プラスミドをトランスフェクトした細胞（Mock-1、-2、および-3細胞）よりかなり速く成長することが示され（図15b）、B9320発現が細胞成長を増強する可能性があることを示している。これらの知見は、RCCの発症に関するB9320の腫瘍発生的役割を暗示している。   As shown in FIG. 14, B9320 (si # 2) significantly suppressed the expression of this gene compared to the control si-RNA construct (si-Scramble) (FIG. 14). Colony formation and MTT assays using these siRNA constructs showed that the introduction of FBXL16-specific siRNA suppressed the growth of Caki-2 (FIG. 14a) and A498 (FIG. 14b) cells. In order to further confirm the growth promoting effect of B9320, NIH3T3-derived cells (FBXL 16-1, -2, -3, and -4 cells) stably expressing exogenous B9320 were established. Western blot analysis showed high levels of exogenous B9320 protein in the four derived clones (FIG. 15a). From subsequent MTT assays, four derived cell lines, namely FBXL16-1, -2, -3, and -4 cells, were derived from cells transfected with the pseudoplasmid (Mock-1, -2, and -3 cells). It has been shown to grow fairly fast (FIG. 15b), indicating that B9320 expression can enhance cell growth. These findings imply an oncogenic role for B9320 in the development of RCC.

（表６）C6700、B7032N、および9320に対する低分子干渉RNAのオリゴヌクレオチド配列

Figure 2009502112
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Table 6: Oligonucleotide sequences of small interfering RNA for C6700, B7032N, and 9320
Figure 2009502112
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考察
分子生物学の最近の進歩により、広範なヒト新生物の発生に関する本発明者らの理解は改善された。RCCにおいて、いくつかの研究グループがマイクロアレイに基づく分子プロファイリングを報告している（Yao M, et al., (2005) J Pathol.;205:377-87；Liou LS, et al., (2004) BMC Urol.;4:9；Takahashi M, et al., (2001) Proc Natl Acad Sci U S A.;98:9754-9；Boer JM, et al., (2001) Genome Res.;l1:1861-70；Young AN, et al., (2001) Am J Pathol.;158:1639-51；Higgins JP, et al., (2003) Am J Pathol.;162:925-32；Skubitz KM and Skubitz AP. (2002) J Lab Clin Med.;140:52-64）。それらの研究は、診断マーカーとして有用となる可能性がある候補遺伝子に重点を置いてきたが、腫瘍塊から単離されたmRNAの発現に基づくデータは、腫瘍塊が一般的に、癌細胞のほかに炎症細胞、間質細胞、および線維芽細胞のような様々な細胞集団の混合物であること、ならびにそれぞれの細胞タイプの比率が人によって有意に異なることから、腎臓癌発生の過程の際の変化を正確に反映していない可能性がある。さらに、RCCは、腎皮質における腎近位尿細管上皮細胞に由来すると考えられている。したがって、これまでに公表されたマイクロアレイデータは、対照調製物における細胞の不均一性によって有意に影響を受けている可能性がある。本発明において、レーザーマイクロビームマイクロダイセクション（LMM）を行って、対照正常腎皮質細胞のみならず腎臓癌細胞の純粋な集団を得た。マイクロアレイによる塊腫瘍組織からのRNAを用いる明細胞RCC（ccRCC）の一つの代表的な発現プロファイルデータ（Takahashi M, et al., (2003) Oncogene.;22:6810-8）と比較すると、本発明のデータにおいて参考となるccRCC症例の75％より多くにおいて共通にアップレギュレートされた遺伝子（表4）の中で、塊発現プロファイルデータ（Takahashi M, et al., (2003) Oncogene.;22:6810-8）と重なり合ったのは、85個中4個（5％）に過ぎなかった。これらの相違は、RCC細胞が組織病理学的に不均一であるという事実に帰因し、塊組織からの発現プロファイルは、非癌性細胞の混入によって有意に影響を受けうる。意外にも、本発明者らの遺伝子リスト（表4）において最も有意にアップレギュレートされた遺伝子の上位24個はいずれも、塊組織からのccRCC発現プロファイルのこれまでの結果（Yao M, et al., (2005) J Pathol.;205:377-87；Takahashi M, et al., (2003) Oncogene.;22:6810-8）に含まれなかった。この証拠は、本発明のマイクロアレイデータが他のデータよりかなり信頼性が高いことを示唆している。この相違は、塊細胞からのこれまでの発現プロファイルが、対照として用いた正常腎組織における腎髄質の混入によって有意に影響を受けうるという事実に帰因する可能性がある。たとえば、腎髄質において高度に発現されるが、腎皮質の腎近位尿細管上皮細胞では発現されない遺伝子は、塊組織からの発現プロファイルにおいてダウンレギュレートされたまたは不変である遺伝子として選択される可能性がある。これらの点を考慮に入れると、外科的検体から得た癌性上皮細胞および正常上皮細胞の集団を可能な限り精製するために、LMMシステムを行うことが肝要である。 Discussion Recent advances in molecular biology have improved our understanding of the development of a wide range of human neoplasms. At RCC, several research groups have reported microarray-based molecular profiling (Yao M, et al., (2005) J Pathol.; 205: 377-87; Liou LS, et al., (2004) BMC Urol .; 4: 9; Takahashi M, et al., (2001) Proc Natl Acad Sci US A .; 98: 9754-9; Boer JM, et al., (2001) Genome Res.; L1: 1861- 70; Young AN, et al., (2001) Am J Pathol.; 158: 1639-51; Higgins JP, et al., (2003) Am J Pathol.; 162: 925-32; Skubitz KM and Skubitz AP. (2002) J Lab Clin Med .; 140: 52-64). Although these studies have focused on candidate genes that may be useful as diagnostic markers, data based on the expression of mRNA isolated from tumor masses generally indicates that tumor masses are typically In addition, because it is a mixture of various cell populations such as inflammatory cells, stromal cells, and fibroblasts, and the ratio of each cell type varies significantly from person to person, May not accurately reflect changes. Furthermore, RCC is thought to originate from renal proximal tubular epithelial cells in the renal cortex. Thus, previously published microarray data may be significantly affected by cell heterogeneity in control preparations. In the present invention, laser microbeam microdissection (LMM) was performed to obtain a pure population of kidney cancer cells as well as control normal renal cortical cells. Compared with one representative expression profile data (Takahashi M, et al., (2003) Oncogene.; 22: 6810-8) of clear cell RCC (ccRCC) using RNA from mass tumor tissue by microarray Among genes commonly up-regulated in more than 75% of ccRCC cases that are referenced in the data of the invention (Table 4), mass expression profile data (Takahashi M, et al., (2003) Oncogene.; 22 : 6810-8) only 4 out of 85 (5%) overlapped. These differences are attributed to the fact that RCC cells are histopathologically heterogeneous, and the expression profile from the mass tissue can be significantly affected by contamination with non-cancerous cells. Surprisingly, the top 24 of the most significantly up-regulated genes in our gene list (Table 4) are all the results of previous ccRCC expression profiles from mass tissue (Yao M, et al., (2005) J Pathol .; 205: 377-87; Takahashi M, et al., (2003) Oncogene .; 22: 6810-8). This evidence suggests that the microarray data of the present invention is much more reliable than other data. This difference may be attributed to the fact that previous expression profiles from mass cells can be significantly affected by contamination of renal medulla in normal kidney tissue used as a control. For example, a gene that is highly expressed in the renal medulla but not in the renal cortical renal proximal tubular epithelial cells can be selected as a gene that is down-regulated or unchanged in the expression profile from the mass tissue There is sex. Taking these points into consideration, it is important to perform an LMM system to purify as much as possible the population of cancerous and normal epithelial cells obtained from surgical specimens.

ccRCCのほとんどにおいて発現が変化した遺伝子は、分子診断マーカーもしくはRCC治療標的の候補作用物質として役立つ可能性がある、または腎臓癌発生において原因的役割を果たす可能性がある。アップレギュレートされた遺伝子において、NNMT（ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ）、IGFBP3（インスリン様成長因子結合タンパク質3）、ENPP3（エクトヌクレオチド ピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ3）、VEGF（血管内皮成長因子）、およびVWF（フォンウィルブランド因子）は、他のものと同様に本出願に含まれた。NNMTは、他のタイプのRCCよりccRCCにおいて頻繁に増加しており、RCCにおける良好な予後と相関していると報告されている（Yao M, et al., (2005) J Pathol.;205:377-87）。IGFBP3は、免疫組織化学染色によって、IGFBP-3がccRCCにおいてIGF軸の調節異常を引き起こすことが示された（Takahashi M, et al., (2005) Int J Oncol.;26:923-31；Cheung CW, et al., (2004) Kidney Int. ;65: 1272-9）。IGFP-3はまた、RCC細胞増殖の調節においてオートクラインによって何らかの役割を果たすことが示された（Takahashi M, et al., (2005) Int J Oncol.;26:923-31；Cheung CW, et al., (2004) Kidney Int.;65:1272-9）。エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ-I酵素（E-NPP）は、様々な基質のホスホジエステルおよびホスホスルフェート結合を切断する。哺乳動物のE-NPPは、三つの近縁タンパク質のファミリーである：E-NPP1、E-NPP2、およびE-NPP3。ENPP3の機能は不明であるが、ENPP3の発現は、周囲の組織より腫瘍組織において高く、ENPP3タンパク質の特異的型は、胆管癌（BDC）を有する患者の血清中に検出されること、およびENPP3が細胞遊走を増強することが報告された。したがって、ENPP3は、新生物BDCの浸潤性に関連する可能性があり、腫瘍マーカーとして応用可能となりうる（Yano Y, et al., (2004) Cancer Lett.;207:139-47）。血清VEGFおよびvWFレベルは、インターロイキン2およびIFN-αを含む免疫調節物質の予測マーカーであることが示されており；VEGFおよびvWFのより高いレベルを有する患者は、これらの二つのタンパク質のより低い血清レベルを示す患者と比較してこれらの処置に対する反応が不良であることを明らかにした（Braybrooke JP, et al., (2000) Clin Cancer Res.;6:4697-704）。さらに、ABCG1（ATP結合カセット サブファミリーG (WHITE) メンバー1）、およびSTC2（スタニオカルシン2）ABCGlは、一般的にコレステロールの輸送を媒介する。Hernanらは、ABCG1が、マイクロアレイ分析およびディファレンシャルディスプレイによって頭頚部扁平上皮癌においてアップレギュレートされることが知られていることを報告した（Yano Y, et al., (2004) Cancer Lett.;207: 139-47）。   Genes with altered expression in most ccRCCs may serve as molecular diagnostic markers or candidate agents for RCC therapeutic targets, or may play a causative role in kidney cancer development. Among the upregulated genes, NNMT (nicotinamide N-methyltransferase), IGFBP3 (insulin-like growth factor binding protein 3), ENPP3 (ectonucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase 3), VEGF (vascular endothelial growth factor), and VWF (Von Willebrand factor) was included in this application as well as others. NNMT is more frequent in ccRCC than other types of RCC and has been reported to correlate with a good prognosis in RCC (Yao M, et al., (2005) J Pathol.; 205: 377-87). IGFBP3 has been shown by immunohistochemical staining that IGFBP-3 causes dysregulation of the IGF axis in ccRCC (Takahashi M, et al., (2005) Int J Oncol .; 26: 923-31; Cheung CW, et al., (2004) Kidney Int.; 65: 1272-9). IGFP-3 has also been shown to play a role by autocrine in regulating RCC cell proliferation (Takahashi M, et al., (2005) Int J Oncol .; 26: 923-31; Cheung CW, et al., (2004) Kidney Int.; 65: 1272-9). The ectonucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase-I enzyme (E-NPP) cleaves the phosphodiester and phosphosulfate bonds of various substrates. Mammalian E-NPP is a family of three closely related proteins: E-NPP1, E-NPP2, and E-NPP3. Although the function of ENPP3 is unknown, ENPP3 expression is higher in tumor tissue than in surrounding tissues, and a specific form of ENPP3 protein is detected in the serum of patients with cholangiocarcinoma (BDC), and ENPP3 Have been reported to enhance cell migration. Thus, ENPP3 may be associated with neoplastic BDC invasiveness and may be applicable as a tumor marker (Yano Y, et al., (2004) Cancer Lett .; 207: 139-47). Serum VEGF and vWF levels have been shown to be predictive markers of immunomodulators including interleukin 2 and IFN-α; patients with higher levels of VEGF and vWF are more likely than those of these two proteins The response to these treatments was found to be poor compared to patients with low serum levels (Braybrooke JP, et al., (2000) Clin Cancer Res .; 6: 4697-704). In addition, ABCG1 (ATP binding cassette subfamily G (WHITE) member 1) and STC2 (stanniocalcin 2) ABCGl generally mediate cholesterol transport. Hernan et al. Reported that ABCG1 is known to be up-regulated in head and neck squamous cell carcinoma by microarray analysis and differential display (Yano Y, et al., (2004) Cancer Lett .; 207 : 139-47).

一方、ダウンレギュレートされた遺伝子において、WT1（ウィルムス腫瘍1）、CDKNlC（サイクリン依存キナーゼインヒビター1C）、およびGASl（増殖停止特異的1）は、成長抑制またはアポトーシスにおけるその役割が暗示される（Niu Z, et al.,(2005)J Urol.;174:1460-2；Kikuchi T, et al., (2002) Oncogene.;21:2741-9；Watanabe H, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci U S A.;95:1392-7；Evdokiou A & Cowled PA. (1998) Int J Cancer.;75:568-77）。Niu Z.らは、WT1の発現が、対応する正常腎組織と比較してRCC腫瘍において有意にダウンレギュレートされることを報告した（Niu Z, et al., (2005) J Urol.;174:1460-2）が、mRNAレベルとRCCの臨床病理学的特色とのあいだに有意な相関を認めなかった。CDKN1Cは、サイクリン依存キナーゼの活性を阻害することによって、細胞周期停止を誘導することが知られている。この遺伝子の後成的サイレンシングは、結腸直腸癌、胃癌、肝細胞癌、および膵臓癌のような固形腫瘍において報告されており（Kikuchi T, et al., (2002) Oncogene.;21:2741-9）、CDKN1Cが腫瘍抑制遺伝子として機能することを示唆している。GAS1はまた、本発明において15例中14例において有意にダウンレギュレートされた。GAS1の誘導は、細胞増殖を抑制する、および／またはニューロン細胞においてアポトーシスを引き起こすことが報告されており、GAS1の発現はグリアの増殖を減少させた（Evdokiou A & Cowled PA. (1998) Int J Cancer.;75:568-77）。   On the other hand, in down-regulated genes, WT1 (Wilms tumor 1), CDKNlC (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C), and GASl (growth arrest specific 1) imply their role in growth inhibition or apoptosis (Niu Z, et al., (2005) J Urol .; 174: 1460-2; Kikuchi T, et al., (2002) Oncogene .; 21: 2741-9; Watanabe H, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci US A.; 95: 1392-7; Evdokiou A & Cowled PA. (1998) Int J Cancer.; 75: 568-77). Niu Z. et al. Reported that WT1 expression was significantly downregulated in RCC tumors compared to the corresponding normal kidney tissue (Niu Z, et al., (2005) J Urol.; 174 : 1460-2) did not show a significant correlation between mRNA levels and clinicopathological features of RCC. CDKN1C is known to induce cell cycle arrest by inhibiting the activity of cyclin dependent kinases. Epigenetic silencing of this gene has been reported in solid tumors such as colorectal cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma, and pancreatic cancer (Kikuchi T, et al., (2002) Oncogene.; 21: 2741 -9), suggesting that CDKN1C functions as a tumor suppressor gene. GAS1 was also significantly down-regulated in 14 of 15 cases in the present invention. Induction of GAS1 has been reported to suppress cell proliferation and / or cause apoptosis in neuronal cells, and expression of GAS1 decreased glial proliferation (Evdokiou A & Cowled PA. (1998) Int J Cancer.; 75: 568-77).

本発明者らのリストにおけるアップレギュレートされた遺伝子において、本発明は、RCCにおける頻繁な転写活性化および本発明者らが調べた任意の正常ヒト成人組織における発現のその検出不能なレベルにより、RCC治療に関する可能性がある分子標的としてセマフォリン5B（SEMA 5B）に焦点を当てた。本発明の文脈において、siRNAによるその発現レベルのノックダウンにより、RCC細胞成長の特異的に有意な抑制が起こることが証明され、それが細胞成長の増強において重要な役割であることを示唆している。SEMA5Bは、成長誘導の役割（cue）をコードする遺伝子の多様な群に属する細胞表面および分泌型糖タンパク質ファミリーである（Kolodkin AL, et al., (1993) Cell.;75:1389-99）。セマフォリンおよびその受容体であるプレキシンは、当初神経系において同定され、神経系では正確なニューロンネットワークを確立するためにそれらが必要である。それらのレパートリーは、心臓および骨格の発達、免疫応答、ならびに上皮形態形成を含むいくつかの非神経プロセスに拡大されている。より最近、セマフォリンは腫瘍の成長および転移におけるその役割に関係している（Tamagnone L & Comoglio PM. (2004) EMBO Rep.;5:356-61）。本明細書において、SEMA5BはRCC細胞株のみならずRCCの明細胞型において頻繁に発現されることが証明され、SEMA5Bに対するターゲティングは、新規治療薬を開発するための有望なアプローチとなる可能性があることを暗示している。   In the up-regulated genes in our list, the present invention is based on frequent transcriptional activation in RCC and its undetectable level of expression in any normal human adult tissue we examined. The focus was on semaphorin 5B (SEMA 5B) as a potential molecular target for RCC treatment. In the context of the present invention, knockdown of its expression level by siRNA proved to cause specifically significant suppression of RCC cell growth, suggesting that it is an important role in enhancing cell growth Yes. SEMA5B is a cell surface and secreted glycoprotein family that belongs to a diverse group of genes that encode growth-inducing cue (Kolodkin AL, et al., (1993) Cell.; 75: 1389-99) . Semaphorin and its receptor, plexin, were initially identified in the nervous system, where they are required to establish an accurate neuronal network. Their repertoire has been expanded to several non-neural processes including heart and skeletal development, immune response, and epithelial morphogenesis. More recently, semaphorins have been implicated in their role in tumor growth and metastasis (Tamagnone L & Comoglio PM. (2004) EMBO Rep .; 5: 356-61). Here, SEMA5B has been demonstrated to be frequently expressed not only in the RCC cell line but also in the clear cell type of RCC, and targeting to SEMA5B may be a promising approach for developing new therapeutics It implies that there is.

本報告において、膀胱癌の正確な発現プロファイルであるが、B7032NおよびB9320は、RCC細胞において有意に過剰発現されたと同定された。複数の正常ヒト組織およびRCC細胞株によるノーザンブロット分析により、B7032Nの発現は、精巣および膵臓を除く正常ヒト組織においてほとんど検出不可能であること、およびB9320の発現が、試験した正常なヒト重要組織においてほとんど検出不可能であることが示された。これらの結果は、これらの遺伝子が、RCCに関する抗癌剤を開発するための有益な標的として役立つはずであることを示した。さらに、内因性のB7032NおよびB9320のノックダウンにより、RCC細胞における細胞成長の抑制が起こることが証明された。結論すると、B7032NおよびB9320が哺乳動物細胞における成長促進活性を示すこと、およびsiRNAによるその発現のノックダウンが、膀胱癌細胞の成長を抑制することが報告された。B7032NおよびB9320の機能に拮抗する薬物の開発は、癌治療の合理的戦略となる可能性がある。B7032NおよびB9320の機能に関するさらなる分析が必要であるが、提供されるデータはRCC癌発生のより深い理解およびRCCの新規治療の開発に貢献するはずである。   In this report, B7032N and B9320 were identified as significantly over-expressed in RCC cells, although in an accurate expression profile of bladder cancer. By Northern blot analysis with multiple normal human tissues and RCC cell lines, B7032N expression is almost undetectable in normal human tissues except testis and pancreas, and B9320 expression is normal human critical tissue tested Was almost undetectable. These results indicated that these genes should serve as valuable targets for developing anticancer drugs for RCC. Furthermore, it was demonstrated that endogenous B7032N and B9320 knockdown resulted in suppression of cell growth in RCC cells. In conclusion, it has been reported that B7032N and B9320 show growth-promoting activity in mammalian cells and that knockdown of their expression by siRNA suppresses the growth of bladder cancer cells. The development of drugs that antagonize the function of B7032N and B9320 may be a rational strategy for cancer treatment. Further analysis on the function of B7032N and B9320 is needed, but the data provided should contribute to a deeper understanding of RCC cancer development and the development of new treatments for RCC.

併せて考慮すると、本発明の正確なRCC発現プロファイルを通して同定されたアップレギュレートされた遺伝子は、腎臓癌発生のよりよい理解に光を与えて、RCC処置およびまた診断腫瘍マーカーを開発するための可能性がある新規分子標的を発見するための有用な情報を提供するはずである。   Taken together, the up-regulated genes identified through the precise RCC expression profile of the present invention illuminate a better understanding of kidney cancer development and to develop RCC treatment and also diagnostic tumor markers It should provide useful information to discover potential new molecular targets.

産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイとの組み合わせによって得られた、本明細書記載の腎細胞癌の遺伝子発現解析により、癌の予防および治療の標的としての特異的遺伝子が同定された。これらの差次的に発現される遺伝子のサブセットの発現に基づき、本発明は、腎細胞癌を同定または検出するための分子診断マーカーを提供する。 INDUSTRIAL APPLICABILITY Specific gene as a target for cancer prevention and treatment by gene expression analysis of renal cell carcinoma as described herein, obtained by combining laser capture dissection and genome-wide cDNA microarray Was identified. Based on the expression of a subset of these differentially expressed genes, the present invention provides molecular diagnostic markers for identifying or detecting renal cell carcinoma.

本明細書記載の方法はまた、腎細胞癌の予防、診断、および処置のためのさらなる分子標的の同定に有用である。本明細書において報告されたデータは、腎細胞癌の包括的な理解を補足し、新規診断戦略の開発を促進し、治療薬および予防薬のための分子標的を同定する手がかりを提供する。そのような情報は、腎細胞癌の形成に関するより深い理解に貢献し、かつ、腎細胞癌を診断、処置、および最終的に予防するための新規戦略を開発するための指標を提供する。   The methods described herein are also useful for identifying additional molecular targets for the prevention, diagnosis, and treatment of renal cell carcinoma. The data reported herein complements a comprehensive understanding of renal cell carcinoma, facilitates the development of new diagnostic strategies, and provides clues to identify molecular targets for therapeutic and prophylactic agents. Such information contributes to a deeper understanding of the formation of renal cell carcinoma and provides an indicator for developing new strategies for diagnosing, treating, and ultimately preventing renal cell carcinoma.

本明細書において示されたように、細胞増殖は、C6700、B7032N、またはB9320遺伝子を特異的に標的とする低分子干渉RNA（siRNA）によって抑制されうる。従って新規siRNAは、抗癌剤を開発するための有用な標的である。例えば、C6700、B7032N、もしくはB9320の発現を阻止する作用物質、またはその活性を阻害する作用物質には、抗癌剤、特に腎細胞癌などの腎臓癌処置用の抗癌剤としての治療的有用性を見出すことができる。   As demonstrated herein, cell proliferation can be suppressed by small interfering RNA (siRNA) that specifically targets the C6700, B7032N, or B9320 gene. Novel siRNAs are therefore useful targets for developing anticancer agents. For example, an agent that blocks the expression of C6700, B7032N, or B9320, or an agent that inhibits its activity, finds therapeutic utility as an anticancer agent, particularly an anticancer agent for treating renal cancer such as renal cell carcinoma. Can do.

本明細書で引用した全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。さらに、本発明を、その特定の態様に言及しながら詳細に説明してきたが、前記の記載は例示的および説明的な性質のものであって、本発明およびその好ましい態様を例示することを意図していることが理解されねばならない。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、慣行的な実験によって様々な変更および修正をそれに加えうることを容易に認識するであろう。したがって、本発明は、上述の記載によって規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって規定されることが意図される。   All patents, patent applications, and publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Moreover, while the invention has been described in detail with reference to specific embodiments thereof, the foregoing description is of exemplary and illustrative nature and is intended to exemplify the invention and its preferred embodiments. It must be understood. Those skilled in the art will readily recognize that various changes and modifications can be made thereto through routine experimentation without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the invention is intended to be defined not by the above description, but by the following claims and their equivalents.

明細胞RCC（左のパネル）および正常腎皮質細胞（右のパネル）の、レーザーマイクロビームマイクロダイセクション（LMM）を用いて、先に顕微解剖を行った細胞の写真画像（レーンa）、後で顕微解剖を行った細胞の写真画像（レーンb）、および顕微解剖を行った細胞の写真画像（レーンc）を表す。Photographic image (lane a) of cells previously microdissected using laser microbeam microdissection (LMM) of clear cell RCC (left panel) and normal renal cortical cells (right panel), after Fig. 2 shows a photographic image (lane b) of a cell subjected to microdissection and a photographic image (lane c) of a cell subjected to microdissection. 図2（a）は、高度に発現された遺伝子の半定量的RT-PCRバリデーションアッセイの結果を描写する。遺伝子21個（アクセッション番号NM_018092、AA632745、NM_007250、W86513、BC077726、AA156409、W57613、CR749811、AW972553、AL832896、AK021778、AK026403、AK025204、NM_000677、AF070609、AI290343、AA442590、NM_000552、BC000234、BC034014、およびNM_004567）ならびにFDFTl（内部対照）の発現を、半定量的RT-PCR実験によって試験した。マイクロアレイのシグナルは、半定量的RT-PCR実験の結果に対応した。正常腎皮質を、このマイクロアレイにおいて用いたRCC患者11人から調製した。RPTECは、腎近位尿細管上皮細胞を意味する。図2（b）は、半定量的RT-PCRによって測定したRCC細胞株11例におけるC6700の発現を描写する。FIG. 2 (a) depicts the results of a semi-quantitative RT-PCR validation assay for highly expressed genes. 21 genes (accession numbers NM_018092, AA632745, NM_007250, W86513, BC077726, AA156409, W57613, CR749811, AW972553, AL832896, AK021778, AK026403, AK025204, NM_000677, AF070609, AI290343, AA442590, NM_000552, BC000234, BC00045 As well as the expression of FDFTl (internal control) was tested by semi-quantitative RT-PCR experiments. Microarray signals corresponded to the results of semi-quantitative RT-PCR experiments. Normal renal cortex was prepared from 11 RCC patients used in this microarray. RPTEC means renal proximal tubule epithelial cells. FIG. 2 (b) depicts C6700 expression in 11 RCC cell lines measured by semi-quantitative RT-PCR. 腎細胞癌細胞株および正常ヒト組織におけるC6700の発現パターンのノーザンブロット分析の結果を描写する。8 depicts the results of Northern blot analysis of the expression pattern of C6700 in renal cell carcinoma cell lines and normal human tissues. 特異的プローブを用いた様々な正常ヒト組織における3545塩基転写物の多重ノーザンブロット分析の結果（上のパネル）、プローブとして3545塩基転写物および4533塩基転写物の共通の配列を用いた正常ヒト組織におけるF5749の発現（下のパネル）を描写する。Results of multiple Northern blot analysis of 3545 base transcripts in various normal human tissues using specific probes (upper panel), normal human tissues using a common sequence of 3545 and 4533 base transcripts as probes 8 depicts the expression of F5749 in (lower panel). 様々なヒト組織におけるC8919転写物のノーザンブロット分析の結果を描写する。2 depicts the results of Northern blot analysis of C8919 transcripts in various human tissues. 様々なヒト組織におけるB7032N転写物のノーザンブロット分析の結果（左のパネル）、およびRCC細胞株（Caki-1、Caki-2、786-O、A498、ACHN、769-P、A704、RXF-631L、OS-RC-2、TUHRlOTKB、およびTUHR14TKB）、RPTEC（腎近位尿細管上皮細胞）、および正常ヒト臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、精巣、および脳）におけるB7032N転写物のノーザンブロット分析の結果（右のパネル）を描写する。Results of Northern blot analysis of B7032N transcripts in various human tissues (left panel), and RCC cell lines (Caki-1, Caki-2, 786-O, A498, ACHN, 769-P, A704, RXF-631L , OS-RC-2, TUHRlOTKB, and TUHR14TKB), Northern blot analysis of B7032N transcripts in RPTEC (renal proximal tubular epithelial cells) and normal human organs (heart, lung, liver, kidney, testis, and brain) Depicts the result (right panel). 様々なヒト組織におけるB9320転写物のノーザンブロット分析の結果（左のパネル）およびRCC細胞株（Caki-1、Caki-2、786-O、およびA498）、RPTEC（腎近位尿細管上皮細胞）、および正常ヒト臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、および精巣）におけるB9320転写物のノーザンブロット分析の結果（右のパネル）を描写する。Results of Northern blot analysis of B9320 transcripts in various human tissues (left panel) and RCC cell lines (Caki-1, Caki-2, 786-O, and A498), RPTEC (renal proximal tubule epithelial cells) And depicts the results (right panel) of Northern blot analysis of B9320 transcripts in normal human organs (heart, lung, liver, kidney, brain, and testis). C6700のゲノム構造を描写する。C6700は、V1およびV2と呼ばれる異なる2つの変異体を有する。図8（a）は、ゲノム構造を描写し、ここで、白三角は、インフレームでの終始コドンの存在を示し、黒三角は、第一のメチオニンを示す。図8（b）は、四つのRCC細胞株（786-O、A704、OS-RC-2、およびTUHR14TKB）から調製されたRNAおよび胎児脳ポリA(+)RNAを用いたSEMA5Bの半定量的RT-PCR分析の結果を描写する。Describes the genomic structure of C6700. C6700 has two different variants called V1 and V2. FIG. 8 (a) depicts the genomic structure, where white triangles indicate the presence of a stop codon in frame and black triangles indicate the first methionine. Figure 8 (b) shows semiquantitative SEMA5B using RNA prepared from four RCC cell lines (786-O, A704, OS-RC-2, and TUHR14TKB) and fetal brain poly A (+) RNA. Depicts the results of RT-PCR analysis. RCC細胞におけるC6700の発現を低減させるように設計された低分子干渉RNA（siRNA）の成長阻害効果を描写する。図9（a）は、RCC細胞株OC-RC-2におけるC6700の内因性の発現の抑制を証明する半定量的RT-PCRの結果を描写する。β2-MGを内部対照として用いた。si-#2ベクターは、ノックダウン効果を明らかにし、si-Scrambleおよびsi-Mockは、C6700転写物のレベルにいかなる効果も示すことができなかった。si-#2ベクターによるトランスフェクションにより、si-Scrambleおよびsi-Mockをトランスフェクトした細胞と比較してコロニー数の低減（図9（c））および生存細胞数の低減（図9（b））が起こった（それぞれ、p＜0.05およびp＜0.001；対応のないt検定）。8 depicts the growth inhibitory effect of small interfering RNA (siRNA) designed to reduce C6700 expression in RCC cells. FIG. 9 (a) depicts semi-quantitative RT-PCR results demonstrating suppression of endogenous expression of C6700 in the RCC cell line OC-RC-2. β2-MG was used as an internal control. The si- # 2 vector revealed a knockdown effect, and si-Scramble and si-Mock failed to show any effect on the level of the C6700 transcript. Transfection with si- # 2 vector reduces the number of colonies compared to cells transfected with si-Scramble and si-Mock (Figure 9 (c)) and viable cells (Figure 9 (b)) Occurred (p <0.05 and p <0.001, respectively; unpaired t-test). COS7細胞における外因性のB7032Nタンパク質の発現および細胞内局在を描写する。図10（a）は、トランスフェクションの24時間後および48時間後のウェスタンブロットによるB7032Nタンパク質の外因性の発現を描写し、図10（b）はCOS7細胞における外因性のB7032タンパク質の細胞内局在を描写する。8 depicts the expression and subcellular localization of exogenous B7032N protein in COS7 cells. Figure 10 (a) depicts the exogenous expression of B7032N protein by Western blot at 24 and 48 hours after transfection, and Figure 10 (b) shows the intracellular location of exogenous B7032 protein in COS7 cells. Describe the presence. RCC細胞成長および細胞生存率に及ぼすB7032NのsiRNAノックダウン効果を描写する。図11（a）は、半定量的RT-PCR（左上）、コロニー形成アッセイ（左下）、およびMTTアッセイ（右）によって分析した、si-B7032N（#4）または対照siRNA（si-Scramble）に対するRXF-631L細胞の効果を描写する。siRNAによって処置した細胞におけるB7032N転写物レベルを調べるためのRT-PCR実験。β2-MG発現レベルは定量対照であった。si B7032N-#4ベクターはノックダウン効果を明らかにし、si-ScrambleはB7032N転写物レベルに対していかなる効果も示さなかった。B7032N-#4ベクターによるトランスフェクションにより、si-Scrambleをトランスフェクトした細胞と比較して、コロニー数の低減および生存細胞数の低減が起こった（p＜0.0001；対応のないt検定）。（b）半定量的RT-PCR（左上）、コロニー形成アッセイ（左下）、およびMTTアッセイ（右）によって分析した、si-B7032N（#4）または対照siRNA（si-Scramble）に対するA498細胞の効果。siRNAによって処置した細胞におけるB7032N転写物レベルを調べるためのRT-PCR実験。β2-MG発現レベルは定量対照であった。si B7032N-#4ベクターはノックダウン効果を明らかにし、si-ScrambleはB7032N転写物レベルに対していかなる効果も示さなかった。si-B7032N-#4ベクターによるトランスフェクションにより、si-Scrambleをトランスフェクトした細胞と比較して、コロニー数の低減および生存細胞数の低減が起こった（p＜0.0001；対応のないt検定）。8 depicts the siRNA knockdown effect of B7032N on RCC cell growth and cell viability. FIG. 11 (a) shows against si-B7032N (# 4) or control siRNA (si-Scramble) analyzed by semi-quantitative RT-PCR (upper left), colony formation assay (lower left), and MTT assay (right). Depicts the effect of RXF-631L cells. RT-PCR experiments to examine B7032N transcript levels in cells treated with siRNA. β2-MG expression level was a quantitative control. The si B7032N- # 4 vector revealed a knockdown effect, and si-Scramble did not show any effect on B7032N transcript levels. Transfection with the B7032N- # 4 vector resulted in a reduction in the number of colonies and the number of viable cells compared to cells transfected with si-Scramble (p <0.0001; unmatched t-test). (B) Effect of A498 cells on si-B7032N (# 4) or control siRNA (si-Scramble) analyzed by semi-quantitative RT-PCR (upper left), colony formation assay (lower left), and MTT assay (right) . RT-PCR experiments to examine B7032N transcript levels in cells treated with siRNA. β2-MG expression level was a quantitative control. The si B7032N- # 4 vector revealed a knockdown effect, and si-Scramble did not show any effect on B7032N transcript levels. Transfection with the si-B7032N- # 4 vector resulted in a reduction in the number of colonies and the number of viable cells compared to cells transfected with si-Scramble (p <0.0001; unmatched t-test). NIH3T3細胞における外因性のB7032Nの成長促進効果を描写する。図12（a）は、高レベルで外因性のB7032Nを発現する細胞、または偽ベクターをトランスフェクトした細胞のウェスタンブロット分析の結果を描写する。B7032N発現の外因性の導入は、抗HAタグモノクローナル抗体によって確認した。β-アクチンはローディング対照とした。図11（b）は、NIH3T3-B7032N細胞のインビトロ成長を描写する。MTTアッセイによって測定したB7032N（B7032N-A、-B、-C、-D）および偽（Mock-A、-B、-C）をトランスフェクトしたNIH3T3細胞。8 depicts the growth-promoting effect of exogenous B7032N in NIH3T3 cells. FIG. 12 (a) depicts the results of Western blot analysis of cells expressing high levels of exogenous B7032N or cells transfected with a mock vector. Exogenous introduction of B7032N expression was confirmed by anti-HA tag monoclonal antibody. β-actin served as a loading control. FIG. 11 (b) depicts the in vitro growth of NIH3T3-B7032N cells. NIH3T3 cells transfected with B7032N (B7032N-A, -B, -C, -D) and mock (Mock-A, -B, -C) as measured by MTT assay. COS7細胞における外因性のB9320タンパク質の発現および細胞内局在を描写する。図12（a）は、トランスフェクションの24時間後および48時間後でのウェスタンブロットによって証明されるように、B9320タンパク質の外因性の発現を描写し、図13（b）は、COS7細胞における外因性のB9320タンパク質の細胞内局在を描写する。8 depicts the expression and subcellular localization of exogenous B9320 protein in COS7 cells. FIG. 12 (a) depicts exogenous expression of B9320 protein as evidenced by Western blot at 24 and 48 hours post-transfection, and FIG. 13 (b) shows exogenous expression in COS7 cells. 2 depicts the intracellular localization of the sex B9320 protein. RCC細胞成長および細胞生存率に及ぼすB9320のsiRNAノックダウン効果を描写する。図14（a）は、半定量的RT-PCR（左上）、コロニー形成アッセイ（左下）、およびMTTアッセイ（右）によって分析したsi-B9320（#2）または対照siRNA（si-Scramble）に対するCaki-2細胞の効果を描写する。siRNAによって処置した細胞におけるB9320転写物レベルを調べるためのRT-PCR実験。β2-MG発現レベルは定量的対照であった。si-B9320-#2ベクターはノックダウン効果を明らかにし、si-Scrambleは、B9320転写物レベルにいかなる効果も示すことができなかった。si-B9320-#2ベクターによるトランスフェクションにより、si-Scrambleをトランスフェクトした細胞と比較して、コロニー数の低減、および生存細胞数の低減が起こった（p＜0.0001；対応のないt検定）。図14（b）は、半定量的RT-PCR（左上）、コロニー形成アッセイ（左下）、およびMTTアッセイ（右）によって分析したsi-B9320-#2または対照siRNA（si-Scramble）に対するA498細胞の効果を描写する。siRNAによって処置した細胞におけるB9320転写物レベルを調べるためのRT-PCR実験。β2-MG発現レベルは定量的対照であった。si-B9320-#2ベクターはノックダウン効果を明らかにし、si-Scrambleは、B9320転写物レベルにいかなる効果も示すことができなかった。si-B9320-#2ベクターによるトランスフェクションにより、si-Scrambleをトランスフェクトした細胞と比較して、コロニー数の低減、および生存細胞数の低減が起こった（p＜0.0001；対応のないt検定）。8 depicts the siRNA knockdown effect of B9320 on RCC cell growth and cell viability. FIG. 14 (a) shows Caki against si-B9320 (# 2) or control siRNA (si-Scramble) analyzed by semi-quantitative RT-PCR (upper left), colony formation assay (lower left), and MTT assay (right). -Describes the effect of 2 cells. RT-PCR experiments to examine B9320 transcript levels in cells treated with siRNA. β2-MG expression level was a quantitative control. The si-B9320- # 2 vector revealed a knockdown effect and si-Scramble failed to show any effect on the B9320 transcript level. Transfection with si-B9320- # 2 vector resulted in a decrease in the number of colonies and viable cells compared to cells transfected with si-Scramble (p <0.0001; unmatched t-test) . Figure 14 (b) shows A498 cells against si-B9320- # 2 or control siRNA (si-Scramble) analyzed by semi-quantitative RT-PCR (upper left), colony formation assay (lower left), and MTT assay (right). Describe the effect of. RT-PCR experiments to examine B9320 transcript levels in cells treated with siRNA. β2-MG expression level was a quantitative control. The si-B9320- # 2 vector revealed a knockdown effect and si-Scramble failed to show any effect on the B9320 transcript level. Transfection with si-B9320- # 2 vector resulted in a decrease in the number of colonies and viable cells compared to cells transfected with si-Scramble (p <0.0001; unmatched t-test) . NIH3T3細胞における外因性のB9320の成長促進効果を描写する。図15（a）は、高レベルで外因性のB9320を発現する細胞または偽ベクターをトランスフェクトした細胞のウェスタンブロット分析の結果を描写する。B9320発現の外因性の誘導は、抗HAタグモノクローナル抗体によって確認した。β-アクチンはローディング対照とした。図15（b）は、NIH3T3-B9320細胞のインビトロ成長を描写する。MTTアッセイによって測定したB9320（B9320-1、-2、-3）および偽（Mock-1、-2、-3）をトランスフェクトしたNIH3T3細胞。Depicts the growth-promoting effect of exogenous B9320 in NIH3T3 cells. FIG. 15 (a) depicts the results of Western blot analysis of cells expressing high levels of exogenous B9320 or cells transfected with a mock vector. Exogenous induction of B9320 expression was confirmed by anti-HA tag monoclonal antibody. β-actin served as a loading control. FIG. 15 (b) depicts the in vitro growth of NIH3T3-B9320 cells. NIH3T3 cells transfected with B9320 (B9320-1, -2, -3) and mock (Mock-1, -2, -3) measured by MTT assay.

Claims (54)

患者由来の生物試料におけるRCC関連遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象におけるRCCまたはRCC発症の素因を診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該試料の発現レベルの上昇または低下が、該対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することを示す、方法。   A method of diagnosing a predisposition to developing RCC or RCC in a subject, comprising determining the expression level of an RCC-related gene in a patient-derived biological sample, wherein A method wherein an increase or decrease indicates that the subject is suffering from or at risk of developing RCC. 該RCC関連遺伝子がRCC 1〜251からなる群より選択され、正常対照レベルと比較した該試料の発現レベルの上昇が、該対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することを示す、請求項1記載の方法。   The RCC-related gene is selected from the group consisting of RCC 1-251 and an increase in the expression level of the sample compared to a normal control level indicates that the subject is suffering from or at risk of developing RCC; The method of claim 1. 該試料の発現レベルが該正常対照レベルより少なくとも10％高い、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the expression level of the sample is at least 10% higher than the normal control level. 該RCC関連遺伝子がRCC 252〜972からなる群より選択され、正常対照レベルと比較した該試料の発現レベルの低下が、該対象がRCCに罹患しているかまたはその発症リスクを有することを示す、請求項1記載の方法。   The RCC-related gene is selected from the group consisting of RCC 252 to 972, and a decrease in the expression level of the sample compared to a normal control level indicates that the subject is suffering from or at risk of developing RCC; The method of claim 1. 該試料の発現レベルが該正常対照レベルより少なくとも10％低い、請求項4記載の方法。   5. The method of claim 4, wherein the expression level of the sample is at least 10% lower than the normal control level. 複数のRCC関連遺伝子の該発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, further comprising determining the expression level of a plurality of RCC-related genes. 遺伝子発現レベルが以下からなる群より選択される方法で決定される、請求項1記載の方法：
(a) RCC関連遺伝子のmRNAの検出；
(b) RCC関連遺伝子にコードされるタンパク質の検出；および
(c) RCC関連遺伝子にコードされるタンパク質の生物活性の検出。 2. The method of claim 1, wherein the gene expression level is determined by a method selected from the group consisting of:
(a) detection of mRNA of RCC-related genes;
(b) detection of the protein encoded by the RCC-related gene; and
(c) Detection of the biological activity of the protein encoded by the RCC-related gene. 該ハイブリダイゼーション段階をDNAアレイ上で行う、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the hybridization step is performed on a DNA array. 該患者由来の生物試料が上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the patient-derived biological sample comprises epithelial cells. 該患者由来の生物試料が腎細胞癌細胞を含む、請求項1記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the patient-derived biological sample comprises renal cell carcinoma cells. 該患者由来の生物試料が腎細胞癌由来の上皮細胞を含む、請求項7記載の方法。   8. The method of claim 7, wherein the patient-derived biological sample comprises renal cell carcinoma-derived epithelial cells. RCC 1〜972からなる群より選択される2個以上のRCC関連遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、RCC参照発現プロファイル。   An RCC reference expression profile comprising gene expression patterns of two or more RCC-related genes selected from the group consisting of RCC 1-972. RCC 1〜251からなる群より選択される2個以上のRCC関連遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、RCC参照発現プロファイル。   An RCC reference expression profile comprising gene expression patterns of two or more RCC-related genes selected from the group consisting of RCC 1-251. RCC 252〜972からなる群より選択される2個以上のRCC関連遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、RCC参照発現プロファイル。   An RCC reference expression profile comprising gene expression patterns of two or more RCC-related genes selected from the group consisting of RCC 252-272. 以下の段階を含む、腎細胞癌を処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
(a) 被験化合物を、RCC 1〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと接触させる段階；
(b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および
(c) ポリペプチドに結合する被験化合物を選択する段階。 A method of screening for a compound for treating or preventing renal cell carcinoma comprising the following steps:
(a) contacting the test compound with a polypeptide encoded by a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 1-972;
(b) detecting the binding activity between the polypeptide and the test compound; and
(c) selecting a test compound that binds to the polypeptide. 以下の段階を含む、腎細胞癌を処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
(a) 候補化合物を1つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞と接触させる段階であって、該1つまたは複数のマーカー遺伝子がRCC 1〜972からなる群より選択される段階；および
(b) 対照と比較して、RCC 1〜251からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させる候補化合物、またはRCC 252〜972からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる候補化合物を選択する段階。 A method of screening for a compound for treating or preventing renal cell carcinoma comprising the following steps:
(a) contacting a candidate compound with a cell expressing one or more marker genes, wherein the one or more marker genes are selected from the group consisting of RCC 1-972; and
(b) a candidate compound that reduces the expression level of one or more marker genes selected from the group consisting of RCC 1-251 compared to the control, or one selected from the group consisting of RCC 252-972 Alternatively, selecting a candidate compound that increases the expression level of a plurality of marker genes. 該細胞が腎細胞癌細胞を含む、請求項16記載の方法。   17. The method of claim 16, wherein the cell comprises a renal cell carcinoma cell. 以下の段階を含む、腎細胞癌を処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
（a）被験化合物を、RCC 1〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（b）段階（a）のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（c）RCC 1〜251からなる群より選択されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの生物活性を、被験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する化合物、またはRCC 252〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの生物活性を、被験化合物の非存在下で検出されたポリペプチドの生物活性と比較して増強する被験化合物を選択する段階。 A method of screening for a compound for treating or preventing renal cell carcinoma comprising the following steps:
(A) contacting a test compound with a polypeptide encoded by a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 1-972;
(B) detecting the biological activity of the polypeptide of step (a); and (c) determining the biological activity of the polypeptide encoded by the polynucleotide selected from the group consisting of RCC 1-251, The absence of the test compound in the absence of the test compound, the compound that inhibits the biological activity of the polypeptide detected in the presence or the polypeptide encoded by a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 252-272 Selecting a test compound that enhances the biological activity of the polypeptide detected below. 以下の段階を含む、腎細胞癌を処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
(a) 1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と候補化合物を接触させる段階であって、該1つまたは複数のマーカー遺伝子がRCC 1〜972からなる群より選択される、段階；
(b) 該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
(c) 被験化合物の非存在下で検出されるレベルと比較して、該マーカー遺伝子がRCC 1〜251からなる群より選択されるアップレギュレートされたマーカー遺伝子である場合には該レポーター遺伝子の発現もしくは活性のレベルを低下させる候補化合物、または、該マーカー遺伝子がRCC 252〜972からなる群より選択されるダウンレギュレートされたマーカー遺伝子である場合には該レポーター遺伝子の発現もしくは活性のレベルを上昇させる候補化合物を選択する段階。 A method of screening for a compound for treating or preventing renal cell carcinoma comprising the following steps:
(a) contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of one or more marker genes and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region is introduced; Or a plurality of marker genes are selected from the group consisting of RCC 1-972;
(b) measuring the expression or activity of the reporter gene; and
(c) when the marker gene is an up-regulated marker gene selected from the group consisting of RCC 1-251 compared to the level detected in the absence of the test compound, the reporter gene Candidate compounds that reduce the level of expression or activity, or the level of expression or activity of the reporter gene if the marker gene is a down-regulated marker gene selected from the group consisting of RCC 252-272 Selecting candidate compounds to be increased. (a) RCC 1〜972からなる群より選択される2つもしくはそれ以上の核酸配列、または(b) それによりコードされるポリペプチドに結合する検出試薬を含む、キット。   A kit comprising (a) two or more nucleic acid sequences selected from the group consisting of RCC 1-972, or (b) a detection reagent that binds to the polypeptide encoded thereby. RCC 1〜972からなる群より選択される1つまたは複数の核酸配列に結合する2つまたはそれ以上の核酸を含む、アレイ。   An array comprising two or more nucleic acids that bind to one or more nucleic acid sequences selected from the group consisting of RCC 1-972. アンチセンス組成物を対象に投与する段階を含む、該対象における腎細胞癌を処置または予防する方法であって、該アンチセンス組成物が、RCC 1〜251からなる群より選択されるコード配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、方法。   A method of treating or preventing renal cell carcinoma in a subject comprising the step of administering an antisense composition to the subject, wherein the antisense composition is a coding sequence selected from the group consisting of RCC 1-251. A method comprising a complementary nucleotide sequence. siRNA組成物を対象に投与する段階を含む、該対象における腎細胞癌を処置または予防する方法であって、該siRNA組成物が、RCC 1〜251からなる群より選択される核酸配列の発現を減少させる、方法。   A method for treating or preventing renal cell carcinoma in a subject comprising administering to the subject an siRNA composition, wherein the siRNA composition expresses a nucleic acid sequence selected from the group consisting of RCC 1-251. Decrease the way. 対象における腎細胞癌を処置または予防する方法であって、RCC 1〜251からなる群より選択される遺伝子のいずれか1つによってコードされるタンパク質と結合する抗体またはその免疫活性断片の薬学的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。   A method for treating or preventing renal cell carcinoma in a subject, wherein the antibody or immunologically active fragment thereof binds to a protein encoded by any one gene selected from the group consisting of RCC 1-251 Administering an amount to the subject. 対象における腎細胞癌を処置または予防する方法であって、(a) RCC 1〜251からなる群より選択される核酸によってコードされるポリペプチド、(b) 該ポリペプチドの免疫活性断片、または(c) そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを該対象に投与する段階を含む、方法。   A method of treating or preventing renal cell carcinoma in a subject, comprising: (a) a polypeptide encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of RCC 1-251, (b) an immunoactive fragment of the polypeptide, or ( c) administering to the subject a vaccine comprising a polynucleotide encoding the polypeptide. 対象における腎細胞癌を処置または予防する方法であって、RCC 252〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチドの発現、またはそれにコードされるポリペプチドの活性を増大させる化合物を該対象に投与する段階を含む、方法。   A method of treating or preventing renal cell carcinoma in a subject, comprising administering to the subject a compound that increases the expression of a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 252 to 972, or the activity of a polypeptide encoded thereby. A method comprising steps. 請求項15〜21のいずれか一項記載の方法によって得られた化合物を投与する段階を含む、対象における腎細胞癌を処置または予防する方法。   22. A method for treating or preventing renal cell carcinoma in a subject comprising administering a compound obtained by the method of any one of claims 15-21. 対象における腎細胞癌を処置または予防する方法であって、(a) RCC 252〜972からなる群より選択されるポリヌクレオチド、または(b) それによってコードされるポリペプチドを含む作用物質の薬学的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。   A method of treating or preventing renal cell carcinoma in a subject comprising: (a) a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 252 to 972, or (b) an agent comprising an polypeptide encoded thereby Administering an effective amount to the subject. RCC 1〜251からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの薬学的有効量を含む、腎細胞癌を処置または予防するための組成物。   A composition for treating or preventing renal cell cancer, comprising a pharmaceutically effective amount of an antisense polynucleotide or a small interfering RNA against a polynucleotide selected from the group consisting of RCC 1-251. RCC 1〜251からなる群より選択される遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を含む、腎細胞癌を処置または予防するための組成物。   A composition for treating or preventing renal cell carcinoma, comprising a pharmaceutically effective amount of an antibody or fragment thereof that binds to a protein encoded by a gene selected from the group consisting of RCC 1-251. 活性成分として請求項15〜19のいずれか一項記載の方法によって選択される化合物の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、腎細胞癌を処置または予防するための組成物。   A composition for treating or preventing renal cell carcinoma, comprising a pharmaceutically effective amount of a compound selected by the method according to any one of claims 15 to 19 as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier. . C6700V2、B7032N、またはB9320V2の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）を含む組成物を対象に投与する段階を含む、該対象における腎細胞癌を処置または予防する方法。   A method of treating or preventing renal cell carcinoma in a subject comprising administering to the subject a composition comprising a small interfering RNA (siRNA) that inhibits expression of C6700V2, B7032N, or B9320V2. siRNAが、センス核酸配列と、C6700V2、B7032N、またはB9320V2由来の配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸配列とを含む、請求項32記載の方法。   35. The method of claim 32, wherein the siRNA comprises a sense nucleic acid sequence and an antisense nucleic acid sequence that specifically hybridizes with a sequence derived from C6700V2, B7032N, or B9320V2. 腎臓癌が腎細胞癌（RCC）である、請求項32記載の方法。   35. The method of claim 32, wherein the renal cancer is renal cell carcinoma (RCC). siRNAが、標的配列としてSEQ ID NO:43、47、81、106、または110からなる群より選択される配列に対応するリボヌクレオチド配列を含む、請求項33記載の方法。   34. The method of claim 33, wherein the siRNA comprises a ribonucleotide sequence corresponding to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110 as a target sequence. 該siRNAが一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]はSEQ ID NO: 43、47、81、106、または110のヌクレオチドからなる群より選択される配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチドループ配列であり、かつ[A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である、請求項35記載の方法。 The siRNA has the general formula
5 '-[A]-[B]-[A']-3 '
Wherein [A] is a ribonucleotide sequence corresponding to a sequence selected from the group consisting of the nucleotides of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110, and [B] is 3 to 36. The method according to claim 35, which is a ribonucleotide loop sequence consisting of 23 nucleotides, and [A ′] is a ribonucleotide sequence consisting of a complementary sequence of [A]. 該組成物がトランスフェクション促進剤を含む、請求項32記載の方法。   35. The method of claim 32, wherein the composition comprises a transfection facilitating agent. センス鎖がSEQ ID NO:43、47、81、106、または110からなる群より選択される標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、センス鎖と相補的であるリボヌクレオチド配列を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子が、C6700V2、B7032N、またはB9320 V2遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖分子。   A ribonucleotide sequence in which the sense strand comprises a ribonucleotide sequence corresponding to a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110, and the antisense strand is complementary to the sense strand And the sense strand and the antisense strand hybridize to each other to form a double-stranded molecule, and the double-stranded molecule is introduced into a cell that expresses the C6700V2, B7032N, or B9320 V2 gene, A double-stranded molecule comprising a sense strand and an antisense strand that inhibits gene expression. 標的配列が、SEQ ID NO:65、112、または118の群から選択されるヌクレオチド配列からの少なくとも約10の連続するヌクレオチドを含む、請求項38記載の二本鎖分子。   40. The double-stranded molecule of claim 38, wherein the target sequence comprises at least about 10 contiguous nucleotides from a nucleotide sequence selected from the group of SEQ ID NO: 65, 112, or 118. 標的配列が、SEQ ID NO:65、112、または118の群から選択されるヌクレオチド配列からの約19〜約25の連続するヌクレオチドを含む、請求項39記載の二本鎖分子。   40. The double-stranded molecule of claim 39, wherein the target sequence comprises from about 19 to about 25 contiguous nucleotides from a nucleotide sequence selected from the group of SEQ ID NO: 65, 112, or 118. 一本鎖リボヌクレオチド配列によって結合されたセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一のリボヌクレオチド転写物である、請求項40記載の二本鎖分子。   41. The double-stranded molecule of claim 40, which is a single ribonucleotide transcript comprising a sense strand and an antisense strand joined by a single-stranded ribonucleotide sequence. 約100ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項39記載の二本鎖分子。   40. The double-stranded molecule of claim 39, wherein the double-stranded molecule is an oligonucleotide of less than about 100 nucleotides in length. 約75ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項42記載の二本鎖分子。   43. The double-stranded molecule of claim 42, wherein the double-stranded molecule is an oligonucleotide less than about 75 nucleotides in length. 約50ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項43記載の二本鎖分子。   44. The double-stranded molecule of claim 43, wherein the double-stranded molecule is an oligonucleotide less than about 50 nucleotides in length. 約25ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項44記載の二本鎖分子。   45. The double-stranded molecule of claim 44, wherein the double-stranded molecule is an oligonucleotide of less than about 25 nucleotides in length. 約19〜約25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項45記載の二本鎖分子。   46. The double-stranded molecule of claim 45, which is an oligonucleotide of about 19 to about 25 nucleotides in length. 請求項39記載の二本鎖分子をコードするベクター。   40. A vector encoding the double-stranded molecule of claim 39. 二次構造を有しかつセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む転写物をコードする、請求項47記載のベクター。   48. The vector of claim 47, which encodes a transcript having a secondary structure and comprising a sense strand and an antisense strand. 転写物が、該センス鎖および該アンチセンス鎖に結合する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項48記載のベクター。   49. The vector of claim 48, wherein the transcript further comprises a single stranded ribonucleotide sequence that binds to the sense strand and the antisense strand. センス鎖核酸がSEQ ID NO:43、47、81、106、または110のヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖核酸がセンス鎖と相補的な配列からなる、センス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸との組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクター。   A combination of a sense strand nucleic acid and an antisense strand nucleic acid, wherein the sense strand nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110, and the antisense strand nucleic acid comprises a sequence complementary to the sense strand A vector comprising a polynucleotide comprising ポリヌクレオチドが一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]がSEQ ID NO:43、47、81、106、または110のヌクレオチド配列であり；[B]が、3〜23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；および[A']が、[A]と相補的なヌクレオチド配列である、請求項49記載のベクター。 Polynucleotide has the general formula
5 '-[A]-[B]-[A']-3 '
Wherein [A] is a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110; [B] is a nucleotide sequence consisting of 3 to 23 nucleotides; and [A 50. The vector of claim 49, wherein '] is a nucleotide sequence complementary to [A]. 活性成分としてC6700V2、B7032N、またはB9320V2の発現を阻害する低分子干渉RNA（siRNA）の薬学的有効量および薬学的に許容される担体を含む、腎細胞癌を処置または予防するための薬学的組成物。   A pharmaceutical composition for treating or preventing renal cell carcinoma comprising a pharmaceutically effective amount of a small interfering RNA (siRNA) that inhibits the expression of C6700V2, B7032N, or B9320V2 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier object. siRNAが、標的配列としてSEQ ID NO:43、47、81、106、または110からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項51記載の薬学的組成物。   52. The pharmaceutical composition of claim 51, wherein the siRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110 as a target sequence. siRNAが一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]がSEQ ID NO:43、47、81、106、または110のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり；[B]が、3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり；および[A']が、[A]と相補的なリボヌクレオチド配列である、請求項52記載の組成物。 siRNA is a general formula
5 '-[A]-[B]-[A']-3 '
Wherein [A] is a ribonucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43, 47, 81, 106, or 110; [B] is a ribonucleotide consisting of 3 to 23 nucleotides 54. The composition of claim 52, wherein the sequence is; and [A '] is a ribonucleotide sequence complementary to [A].
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