JP2009298805A - 血管系の特異的凝固のための方法および組成物 - Google Patents

血管系の特異的凝固のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】特異的凝固、例えば、腫瘍血管系中の凝固を達成する使用のための、
副作用が制限された新規な組成物および方法を提供することによる、先行技術の
制限を克服、および特定の血液凝固の達成に使用される種々の組成物および方法
の提供。
【解決手段】以下の（ａ）および（ｂ）：（ａ）疾患細胞、疾患関連血管系の
成分、または疾患関連支質の成分に結合する第１結合領域；該第１結合領域が作
動可能に連結した、（ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域、
を含むリガンド。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般に、血管および凝固の分野に関する。より詳細には、本発明は
、特異的凝固を達成する使用のための、二重特異性抗体を含む種々の増殖因子ベ
ースの試薬および免疫学的試薬を提供する。
過去３０年間の間に、新生物形成疾患の化学療法における進歩が実現されてき
た。これは、新しい化学療法剤の開発、より詳細には、薬物の同時投与のための
処法の開発におけるいくつかの進歩を含む。細胞レベルおよび組織レベルにおけ
る新生物形成のプロセス、および基礎となる抗新生物形成剤の作用のメカニズム
に対する重要な理解もまた、絨毛膜ガン腫、ウイルムス腫瘍、急性白血病、横紋
筋腫、網膜芽腫、ホジキン病およびバーキットリンパ腫を含む、多くの新生物形
成疾患の化学療法の進歩を可能にしてきた。いくつかの腫瘍において進歩がなさ
れてきたが、ヒトガンの最も普通の形態の多くはまだ、有効な化学療法の介入に
抵抗している。
いずれの処置処法でも言及しなければならない重要な根本的な問題は、「全細
胞殺傷」の概念である。この概念は、有効な処置処法を有するために、それが外
科的アプローチまたは化学療法的アプローチのいずれかまたはその両方であるか
どうかかかわらず、全てのいわゆる「クローン原性」悪性細胞の全細胞殺傷が存
在しなければならないこと、すなわち、制御されずに増殖しそして任意の腫瘍塊
に入れ替える能力を有する細胞が除去され得ることを確保する。全細胞殺傷を実
現する治療剤および治療処法を開発する究極の要求のためには、特定のタイプの
腫瘍が他の腫瘍より治療しやすい。例えば、軟組織腫瘍（例えば、リンパ腫）、
および血液および血液形成器官の腫瘍（例えば白血病）は、一般に、化学療法治
療に対してガン腫のような固形腫瘍よりも応答しやすい。
化学療法に対する軟組織腫瘍および血液ベースの腫瘍のこの感受性についての
１つの理由は、化学療法的介入に対してリンパ球および白血球が物理的に接近し
やすいからである。単純な投与では、大部分の化学療法剤は固形腫瘍塊の全ての
細胞に到達することが軟腫瘍および血液ベースの場合よりもはるかに難しく、そ
してそれゆえ全細胞殺傷を達成することがはるかに難しい。化学療法剤の投与量
を増大することにより、しばしば、毒性副作用が生じる。これは、一般に従来の
抗腫瘍剤の有効性を制限する。
成功した抗腫瘍剤を開発する戦略は、腫瘍細胞を選択的に殺すが、正常な組織
に対しては、存在しても比較的小さな不都合な作用しか示さない薬剤の設計を含
む。新生物形成組織と正常組織との間には定性的相違がほとんどないため、この
目標の達成は困難である。このために、多年にわたって多くの研究は、化学療法
および診断の両方のための免疫学的標的として供し得る腫瘍特異的「マーカー抗
原」を同定することに集中してきた。多くの腫瘍特異的、または準腫瘍特異的（
「腫瘍関連の」）マーカーが、特異的抗体により認識され得る腫瘍細胞抗原とし
て同定されてきた。不幸にも、一般に、腫瘍特異的抗体それ自体は、基本的にガ
ン治療に有用であるように十分な抗腫瘍効果を発揮しない。
つい最近、イムノトキシンが、ガン細胞を選択的に標的とする試みに利用され
た。イムノトキシンは、特異的な標的化剤、代表的には腫瘍特異的な抗体または
フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）と細胞毒性剤（例えば、トキシン部分）との
接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）である。標的化剤は、標的にされた抗原を有する
細胞にトキシンを向け、そしてこれらの細胞を殺すように設計される。「第２世
代」のイムノトキシン、例えば、脱グリコシル化されたリシンＡ鎖を利用して肝
臓によるイムノトキシンの取り込みを防ぎ、そして肝臓毒性を低減するような（
Ｂｌａｋｅｙら、１９８７ａ；ｂ）、およびイムノトキシンにインビボでより高
い安定性を与える新しい架橋剤を有するような（Ｔｈｏｒｐｅら、１９８８）イ
ムノトキシンが、現在開発されている。
イムノトキシンは、マウス（Ｔｈｏｒｐｅら、１９８８；Ｇｈｅｔｉｅら、１
９９１；Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９８８ａ；ｂ）およびヒト（Ｖｉｔｅｔｔａら、
１９９１）におけるリンパ腫および白血病を処置する際に有効であった。しかし
、リンパ系新形成は、腫瘍細胞が血液で運ばれるイムノトキシンに比較的に接近
しやすいため、特に、イムノトキシン療法を受けやすい。また、正常なリンパ球
抗原を標的にすることも可能である。なぜなら、治療の間に悪性細胞とともに殺
される正常なリンパ球は、標的抗原を欠く始原細胞から迅速に再形成されるから
である。
リンパ腫におけるこれらの効果とは対照的に、イムノトキシンは固形腫瘍の処
置において相対的に有効ではない（Ｗｅｉｎｅｒら、１９８９；Ｂｙｅｒｓら、
１９８９）。これに対する主な理由は、固形腫瘍が一般に抗体サイズ分子に対し
て不透過性であることである：注入投与量／ｇ腫瘍の０．００１％未満の比取込
み値はヒトの研究にはまれではない（Ｓａｎｄｓら、１９８８；Ｅｐｅｎｅｔｏ
ｓら、１９８６）。別の重要な問題は、抗原欠損変異体がイムノトキシンによる
殺傷からのがれ、そして再増殖し得ることである（Ｔｈｏｒｐｅら、１９８８）
。
さらに、腫瘍塊に侵入する抗体は、いくつかの理由により均一に分布しない。
第１に、腫瘍細胞の密なパッキングおよび繊維状の腫瘍支質が、高分子輸送に対
して圧倒的な物理的バリアーを示し、そしてリンパ球による排出がないことと組
み合わされて、腫瘍コアで浸出および液体対流を低減する高い割り込み圧力を作
り出す（Ｂａｘｔｅｒら、１９９１；Ｊａｉｎ、１９９０）。第２に、大部分の
腫瘍における血管の分布は、組織化されておらずかつ不均一であり、これにより
、いくつかの腫瘍細胞は、大きな拡散距離により、浸出する抗体から分離される
（Ｊａｉｎ、１９９０）。第３に、腫瘍に侵入する抗体の全てが、脈管周囲領域
において、最初に遭遇する腫瘍細胞により吸着され得、より遠い部位の腫瘍細胞
に到着するものをなくする（Ｂａｘｔｅｒら、１９９１；Ｋｅｎｎｅｌら、１９
９１）。
従って、固形腫瘍の処置のための新規戦略の開発に対する顕著な必要性が存在
することは明らかである。１つのアプローチは、腫瘍細胞よりもむしろ腫瘍の血
管系に薬剤を標的化することを含む。固形腫瘍の増殖は、腫瘍の血管形成に高度
に依存し、そして腫瘍細胞の増殖は、酸素、栄養素および他の増殖因子の供給、
および代謝産物の流出が満足される場合のみ維持され得る。実際、多くの現存す
る療法は、それらの作用の一部として、血管媒介の作用メカニズムを有し得るこ
とが既に観察されている（Ｄｅｎｅｋａｍｐ、１９９０）。
本発明者らは、血管系を標的にすることは、腫瘍から生命維持事象を奪い、そ
して腫瘍の増殖速度を低下させ、または腫瘍細胞の死をもたらすようであること
を提案する。このアプローチは、腫瘍細胞を直接標的にすることに対していくつ
かの利点を与えることが期待される。第１に、標的細胞は、静脈内投与された治
療剤に直接に接近し得、それにより、注入された投与量の高い割合を迅速に局在
化することを可能にする（Ｋｅｎｎｅｓら、１９９１）。第２に、毛細管のそれ
ぞれが腫瘍を取り込む「コード（ｃｏｒｄ）」中で数千の細胞に酸素および栄養
素を提供するため、腫瘍血管系に対する限られた損傷でさえ、腫瘍細胞死の雪崩
を生じる（Ｄｅｎｅｋａｍｐ、１９９０；Ｄｅｎｅｋａｍｐ、１９８４）。最後
に、標的抗原を欠く変異体内皮細胞の外殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は有りそうも
ない。これらは正常細胞だからである。
現時点では、腫瘍血管の標的化を成功させるため、正常組織中の内皮細胞では
なく、腫瘍の内皮細胞を認識する抗体が必要であることが一般に受け入れられて
いる。数種の抗体が開発されたが（Ｄｕｉｊｖｅｓｔｉｊｎら、１９８７；Ｈａ
ｇｅｍｅｉｅｒら、１９８６；Ｂｒｕｌａｎｄら、１９８６；Ｍｕｒｒａｙら、
１９８９；Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９８５）、いずれも高度な特異性を
示さなかった。また、血管を標的にする抗体接合体中の第２の薬剤として有望な
任意の特定の薬剤は、上記トキシン以外には報告されていないようである。従っ
て、不幸にも、血管を標的にすることは一定の理論的利点を示すが、これらの利
点を取り込む有効な戦略はまだ開発されていない。
本発明は、特異的凝固、例えば、腫瘍血管系中の凝固を達成する使用のための
、副作用が制限された新規な組成物および方法を提供することにより、先行技術
の制限を克服する。本発明は、一般的および全体的意味では、疾患に関連する血
管系中の凝固を刺激し得る種々の新規な免疫学的因子および増殖因子ベースの二
重特異性組成物、ならびにこれらの調製方法および使用方法を提供する。
本発明は、一般に「二重特異性結合リガンド」として記載され得る結合リガン
ドを提供する。このようなリガンドは、代表的には、疾患と関連する標的細胞（
例えば、腫瘍細胞）、またはこのような細胞と関連する成分；疾患と関連する血
管系（例えば、腫瘍血管系）に関連する特定の成分；あるいは疾患と関連する支
質の成分またはそれと関連する成分に結合する「第１結合領域」を含む。第１結
合領域は、凝固因子それ自身であり得るか、または凝固因子に結合し得る第２結
合領域であり得る「凝固剤」と作動可能に会合するかまたは連結される。
本発明の結合リガンドは、「二重特異性」として記載される。なぜなら、これ
らは「少なくとも」二重特異性であり、すなわち、これらは最小でも２つの機能
的に異なる領域を含むからである。他の構築物（例えば、三重特異性および多重
特異性の結合リガンド）を使用する組成物および方法もまた、本発明の範囲内に
含まれる。本明細書中に記載の二重特異性凝固リガンドを、他のエフェクター（
例えば、他の免疫学的因子および増殖因子ベースの組成物、抗原誘発剤、免疫刺
激剤、免疫抑制剤、化学療法薬物など）とともに使用する、組み合わせ組成物、
キットおよび方法もまた意図される。
第１結合領域および任意の第２結合領域は、抗体またはそのフラグメントであ
り得る。本明細書中で使用される用語「抗体」とは、任意の免疫学的結合剤（例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を広く意味することが意
図される。一般に、ＩｇＧまたはＩｇＭが好ましい。なぜなら、これらは、生理
学的状態で最も一般な抗体であり、そしてこれらは実験室設定中で最も容易に作
製されるからである。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、一定の利点（例えば、
再生産性および大規模生産）を有し、そしてそれらの使用が一般に好ましいこと
が認識されている。操作された抗体（例えば、組換え抗体およびヒト化された抗
体）もまた、本発明の範囲内に入る。
抗体の抗原結合領域が結合および標的化剤として利用される場合、完全な抗体
分子が利用され得る。あるいは、抗体のＦｖ、ｓｃＦｖ（一重鎖Ｆｖ）、Ｆａｂ
’、Ｆａｂ、ＤａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントにより例示されるように
機能的な抗原結合領域が使用され得る。種々の抗体ベースの構築物を調製および
使用する技術は、該当分野で周知であり、そして本明細書にさらに記載されてい
る。
結合リガンドの凝固因子部分は、それが有意な機能的能力を維持するように形
成され、すなわち、結合リガンドの凝固因子部分は、標的領域に送達されるとき
に、それがまだ血液凝固または血餅形成を促進するその能力を保持するような形
態である。しかし、特定の実施態様では、結合リガンドの凝固因子部分は、例え
ば、コアギュラントの天然の相応物よりも活性が少なく、そしてこの因子は、標
的領域への送達に際してのみ所望のレベルの活性を達成する。このような例の１
つは、Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子であるが、これは、膜環境へ
の二重特異性リガンドの第１結合領域の結合に際して有意な機能的活性を達成す
る。
第２結合領域が凝固因子に結合するために使用される場合、これは、一般に、
凝固を誘導するその能力を有意に損害しない凝固因子上の部位を認識するように
選択される。同様に、凝固因子が第１結合剤に共有結合する場合、その機能的凝
固部位と異なる部位が、一般に、分子を連結するために使用される。
本発明の二重特異性リガンドの「第１結合領域」は、指定の標的部位、すなわ
ち、凝固が必要とされる腫瘍領域または他の疾患部位と関連する部位に結合する
任意の成分であり得る。標的分子は、腫瘍を標的にする場合、一般に、腫瘍部位
中では非腫瘍部位中よりも高い濃度で存在する。特定の好ましい実施態様では、
標的分子は、腫瘍細胞、腫瘍血管細胞、腫瘍関連支質、または他の成分と関連す
るかどうかにかかわらず、このような細胞または他の腫瘍関連の実体に制限され
る。しかし、これは、本発明の要件ではない。
この点に関して、腫瘍血管系は、「プロトロンボチック（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂ
ｏｔｉｃ）」であり、そして凝固する傾向にあることに注意されべきである。従
って、標的コアギュラントは、腫瘍血管系を優先的に凝固させるが、たとえ他の
正常細胞または体成分、特に、正常な内皮細胞または支質でさえもが標的分子の
有意なレベルを発現しても、正常組織の血管系を凝固させないことが意図される
。従って、このアプローチは、例えば、ガンの処置手段として、ヒトでの使用が
、腫瘍血管系にトキシンを標的づける使用よりも安全であると考えられる。
特定の実施態様では、本発明における使用のために意図される第１結合領域は
、腫瘍細胞成分または腫瘍細胞と関連する成分に関し得る。一般に、腫瘍細胞を
標的にする際、第１結合リガンドは、二重特異性結合リガンドの凝固因子成分を
、血管に最も近い血管周囲の腫瘍細胞上に濃縮し、それにより、腫瘍血管の凝固
の引金となり、二重特異性結合リガンドに有意な有用性を与えると考えられる。
従って、第１結合領域は、腫瘍細胞に結合する抗体または他の薬剤のような成
分であり得る。「腫瘍細胞に結合する」薬剤は、本明細書中で任意の接近可能な
成分または腫瘍細胞の成分に結合するリガンドとして、あるいは本明細書にさら
に記載されるように、それ自身が腫瘍細胞に結合するかまたは腫瘍細胞と関連す
る成分に結合するリガンドとして定義される。
このような腫瘍結合リガンドの大多数は、細胞表面腫瘍抗原またはマーカーに
結合する薬剤、特に抗体であることが意図される。このような抗原の多くは、抗
原結合および腫瘍標的化における使用のための種々の抗体が存在するように、公
知である。従って、本発明は、表Ｉに例示されるような同定された腫瘍細胞表面
抗原に結合する第１結合領域（例えば、抗体の抗原結合領域）、および表ＩＩに
例示される腫瘍細胞への結合のようなインタクトの腫瘍細胞に優先的にまたは特
異的に結合する第１結合領域を含む。
現在、腫瘍細胞結合領域の好ましい例は、細胞表面腫瘍抗原ｐ１８５ＨＥＲ２
、乳汁ムチンコアタンパク質（ｍｉｌｋ ｍｕｃｉｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）、ＴＡＧ−７２、ルイスａまたはガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する抗体
の抗原結合領域を含む領域である。現在好ましい腫瘍細胞結合領域の別のグルー
プは、抗体９．２．２７、ＯＶ−ＴＬ３、ＭＯｖ１８、Ｂ３、ＫＳ１／４、２６
０Ｆ９またはＤ６１２に結合する、腫瘍関連抗原に結合する抗体の抗原結合性領
域を包含する領域である。
抗体９．２．２７は高分子量（Ｍｒ）のメラノーマ抗原に結合し、ＯＶ−ＴＬ
３およびＭＯｖ１８の両方は卵巣関連の抗原に結合し、Ｂ３およびＫＳ１／４は
ガン腫抗原に結合し、２６０Ｆ９は***ガン腫に結合し、そしてＤ６１２は結腸
直腸ガン腫に結合する。Ｄ６１２、Ｂ３またはＫＳ１／４と同じ抗原に結合する
抗原結合部分が特に好ましい。Ｄ６１２は米国特許第５，１８３，７５６号に記
載されており、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９７９６を有し；Ｂ３は米国特許第５，２
４２，８１３号に記載されており、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０５７３を有し；そ
して組換えおよびキメラＫＳ１／４抗体は米国特許第４，９７５，３６９号に記
載されており；それぞれは参考として本明細書中に援用される。
腫瘍細胞標的化において、腫瘍マーカーが、生物学的リガンドが同定されてい
る成分（例えば、レセプター）である場合、抗体よりもむしろこのリガンド自体
がまた標的化剤として利用され得る。このようなリガンドの活性フラグメントま
たは結合領域もまた利用され得る。
本発明における使用のための第１結合領域はまた、腫瘍細胞マーカーと関連す
るリガンドに結合する成分であり得る。例えば、目的の腫瘍抗原が細胞表面レセ
プターである場合、インビボの腫瘍細胞は、それらの表面に結合しそして標的と
して利用可能な、対応する生物学的リガンド（例えば、ホルモン、サイトカイン
または増殖因子）を有する。これは、腫瘍細胞によって生成され、続いてこの細
胞の表面に結合され得る循環性リガンドおよび「パラ分泌型」リガンドの両方を
含む。
従って、本発明はさらに、同定された腫瘍細胞表面抗原（表Ｉに例示されるよ
うな）に結合するリガンドに結合するか、あるいは１つまたはそれ以上のインタ
クトの腫瘍細胞に優先的にまたは特異的に結合する第１結合領域（例えば、抗体
およびそのフラグメント）を包含する。さらに、レセプター自体、または好まし
くはレセプターまたはレセプター結合ドメインの操作された形態または可溶性形
態もまた二重特異性凝固リガンドの結合領域として利用され得る。
さらなる実施態様では、第１結合領域は、腫瘍部位以外の疾患部位で特異的ま
たは優先的に発現される標的分子に結合する成分であり得る。他の疾患細胞と関
連する代表的な標的分子は、例えば、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）と関連するＰ
ＳＡおよび増殖性糖尿病性網膜症と関連するＦＧＦを含む。上記の疾患の１つを
有する動物または患者は、疾患部位における凝固の特異的誘発から恩恵を受け得
ると考えられる。
本明細書の文脈中では「疾患細胞」の意味は、疾患または障害と関連した細胞
である。この細胞は、非疾患の部位および細胞中のレベルに比べて、疾患の部位
および細胞中でより高い濃度で存在する標的可能な成分を発現するかまたはそれ
と関連する。これは、疾患部位中の血管系と関連する標的可能な成分を含む。
他の疾患部位にコアギュラントを標的づけかつ送達する使用のための代表的な
第１結合領域は、抗体（例えば、抗−ＰＳＡ（ＢＰＨ）、およびＦＧＦに結合す
るＧＦ８２、ＧＦ６７ ３Ｈ３）を含む。対応するレセプター（この場合はＦＧ
Ｆレセプター）に結合する生物学的結合リガンド（例えば、ＦＧＦ）もまた使用
され得る。以下に記載されるように、血管標的に対する抗体もまた使用され得る
。支質または内皮細胞の標的化は、他の疾患を処置する強力な手段を提供し、こ
こで「疾患細胞」自体は強力または独特なマーカー抗原と関連しなくても良い。
さらなる実施態様では、本発明の第１結合領域は、疾患関連の血管系、すなわ
ち、特異的凝固が動物または患者に有利であり得る血管系の領域の成分に結合し
得る成分である。腫瘍血管系と特異的または優先的に関連する成分に結合し得る
第１結合領域が、現時点では好ましい。「腫瘍血管系の成分」は、腫瘍血管系内
皮細胞表面分子および細胞表面レセプターまたは分子に結合し得る任意の成分（
例えば増殖因子）の両方を含む。
特定の好ましい結合リガンドは、細胞表面レセプターに結合する抗体およびそ
のフラグメント、ならびにこれらのレセプターの対応する生物学的リガンドに結
合する抗体である。代表的な抗体は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＶＥＧＦ／
ＶＰＥレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＧＦβレセプター、ＴＩＥ（ＴＩＥ−
１およびＴＩＥ−２を含む、チロシンキナーゼ−免疫グロブリン−上皮増殖因子
様レセプター）、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、αｖβ３イ
ンテグリン、プレイオトロピン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、エンドシアリン（
ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）およびエンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）に結合する抗
体である。
エンドグリンに結合する抗体の抗原結合領域を含む第１結合領域は、好ましい
薬剤の１群である。これらは、モノクローナル抗体ＴＥＣ−４またはモノクロー
ナル抗体ＴＥＣ−１１と同じエピトープに結合する抗体およびフラグメントによ
り代表される。
ＶＥＧＦレセプターに結合する抗体の抗原結合領域は、好ましい薬剤の別の群
である。これらは、特に、モノクローナル抗体３Ｅ１１、３Ｅ７、５Ｇ６、４Ｄ
８、１０Ｂ１０またはＴＥＣ−１１０と同じエピトープに結合する抗体またはフ
ラグメントにより代表される。以下のように名付けた抗体の任意の１つと実質的
に同じ結合特異性を有する抗−ＶＥＧＦ抗体もまた使用され得る：１Ｂ４、４Ｂ
７、１Ｂ８、２Ｃ９、７Ｄ９、１２Ｄ２、１２Ｄ７、１２Ｅ１０、５Ｅ５、８Ｅ
５、５Ｅ１１、７Ｅ１１、３Ｆ５、１０Ｆ３、１Ｆ４、２Ｆ８、２Ｆ９、２Ｆ１
０、１Ｇ６、１Ｇ１１、３Ｇ９、９Ｇ１１、１０Ｇ９、ＧＶ９７、ＧＶ３９、Ｇ
Ｖ９７γ、ＧＶ３９γ、ＧＶ５９またはＧＶ１４。さらに適切な抗ＶＥＧＦ抗体
は、４．６．１．、Ａ３．１３．１、Ａ４．３．１およびＢ２．６．２（Ｋｉｍ
ら、１９９２）；ＳＢＳ９４．１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｇ１
４３−２６４およびＧ１４３−８５６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む。
さらに有用な抗体は、腫瘍血管系細胞表面レセプターに結合するリガンドに結
合する抗体である。従って、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβに結合する抗
体、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連のイソ型フィブロネクチン、スキャッ
ター因子（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小
板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦ（ＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦｂを含む）およびＴ
ＩＭＰ（メタロプロテイナーゼの組織インヒビター、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−
２およびＴＩＭＰ−３を含む）は、これらの実施態様で有用であり、そのうち、
ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβに結合する抗体、ＴＩＥに結合するリガン
ドまたは腫瘍関連イソ型フィブロネクチンがしばしば好ましい。
さらに別の実施態様では、腫瘍血管系に特異的なマーカーは、最初に誘導され
た、すなわち、それの発現が人間の手によって特異的に操作されたマーカーであ
り得、それにより、結合リガンド（例えば、抗体）を用いる次の標的化を可能に
する。
代表的な誘導性抗原は、単核細胞、マクロファージ、肥満細胞、ヘルパーＴ細
胞、ＣＤ８−陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞または腫瘍細胞によってさえ放出され得るよ
うな、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βま
たはＩＦＮ−γ）により誘導性抗原を含む。誘導された標的の例は、Ｅ−セレク
チン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、エンドグリンおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原
である。ＭＨＣクラスＩＩ誘導を使用する場合、正常組織中のＭＨＣクラスＩＩ
の抑制が、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、または機能
的に等価な薬剤）を用いて達成され得るように、一般に必要とされる。
さらに誘導性抗原は、コアギュラント（例えば、トロンビン、第ＩＸ／ＩＸａ
因子、第Ｘ／Ｘａ因子、プラスミンまたはメタロプロテイナーゼ（マトリックス
メタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ））によって誘導性抗原を含む。一般に、トロン
ビンによって誘導性抗原が使用される。この群の抗原は、Ｐ−セレクチン、Ｅ−
セレクチン、ＰＤＧＦおよびＩＣＡＭ−１を含み、そのうち、Ｐ−セレクチンお
よび／またはＥ−セレクチンの誘導および標的化が一般に好ましい。
リガンド−レセプター複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）に存在するが、個々のリガン
ドおよびレセプターの両方には存在しないエピトープに結合する抗体もまた使用
され得る。このような抗体は、細胞表面に存在するリガンド−レセプター複合体
を認識し、かつそれに結合するが、遊離のリガンドまたは複合体化されていない
レセプターには結合しない。従って、本明細書中で使用される「リガンド−レセ
プター複合体」は、リガンド（例えば、増殖因子）がそのレセプター（例えば、
増殖因子レセプター）に特異的に結合する場合に生成される結果としての複合体
を意味する。これは、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦレセプター複合体により代表される。
このようなリガンド−レセプター複合体は、腫瘍に関連しない内皮細胞よりも
腫瘍関連の内皮細胞上で有意に多い数で存在するようであり、それゆえ、抗複合
体抗体により標的化され得ることが期待される。抗複合体抗体は、モノクローナ
ル抗体２Ｅ５、３Ｅ５または４Ｅ５と同じエピトープに結合するような抗体およ
びそのフラグメントを含む。
さらなる実施態様では、本発明における使用のために意図される第１結合領域
は、疾患関連の支質の成分（例えば、腫瘍関連の支質の成分）に結合する。これ
は、基底膜成分、活性された血小板および誘導性の腫瘍支質成分、特にコアギュ
ラント（例えば、トロンビン）によって誘導性の成分に結合する抗体の抗原結合
領域を含む。「活性化された血小板」は、本明細書では腫瘍支質の成分として定
義され、その理由の１つは、それらが活性されるときに支質に結合することであ
る。
腫瘍関連支質の好ましい標的可能な要素は、現在のところ、腫瘍関連イソ型フ
ィブロネクチンである。イソ型フィブロネクチンは、インテグリンファミリーの
レセプターに結合するリガンドである。腫瘍関連のイソ型フィブロネクチンは、
例えば、ＭＡｂ ＢＣ−１によって認識されるように利用可能である。従って、
このＭａｂ、および類似の特異性を有する他のＭａｂは、本発明における使用の
ために好ましい薬剤である。イソ型フィブロネクチンは、支質成分であるが、内
皮細胞に結合し、それゆえ、本発明の文脈では標的可能な血管内皮細胞結合リガ
ンドとして考慮され得る。
好ましい抗支質抗体の別の群は、フィブリノーゲン上のＲＩＢＳ（レセプター
誘導結合部位）に結合する抗体である。ＲＩＢＳは、標的可能な抗原であり、支
質におけるＲＩＢＳの発現は活性化された血小板によって指示される。活性化さ
れた血小板上のリガンド誘導結合部位であるＬＩＢＳに結合する抗体もまた有用
である。
有用な抗体のさらなる群の１つは、種々の良性および悪性の腫瘍の支質で発現
される高分子量の細胞外糖タンパク質であるテネイシンに結合する抗体である。
それゆえ、Ｓｈｒｅｓｔｈａら（１９９４）に記載されるような抗体およびＴｕ
ｏｍｉｎｅｎ ＆ Ｋａｌｌｉｏｉｎｅｎ（１９９４）により記載される１４３
ＤＢ７Ｃ８は、コアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）の結合部分として
使用され得る。
「疾患および腫瘍関連の支質の成分」は、種々の細胞型、マトリックス成分、
エフェクター、およびそのいくつかが「支質」の最も狭い定義から外れると考え
られ得る他の分子成分を含むが、疾患領域（例えば、腫瘍）と優先的に関連する
標的可能な実体である。
従って、第１結合領域は、平滑筋細胞、周囲細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）、繊維
芽細胞、マクロファージ、浸潤性リンパ球または白血球に結合する抗体またはリ
ガンドであり得る。第１結合領域はまた、結合組織の成分に結合し得、そして例
えば、フィブリン、プロテオグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、およびアニ
オン性ポリサッカライド（例えば、へパリンおよびへパリン様化合物）に結合す
る抗体およびリガンドを含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の血管系および支質結合リガンドは、それ
ら自体が抗体であるよりもむしろ生物学的なリガンドまたはその一部分である結
合領域である。この意味では、「生物学的なリガンド」は、サイトカイン、ホル
モン、増殖因子などにより代表されるように、細胞表面分子（例えば、レセプタ
ー）に結合するかまたはこれと会合し、支質中または血管細胞上に接近可能な分
子である。任意のそのような増殖因子またはリガンドが、それが疾患関連の支質
または血管系、例えば、腫瘍血管系内皮細胞の表面上に存在する特異的生物学的
レセプターに結合する限り、使用され得る。
本発明のこれらの局面における使用のための適切な増殖因子は、例えば、ＶＥ
ＧＦ／ＶＰＦ（血管内皮増殖因子／血管透過性因子）、ＦＧＦ（タンパク質の繊
維芽細胞増殖因子ファミリー）、ＴＧＦβ（形質転換増殖因子Ｂ）、ＴＩＥに結
合するリガンド、腫瘍関連のイソ型フィブロネクチン、スキャッター因子（ｓｃ
ａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板因子４（ＰＦ
４）、ＰＤＧＦ（血小板由来の増殖因子）、ＴＩＭＰまたはＩＬ−８、ＩＬ−６
またはＸＩＩＩａ因子さえを含む。ＶＥＧＦ／ＶＰＦおよびＦＧＦがしばしば好
ましい。
公知のレセプターに基づいた結合リガンド構築物を用いて内皮細胞結合成分（
例えば、サイトカインまたは増殖因子）を標的にすることもまた意図される。一
般に、レセプターが標的化成分として使用される場合、レセプターの短縮型また
は可溶性形態が利用され得る。このような実施態様では、標的化された内皮細胞
結合成分が二量体リガンド（例えば、ＶＥＧＦ）であることが特に好ましい。こ
れが好ましい理由は、二量体の１つ成分が既に細胞表面レセプターにインサイチ
ュで結合され、二量体の他の成分を二重特異性の凝固リガンドの可溶性レセプタ
ー部分に結合するために利用されるように残すからである。
疾患関連の血管系の成分に結合し得る少なくとも１つの標的化領域を含む二重
特異性、あるいは三重または多重特異性リガンドは、血管内皮細胞、および疾患
関連の薬剤（例えば、活性化された血小板）が、異なる疾患において（特に異な
る腫瘍において）類似しているという利点を有する。この現象は、個々の疾患ま
たは特異的な腫瘍タイプのそれぞれに薬剤を合わせなければならないよりも、多
くの疾患およびガンのタイプを１種の薬品で処置することを実行可能にする。
それゆえ、本発明の組成物および方法は、血管成分を有する良性および悪性疾
患を処置するための使用に適切である。このような血管系関連疾患は、良性増殖
（例えば、ＢＰＨ）、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、動静脈性奇形（ＡＶＭ）、
髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障および乾癬を含む。さらにこの群に含まれるの
は、滑膜炎、皮膚炎、子宮内膜炎、血管繊維腫、慢性関節リウマチ、アテロマ硬
化斑、角膜移植新血管化、血友病性関節、過形成性瘢痕、ｏｓｌｅｒ−ｗｅｂｅ
ｒ症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後繊維増殖、硬皮症、トラコーマおよび血管癒
着である。上記疾患のそれぞれは、共通の血管依存性病理学を有することが知ら
れ、それゆえ、これは、疾患部位において凝固を達成することが有益であり得る
ことが意図される。
本発明の二重特異性結合リガンド−凝固因子接合体は、例えば、生化学的架橋
剤、および好ましくは、ＳＭＰＴにより代表されるように、血中においてかなり
の安定性を有するものを使用することにより、２つまたはそれ以上成分が共有結
合される接合体であり得る。これらの成分はまた、周知のアビジン（またはスト
レプトアビジン）およびビオチンの組み合わせを使用して連結され得る。種々の
架橋剤、アビジン：ビオチン組成物および組み合わせ、ならびに接合体を調製す
る技術は、当該分野で周知であり、そして本明細書にさらに記載される。
あるいは、このような二重特異性凝固剤は、分子生物学的技術、即ち、結合リ
ガンドまたは領域をコードする遺伝子（またはｃＤＮＡ）を凝固因子をコードす
る遺伝子（またはｃＤＮＡ）に連結することにより調製される融合タンパク質で
あり得る。このことは当該技術分野で周知であり、そして本明細書でさらに記載
される。代表的には、凝固因子をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結
された第１の結合領域をコードするＤＮＡセグメントを同じリーディングフレー
ムで含む発現ベクターが調製され、そして組換え宿主細胞がコードされた融合タ
ンパク質を産生するようにこのベクターを発現する。
本発明で使用するための凝固因子は、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩ
ａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子または第Ｘ／Ｘａ因子のような、ビタミンＫ依存性
凝固因子の１つを含み得る。第Ｖ／Ｖａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第
ＸＩ／ＸＩａ因子、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子および第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ因子
もまた用いられ得る。
特定の局面は、Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子に関する。このよ
うな因子は、ビタミンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子を、原核生物宿主細
胞中（この細胞はＧｌｕからＧｌａへの改変を行うことができない）で発現する
ことにより調製され得る。この因子はまた、必要なまたは「対応する」グルタミ
ン酸残基を欠いているビタミンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子操作された
凝固因子遺伝子を作成し、次いで、この遺伝子操作された遺伝子を、実際に、任
意の組換え宿主細胞で発現することにより調製され得る。同様に、このような凝
固因子はまた、ビタミンＫ依存性凝固因子タンパク質を処理して対応するグルタ
ミン酸残基を除去または改変することにより調製され得る。
本発明の結合リガンドに使用される好ましい凝固因子は、組織因子および組織
因子誘導体である。有用な組織因子の１つのグループは、第ＶＩＩ因子を活性化
する能力を欠く変異体である。組織因子は、一般にアミノ酸配列の約１５７位と
約１６７位との間の領域に由来する１つまたはそれ以上のアミノ酸を改変するこ
とにより第ＶＩＩ因子を活性化する能力における欠損を与え得る。例示の変異体
は、１５８位のＴｒｐがＡｒｇに；１６２位のＳｅｒがＡｌａに；１６４位のＧ
ｌｙがＡｌａに変化した変異体；ならびに１５８位のＴｒｐがＡｒｇに、かつ１
６２位のＳｅｒがＡｌａに変化した二重変異体である。
さらに好ましい組織因子誘導体は、短縮型組織因子、二量体またはなお多量体
の組織因子、および二量体またはなお多量体の短縮型組織因子である。
本発明は、少なくとも１つの他の組織因子または誘導体に作動可能に連結され
た組織因子または誘導体を含む新規な組織因子構築物をさらに提供する。短縮型
組織因子が好ましく、短縮型の組織因子が改変されて疎水性膜挿入部分を含む場
合が特に好ましい。
本明細書で規定されるように「疎水性膜挿入部分」は、組織因子の膜への挿入
または膜との機能的接触を指向する１つまたはそれ以上のユニットである。本発
明の疎水性膜挿入部分は、約３と約２０との間の疎水性アミノ酸のような実質的
に疎水性のアミノ酸の連続部分により；および脂肪酸によっても例示される。
疎水性アミノ酸は、短縮型組織因子のＮ末端もしくはＣ末端に配置され得るか
、または分子の別の点に付加され得るかのいずれかである。疎水性アミノ酸が用
いられる場合、これらは、有利には、分子生物学的技術により分子中に組み込ま
れ得る。同様に、疎水性アミノ酸または脂肪酸は、合成化学技術を用いて組織因
子に付加され得る。
本発明の組織因子二量体、三量体および多量体では、組織因子または誘導体の
各々は、例えば、ジスルフィド、チオエーテルまたはペプチド結合を介して作動
可能に連結され得る。ある実施態様では、組織因子ユニットは、その使用が意図
される血漿中、または生理学的環境中で実質的に安定である結合を介して連結さ
れる。これは、組織因子の二量体形態が生物学的に最も活性であることが証明さ
れ得るという本発明者らの思想に基づく。しかし、本発明の方法では、組織因子
単量体が活性であることが知られているように、安定な結合が必要な訳ではない
。
二量体および多量体中の１つまたはそれ以上の組織因子または短縮型組織因子
はまた、改変されて、結合領域のような第２の薬剤に組織因子構築物を連結する
ために適切である末端システイン残基または別の部分を含み得る。
従って、選択的に切断可能なアミノ酸配列を含むペプチドを含む、組織因子単
量体、短縮型組織因子、および組織因子二量体ならびに多量体は、本発明の別の
局面を形成する。ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘ
ａ因子、または間質コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）、ま
たはストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）のようなメタロプロテイナーゼ
に対する切断部位を含むペプチドリンカーが特に好ましい。
従って、組織因子単量体、短縮型組織因子、組織因子二量体および多量体、な
らびに実際任意のコアギュラントを、生物学的に放出可能な結合を介して、抗体
、抗体の抗原結合領域、リガンド、またはレセプターのような第２の薬剤に連結
し得る。上記の列挙したプロテイナーゼに対する切断部位を含むペプチドリンカ
ーの選択は、例えば、腫瘍環境内のそのようなプロテイナーゼの存在に基づく。
腫瘍部位に対する二重特異性薬剤またはリガンドの送達は、切断を生じると予想
され、凝固因子の相対的に特異的な放出を生じる。
本発明の特定の構築物は、その配列中に作動可能に連結した一連の以下のユニ
ットを含む構築物である：システイン残基、選択的に切断可能なペプチドリンカ
ー、疎水性アミノ酸の連続部分、第１の短縮型組織因子、および第２の短縮型組
織因子；または配列中に：第１のシステイン残基、選択的に切断可能なペプチド
リンカー、疎水性アミノ酸の第１の連続部分、第１の短縮型組織因子、第２の短
縮型組織因子、および疎水性アミノ酸の第２の連続部分；ここで各構築物は、抗
体、リガンドまたはレセプターのような第２の薬剤に連結されてもよく、または
連結されなくてもよい。
他の適切な凝固因子は、ラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーター；トロ
ンボキサンＡ２およびトロンボキサンＡ２シンターゼのような血小板活性化化合
物；およびα２−抗プラスミンのようなフィブリン溶解のインヒビターである。
凝固因子が複合体に共有結合しないが、構築物の標的化物に作動可能に連結し
ている第２の結合領域への結合手段により非共有結合する結合リガンドもまた、
本発明に包含される。適切な「第２の結合領域」は、凝固因子に対して結合特異
性を有する抗体の抗原結合部位を含み、これには、ＳｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体の機能的部分が含まれ
る。
従って、ビタミンＫ依存性凝固第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子
、第ＩＸ／ＩＸａ因子、または第Ｘ／Ｘａ因子；Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依
存性凝固因子；組織因子、変異体組織因子、短縮型組織因子、二量体組織因子、
多量体組織因子、二量体短縮型組織因子；プレカリクレイン；第Ｖ／Ｖａ因子、
第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、
および第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ因子；ラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベー
ター、トロンボキサンＡ２またはα２−抗プラスミンに対して指向された抗体、
またはそれらのフラグメントを含む結合リガンドが考慮される。
非共有結合した凝固剤は、凝固因子に結合され得るか、または凝固因子と「予
め複合体化」され得、それらを用いて、投与の際に、外因性凝固因子を動物の疾
患部位（例えば腫瘍血管系）に送達し得る。同様に、凝固因子に特異的な第２の
結合領域を含む結合リガンドもまた、「非複合体化」形態および特異的凝固をな
お達成する機能で動物に投与され得る；この例では、薬剤は、循環（内因性）凝
固因子を蓄積し得、そしてそれを疾患部位または腫瘍部位内に濃縮する。
用語「凝固因子」または凝固剤は、内因性凝固因子およびその誘導体、または
組換え型を含む外から添加された型のこのような因子であり得る。コアギュラン
ト（本発明の「コアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）」）は、トキシン
（イムノトキシン）に対して明確な利点を有する。何故なら、これらは、１００
％疾患に限定されないことがわかるマーカーを標的にする際、顕著な有害な副作
用を生じないからである。さらに、用いられるコアギュラントは、ほとんどの場
合ヒト起源であり、そしてそれ故、リシンＡ鎖のような外来トキシンより免疫原
性の問題が少ないからである。
このような組成物に制限されないが、本発明に従った組成物の重要な例は、二
重特異性抗体であり、この抗体は、疾患細胞または疾患関連血管系マーカーの成
分に結合する第１の抗原結合領域、および凝固因子に結合する第２の抗原結合領
域を含む。本発明はまた、このような二重特異性抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ
’、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片を提供する。このような二重特異性抗体
の１つの現在好ましい例は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して指向される１つの結
合部位、および組織因子に対して指向される別の結合部位を含む抗体である。
さらなる実施態様で、本発明は、上記の結合リガンドおよび二重特異性抗体の
任意または組み合わせを薬理学的に受容可能な形態で含む薬学的組成物、および
治療用キットを提供する。これは、結合リガンドが、凝固因子に共有結合してい
る第１の結合領域を有し、そしてまた結合リガンドにおける第１の結合領域は、
次に凝固因子に結合する第２の結合領域に共有結合する−結合は動物への投与の
前、または投与後に起こる−薬学的組成物およびキットを含む。
本発明に従って、二重特異性、三重特異性、または多重特異性の結合リガンド
の組み合わせを含む薬学的組成物および治療用キットがまた考慮される。これは
、１つの結合リガンドが疾患細胞または腫瘍細胞に指向し、そしてもう１つが血
管系内皮細胞マーカーまたは疾患関連支質の成分に対して指向する組み合わせを
含む。抗体、イムノトキシン、免疫エフェクター、化学療法剤などのような他の
別の成分もまた、本発明の組成物およびキットに含まれ得る。
キットはまた、正常組織の内皮細胞で抗原発現を抑制する際の使用については
、シクロスポリンのような抗原サプレッサー；および／または疾患関連血管内皮
細胞または支質を誘導して標的化可能な抗原を発現する際の使用については、Ｅ
−セレクチン、Ｐ−セレクチン、またはＭＨＣクラスＩＩ抗原のような「誘導剤
」を含み得る。例示の誘導剤は、疾患または腫瘍抗原を結合し、そしてＩＦＮ−
γを生成するＴ細胞クローンを含むが、このようなクローンは、キットを用いて
処置されるべき動物から単離されることが現在好ましい。
好ましい誘導剤は、疾患または腫瘍細胞抗原、あるいは支質成分にさえも結合
し、そして所望の標的抗原の発現を誘導するサイトカイン、コアギュラント、ま
たは他の因子を産生し得るエフェクター細胞に結合する二重特異性抗体である。
現在のところ、二重特異性抗体の１つの好ましい群は、腫瘍抗原に、および活性
化抗原ＣＤ１４またはＣＤ１６に結合して、単球、マクロファージ、またはマス
ト細胞によるＩＬ−１産生を刺激するような群；ならびに腫瘍抗原に、および活
性化抗原ＣＤ２、ＣＤ３またはＣＤ２８に、そして好ましくはＣＤ２８に結合し
て、ＮＫ細胞によりまたは好ましくはＴ細胞によりＩＦＮ−γ産生を刺激するよ
うな群である。
二重特異性抗体の第２番目の好ましい群は、腫瘍抗原にまたは腫瘍支質の成分
に、および組織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因
子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、またはラッセ
ルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターに結合して、トロンビン産生を刺激する
ような群である。このような二重特異性抗体を第１の「誘導」組成物として含む
キットは、一般に、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する第１の結合
領域を含む結合リガンドを含む第２の薬学的組成物を含む。
本発明の二重特異性リガンド、および所望による他の成分は、１つまたはそれ
以上の適切な容器手段を用いて、便利なように少量に分けおよびパッケージにさ
れ、そして別々の容器は単一のパッケージで調剤され得る。薬学的組成物および
キットは、本明細書にさらに記載されている。
本発明は、コアギュラントの送達および疾患処置において有意な臨床的有用性
を有しているが、それはまた多くのインビトロ用途を有する。これらは例えば、
二重特異性化合物である、特定の抗体、リガンド、またはレセプターの結合能力
に基づく種々のアッセイを含む。従って、本発明の二重特異性凝固リガンドは、
本明細書にさらに記載されるように、イムノブロット、ウェスタンブロット、ド
ットブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、蛍光活性化細胞ソーティン
グ（ＦＡＣＳ）、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィーなどのような、標
準的な結合アッセイおよびプロトコールで用いられ得る。
なおさらなる実施態様では、本発明は、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、ＡＶＭ
、血管腫、血管新生緑内障、乾癬および慢性関節リウマチ、ならびに血管化腫瘍
成分を有する腫瘍のような疾患を処置するために用いられ得るように、疾患関連
血管系にコアギュラントを送達する方法に関する。このような方法は一般に、血
管成分を有する疾患を伴うヒト被験体を含む動物に、少なくとも１つの上記のよ
うな二重特異性結合リガンドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
組成物は、疾患部位（例えば固形腫瘍）の血管系で血液凝固を促進するに有効
な量および経路により投与される。有効用量は、好適な実施態様および詳細な実
施例中の情報のような、本発明の開示を考慮すれば、当業者に公知である。他の
方法のように、例えば、血管化腫瘍部位への注射のような非経口投与がしばしば
適切である。
本発明の方法は、共有結合した凝固因子を含む結合リガンドを投与する手段、
および二重特異性リガンドまたは抗体の第２の結合領域に複合体化されている非
共有結合した凝固因子を含む結合リガンドを投与する手段の両方により、外因性
凝固因子の送達を提供する。
本発明のさらなる方法は、疾患または腫瘍血管系への内因性凝固因子の送達を
生じる方法を含む。これは、動物または患者に、内因性凝固因子に結合しそして
この因子を疾患関連または腫瘍血管系に濃縮する第２の結合領域を含む結合リガ
ンドを投与することにより達成される。
なおさらなる方法論の実施態様では、腫瘍血管系または支質のマーカーが特異
的に誘導され、次いで抗体のような結合リガンドを用いて標的とされ得ることが
考慮される。例示の誘導性抗原は、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＭＨＣク
ラスＩＩ抗原、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−Ｉ、エンドグリン、ＬＡＭ−１と反応
性のリガンド、血管アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）、および他の接着分子を
含み、Ｅ−セレクチンおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原が現在好適である。
誘導しそして次にＭＨＣクラスＩＩタンパク質を標的にする場合、正常組織中
のＭＨＣクラスＩＩの抑制が一般に必要である。ＭＨＣクラスＩＩ抑制は、シク
ロスポリン、または機能的に等価な薬剤を用いて達成され得る。次いでＭＨＣク
ラスＩＩ分子は、疾患関連血管系をエフェクター細胞（一般に誘導性サイトカイ
ンＩＦＮ−γを放出する、動物のヘルパーＴ細胞またはＮＫ細胞）に曝すことな
どによる、シクロスポリンに依存しない手段を用いて疾患関連血管内皮細胞中で
誘導され得る。
活性化された単球、マクロファージ、およびさらにマスト細胞は、Ｅ−セレク
チンを誘導するサイトカイン（ＩＬ−１；ＴＮＦ−α； ＴＮＦ−β）を生成し
得るエフェクター細胞である；その一方、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ−８陽性Ｔ細胞
およびＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩを誘導するＩＦＮ−γを生成し得る。ＩＬ
−１を生成するために疾患部位で単球／マクロファージを活性化すること、また
はＩＦＮ−γを生成するために疾患関連ヘルパーＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化
することは、動物に、エフェクター細胞表面活性化抗原に結合する活性化抗体を
投与することにより達成され得る。例示の活性化抗原は、単球／マクロファージ
についてはＣＤ１４およびＣＤ１６（ＩｇＥについてはＦｃＲ）；およびＴ細胞
についてはＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ２８；を含み、特定の実施態様で使用する
ためには、ＣＤ１４およびＣＤ２８がそれぞれ好適である。
特異的な活性化および誘導を達成するために、１つの現在好ましい方法は、Ｃ
Ｄ１４またはＣＤ２８のようなエフェクター細胞活性化抗原、および疾患または
腫瘍細胞抗原の両方に結合する二重特異性抗体を用いることである。これらの二
重特異性抗体は、疾患または腫瘍部位に局在化し、そして単球／マクロファージ
およびＴ細胞をそれぞれ活性化する。標的疾患または腫瘍成分付近の活性化され
たエフェクター細胞は、誘導性サイトカイン、この場合、ＩＬ−１およびＩＦＮ
−γをそれぞれ生成する。
正常組織中のＭＨＣクラスＩＩ抑制はまた、動物に抗ＣＤ−４抗体を投与する
ことにより達成され得る；動物のＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を抑制するこの機
能は、ＭＨＣクラスＩＩ発現の阻害を生じる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、再び、
疾患部位をＩＦＮ−γのみに曝すことにより疾患関連血管内皮細胞で特異的に誘
導され得る。これを達成するための１つの手段は、疾患部位にある抗原に結合す
るＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞クローンを動物投与することによる。このＩＦＮ−γ産
生Ｔ細胞は、好ましくは、インビトロで増殖した腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）の
ような、動物の疾患部位から得られる浸潤性白血球である。
二重特異性抗体を用いて、トロンビンのようなコアギュラント産生を、腫瘍部
位のような局所環境でのみ誘導する方法がまた提供される。さらに、これは、一
般に、腫瘍細胞または腫瘍支質の成分、および組織因子、組織因子誘導体、プロ
トロンビン、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、
第ＸＩ／ＸＩａ因子、またはラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターに結
合する二重特異性抗体を含む薬学的組成物を動物に投与することにより達成され
得る。次いで、Ｅ−セレクチンまたはＰ−セレクチンに結合する抗体が、凝固因
子または凝固因子に結合する第２の結合領域に連結し、そして動物の血流中に導
入される。
より一般的な組み合わせ処理療法もまた可能であり、ここでは、例えば、本発
明の腫瘍凝固エレメントを、放射線療法または化学療法のような現存する抗腫瘍
療法と組み合わせるか、または抗腫瘍イムノトキシンのような第２の免疫学的試
薬の使用と組み合わせる。良性疾患の新規の処置方法もまた、現在用いられてい
る他の療法と組み合わされ得る。
従って、１つの局面において、本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む結
合リガンドを提供する：
（ａ）疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関連支質の成分に結合する
第１結合領域；この第１結合領域が作動可能に連結した
（ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。
１つの実施形態において、上記第１結合領域は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ま
たは抗体の抗原結合性領域を含み得る。
別の実施形態において、上記第１結合領域は、、抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａ
ｂ’、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、、腫瘍細胞、腫瘍血管系の
成分、または腫瘍支質の成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍細胞の細胞表面抗原に
結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、細胞表面腫瘍抗原ｐ１８５
ＨＥＲ２、乳汁ムチンコアタンパク質、ＴＡＧ−７２、ルイスａ、ガン胎児性抗
原（ＣＥＡ）、または腫瘍関連抗原に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得、
この腫瘍関連抗原は、９．２．２７、ＯＶ−ＴＬ３、ＭＯｖ１８、Ｂ３、ＫＳ１
／４、２６０Ｆ９およびＤ６１２からなる群から選択される抗体に結合し得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、、腫瘍血管系の成分に結合
する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍血管系細胞表面レセプ
ターに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク
質、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＧＦβレセプター、Ｔ
ＩＥ、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、αｖβ３インテグリン
、プレイオトロピン、エンドシアリンまたはエンドグリンに結合する抗体の抗原
結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、エンドグリンに結合する抗
体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、モノクローナル抗体ＴＥＣ
−４またはモノクローナル抗体ＴＥＣ−１１と同じエピトープに結合する抗体の
抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＶＥＧＦレセプターに結合
する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、モノクローナル抗体３Ｅ１
１、３Ｅ７、５Ｇ６、４Ｄ８または１０Ｂ１０と同じエピトープに結合する抗体
の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、モノクローナル抗体ＴＥＣ
−１１０と同じエピトープに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍血管系細胞表面レセプ
ターに結合するリガンドに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ
、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンイソ型、ス
キャッターファクター、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板第４因子（ＰＦ４）
、ＰＤＧＦまたはＴＩＭＰに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ
、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンドまたは腫瘍関連フィブロネクチンイソ型
に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、誘導性の腫瘍血管系成分に
結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、コアギュラントにより誘導
性の腫瘍血管系成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、トロンビンにより誘導性の
腫瘍血管系成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−
セレクチンに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、サイトカインによって誘導
性の腫瘍血管系成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、単球、マクロファージ、マ
スト細胞、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８−陽性Ｔ細胞またはＮＫ細胞が放出するサイ
トカインによって誘導性の腫瘍血管系成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含
み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、サイトカインＩＬ−１、Ｌ
Ｉ−４、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたはＩＦＮ−γによって誘導性の腫瘍血管系
成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ
−１、ＩＣＡＭ−１、エンドグリンまたはＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する抗体
の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、Ｅ−セレクチンに結合する
抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結
合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、リガンド：レセプター複合
体に結合する抗体であり得るが、このリガンドまたはレセプターがリガンド：レ
セプター複合体になっていない場合には、このリガンドまたはこの因子レセプタ
ーに結合しない抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、モノクローナル抗体２Ｅ５
、３Ｅ５または４Ｅ５と同じエピトープに結合する抗体の抗原結合性領域を含み
得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍支質の成分に結合する
抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、テネイシンに結合する抗体
の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、基底膜成分に結合する抗体
の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、活性化血小板に結合する抗
体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、誘導性の腫瘍支質成分に結
合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、コアギュラントによって誘
導性の腫瘍支質成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、トロンビンによって誘導性
の腫瘍支質成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＲＩＢＳに結合する抗体の
抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、疾患細胞または疾患関連血
管系の成分に結合するリガンドまたはレセプターを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍細胞表面レセプターに
結合するリガンド、または腫瘍細胞表面分子に結合するリガンドに結合するレセ
プターの可溶性結合ドメインを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍血管系の成分に結合す
るリガンドまたはレセプターを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍血管系内皮細胞表面レ
セプターに結合するリガンドを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ
、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンイソ型、ス
キャッターファクター、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板第４因子（ＰＦ４）
、ＰＤＧＦまたはＴＩＭＰを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦを含み得
る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＦＧＦを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、腫瘍血管系内皮細胞表面レ
セプターに結合するリガンドに結合するレセプターの可溶性結合ドメインを含み
得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプタ
ーの可溶性結合ドメインを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、凝固因子に作動可能に連結
し得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、ビタミンＫ依存性ＩＩ／ＩＩａ
凝固因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子またはＸ／Ｘａ因子を含み
得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依
存性凝固因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、ビタミンＫ依存性凝固因子をコ
ードする遺伝子を原核宿主中で発現させることによって調製され得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、ビタミンＫ依存性凝固因子タン
パク質を処理して、その対応のグルタミン酸残基を除去または変更することによ
って調製され得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、その対応のグルタミン酸残基を
欠くビタミンＫ依存性凝固因子をコードする操作された凝固因子遺伝子を調製す
ること、およびこの操作された遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させることによ
って調製され得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、組織因子または組織因子誘導体
を含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、ＶＩＩ因子を活性化する能力が
欠損した変異組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、約１５７位と約１６７位との間
のアミノ酸領域における変異を伴う組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は変異組織因子を含み得、１５８位
のＴｒｐはＡｒｇに変化し；１６２位のＳｅｒはＡｌａに変化し；１６４位のＧ
ｌｙはＡｌａに変化し；または１５８位のＴｒｐはＡｒｇに変化し、かつ１６２
位のＳｅｒはＡｌａに変化し得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は短縮型組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は二量体の短縮型組織因子を含み得
る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子はラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子ア
クチベーターを含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は血小板活性化化合物を含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、トロンボキサンＡ２またはトロ
ンボキサンＡ２シンターゼを含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子は、フィブリン溶解のインヒビター
を含み得る。
さらなる実施形態において、上記凝固因子はα２−抗プラスミンを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、凝固因子に結合する第２結
合領域に作動可能に連結し得る。
さらなる実施形態において、上記結合リガンドは、上記第２結合領域に結合し
た凝固因子をさらに含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、凝固因子に結合する抗体の
抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、
あるいは抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグ
メントを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、ビタミンＫ依存性ＩＩ／Ｉ
Ｉａ凝固因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子またはＸ／Ｘａ因子に
結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、Ｇｌａ改変を欠くビタミン
Ｋ依存性凝固因子に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、組織因子に結合する抗体の
抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、変異組織因子に結合する抗
体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、短縮型組織因子に結合する
抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、二量体の短縮型組織因子に
結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２結合領域は、ラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ
因子アクチベータ、トロンボキサンＡ２またはα２−抗プラスミンに結合する抗
体の抗原結合性領域を含み得る。
別の実施形態において、上記第１結合領域は、共有結合を介して上記凝固因子
または上記第２結合領域に作動可能に連結し得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、化学的架橋リンカーを介し
て上記凝固因子または上記第２結合領域に作動可能に連結し得る。
さらなる実施形態において、上記結合リガンドは、宿主細胞中で組換えベクタ
ーを発現させることによって調製される融合タンパク質であり得、このベクター
は、同じリーディングフレーム中に、上記凝固因子または第２結合領域をコード
するＤＮＡセグメントに作動可能に連結した上記第１結合領域をコードするＤＮ
Ａセグメントを含み得る。
別の実施形態において、上記第１結合領域は、アビジン：ビオチンの組み合わ
せを用いて、上記凝固因子または上記第２結合領域に作動可能に連結し得る。
別の実施形態において、上記結合リガンドは二重特異性抗体としてさらに規定
され得、この二重特異性抗体は、腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍
関連支質の成分に結合する第１抗原結合性領域を含み、この第１抗原結合性領域
は、凝固因子に結合する第２抗原結合性領域に作動可能に連結し得る。
さらなる実施形態において、上記結合リガンドは、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、
あるいは二重特異性抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’
）２フラグメントとしてさらに規定され得る。
さらなる実施形態において、上記結合リガンドは、短縮型組織因子に結合する
第２抗原結合性領域に作動可能に連結している、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に
結合する第１抗原結合性領域を含む二重特異性抗体としてさらに規定され得る。
別の局面において、本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む結合リガンド
を提供する：
（ａ）腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍関連支質の成分に結合する
第１結合領域；この第１結合領域が作動可能に連結した
（ｂ）操作された凝固因子、または操作された凝固因子に結合する第２結合領域
。
１つの実施形態において、上記操作された凝固因子は、Ｇｌａ改変を欠くビタ
ミンＫ依存性凝固因子であり得る。
別の実施形態において、上記操作された凝固因子は、Ｇｌａ改変を欠く、ＩＩ
／ＩＩａ凝固因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子またはＸ／Ｘａ因
子であり得る。
さらなる実施形態において、上記操作された凝固因子は、ビタミンＫ依存性凝
固因子遺伝子を原核宿主中で発現させることによって調製され得る。
さらなる実施形態において、上記操作された凝固因子は、ビタミンＫ依存性凝
固因子タンパク質を処理して、その対応のグルタミン酸残基を除去または変更す
ることによって調製され得る。
さらなる実施形態において、上記操作された凝固因子は、対応するグルタミン
酸残基を欠くビタミンＫ依存性凝固因子をコードする操作された凝固因子遺伝子
を調製すること、およびこの操作された遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させる
ことによって調製され得る。
さらなる実施形態において、上記操作された凝固因子は、第２の組織因子また
は誘導体に作動可能に結合した第１の組織因子または誘導体を含む組織因子構築
物であ得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は短縮型組織因子を含み得る
。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、疎水性膜挿入部分を含み
得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、約３と約２０との間の疎
水性アミノ酸の連続部分を含む短縮型組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は短縮型組織因子を含み得、
この短縮型組織因子は、この短縮型組織因子のＮ末端またはＣ末端に位置する疎
水性アミノ酸の連続部分を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、脂肪酸を含む短縮型組織
因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、２つの短縮型組織因子を
含み得、これらの各々は膜挿入部分を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、ジスルフィド、チオエー
テルまたはペプチド結合で作動可能に連結した第１および第２の組織因子または
誘導体を含み得る。
別の実施形態において、上記第１結合領域は、操作された凝固因子に結合する
第２結合領域に作動可能に連結し得る。
なお別の実施形態において、上記第１結合領域は、操作された凝固因子に作動
可能に連結し得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、生物学的に除去可能な結合
を介して上記操作された凝固因子に結合し得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、選択的に切断可能なペプチ
ド結合を介して上記操作された凝固因子に結合し得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、ウロキナーゼ、プラスミン
、トロンビン、ＩＸａ因子、Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼに対する切断
部位を含むペプチドリンカーを介して、上記操作された凝固因子に結合し得る。
別の局面において、本発明は、第２の組織因子または誘導体に作動可能に連結
した第１の組織因子または誘導体を含む組織因子構築物を提供する。
１つの実施形態において、上記組織因子構築物は、作動可能に連結された第１
、第２および第３の組織因子または組織因子誘導体を含み得る。
別の実施形態において、上記組織因子構築物は、作動可能に連結された約５個
の組織因子または組織因子誘導体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、作動可能に連結された約
１０個の組織因子または組織因子誘導体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、作動可能に連結された約
２０個の組織因子または組織因子誘導体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、縮型組織因子を含み得る
。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、疎水性膜挿入部分を含む
短縮型組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、約３と約２０との間の疎
水性アミノ酸の連続部分を含む短縮型組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は短縮型組織因子を含み得、
この短縮型組織因子は、この短縮型組織因子のＮ末端またはＣ末端に位置する疎
水性アミノ酸の連続部分を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、脂肪酸を含む短縮型組織
因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、２つの短縮型組織因子を
含み得、これらの各々が疎水性膜挿入部分を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、末端システイン残基を含
むように改変された短縮型組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は２つの短縮型組織因子を含
み得、これらの各々は末端システイン残基を含むように改変され得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、上記システイン残基に作
動可能に連結した抗体または抗体の抗原結合性領域をさらに含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、選択的に切断可能なペプ
チドリンカーを含むように改変された短縮型組織因子を含み得る。
さらなる実施形態において、上記選択的に切断可能なペプチドリンカーは、ウ
ロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、ＩＸａ因子、Ｘａ因子またはメタロプロ
テイナーゼについての切断部位を含み得る。
さらなる実施形態において、上記選択的に切断可能なペプチドリンカーは、間
質コラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメリシンについての切断部位を含み
得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、上記選択的に切断可能な
ペプチドリンカーに作動可能に連結した抗体または抗体の抗原結合性領域をさら
に含み得る。
別の実施形態において、上記組織因子構築物は、その配列中に作動可能に連結
した一連のユニット：システイン残基、選択的に切断可能なペプチドリンカー、
疎水性アミノ酸の連続部分、第１の短縮型組織因子および第２の短縮型組織因子
を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、その配列中に作動可能に
連結した一連のユニット：第１のシステイン残基、選択的に切断可能なペプチド
リンカー、第１の疎水性アミノ酸の連続部分、第１の短縮型組織因子、第２の短
縮型組織因子および第２の疎水性アミノ酸の連続部分を含み得る。
さらなる実施形態において、上記組織因子構築物は、上記システイン残基に作
動可能に連結した抗体または抗体の抗原結合性領域をさらに含み得る。
さらなる局面において、本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む結合リガ
ンドを薬理学的に受容可能な形態で含む薬学的組成物を提供する：
（ａ）疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関連支質の成分に結合する
第１結合領域；この第１結合領域が作動可能に連結した
（ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。
１つの実施形態において、上記結合リガンドは、凝固因子に共有結合した第１
結合領域を含み得る。
別の実施形態において、上記結合リガンドは、凝固因子に結合する第２結合領
域に共有結合した第１結合領域を含み得る。
さらなる実施形態において、上記結合リガンドは、上記第２結合領域に非共有
結合的に結合した凝固因子をさらに含み得る。
さらなる実施形態において、上記結合リガンドは二重特異性抗体であり得る。
さらなる実施形態において、上記第１結合領域は、組織因子、組織因子誘導体
、あるいは抗体の抗原結合性領域に作動可能に連結し、この抗体は組織因子また
は組織因子誘導体に結合し得る。
なおさらなる局面において、本発明は、適切な容器手段中に以下の（ａ）およ
び（ｂ）を含むキットを提供する：
（ａ）第１の薬学的組成物であって、疾患関連血管系または疾患関連支質におけ
る標的抗原の発現を誘導し得る生物学的薬剤を含む、第１の薬学的組成物；およ
び
（ｂ）第２の薬学的組成物であって、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む結合リ
ガンドを含む、第２の薬学的組成物：
（ｉ）疾患関連血管系または疾患関連支質の誘導性標的抗原に結合する第１結
合領域；この第１結合領域が作動可能に連結した
（ｉｉ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。
１つの実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、疾患関連血管内皮細胞
上の標的抗原の発現を誘導し得る生物学的薬剤を含み得る。
別の実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、白血球細胞の細胞表面上
の活性化抗原および血管化腫瘍の腫瘍細胞の細胞表面上の腫瘍抗原に結合する二
重特異性抗体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、活性化抗原ＣＤ２、
ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６（ＩｇＥについてはＦｃＲ）、ＣＤ２８またはＴ細
胞レセプター抗原に結合する二重特異性抗体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、ＣＤ１４に結合し、
そして単球／マクロファージ細胞によるＩＬ−１の発現を誘導する二重特異性抗
体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２の薬学的組成物は、Ｅ−セレクチンに結
合する第１結合領域を含む結合リガンドを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、ＣＤ２８に結合し、
そしてＴ細胞によるＩＦＮ−γの発現を誘導する二重特異性抗体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２の薬学的組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ抗
原に結合する第１結合領域を含む結合リガンドを含み得る。
さらなる実施形態において、上記キットは、正常組織の血管内皮細胞における
ＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を抑制し得る抗原を含む、第３の薬学的組成物をさ
らに含み得る。
さらなる実施形態において、上記キットは、シクロスポリンを含む第３の薬学
的組成物をさらに含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、腫瘍抗原ｐ１８５Ｈ
ＥＲ２、乳汁ムチンコアタンパク質、ＴＡＧ−７２、ルイスａ、ガン胎児性抗原
（ＣＥＡ）、または腫瘍関連抗原に結合する二重特異性抗体を含み得、この腫瘍
関連抗原は、９．２．２７、ＯＶ−ＴＬ３、ＭＯｖ１８、Ｂ３、ＫＳ１／４、２
６０Ｆ９およびＤ６１２からなる群から選択される抗体に結合し得る。
別の実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、疾患関連支質成分におけ
る標的抗原の発現を誘導し得る生物学的薬剤を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第１の薬学的組成物は、腫瘍細胞または腫瘍
支質の成分；および組織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、ＶＩＩ／ＶＩ
Ｉａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子またはラッセル
クサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターに結合する二重特異性抗体を含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２の薬学的組成物は、Ｐ−セレクチンに結
合する第１結合領域を含む結合リガンドを含み得る。
さらなる実施形態において、上記第２の薬学的組成物は、Ｅ−セレクチンに結
合する第１結合領域を含む結合リガンドを含み得る。
なお別の局面において、本発明は、疾患関連血管系に凝固因子を送達するため
の医薬の調製における結合リガンドの使用を提供し、この結合リガンドは、以下
の（ａ）および（ｂ）を含む：
（ａ）疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関連支質の成分に結合する
第１結合領域；この第１結合領域が作動可能に連結した
（ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。
１つの実施形態において、上記結合リガンドは、外因性凝固因子を疾患関連血
管系に送達するための医薬の調製において使用され得、この結合リガンドは、凝
固因子に共有結合した第１結合領域を含み得る。
他の実施形態において、上記結合リガンドは、外因性凝固因子を疾患関連血管
系に送達するための医薬の調製において使用され得、この結合リガンドは、凝固
因子に非共有結合的に結合する第２結合領域に共有結合した第１結合領域を含み
得る。
別の実施形態において、上記結合リガンドは、外因性凝固因子を疾患関連血管
系に送達するための医薬の調製において使用され得、この結合リガンドは、外因
性凝固因子に結合する第２結合領域に共有結合した第１結合領域を含み得、そし
てこの医薬を動物に投与するとこの因子を疾患関連血管系に集中させ得る。
なお別の実施形態において、上記医薬は、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、糖尿
病性網膜症、血管再狭窄、動静脈性奇形（ＡＶＭ）、血管腫、血管新生緑内障、
慢性関節リウマチまたは乾癬の処置において使用されることが意図され得る。
さらに別の実施形態において、上記医薬は、血管化腫瘍を有する動物の処置に
おいて使用されることが意図され得る。
さらなる実施形態において、上記医薬は、動物の腫瘍関連血管系または腫瘍関
連支質における標的化可能な成分の発現の誘導の後に使用されることが意図され
得、この医薬は、誘導された標的化可能な成分に結合する第１結合領域を含む結
合リガンドを含み得る。
さらなる実施形態において、腫瘍関連血管系における上記標的化可能な成分の
発現は、サイトカインによって誘導され得る。
さらなる実施形態において、腫瘍関連血管系における上記標的化可能な成分の
発現は、上記動物の白血球細胞から放出されるサイトカインによって誘導され得
る。
さらなる実施形態において、腫瘍関連血管系における上記標的化可能な成分の
発現は、上記動物の単球、マクロファージ、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ
８−陽性Ｔ細胞またはＮＫ細胞から放出されるサイトカインによって誘導され得
る。
さらなる実施形態において、腫瘍関連血管系における上記標的化可能な成分の
発現は、サイトカインＩＬ−１、ＬＩ−４、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたはＩＦ
Ｎ−γによって誘導され得る。
さらなる実施形態において、上記動物の上記白血球細胞は、白血球細胞表面活
性化抗原に結合する活性化抗体を含む薬学的組成物をこの動物に投与することに
よって活性化されて、サイトカインを放出し得る。
さらなる実施形態において、上記活性化抗体は、白血球細胞表面活性化抗原Ｃ
Ｄ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＩｇＥについてのＦｃＲ、ＣＤ２８または
Ｔ細胞レセプター抗原に結合し得る。
さらなる実施形態において、上記活性化抗体は、動物腫瘍内で、活性化された
白血球および腫瘍細胞に結合および架橋する二重特異性抗体であり得る。
さらなる実施形態において、上記活性化抗体は、ＣＤ１４またはＣＤ２８、お
よび腫瘍細胞の細胞表面抗原に結合する二重特異性抗体であり得る。
さらなる実施形態において、上記Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−
１、エンドグリンまたはＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現は、腫瘍関連血管系におい
て誘導され得る。
さらなる実施形態において、上記Ｅ−セレクチンの発現は、腫瘍関連血管系に
おいて誘導され得る。
さらなる実施形態において、上記ＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現は、腫瘍関連血
管系において誘導され得る。
さらなる実施形態において、動物の正常組織における内皮細胞による上記ＭＨ
ＣクラスＩＩ抗原の発現は、この動物へのシクロスポリンの投与によって抑制さ
れ得；そして、次いで腫瘍関連血管系におけるＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現は、
ＣＤ２８および腫瘍細胞の細胞表面抗原に結合する二重特異性抗体のこの動物へ
の投与によって誘導され得る。
さらなる実施形態において、動物の正常組織における内皮細胞による上記ＭＨ
ＣクラスＩＩ抗原の発現は、この動物のＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を抑制す
る抗ＣＤ４抗体のこの動物への投与によって抑制され得；そして、次いで腫瘍関
連血管系におけるＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現は、上記疾患部位中の抗原に結合
するＩＦＮ−γ−産生Ｔ細胞クローンのこの動物への投与によって誘導され得る
。
さらなる実施形態において、上記ＩＦＮ−γ−産生Ｔ細胞クローンは、以下：
（ａ）この動物の疾患部位から組織断片を取り出す工程；
（ｂ）この疾患部位から、浸潤した白血球を抽出する工程；および
（ｃ）この浸潤した白血球をインビトロで拡大させてＩＦＮ−γ産生クローンを
提供する工程、を包含する方法によって調製され得る。
さらなる実施形態において、腫瘍関連血管系における上記標的化可能な成分の
発現は、トロンビンによって誘導され得る。
さらなる実施形態において、上記トロンビンの産生は、腫瘍細胞または腫瘍支
質の成分、および組織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、ＶＩＩ／ＶＩＩ
ａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子またはラッセルク
サリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターに結合する二重特異性抗体を含む薬学的組成
物を動物に投与することによって誘導され得る。
さらなる実施形態において、上記Ｐ−セレクチンの発現は、腫瘍関連血管系に
おいて誘導され得る。
さらなる実施形態において、上記Ｅ−セレクチンの発現は、腫瘍関連血管系に
おいて誘導され得る。
なおさらなる局面において、本発明は、ガンを処置するための医薬の調製にお
ける凝固性結合リガンドの使用を提供し、この結合リガンドは、以下の（ａ）お
よび（ｂ）を含む：
（ａ）腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍関連支質の成分に結合する
第１結合領域；この第１結合領域が作動可能に連結した
（ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領域。
１つの実施形態において、上記医薬は、非経口投与のための処方物であり得る
。
他の実施形態において、上記医薬は、血管化腫瘍部位中に注入されるための処
方物であり得る。
別の実施形態において、上記医薬は、ヒト患者における使用に適している。
なお別の実施形態において、上記凝固性結合リガンドは、組織因子、短縮型組
織因子、二量体組織因子、あるいは組織因子または組織因子誘導体に結合する抗
体の抗原性結合領域に作動可能に連結した第１結合領域を含み得る。
本発明により、特異的凝固、例えば、腫瘍血管系中の凝固を達成する使用のた
めの、副作用が制限された新規な組成物および方法が提供される。
図１は、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０二重特異性抗体を介した、ｔＴＦのＡ２０細胞への繋ぎ止め（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）を示す。Ａ２０細胞を様々な濃度のＢ２１−２／１０Ｈ１０（白四角）、ＳＦＲ８／１０Ｈ１０（黒丸）またはＢ２１−２／ＯＸ７（白丸）および過剰量の１２５Ｉ−ｔＴＦと共に、アジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュベートした。細胞に結合した１２５Ｉ−ｔＴＦの数を、実施例ＩＩに説明するように決定した。 図２は、Ａ２０細胞当たりの繋ぎ止められたｔＴＦ分子の数と、血漿の凝固を誘導する能力との関係を示す。Ａ２０細胞を、様々な濃度のＢ２１−２／１０Ｈ１０および過剰量のｔＴＦと共にアジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、３７℃に加温し、カルシウムおよびマウス血漿を加え、最初のフィブリン鎖が形成されるまでの時間を記録した（横座標）。Ａ２０細胞を、二重特異性抗体および１２５Ｉ−ｔＴＦと共に４℃にて１時間インキュベートする同一の研究を行って、細胞に特異的に結合したｔＴＦの数を、実施例ＩＩに説明するように決定した（縦座標）。未処理のＡ２０細胞に加えられた血漿（すなわちｔＴＦ分子０個／細胞）は、１９０秒で凝固した。 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、コアギュリガンド投与後の血管血栓形成および腫瘍壊死の時間経過を示す。直径０．８ ｃｍのＣ１３００（Ｍｕγ）腫瘍を有する３匹のマウスのグループに、１４μｇのＢ２１−２／１０Ｈ１０および１１μｇのｔＴＦからなるコアギュリガンドの静脈内注射をおこなった。図３Ａ；注射前：血管は完全（ｉｎｔａｃｔ）であり腫瘍細胞は健常である。図３Ｂ；０．５時間：腫瘍全体にわたる血管が血栓を有している；腫瘍細胞は健常である。図３Ｃ；４時間：全腫瘍血管中に稠密な血栓が存在しており、腫瘍細胞は分離して核凝縮が発生している。腫瘍間隙内に赤血球が見える。図３Ｄ；２４時間：腫瘍全体にわたって進行した腫瘍壊死。矢印は血管を示す。 図４は、腫瘍血管系を照準とするコアギュリガンド治療によって誘導された固形腫瘍の退行を示す。直径約０．８ｃｍのＣ１３００（Ｍｕγ）腫瘍を有するＮｕ／ｎｕマウスに、ｔＴＦ（１１μｇ）と混合したＢ２１−２／１０Ｈ１０（１４μｇ）の静脈内注射を、１週間間隔で２回おこなった（矢印）（白四角）。コントロールグループのマウスには、ｔＴＦのみ（黒丸）、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０のみ（白丸）または希釈液（黒四角）を同用量与えた。イソ型適合性（ｍａｃｈｅｄ）コントロール二重特異性抗体（ＳＦＲ８／１０Ｈ１０、ＯＸ７／１０Ｈ１０またはＢ２１−２／ＯＸ７）およびｔＴＦを同用量与えた他のコントロールグループのマウスは、ｔＴＦのみを与えられた動物におけるものと同様な腫瘍応答を示した。グループ毎のマウスの数は７または８であった。 図５は、抗体−ｔＴＦ構築物の例である。この図は、化学的に誘導体化された抗体をジスルフィド結合を介して化学的に誘導体化されたｔＴＦに連結することによって合成された接合体と、様々なＴＦまたはＴＦ二量体の抗体およびそのフラグメントへの連結によって合成された接合体との両方を示している。 図６は、Ａ２０細胞に結合した際のｔＴＦ接合体の血餅形成活性を示す。Ａ２０細胞を、様々な濃度の二重特異性Ｂ２１−２／１０Ｈ１０＋Ｈ６［ｔＴＦ］を１：１のモル濃度比で１時間予備混合したもの（白四角）、Ｂ２１−２抗体−Ｈ６Ｃ［ｔＴＦ］（黒丸）、およびＢ２１−２抗体−Ｈ６［ｔＴＦ］（黒三角）と共にアジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、３７℃に加温し、カルシウムおよびマウス血漿を加え、最初のフィブリン鎖が形成されるまでの時間を記録した。結果を、ｔＴＦ不在下の血餅形成時間の％血餅形成時間として表している。 図７は、抗腫瘍細胞ｔＴＦ接合体の血餅形成活性を示す。ＴＦ９−６Ｂ４およびＴＦ８−５Ｇ９抗体とプレインキュベートしたＬＳ１７４細胞（黒四角）、Ｗｉｄｒ細胞（黒丸）およびＨ４６０細胞（黒三角）を、様々な濃度の、Ｄ６１２抗体−Ｈ６Ｃ［ｔＴＦ］（黒四角）、ＫＳ１／４抗体−Ｈ６［ｔＴＦ］（黒丸）、およびＸＭＭＣＯ７９１抗体−Ｈ６［ｔＴＦ］（黒三角）と共にアジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、３７℃に加温し、カルシウムおよびマウス血漿を加え、最初のフィブリン鎖が形成されるまでの時間を記録した。結果を、ｔＴＦ不在下の血餅形成時間の％血餅形成時間として表している。 図８は、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、および第Ｘ／Ｘａ因子、のＧｌａドメイン（γ−カルボキシグルタミン酸）を示す。矢印は、シグナルペプチド切断部位およびペプチド切断部位ならびに活性化切断部位（斜めの矢印）を表している。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）およびイムノトキシン（ＩＴ）は、リンパ腫お
よび白血病の治療に大きな可能性を示している（Ｌｏｗｄｅｒら、１９８７。Ｖ
ｉｔｅｔｔａら、１９９１）が、ヒトの全てのガンの９０％以上を占める（Ｓｈ
ｏｃｋｌｅｙら、１９９１）ガン腫およびその他の固形腫瘍に対しては、現在の
ところ臨床治験において比較的非効果的であることがわかっている（Ｂｙｅｒｓ
およびＢａｌｄｗｉｎ、１９８８。ＡｂｒａｍｓおよびＯｌｄｈａｍ、１９８５
）。この主な理由は、高分子は容易には固形腫瘍中に浸出せず（Ｓａｎｄｓ、１
９８８。Ｅｐｅｎｅｔｏｓら、１９８６）、いったん腫瘍塊中に入ると、腫瘍細
胞間の緊密な結合（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１）、繊維間質（Ｂａｘｔｅｒら、
１９９１）、間隙圧力勾配（Ｊａｉｎ、１９９０）、および結合部位バリア（Ｊ
ｕｗｅｉｄら、１９９２）の存在のために均一に分布し得ないためである。
従って、固形腫瘍を処置するための新しいストラテジーの開発において、腫瘍
細胞そのものよりも腫瘍の血管系を標的化する工程を包含する方法は、ある種の
利点を提供すると思われる。例えば腫瘍血管系特異的フィブリン形成による腫瘍
を通る血流の障害の誘導は、腫瘍部位における流入および流出プロセスを妨害し
、従って抗腫瘍効果が生じる。腫瘍への血液供給を停止させることは、腫瘍関連
血管における凝固促進−フィブリン溶解バランスを、凝固剤（ｃｏａｇｕｌａｔ
ｉｎｇ ａｇｅｎｔ）に特異的に曝すことによって凝固プロセス側にシフトする
ことを通じて達成され得る。
本発明は、腫瘍特異的凝固に代表される特異的な血液凝固を得るための、様々
な手段を提供する。これは、少なくとも一つの成分が免疫的標的化成分または成
長因子ベースの標的化成分であり、凝固を直接的または間接的に刺激し得る少な
くとも一つの他の成分が用いられる、二重特異性または多重特異性の結合リガン
ドを用いることによって達成される。
（Ａ．標的化可能疾患部位）
本発明によって提供される組成物および方法は、血管部分を有する良性または
悪性腫瘍などのいずれの疾患の処置にも幅広く適用可能である。このような血管
系関連疾患は、ＢＰＨ、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、動静脈性奇形（ＡＶＭ）
、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障および乾癬、ならびに血管線維腫、関節炎、
アテローム性動脈硬化プラーク、角膜移植血管新生、血友病関節、過形成性瘢痕
、ｏｓｌｅｒ−ｗｅｂｅｒ症候群（ｏｓｌｅｒ−ｗｅｂｅｒｓｙｎｄｒｏｍｅ）
、化膿肉芽腫、後水晶体繊維増殖症、鞏皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、
皮膚炎および子宮内膜症さえも含む。
代表的な血管形成性腫瘍は、酸素および栄養素の供給のために血管部分を必要
とする固形腫瘍、特にガン腫である。本発明を用いて処置され得る固形腫瘍の例
は、肺、胸部、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸
、直腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、および甲状腺のガン
腫、扁平上皮細胞ガン腫、腺ガン腫、小細胞ガン腫、メラノーマ、 神経膠腫、
神経芽腫などを含むがこれに限定されない。
本発明の二重特異性剤の一つの結合領域は、凝固剤を腫瘍領域に送達し得る、
すなわち上記に示すような腫瘍部位に局在化させることが可能な成分である。凝
固剤は、若干広く分布しても、トキシン部分の場合において発生が知られている
ような激しい副作用を伴わないため、二重特異性リガンドの標的化成分に対する
必要条件は比較的厳密ではない。標的化剤は従って、腫瘍細胞成分、腫瘍血管系
成分、腫瘍細胞に結合するまたは一般的に関連する成分、腫瘍血管系に結合する
または一般的に関連する成分、腫瘍細胞外マトリックスまたは間質の成分、およ
び腫瘍血管系中に見られる細胞型さえも対象とし得る。
例えばイムノトキシンを用いる場合に必要となる非常に厳密な標的化という問
題は、腫瘍血管系は「プロトロンビン産生性（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）」
であり凝固傾向にあるという事実によってもまた軽減される。従って、特異的標
的化手段を達成することにより、凝固は非腫瘍部位中の血管系よりも腫瘍血管系
において促進される。従って、特異的標的化は、標的化剤の生物分布特性に関連
する純粋に物理的な用語というよりもむしろ、機能的な用語であり、有用な標的
が完全に腫瘍に制限されず、腫瘍特異性凝固の促進に有効な標的化リガンドが投
与後に身体の他の部位で見出されることはあり得ないことではない。
（１．腫瘍細胞標的）
腫瘍を構成する悪性細胞は、腫瘍細胞の比較的特異的なマーカーに結合可能な
領域を有する二重特異性リガンドを用いて標的化され得る。腫瘍細胞への結合が
、結合した凝固剤を腫瘍へ局在化させることにより、特異的な凝固が達成される
。更に、血管周辺腫瘍細胞への物理的な接近可能性に起因して血管に最も近い腫
瘍細胞付近に二重特異性剤が集中する可能性が高いために、これは凝固を促進す
るための特に効果的な手段であることが予想される。
多くのいわゆる「腫瘍抗原」が記載されているが、そのいずれも本発明におい
て標的として用いることが可能である。固形腫瘍関連抗原の例を多数、本明細書
中の表Ｉ中に列挙した。このような抗原に対する抗体の調製および使用は、充分
に当該技術の範囲内であり、抗体例も同時に表Ｉに列挙しておく。
標的化可能腫瘍を規定するもう一つの手段は、腫瘍細胞によって発現された抗
原の生化学的特性を記載するのではなく、腫瘍細胞そのものの特性を考慮して説
明される。従って、（ＡＴＣＣカタログから）公的に入手可能なヒト腫瘍細胞株
を例示する意味で表ＩＩを提供する。
表ＩＩに提供した情報は一例であり、年度または範囲による制限は意図してい
ない。任意の後年のＡＴＣＣカタログを参照することによって、他の適切な細胞
株を同定することが可能である。また、特定の細胞型が所望であるならば、その
ような細胞を得るための手段および／またはその即時入手可能な供給源は、当該
技術分野の当業者に公知である。従って、科学文献の分析により、標的化するこ
とを所望する任意の腫瘍細胞型の細胞について適切な選択を容易に行い得る。
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（（ａ）抗腫瘍細胞抗体）
腫瘍抗原標的を認識するための容易な手段は、その特定の抗原に対する結合親
和性を有する抗体を使用することである。固形腫瘍抗原に対する幅広い数の抗体
が公知である。いくつかの有用な抗腫瘍抗体を上記表Ｉに示している。しかし当
業者には直ちに理解されるように、表Ｉに示す抗体のいくつかは、治療用途に対
して適切な生化学的特性を有さないか、十分な腫瘍特異性を有さない可能性があ
る。その一例は、細胞質抗原を認識するＭＵＣ８−２２である。一般に、これら
のような抗体は、モデル系またはスクリーニングアッセイにおけるような研究的
実施態様においてのみ有用である。
一般に、本発明のこれらの局面において使用される抗体は、好ましくは、細胞
表面に接近可能な抗原および腫瘍細胞によって優先的にあるいは特異的に発現さ
れる抗原を認識する。このような抗体はまた好ましくは、例えばＫｄ＜２００ｎ
Ｍ、好ましくは＜１００ｎＭを示す高い親和特性を示し、生命を維持している（
ｌｉｆｅ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）通常組織、例えば心臓、腎臓、脳、肝臓、骨
髄、結腸、胸部、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経繊維、膵臓、皮
膚、またはその他のヒト身体中の生命を維持している器官または組織から選ばれ
る一つ以上の組織に対しては、有意な反応性を示さない。本発明の目的において
最も重要な「生命を維持している」組織は、低反応性の観点から言えば、心臓、
腎臓、中枢神経系および末梢神経系組織および肝臓を含む。本明細書で使用する
用語「有意な反応性」とは、免疫組織化学分析に適した条件下において特定の組
織に適用された際に、大部分ネガティブな細胞ばかりのフィールド中にほんの僅
かのポジティブな細胞が散りばめられた状態であって染色を引き起こさないある
いは無視可能な程度の染色しか引き起こさないような、抗体または抗体フラグメ
ントをいう。
本発明での使用が考えられる表Ｉ内の抗体中で可能性が特に高い抗体は、固形
腫瘍に高い選択性を有するものである。例えば、多くの乳ガン、肺ガン、および
結腸／直腸ガンの表面に選択的に見られるＴＡＧ７２およびＨＥＲ−２プロトオ
ンコジーンタンパク質に結合する抗体（Ｔｈｏｒら、１９８６。Ｃｏｌｃｈｅｒ
ら、１９８７。Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１）；ＭＯｖ１８およびＯＶ−ＴＬ３
ならびに乳ムチンコアタンパク質およびヒト乳脂肪小球体に結合する抗体（Ｍｉ
ｏｔｔｉら、１９８５。Ｂｕｒｃｈｅｌｌら、１９８３）；および高Ｍｒメラノ
ーマ抗原に結合する抗体９．２．２７（Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、１９８２）である
。更に有用な抗体は、ほぼ全ての卵巣ガン腫において均一に発現することが知ら
れている、葉酸結合タンパク質に対する抗体；扁平上皮細胞ガン腫および大多数
の神経膠腫において過剰発現されるオンコジーンのｅｒｂファミリーに対する抗
体；および現行の前臨床評価および臨床評価の対象として知られるその他の抗体
である。
抗体Ｂ３、ＫＳＩ／４、ＣＣ４９、２６０Ｆ９、ＸＭＭＣＯ−７９１、Ｄ６１
２およびＳＭ３は、当該分野で通常実施されている標準的な前臨床試験後の臨床
実施態様における使用に特に適切であると思われる。Ｂ３（米国特許第５，２４
２，８１３号；Ｂｒｉｎｋｍａｎら、１９９１）は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １
０５７３を有する；ＫＳ１／４は米国特許第４，９７５，３６９号に記載される
ように作製し得る；Ｄ６１２（米国特許第５，１８３，７５６号）は、ＡＴＣＣ
受託番号ＨＢ ９７９６を有する。
腫瘍関連標的を規定するための別の手段は、腫瘍細胞によって発現された抗原
の生化学的特性を記載するのではなく、腫瘍細胞の特性を考慮して説明する。従
って、本発明者らは、表ＩＩに挙げた腫瘍細胞に優先的に結合する任意の抗体を
、二重特異性リガンドの標的化成分として使用し得ると考える。優先的な腫瘍細
胞結合もまた、腫瘍細胞に高親和性を示し、かつ、上記に定義された生命維持し
ている正常細胞または組織に対して有意な反応性を有さない抗体に基づく。
本発明は従って、本明細書に記載する標的化された凝固方法に使用される抗体
を生成するためのいくつかの手段を提供する。腫瘍細胞特異的抗体を生成するた
めには、腫瘍細胞抗原を含有する組成物を用いて動物を免疫化し、本明細書中以
下において詳細に説明するように、得られた抗体のなかで適切な特異性を有する
ものを選択することになるであろう。免疫化組成物は、表Ｉ中の任意の抗原の精
製されたあるいは部分的に精製された調製物；表Ｉ中の任意の抗原を富化した（
ｅｎｒｉｃｈｅｄ）膜調製物（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）等
の組成物；表ＩＩ中に挙げた任意の細胞；または、表ＩＩ中に挙げた任意の細胞
タイプを含む細胞混合物または細胞集団を含有していてもよい。
もちろん、抗体の供給源に関わらず、ヒト処置における本発明の実施の際には
、臨床的に標的化された腫瘍が最終的に選択された抗原を発現することを前もっ
て確実にすることが好ましい。これは、例えば外科的生検のような腫瘍組織サン
プルを抗原について試験することまたは恐らくは循環している放出抗原（ｓｈｅ
ｄ ａｎｔｉｇｅｎ）を試験することを包含する、比較的容易なアッセイによっ
て達成される。これは、腫瘍に対する反応性に関してハイブリドーマの「バンク
」由来の抗体の結合親和性を試験するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）
のような免疫学的スクリーニングアッセイにおいて容易に実施し得る。その後、
適切な腫瘍選択性および親和性を示す抗体を選択して、本発明の二重特異性抗体
の調製のために用いることができる。
周知の交差反応性現象のため、最初の抗原をヒト細胞から得る免疫化プロトコ
ルに加えて、最初に使用される抗原がマウスや霊長類のような動物由来であるよ
うな免疫化プロトコルから有用な抗体が得られ得ることが予想される。ヒト起源
の抗原を用いる場合、これらはヒト腫瘍細胞株から得てもよく、または、問題と
なっている特定の患者からの生体サンプルを得ることによって調製してもよい。
実際、患者の腫瘍に対する「特別に誂えた（ｃｕｓｔｏｍ−ｔａｉｌｏｒｅｄ）
」抗体の誘起のための方法は公知であり（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９９０）、
本発明においての使用が考えられる。
（（ｂ）更なる腫瘍細胞標的および結合リガンド）
腫瘍細胞抗原への結合により凝固剤を腫瘍部位に向けるために、抗体の使用に
加えて他のリガンドも用いることが可能である。過剰発現されたレセプター（エ
ストロゲンレセプター、ＥＧＦレセプター）または変異レセプターである腫瘍抗
原に関しては、対応するリガンドを標的化剤として用いることが可能である。
内皮細胞レセプターリガンドと同様に、特異的または優先的に腫瘍細胞に結合
する成分が存在し得る。例えば、腫瘍抗原が過剰発現されたレセプターである場
合は、腫瘍細胞をインビボで特異的なリガンドでコートし得る。その後にリガン
ドに対する抗体またはレセプター自体の形態を用いてリガンドを標的化すること
が可能と思われる。これらのタイプの標的化剤の具体例は、ＴＩＥ−１またはＴ
ＩＥ−２リガンドに対する抗体、第４血小板因子に対する抗体、および白血球接
着結合タンパク質である。
（２．他の疾患標的）
更なる実施態様において、第一の結合領域は、腫瘍部位以外の疾患部位におい
て特異的または優先的に発現される標的分子に結合する成分であってもよい。
他の疾患細胞に関連する標的分子の例は、例えば、乾癬に関連する白血球接着
分子；増殖性糖尿病性網膜症に関連するＦＧＦ；様々な疾患における活性化内皮
細胞に関連する第４血小板因子；および血管増殖性疾患に関連するＶＥＧＦを含
む。上記疾患のいずれか一つを有する動物または患者は、疾患部位に凝固を特異
的に誘導することによって恩恵を受けると思われる。
ＫｌａｇｓｂｕｒｎおよびＦｏｌｋｍａｎ（１９９０）に記載される、通常の
血管依存性病因を有することが知られている疾患もまた、本明細書に記載する二
重特異性リガンドを用いて処置し得る。特に、血管内皮細胞標的化リガンドまた
は間質標的化リガンドを用いて疾患部位における凝固を達成できる。ＢＰＨ、糖
尿病性網膜症、血管再狭窄、血管癒着、ＡＶＭ、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内
障、リューマチ性関節炎および乾癬の処置が現在特に考えられる。
（３．疾患関連血管系細胞標的）
血管系の細胞は、本発明における標的としての使用が意図される。これらの場
合、二重特異性リガンドの１つの結合領域が、疾患関連血管系内皮細胞によって
優先的に発現される接近可能マーカーに結合し得る。血管内皮細胞が、疾患領域
、および局所的な異常生理プロセスによる産物に近接しているため、血管マーカ
ーの搾取作用が可能となる。例えば、腫瘍血管内皮細胞は、内皮細胞の表現型プ
ロフィールを変化させる、腫瘍細胞および腫瘍由来産物にさらされる。
腫瘍細胞は、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、成長因子および
血管形成誘導因子のような腫瘍由来産物を合成する（ｅｌａｂｏｒａｔｅ）こと
が知られており、これらの腫瘍由来産物は、近隣の血管内皮細胞（Ｋａｎｄｅｌ
ら、１９９１；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９８５ａ、ｂ）およびサイトカイン（Ｂｕｒ
ｒｏｗｓら、１９９１； Ｒｕｃｏら、１９９０； Ｂｏｒｄｅｎら、１９９０
）に作用する。腫瘍産物は、内皮細胞に結合し、そして特定の分子の発現を選択
的に誘導する。これらの誘導された分子が、本発明の特定の局面によって提供さ
れる腫瘍内皮特異性コアギュラント送達を用いて標的化され得る。腫瘍内の血管
内皮細胞は、多様な正常組織内の内皮細胞より３０倍速い速度で増殖し（Ｄｅｎ
ｅｋａｍｐら、１９８２）、このことは増殖関連決定基が、腫瘍血管内皮細胞の
マーカーとして作用し得ることを示唆している。
本発明の特定の実施態様において、二重特異性リガンドの標的化成分は、腫瘍
血管系に対して比較的高い特異性を有する成分である。これらの標的化成分は、
腫瘍内皮において発現される分子と結合するが、正常内皮細胞の表面においては
、ほとんどまたは全く発現のない成分として定義され得る。このような特異性は
、当業者にとっては慣例である、組織切片の免疫染色の標準的な手順によって評
価され得る。
しかし、上述したように、本発明の利得は、選択性の要求が、先行技術の方法
、特にイムノトキシンを用いる方法において以前必要とされていたほど厳密では
ない点にある。これはなぜなら、凝固剤の誤った標的化に伴ういかなる副作用も
、トキシンの誤った標的化から生じる副作用と比較すると最小となるからである
。
従って、本発明の二重特異性リガンドまたは抗体を用いて標的化される分子は
、腫瘍血管系上において、正常内皮細胞よりも高いレベルにて発現される分子と
一般的に提唱される。
（（ａ）疾患における血管内皮細胞マーカー）
疾患部位または疾患環境内の血管内皮細胞の表面において優先的に発現するこ
とが知られている分子は、本明細書中において、「自然疾患関連血管内皮細胞マ
ーカー」と称される。この用語は、増加した、または不適切な脈管形成または内
皮細胞の増殖に関連した疾患において発現される内皮細胞成分を、簡潔にいうた
めに用いられる。１つの特定の例として、腫瘍由来因子に応答してインサイチュ
で発現される腫瘍内皮細胞成分が挙げられる。これらの成分はまた、「自然誘導
腫瘍内皮細胞マーカー」とも称される。
ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（血管内皮増殖因子／血管透過性因子）、およびＦＧＦ（線
維芽細胞成長因子）ファミリーの構成要素の両方が、腫瘍血管系内または腫瘍血
管系上において濃縮される。従って、対応するレセプターは、腫瘍血管系上に潜
在的な攻撃の標的を提供する。例えば、ＶＥＧＦレセプターは、齧歯類およびヒ
トの両方において、正常組織内の内皮細胞と対照的に、腫瘍内皮細胞上において
アップレギュレートされることが知られている（Ｔｈｉｅｍｅら、１９９５）。
おそらく、これは腫瘍微環境の特徴である低酸素の結果である（Ｌｅｉｔｈら、
１９９２）。ＦＧＦレセプターはまた、低酸素にさらされた内皮細胞上において
３倍アップレギュレートされ、それゆえ腫瘍においてアップレギュレートされる
と考えられている（ＢｉｃｋｎｅｌｌおよびＨａｒｒｉｓら、１９９２）。
内皮細胞上のＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）レセプター（エン
ドグリン）は、***細胞上でアップレギュレートされ、他の標的を提供する。本
発明者の一人は、エンドグリンが、培養中の、活性化されて***しているＨＵＶ
ＥＣにおいてアップレギュレートされ、そして広範囲の固形腫瘍および胎盤胎児
部を含む、血管新生の部位における内皮細胞上でヒト組織において強く発現され
ることを見いだした。対照的に、前新生物病巣を含む、多様な非悪性成人組織の
大半における内皮細胞は、ほとんどまたは全くエンドグリンを含有しない。重要
なことに、エンドグリン発現は、ＴＥＣ−４およびＴＥＣ−１１抗体が低いレベ
ルで良性線維腺種および初期のガンに結合すること、ならびにこれらの抗体が高
いレベルで後期腺管内ガンおよび浸潤ガンに結合することにより示されるように
、胸部における新生物進行と相関すると考えられている。
他の自然疾患関連血管内皮細胞マーカーは、ＴＩＥ、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−セレ
クチン、Ｅ−セレクチン、αＶβ３インテグリン、プレイオトロピンおよびエン
ドシアリンを含み、それぞれが本発明を用いて標的化され得る。
（（ｂ）サイトカイン誘導性血管内皮マーカー）
しばしば身体における局所的な機能不全を起こす疾患プロセスの性質により、
他の組織に比較的影響することなく、疾患部位を操作する方法が利用可能である
。これは、動物の身体内において別個の物として存在する悪性および良性腫瘍に
特に当てはまる。例えば、腫瘍血管内皮細胞に特異的なさらなるマーカーをつく
るように、腫瘍環境を操作し得る。これらの方法は、概して固形腫瘍において自
然に生じる腫瘍環境を模倣し、また、近接する血管内皮細胞の表面において特定
の分子の特異的発現を誘導する、成長因子またはサイトカインのようなシグナル
因子の局所的な産生を伴う。
疾患または腫瘍環境における血管内皮細胞の表面において発現するように人工
的に誘導され得る分子群は、本明細書において「誘導性内皮細胞マーカー」、ま
たは特定的には誘導性腫瘍内皮細胞マーカーと称される。この用語は、動物内の
疾患または腫瘍発達プロセスの一部として誘導されるマーカーではなく、人工的
に誘導される、つまり人の手による操作の結果誘導されるマーカーを指すのに用
いられる。上記定義された用語「誘導性マーカー」を、「自然マーカー」も例え
ば腫瘍由来因子によって誘導されるという事実にも関わらず、本出願における簡
潔な表記のために選択した。
従って、本発明を実施するためには必要ではないが、疾患関連血管系の表面上
の血管内皮抗原標的の選択的誘起のための技法が利用可能であり、これは、所望
であれば本発明と併用して用いられ得る。これらの技法は、抗原発現、すなわち
細胞表面提示を操作して、標的抗原が、疾患関連血管系の表面において発現また
は利用可能にされるが、正常内皮の表面上では発現されない、あるいは接近可能
または結合のために利用可能にされない、または少なくともより少ない程度にさ
れるようにする。
腫瘍内皮マーカーは、腫瘍由来サイトカイン（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９１；
Ｒｕｃｏら、１９９０）および血管形成誘導因子（Ｍｉｇｎａｔｔｉら、１９
９１）によって誘導され得る。本発明によって提供される、腫瘍内皮において特
異的に誘導され得、次いで二重特異性凝固リガンドを用いて標的化され得る細胞
表面マーカーの例には、表ＩＩＩに示されるものが含まれる（Ｂｅｖｉｌａｃｑ
ｕａら、１９８７； Ｄｕｓｔｉｎら、１９８６； Ｏｓｂｏｒｎら、１９８９
； Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８４）。
提案されるマーカーの誘導のメカニズム；ＩＬ−１およびＩＦＮ−γのような
誘導、すなわち「中間サイトカイン」；ならびに、その標的化によってサイトカ
インの放出が生じる白血球細胞タイプおよび関連するサイトカイン活性分子もま
た、表ＩＩＩに示されている。特異的なマーカーの誘導の際には、二重特異性「
サイトカイン誘導」または、「抗原誘導」抗体が通常必要とされる。この抗体は
、腫瘍の場所における適切なサイトカインの放出を選択的に誘導し、従って、血
管内皮細胞による、所望の標的抗原の発現を選択的に誘導する。二重特異性抗体
は、腫瘍塊およびサイトカイン産生白血球の細胞を架橋し、その結果白血球を活
性化し、サイトカインを放出する。
これらのような、二重特異性抗体の調製および使用は、ＣＤ３、ＣＤ１４、Ｃ
Ｄ１６およびＣＤ２８を認識する架橋抗体が、第２抗原と架橋して、サイトカイ
ン産生を選択的に誘起するという先に示された事実に部分的に基づいている（Ｑ
ｉａｎら、１９９１）。本発明においては、首尾良く腫瘍細胞架橋された白血球
のみが活性化され、サイトカインを放出するので、サイトカイン放出は、腫瘍の
場所に限定される。従って、Ｅ−セレクチンのような所望のマーカーの発現も同
様に、腫瘍血管系の内皮に限定される。
Figure 2009298805
Figure 2009298805
表ＩＩＩに示される可能な誘導性マーカーの内、Ｅ−セレクチンおよびＨＬＡ
−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱのようなＭＨＣクラスＩＩ抗原（Ｃｏ
ｌｌｉｎｓら、１９８４）が、臨床実施態様と合わせて使用される断然最も好ま
しい標的であることに留意することが重要である。表ＩＩＩの他の接着分子は、
正常組織、通常はリンパ器官内および内皮上において、変化する程度に発現し、
このことはこれらの標的化をおそらく、動物モデルにおいて、または正常組織に
おけるそれらの発現が有意な副作用なしに阻害され得る場合にのみに適切にして
いる。Ｅ−セレクチンまたはＭＨＣクラスＩＩ抗原の標的化が好ましい。なぜな
ら、これらの抗原の発現が、腫瘍結合内皮において選択的に最も直接的に促進し
そうであるからである。
（Ｅ−セレクチン）
正常内皮の表面において発現されない抗原の標的化は、誘導法の最も率直な形
態である。Ｅ−セレクチンは、正常内皮血管系、または他のヒト細胞タイプにお
いて発現されない接着分子であるが（Ｃｏｔｒａｎら、１９８６）、ＩＬ−１、
ＴＮＦ、リンホトキシンおよび細菌エンドトキシンのようなサイトカインの作用
によって、内皮細胞の表面上に誘導され得る（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、１９８
７）。これは、ＩＦＮ−γによっては誘導されない（Ｗｕら、１９９０）。従っ
て、Ｅ−セレクチンの発現は、そのようなサイトカインの選択的な送達を介して
、または腫瘍環境においてそのようなサイトカインの選択的な放出を生じる組成
物の使用を介して、腫瘍内皮中に選択的に誘導され得る。
二重特異性抗体は、腫瘍部位において、１つ以上の上記またはその他の適切な
サイトカインの選択的な放出を生じ得るが、身体のその他の部分において放出を
生じ得ない組成物の一例である。そのような二重特異性抗体は、本明細書におい
て、「抗原誘導抗体」と称され、当然、標的化および凝固成分を有する、本発明
の任意の二重特異性抗体とは異なる。抗原誘導抗体は、単球／マクロファージ系
列（ｌｉｎｅａｇｅ）、Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞、あるいは肥満細胞の
ようなサイトカインエフェクター細胞と、標的化された固形腫瘍塊の腫瘍細胞と
を架橋するように設計される。次いで、この架橋は、架橋の部位、すなわち腫瘍
に局在化されたサイトカインの放出をもたらす。
有効な抗原誘導抗体は、一方で選択された腫瘍細胞表面抗原（例えば、表Ｉに
おける腫瘍細胞表面抗原）を認識し、他方で選択された白血球細胞タイプの表面
上の選択された「サイトカイン活性化」抗原を認識する。「サイトカイン活性化
」抗原という用語は、抗体またはそのフラグメント、もしくは自然に生じる因子
またはその合成アナログのようなエフェクター分子によって結合されると、それ
が可溶性因子であっても他の細胞上の膜結合カウンターレセプターであっても、
白血球細胞によってサイトカインの放出を促進する白血球の表面上の種々の既知
の分子のいずれをも指すために用いられる。サイトカイン活性化分子の例にはそ
れぞれ、ＩＬ−１およびＴＮＦαの放出を活性化するＣＤ１４（ＬＰＳレセプタ
ー）およびＩｇＥに対するＦｃＲ；ならびにＩＦＮγおよびＴＮＦβの放出を活
性化するＣＤ１６、ＣＤ２、またはＣＤ３、または、ＣＤ２８が含まれる。
そのような抗原誘導二重特異性抗体は、いったん腫瘍を有する動物の血流に導
入されると、腫瘍内の腫瘍細胞に結合し、それらの腫瘍細胞を、腫瘍に浸潤した
エフェクター細胞（例えば単球／マクロファージ）と架橋し、その後、腫瘍内の
サイトカインの選択的な放出をもたらす。しかし、重要なことに、腫瘍および白
血球の架橋なしに、抗原誘導抗体は、サイトカインの放出をもたらさない。従っ
て、腫瘍から離れた身体の部分において、サイトカイン放出は生じないため、サ
イトカイン誘導分子（例えば、Ｅ−セレクチン）の発現は、腫瘍内皮内のみに生
じる。
適切な二重特異性抗体と架橋されると、架橋された白血球によってサイトカイ
ンの放出を生じる、多数の有用な「サイトカイン活性化」抗原が知られている。
この目的のために通常好ましい標的は、単球およびマクロファージの表面におい
て見いだされるＣＤ１４である。ＣＤ１４は架橋されると、単球／マクロファー
ジを刺激し、ＩＬ−１（Ｓｃｈｕｔｔら、１９８８； Ｃｈｅｎら、１９９０）
、およびおそらく他のサイトカインを放出し、これらは次いで、近接する血管系
上のＥ−セレクチンの出現を刺激する。Ｅ−セレクチン誘導および標的化に関連
した他の可能な架橋の標的には、肥満細胞上に見いだされるＩｇＥに対するＦｃ
Ｒ；ＮＫ細胞上に見いだされるＩｇＧ（ＣＤ１６）に対するＦｃＲ；およびＴ細
胞の表面上に見いだされるＣＤ２、ＣＤ３またはＣＤ２８が含まれる。他の白血
球細胞タイプよりも、固形腫瘍の単球／マクロファージ浸潤が相対的に分布する
ため、これらの内、ＣＤ１４標的化が通常望ましい。
誘導実施態様の例において、固形腫瘍を有している動物に、二重特異性（Ｆａ
ｂ’−Ｆａｂ’）抗ＣＤ１４／抗腫瘍抗体（例えば、高Ｍｒメラノーマ抗原ＯＶ
−ＴＬ３に対する抗−ＣＥＡ、９．２．２７抗体、または卵巣関連抗原に対する
ＭＯｖ １８抗体）を注射する。抗体は、その腫瘍結合活性によって、腫瘍内に
局在化し、次いで、腫瘍内の単球およびマクロファージを、それらのＣＤ１４抗
原を架橋することによって活性化する（Ｓｃｈｕｔｔら、１９８８； Ｃｈｅｎ
ら、１９９０）。活性化された単球／マクロファージは、抗腫瘍性活性を有し（
Ｐａｌｌｅｒｏｎｉら、１９９１）、そして腫瘍血管内皮細胞上のＥ−セレクチ
ン抗原をすばやく誘導するＩＬ−１およびＴＮＦを放出する（Ｂｅｖｉｌａｃｑ
ｕａら、１９８７； Ｐｏｂｅｒら、１９９１）。
（ＭＨＣクラスＩＩ抗原）
本発明における使用が考えられる誘導性マーカーの第２の好ましいグループは
、ＨＬＡ−ＤＡ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱを含むＭＨＣクラスＩＩ抗原
（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８４）である。クラスＩＩ抗原は、ヒトを含む数種類
の種のほとんどの正常な組織内の血管内皮細胞上で発現される。インビトロ（Ｃ
ｏｌｌｉｎｓら、１９８４；Ｄａａｒら、１９８４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１
９９０）およびインビボ（Ｇｒｏｅｎｅｗｅｇｅｎら、１９８５）での研究によ
り、血管内皮細胞によるクラスＩＩ抗原の発現には、ＴＨ１細胞によって形成さ
れ、そしてＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によってもより低い程度に形成される
ＩＦＮ−γの継続した存在が要求されることが示されている。
ＭＨＣクラスＩＩ抗原は血管内皮細胞に特有のものでなく、マウス（Ｈａｍｍ
ｅｒｌｉｎｇ、１９７６）およびヒト（Ｄａａｒら、１９８４）の双方において
、Ｂ細胞、活性化されたＴ細胞、単球／マクロファージ系統の細胞、およびある
種の上皮細胞上においても構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）に発現する
。「正常な」内皮上でのＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現のため、それらの標的化は
Ｅ−セレクチンほどには簡単ではない。しかし、正常な組織内でのクラスＩＩ分
子の発現を効果的に抑制する能力を有するシクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏ
ｒｉｎ Ａ； ＣｓＡ）など（Ｇｒｏｅｎｅｗｅｇｅｎら、１９８５）の免疫抑
制剤と関連して使用することによって、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の誘導および標的
化が可能となる。ＣｓＡは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化を防止することによ
って作用し（Ｇｒｏｅｎｅｗｅｇｅｎら、１９８５；ＤｅＦｒａｎｃｏ、１９９
１）、それによってＩＦＮ−γの基底レベル（ｂａｓａｌ ｌｅｖｅｌ）を内皮
上におけるクラスＩＩの発現を維持するのに必要とされるレベル以下に減少させ
る。
やはり免疫抑制効果を有し、クラスＩＩ発現を抑制する能力を示すと思われる
、シクロスポリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇなどを含む、ＣｓＡに関連するその他各種
のシクロスポリンが存在する。同様に有効であり得るその他の作用剤には、ＦＫ
５０６およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）が含まれる。
従って、ＭＨＣクラスＩＩ誘導および標的化の実施態様の実施では、腫瘍を有
する動物を、クラスＩＩ発現を抑制するために効果的な用量のＣｓＡまたは他の
クラスＩＩ免疫抑制剤で事前に処置することが必要である。これはＣｓＡの場合
、代表的には約１０から約３０ ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーである。正常組織内
で一旦抑制されると、クラスＩＩ抗原は、ここでも二重特異性抗体の使用を通じ
て、腫瘍の内皮内に選択的に誘導され得る。
この場合、抗原を誘導する二重特異性抗体は、腫瘍細胞マーカーと、ＩＦＮ−
γの生成を誘導することのできるエフェクター細胞の表面上に見られる活性化抗
原とに対する特異性を有する。そのようなエフェクター細胞とは、一般的にはヘ
ルパーＴ細胞（ＴＨ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。これらの実
施態様では、クラスＩＩ抗原の発現がＩＦＮ−γを用いて達成され、他のサイト
カインでは達成されないという点で、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（ＣＤ１６が使用さ
れる場合）が腫瘍中に存在し、サイトカイン中間体を生成する必要がある。従っ
て、本発明のこの局面の実施のためには、抗原を誘導する二重特異性抗体による
標的化のためのサイトカイン活性化抗原としてＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、最も
好ましくはＣＤ２８、を選択することが望ましい。
腫瘍中で活性化されるべきＴ細胞は、血管系に隣接するものである。細胞にと
って最もアクセスし得る領域であり、二重特異性抗体が最も集中するところでも
あるからである。活性化されたＴ細胞は、その後、ＩＦＮ−γを分泌し、これが
隣接する腫瘍血管系上にクラスＩＩ抗原を誘導する。
一方のアームが腫瘍抗原に対して向けられており、もう一方のアームがＣＤ２
８に対して向けられている二重特異性（Ｆａｂ’−Ｆａｂ’）抗体の使用が、現
状では好ましい。この抗体は、腫瘍中でＴ細胞上のＣＤ２８抗原を架橋し、これ
は、（例えば、一般に腫瘍細胞によって分泌されるＩＬ−１によって提供される
（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９１：Ｒｕｃｏら、１９９０））第２の信号と組合わ
さった場合、Ｔ細胞をＣＡ２＋−非依存性ＣｓＡ−非抑制性の経路を通じて活性
化することが示されている（Ｈｅｓｓら、１９９１；Ｊｕｎｅら、１９８７；Ｂ
ｊｏｒｎｄａｈｌら、１９８９）。
種々のサイトカイン活性化分子に対する抗体の調製も、当該分野で周知である
。例えば、白血球による、サイトカイン生成を誘導する能力を有する抗−ＣＤ１
４および抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体の調製および使用は、今ではいくつか
の研究室によって記述されている（Ｓｃｈｕｔｔら、１９８８；Ｃｈｅｎら、１
９９０；およびＪｕｎｅら、１９９０で、それぞれ概説されている）。さらに、
その他のメカニズムおよびその他の活性化抗原を通じて白血球によるサイトカイ
ンの放出を刺激するモノクローナル抗体の調製もまた、公知である（Ｃｌａｒｋ
ら、１９８６；Ｇｅｐｐｅｒｔら、１９９０）。
さらなる実施態様では、クラスＩＩ分子の発現を抑制し、そして腫瘍が存在す
る部分でのクラスＩＩ分子の発現を選択的に引き出すための別のアプローチが、
意図される。ＣｓＡおよび二重特異性活性化抗体の双方の使用を回避するこのア
プローチは、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの生成を抑制すること（例えば抗−ＣＤ４
抗体の使用を通じて（Ｓｔｒｅｅｔら、１９８９））によって、クラスＩＩ分子
の発現が効果的に阻害され得るという事実を利用する。この実施態様の使用にお
いて、ＩＦＮ−γの生成は抗−ＣＤ４を投与することによって阻害され、結果的
にクラスＩＩ発現の一般的な抑制となる。クラスＩＩは、その後、例えば腫瘍内
部においてのみ活性化可能である腫瘍特異的Ｔ細胞の使用により、腫瘍サイトに
おいてのみ誘導される。
この処置モードにおいては、一般的には動物またはヒトの患者をＩＦＮ−γの
生成を抑制するために効果的な用量の抗−ＣＤ４によって事前に処置し、それに
よってクラスＩＩ分子の発現を抑制する。効果的な用量は、例えば、約４〜約１
０ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーである。クラスＩＩ発現が抑制された後は、腫瘍細
胞の表面上に発現される抗原に対して特異的な、ＩＮＦ−γを生成するＴ細胞ク
ローン（例えば、Ｔｈ１または細胞毒性のＴリンパ球、ＣＴＬ）が調製され、血
流内へ導入される。これらのＴ細胞はそれらの抗原認識能力のため腫瘍塊に局在
化され、そのような認識が行われる際にＩＦＮ−γを放出する。このように、サ
イトカインの放出はここでも腫瘍に対してのみ制限されて、従って、クラスＩＩ
分子の発現を腫瘍血管系に限定する。
ＩＦＮ−γを生成するＴ細胞クローンは、末梢の血液から入手し得るが（Ｍａ
ｚｚｏｃｃｈｉら、１９９０）、好ましいソースは腫瘍塊の中からである（Ｆｏ
ｘら、１９９０）。そのようなＴ細胞クローンの現行での好ましい調製手段では
、患者から腫瘍塊の一部分を取り除き；（必要に応じてコラゲナーゼ消化を用い
て）細胞を分離し；密度勾配遠心分離を用いて腫瘍に浸透する白血球を濃縮し、
続いて、（例えば特異性抗体と補体とによる処置によって）その他の白血球の部
分集合を枯渇させ；その後、腫瘍に浸透する白血球をインビトロで拡大（ｅｘｐ
ａｎｄ）させて、ＩＦＮ−γを生成するクローンを供給する。このクローンは、
必然的に、患者と免疫学的に適合し、従って、患者によって十分に許容される。
各個別のクローンのサイトカイン分泌パターンを１４日毎に決定することによ
って、高ＩＦＮ−γ生成Ｔ細胞クローンを、拡大させた白血球からさらに選択し
、そのことによって格別の利益を達成することができることが提案されている。
この目的のため、静止したクローンは有糸***的または抗原的に２４時間刺激さ
れ、それらの培養上澄液は、例えば、特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ技術（Ｃｈ
ｅｒｗｉｎｓｋｉら、１９８９）を使用して、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４
、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の存在についてアッセイされる。ＴＨ１クローンの
特徴的なサイトカイン分泌パターンである、高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−
γを分泌するクローンが選択される。腫瘍特異性は、増殖アッセイを用いて確認
される。
さらに、抗−ＣＤ４抗体として、抗−ＣＤ４ Ｆａｂを採用することが好まし
い。その理由は、この抗体は注入後２４時間以内に身体から除去され、従って後
で投与される腫瘍認識Ｔ細胞クローンの抑制を生じさせないからである。腫瘍特
異性を有するＴ細胞クローンの調製は、一般に当該分野で周知であり、例えば固
形の黒色腫に浸透するリンパ球からのＴ細胞クローンの生成および特徴付けによ
って示される（Ｍａｅｄａら、１９９１）。
ＭＨＣクラスＩＩ抑制−誘導法のいずれを使用するにしても、静脈注射される
抗−クラスＩＩ抗体が、外皮細胞または肝臓および脾臓以外の正常な臓器内の単
球／マクロファージに達するようには見えないという事実より、結果的に更なる
利益が得られそうである。これは、おそらく、ほとんどの正常な臓器内の血管内
皮は、肝臓および脾臓内でのように有窓性を有さずタイトであり、従って抗体は
クラスＩＩ−陽性細胞に達するために基底膜を横切って拡散せねばならないから
である。また、例えば架橋に続いて、結果として生じ得るいかなるＢ細胞除去も
、これらの細胞がクラスＩＩ陰性の先祖細胞から補充されるので、重要な問題を
提示しそうにない（Ｌｏｗｅら、１９８６）。Ｂリンパ腫の患者に起こるＢ細胞
の殺傷さえも、明らかな害を生じるものではない（Ｖｉｔｅｔｔａら、１９９１
）。
要約すると、本発明の腫瘍凝固組成物および抗体はすっきりとシンプルであり
、それらの操作性に関して抗原の誘導を必要としないが、抗原を誘導する二重特
異性抗体の、本発明と組み合わせた使用も意図されている。そのような抗体は一
般的に、本発明の二重特異性凝固リガンドに先立って、投与される。
一般的に言って、「免疫原性」の腫瘍であるほど、例えば腫瘍内のＴ細胞の抗
−ＣＤ２８／抗−腫瘍二重特異性抗体を通じての架橋を含む、ＭＨＣクラスＩＩ
アプローチにより適している。その理由は、これらの腫瘍はＴ細胞によってより
浸透されやすいからであり、このことはこの方法が有効であるための前提条件だ
からである。免疫原性固形腫瘍の例として、腎臓ガン腫、黒色腫、少数の乳ガン
および結腸ガンの他に、可能性のあるものとして膵臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、
肺ガンおよび神経膠ガンが含まれる。これらの腫瘍は、「免疫原性」として言及
される。それは、これらが宿主中で免疫反応を引き起こす証拠が在り、細胞免疫
療法を施せることが判明しているからである（Ｙａｍａｕｅら、１９９０）。黒
色腫および大腸ガンの場合、これらの事例での使用が最も好ましい抗体は、Ｂ７
２．３（抗−ＴＡＧ−７２）およびＰＲＳＣ５／ＰＲ４Ｃ２（抗−Ｌｅｗｉｓ
ａ）または９．２．２７（抗−高 Ｍｒ 黒色腫抗原）である。
全ての起源の固形腫瘍の多数について、マクロファージ／単球中間体を採用す
る抗−ＣＤ１４アプローチがより適切である。これは、ほとんどの腫瘍はマクロ
ファージを豊富に含んでいるからである。マクロファージを豊富に含む腫瘍の例
として、ほとんどの乳ガン腫、結腸ガン腫および肺ガン腫が含まれる。これらの
事例での使用が好ましい抗−腫瘍抗体の例として、抗−ＨＥＲ−２、Ｂ７２．３
、ＳＭ−３、ＨＭＦＧ−２、およびＳＷＡ１１がある（Ｓｍｉｔｈら、１９８９
）。
（（ｃ）コアギュラント誘導性マーカー）
トロンビン、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、プラスミンおよび、間質
性コラゲナーゼ、ストロメリシンおよびゼラチナーゼなどの金属結合タンパク分
解酵素などのコアギュラントは、ある種のマーカーを誘導するようにも作用する
。特に、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＰＤＧＦおよびＩＣＡＭ−１は、ト
ロンビンによって誘導される（Ｓｕｇａｍａら、１９９２；Ｓｈａｎｋａｒら、
１９９４）。
従って、この誘導については、抗−コアギュラント／抗−腫瘍二重特異性抗体
が利用される。抗体は、その腫瘍結合活性によって腫瘍内に局在化される。その
後、二重特異性体はコアギュラント（例えばトロンビン）を腫瘍内に濃縮し、結
果的に腫瘍血管内皮細胞上でのＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの誘導が得
られる（Ｓｕｇａｍａら、１９９１；Ｓｈａｎｋａｒら、１９９４）。
あるいは、短縮型組織因子の腫瘍細胞または内皮への標的化が、腫瘍内でのト
ロンビンの堆積を誘導する。トロンビンが堆積されると、腫瘍血管内皮細胞上に
Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンが誘導される。
（（ｄ）血管内皮細胞マーカーに対する抗体）
疾患関連血管系標的を認識するための直載的な手段は、自然環境においてまた
は人工的な手段によって誘導されたものかに関係なく、特定の細胞表面レセプタ
ー、分子または抗原に対して結合親和力を有する抗体を使用する。これらは、例
えば腫瘍血管内皮細胞上に存在することが知られているもの、腫瘍に由来する因
子に反応して誘導あるいは過剰発現されるもの、およびヒトの手による操作に従
って誘導されるものである、全ての細胞表面成分に対する抗体を含む。表ＩＶお
よび表Ｖに、有用な抗体およびそれらの特性を要約する。
Figure 2009298805
Figure 2009298805
 本発明で使用し得るさらなる２種類の抗体は、Ｒｅｔｔｉｇら（１９９２）お
よびＷａｎｇら（１９９３）によって記載された、ヒトの腫瘍の血管系内に発現
されるがほとんどの正常な組織内では発現されない、未知の機能を有する関連の
ない抗原に対する抗体である。
Ｋｉｍら（１９９３）によって記載された抗体も、特にこの抗体がインビボで
血管形成を阻害し腫瘍の成長を抑制したので、本発明で使用し得る。
ヒトの腫瘍について特異的であることが以前に示されていない抗体も使用し得
る。例えば、Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎら（１９９２）は、抗−ＦＧＦ ＭＡ
ｂｓの生成を記載した。Ｘｕら（１９９２）は、ＦＧＦレセプター（ｆｌｇ）イ
ソ型に対する、１６個のイソ型およびドメイン特異的ポリクローナルおよびモノ
クローナル抗体のパネルの開発および特徴付けを行った。Ｍａｓｓｏｇｌｉａら
（１９８７）も、ＦＧＦに対するＭＡｂｓを報告した。
（（ｅ）疾患血管系に対する抗体の生成）
上記の抗体および科学文献において公知で公表されているその他の抗体など、
既知の抗体を利用することに加えて、以下により詳細に説明されるように、通常
の免疫化手順を使用することによっても新規な抗体を生成し得る。周知の疾患関
連血管マーカー抗原に対する抗体を生成するために、抗原を含む免疫原性組成物
によって動物を免疫化する。これは、抗原を含む、あるいは抗原が濃縮された膜
調製物；細胞または膜から分離されたような抗原の比較的精製された形態；例え
ば、天然の抗原抽出物または組換型宿主細胞から得られた抗原の組換型の形態を
用いる、種々の精製工程によって得られるような、抗原の高度に精製された形態
であり得る。
本発明は、疾患関連血管系内皮細胞上に存在する抗原に対する抗体を生成する
ための更なる方法をも提供し、それらの方法は抗原の生化学的本質が未知である
場合であっても使用に適切である。これらの方法は、腫瘍血管系内皮細胞に対す
る抗体の生成を通じて例示される。この様式により抗体の生成を達成する第１の
手段には、動物またはヒトの患者の腫瘍部位から得られる血管内皮細胞の調製物
が用いられる。そのような細胞の調製物で単に実験動物を免疫化することにより
、生成される抗体を回収する。この方法の最も有効な形態は、特異的抗体がつい
で選択されるが、これは従来のハイブリドーマ技術および腫瘍血管系内皮細胞に
対するスクリーニングを使用することにより達成され得る。
上記方法の発展は、インビトロで腫瘍血管系事象を模倣するものであり、細胞
の精製は必要ではない。この方法の使用では、内皮細胞を、動物中よりもむしろ
細胞培養中の腫瘍馴化培地から得られ得るような、腫瘍に由来する生成物にさら
す。この方法は、一般的に内皮細胞を腫瘍馴化培地で刺激すること、および刺激
された内皮細胞を免疫原として適用し、抗体の収集物を調製することを包含する
。ここでも、特異的抗体が選択されるが、それは例えば従来のモノクローナル抗
体技術、または免疫化し動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製された組み合
わせ的な免疫グロブリンファージミドライブラリなどのその他の技術を用いる。
腫瘍に刺激された血管内皮を優先的に認識し、正常なヒト成人の組織とよりも腫
瘍関連内皮細胞とより強く反応する特異的抗体が選択される。
この点に関して使用を意図される刺激された内皮細胞は、例えば、ヒト臍静脈
内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ
ｌ ｃｅｌｌｓ； ＨＵＶＥ）、ヒト皮膚細血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒ
ｍａｌ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；
ＨＤＥＭＣ）、ヒト伏在静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｓａｐｈｅｎｏｕｓ ｖ
ｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、ヒト大網脂肪内皮細胞（ｈｕ
ｍａｎ ｏｍｅｎｔａｌ ｆａｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、そ
の他のヒト細血管内皮細胞、ヒト脳の毛細管内皮細胞などである。本願明細書の
記述に従い、他種からの内皮細胞が、腫瘍馴化培地によって刺激され得、免疫抗
原として用いられてハイブリドーマを生成し抗体を生産することも意図される。
すなわち腫瘍で刺激されたヒトの血管内皮細胞と交差反応する抗体、および／ま
たは前臨床モデルで使用する抗体を生成することも、意図される。
本明細書において、「腫瘍馴化培地」は、ひとつまたはそれ以上の腫瘍に由来
するサイトカイン、リンフォカインまたはその他のエフェクター分子を含有する
培養培地のような組成物または培地として定義される。最も典型的には、腫瘍馴
化培地は、選択された腫瘍細胞が培養され、従ってそのような腫瘍に由来する生
成物が濃縮される培養培地から調製される。培地のタイプは、少なくとも初期の
時点で腫瘍細胞の増殖を維持するのに適切な養分と条件とを含有する限り、特に
重要とは考えられない。腫瘍馴化培地から物質を抽出しさらには分離し、ひとつ
またはそれ以上の抽出物を内皮細胞に適用することも、もちろん可能である。
培地の調製のために使用される腫瘍のタイプに関しては、究極的に本発明を使
用する分析または処置を受ける腫瘍を模倣するまたはそれに類似する腫瘍を採用
することがもちろん好ましい。従って、例えば、乳ガンの治療のためのプロトコ
ールの開発を予測する場合、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−
ＭＢ−２３１などの乳ガン細胞を採用することが好ましい。結直腸腫瘍の場合、
ＨＴ２９ガン腫と同様ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６若しくはＳＷ４８またはＳＷ１
２２が、例として言及され得る。肺腫瘍の場合、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＳＷ２、ＮＣ
Ｉ Ｈ２３、ＮＣＩ Ｈ４６０、ＮＣＩ Ｈ６９、またはＮＣＩ Ｈ８２が、例
として言及され得る。黒色腫の場合の良い例は、ＤＸ．３、Ａ３７５、ＳＫＭＥ
Ｌ−２３、ＨＭＢ−２、ＭＪＭ、Ｔ８または実際にＶＵＰである。上記のいかな
る場合も、処置されるべき腫瘍から生成された細胞、すなわち生検から得られた
細胞も採用され得ることが更に考えられる。
一旦調製されると、腫瘍馴化培地は、ついで内皮細胞の細胞表面上の腫瘍内皮
細胞特異的マーカーの出現を刺激するために用いられる。例えば、選択された内
皮細胞を腫瘍馴化培地（またはそれに由来する生成物）の存在下で培養すること
を含む。ここでも、採用される内皮細胞のタイプは、それが最終的に治療または
診断されるべき特定の腫瘍の血管系に関連する内皮細胞を一般的に代表する限り
、決定的に重要でないことが提案される。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ）また
はヒト皮膚細血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ、Ｋａｒａｓｅｋ、１９８９）を適用す
ることが好ましい。なぜならヒトにその起源を有し、サイトカイン成長因子およ
び血管形成因子に反応し、容易に得られるからである。しかし、インビトロで培
養し得るいかなる内皮細胞も本発明の実施において採用され得、やはり有益な結
果を達成し得ることが期待されている。ＥＡ．ｈｙ９．２６、ＥＣＶ３０４、ヒ
トの伏在静脈内皮細胞などが、例として言及され得る。
一旦、腫瘍に由来する生成物を用いて刺激されると、内皮細胞はその後、モノ
クローナル抗体（ＭＡｂ）の調製の免疫原として適用される。抗原細胞表面マー
カーに対するＭＡｂを調製する技術はまったく明確であり、当業者に周知の技術
を使用することにより容易に実施され得る。これは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ（１９７５）の手順によって例示され、以下で更に説明される。
一般的に言って、刺激された内皮細胞を使用してＭＡｂを調製する好ましい方
法は、以下の手順を包含する。ヒト腫瘍由来の細胞または細胞株が、組織培養で
４日間またはそれ以上増殖される。組織培養上澄液（「腫瘍馴化培地」）を腫瘍
細胞培養液から取り出し、ＨＵＶＥＣの培養液へ５０％（ｖ／ｖ）の最終濃度と
なるように加える。２日間の培養の後、ＨＵＶＥＣは非酵素的に回収され、１〜
２×１０６個の細胞がマウスの腹腔内に注入される。このプロセスを、２週間の
間隔をおいて３回繰り返し、最終の免疫化は静脈ルートによる。３日後、脾臓細
胞を採取し、通常のプロトコール（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９
７５）に従ってＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合し、適切な反応性を有する抗体を生
成するハイブリドーマを限界希釈法によってクローン化する。
結果として生じるハイブリドーマのコレクションから、活性化されていない血
管内皮を認識する以上に活性化された血管内皮を認識する抗体を生成する、ひと
つまたはそれ以上のハイブリドーマを選択する。ひとつのゴールは、正常な内皮
に対する結合親和力を実質的に有しない抗体の同定である。しかし、先行技術と
比較した際、本発明においてはこの特性は決定的ではない。いずれにしても、腫
瘍により活性化された内皮細胞のひとつまたはそれ以上のタイプに対する適切な
抗体生成ハイブリドーマは、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、ＩＩＦ、ま
たは同様の免疫アッセイを用いるスクリーニングによって、一般的に同定される
。一旦候補が同定されると、活性化されていないまたは「正常な」内皮あるいは
その他の正常な組織または細胞のタイプに対する反応性の欠損についてのテスト
が望まれている。この様に、特定の適用に際して予測される望ましくない高レベ
ルの正常な交差反応性を有する抗体を生成するハイブリドーマを排除し得る。
（（ｆ）抗エンドグリン抗体）
上記の技術を使用することにより、腫瘍血管内皮細胞に対する比較的特異性を
有する抗体が調製および分離された。ひとつの特定の例では、ＨＴ２９ガン腫細
胞を用いて馴化培地を調製し、ついで、これを用いて培養中のＨＵＶＥ細胞を刺
激した。結果として生じたＨＴ２９−活性化ＨＵＶＥ細胞は、ついで、ハイブリ
ドーマバンクの調製の免疫原として用いられ、ハイブリドーマバンクはＨＴ２９
−活性化ＨＵＶＥ細胞を使用するＥＬＩＳＡ−スクリーニング、さらにはヒトの
腫瘍および正常組織の切片の免疫組織学的分析によってスクリーニングされた。
このバンクから、腫瘍血管内皮細胞抗原を認識する抗体が選択された。
腫瘍内皮細胞抗体４および腫瘍内皮細胞抗体１１（ＴＥＣ４およびＴＥＣ１１
）と命名されたＭＡｂは、上記方法を使用して得られた。ＴＥＣ４およびＴＥＣ
１１によって認識される抗原は、最終的には分子エンドグリンであると決定され
た。ＴＥＣ４およびＴＥＣ１１によって認識されるエンドグリン上のエピトープ
は刺激されたＨＵＶＥ細胞の細胞表面上に存在し、刺激されていない細胞の表面
上には最小限度でのみ（または免疫学的に接近可能な程度）存在する。エンドグ
リンに対するＭＡｂはすでに生成されている。しかし、ＨＵＶＥＣまたはＴＣＭ
−活性化ＨＵＶＥＣ細胞表面決定基との反応性をＦＡＣＳまたは間接免疫蛍光検
査法によって分析することにより、ＴＥＣ−４およびＴＥＣ−１１によって認識
されるエピトープが４４Ｇ４と命名された以前の抗体（ＧｏｕｇｏｓおよびＬｅ
ｔａｒｔｅ、１９８８）のそれとは異なることが示される。
公知の任意の抗エンドグリン抗体（例えば、ＧｏｕｇｏｓおよびＬｅｔａｒｔ
ｅ、１９８８；Ｇｏｕｇｏｓら、１９９２；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９９２；
Ｂｕｈｒｉｎｇら、１９９１）が本発明と関連して使用され得るが、ＴＥＣ−４
およびＴＥＣ−１１ ｍＡｂが特に適切であると考えられる。これは、それらが
広範囲の固形腫瘍の（および数種類の慢性炎症性状態および胎児胎盤における）
毛細血管および細静脈内皮細胞を「中程度」から「強度」で標識するが、正常で
健康な成人の組織の大多数においては血管の比較的弱い染色を示すからである。
ＴＥＣ−１１は実質的に非内皮細胞と反応性を示さないため、特に好ましい。さ
らに、ＴＥＣ−４とＴＥＣ−１１の双方とも補体結合性であり、それにより腫瘍
血管床内の内皮細胞の選択的溶解をも誘導する能力が与えられる。
ＭＡｂ ＴＥＣ−４およびＴＥＣ−１１と交差反応する抗体、すなわちＴＥＣ
−４またはＴＥＣ−１１と同じエピトープでのエンドグリンに結合するものも、
本発明で有効であると考えられる。ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１と同じエピト
ープでエンドグリンに結合する抗体の同定は、まったく明白な事柄である。この
ことは、抗体の競合を評価することのできる種々の免疫学的スクリーニングアッ
セイの中の任意のものを用いて容易に決定することができる。例えば、検査され
るべきテスト抗体がＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１のそれとは異なるソース、例
えばウサギから得られる場合、あるいは異なるイソ型、例えばＩｇＧ１またはＩ
ｇＧ３である場合でも、競合ＥＬＩＳＡが使用され得る。競合ＥＬＩＳＡのその
ような一実施態様では、ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１を異なる量のテスト抗体
と共に事前に混合して、ついで抗原でコートしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに
適用する。抗−ネズミまたは抗−ＩｇＭ２次抗体のいずれかを使用することによ
って、結合したＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１抗体のみを検出することができ、
それらの結合は、ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１のいずれかと同じエピトープを
認識するテスト抗体の存在によって減少される。
ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１とテスト抗体との間の抗体競合の研究を行うた
めに、最初にＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１を検出可能な標識、例えばビオチン
もしくは酵素または放射性標識など標識し得、その後の同定を可能とする。これ
らの場合は、標識された抗体を試験されるべきテスト抗体と共に種々の比率（例
えば、１：１、１：１０および１：１００）でインキュベートし、適切な時間の
後、標識されたＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１抗体の反応性をアッセイし、これ
を、インキュベーション中に競合する抗体（テスト）が含まれなかった場合のコ
ントロール値と比較する。
アッセイは、抗体結合に基づく免疫学的アッセイの範囲内のひとつであればい
かなるものでも良く、ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１抗体は、それらの標識を検
出することにより、例えばビオチン化された抗体の場合はストレプトアビジンを
使用し、または酵素的標識に関する発色基質を使用することによって、または単
に放射性標識を検出することによって検出される。ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１
１と同じエピトープに結合する抗体は、結合について効果的に競合し得、ＴＥＣ
−４またはＴＥＣ−１１結合を著しく減少する。これは標識された抗体の結合の
減少によって証明される。本ケースでは、標識されたＴＥＣ−４またはＴＥＣ−
１１抗体をテスト抗体と混合した後、残りの反応性を決定するのに適切なアッセ
イとして、例えば、ヒトのエンドグリンを用いるＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはウエ
スタンブロット；エンドグリンの免疫沈降反応；ヒトエンドグリンを発現する組
換型細胞のＥＬＳＡ、ＲＩＡまたは免疫蛍光染色；腫瘍血管系内皮細胞の間接免
疫蛍光染色；ＨＵＶＥＣまたはＴＣＭ−活性化ＨＵＶＥＣ細胞表面決定基との反
応性の間接免疫蛍光検査；およびＦＡＣＳ分析が含まれる。この後者の方法が最
も好適であり、ＴＥＣ−４およびＴＥＣ−１１によって認識されるエピトープが
４４Ｇ４（ＧｏｕｇｏｓおよびＬｅｔａｒｔｅ、１９８８）のそれとは異なるこ
とを示すために採用された。
いかなるテスト抗体も存在しない状況下での標識されたＴＥＣ−４抗体または
ＴＥＣ−１１抗体の反応性は、高いコントロール値である。低いコントロール値
は、標識された抗体と同じタイプの標識されていない抗体と共にインキュベート
することによって得られるが、それは競合が生じ、標識された抗体の結合が減少
するときである。標識された抗体反応性のテスト抗体存在下における著しい減少
は、同じエピトープを認識するテスト抗体、すなわち標識された抗体と「交差反
応」するものが存在することを示す。本願のこの局面における「著しい減少」と
は、約１：１の比率での少なくとも約１０％〜５０％、またはより好ましくは約
１：１００の比率での約９０％に等しいまたはそれ以上の結合の再生可能な（す
なわち首尾一貫して観察される）減少として定義され得る。
「交差反応性アッセイ」の使用は、ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１という面に
おける上記の説明のように、本発明に使用し得るいかなる抗体に対しても適用さ
れ得る。従って、腫瘍細胞の構成成分、腫瘍血管系の構成成分、腫瘍細胞関連成
分、腫瘍血管系関連成分、腫瘍細胞外のマトリクス成分、または本明細書にリス
トされている細胞タイプと本明細書にリストされている抗体のいかなるものとも
同じエピトープで結合し、抗体競合アッセイによって決定される抗体は、凝固剤
と組み合わされ二重特異性リガンドを形成する場合、本発明の範囲に入る抗体と
なる。
（（ｇ）血管内皮細胞結合リガンドの使用）
成長因子レセプターのような、内皮細胞表面分子に結合、あるいはそれと相互
作用することが知られている生物学的リガンドは、標的化成分としても使用され
得る。
この意味において標的として有用であると考えられる成長因子またはリガンド
として、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンド、腫
瘍関連フィブロネクチンイソ型、消散因子（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）、
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦおよびＴＩＭＰ
が含まれる。
特に好ましい標的は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦファミリーのタンパク質およ
びＴＧＦβである。Ａｂｒａｈａｍら（１９８６）はＦＧＦをクローン化し、従
って組換えタンパク質として入手可能である。Ｆｅｒｒａｒａら（１９９１）に
よって報告されているように、１２１、１６５、１８９、および２０６個のアミ
ノ酸を有する４種のＶＥＧＦがクローン化されている。
（（ｈ）結合リガンドの標的化）
抗体または特異的標的化リガンドはまた、腫瘍のような疾患部位内の血管内皮
細胞の表面に結合するいかなる成分に対しても向けられ得る。このような成分は
、腫瘍環境に応答する内皮細胞上で、内皮細胞上に既に存在する特異的細胞表面
レセプターに、あるいは誘導または過剰発現されたレセプターに結合する、腫瘍
由来のリガンドおよび抗原（例えば、増殖因子）によって例示される。腫瘍血管
関連標的はまた、腫瘍由来の内皮細胞結合因子とも命名され得る。
成功的な疾患標的化のために必要である特異性のレベルは達成される。なぜな
ら、部分的には、局所内皮細胞が、正常内皮細胞上に存在しないか、または過小
発現もしくはマスクされるレセプターを発現または現すために誘導されるからで
ある。腫瘍について、その他の組織のために用い得るリガンドの量が減少するこ
とで、腫瘍中の内皮細胞が腫瘍由来の因子を捕獲し、そしてそれらを細胞表面に
結合させるという事実のために、さらなる特異性が得られる。血液および組織液
のプール中に分配することによる、因子またはリガンドのさらなる希釈と組み合
わされた場合、正常組織内の内皮細胞は、比較的少数のこのような因子を結合す
ると予期される。従って、操作上は、細胞表面結合リガンドまたは因子は、腫瘍
内皮細胞マーカーとして使用することができる。
腫瘍細胞自身による生成に加え、腫瘍内皮細胞結合因子はまた、腫瘍に浸潤し
たその他のタイプの細胞（例えば、マクロファージおよびマスト細胞）から生じ
得るか、あるいは腫瘍内部で活性化される血小板によって形成され得る。
腫瘍血管系関連標的として有用であると考えられるさらなる増殖因子またはリ
ガンドとして、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ （ＮａＫａｍｕ
ｒａ、１９９１）、アンジオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）、ＴＧＦ−α
、ＴＮＦ−α、ＰＤ−ＥＣＧＦおよびＴＩＥ結合リガンド（Ｂｉｃｋｎｅｌｌお
よびＨａｒｒｉｓ、１９９２）が包含される。現在の好ましい標的として、ＶＥ
ＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦファミリーのタンパク質形成転換増殖因子β（ＴＧＦ−β
）；ＴＧＦ−α；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；アンジオトロピン；血小板
由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；ＴＩＥ結合リガンド；プレイオトロ
ピンが含まれる。
本発明の別の局面は、リガンド−レセプター複合体上のみに存在するエピトー
プに特異的である標的化抗体またはそれ由来の結合領域の使用であり、そのエピ
トープは、個々の（遊離の）リガンドおよび非結合形態レセプターの双方に存在
しない。これらの抗体は、リガンド（例えば、増殖因子）がそのレセプター（例
えば、増殖因子レセプター）に結合して、特異的に結合した複合体を形成する場
合に生じる独特のコンホメーションを認識し、そしてそれに結合する。このよう
なエピトープは、リガンドまたはレセプターの非複合体上には存在しない。
発明者らは、これらの抗体が結合するリガンド−レセプター複合体が、非腫瘍
関連内皮細胞上よりも腫瘍関連内皮細胞上に著しく多数で存在することに注目す
る。従って、このような抗体は標的化剤として有用であり、そして本発明の二重
特異性コアギュラントの特異性をさらに増加させるように作用する。
（（ｉ）レセプター構築物）
内皮細胞表面レセプターの可溶性結合ドメインはまた、本発明の標的化リガン
ドとしての使用も考えられる。この概念は、一般的に、種々のインビトロおよび
インビボでの結合プロトコールで利用されている周知のサンドイッチ結合現象に
基づく。基本的には、内皮細胞が特異的なレセプターを発現すると、細胞は対応
するリガンドに結合し、そしてそれを吸着する。ついで、リガンドがシステム内
へ導入されると、さらなるレセプター構築物に結合するためにそれらが用いられ
得る。
有用な内皮細胞レセプターの範囲は、前述のセクションで同定されており、Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２が特に好まし
い標的である。これらのレセプターのそれぞれは、標的化リガンドとしての使用
のための可溶性結合ドメインを形成するために操作され得る。
（４．疾患関連支質細胞標的）
（（ａ）細胞外マトリクス／支質標的）
腫瘍病理における基底膜マーカーの有用性が、Ｂｉｒｅｍｂａｕｔら（１９８
５）によって記載された。これらの研究により、基底膜（ＢＭ）マーカー、タイ
プＩＶコラーゲン、ラミニン（ＬＭ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰ
）、およびフィブロネクチン（ＦＮ）の分布が、腫瘍病理において崩壊したこと
が示された。Ｂｕｒｔｉｎら（１９８３）はまた、ヒトの転移リンパ節内の基底
膜および結合組織抗原の変更を記載した。
本発明での使用のための好ましい標的はＲＩＢＳである。Ｕｇａｒｏｖａら（
１９９３）は、コンホメーション的変化がフィブリノーゲン中に発生し、そして
血小板膜糖タンパク質ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａとの相互作用によって誘導されるこ
とを報告した。活性化された血小板上でのフィブリノーゲンの膜糖タンパク質Ｇ
ＰＩＩｂ−ＩＩＩａへの結合は、血小板の凝集を導く。この相互作用の結果、遊
離リガンドではなく結合リガンドによって発現される、レセプター誘導の結合部
位、ＲＩＢＳ、エピトープの発現によって証明されるように、フィブリノーゲン
中におけるコンホメーション的変化が得られる。
２つのＲＩＢＳエピトープが、Ｕｇａｒｏｖａら（１９９３）によって局在化
された。１つの配列はγ１１２〜１１９に在り、ＭＡｂ ９Ｆ９によって認識さ
れる；２つ目はＡα９５〜９８のＲＧＤＦ配列であり、ｍＡｂ １５５Ｂ１６に
よって認識される。これらのエピトープはまた、フィブリノーゲンのプラスチッ
ク表面上への吸着およびプラスミンによる分子の消化によって露呈される。エピ
トープのタンパク質分解による曝露と同時に、Ａα−鎖のカルボキシル末端面の
切断が生じ、フラグメントＸ２を形成する。フィブリノーゲン中でのＡα ９５
〜９８でのＲＧＤＦ配列の非アクセス性は、この配列が分子のＧＰＩＩｂ−ＩＩ
Ｉａへの初期結合に参加しないことを示唆する。
フィブリノーゲンのそのレセプターへの結合は、Ａα−鎖のカルボキシル末端
面のコンホメーションを変更し、分子のＤドメインとＥドメインとの間のコイル
ドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）の結合セグメント内に在る配列を露呈し、
ＲＩＢＳエピトープを生成する。実際的には、ＲＩＢＳ配列は、凝固リガンド（
ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）を用いて標的化の際に使用するためのエピトープとし
て提案される。従って、ＭＡｂ ９Ｆ９およびＭＡｂ１５５Ｂ１６は、Ｚａｍａ
ｒｒｏｎら（１９９１）によって記載された抗体のように、都合良く使用し得る
。
（（ｂ）付加的細胞標的）
本発明は、疾患領域内に見られる細胞のタイプに対して標的化を行うことによ
って、コアギュラントを疾患関連血管系に向けるために使用し得るという、さら
なる長所を有する。
血小板は、傷ついた血管壁に付着し損傷部位に蓄積することによって、止血お
よび血栓形成に関与する。生理学的条件下での初期の出血停止は、血管の損傷部
位における血小板の堆積がその原因であるが、それは、病理学的条件下では、そ
の後の虚血性組織損傷および血栓による塞栓形成によって、血管閉塞を導き得る
。
血小板とその環境との相互作用、および血小板とそれ自身との相互作用は、細
胞表面で始められる複雑なプロセスを表す。従って、表面膜は、血管壁および血
漿成分を含む外部媒体と内部の血小板との間の反応性界面を提供する。
活性化された血小板上に発現される多量体の血小板タンパク質であるｐ−１１
５（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９１）は、本発明を使用して標的化され得る。血小
板は、複雑な生化学的および形態学的変化を経ることによって、多数の刺激剤に
応答する。これらの変化は、付着、凝集、および凝固を含む生理学的プロセスに
含まれる。血小板の活性化は、モノクローナル抗体によって認識され得る膜の変
更を生じる。モノクローナル抗体であるＪＳ−１（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９１
）は、凝固リガンドの一部分として使用されることが考えられる、このような抗
体のひとつである。
リガンドに誘導される結合部位（ＬＩＢＳ）は、リガンド結合がレセプターの
形状変化を引き起こした後、細胞表面レセプター上に発現される部位であり、そ
の後の生物学的事象を仲介する。これらは、ＲＩＢＳに対する対応物として見な
され、そして本発明で使用するための好ましい標的でもある。
１３個の抗−ＬＩＢＳ抗体がＦｒｅｌｉｎｇｅｒら（１９９０；１９９１）に
よって開発され、それらの内のいずれもが、本明細書中の記載に従って、疾患ま
たは腫瘍の部位へコアギュラントを送達するために使用し得る。マウスのモノク
ローナル抗血小板抗体であるＭＡ−ＴＳＰＩ−１（ヒトのトロンボスポンジンに
対する）ならびにＤｅｗｅｒｃｈｉｎら（１９９１）のＭＡ−ＰＭＩ−２、ＭＡ
−ＰＭＩ−１、およびＭＡ−ＬＩＢＳ−１（ヒトの血小板糖タンパク質ＩＩｂ／
ＩＩＩａ上のＬＩＢＳに対する）もまた、Ｈｅｙｎｅｎら（１９９４）のＲＵＵ
２．４１およびＬＩＢＳ−１；Ｔｏｍｉｙａｍａら（１９９２）のＯＰ−Ｇ２；
およびＡｂ−１５のように、使用され得る。
他の多くの標的（例えば、平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞、マクロファー
ジならびに浸潤性リンパ球および白血球上の抗原）も使用し得る。
（Ｂ．凝固剤）
本発明の二重特異性薬剤の第２のアーム（ａｒｍ）あるいは要素は、凝固を促
進し得る成分である。「凝固促進薬剤」は、凝固因子、凝固を間接的に刺激する
因子であり得、あるいは、凝固因子または凝固を間接的に刺激する因子を結合お
よび放出し得る第２結合領域の形態であり得る。
（１．凝固因子）
以下に示す薬剤によって例示されるように、様々な凝固因子が本発明に関連し
て用いられ得る。凝固因子が第１結合薬剤と共有結合する場合、機能性凝固部位
とは異なる部位が分子の連結に用いられる。凝固因子の、活性部位あるいは機能
性領域とは異なる適切な結合領域もまた、以下のセクションのそれぞれに記載さ
れる。
（（ａ）組織因子）
組織因子（ＴＦ）は、血液凝固を開始し得る１つの因子である。ＴＦは血液凝
固の外因性経路の活性化因子であり、生理学的に正常な状態においては、血液と
直接接触しない（Ｏｓｔｅｒｕｄら、１９８６；Ｎｅｍｅｒｓｏｎ、１９８８、
Ｂｒｏｚｅ、１９９２；Ｒｕｆ＆Ｅｄｉｎｇｔｏｎ、１９９４）。しかし、血管
の損傷時、あるいは特定のサイトカインまたはエンドトキシンにより活性化され
た場合、内皮（下）細胞（Ｗｅｉｓｓら、１９８９）または特定の血液細胞（Ｗ
ａｒｒら、１９９０）のいずれかによってＴＦは血液に曝される。次いで、ＴＦ
は、正常な状態においては低濃度で血液中を循環するＶＩＩａ因子（Ｗｉｌｄｇ
ｏｏｓｅら、１９９２）と複合体を形成し、そして、このＴＦ／ＶＩＩａ因子複
合体は、Ｘ因子のＸａ因子への活性化によって、凝固カスケードを開始する。カ
スケードによって、最終的に、フィブリンが形成される。
この連続する事象が起こるために、ＴＦ：ＶＩＩａ複合体は、リン脂質表面と
結合しなければならず、この表面にはＩＸまたはＸ因子を有する凝固開始複合体
が会合し得る（Ｒｕｆら、１９９１；Ｐａｂｏｒｓｋｙら、１９９１；Ｂａｃｈ
ら、１９８６）。この理由のために、遺伝子を短縮することによって貫膜および
細胞質領域を除去した短縮型ＴＦ（即ちｔＴＦ）は、天然ＴＦのＸ因子の１０万
分の１の活性化活性を有する可溶性タンパク質である（Ｒｕｆら、１９９１）。
（（ｂ）血餅形成因子（ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ））
トロンビン、第Ｖ／Ｖａ因子および誘導体、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子およ
び誘導体、第ＩＸ／ＩＸａ因子および誘導体、第Ｘ／Ｘａ因子および誘導体、第
ＸＩ／ＸＩａ因子および誘導体、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子および誘導体、第ＸＩ
ＩＩ／ＸＩＩＩａ因子および誘導体、第Ｘ因子活性化因子および第Ｖ因子活性化
因子もまた、本発明に使用され得る。
（（ｃ）ヘビ毒コアギュラント）
ラッセルクサリヘビ蛇毒が凝固タンパク質を含有することは、Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓおよびＥｓｎｏｕｆによって１９６２年に明らかにされた。Ｋｉｓｉｅｌ（１
９７９）は、第Ｖ因子を活性化するヘビ毒糖タンパク質を単離し、Ｄｉ Ｓｃｉ
ｐｉｏら（１９７７）は、その毒からのプロテアーゼがヒト第Ｘ因子を活性化す
ることを明らかにした。この第Ｘ因子活性化因子は、本発明において使用するこ
とが意図された成分である。
ラッセルクサリヘビ蛇毒中に存在する第Ｘ因子活性化因子に特異的なモノクロ
ーナル抗体（例えば、Ｐｕｋｒｉｔｔａｙａｋａｍｅｅら、１９８３、のＭＰ１
）もまた生成されており、人体内の特異的標的部位に薬剤を送達するために用い
られ得る。
（（ｄ）プロスタグランジンおよび合成酵素）
トロンボキサンＡ２は、内因性の過酸化物（ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）か
ら、血小板ミクロソーム内の酵素シクロオキシゲナーゼおよびトロンボキサンシ
ンテターゼの連続的作用によって形成される。トロンボキサンＡ２は、血小板に
よって容易に生成され、そして、強力な血管収縮因子であり、血小板の凝集を起
こし得る（Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８１）。
トロンボキサンＡ２およびその活性類似体の両方は、本発明において使用する
ことが意図されている。トロンボキサンＡ２生成のための合成プロトコルは、Ｂ
ｈａｇｗａｔら（１９８５）に記載されている。Ｏｈｕｃｈｉｄａら（１９８１
）によって記載されたトロンボキサンＡ２類似体（特に化合物２）は、本発明に
使用することが特に意図されている。
トロンボキサンシンターゼ、および血小板を活性化するプロスタグランジンを
合成する他の酵素もまた、本発明において「コアギュラント」として用いられ得
る。ＳｈｅｎおよびＴａｉ（１９８６ａ；ｂ）は、トロンボキサンシンターゼの
モノクローナル抗体および免疫アフィニティー精製を記載し；また、Ｗａｎｇら
（１９９１）は、ヒトトロンボキサンシンターゼのためのｃＤＮＡを報告してい
る。
（（ｅ）フィブリン溶解の阻害剤）
α２抗プラスミン、すなわちα２プラスミン阻害剤は、ヒトの血漿に天然に存
在するプロテナーゼ阻害剤であり、プラスミノーゲン活性化因子によって誘導さ
れるフィブリン塊（ｃｌｏｔｓ）の溶解を効果的に阻害する機能を果たす（Ｍｏ
ｒｏｉ＆Ａｏｋｉ、１９７６）。α２抗プラスミンは、特に強力な阻害剤であり
、本発明において使用することが意図されている。
α２抗プラスミンは精製され得るが、これは最初にＭｏｒｏｉ＆Ａｏｋｉ（１
９７６）に記載されている。他の精製スキームもまた用いられ得る。例えば、プ
ラスミノーゲンセファロース上でのアフィニティークロマトグラフィー、ＤＥＡ
Ｅセファデックス上でのイオン交換クロマトグラフィー、およびコンカナバリン
Ａセファロース上でのクロマトグラフィーを行う；あるいは、プラスミンＡ鎖（
ＬＢＳＩ）内の３つのＮ末端三重ループ構造を含有するエラスターゼ消化（ｅｌ
ａｓｔａｓｅ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ）プラスミノーゲン処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔ
ｉｏｎ）を有するセファロースカラム上でのアフィニティークロマトグラフィー
を行い、次いでゲル濾過を行う（それぞれ、Ｗｉｍａｎ＆Ｃｏｌｌｅｎ、１９７
７；Ｗｉｍａｎ、１９８０）、などである。
α２抗プラスミンのｃＤＮＡ配列（Ｔｏｎｅら、１９７７）が利用できるので
、α２抗プラスミン生成の好適な方法は、組換え発現による。
α２抗プラスミンに対するモノクローナル抗体もまた利用でき、本発明の二重
特異性結合リガンドの実施態様として使用され得る。例えば、Ｈａｔｔｅｙら（
１９８７）は、α２抗プラスミンに対する２つのＭＡｂ、ＭＰＷ２ＡＰおよびＭ
ＰＷ３ＡＰを記載した。これらのＭＡｂのそれぞれは、同等に良好に、天然のα
２抗プラスミンと反応することが報告されているので、それら両方が、外因性の
α２抗プラスミンを標的部位に送達するため、あるいは内因性のα２抗プラスミ
ンを蓄積してそれを標的領域内に濃縮するために使用され得る。Ｍｉｍｕｒｏお
よび共同研究者によって記載されたＪＴＰＩ−２などの他の抗体もまた使用され
得る。
（２．凝固因子を結合する薬剤）
本発明の他の群の二重特異性凝固リガンドは、標的化領域が凝固因子に直接連
結されるのではなく、凝固因子に結合する第２結合領域に連結される。
第２結合領域を用いて凝固因子を結合および送達する場合、その結合領域は、
凝固誘導能力を大きく損なわないような凝固因子上の部位を認識するように選択
される。このような結合に適した凝固因子の領域は、前のセクションに記載した
ように、標的化領域への共有結合に適した領域と、一般的に同じである。
しかし、このクラスの二重特異性リガンドは、腫瘍部位あるいは領域への送達
の後に、凝固因子を放出することが予想され得るため、第２結合薬剤あるいは抗
体への結合に適した凝固因子の領域には、より大きな柔軟性がある。また別の利
点は、二重特異性抗体が、ｔＴＦ注入の前に予め局在化され得ることであり、こ
れは、必要なｔＴＦの量、ひいては毒性を低減し得る。
この方法での使用に適切な第２結合領域は、一般的に、凝固因子に対する結合
特異性を有する抗体の抗原結合部位であり、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ
およびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体の機能性部分を含む。
組織因子、トロンビン、プレカリクレイン（ｐｒｅｋａｌｌｉｋｅｉｎ）、第
Ｖ／Ｖａ因子、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ
因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ
因子、ラッセルクサリヘビ蛇毒、トロンボキサンＡ２またはα２抗プラスミンに
対する抗体あるいはそのフラグメントを含有する二重特異性結合リガンドは、本
発明のこの局面の実施態様の例示である。
（Ｃ．連結手段）
第１標的化領域および第２凝固領域は、作動可能に連結され、これにより、各
領域が、重大な障害を伴わずに、意図された機能を果たすことが可能になる。こ
のように、標的化領域は、腫瘍環境標的の範囲から選択されるように、意図され
た標的に結合することが可能であり、また、凝固領域は、直接的または間接的に
、例えば結合した因子の放出によって、血液凝固あるいは血餅形成を促進するこ
とが可能である。
標的化領域結合機能を評価するために必要とされることは、二重特異性リガン
ドが依然として、複合体を形成していない第１結合領域と実質的に同じ方法で、
標的化された成分に結合することを確かめるために、結合アッセイを行うことで
ある。適切な結合アッセイは、通常用いられるタイプのアッセイであり、第１標
的化領域が抗体である免疫学的な結合アッセイ、および／または他の生化学的な
結合アッセイであり、例えば、１２５ヨウ素標識されたタンパク質または他の放
射標識された成分を用いてリガンド−レセプター結合を評価し、スキャッチャー
ドプロットを生成するようなアッセイである。
このようなアッセイにおける標的抗原あるいは標的成分は、天然または組み換
え体供給源から精製されるタンパク質、膜濃縮調製物、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）
細胞および組織切片を含む数多くの形態で提供され得る。一般に、タンパク質組
成物が使用される場合、それらは、マイクロタイタープレート、膜、などの固体
の支持体に、あるいは、カラムマトリクスにさえ固定される。また、生理学的標
的を反映する標的組成物を使用するのが一般的に好ましく、標的が通常、細胞関
連であるので、組織および細胞自体を含む無傷の細胞を含む組成物の使用もまた
好ましい。
二重特異性複合体の機能性結合の確認に用いられる種々の免疫学的アッセイは
、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、固定細胞を用いたＥＬＩＳ
Ａ、免疫組織化学、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を含む。こ
のようなアッセイの全ての実施は、一般に、当業者には公知であり、本明細書で
さらに開示される。
上記または他の結合アッセイのいずれにおいても、二重特異性化合物の標的化
領域結合機能の評価は容易なことであり、二重特異性リガンドと、複合化してい
ない第１結合領域とは、通常、比較を容易にするために、同じ条件下で平行して
アッセイに供される。効果的な二重特異性リガンドは、大きな障害を伴わずに、
つまり、複合化していない第１結合領域と実質的に同じ様に、標的に結合する。
複合化していない結合領域アッセイの結果を１００％の基準値とすると、本明細
書の用語、二重特異性リガンドの「実質的な結合」とは、二重特異性リガンドが
少なくとも約５０％の結合、より好ましくは、約５０％から約８０％の間の結合
、さらに、最も好ましくは、約８０％から約１００％の間の結合を示すことを意
味する。
二重特異性リガンドが、コアギュラントに結合する第２結合領域を含む場合、
例えば、二重特異性抗体である場合、さらに有用なアッセイは、二重特異性リガ
ンドの両方のアームの結合機能が同時に評価できるタイプのものである。これは
、例えば、二重特異性リガンドまたは抗体との架橋を介する、放射標識されたコ
アギュラントの標的細胞への結合を評価することによって達成される。このよう
なアッセイは、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０二重特異性抗体を用いた、ｔＴＦの標的
細胞への結合によって例示され、実施例ＩＩに記載されている。
二重特異性リガンドの凝固剤機能を決定することもまた、容易なことである。
ここで必要とされることは、二重特異性リガンドを用いた凝固アッセイを行い、
それが、複合化していない凝固剤と実質的に同じ方法で、凝固を促進する機能を
果たすことを確かめることである。このことは、それら自体が共に凝固因子であ
る「凝固剤」、および凝固因子に結合する第２結合領域であるものについて当て
はまる。当然、後者の場合、第２結合領域への結合を可能にするために、二重特
異性リガンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいて凝
固因子と予め複合化される。
１つの適切な凝固アッセイは、必要に応じて予めコアギュラントと複合化され
る二重特異性リガンドが、血漿サンプルと混合される。このアッセイにおいては
、フィブリンストランドの出現が凝固を示す。したがって、効果的な二重特異性
リガンドは、フィブリンストランドが出現するまでの時間を短縮し、特に、コン
トロールのレベルと比較して経過時間を有意に短縮することが期待される。
上記アッセイの改変例は、まず、適切な標的細胞を有効な条件下および十分な
時間、二重特異性リガンドにさらして結合させること、非特異的に結合した成分
を除去するために細胞を洗浄すること、次いで、洗浄された細胞を血漿内で再懸
濁することを包含する。このアッセイでは、二重特異性リガンドで効果的にコー
ティングされた細胞のみが、フィブリンストランドが出現するまでの時間を短縮
すると期待される。このタイプのアッセイは、それ自体が二重特異性構築物の機
能の両方、即ち、細胞の初期標的化、およびその後の局在化された凝固を評価す
るアッセイである点で好ましい。
二重特異性化合物の凝固機能を、複合化していない凝固剤のそれと比較するた
めには、再び、平行したアッセイが行われる。効果的な二重特異性リガンドは、
大きな障害を伴わずに、凝固を促進する機能を果たす、つまり、複合化していな
い凝固剤と実質的に同じ様に機能する。複合化していないコアギュラントアッセ
イの結果を１００％の基準値とすると、本明細書の用語「実質的な機能」とは、
二重特異性リガンドが少なくとも約５０％の凝固、より好ましくは、約５０％か
ら約８０％の間の凝固、さらに、最も好ましくは、約８０％から約１００％の間
の凝固を示すことを意味する。
二重特異性リガンドの２つの機能性領域は合成化学技術あるいは組み換えＤＮ
Ａ技術を用いて連結され得る。これらの技術のそれぞれは、通常採用され、当業
者には周知であり、実施例Ｉにおいて、また、以下の詳細な説明によってさらに
例示される。
（１．生化学的架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ））
一般に、抗体または他の標的化成分の凝固剤への結合には、イムノトキシンの
調製のために開発されたものと同じ技術が適用される。しかし、生理学的に用い
られるようになる特定の量の複合化していない凝固剤が、特に厳密なものを意図
しないゆえに、本技術に相当な利点があることは明らかである。このように、い
かなる架橋剤の安定性要件も、イムノトキシンなどの他の構築物に採用されるリ
ンカー程厳密ではない。したがって、イムノトキシンにおける使用に適したあら
ゆる架橋剤もまた本発明において使用できることが、一般的なガイドラインとし
て考慮され得、そして、さらなるリンカーもまた考慮され得る。
トキシンに加えて、他の様々な化学療法および薬理学的な薬剤が抗体に連結さ
れ、薬理学的に機能することが明らかになっている接合体が形成されている（例
えば、Ｖａｉｃｋｕｓら、１９９１、参照）。調査された抗腫瘍性薬剤の例は、
ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキセート、およびビンブラスチンそ
の他を含む（Ｄｉｌｌｍａｎら、１９８８；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、１９８８）。
また、ネオカルチノスタチン（Ｋｉｍｕｒａら、１９８３）、マクロマイシン（
ｍａｃｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｍａｎａｂｅら、１９８４）、トレニモン（ｔｒｅｎ
ｉｍｏｎ）（Ｇｈｏｓｅ、１９８２）およびαアマニチン（α−ａｍａｎｉｔｉ
ｎ）（Ｄａｖｉｓ ＆ Ｐｒｅｓｔｏｎ、１９８１）などの他の薬剤の結合が記
載されている。上記科学論文のそれぞれに記載される連結技術もまた、本発明に
関連して使用することが意図されている。
架橋試薬を用いて２つの異なる分子の官能基、例えば結合および凝固剤を互い
に結びつける分子架橋が形成される。２つの異なるタンパク質を段階的に連結す
るために、望ましくないホモポリマーの形成を排除するヘテロ２機能性架橋剤が
用いられ得る（表ＶＩ）。

Figure 2009298805
Figure 2009298805
例示的なヘテロ二官能性架橋剤は２つの反応基を含む：一方は一級アミン基（
例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、他方はチオール基（例えば
、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。架橋剤は、
一級アミン反応基を介して、一方のタンパク質（例えば、選択された抗体または
フラグメント）のリジン残基（単数または複数）と反応し得、そして既に第１の
タンパク質に結合した架橋剤は、チオール反応基を介して、他方のタンパク質（
例えば、コアギュラント）のシステイン残基（遊離メルカプト基）と反応する。
従って、好適なコアギュラントまたは凝固結合領域は、一般には、架橋のため
に利用可能な官能基を有するか、または有するように誘導体化されることが理解
され得る。この要件により、広範囲な基をこの様式で用い得ることが制限される
とは考えられない。例えば、一級または二級アミン基、ヒドラジド基またはヒド
ラジン基、カルボキシルアルコール基、リン酸基、もしくはアルキル化基が、結
合または架橋のために用いられ得る。連結技術の概略については、Ｇｈｏｓｅ＆
Ｂｌａｉｒ（１９８７）を参照のこと。
架橋剤の２つの反応基の間のスペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）は様
々な長さおよび化学組成を有し得る。スペーサーアームが長いほど、接合成分の
柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）が良好になり、一方、ブリッジのいくつかの
特定の成分（例えば、ベンゼン基）により、反応基に安定性の増加がもたらされ
るか、または様々な局面の作用に対する化学結合の耐性（例えば、還元剤に対す
るジスルフィド結合の耐性）の増加がもたらされ得る。Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ
−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａのようなペプチドスペーサーの使用もまた意図される
。
血液中で適切な安定性を有する架橋剤を用いるのが好ましい。標的化剤および
凝固剤を接合するためにうまく用いられ得る数多くのタイプのジスルフィド結合
含有結合剤が知られている。立体的に障害をもつジスルフィド結合を含む結合剤
は、インビボにおいてより高い安定性を示し、これにより作用部位での結合前に
コアギュラントが放出されるのを防止し得ることが分かる。従って、このような
結合剤は、結合剤１つの好適なグループである。
イムノトキシンで使用するのに最も好適な架橋剤の１つはＳＭＰＴである。Ｓ
ＭＰＴは、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体障害をもつ」ジス
ルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は
、組織および血液中に存在し得るグルタチオンのようなチオレートアニオンによ
る攻撃から結合を保護する機能を有し、これにより、結合した薬剤が腫瘍部位に
送達される前に接合体が分離するのを防ぐのを補助すると考えられる。ＳＭＰＴ
薬剤もまた、本発明の二重特異性凝固リガンドと共に用いられ得ることが意図さ
れる。
多くの既知の他の架橋剤と同様に、ＳＭＰＴ架橋剤は、システインのＳＨまた
は一級アミンのような官能基（例えば、リジンのεアミノ基）を架橋する能力を
有する。別の可能なタイプの架橋剤としては、スルホスクシンイミジル−２−（
ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネートのような
切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジド
が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は一級アミノ基と反応し、
フェニルアジドは（光分解の際に）非選択的に任意のアミノ酸残基と反応する。
立体障害をもつ架橋剤に加えて、立体障害をもたない結合剤もまた本発明にお
いて使用され得る。保護されたジスルフィドを含有または生成するとは考えられ
ない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、および２−イミノチオラ
ン（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ＆Ｔｈｏｒｐｅ，１９８７）がある。このような架
橋剤の使用は当該分野では充分理解されている。
ひとたび接合体化されると、二重特異性薬剤は通常は精製され、未接合体化標
的化剤またはコアギュラントおよび他の混入物質から接合体が分離される。未接
合標的化剤を取り除いて、接合体化種と未接合体化種との間で抗原をめぐる競合
が起こる可能性を防ぐことが重要である。充分な純度を有する接合体を提供して
これらを臨床的に有用にする際に、多くの精製技術が利用可能である。ゲル濾過
、ゲル透析または高速液体クロマトグラフィーのような、サイズ分離に基づく精
製方法が一般に最も有用である。Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分離のような他
のクロマトグラフィー技術もまた用いられ得る。
（２．組換え融合タンパク質）
本発明の二重特異性標的コアギュラントはまた、分子生物学技術によって調製
される融合タンパク質であり得る。このような目的を達成するために組換えＤＮ
Ａ技術を用いることは、現在では当業者にとって通常の作業である。このような
方法としては、例えば、インビトロにおける組換えＤＮＡ法、合成技術、および
インビボにおける組換え／遺伝子組換えがある。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡ合
成は、自動合成機を用いて行い得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；
およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９に記載されている技術を参照）。
一般に、融合タンパク質を調製するためには、結合リガンドまたは他の標的化
領域をコードする遺伝子またはｃＤＮＡのようなＤＮＡコード領域を、凝固因子
または凝固結合領域をコードするＤＮＡコード領域（すなわち、遺伝子またはｃ
ＤＮＡ）に結合させる。これは、代表的には、凝固因子をコードする第２ＤＮＡ
セグメントに作動可能に連結した第１結合領域をコードする第１ＤＮＡセグメン
トを、同じリーディングフレーム内に含む発現ベクターを調製する工程を包含す
る。配列は、核酸全体を翻訳すると本発明の所望の二重特異性化合物が得られる
ような方法で結合する。発現ベクターは、挿入されたＤＮＡ領域より上流側に、
ＤＮＡの転写を促進し、これによりコードされる組換えタンパク質の発現を促進
するように作用する１つまたはそれ以上のプロモーターを含む。これが「組換え
発現」の意味である。
特定の結合領域またはコアギュラントが好適であるが、コードＤＮＡが直ちに
利用できない場合は、これは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ分子をＤＮ
Ａライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー）から得る「分子
クローニング」の技術を用いて得られ得る。このような手順では、適切なＤＮＡ
ライブラリーが、例えば、タンパク質に対する抗体を用いる発現スクリーニング
プロトコル、または活性アッセイを用いてスクリーニングされる。もしくは、ス
クリーニングは、タンパク質のアミノ酸配列部分を考慮して、または関連タンパ
ク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列から設計されたオリゴヌクレオチドプロー
ブのハイブリダイゼーションに基づいてもよい。このようなスクリーニングプロ
トコルの操作は当業者には周知であり、科学文献、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
（１９８９）に詳細に記載されている。
組換えＤＮＡ技術により産生されるときは、本発明の標的化剤／凝固剤化合物
は「融合タンパク質」と呼ばれる。このような融合タンパク質は、少なくとも、
本発明で定義される標的化剤および凝固剤を含み、そしてこれらの薬剤は作動可
能に結合されることが理解される。融合タンパク質はまた、得られる融合タンパ
ク質の標的化または凝固活性にある程度の影響を与えない限り、標的化剤および
凝固剤化合物を作動可能に連結するペプチドスペーサーのようなさらなるペプチ
ド配列を含み得る。
組換え二重特異性タンパク質リガンドは、いわゆる天然に産生されたタンパク
質を化学的に架橋することによって生成される二重特異性構築物とは異なり得る
。特に、例えば、グリコシル化およびリン酸化のような翻訳後の修飾の程度は、
同じ２つのタンパク質の組換え融合体と化学的融合体との間で異なり得る。これ
は重大な問題であるとはみなされないが、当業者であれば、臨床設定で使用する
前に、組換え融合タンパク質が、意図したように、そして他のデータから想定さ
れるように機能するかどうかを確認し得る。
組換え発現の１つの利点は、結合領域を、例えばその長さおよび／またはアミ
ノ酸組成が容易に変動し得るように容易に操作し得ることである。所望であれば
、本発明の２つの薬剤を作動可能に連結するために、切断不能なペプチドスペー
サーが提供され得る。同様に、固有の切断部位を有するペプチドを２つの化合物
の間に挿入し得る。
特定の場合、所望であれば、ジスルフィド結合ループ構造に折り畳み得る、標
的化剤および凝固剤を作動可能に連結するペプチドスペーサーを提供することが
可能である。ループ内のタンパク質分解性切断により、標的化剤と凝固剤とが単
一のジスルフィド結合のみによって連結されているヘテロ二量体ポリペプチドが
生成される（例えば、Ｌｏｒｄら、１９９２参照）。
様々な宿主発現系でタンパク質の発現を実現するために、適切な核酸および転
写／翻訳制御配列を含む発現ベクターを構築するための多くの標準的な技術が利
用可能である。発現に利用し得る細胞型としては、標的化剤／凝固剤コード化配
列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコス
ミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌、Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）；標的化剤／凝固剤コード配列を含む組換え酵母発現ベクターに
より形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ
）；標的化剤／凝固剤コード配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、
バキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウィルス発現ベクター（例
えば、カリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶ；タバコモザイクウィルスＴＭＶ
）を感染させた、または標的化剤／凝固剤コード配列を含む組換えプラスミド発
現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；およ
び哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモー
ター）、または哺乳類ウィルス由来のプロモーター（例えば、アデノウィルス後
期プロモーター；ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現
構築物を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ
３）のような微生物があるが、これらに限定されない。
細菌系では、発現される標的化剤／凝固剤構築物について意図される用途に応
じて、多くの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、多量の二重特異性薬
剤を産生する場合は、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を
指向するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、標的化剤／凝固剤
コード配列が、ｌａｃ ｚコード領域を有するベクターのフレーム内に個別に連
結され得、これによりｌａｃ Ｚ産物部分をさらに含む融合タンパク質が提供さ
れる、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３）；ｐＩＮ
ベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅら、１９８９）など
があるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターは、標的化剤／凝固剤の組
み合わせのような外来ポリペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（
ＧＳＴ）をさらに含む融合タンパク質として発現するためにも用いられ得る。一
般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビ
ーズへの吸着およびこの後の遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解
した細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターはトロンビンまたは第Ｘａ
因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、これにより融合タンパク質全
体の中の結合剤／凝固タンパク質がＧＳＴ部分から放出され得る。
１つの有用な昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多
角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして
用いられる。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細
胞内で増殖する。標的化剤／凝固剤コード配列は、ウィルスの非必須領域（例え
ば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば
、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。二重特異性リガンドコ
ード配列を首尾良く挿入することによって、ポリヘドリン遺伝子が不活性となり
、非閉塞（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウィルス（例えば、ポリヘドリン
遺伝子によってコードされるタンパク質コートを欠いたウィルス）が産生される
。このような組換えウィルスは、次に、挿入した遺伝子を発現させるＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させるために用いられる（例えば
、Ｓｍｉｔｈら、１９８３；＊Ｓｍｉｔｈの米国特許第４，２１５，０５１号参
照）。
哺乳類宿主細胞では、多数のウィルスベースの発現系が利用され得る。アデノ
ウィルスを発現ベクターとして用いる場合は、標的化剤／凝固剤コード配列を、
アデノウィルス転写／翻訳制御接合体（例えば、後期プロモーターおよび三部分
（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）に連結し得る。このキメラ遺伝子は、
次に、インビトロにおけるまたはインビボにおける組換えによってアデノウィル
スゲノムに挿入され得る。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１また
はＥ３）への挿入により、生存能力があり、感染宿主内に二重特異性タンパク質
を発現し得る組換えウィルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎら、１９８４参照
）。
挿入された標的化剤／凝固剤コード配列を効率的に翻訳するためには、特異的
な開始シグナルもまた必要であり得る。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コド
ンおよび隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナ
ルをさらに備える必要があり得る。当業者であれば容易にこれを決定し、必要な
シグナルを備え得る。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所
望のコード配列のリーディングフレームと同調（すなわちインフレーム）してい
なければならないことは周知である。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開
始コドンは、天然および合成を問わず多様な起源から得られ得る。適切な転写エ
ンハンサー要素、転写ターミネーターなどを加えることによって、発現効率が増
強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７参照）。
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特異
的な様式で修飾およびプロセスする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物
のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切
断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。宿主細胞はそれぞれ、タン
パク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有
する。発現された外来タンパク質の適切な修飾およびプロセッシングを確実にす
るために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のために、遺伝
子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適切な処理のための細胞機
構を有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。このような哺乳類宿主細胞として
は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３
、ＷＩ３８などがあるが、これらに限定されない。
組換えタンパク質を長期にわたり高収量で産生するためには、安定した発現が
好ましい。例えば、標的化剤／凝固リガンドをコードする構築物を安定して発現
する細胞株が設計され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよ
りむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハン
サー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御され
る標的化剤／凝固剤ＤＮＡおよび選択マーカーにより形質転換され得る。外来Ｄ
ＮＡの導入後、設計された細胞を富養培地で１〜２日増殖させ、次に選択培地に
置き換える。組換えプラスミド中の選択マーカーによりこの選択に対する耐性が
付与され、細胞がそれぞれの染色体にプラスミドを安定して組み込み、増殖して
フォーカスを形成し、これが次にクローン化され、拡大されて細胞株となり得る
。
ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７）、ヒポ
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ
ら、１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌ
ｏｗｙら、１９８０）を含むがこれらに限定されない多くの選択系が用いられ得
、これらはそれぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞で用いられ
得る。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ
ら、１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１）；ミコフェノール酸に対する耐性を
付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１
８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９
８１）；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅ
ｒｒｅら、１９８４）の選択の基礎として、代謝拮抗物質耐性が用いられ得る。
（Ｄ．抗体）
抗体が二重特異性リガンドの一方または両方の一部として用いられる場合、抗
体の選択は、一般に腫瘍のタイプおよび選択される凝固リガンドに依存する。し
かし、ある有利点は、特定のタイプの抗体の適用により達成され得る。例えば、
ＩｇＧベースの抗体は、そのＦａｂ’対応物よりも良好な結合能力および遅い血
中クリアランスを示すことが予測され得るが、Ｆａｂ’フラグメントベースの組
成物は、一般に、良好な組織浸透能力を示す。
（１．モノクローナル抗体）
抗体を調製し特徴付けする手段は当業者に周知である（例えば、＊Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成する方法は、一般に、ポリクローナル抗
体を調製するための方針と同じ方針に沿って始める。簡単にいえば、ポリクロー
ナル抗体は、動物を、用いられている抗原組成物およびプロトコル（例えば、正
常細胞集団に寛容になり、次いで腫瘍細胞集団で免疫すること）に依存して、免
疫寛容前または免疫寛容前でないいずれかに、本発明に従って免疫原性組成物で
免疫し、そして免疫された動物から抗血清を回収することにより、調製される。
広範な動物種が抗血清の生成に用いられ得る。代表的には、抗−抗血清の生成に
用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、または
ヤギである。ウサギの血液量が比較的大量であるため、ウサギはポリクローナル
抗体の生成のための好適な選択である。
当該分野で周知のように、所定の組成物はその免疫原性が変化し得る。従って
、宿主の免疫系をブーストすることがしばしば必要であり、これはペプチドまた
はポリペプチド免疫原をキャリアに結合することにより達成され得る。代表的か
つ好適なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、ま
たはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして用い
られ得る。ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合する手段は当該分野におい
て周知であり、そしてグルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル（ｍａｌ
ｅｉｍｉｄｏｂｅｎｃｏｙｌ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カル
ボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｙｄｅ）、およびビス−ジアゾ化ベンジジン（
ｂｉｓ−ｄｉａｚｏｔｉｚｅｄ）を含む。
当該分野においてまた周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジ
ュバントのような公知の免疫応答の非特異的刺激剤の使用により増強され得る。
代表的かつ好適なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異
的刺激剤）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュ
バントが挙げられる。
ポリクローナル抗体の産生に用いられる免疫原組成物の量は、免疫原の性質な
らびに免疫に用いられる動物によって変化する。種々の経路が免疫原の投与に用
いられ得る（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）。ポリクローナル抗
体の産生は、免疫後の種々の時点で免疫された動物の血液をサンプリングするこ
とによりモニターされ得る。第二に、追加接種もまた与えられ得る。追加免疫お
よび力価検定のプロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返され得る。所望
の力価レベルが得られると、免疫された動物を出血させ得、そして血清を単離し
て保存し、および／または動物をＭＡｂを生成するために用い得る。
ＭＡｂは、＊米国特許第４，１９６，２６５号（本明細書中に参考として援用
される）に例示されるように、周知の技法の使用により容易に調製され得る。代
表的には、この技法は、選択された免疫原組成物（例えば、精製または部分精製
腫瘍細胞あるいは血管内皮細胞タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または完
全な細胞組成物）で適切な動物を免疫することを包含する。免疫する組成物は、
抗体産生細胞を刺激するために効果的な様式で投与される。マウスおよびラット
のような齧歯類は好適な動物であるが、ウサギ、ヒツジ蹄叉細胞の使用もまた可
能である。ラットの使用はある有利点を提供し得る（＊Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６
、６０−６１頁）が、マウスが好適であり、ＢＡＬＢ／ｃマウスが最も好適であ
り、これは最も日常的に用いられ、そして一般に、より高い割合の安定な融合を
生じる。
免疫後、抗体産生能力のある体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）が、ＭＡｂ生
成プロトコルにおける使用について選択される。これらの細胞は、生検された脾
臓、扁桃腺、またはリンパ節から、あるいは末梢血サンプルから得られ得る。脾
臓細胞および末梢血細胞が好適であり、前者は、***形質芽球期における抗体産
生細胞の豊富な供給源であるためであり、そして後者は末梢血が容易に入手し可
能であるからである。時折、パネルの動物が免疫され、そして最高の抗体力価を
有する動物の脾臓が取り出され、そして脾臓リンパ球が脾臓をシリンジでホモジ
ナイズすることにより得られている。代表的には、免疫されたマウス由来の脾臓
は、約５×１０７〜２×１０８のリンパ球を含む。
免疫された動物由来の抗体産生Ｂリンパ球は、次いで、不死化ミエローマ細胞
の細胞、一般に免疫された動物と同種の細胞、と融合される。好適には、ハイブ
リドーマ産生融合手順に使用するために適したミエローマ細胞株は非抗体産生で
あり、高い融合効率、および次いで、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの
増殖を支持するある選択培地中での増殖を不可能にする酵素欠損を有する。
多くのミエローマ細胞の任意の１つが、当業者に知られているように用いられ
得る（＊Ｇｏｄｉｎｇ，６５−６６頁、１９８６；＊Ｃａｍｐｂｅｌｌ、７５−
８３頁、１９８４）。例えば、免疫された動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６
３−／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１
０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ
１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌを使用し得；ラットについては、
Ｒ２１０．ＲＣＹ．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２
１０、または上記に挙げたマウス細胞株の１つを使用し得；そして、Ｕ−２６６
、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−
６はヒト細胞融合と関連して全て有用である。
１つの好ましいマウスミエローマ細胞はＡ６３−Ａ６８、６５３ミエローマ細
胞株であり、これはＡＴＣＣから容易に入手可能である。用いられ得る別のマウ
スミエローマ細胞株は、８−アザグアニン耐性マウスミエローマＳＰ２／０非産
生細胞株である。
抗体産生脾臓細胞またはリンパ節細胞とミエローマ細胞とのハイブリッドを生
成する方法は、通常、体細胞をミエローマ細胞と４：１の割合で混合する工程を
包含するが、この割合は、細胞膜の融合を促進する１つの薬剤または複数の薬剤
（化学物質または電気的物質）の存在下、それぞれ約２０：１〜約１：１まで変
化し得る。Ｓｅｎｄａｉウイルスを用いる融合方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）に記載されており、そして３７％（ｖ／ｖ
）ＰＥＧのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法がＧｅｆｔｅ
ｒら（１９７７）により記載されている。電気的に誘導される融合方法の使用も
また適切である（＊Ｇｏｄｉｎｇ，７１−７４頁、１９８６）。
融合手順は、通常、低い頻度、約１×１０−６〜１×１０−８で生存可能なハ
イブリッドを産生する。しかし、これは、選択培地中で培養することにより、生
存可能な融合されたハイブリッドが親の非融合細胞（特に正常には無限に***し
続ける非融合ミエローマ細胞）から分化されるような問題を提起しない。この選
択培地は、一般に、組織培養培地でヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤
を含む培地である。代表的かつ好適な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセー
ト、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリ
ンおよびピリミジンの両方の新規合成をブロックするが、アザセリンはプリン合
成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキセートが用いられる場
合、培地にヌクレオチド供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンが補充され
る（ＨＡＴ培地）。アザセリンが用いられる場合、培地にヒポキサンチンが補充
される。
好適な選択培地はＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路の操作可能な細
胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存し得る。ミエローマ細胞はサルベージ経路の重要
な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ
））が欠損しており、そしてそれらは生存し得ない。Ｂ細胞はこの経路を操作し
得るが、培養物中での生存期間が限定されており、一般に、約２週間以内に死滅
する。従って、選択培地中で生存し得る細胞のみがミエローマおよびＢ細胞から
形成されるハイブリッドである。
この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの群を提供す
る。代表的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートで単一の
クローンの希釈により細胞を培養すること、次いで所望の反応性について（約２
〜３週後）個々のクローン上清を試験することにより行われる。このアッセイは
、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞障害性アッセイ、プ
ラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどのように、感度が高く、簡単、か
つ迅速であるべきである。
次いで、選択されたハイブリドーマは連続希釈され、そして個々の抗体産生細
胞株中にクローニングされ、次いで、このクローンは、ＭＡｂを提供するために
無限に増殖され得る。この細胞株は、ＭＡｂ産生のために２つの基本的な方法で
利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、最初の融合用の体細胞およびミエ
ローマ細胞を提供するために用いられたタイプの組織適合性動物に（しばしば腹
腔に）注入され得る。注入された動物は、融合された細胞ハイブリッドにより産
生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。次いで、この動
物の体液（例えば、血清または腹水）は、高濃度でＭＡｂを提供するために採取
され得る。個々の細胞株はまたインビトロで培養され得、ここではＭＡｂが高濃
度で容易に得られ得る培養培地中に自然に分泌される。いずれかの手段により産
生されるＭＡｂは、所望であれば、濾過、遠心分離、および種々のクロマトグラ
フ法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）を用いてさ
らに精製され得る。
発明者らはまた、モノクローナル抗体を生成するために分子クローニングアプ
ローチを使用することを意図する。このために、組み合わせ免疫グロブリンファ
ージミドライブラリーは、免疫された動物の脾臓から単離されるＲＮＡから調製
され、そして適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞および
コントロール細胞（例えば、正常細胞対腫瘍細胞）を用いてパンニングすること
により選択される。このアプローチが従来のハイブリドーマ技術よりも有利な点
は、１ラウンドで約１０４倍多くの抗体が産生およびスクリーニングされ得るこ
と、および、ＨおよびＬ鎖の組み合わせにより新しい特異性が生じることであり
、このことは適切な抗体を見出す機会をさらに増加させる。
本発明でＭＡｂを用いる場合、これは、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムス
ター、ニワトリ、またはさらにウサギ起源であり得る。本発明は、ヒト抗体、ヒ
ト定常および／または可変領域ドメインを有するマウス、ラット、または他の種
由来の「ヒト化」またはキメラ抗体、および他の組換え抗体ならびにこれらのフ
ラグメントの使用を意図する。もちろん、調製の容易さおよび試薬の迅速な入手
可能性のため、代表的にはマウスモノクローナル抗体が好ましい。
（２．機能的抗体結合領域）
標的化剤抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ
’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ）の起源または由来は、二重特異性リガンドの調製
に実際に用いられる抗体またはフラグメントが所望の結合特性を示す限りは、本
発明の実施に特に重要であるとは考えられない。
Ｆｃ部分が除去されている抗体調製物を使用する必要があり得る。免疫グロブ
リン分子のフラグメント化は、制御されたタンパク質分解により達成され得るが
、その条件は、種および免疫グロブリンクラスまたはサブクラスによりかなり変
化する。２価Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、通常、１価ＦａｂまたはＦａｂ’
フラグメントよりも好適である。
（Ｆａｂ）
Ｆａｂフラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる
全免疫グロブリンのタンパク質分解より得られ得る。パパインは、まず、システ
イン、２−メルカプトエタノール、またはジチオトレイトールを用いて活性部位
におけるスルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を還元することにより活性
化されなければならない。ストック酵素中の重金属は、最大酵素活性を確実にす
るためにＥＤＴＡ（２ｍＭ）を用いるキレート形成により除去すべきである。酵
素および基質は、正常には１：１００の重量比で一緒に混合される。インキュベ
ーション後、反応は、ヨードアセトアミドを用いるチオール基の不可逆的アルキ
ル化によってまたは単に透析によって停止され得る。消化の完全性はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによりモニターされるべきであり、そして種々の画分は、プロテインＡ−
セファロースまたはイオン交換クロマトグラフィーにより分離されるべきである
。
（Ｆ（ａｂ’）２）
ウサギおよびヒト起源のＩｇＧからのＦ（ａｂ’）２フラグメントを調製する
ための通常の手順は、酵素ペプシン（プロトコル７．３．２）によるタンパク質
分解により制限される。条件（酢酸緩衝液中１００×抗体過剰ｗ／ｗ、ｐＨ ４
．５、３７℃）は、抗体が重鎖間ジスルフィド結合のＣ末端側で切断されること
を示唆する。マウスＩｇＧの消化速度はサブクラスによって変化し得、そしてい
くつかの未消化または完全に分解されたＩｇＧを含まない高収率の活性Ｆ（ａｂ
’）２フラグメントを得ることは困難であり得る。特に、ＩｇＧ２ｂは完全な分
解を非常に受けやすい。他のサブクラスは、最適な結果を生じるために異なるイ
ンキュベーション条件を必要とする。
ペプシンによるラットＩｇＧの消化は、０．１Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ ４．５
中での透析、および次いで１％ｗ／ｗペプシンとの４時間のインキュベーション
を包含する条件を必要とし；ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの消化は、最初に０．１
Ｍ ギ酸緩衝液、ｐＨ ２．８に対して４℃で１６時間透析し、次いで酢酸緩衝
液に対して透析する場合は改良される。ＩｇＧ２ｂでは、０．１Ｍ リン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ ７．８中、３７℃にて４時間、スタフィロコッカスのＶ８
プロテアーゼ（３％ｗ／ｗ）とインキュベーションすることによってさらに一貫
した結果が得られる。
（３．二重特異性抗体）
一般に、二重特異性抗体の調製もまた、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）により
例示されるように、当業者に周知である。二重特異性抗体は、例えば、ガン患者
を処置するために（Ｂａｕｅｒら、１９９１）臨床的に用いられている。二重特
異性抗体の調製の１つの方法は、一方は標的された腫瘍細胞抗原および他方は凝
固剤（または活性化抗原のような他の所望の標的）に特異性を有する抗体の別個
の調製を包含する。
二重特異性抗体はまた、免疫療法剤としての使用のために特に開発されている
。抗原誘発とともに初期に述べられているように、これらの抗体のいくつかがリ
ンパ球と腫瘍抗原とを架橋するために開発された（Ｎｅｌｓｏｎ，１９９１；Ｓ
ｅｇａｌら、１９９２）。例としては、Ｔ細胞と、例えば、ＣＤ３において腫瘍
抗原とを結合し、ならびに標的細胞に極めて接近してＴＣＲ／ＣＤ３複合体を物
理的に架橋することによりリンパ球活性化を引き起こすキメラ分子を包含する（
Ｓｔａｅｒｚら、１９８５；Ｐｅｒｅｚら、１９８５；１９８６ａ；１９８６ｂ
；Ｔｉｎｇら、１９８８）。
実際に、ガン腫、リンパ腫、白血病、およびメラノーマの腫瘍細胞は、Ｔ細胞
による二重特異性抗体媒介死滅を受けやすいことが報告されている（Ｎｅｌｓｏ
ｎ、１９９１；Ｓｅｇａｌら、１９９２；ｄｅＬｅｉｊら、１９９１）。これら
のタイプの二重特異性抗体はまた、悪性の腫瘍標的に対していくつかの第Ｉ相臨
床試験で用いられている。それらは本発明によれば新規な組成物ではないが、二
重特異性架橋抗体を本明細書に記載される二重特異性凝固リガンドとともに組み
合わせて使用することもまた意図される。二重特異性架橋抗体は、参考文献（例
えば、ｄｅＬｅｉｊら（１９９１）；Ｃｌａｒｋら（１９９１）；Ｒｉｖｏｌｔ
ｉｎｉら（１９９２）；Ｂｏｌｈｕｉｓら（１９９２）；およびＮｉｔｔａら（
１９９０））に記載されるように投与され得る。
二重特異性抗体の調製について当該分野では多くの方法が公知であるが、Ｇｌ
ｅｎｎｉｅら（１９８７）の方法は、２つの選択された抗体からの消化性Ｆ（ａ
ｂ’γ）２フラグメントの調製、次いで別個のＦａｂ’γＳＨフラグメントを提
供するためのそれぞれの還元を包含する。結合されるべき２つのパートナーのう
ちの１つにおけるＳＨ基は、次いで、ｏ−フェニレンジマレイミドのような架橋
試薬でアルキル化されて、一方のパートナーにおいて遊離のマレイミド基を提供
する。次いで、このパートナーは、チオエーテル結合によって他方に結合されて
、所望のＦ（ａｂ’γ）２ヘテロ接合体を得る。
調製、高収量、および再現性の容易さのため、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）
の方法は、しばしば二重特異性抗体の調製に好適であるが、用いられ得るおよび
発明者らにより意図される多くの他のアプローチがある。例えば、他の技術は公
知であり、ＳＰＤＰまたはプロテインＡとの架橋が行われるか、あるいは三重特
異性構築物が調製される（Ｔｉｔｕｓら、１９８７；Ｔｕｔｔら、１９９１）。
二重特異性抗体を産生する別の方法は、２つのハイブリドーマの融合によるク
アドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）の形成である（Ｆｌａｖｅｌｌら、１９９１、
１９９２；Ｐｉｍｍら、１９９２；Ｆｒｅｎｃｈら、１９９１；Ｅｍｂｌｅｔｏ
ｎら、１９９１）。本明細書中で用いられる用語「クアドローマ」は、２つのＢ
細胞ハイブリドーマの生産的融合を記載するために用いられる。現在の標準的技
術を用いて、２つの抗体産生ハイブリドーマが融合されて娘細胞を得、そして次
いで、両セットのクローン型の免疫グロブリン遺伝子の発現を維持したこれらの
細胞が選択される。
クアドローマを生成する好ましい方法は、親ハイブリドーマの少なくとも１つ
の酵素欠損変異体の選択を包含する。次いで、この第１の変異体ハイブリドーマ
細胞株が、例えば、ヨードアセトアミドに致死的に曝された、その継続した生存
が妨げられる第２のハイブリドーマの細胞に融合される。細胞融合は、致死的に
処理されたハイブリドーマから酵素欠損に関する遺伝子を獲得することによる第
１のハイブリドーマのレスキュー、および第１のハイブリドーマへの融合による
第２のハイブリドーマのレスキューを可能にする。同じイソ型であるが異なるサ
ブクラスの免疫グロブリンの融合が、好ましいが、必要とされるわけではない。
混合サブクラス抗体は、好ましいクアドローマの単離のための代替アッセイの使
用を可能にする。
より詳細には、クアドローマ開発およびスクリーニングの１つの方法は、第１
の選択ＭＡｂを分泌するハイブリドーマ株を得、そして必須代謝酵素であるヒポ
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損
しているこの株を作製することを包含する。ハイブリドーマの欠損変異体を得る
ために、細胞を８−アザグアニンの漸増濃度（１×１０−７Ｍ〜１×１０−５Ｍ
）の存在下で増殖させる。変異体を限界希釈によりサブクローン化し、そしてヒ
ポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）感受性について試験する。
培養培地は、例えば、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭペ
ニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭからなり得る。
第２の所望のＭＡｂを産生する相補ハイブリドーマ細胞株は、標準的な細胞融
合技術（Ｇａｌｆｒｅら、１９８１）によるか、またはＣｌａｒｋら、（１９８
８）により記載のプロトコルを用いることにより、クアドローマを生成するため
に用いられる。簡単にいえば、４．５×１０７個のＨＡＴ−感受性第１細胞を、
致死用量の不可逆性の生化学的インヒビターであるヨードアセトアミド（リン酸
緩衝化生理食塩水中５ｍＭ）で、融合前に、３０分間氷上で前処理した２．８×
１０７個のＨＡＴ−耐性第２細胞と混合する。細胞融合をポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を用いて誘導し、そして細胞を９６ウェルマイクロ培養プレートに
播種する。クアドローマをＨＡＴ含有培地を用いて選択する。二重特異性抗体含
有培養物を、例えば、固相イソ型特異的ＥＬＩＳＡおよびイソ型特異的免疫蛍光
染色を用いて、同定する。
二重特異性抗体を同定するための１つの同定の実施態様では、マイクロタイタ
ープレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒ
ｅ）のウェルが、親ハイブリドーマ抗体の１つと特異的に相互作用し、かつ両抗
体と交差反応性を有さない試薬でコートされる。プレートは洗浄され、ブロック
され、そして試験されるべき上清（ＳＮ）が各ウェルに添加される。プレートは
室温で２時間インキュベートされ、上清は捨てられ、プレートは洗浄され、そし
て希釈アルカリホスファターゼ−抗抗体接合体が室温で２時間添加される。プレ
ートは洗浄され、そしてホスファターゼ基質（例えば、Ｐ−ニトロフェニルリン
酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））が各ウェルに添加される。プレートはイ
ンキュベートされ、３Ｎ ＮａＯＨが各ウェルに添加されて反応を停止させ、そ
してＯＤ４１０値がＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定される。
別の同定実施態様では、ポリ−Ｌ−リジンで前処理したマイクロタイタープレ
ートが、標的細胞の１つを各ウェルに結合させるために用いられ、次いで細胞が
、例えば、１％グルタルアルデヒドを用いて固定化され、そして二重特異性抗体
が、それらの無傷細胞への結合能力について試験される。さらに、ＦＡＣＳ、免
疫蛍光染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイ、および抗体特
徴付けの分野において一般的な他の方法が、本発明と共に、好ましいクアドロー
マを同定するために用いられ得る。
クアドローマを単離した後、二重特異性抗体が他の細胞産物から精製される。
これは、免疫グロブリン精製の当業者に公知の種々のタンパク質単離手順により
達成され得る。抗体を調製および特徴付けする手段は、当該分野において周知で
ある（例えば、★Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，１９８８を参照のこと）。
例えば、選択されたクアドローマからの上清が、プロテインＡまたはプロテイ
ンＧセファロースカラムに通され、ＩｇＧを結合する（イソ型に依存する）。次
いで、結合された抗体が、例えば、ｐＨ５．０クエン酸緩衝液で溶出される。Ｂ
ｓＡｂを含有する溶出画分が、等張緩衝液に対して透析される。あるいは、溶出
液はまた、抗免疫グロブリンセファロースカラムに通される。次いで、ＢｓＡｂ
が、３．５Ｍ塩化マグネシウムで溶出される。次いで、このようにして精製され
たＢｓＡｂは、例えば、上記のように、イソ型特異的ＥＬＩＳＡおよび標的細胞
の免疫蛍光染色アッセイにより、結合活性について試験される。
精製ＢｓＡｂおよび親抗体はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、続いて
銀またはクマシーで染色することにより特徴づけおよび単離され得る。これは、
親抗体の一方が他方より高い分子量を有する場合に可能である。その場合、Ｂｓ
Ａｂのバンドは、２つの親抗体のバンド間の中間部に移動する。サンプルの還元
は、２つの異なる見かけ分子量を有する重鎖の存在を確証する。
さらに、組換え技術が、一般に抗体の調製のために、現在利用可能である。こ
のことにより、所望の二重特異性を有する抗体をコードする組換え抗体遺伝子の
調製が可能となる（Ｖａｎ Ｄｕｋら、１９８９）。従って、最も好ましい結合
特性を有するモノクローナル抗体を選択した後、これらの抗体に関するそれぞれ
の遺伝子が、例えば、ファージ発現ライブラリーの免疫スクリーニングにより、
単離され得る（ＯｉおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８６；ＷｉｎｔｅｒおよびＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ，１９９１）。次いで、Ｆａｂコードドメインの再配列により、
適切なキメラ構築物が容易に得られ得る。
（Ｅ．結合アッセイ）
本発明は、動物およびヒト処置法（ｒｅｇｉｍｅｎ）において重要な有用性を
有するが、これは、多くの他の実施用途もまた有する。これらの用途は、一般に
、二重特異性化合物の特異的結合能に関連する。本発明の全ての化合物は、少な
くとも１つの標的および結合成分（例えば、抗体、リガンド、レセプターなど）
を含むので、得られる二重特異性構築物は、本来の抗体、リガンド、またはレセ
プターなどが用いられ得る事実上全ての結合実施態様において用いられ得る。コ
アギュラントまたは他の結合領域の存在は、いずれの結合アッセイにおいても第
１の結合領域の有用性を打ち消さない。
このようにして、二重特異性凝固リガンドは、標準的な結合アッセイにおいて
用いられ得る。この結合アッセイとしては、例えば、免疫ブロット、ウェスタン
ブロット、および抗原が固体支持体マトリックス（例えば、ニトロセルロース、
ナイロン、またはそれらの組合せ）上に固定化されている他のアッセイが挙げら
れる。それらリガンドは、単に「抗体基質」として用いられ得るか、または標準
的な二次試薬が許容不能に高いバックグラウンドを生じさせる抗原の検出で用い
られる、より特異的な検出手段を提供するために用いられ得る。これは、研究さ
れる抗原がそれ自身免疫グロブリンであるか、または他の抗体がこの手順におい
て用いられる（ＥＬＩＳＡの場合において以下に例示する）場合、特に有用であ
る。
二重特異性結合リガンドはまた、解凍したばかりの組織塊およびホルマリン固
定化パラフィン包埋組織塊の両組織塊と共に、免疫組織化学；蛍光活性化細胞選
別、フローサイトメトリー、またはフローマイクロフルオロメトリー；複合体混
合物から標的抗原を分離するための免疫沈降（この場合、それらが分子格子を形
成できるため、二次マトリックス結合試薬を用いなくても沈降を達成し得る）；
抗原または細胞精製実施態様（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、特
定の場合では、１つまたはそれ以上の細胞集団の同時一工程高速精製さえも包含
する）；および本明細書中に示される情報を与えられる当業者に公知の多くの他
の結合アッセイにおいて、用いられ得る。
一例として、本発明の二重特異性リガンドは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて用
いられ得る。多くのタイプのＥＬＩＳＡが知られており、そして当該分野におい
て日常的に実施されている。二重特異性リガンドは、実施される特定のＥＬＩＳ
Ａタイプおよび検出されるべき「抗原」（成分）に依存して、いずれの結合工程
においても用いられ得る。従って、リガンドは、プレートをコートするように用
いられ得、抗原として結合部位に関して競合し得、一次結合リガンド、二次結合
リガンド、または三次または他の結合リガンドとしてさえ標準曲線を作成し得る
。以下に記載する代表的な様式をさらに考慮し、多くのＥＬＩＳＡ実施様式が当
業者に公知である。
ＥＬＩＳＡの１つの形態では、結合標的（一般的に抗体自身である）が、ポリ
スチレンマイクロタイタープレートのウェルのような選択された表面、好ましく
はタンパク質親和性を示す表面上に固定化される。洗浄して不完全に吸着した物
質を除去した後、試験抗血清に関して抗原的に中性であると知られる非特異的タ
ンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、または粉乳溶液
）でアッセイプレートウェルを結合またはコートすることが望ましい。これは、
固定化表面上の非特異的吸着部位のブロックを可能にし、従って表面上の抗血清
の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを低下させる。
これらのＥＬＩＳＡタイプ（一般的にサンドイッチＥＬＩＳＡと呼ばれる）に
おいて、プレート結合抗体は、抗原を「捕捉」するために用いられる。第１の抗
体をウェルに結合させ、非反応性物質でコートしてバックグラウンドを低下させ
、そして洗浄して非結合物質を除去した後、固定化表面は、本発明の代表的な実
施態様において、免疫複合体（抗原／抗体）形成が導かれる様式で、検出および
／または力価測定されるべき抗原性物質を含有する試験サンプルと接触される。
これらの実施態様は、臨床サンプルまたは生体抽出液においてリガンドを検出す
るために、特に有用である。サンプルは、好ましくは、ＢＳＡ、ウシγグロブリ
ン（ＢＧＧ）、およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに界面活性剤
（例えばＴｗｅｅｎ）の溶液で希釈される。
次いで、重層した抗血清が、２〜４時間、好ましくは２５〜３７℃の目安の温
度でインキュベートされる。インキュベーション後、抗血清接触表面は、非免疫
複合物質を除去するように洗浄される。好ましい洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎ、またはホウ酸緩衝液のような溶液を用いる洗浄を包含する。
結合抗原と試験サンプルとの間で特異的免疫複合体を形成し、続いて洗浄した
後、免疫複合体形成の発生および量は、同じ複合体を二次特異的結合成分（一般
に抗体ベースの成分である）に供することにより決定され得る。特定の実施態様
では、本発明の二重特異性リガンドは、この工程において用いられるように提案
されている。次いで、特異的結合工程および洗浄工程がさらに実施される。
本発明の代表的な実施態様において検出手段を提供するために、検出標識に結
合されている第３の抗体が用いられる。検出標識としては、適切な色素原基質と
インキュベートさせた際に発色を生じさせる結合酵素が挙げられる。第３のまた
は三次の標識抗体は、二重特異性リガンドの一成分に対して結合親和性を有する
。最終免疫複合体は、適切な結合工程および洗浄工程の後に、標識を検出するこ
とにより決定される。この標識の検出は、例えば、色素原基質とインキュベート
することにより行われる。色素原基質としては、例えば、尿素およびブロモクレ
ゾールパープル、または２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリ
ン−６−スルホン酸［ＡＢＴＳ］およびＨ２Ｏ２が挙げられる。次いで、定量は
、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて、発色の程度を測定することによ
り達成される。
上記のＥＬＩＳＡタイプと共に、二次検出試薬として二重特異性凝固リガンド
を用いることは、別個の利益を有する。例えば、そのことにより、通常標的され
る典型的な抗体定常領域とは異なる二重特異性リガンドの部分に特異的な三次の
標識抗体の使用が可能になる。特に、二重特異性構築物の凝固部分（または凝固
結合領域）に特異的である三次結合リガンドが用いられ得る。免疫複合体形成を
検出するこの新規な手段は、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて特に有用な改良特
異性を与える。このサンドイッチＥＬＩＳＡでは、三次抗体が、意図された二次
抗体にちょうど結合するのではなく、プレートをコートするために用いられる本
来の物質（すなわち、本来の抗体）と交差反応し、そして結合し得る。二重特異
性リガンドの非抗体部分に対して、または新規な抗原結合領域に対してさえも標
識三次成分を指向することにより、非特異的結合の問題および異例に高いバック
グラウンドは回避される。
二重特異性リガンドのさらなる実施用途は、それらの凝固能を利用することに
より明らかである。提案された全ての化合物は凝固を誘導し得るので、それらは
、凝固を一成分として包含する任意のアッセイにおいて、例えば、コントロール
として用いられ得る。標的成分の存在は、このようなアッセイにおいて、他とは
独立した各成分機能として、コアギュラントの有用性を打ち消さない。
（Ｆ．組織因子結合二重特異性抗体の有効な用途）
初めの方で述べたように、組織因子（ＴＦ）は、血液凝固を開始させ得る１つ
の因子である。ＴＦは、血管損傷において、または特定のサイトカインによる活
性化後に、血液に曝される。次いで、利用可能なＴＦが、第ＶＩＩａ因子と複合
体を形成し、最終的にフィブリン形成を生じる凝固カスケードを開始させる。
１つの代表的な実施態様において、本発明者らは、１つの抗原結合部位では腫
瘍血管系内皮細胞上の抗原に対する特異性を有し、そして他方の抗原結合部位で
はヒトＴＦの細胞外ドメインに対する特異性を有する二重特異性抗体を合成した
。ヒトＴＦに対して特異性を有する抗体は、第ＶＩＩａ因子複合体形成事象また
はＴＦ／ＶＩＩａ活性を妨害することなく、高い親和性でＴＦに結合することが
既に示された（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、１９８８）。全長ヒトＴＦを用いる代わ
りに、本発明者らは、短縮型（ｔＴＦ）を用いた。この短縮型は、細胞質ドメイ
ンならびに膜貫通ドメインを欠く。短縮されたＴＦは、第ＶＩＩａ因子と複合体
を形成し得るが、凝固誘導活性を欠く。これはおそらく、凝固開始複合体（第Ｘ
因子を含む）がアセンブルし得る膜表面と、複合体を形成し得ないからである。
この腫瘍血管系内皮細胞表面特異的標的構築物の有効性を分析するために用い
られるマウスモデルは、最近確立されたモデルであり、このモデルでは、ＭＨＣ
クラスＩＩ抗原（正常組織の血管系には存在しない）が、腫瘍細胞により分泌さ
れるＩＦＮ−γによる誘導により、腫瘍血管系で発現される（Ｂｕｒｒｏｗｓら
、１９９２；ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９３）。静脈内に投与さ
れた抗クラスＩＩ抗体は迅速かつ強く腫瘍血管系に局在化することが実証されて
いる（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２）。
本発明者らは、Ｃ１３００（Ｍｕγ）腫瘍生成マウスにおいて、抗ＭＨＣクラ
スＩＩ／抗ＴＦ二重特異性抗体が、ｔＴＦと共に投与される場合、腫瘍の血管系
において特異的に凝固を誘導し得ることを、本明細書中において実証する。実際
に、抗体：ｔＴＦ複合体の静脈内投与は、腫瘍血管系の迅速な血栓症を誘導し、
７０％の動物で腫瘍退縮を完了した。二重特異性抗体単独、ｔＴＦ抗体単独、ｔ
ＴＦ存在下または非存在下の任意のイソ型適合性コントロール抗体のいずれもが
、同一の効果を誘起し得なかった。このことは、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０二重特
異性抗体が、標的細胞およびｔＴＦを架橋し得る「コアギュリガンド」として作
用し、それによりｔＴＦが第Ｘ因子を活性化し得、そして凝固カスケードを開始
させ得ることを示している。これはまた、固形腫瘍の処置におけるコアギュリガ
ンドの明らかな成功を示す。
（Ｇ．薬学的組成物およびキット）
本発明の薬学的化合物は、一般に薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体
に溶解または分散した有効量の二重特異性凝固リガンドを包含する。
用語「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、動物またはヒト
に、適切に投与されるとき、有害な、アレルギー性のまたはその他の不都合な反
応を起こさない分子実体および組成物をいう。本明細書中で用いられるように、
「薬学的に受容可能なキャリア」としては、任意のおよびすべての溶媒、分散媒
、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇ
ｅｎｔ）および吸収遅延剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅ
ｎｔ）などが挙げられる。薬学的活性物質に対するこのような媒体および薬剤の
使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤は、活性成分と適
合しないものではない限り、本治療組成物中でのその使用が意図される。補助活
性成分もまた、組成物に取り入られ得る。
（１．非経口処方物）
本発明の二重特異性リガンドは、しばしば非経口投与のために処方される。例
えば、静脈内、筋肉内、皮下または他のそのような経路を経る注射（腫瘍部位ま
たは疾病部位に直接点滴することを含む）のために処方される。活性成分として
腫瘍標的化凝固剤を含有する水性組成物は、本発明の開示を考慮すれば当業者に
理解される。代表的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれ
かのように注射可能なものとして調製され得る。注射前に液体を加えて溶液また
は懸濁液を調製するために用いられるのに適する固体の形態もまた、調製され得
る。そして調製物はまた、乳化もされ得る。
遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩のような活性化合物の溶液は、ヒドロ
キシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製され
得る。分散体はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれ
らの混合物、ならびにオイル中で調製され得る。通常の保存および使用条件下で
は、これらの調製物は、保存剤を含有し微生物の成育を防止する。
注射用途に適した薬学的形態としては、無菌水溶液または分散体；ゴマ油、ピ
ーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含有する処方物；および無菌注
射溶液または分散体の用時調製のための無菌粉末が挙げられる。すべての場合で
、形態は、無菌でなければならず、容易にシリンジで使用できる程度まで流動的
でなければならない。それは、製造および保存条件下で安定でなければならず、
微生物（例えば、細菌類および真菌類）の混入作用に対して保護されなければな
らない。
二重特異性リガンドまたは抗体は、中性または塩の形態で組成物の中に処方さ
れ得る。薬学的に受容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により
形成される）を包含し、そしてこれは無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）また
は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）により形成され
る。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または
水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミ
ン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
キャリアはまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロー
ル、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それら
の適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動
性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には要
求される粒子の大きさの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得
る。微生物の作用を防止することは、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、
パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）に
より達成され得る。多くの場合、等張化剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）
を含有することが好ましい。注射可能な組成物の吸収を延長することは、吸収を
遅延する薬物（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）の組成
物中での使用で達成され得る。
無菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列
挙した種々の他の成分と組み合わせ、続いて滅菌濾過を行うことにより調製され
る。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、塩基性分散媒および上に
列挙したもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルの中に組み入
れることにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製
の好ましい方法は真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、それらの技法は、活
性成分と付加的な所望の成分との粉末を、あらかじめ無菌濾過されたそれらの溶
液から生成する。
処方されると、溶液は、投薬処方物に適合した方法および治療に効果のあるよ
うな量で、投与される。処方物は、種々の剤形（例えば、上記の注射溶液のタイ
プ）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた、用いられ得る。
本発明に従った適切な薬学的組成物は、一般に、予定される使用に応じて、受
容し得る薬学的希釈剤または賦形剤（例えば、無菌水溶液）と混合して最終濃度
の範囲にされた、ある量の二重特異性リガンドを含有する。調製技術は、Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６
版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０（本明細書中
で参考として援用される）により例示されるように当該分野で周知である。エン
ドトキシン混入は、安全レベル（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満）で
最小限に維持されるべきことが理解される。さらに、ヒト投与については、調製
品は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓにより要求されるような無菌性、発熱性、一般安全性および純度標準を満たす
べきである。
治療効果量は、本明細書中（例えば、実施例ＩＩＩ参照）に詳述する研究で示
されるように、動物モデルを用いて容易に決定され得る。固形腫瘍を有する実験
動物は、臨床環境に移される前に適切な治療用量を最適化するのに、よく用いら
れる。このようなモデルは、効果的な抗ガンストラテジーを予測するのに、非常
に信頼性のあることが知られている。例えば、実施例ＩＩＩで用いられるように
、腫瘍を有するマウスは、前臨床試験で広く用いられる。
本発明者は、Ｃ１３００（Ｍｏ８）腫瘍を有するマウスを用い、毒性限界、お
よび最小限の毒性で至適な抗腫瘍効果を与える二重特異性の作用範囲を決定した
。
ガンの処置においての使用のための有効量は、１週間あたり約１回の頻度でＩ
Ｖルートを経て投与される場合、約０．１ｍｇ／ｋｇと約２ｍｇ／ｋｇとの間、
および好ましくは約０．８ｍｇ／ｋｇと約１．２ｍｇ／ｋｇとの間であると、現
在のところ提示されている。処置される被験体の状態により、用量のいくらかの
変化は必然的に生じる。投与に対して責任のある人は、いずれにしても、個々の
患者に対して適切な用量を決定する。このような最適化および調整は、当該分野
で日常的に行われ、そして決して過度の実験量を表さない。
本発明の一つの局面は、循環から内因性凝固因子を蓄積し、腫瘍部位内にそれ
を濃縮する、複合化していない二重特異性結合リガンドを投与することによる腫
瘍部位への凝固剤の送達に関することに留意すべきである。これらの場合、用い
られる薬学的組成物は、標的化領域およびコアギュラント結合領域を有するリガ
ンドを含有するが、他の点では一般に上記のものと同じである。
非経口投与（例えば、静脈内注射または筋肉内注射）用に処方された化合物に
加えて、他の薬学的に受容され得る形態（例えば、錠剤または他の経口投与のた
めの固形物、時間放出（ｔｉｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ）カプセル、リポソーム形態
など）もまた意図される。処置される状態に応じて、他の薬学的処方物もまた用
いられ得る。例えば、皮膚炎および乾癬のような病的状態を処置するために適切
な局所処方物；および糖尿病性網膜症のための眼用処方物。
（２．摂取可能な処方物）
特定の実施態様では、活性化合物は、経口投与され得る。このことは、消化酵
素によるタンパク質分解に、一般に耐性の、または耐性となる薬剤について意図
される。このような化合物は、化学的に設計または修飾された薬剤；右旋性ペプ
チジル薬剤；リポソーム処方物；およびペプチダーゼ分解およびリパーゼ分解を
避けるために時間放出カプセルに入った処方物を包含することが意図される。
経口投与のために、活性二重特異性化合物は、例えば不活性希釈剤または消化
され得る食用キャリアと共に投与され得る。あるいは、それらは、堅いまたは軟
らかいシェルのゼラチンカプセル内に封入されるか、あるいは錠剤として圧縮さ
れるか、あるいは食餌内に直接組み入れられる。経口治療投与のために、活性化
合物は、賦形剤に組み入れられ、そして摂取し得る錠剤、舌下錠剤、トローチ、
カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤（ｗａｆｅｒ）などの形
態で用いられる。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性
二重特異性コアギュラントを含有するべきである。組成物および調製物の割合は
、当然変化し得、好ましくはユニットの重量の約２％〜約６０％の間であり得る
。このような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られる
ような量である。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、また：結合剤（例えば、ゴムトラガ
カント、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、
リン酸ジカルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、ア
ルギン酸など）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）を含有し得、そし
て甘味料（例えば、スクロース、ラクトース、またはサッカリン）または香料（
例えば、ペパーミント、冬緑油、またはチェリー香料）が添加され得る。用量単
位形態がカプセルの場合、上記のタイプの材料に加えて液体キャリアが含有され
得る。
種々の他の材料は、コーティングとして、またはそれ以外に用量単位の物理的
形態を改変するように存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、シ
ェラック、糖またはその両方でコートされ得る。エリキシル剤のシロップは、活
性化合物、甘味料としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプ
ロピルパラベン、染料、および香料（例えば、チェリー香料またはオレンジ香料
）を含有し得る。当然、任意の用量単位形態の調製に用いられる任意の材料は、
薬学的に純粋で、用いられる量で実質的に無毒であるべきである。さらに、活性
化合物は、持続放出調製物および処方物に組み入れられ得る。
（３．リポソーム処方物）
本発明の二重特異性凝固リガンドはまた、所望であれば、リポソーム調製物と
して処方され得る。以下の情報は、本発明のコアギュラントを組み入れたリポソ
ーム処方物の製造において利用され得る。リン脂質は、水に分散された場合、脂
質と水のモル比に依存してリポソームを形成する。リポソームの物理的特性は、
ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン
性物質および極性物質に対して低い浸透性を示すが、高温において相転移して、
これによりその浸透性が著しく変わる。相転移は、ゲル状態として知られる密に
充填された秩序ある構造から、流体状態として知られるゆるく充填されたあまり
秩序のない構造への変化を意味する。この相転移は、特有の相転移温度で起こり
、イオン、糖および薬物に対する浸透性の増加を生じる。
温度に加えて、タンパク質に曝されることで、リポソームの浸透性は、変わり
得る。特定の可溶タンパク質（例えば、シトクロームｃ）は、二重層に結合し、
変形させ、そして貫入し、それにより浸透性の変化を引き起こす。コレステロー
ルは、見かけ上リン脂質をさらに堅密に充填することにより、タンパク質のこの
貫入を阻害する。本発明での使用について最も有用なリポソーム形成は、コレス
テロール、またはＰＥＧさえ含有することは、意図される。
溶質をトラップする能力は、異なるタイプのリポソームの間で変化する。例え
ば、多層ベシクル（ＭＬＶ）は、溶質をトラップすることにおいて適度に効果が
あり、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）は、十分ではない。ＳＵＶは、サイズ分布
において均一性および再現性の点で有利であるが、サイズとトラップ効率との間
の妥協（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）は、大きい単層ベシクル（ＬＵＶ）により示さ
れる。これらは、エーテルエバポレーションにより調製され、そして溶質トラッ
プにおいて、ＭＬＶより３〜４倍効果がある。
リポソーム特性に加えて、化合物のトラップにおける重要な決定因子は、化合
物自体の物理化学的性質である。極性化合物は、水性空間でトラップされ、そし
て非極性化合物は、ベシクルの脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透によ
りまたは二重層が破壊されたときに遊離されるが、非極性化合物は、二重層が温
度またはリポタンパク質への曝露により破壊されない限り、二重層と結びついた
ままである。両方のタイプとも、相転移温度において最大外向き流出速度（ｅｆ
ｆｌｕｘ ｒａｔｅ）を示す。
リポソームは、以下の４つの異なるメカニズムを経て、細胞と相互作用する：
網内系の食細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）によるエンドサイトー
シス；非特異的な弱い疎水性の力または静電力、あるいは細胞表面成分との特異
的な相互作用のどちらかによる細胞表面への吸着；リポソームの脂質二重層の細
胞質膜への挿入による細胞質膜との融合（細胞質の中へのリポソーム内容物の同
時放出を伴う）；およびリポソーム内容物との任意の会合なしでのリポソーム脂
質の細胞膜または細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）膜への転移、あるいはその
逆による。どのメカニズムが作用し、そして１つより多くのメカニズムが同時に
作用するかどうかを決定することは、しばしば困難である。
静脈内に注射されたリポソームの成りゆき（ｆａｔｅ）および性質は、それら
の物理的性質（例えば、大きさ、流動性、および表面電荷）に依存する。それら
は、それらの組成に依存して、数時間から数日間、組織に残存し、そして血中で
の半減期は、数分から数時間の範囲である。より大きいリポソーム（例えば、Ｍ
ＬＶおよびＬＵＶ）は、網内系の食作用細胞により速やかに取り込まれるが、循
環系の生理学が、大部分の部位でこのような大きな種の排出（ｅｘｉｔ）を制限
する。それらは、毛細管内皮（例えば、肝臓または脾臓の洞様血管）に存在する
大きな開口部または孔においてのみ排出され得る。従って、これらの器官は、取
り込みの主要部位である。一方、ＳＵＶは、より広い組織分布を示すが、なお肝
臓および脾臓中に高度に隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）される。一般に、このイン
ビボでの性質は、リポソームの大きいサイズを受け入れやすい器官および組織の
みへのリポソームの集中を決定する。これは、明らかに血液を含んでいるので、
このことは、それらの本発明と組み合わせた使用の限定とはならない。
他の実施態様では、本発明の二重特異性成分は、リポソーム表面と混合され得
、薬物内容物を、標的細胞表面上に位置する特異的抗原レセプターに導く。炭水
化物決定因子（細胞−細胞間の認識、相互作用、および付着において役割を有す
る糖タンパク質または糖脂質細胞表面成分）もまた、認識部位として用いられ得
る。なぜならそれらは、リポソームを特定の細胞タイプに導く能力があるからで
ある。主として、リポソーム調製物の静脈内注射が用いられるが、他の投与経路
もまた考え得ることは意図されている。
（４．局所処方物）
局所使用のための二重特異性コアギュラントの処方物、例えば、クリーム、軟
膏およびゲルとしての処方物もまた意図される。油性または水溶性軟膏基剤の調
製物もまた、当業者に周知である。例えば、これらの組成物としては、植物油、
動物性脂肪、およびさらに好ましくは石油から得られた半固体炭水化物が挙げら
れ得る。用いられる特定の成分としては、白色軟膏、黄色軟膏、セチルエステル
ワックス、オレイン酸、オリーブ油、パラフィン、ワセリン、白色ワセリン、鯨
ロウ、スターチグリセリン剤、白色ワックス、黄色ワックス、ラノリン、無水ラ
ノリン、およびグリセリルモノステアレートが挙げられ得る。
種々の水溶性軟膏基剤もまた用いられ得、例としては、グリコールエーテルお
よびその誘導体、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、お
よびポリソルベートが挙げられる。所望であれば、皮膚を通しての送達すら、例
えば、経皮パッチ、イオン浸透療法、または電気移送（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎ
ｓｐｏｒｔ）により、用いられ得る。
（５．眼用処方物）
本発明の二重特異性凝固リガンドはまた、眼用溶液としての使用に適した薬学
的組成物に処方され得る。このような眼用溶液は、例えば、糖尿病性網膜症の処
置において重要である。従って、糖尿病性網膜症の処置のために、本発明の二重
特異性接合体は、治療を必要とする被験者の目に、従来の薬学的な慣行（例えば
、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ」第１５版、１４８８〜１５０１頁（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ））に従って調製された眼用調製物の形態で投与される
。
眼用調製物は、新規の二重特異性コアギュラントまたはその薬学的に受容可能
な塩を、薬学的に受容可能な溶液、懸濁液、または軟膏中において、約０．０１
重量％〜約１重量％、好ましくは約０．０５重量％〜約０．５重量％の濃度で含
有する。いくらかの濃度の変化は、用いる特定の化合物、処置される被験体の状
態などにより、必然的に生じる。そして、処置の責任者は、個別の被験体につい
て最も適した濃度を決定する。眼用調製物は、好ましくは無菌水溶液の形態であ
り、所望であれば、付加的な成分（例えば、保存剤、緩衝剤、張度調節剤、抗酸
化剤および安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤など）を含有する。
このような溶液中での使用に適した保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、
塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。適切
な緩衝剤としては、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナ
トリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナト
リウム、二リン酸ナトリウムなどが挙げられ、ｐＨを約６〜８の間、好ましくは
約７〜７．５の間に維持するに充分な量である。適切な張度調節剤は、デキスト
ラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プ
ロピレングリコール、塩化ナトリウムなどであり、眼用溶液の塩化ナトリウム当
量は、０．９±０．２％の範囲である。
適切な抗酸化剤および安定剤としては、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナ
トリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤お
よび清澄剤としては、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー
２８２、およびチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキスト
ラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロ
ース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワ
セリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。眼用調製物は、従来の方法
（例えば、点眼液の形態でまたは眼用溶液中に目を浸すことにより）により治療
が必要とされる被験体の目に、局所的に投与される。
（６．治療キット）
本発明はまた、本明細書中で記載された二重特異性凝固リガンドを含む治療キ
ットを提供する。このようなキットは、一般に、本発明に従う少なくとも一つの
二重特異性リガンドの薬学的に受容可能な処方物を、適切な容器手段中に含有す
る。キットはまた、以下のものを含有し得る：他の薬学的に受容可能な処方物（
例えば、一般に異なる標的成分を有するさらなる二重特異性凝固リガンドを含有
する処方物）；複合化されていない余分の凝固因子；二重特異性抗体、Ｔ細胞、
または例えば抗原誘導で用いられる他の機能成分；抗原抑制で用いられる成分（
例えば、シクロスポリン）；異なる抗腫瘍部位の抗体またはイムノトキシン；お
よび１つ以上の一連の（ａ ｒａｎｇｅ ｏｆ）化学療法薬剤。
組み合わせキットで用いられる好ましい薬剤としては、疾患関連血管内皮細胞
を誘導して、標的化可能な抗原（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＭＨＣクラスＩ
Ｉ抗原）を発現し得る薬剤が挙げられる。誘導剤としては、疾患抗原または腫瘍
抗原に結合し、そしてＩＦＮ−γを産生するＴ細胞クローンが挙げられ得る。好
ましい誘導剤としては、疾患細胞抗原または腫瘍細胞抗原、ならびにサイトカイ
ンの同化により標的抗原発現を誘導し得るエフェクター細胞と結合する二重特異
性抗体が挙げられる。
このように、さらに本発明は、適切な容器手段中に以下を含有するキットを包
含する：エフェクター細胞表面（すなわち、単球／マクロファージ、マスト細胞
、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞）上の活性化抗原、および疾患細胞の細胞表面上の抗
原に結合する二重特異性抗体を含有する第１の薬学的組成物；および、二重特異
性リガンドを含む第２の薬学的組成物。この二重特異性リガンドは、活性化エフ
ェクター細胞またはそれからのサイトカインにより誘導される内皮細胞抗原に結
合する第１結合領域を含み、ここでのこの第１結合領域は、凝固因子または凝固
因子に結合する第２結合領域と作動可能に連結している。
活性化抗原ＣＤ１４、ＣＤ１６（ＩｇＥについてはＦｃＲ）、ＣＤ２、ＣＤ３
、ＣＤ２８またはＴ細胞レセプター抗原に結合する二重特異性抗体を含有する第
１の薬学的組成物を含むキットが好ましく、ＣＤ１４結合二重特異性抗体または
ＣＤ２８結合二重特異性抗体を含有する第１の薬学的組成物を含むキットがさら
に好ましい。ＣＤ１４またはＣＤ１６の結合を経た単球／マクロファージまたは
マスト細胞の活性化は、Ｅ−セレクチンを誘導するＩＬ−１産生を生じ、他方、
ＣＤ２、ＣＤ３、またはＣＤ２８の結合を経たＴ細胞の活性化は、ＭＨＣクラス
ＩＩを誘導するＩＦＮ−γ産生を生じる。従って、Ｅ−セレクチンまたはＭＨＣ
クラスＩＩ抗原に結合する第１結合領域を含む、二重特異性リガンドを含有する
、第２の薬学的組成物を含むキットもまた好ましい。
キットは、任意の追加の成分があってもなくても二重特異性凝固リガンドを含
有する単一の容器手段を有し得る。あるいは、キットは、それぞれの所望される
薬剤に対して異なる容器手段を有し得る。二重特異性凝固リガンドを生成するの
に必要な別々の成分を含むキットもまた意図される。
キットの成分が１つ以上の液体溶液として供給されるとき、その液体溶液は水
溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの成分は、乾燥粉末と
して供給され得る。試薬または成分が乾燥粉末として供給されるとき、粉末は、
適切な溶媒の添加により再構成される。溶媒もまた、他の容器手段中で供給され
得ることは想像される。
キットの容器手段としては、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フ
ラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段が挙げられ、その中に二重特異性凝固
リガンドおよび他の所望される薬剤が入れられ得、好ましくは適切に小分けされ
る。追加の成分が含有される場合、キットはまた、一般に第２のバイアルまたは
他の容器を有し、追加の成分はその中に入れられ、別々に計画された用量の投与
を可能にする。キットは、無菌の薬学的に受容可能な緩衝剤または他の希釈剤を
含有するための第２／第３の容器手段もまた含有し得る。
キットはまた、二重特異性リガンドを動物または患者に投与する手段（例えば
、１つ以上の針またはシリンジ、あるいは点眼容器、ピペット、あるいは同様の
器具）を有し、それにより処方物が動物内に注入され得、または身体の疾患領域
に適用され得る。本発明のキットはまた、代表的には、バイアルなどおよび他の
成分を市販のための密閉するための手段（例えば、所望のバイアルおよび他の器
具を入れて保存する、射出成型またはブロー成型プラスチック容器）を含み得る
。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を説明するために包含される。以
下の実施例において開示された技術が、本発明者により発見され、本発明の実施
において良好に作用する技術を表し、従ってその実施についての好ましい様式を
構成すると考えられることは、当業者により理解されるべきである。しかし、当
業者は、本発明の真意および範囲から逸脱することなしに、多くの改変が開示さ
れた特定の実施態様においてなされ得、同様の結果を得ることは、本発明の開示
を考慮して理解すべきである。
本発明において、特定の血液凝固の達成に使用される種々の組成物および方法
が開示されている。これは、二重特異性抗体を用いたコアギュラントの部位特異
的送達による、腫瘍の退行を引き起こす特定のインビボにおける腫瘍血管系の凝
固によって例示される。
以下の図面は本明細書の一部をなすものであり、本発明の特定の局面を更に説
明するために添付されている。本発明は、これら図面のうち一つ以上を本明細書
に記載した具体的な実施例の詳細な説明とともに参照することにより、よりよく
理解され得るであろう。
（実施例Ｉ）
（二重特異性凝固抗体の合成）
本実施例は、腫瘍部位にコアギュラントを特異的に導き得る二重特異性抗体（
すなわち、「コアギュリガンド」）の合成を記載する。
（Ａ．材料および方法）
（１．試薬）
ペプシン（Ａ；ＥＣ ３．４．２３．１）、Ｅｌｌｍａｎ試薬（ＥＲ；５，５
’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸、ＤＮＴＢ）、２−メルカプトエタノー
ル（２−ＭＥ）、亜砒酸ナトリウム（ＮａＡｓＯ２）、およびウサギ脳トロンボ
プラスチン（アセトン粉末）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ．から得た。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５およびＧ−１００
を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得た。
（２．ヒト短縮型組織因子（ｔＴＦ））
組換えヒト短縮型ＴＦ（ｔＴＦ）を、２つの異なる方法の１つを用いて調製し
た。
方法Ｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの構築。ｔＴＦ（残基１〜２１８）をコー
ドするｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの上流のトロンビン切断部位に対するコード領域の
添加を可能にするプライマー５’−ＧＡＡＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣ
ＴＣＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴ−３’（５’−プライマ
ー；配列番号２８）および５‘−ＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＧＡＡ
ＴＴＣＡＣＣＴＴＴ−３’（３’−プライマー；配列番号２９）を用いるＰＣＲ
により増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断
し、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に連結した。
ＤＨ５α細胞を連結混合物で形質転換し、そしてアンピシリンの存在下での選
択の後に組換えプラスミドを単離した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１を、組換えプラ
スミドｐＴｒｃＨｉｓＣ−ｔＴＦを用いて形質転換し、そして得られた形質転換
体をタンパク質発現に用いた。
方法Ｉ：Ｅ．ｃｏｌｉからのｔＴＦの発現、再折畳み、および精製。ポリ（ｈｉ
ｓ）−ｔＴＦ融合タンパク質を、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＣ−ｔＴＦで形質転換したＢ
Ｌ２１細胞を用いて発現させた。接種培養物（ＬＢ培地中１０ｍｌ）を、３７℃
にて振盪しながら一晩増殖させた。
接種培養物を増殖培地に添加し、次いでこれを３７℃にて振盪しながら増殖さ
せた。５５０ｎｍの吸光度が約０．５に達した場合、１０ｍｌの１００ｍＭイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加した。振盪を、３７℃にて約
２０時間（定常期まで）続けた。
細胞を、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間）により回収し、そしてイン
クルージョンボディーを以下のように単離した（試薬の量は、細胞ペースト１グ
ラムあたりである）。細胞ペーストを、４ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．
５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｎＭ ＭｇＣｌ２、０．１７ｍｇ／ｍｌ ＰＭ
ＳＦ、２ｍｇ／ｍｌ ニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）に懸濁した。ベン
ゾナーゼ（２５０単位，ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した懸濁物を、室温にて
１．５時間、緩やかに混合し、次いで１２，０００ｇにて１５分間遠心分離した
。
ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％Ｎ
Ｐ４０（２ｍｌ）中に再懸濁し、５０％の力で１分間超音波処理し、そして１２
，０００×ｇにて２０分間遠心分離した。ペレットを水中に再懸濁し、５０％の
力で２０〜３０秒間超音波処理し、そして１２，０００×ｇにて２０分間遠心分
離した。水洗を繰り返し、最終的なペレット（インクルージョンボディーが非常
に多い）を６Ｍ 塩化グアニジウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸、１
０ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０（１ｇインクルージョンボディ
ーあたり９ｍｌの）中に、室温にて一晩、緩やかに混合することにより懸濁した
。
懸濁物を、１２，０００×ｇにて２０分間遠心分離し、そして上清をニッケル
ニトリロ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ，Ｑｉａｇｅｎ）カラムに載せた。カラムを、同じ
６Ｍ 塩化グアニジウム緩衝液ｐＨ８、次いでｐＨ７を用いて連続的に洗浄し、
次いでｐＨを４まで減少させることによりタンパク質を溶出させた。
融合タンパク質を含有するＮｉ−ＮＴＡカラム画分を合わせ、そしてジチオト
レイトールを５０ｍＭに添加した。溶液を、室温にて一晩保持し、次いで６Ｍ
尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ８．０）中に約
１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈し、そして同じ緩衝液の１０〜２０容量に
対して４℃にて透析した。緩衝液を、２Ｍ 尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００
ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ 還元グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチオ
ン、０．０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ８．０）（折畳み緩衝液）に変えた。透
析をさらに２日続け、緩衝液を新鮮な折畳み緩衝液に交換し、そして透析をさら
に２日続けた。
次いで、溶液を２０ｍＭ ＴＥＡに対して十分に透析し、透析バッグから取り
出し、ヒトトロンビン（約５００部組換えタンパク質あたり１部（ｗ／ｗ））で
室温にて一晩処理し、そしてＨＲ−１０／１０ ｍｏｎｏ−Ｑ陰イオン交換カラ
ムに載せた。ｔＴＦタンパク質を、３０分間にわたって、０〜１５０ｍＭまで直
線的に濃度が増加するＮａＣｌを含有する２０ｍＭ ＴＥＡ緩衝液（流速３ｍｌ
／分）を用いて溶出した。
方法ＩＩ：ｔＴＦ相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製。Ｊ−８２細胞（ヒト膀胱ガ
ン）由来のＲＮＡを、ｔＴＦのクローン化に用いた。全ＲＮＡを、ＧｌａｓｓＭ
ａｘＴＭ ＲＮＡマイクロ単離試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて単離した。
ＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｔＴＦ ｃＤＮＡを、同じキットで、以下の
２つのプライマーで増幅した：
Figure 2009298805
 下線を付した配列は、ｔＴＦのＮ末端およびＣ末端をコードする。５’プライ
マーの残りの配列は、 発現ベクターへのｔＴＦのクローン化を可能にするＮｃ
ｏＩの制限部位であり、そしてトロンビンに対する切断部位をコードする。３’
プライマーの配列は、発現ベクターにｔＴＦをクローン化するためのＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位である。ＰＣＲ増幅を、製造者により提案されるように行った。簡略に
は、７５μＭ ｄＮＴＰ；０．６μＭプライマー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を用
いて、９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、および７２℃にて３０秒間の
３０サイクルを行った。
方法ＩＩ．ベクター構築。Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターＨ６ｐＱＥ−６０を、ｔ
ＴＦ（Ｌｅｅら，１９９４）発現のために用いた。ＰＣＲ増幅したｔＴＦ ｃＤ
ＮＡを、ＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。Ｈ６ｐＱＥ−６
０は、発現されるタンパク質がＮ末端に（Ｈｉｓ）６配列を有するように組み込
まれた（Ｈｉｓ）６コード配列を有し、このタンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムで
精製し得る。
方法ＩＩ．ｔＴＦ精製。ｔＴＦを含有するＨ６ｐＱＥ−６０ＤＮＡを、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＴＧ−１細胞に形質転換した。細胞を、ＯＤ６００＝０．５まで増殖さ
せ、そしてＩＰＴＧを３０μＭまで添加し、ｔＴＦ産生を誘導した。細胞を、３
０℃にて１８時間振盪した後に回収した。細胞ペレットを、６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌ
において変成し、そして溶解物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に載せた
。結合したｔＴＦを、６Ｍ尿素で洗浄し、そして６Ｍ〜１Ｍの尿素のグラジエン
トを用いて室温にて１６時間再折畳みさせた。カラムを、洗浄緩衝液（０．０５
Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）で洗浄し、そ
してｔＴＦを、洗浄緩衝液中の０．２Ｍ イミダゾールで溶出させた。
溶出したｔＴＦを濃縮し、そしてＧ−７５カラムに載せた。ｔＴＦモノマーを
回収し、そしてトロンビンで処理してＨ６ペプチドを除去した。これは、５００
部のｔＴＦ（ｗ／ｗ）に対して１部のトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を添加すること
により、室温にて１８時間行った。混合物をベンズアミジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂトロンビンアフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通過させるこ
とにより、トロンビンをｔＴＦから除去した。
ｔＴＦは、第ＶＩＩａ因子に結合し、および第ＶＩＩａ因子の触媒活性（Ｒｕ
ｆｅｔら、１９９１）を増強する酵母またはチャイニーズハムスター卵巣細胞由
来の組換えｔＴＦと同一の能力を有した。ドデシル硫酸ナトリウム中のポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分析した場合、これは、約２４ｋＤの分子量を有
する単一成分として移動した。
（３．モノクローナル抗体）
Ｂ２１−２（ＴＩＢ−２２９）ハイブリドーマおよびＳＦＲ８−Ｂ６ハイブリ
ドーマ（ＨＢ−１５２、以下ＳＦＲ８と称する）を、ＡＴＣＣから得た。両方の
ハイブリドーマは、ラットＩｇＧ２ｂ抗体を分泌し、これを培養上清からプロテ
インＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Ｂ２１−２抗体は、
Ａ−２０細胞ならびにＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス中に増殖したＣ１３００
（Ｍｕγ）トランスフェクタント腫瘍の血管系上に発現されるＩ−Ａｄ抗原と反
応する。ＳＦＲ８抗体は、ＨＬＡ−Ｂｗ６エピトープに対して指向し、そしてＢ
２１−２抗体に対するイソタイプのマッチしたネガティブコントロールとして供
する。
ＴＦ９／１０Ｈ１０（１０Ｈ１０と称する）であるマウスＩｇＧ１は、ＴＦ／
第ＶＩＩａ因子活性を妨害することなくヒトＴＦと反応性であり、そしてＭｏｒ
ｒｉｓｓｅｙら（１９８８）に記載のように産生した。
細胞株ＭＲＣ ＯＸ７（ＯＸ７と称する）を、Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士
（ＭＲＣ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ，Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から得た。こ
れは、Ｔリンパ球上のＴｈｙ １．１抗原を認識する、マウスＩｇＧ１抗体ＯＸ
７抗体を分泌した。これを、ＴＦ９／１０Ｈ１０に対するネガティブコントロー
ルにマッチしたイソタイプとして用いた。
全ての抗体を、培養上清からプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。
（４．二重特異性抗体の合成）
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、それぞれのＩｇＧを２％（ｗ／ｖ）ペプシン
で３７℃にて５〜９時間消化し、そしてフラグメントをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１
００クロマトグラフィーにより精製することにより得た。二重特異性抗体Ｂ２１
−２／１０Ｈ１０、ＳＦＲ８／１０Ｈ１０、およびＢ２１−２／ＯＸ７の合成を
、微小な改変を加えたＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）の方法に従って実行した。
二重特異性抗体Ｂ２１−２／１０Ｈ１０、ＳＦＲ８／１０Ｈ１０、ＯＸ７／１
０Ｈ１０、およびＢ２１−２／ＯＸ７を、微小な改変を加えたＢｒｅｎｎａｎら
（１９８５）の方法に従って合成した。簡略には、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント
を、ＩｇＧ抗体からペプシンでの消化により得、そしてクロマトグラフィーＳｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ１００により均一に精製した。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを
、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＢＳＥ緩衝液）および９ｍＭ ＮａＡｓＯ２を含有する
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中の５ｍＭ ２−メルカプトエ
タノールを用いて２０℃にて１６時間還元した。Ｅｌｌｍａｎ試薬（ＥＲ）を、
２５ｍＭの最終濃度になるように添加し、２０℃にて３時間後、Ｅｌｌｍａｎ誘
導Ｆａｂ’フラグメント（Ｆａｂ’−ＥＲ）を、ＰＢＳＥにおいてＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ２５のカラム条で未反応ＥＲから分離した。
二重特異性抗体を形成させるために、１つの抗体に由来するＦａｂ’−ＥＲを
、限外濾過セル中に約２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして１０ｍＭ ２−メル
カプトエタノールを用いて２０℃にて１時間還元した。得られたＦａｂ’−ＳＨ
をＰＢＳＥにおいてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５のカラムを通して濾過し、そして
第２の抗体から調製した等モル量のＦａｂ’−ＥＲと混合した。混合物を、限外
濾過により約３ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして２０℃にて１６時間撹拌した。反
応産物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００のカラムで分画し、そして二重特異性抗体
（１１０ｋＤａ）を含有する画分を１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そして０．０２％ア
ジ化ナトリウム中で４℃にて貯蔵した。
（Ｂ．結果）
（１．二重特異性抗体の分析）
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび二重特異性調製物の分子量を、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ−Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる４〜１５％グラジエントゲルでのＳＤＳ−
Ｐａｇｅ電気泳動により決定した。二重特異性ならびにホモダイマー対ヘテロダ
イマーの％を、ＦＡＣＳ分析により決定した（実施例ＩＩ）。
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動による（およびＦＡＣＳ、実施例ＩＩによる）二重
特異性抗体の分析は、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０ 二重特異性が、いずれかの起源
の４％未満のホモダイマーおよび１４０ｋＤまたは５５ｋＤの分子量を有する、
＜１０％フラグメントを含有することを示した。調製物の約１０％は、おそらく
（いずれかの起源の）超軽鎖と付着したＦ（ａｂ’）２構築物である１４０ｋＤ
フラグメントよりなった。
（実施例ＩＩ）
（凝固抗体結合およびインビトロでの機能）
本実施例は、凝固抗体（コアギュリガンド）の二重特異性を示し、そして特異
的結合、細胞送逹、および凝固がコアギュリガンドを用いてインビトロで達成さ
れることを示す。
（Ａ．材料および方法）
（１．細胞）
Ａ２０細胞株（これは、Ｉ−ＡｄポジティブＢＡＬＢ／ｃ Ｂ細胞リンパ腫で
ある）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，ＭＤ；ＴＩＢ−２０８）から購入した。Ａ２０細胞を、１０％（ｖ／ｖ
）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、０．２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２００単位／ｍｌペ
ニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１８ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、
０．１ｍＭ非必須アミノ酸混合物、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充し
たＤＭＥＭ（この培地を、以下完全ＤＭＥＭ培地と称する；全ての試薬をＬｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤから得た）中で
増殖させた。２−ＭＥを、Ａ２０細胞に対して０．０６４ｍＭの最終濃度で完全
ＤＭＥＭに添加する。培養物を、９０％空気／１０％ＣＯ２の加湿雰囲気中にお
いて３７℃にて維持した。
Ｊ８２（ＴＦを発現するヒト胆嚢ガン）を、ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−１）から得た
。細胞は、完全ＤＭＥＭ中で付着して増殖した。
Ｃ１３００神経膠腫細胞株を、自然発症腫瘍（これは、Ａ／Ｊａｘマウス（Ｄ
ｕｎｈａｍ＆Ｓｔｅｗａｒｔ，１９５３）中で生じた）から樹立した。Ｃ１３０
０（Ｍｕγ）１２株（以下、Ｃ１３００（Ｍｕγ）と称する）は、ＩＦＮ−γ発
現レトロウイルスｐＳＶＸ（Ｍｕγ ΔＡｓ）（Ｗａｔａｎｂｅら，１９８９）
を用いるマウスＩＦＮ−−γ遺伝子を有するＣ１３００神経膠腫細胞のトランス
フェクションに由来した。ＩＦＮ−γ発現レトロウイルスを、Ｄｒ．Ｙ．Ｗａｔ
ａｎａｂｅ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）から得た。
Ｃ１３００（Ｍｕγ）１２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
、２．４ｍＭ Ｌ−グルタミン、２００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍ
ｌストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ酸、１μＭピルビン酸ナトリウ
ム、１８μＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉ
ｎ；Ｓｉｇｍａ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ
）中で維持した。培養物を、９０％空気／１０％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃
にて維持した。
Ｔｈｙ １．１−発現ＡＫＲ−ＡマウスＴリンパ球細胞株を、Ｄｒ．Ｉ．Ｍａ
ｃＬｅｎｎａｎ教授（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｉｒ
ｍｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から得て、そして完全ＤＭＥＭ中で増殖させ
た。
（２．間接的免疫蛍光）
Ａ２０細胞を、ＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０２％ Ｎａ−アジド（以下
、ＦＡＣＳ緩衝液と称する）中に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。Ｊ８２細
胞を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ（０．２％ ｗ／ｖ）を用いてフラスコから穏やかな条
件下で放出させ、そしてＦＡＣＳ緩衝液中に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した
。５０μｌの細胞懸濁物を、丸底９６ウェルプレートのウェル中の１次抗体の５
０μｌの適切な系列希釈物に添加した。室温にて１５分間のインキュベーション
後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後の上清を除去した後、ＦＡＣ
Ｓ緩衝液中で１対２０希釈でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に
結合させた５０μｌの２次抗体を細胞に添加した。細胞を、さらに１５分間室温
にてインキュベートし、そしてＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。フルオレセイン
と会合した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｆｕ
ｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で測定した。データを、Ｌｙｓｉｓ ＩＩプログラムを
用いて分析した。ＦＩＴＣ−抗−ラットイムノグロブリンを２次抗体として用い
た場合、正常なマウス血清（１０％ ｖ／ｖ）を、マウス細胞との非特異的交差
反応をブロックするために添加した。
（３．タンパク質の放射性標識）
タンパク質を、ＭａｓｏｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９８０）、（プロトコ
ル２）により記載されるクロラミンＴプロトコルに従って１２５ヨウ素を用いて
標識した。ヨウ素化産物をＧ２５で精製し、そしてモノクローナルフラグメント
の場合は５％ ＤＭＳＯおよび５ｍｇ／ｍｌウシＩｇＧの存在下で、そしてｔＴ
Ｆの場合は５％ ＤＭＳＯおよび５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡの存在下で−７０℃にて
貯蔵した。比活性は、２．５μＣｉ／μｇと４．８μＣｉ／μｇとの間の範囲で
あった。
（４．結合研究）
ヒトｔＴＦを、ＭａｓｏｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９８０）により記載さ
れるクロラミンＴ手順（プロトコル２）を用いて２．５〜４．８μＣｉ／μｇの
比活性まで１２５ヨウ素で標識した。２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび０．０２％ア
ジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中のＡ２０細胞の２×１０６細胞／ｍｌの懸濁
液を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに５０μｌの容量で分
配した。ウェルに、同じ緩衝液中に８〜０．０２μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたっ
て調製した２５μｌの二重特異性抗体を添加した。
同じ緩衝液中の２５μｌの８μｇ／ｍｌの１２５Ｉ−ｔＴＦを各ウェルに添加
し、モル過剰のｔＴＦを得た。プレートを振盪し、そして４℃にて１時間インキ
ュベートした。次いで、細胞を、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する０．９％（ｗ
／ｖ）ＮａＣｌを用いてプレート中で３回洗浄した。ウェルの内容物を、微小遠
心管中のジブチルフタレートおよびビス（２−エチルヘキシル）フタレート油の
１０：１１（ｖ／ｖ）混合物上にピペットした。チューブを７５００ｇにて１．
５分間遠心分離し、そして液体窒素中で瞬間凍結させた。細胞を含有するチップ
を、切り離した。細胞ペレット中および上清中の放射活性を、γカウンター中で
測定した。
（５．凝固アッセイ）
上記結合アッセイに用いられたマイクロプレートと同一のマイクロプレートを
、１２５Ｉ−ｔＴＦの代わりに非標識ｔＴＦを添加したことを除いて同じ条件で
設定した。４℃にて１時間インキュベーション後、細胞を前述のように３回洗浄
し、そして２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび１２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する７
５μｌの０．９％ ＮａＣｌに再懸濁した。ウェルの内容物を、５ｍｌ透明プラ
スチックチューブに移し、そして３７℃に暖めた。各チューブに、３０μｌのク
エン酸処理マウス血漿を３７℃にて添加した。最初のフィブリンストランドを形
成した時間を記録した。
（Ｂ．結果）
（１．抗体二重特異性）
ＳＦＲ８／１０Ｈ１０に関する二重特異性を、標的細胞としてのＪ２８細胞（
ＴＦポジティブ）および１０Ｈ１０の存在を示すためのＦＩＴＣ−抗−マウス免
疫グロブリンを用いてＦＡＣＳにより示した。ＦＩＴＣ−抗−ラットイムノグロ
ブリンを用いてＳＦＲ８の存在を示した。平均蛍光強度−対−濃度曲線は、両方
の株の一致した。これは、マウスおよびラットの両方のアームが二重特異性調製
物中に存在することを示す。
（２．抗体結合）
１２５ヨウ素標識Ｂ２１−２ Ｆａｂ’およびＳＦＲ８ Ｆａｂ’を用いる結
合研究は、Ａ２０細胞に対するＢ２１−２ Ｆａｂ’の結合の飽和に達するする
濃度が２１．５ｎＭであることを示した。ＳＦＲ８ Ｆａｂ’は、２１．５ｎＭ
では、Ｂ２１−２ Ｆａｂ’については細胞あたり５３０，０００分子であるの
に対して、細胞あたり５０，０００未満の分子数でＡ２０細胞に非特異的に結合
した。
（３．コアギュラント送逹および拘束）
コントロールの二重特異性抗体と比較した、ｔＴＦをＢ２１−２／１０Ｈ１０
二重特異性抗体を媒介してＡ２０細胞に架橋させる能力を研究するために、Ａ
２０細胞を、示すような濃度範囲の二重特異性抗体および１２５Ｉ−ｔＴＦとと
もにインキュベートした。飽和は、１０ｎＭ（１μｇ／ｍｌ）以上の二重特異性
抗体の濃度で達成され、この時、平均３１０，０００分子のｔＴＦが各Ａ２０細
胞に結合した。結合は特異的であった。なぜなら、ｔＴＦ結合が、イソタイプに
マッチするコントロールの二重特異性抗体（ＳＦＲ８／１０Ｈ１０またはＢ２１
−２／ＯＸ７）のいずれにも媒介されなかったからである。これらの抗体は、ｔ
ＴＦを拘束するために必要とされる２つの特性のうちの１つのみを有する（図１
）。
（４．凝固）
二重特異性抗体によりＡ２０細胞に結合しているｔＴＦが、凝固を誘導し得る
か否かを調査するために、本発明者らは、まず第１に、Ａ２０細胞を２１．５ｎ
Ｍ 二重特異性抗体および６９ｎＭ ｔＴＦとともにインキュベートした。得ら
れた凝固時間に対する影響を、表ＶＩＩに示す。これらの第１の研究は、Ｂ２１
−２／１０Ｈ１０およびｔＴＦの複合体でコートされたＡ２０細胞が、フィブリ
ン形成を誘導し得ることを示した：これは、凝固時間を、１４０秒（用いられる
特定の条件下で添加される抗体またはＴＦの非存在下で凝固するＣａＣｌ２中の
マウス血漿についての時間）から６０秒に短縮した。対照的に、コントロールの
二重特異性抗体は、凝固の活性化を誘導しなかった：これらの場合では、凝固時
間は、１４０秒であった。
後の研究は、最初の研究の結果を確認および拡張した。ｔＴＦがＢ２１−２／
１０Ｈ１０で拘束されているＡ２０細胞にマウス血漿を添加すると、迅速に凝集
した。フィブリンストランドは、非処理Ａ２０細胞へ添加される血漿中における
１６４秒と比較して血漿添加の３６秒後に見られた（表ＶＩＩ）。ｔＴＦが細胞
に拘束されている場合にのみ凝固が誘導される：ｔＴＦ単独、ホモダイマーＦ（
ａｂ’）２、Ｆａｂ’フラグメント、またはｔＴＦの拘束に必要な２つの特性の
うち１つしか有さない二重特異性抗体とともにインキュベートした細胞について
は、凝固時間における影響は見られなかった。
各Ａ２０細胞に拘束されたｔＴＦ分子の平均数のｌｏｇとマウス血漿の凝固を
誘導した細胞についての速度との間には、直線関係が存在した（図２）。細胞あ
たり３００，０００分子のｔＴＦを有する細胞は４０秒で凝固を誘導したが、細
胞あたり２０，０００分子を有する細胞でさえも凝固は非処理細胞（１９０秒）
についてよりも有意に速かった（１４０秒）。
Figure 2009298805
 １二重特異性抗体であるＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ’フラグメント（０．３３
μｇ／１０５細胞／１００μｌ）ならびにｔＴＦ（０．１７μｇ／１０５細胞／
１００μｌ）を、Ａ２０細胞とともに４℃にて１時間、０．２％ ｗ／ｖアジ化
ナトリウム中でインキュベートした。細胞を洗浄し、３７℃に加温し、カルシウ
ムおよび血漿を添加し、そして第１のフィブリンストランドが形成される時間を
記録した。
２３連測定の相加平均±標準偏差
（実施例ＩＩＩ）
（インビボでの特定腫瘍脈管系特異的凝固）
本実施例は、ヒト組織因子に対する送逹ビヒクルとしての二重特異性抗体コア
ギュリガンドの投与後にもたらされる腫瘍脈管系のインビボでの特異的凝固を記
載する。
（Ａ．材料および方法）
（１．試薬）
マウス血液を心臓穿刺により得、そして３．８％緩衝化クエン酸の１／１０容
量に回収した。血液を３０００ｇにて１０分間遠心分離し、そして血漿を少量で
瞬間凍結し、そして−７０℃にて貯蔵した。
（２．動物）
ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ
）から得て、そしてＳＰＦ条件下で維持した。
（３．Ｃ１３００（Ｍｕγ）マウスモデルおよび処理）
腫瘍モデルは、３つの改良を加えた以外は、以前に記載された（Ｂｕｒｒｏｗ
ｓら、１９９２；Ｂｕｒｒｏｗｓ＆Ｔｈｏｒｐｅ，１９９３）通りであった。第
１に、異なる抗体であるＢ２１−２を用いた。この抗体は、両方の分子を認識す
る、以前に用いたＭ５／１１４抗体とは異なり、Ｉ−Ａｄを認識するが、Ｉ−Ｅ
ｄを認識しない。Ｂ２１−２抗体は、Ｍ５／１１４よりも約１０培良好な親和性
を有する。第２に、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて連続的に増殖する
、以前に用いたＣ１３００（Ｍｕγ）１２株のサブ株を用いた。以前に用いたＣ
１３００（Ｍｕγ）１２細胞は、連続的に増殖する腫瘍を形成させるために非感
染Ｃ１３００細胞と混合しなければならなかった。Ｃ１３００（Ｍｕγ）ｔ１Ｐ
３と称する新しいサブ株を、以下ではＣ１３００（Ｍｕγ）という。第３に、腸
内細菌が胃腸内上皮においてＩ−Ａｄを誘導することを防止するために、マウス
の飲料水中にテトラサイクリンを添加することは不必要であった。イムノトキシ
ンとは異なり、コアギュリガンドは、Ｉ−Ａｄ発現胃腸上皮を損傷しない。
固形腫瘍の確立のために、１．５×１０７ Ｃ１３００（Ｍｕγ）細胞を、Ｂ
ＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹中に皮下的に注射した。腫瘍が直径０．
８ｃｍまで増殖したら、マウスをランダムにそれぞれ７〜８匹のマウスを含む異
なる処置グループに割り当てた。
コアギュリガンドを、総容量２．５ｍｌの０．９％ ＮａＣｌ中に二重特異性
抗体（１４０μｇ）およびｔＴＦ（１１０μｇ）を混合し、そしてこれらを４℃
にて１時間放置することにより調製した。次いで、マウスにこの混合物（すなわ
ち、１４μｇの二重特異性抗体および１１μｇのｔＴＦ）０．２５ｍｌの静脈内
注射を受けさせた。他のマウスは、１４μｇの二重特異性抗体単独、または１１
μｇのｔＴＦ単独を受けた。この注射を、尾の静脈の１つに約４５秒間にわたっ
てゆっくりと行い、そして同じ静脈に２００μｌの第２の注射が続いた。この注
射手順は、マウスに急速に注入される場合（１〜２秒間）に見られる尾の静脈の
血栓を防ぐために適している。７日後、処置を繰り返した。
垂直腫瘍直径を、規則的な間隔をおいて測定し、そして腫瘍容量を、以下の式
に従って評価した：
容量＝短径２×長径×π／６。
腫瘍容量の差を、統計的有意さについて２つの独立サンプルについてＭａｎｎ
−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ非パラメトリック試験を用いて試験した（
Ｇｉｂｂｏｎｓ，１９７６）。
組織病理学的分析については、動物を、処置後にメトファンを種々の時間で用
いて麻酔し、そしてヘパリン処理生理食塩水を用いる潅流により放血した。５０
０ＩＵのヘパリンをｉ．ｖ．注射し、動物をメトファンで麻酔し、そして肝臓か
ら血液が一掃されるまで０．６ｍｌ／分の流速でＰＢＳを用いて全身の循環を潅
流した。腫瘍および正常な組織を取り出し、そしてホルマリン固定した（４％
ｖ／ｖ）。組織のパラフィン切片を切断し、そしてフィブリンの検出のために標
準的なＭａｒｔｉｕｓ Ｓｃａｒｌｅｔ Ｂｌｕｅ（ＭＳＢ）トリクロム技術を
用いて、ならびに細胞形態学のためにヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染
色した。
（Ｂ．結果）
（１．改良腫瘍モデル）
前記のＣ１３００（Ｍｕγ）腫瘍モデル（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２）を改
良するために、本発明者らは、Ｃ１３００（Ｍｕγ）細胞株を、その親細胞であ
るＣ１３００と混合することなく増殖し得るが、腫瘍の内皮細胞上でＩ−Ａｄ
ＭＨＣ ＩＩクラス抗原をいまだ発現し得る細胞株にサブクローン化した。本発
明者らは、ＦＡＣＳにより測定されるように、このモデルに使用される初期の抗
Ｉ−Ａｄ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２）よりも、その抗原に対して５倍〜１０
倍高い親和性を有する抗Ｉ−Ａｄ抗体（Ｂ２１−２）を使用した。この新規抗Ｉ
−Ａｄ抗体を用いるインビボ分布研究は、Ｍ５／１１４．１５．２が示したのと
同一の組織分布パターンを示した。Ｂ２１−２を用いる濃い染色は、腫瘍血管内
皮において見られ、薄い染色から中程度の染色は、肝臓中のクッパー細胞、脾臓
中の周辺帯ならびに小腸および大腸のいくつかの領域に見られた。他の正常組織
中の血管は、染色されなかった。
（２．適切なインビボ用量の決定）
マウスの尾静脈に静脈内注射された最大耐性用量は、１６μｇのＢ２１−２／
１０Ｈ１０プラス１１μｇのｔＴＦであった。この用量で、マウスは体重が減少
せず、正常な外観および活動レベルを有していた。２０μｇのＢ２１−２／１０
Ｈ１０プラス１６μｇのｔＴＦのより高い用量では、１０匹のマウスのうち２匹
が、最終的には消散する局所的皮膚出血を発生した。より低い用量を、インビボ
研究に採用した。静脈内で与えられた短縮型ＴＦ自体は、５０μｇで無毒であっ
た。
（３．腫瘍血管系における特異的凝固および梗塞形成）
Ｂ２１−２／１０Ｈ１０（２０μｇ）およびｔＴＦ（１６μｇ）からなる凝固
リガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）の、固体Ｃ１３００（Ｍｕγ）腫瘍を有す
るマウスへの静脈内投与により、３０分以内に腫瘍は黒化した挫傷外観を生じた
。腫瘍内での現象の時間経過の組織学的研究は、凝固リガンドの注射３０分後、
腫瘍の全ての領域中の全ての血管が、血栓形成したことを示した（図３Ｂ）。血
管は、血小板凝集、パックされた赤血球およびフィブリンを含んでいた。この時
点で、腫瘍細胞は、健常であり、未処置マウスの腫瘍細胞と形態学的に区別でき
なかった（図３Ａ）。
４時間までに、腫瘍細胞の窮迫の徴候が明らかになった。腫瘍細胞の大部分は
、互いに分離し始め、そしてピクノーゼ核を発生した（図３Ｃ）。赤血球は、通
常、腫瘍間隙中に観察された。２４時間までに、腫瘍壊死の進行が腫瘍中で見ら
れた（図３Ｄ）。７２時間までに、腫瘍の中央領域全体が形態学的に不明瞭な壊
死組織片（ｄｅｂｒｉｓ）に凝集した。
試験した３つの腫瘍のうち１つにおいて、５〜１０細胞層厚の腫瘍細胞の生存
可能縁が、腫瘍の周辺で見られた。その周辺部で、腫瘍が周辺の正常組織に浸潤
していた。同一の腫瘍の連続切片の免疫組織学的検査は、腫瘍浸潤領域中の血管
がＩＩクラス抗原を欠いていたことを示した。
３０分または２４時間前にＢ２１−２／１０Ｈ１０二重特異性抗体（２０μｇ
）のみを受けたコントロールマウス由来の腫瘍は、梗塞形成の徴候を示さなかっ
た。ｔＴＦ（１６μｇ）のみ、あるいはＢ２１−２／ＯＸ７またはＳＦＲ８／１
０Ｈ１０との組み合わせを受けたマウス由来の腫瘍は、注射後３０分では梗塞形
成の徴候を示さなかったが、注射後２４時間では腫瘍中の偶発的な血管（全ての
血管の約２０％）が梗塞形成した。これらは、腫瘍の核において最も一般的であ
るようであった。
血栓または形態学的異常が、凝固リガンドまたはｔＴＦの投与の３０分後、４
時間後および２４時間後に腫瘍を有するマウスから取られた肝臓、腎臓、肺、腸
、心臓、脳、副腎、膵臓および脾臓のパラフィン切片において見られなかった。
（４．固形腫瘍の腫瘍退行）
図４は、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０およびｔＴＦからなる凝固リガンドを、直径
０．８ｃｍの腫瘍を有するマウスに投与した、代表的な抗腫瘍研究の結果を示す
。腫瘍は、それらの処置前サイズの約半分に退行した。７日目で処置を繰り返す
ことにより、腫瘍はさらに、通常は完全に退行した。７匹の動物のうち５匹にお
いて、完全な退行が得られた。２匹のマウスは、４か月後および６か月後に続い
て再発した。これらの抗腫瘍効果は、全ての他の群と比較した場合、統計学的に
高度に有意（Ｐ＜０．００１）である。
ｔＴＦのみ、またはイソ型が一致したコントロールの二重特異性抗体（ＳＦＲ
８／１０Ｈ１０またはＢ２１−２／ＯＸ７）と混合したｔＴＦで処置したマウス
の腫瘍は、抗体または希釈剤のみを受ける群の腫瘍よりも、よりゆっくり増殖し
た。これらの違いは、１２日〜１４日で統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であっ
た。従って、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０凝固リガンドで見られた抗腫瘍効果の一部
は、ｔＴＦ自体のわずかな非特異的作用のためである。
研究の最後で、希釈剤のみで処置し、そして２．０ｃｍ３および２．７ｃｍ３
の非常に大きな腫瘍（すなわち、体重の１０％〜１５％）を有した２匹のマウス
に、凝固リガンド治療を行った。両方とも、完全な緩解を有したが、それらの腫
瘍はその後、腫瘍増殖の元の部位で再増殖した。
（Ｃ．議論）
本研究は、凝固を誘導する能力を事実上有しない可溶性ヒトｔＴＦが、腫瘍内
皮細胞に対して二重特異性抗体により標的化される場合、腫瘍血管系に対して強
力なトロンボゲンとなることを示す。インビトロ凝固の研究は、ｔＴＦの血栓活
性の修復が、細胞表面上の抗原への架橋を介して仲介されることを示した。
ｔＴＦは、高親和性を有する第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子を結合し、そ
してＶＩＩａの触媒活性を高めるが、血漿の凝固を誘導しない。なぜなら、ｔＴ
Ｆ：ＶＩＩａ複合体は、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の効率的な活性化のために膜
表面と会合しなければならないからである（Ｒｕｆら、１９９１；Ｋｒｉｓｈｎ
ａｓｗａｍｙら、１９９２）。二重特異性抗体によるｔＴＦ：ＶＩＩａの細胞表
面への連結は、ｔＴＦ：ＶＩＩａを膜の極近くに近接させることにより凝固を誘
導する能力を修復する：膜リン脂質は、第ＩＸ因子または第Ｘ因子との凝固開始
複合体が、凝固プロセスにおいて中間体を組立て、そして効率的に生成し得る表
面を提供する。
ＩＩクラスに対する凝固リガンドの、ＩＩクラスを発現する血管系を有する腫
瘍を有するマウスへの投与は、腫瘍中の血管の急速な血栓症を引き起こした。こ
れに引き続き、大部分の動物における腫瘍の梗塞および完全な腫瘍退行があった
。完全な退行が得られなかった動物において、腫瘍は、腫瘍が周囲の正常組織に
浸潤した腫瘍周辺部の腫瘍細胞の生存縁から再増殖した。腫瘍の増殖端での血管
は、ＩＩクラス抗原を欠いていた。従って、凝固リガンドによるこれらの血管の
血栓症がないことを説明する。これらの生存細胞は、既に見出されているように
（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９３）、腫瘍細胞自体に作用する薬
物を同時投与することにより死滅され得るようである。
凝固リガンドの抗腫瘍効果は、抗ＩＩクラス抗体および脱グリコシル化リシン
Ａ鎖からなるイムノトキシンを用いる同一の腫瘍モデルにおいて得られる効果（
ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９３）と類似の大きさであった。２つ
の薬剤間の１つの違いは、作用の速度である。凝固リガンドは、３０分未満で腫
瘍血管の血栓症を誘導する。一方、イムノトキシンは同様の効果を達成するのに
６時間要した。イムノトキシンはよりゆっくり作用する。なぜなら、血栓症は、
タンパク質合成の閉鎖により生じる内皮細胞損傷に対して二次的であるからであ
る。
イムノトキシンと凝固リガンドとの間の第２の重要な違いは、それらが異なる
毒性の副作用を有することである。イムノトキシンは、抗生物質を与えて、腸内
細菌によるＩＩクラス誘導を抑制しない限り、ＩＩクラス発現の胃腸上皮の致死
破壊を生じた。凝固リガンドは、血液を除いて凝固因子が存在しないことから予
想されるように胃腸損傷を生じなかったが、高用量で投与された場合に、いくつ
かのマウスにおいて凝固障害を生じた。
本報告に記載される知見は、ヒト凝固誘導タンパク質を腫瘍血管系に対して標
的化する治療能力を示す。臨床適用のため、抗体または他のリガンドは、固形腫
瘍の血管内皮細胞の表面に存在するが、正常組織の内皮細胞に存在しない分子に
結合することが必要とされる。腫瘍内皮マーカーは、腫瘍由来血管形成因子（Ｆ
ｏｌｋｍａｎ、１９８５）またはサイトカイン（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９１；
Ｒｕｃｏら、１９９０）により直接誘導され得るか、あるいは新血管形成中の内
皮細胞の急速な増殖（ＤｅｎｅｋａｍｐおよびＨｏｂｓｏｎ、１９８２）および
転移（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９８５）に関し得る。
いくつかの候補抗体が記載されている。エンドグリンに対する抗体であるＴＥ
Ｃ−１１は、ヒト腫瘍内皮細胞に選択的に結合する特定の例である。
他の抗体として、エンドシアリンに対するＦＢ５（Ｒｅｔｔｉｇら、１９９２
）、エンドグリン様分子に対するＥ−９（Ｗａｎｇら、１９９３）、フィブロネ
クチンのイソ型に対するＢＣ−１（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、１９８９）ならび
に骨肉腫関連抗原に対するＴＰ−１およびＴＰ−３（Ｂｒｕｌａｎｄら、１９８
８）が挙げられる。ＣＤ３４は、転移性内皮細胞および腫瘍および胎児組織にお
ける出芽性毛細管（ｂｕｄｄｉｎｇ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）のアルブミン（
ａｂｌｕｍｉｎａｌ）プロセスに対してアップレギュレートされることが報告さ
れている（Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９９０）。血管内皮細胞増殖因子（
ＶＥＧＦ）に対するレセプターは、おそらく低酸素症に応答して（Ｔｈｉｅｍｅ
ら、１９９５）腫瘍血管においてアップレギュレートされ（Ｐｌａｔｅら、１９
９３；Ｂｒｏｗｎら、１９９３）、そして腫瘍血管においてＶＥＧＦを選択的に
濃縮する（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１）。
凝固誘導タンパク質をこれらのおよび他の腫瘍内皮細胞マーカーに標的化する
ことによる腫瘍梗塞形成の誘導は、固形腫瘍の処置への価値のある新規アプロー
チとして提案される。専らヒト凝固リガンドを産生するために、ヒト（またはヒ
ト化）抗体のヒト凝固タンパク質への結合は、特に意図される。従って、与えら
れる処置過程を繰返すことにより、初期腫瘍およびその転移の両方と戦うことが
可能となる。
（実施例ＩＶ）
（短縮型組織因子（ｔＴＦ）構築物の合成）
ｔＴＦは、本明細書では成熟組織因子タンパク質の細胞外ドメイン（成熟タン
パク質のアミノ酸１〜２１９；配列番号２３）として示される。配列番号２３は
、例えば、配列番号２２によりコードされる。
（Ａ．Ｈ６［ｔＴＦ］）
Ｈ６ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ［ｔＴＦ］。ｔＴＦ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
を、以下のように調製した：Ｊ−８２細胞（ヒト膀胱ガン）由来のＲＮＡを、ｔ
ＴＦのクローニングのために使用した。全ＲＮＡを、ＧｌａｓｓＭａｘＴＭ Ｒ
ＮＡマイクロ単離試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて単離した。ＲＮＡを、Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてｃ
ＤＮＡに逆転写した。ｔＴＦ ｃＤＮＡを、同一キットを用いて以下の２つのプ
ライマーで増幅した：
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＴ ＣＡＧ Ｇ
ＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ（配列番号１）
３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ Ａ
ＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＴ（配列番号２）
下線を引いた配列は、ｔＴＦのＮ−末端をコードする。５’プライマー中の残
りの配列は、発現ベクターへのｔＴＦのクローニングを可能にするＮｃｏＩの制
限部位である。３’プライマー中の配列は、発現ベクターへのｔＴＦのクローニ
ングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位である。ＰＣＲ増幅を、製造者により提案され
るように実施した。簡潔に述べると、７５μＭ ｄＮＴＰ；０．６μＭプライマ
ー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用し、そして９５℃で３０秒、５５℃で３０秒
および７２℃で３０秒の３０サイクルを実施した。
Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターＨ６ ｐＱＥ−６０を、ｔＴＦを発現するために使
用した（Ｌｅｅら、１９９４）。ＰＣＲ増幅ｔＴＦ ｃＤＮＡを、ＮｃｏＩとＨ
ｉｎｄ３部位との間に挿入した。Ｈ６ ｐＱＥ−６０は、組込まれた（Ｈｉｓ）
６コード配列を有し、その結果発現タンパク質は、Ｎ−末端で（Ｈｉｓ）６配列
を有し、これはＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し得る。
ｔＴＦを精製するため、ｔＴＦ含有Ｈ６ ｐＱＥ−６０ ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＴＧ−１細胞に形質転換した。細胞をＯＤ６００＝０．５まで増殖し、そ
してＩＰＴＧを３０μＭまで添加し、ｔＴＦ産生を誘導した。３０℃で１８時間
振盪後、細胞を採集した。細胞ペレットを６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌ中で変性し、そし
て溶解液をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に載せた。結合ｔＴＦを６Ｍ尿
素で洗浄し、そしてｔＴＦを、室温で１６時間、６Ｍ〜１Ｍ尿素の勾配で再び折
り畳んだ（ｒｅｆｏｌｄ）。カラムを洗浄緩衝液（０．０５ ＮａＨ２ＰＯ４、
０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）で洗浄し、そしてｔＴＦを洗浄緩衝
液中の０．２Ｍイミドゾール（Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ）で溶出した。溶出したｔＴ
Ｆを濃縮し、そしてＧ−７５カラムに載せた。ｔＴＦ単量体を採取した。
（Ｂ．ｔＴＦ）
Ｇｌｙ［ｔＴＦ］。ＧｌｙｔＴＦ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＰＣＲにおい
て５’プライマーを以下のプライマーで置き換えたこと以外は前記セクションで
記載したのと同一の方法で調製した。
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ Ｃ
Ｔ（配列番号３）
下線を引いた配列は、ｔＴＦのＮ−末端をコードする。残りの配列は、Ｎｃｏ
Ｉの制限部位およびトロンビンの切断部位をコードする。
Ｈ６ ｐＱＥ−６０発現ベクターおよびタンパク質精製の手法は、最終タンパ
ク質生成物をトロンビンで処理してＨ６ペプチドを除去したこと以外は上記と同
一である。これを、１部のトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を５００部のｔＴＦ（ｗ／
ｗ）に添加することにより行い、そして切断を室温で１８時間実施した。混合物
をベンズアミジンセファロース６Ｂトロンビンアフィニティーカラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）に通すことにより、トロンビンをｔＴＦから除去した。
（Ｃ．システイン改変ｔＴＦＳ）
ｔＴＦ構築物を、Ｎ末端またはＣ末端システインで改変して、ジスルフィド結
合を介する誘導体化抗体への結合を容易にした。
Ｈ６ Ｃ［ｔＴＦ］。（Ｈｉｓ）６ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｃｙｓ−［ｔ
ＴＦ］。ＰＣＲにおいて５’プライマーを以下のプライマーで置き換えたこと以
外は前記セクションに記載のように、ＤＮＡを作製した。
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＣＴ Ｃ
ＡＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ ＣＴＧ ＴＧ（配列番号４）
すべての手法は、Ｎ−末端ｃｙｓを交換可能な酸化剤／還元剤で保護したこと
以外は、上記と同一であった。
Ｃ［ｔＴＦ］。Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ［ｔＴＦ２−２１９］。ＰＣＲにお
いて５’プライマーを以下のプライマーで置き換えたこと以外は前記セクション
に記載のように、ＤＮＡを作製した。
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ Ａ
ＴＡ ＣＴ（配列番号５）
ベクター構築物およびタンパク質精製は、上記のようにトロンビン処理を使用
して（Ｈｉｓ）６を除去したこと以外は、（Ｈｉｓ）６ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌ
ａ Ｃｙｓ ［ｔＴＦ］構築物について記載したのと同一である。
Ｈ６ ［ｔＴＦ］Ｃ。（Ｈｉｓ）６ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ ［ｔＴＦ］
Ｃｙｓ。３’プライマーを以下のプライマーで置き換えたこと以外は（Ｈｉｓ）
６ ＡＭＡ ［ｔＴＦ］セクションに記載と同一の方法で、ＤＮＡを作製した。
３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＧ ＣＡＴ ＴＣＴ Ｃ
ＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＴ（配列番号６）
下線を引いた配列は、ｔＴＦのＣ末端をコードする。残りの配列は、ｔＴＦを
発現ベクターにクローニングするためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。
全ての手法は、１０ｍＭ β−ＭＥを６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌ変性溶液中で使用し
、Ｃ末端システインを交換可能な酸化剤／還元剤で保護したこと以外はｔＴＦセ
クションに記載と同一であった。
他の［ｔＴＦ］ Ｃｙｓ単量体（例えば、［ｔＴＦ １−２２０］ Ｃｙｓ、
［ｔＴＦ １−２２１］ Ｃｙｓおよび［ｔＴＦ １−２２２］ Ｃｙｓ）もま
た、同一の方法論を用いて作製（および結合）する。
（Ｄ．Ｃリンカー［ｔＴＦ］）
Ｃリンカー［ｔＴＦ］であるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ
−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−［ｔＴＦ］もまた構築した。
ｃＤＮＡを、以下の２工程のＰＣＲ手法を用いて作製した：
ＰＣＲ１：リンカーＤＮＡの増幅
ＮｃｏＩ部位、トロンビン切断部位、システイン、リンカーおよびｔＴＦのＮ
末端をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを用いて増幅した：
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＣＧ ＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＣ
Ａ ＧＧＣ（配列番号７）
３’プライマー：５’ ＡＧＴ ＡＴＴ ＴＧＴ ＡＧＴ ＧＣＣ ＴＧＡ Ｇ
ＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＣＴ（配列番号８）
下線を引いた配列は、リンカーペプチドをコードする。ＰＣＲにおいて使用し
たＤＮＡテンプレートは、以下のリンカーをコードする二重鎖ＤＮＡであった。
配列：ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ Ｇ
ＧＴ ＡＧＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号９）
ｔＴＦセクションに記載と同一のＰＣＲ条件を用いた。９５ｂ．ｐ．増幅生成
物を、ＰＣＲ２においてｔＴＦ ＤＮＡに結合した。
ＰＣＲ２：ＣｙｓリンカーＤＮＡのｔＴＦ ＤＮＡへの結合。ＰＣＲに使用し
たＤＮＡテンプレートは、２つの重複ＤＮＡであった：上記のＰＣＲ１由来の９
５ｂ．ｐ．ＤＮＡおよびｔＴＦ ＤＮＡ。使用したプライマーは以下であった：
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧ（配列
番号１０）
３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ Ａ
ＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＴ（配列番号１１）
７４０ｂ．ｐ．の最終ＰＣＲ生成物を、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、そしてｔＴＦセクションに記載のようにＨ６ ｐＱＥ ６０に挿入した。
ベクター構築物およびタンパク質精製手法は、Ｃ［ｔＴＦ］セクションに記載
と全て同一である。
（実施例Ｖ）
（二量体組織因子の合成）
組織因子二量体が、凝固開始時に単量体よりも強力であり得ることを、本発明
者らは推論した。Ｊ８２膀胱ガン細胞の表面上の天然の組織因子が、二量体とし
て存在し得ることが可能である（Ｆａｉｒら、１９８７）。１つの第ＶＩＩ因子
または第ＶＩＩａ因子分子の１つの組織因子分子への結合はまた、別の第ＶＩＩ
因子または第ＶＩＩａ因子の別の組織因子への結合を促進し得る（Ｆａｉｒら、
１９８７；Ｂａｃｈら、１９８６）。さらに、組織因子は、サイトカインレセプ
ターファミリーのメンバーに対して構造的相同性を示し（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎら
、１９９１）、これらのいくつかは二量体化して活性レセプターを形成する（Ｄ
ａｖｉｅｓおよびＷｌｏｄａｗｅｒ、１９９５）。従って、本発明者らは以下の
ようにＴＦ二量体を合成した。
（Ａ．［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］）
構造Ｇｌｙ［ｔＴＦ］ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇ
ｌｙ）４ Ｓｅｒ ［ｔＴＦ］を有するＧｌｙ ［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］
を作製した。２つのＤＮＡ断片を、以下のように、別々にＰＣＲ増幅し、結合し
、そしてベクターに挿入した：
ＰＣＲ１：ｔＴＦおよびリンカーＤＮＡの５’半分の調製。ＰＣＲにおけるプ
ライマー配列は以下の通りである：
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ Ａ
ＴＡ ＣＴ（配列番号１２）
３’プライマー：５’ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ Ａ
ＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＴＴＣ Ｃ
ＣＣ ＴＴＴ ＣＴ（配列番号１３）
Ｇｌｙ［ｔＴＦ］ ＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用した。さらにＰＣ
Ｒ条件はｔＴＦセクションに記載の通りであった。
ＰＣＲ２：リンカーＤＮＡの３’半分およびｔＴＦ ＤＮＡの調製。ＰＣＲに
おけるプライマー配列は以下の通りであった：
５’プライマー：５’ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ Ｇ
ＧＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＧＴ（配列
番号１４）
３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ Ａ
ＡＴ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｔ（配列番号１５）。
ｔＴＦ ＤＮＡをＰＣＲにおいてテンプレートとして使用した。ＰＣＲ１由来
の生成物を、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨで消化した。ＰＣＲ２由来の生成物を、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で消化した。消化したＰＣＲ１ ＤＮＡおよびＰ
ＣＲ２ ＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化のＨ６ ｐＱＥ ６０
ＤＮＡと結合した。
ベクター構築物およびタンパク質精製のための手法は、Ｇｌｙ ［ｔＴＦ］セ
クションに記載と同一であった。
（Ｂ．Ｃｙｓ ［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］）
構造Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ ［ｔＴＦ ２−２１９］ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅ
ｒ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ ［ｔＴＦ］を有するＣｙｓ
［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］もまた構築した。ＤＮＡを、以下のプライマー
を用いてＰＣＲにより作製した：
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ Ａ
ＴＡ ＣＴ（配列番号１６）
３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ Ａ
ＡＴ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｔ（配列番号１７）
［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］ ＤＮＡをテンプレートとして使用した。残り
のＰＣＲ条件は、ｔＴＦセクションに記載と同一であった。ベクター構築物およ
びタンパク質精製は、全て、Ｈ６Ｃ［ｔＴＦ］の精製に記載の通りであった。
（Ｃ．［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］ ｃｙｓ）
タンパク質構造［ｔＴＦ］ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ
（Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ ［ｔＴＦ］ Ｃｙｓを有する［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴ
Ｆ］ ｃｙｓ二量体もまた作製した。ＤＮＡを、以下のプライマーを用いてＰＣ
Ｒにより作製した：
５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ ＣＴ（配列
番号１８）
３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＧ ＣＡＴ ＴＣＴ Ｃ
ＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｔ（配列番号１９）
［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］ ＤＮＡをテンプレートとして使用した。残り
のＰＣＲ条件は、ｔＴＦセクションに記載と同一であった。ベクター構築物およ
びタンパク質精製は、［ｔＴＦ］ ｃｙｓセクションの精製に記載のように再度
実施した。
（Ｄ．化学的結合二量体）
［ｔＴＦ］ Ｃｙｓ単量体を化学的に結合して、［ｔＴＦ］ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ
［ｔＴＦ］二量体を形成する。これを、室温で１時間、等モル量のＤＴＴを保
護した［ｔＴＦ］ Ｃｙｓに添加して脱保護し、そして［ｔＴＦ］ ＣｙｓのＣ
末端でシステインを曝すことにより行う。等モル量の保護した［ｔＴＦ］ Ｃｙ
ｓを、ＤＴＴ／［ｔＴＦ］ Ｃｙｓ混合物に添加し、そして室温で１８時間イン
キュベーションを続ける。二量体をＧ−７５ゲル濾過カラムで精製する。
Ｃｙｓ ［ｔＴＦ］単量体を、同一の方法を用いて化学的に結合して、二量体
を形成する。
（実施例ＶＩ）
（組織因子変異体の合成）
ｔＴＦ結合第ＶＩＩ因子を第ＶＩＩａ因子に変換する能力を欠く２つのｔＴＦ
変異体を記載する。第ＶＩＩ因子と比較して、血漿中に第ＶＩＩａ因子は３００
倍少なく存在する（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、１９９３）。従って、循環性の変異
体ｔＴＦは、凝固をほとんど開始し得ず、それゆえ非常に低い毒性を示す。凝固
リガンドにおいて、一旦変異体ｔＴＦが結合抗体を介して腫瘍部位に局所化する
と、第ＶＩＩａ因子が注入されてｔＴＦ結合第ＶＩＩ因子と交換する。変異体は
、第ＶＩＩａ因子の存在下で活性である。
（Ａ．［ｔＴＦ］Ｇ１６４Ａ）
「［ｔＴＦ］Ｇ１６４Ａ」は、Ａｌａにより置換されたｔＴＦのアミノ酸１６
４（Ｇｌｙ）を有する変異体タンパク質構造を有する。Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ二重
鎖部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、変異体の生成に使用
する。ＤＮＡテンプレートはＧｌｙ［ｔＴＦ］ ＤＮＡであり、そして変異誘発
プライマーの配列は以下である：
５’ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＡＡＣ（配列番号２０）
上記のベクター構築物およびタンパク質精製手法を、Ｇｌｙ［ｔＴＦ］の精製
に使用する。
（Ｂ．［ｔＴＦ］ Ｗ１５８Ｒ Ｓ１６２Ａ）
［ｔＴＦ］Ｗ１５８Ｒ Ｓ１６２Ａは、ｔＴＦのアミノ酸１５８（Ｔｒｐ）が
Ａｒｇで置換され、そしてアミノ酸１６２（Ｓｅｒ）がＡｌａで置換されている
二重変異体である。［ｔＴＦ］ Ｇ１６４Ａについての記載と同一の変異誘発方
法を使用する。変異誘発プライマーは以下である：
５’ ＡＣＡ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＡＴ ＣＧＧ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＣＡ
ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＡＧ（配列番号２１）
前記ベクター構築物およびタンパク質精製手法を、Ｇｌｙ［ｔＴＦ］の精製に
使用する。
（実施例ＶＩＩ）
（組織因子接合体の合成）
（Ａ．化学的誘導体化および抗体結合）
抗体ｔＴＦ接合体を、ジスルフィド結合を介して、化学的に誘導体化した抗体
を化学的に誘導体化したｔＴＦに結合することにより合成した（図５に例示する
ように）。
抗体を５倍モル過剰のスクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル α−
（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）と室温で１時間反応させて、抗体
１分子あたり平均２個のピリジルジスルフィド基を有する誘導体化抗体を得た。
誘導体化抗体を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより精製した。
抗体に対して２．５倍モル過剰のｔＴＦを、４５倍モル過剰の２−イミノチオ
ラン（２ＩＴ）と室温で１時間反応させて、ｔＴＦ１分子あたり平均１．５個の
スルフヒドリル基を有するｔＴＦを得た。誘導体化ｔＴＦもまた、ゲルパーミエ
ーションクロマトグラフィーにより精製し、そして直ちに誘導体化抗体と混合し
た。
混合物を放置して室温で７２時間反応させ、次いでＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
３００カラムに添加して抗体−ｔＴＦ接合体を遊離ｔＴＦおよび遊離したピリジ
ン−２−チオンから分離した。接合体を、抗ｔＴＦカラムのアフィニティークロ
マトグラフィーにより遊離抗体から分離した。最終接合体生成物の優勢な分子種
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価されるように、より少量の多置換接合体（Ｍｒ
約２０２，０００以下）を有する単置換抗体−ｔＴＦ接合体（Ｍｒ 約１７６
，０００）であった。
（Ｂ．システイン改変ｔＴＦの誘導体化抗体への結合）
抗体−Ｃ［ＴＦ］および［ｔＴＦ］Ｃ接合体を、ジスルフィド結合を介して、
システイン改変ｔＴＦを化学的に誘導体化した抗体に直接結合することにより合
成した（図５に例示するように）。
抗体を、１２倍モル過剰の２ＩＴと室温で１時間反応させて、抗体１分子あた
り平均１．５個のスルフヒドリル基を有する誘導体化抗体を得た。誘導体化抗体
をゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより精製し、そして直ちに２倍モ
ル過剰のシステイン改変ｔＴＦと混合した。混合物を放置して室温で２４時間反
応させ、次いで接合体を、上記のようにゲルパーミエーションクロマトグラフィ
ーおよびアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
最終接合体の優勢な分子種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価されるように、よ
り少量の多置換接合体（Ｍｒ 約２０２，０００以下）を有する単置換接合体（
Ｍｒ 約１７６，０００）であった。
（Ｃ．システイン改変ｔＴＦのＦａｂ’フラグメントへの結合）
抗体 Ｆａｂ’−Ｃ［ｔＴＦ］および［ｔＴＦ］Ｃ接合体を調製する。このよ
うな接合体は、インビボにおいてより強力であり得る。なぜなら、このような接
合体は、制限された内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能により、２価
接合体よりも長く細胞表面上に残存するからである。Ｆａｂ’フラグメントを、
２倍モル過剰のシステイン改変ｔＴＦと２４時間混合し、次いで接合体を、上記
のようにゲルパーミエーションクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製する。
（Ｄ．ｔＴＦ接合体の凝固活性）
ｔＴＦ接合体を、Ａ２０細胞に対する表面上で発現されるＩＩクラス抗原に結
合するＢ２１−２モノクローナル抗体を用いて調製した。接合体を、化学的に誘
導体化したｔＴＦおよびシステイン改変ｔＴＦを用いて調製し、そしてＣａＣｌ
２中のマウス血漿を凝固する接合体の能力を、Ａ２０細胞の表面への結合後測定
した。
両方のＢ２１−２接合体は、用量依存様式で、ＣａＣｌ２中のマウス血漿（コ
ントロール）の凝固時間を短縮した。ｔＴＦ接合体は、二重特異性抗体Ｂ２１−
２／１０Ｈ１０を用いて、Ａ２０細胞の表面にｔＴＦを連結した場合に生じるの
と同様の凝固促進を示した（図６）。
（Ｅ．抗腫瘍細胞ｔＴＦ接合体）
ｔＴＦが腫瘍血管内皮細胞に標的化される場合、ｔＴＦが腫瘍血管内で凝固を
誘導することが既に確立されている（実施例Ｉ〜ＩＩＩ）。本発明者らは、ｔＴ
Ｆが腫瘍細胞の表面に標的化される場合、凝固が腫瘍血管内で誘導されることを
意図した。
３つの抗腫瘍細胞抗体（ＫＳ１／４、Ｄ６１２、およびＸＭＭＣＯ−７９１）
を、上記の「ｔＴＦ接合体の調製」セクションに記載のようにｔＴＦに結合した
。ＫＳ１／４を、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａのＤｒ．Ｒ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄから得た。そしてこれは米国特許
第４，９７５，３６９号にも記載されている；Ｄ６１２は、ＮＣＩ、Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭａｒｙｌａｎｄのＤｒ．Ｊ．Ｓｃｈｌｏｍから得、米
国特許第５，１８３，７５６号に記載されており、そしてＡＴＣＣハイブリドー
マ細胞株アクセション番号ＨＢ ９７９６由来の培養上澄みから得られ得る；Ｘ
ＭＭＣＯ−７９１は、ＡＴＣＣから購入したハイブリドーマ細胞株由来の組織培
養上澄みから精製した。
ヒト結腸ガン細胞株Ｗｉｄｒを、ＫＳ１／４に対する標的細胞として使用した
。Ｗｉｄｒ細胞をＡＴＣＣから購入し、そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、
Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ中、空気において１０％（ｖ
／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で維持した。ヒト結腸ガン細胞株ＬＳ１４７Ｔを、Ｄ６１
２に対する標的細胞として使用した。ＬＳ１４７Ｔ細胞をＡＴＣＣから購入し、
そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充し
たＲＰＭＩ中、空気において５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で維持した。ヒトの
非小細胞肺ガン細胞株Ｈ４６０を、ＸＭＭＣＯ−７９１に対する標的細胞として
使用した。Ｈ４６０細胞を、Ｄｒ．Ａｄｉ Ｇａｚｄａｒ、Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕ
ｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａ
ｓから得、そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物
質を補充したＤＭＥＭ中、空気において１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で維持
した。３つの細胞株は全て、付着性単層として増殖した。
接合体を、関連の標的抗原を発現する腫瘍細胞に結合した場合、ＣａＣｌ２中
のマウス血漿の凝固時間を増大する能力について試験した。腫瘍細胞を、ＰＢＳ
中の０．０５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡを用いて組織培養フラスコから取り出した。
細胞を、ＴＦ９−６Ｂ４およびＴＦ８−５Ｇ９抗体でプレインキュベートして任
意の天然の組織因子活性を中和し（Ｍｏｒｒｉｓｅｙら、１９８８）、次いで凝
固アッセイをＡ２０細胞について記載の通りに実施した。
全ての３つの接合体は、標的細胞株に結合した場合、用量依存様式で、ＣａＣ
ｌ２中のマウス血漿（コントロール）の凝固時間を短縮した（図７）。これは、
ｔＴＦが細胞表面に標的化された場合、凝固が腫瘍細胞の表面で加速されたこと
を示す。
（実施例ＶＩＩＩ）
（組織因子プロドラッグの合成）
例示的なｔＴＦプロドラッグは以下の構造を有する：ｔＴＦ１−２１９
（Ｘ）ｎ１（Ｙ）ｎ２Ｚリガンド、ここでｔＴＦ１−２１９は、サイトゾルドメインお
よび膜貫通ドメインを除いたＴＦを表し；Ｘは、長さｎ１のアミノ酸（ＡＡ）の
疎水性膜貫通ドメイン（１−２０ ＡＡ）を表し；Ｙは、長さｎ２のＡＡの親水
性プロテアーゼ認識配列（適切なプロテアーゼ認識を確実にするに十分なＡＡ）
を表し；Ｚは、ジスルフィドチオエステルまたは他の結合基（例えば、（Ｃｙｓ
）１−２）を表し；リガンドは、腫瘍細胞、腫瘍ＥＣ、結合組織（支質）または
基底膜マーカーを認識する抗体または他の標的化部分を表す。
ｔＴＦプロドラッグは、疾患組織（すなわち、腫瘍）への局所化を可能にする
静脈内注射を意図する。一旦疾患組織に局所化されると、内因性プロテアーゼ（
すなわち、メタロプロテイナーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、
第ＩＸａ因子、プラスミン）は、プロドラッグ由来の親水性プロテアーゼ認識配
列を切断する。これは、疎水性膜貫通配列を局所細胞膜に挿入することを可能に
する。一旦その尾部（ｔａｉｌ）が膜内に挿入すると、ｔＴＦは凝固誘導特性を
回復し、その結果疾患組織の血管において凝固を形成する。
（実施例ＩＸ）
（Ｇｌａ修飾を欠く凝固因子の合成）
Ｇｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸）修飾を欠くビタミンＫ依存性凝固因子
（第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子および第
Ｘ／Ｘａ因子）は、凝固リガンドの形成に有用であることを意図する。Ｇｌａ修
飾を欠く凝固因子は、貧弱な凝固剤である。なぜなら、非修飾因子は脂質膜と効
率的に会合しないからである：リガンドを介した因子の腫瘍の血管または他の部
位への標的化により、因子は細胞表面近傍に戻されるはずであり、そしてその部
位での凝固の進行を可能にするはずである。
「Ｇｌａ」は、存在するＧｌｕ（グルタミン酸）残基の翻訳後修飾により作製
される。Ｇｌａ修飾を欠くビタミンＫ依存性凝固因子（第ＩＩ／ＩＩａ因子、第
ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子および第Ｘ／Ｘａ因子）は、Ｇｌｕ
をＧｌａに改変しない宿主（例えば、細菌）中でビタミンＫ依存性凝固因子をコ
ードする遺伝子を発現することにより作製され得る。第ＩＩ／ＩＩａ因子、第Ｖ
ＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子および第Ｘ／Ｘａ因子のそれぞれをコ
ードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６お
よび配列番号２７として本明細書に包含される。従って、原核生物の発現は簡単
である。
このようなＧｌａ欠失因子はまた、この遺伝子を発現する前に、この場合は実
質的に任意の宿主細胞において、相当するＧｌｕ残基を他のアミノ酸に変化させ
るように上記の配列のいずれか（配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、
および配列番号２７）を変異させることにより作製され得る。変化されるべきコ
ドンは、ＧＡＧコドンである（ＧＡＡもまたＧｌｕをコードし、これは避けられ
るべきである）。例示として第ＶＩＩ因子を用いて、Ｇｌａ「ドメイン」は、一
般に２１６〜３２５領域に位置する。第一のＧｌａコードトリプレットは、配列
番号２５の２３１に存在し、そして最後は、配列番号２５の３１８から伸長する
。ＧＡＧコドンは、分子生物学的技術を用いて容易に変化され得る。
図８は、上記のビタミンＫ依存性凝固因子の各々のＧｌａドメインが、類似し
た領域に位置することを示す。それ故、配列番号２４、配列番号２６、および配
列番号２７のいずれか１つにおける、いわゆる「相当する」Ｇｌｕ残基の変異は
また、容易に理解される。
以下のコドンの表は、所定のＧｌａコードコドンまたは配列を改変することに
おいて作製される変異の容易な選択を可能にするために提供される。
Figure 2009298805
 部位特異的変異誘発は、基礎を成すＤＮＡの特定の変異誘発およびこのＤＮＡ
への１つ以上のヌクレオチド配列の変化の導入による、Ｇｌａ改変されていない
個々のビタミンＫ依存性凝固因子の調製における使用が意図される技術である。
部位特異的変異誘発は、横断される欠失連結部の両側に安定な２重鎖を形成す
るための十分なサイズおよび配列の複雑さのプライマー配列を提供するために、
所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、ならびに
十分な数の隣接したヌクレオチドの使用により変異体を生成させる。代表的には
、改変される配列の結合部の両側に約５〜１０残基を有する、約１７〜２５ヌク
レオチドの長さのプライマーが好ましい。
一般には、部位特異的変異誘発の技術は、Ａｄｅｌｍａｎら、（１９８３）の
ような刊行物および上記のＴＦ変異体研究により例示されるように、当該分野に
おいて周知である。この技術は、代表的には１本鎖および２本鎖形態の両方で存
在するファージベクターを使用する。部位特異的変異誘発において有用な代表的
なベクターは、Ｍ１３ファージ（Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９８１）のようなベクタ
ーを包含する。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてこ
れらの使用は、一般に当業者に周知である。２本鎖プラスミドはまた、目的の遺
伝子をプラスミドからファージに移す工程を削除する部位特異的変異誘発におい
て日常的に用いられる。
一般に、本明細書による部位特異的変異誘発は、最初に１本鎖ベクターを得る
こと、または２本鎖ベクターの２本鎖を融解して分離することにより実施される
。このベクターは、ビタミンＫ依存性凝固因子をコードするＤＮＡ配列をその配
列内に含む。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーが（一般
的には、例えばＣｒｅａら、（１９７８）の方法により合成的に）調製される。
次いで、このプライマーは、１本鎖ベクターとアニールされ、そして変異保有鎖
（ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｂｅａｒｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）の合成を完了するために
、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ ＫｌｅｎｏｗフラグメントのようなＤＮＡ重合
酵素に供される。従って、ヘテロ２重鎖が形成され、ここで１つの鎖は、本来の
非変異配列をコードし、そして第２の鎖は所望の変異を保有する。次いで、この
ヘテロ２重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換
するために使用され、そして変異配列アレンジメントを保有する組換えベクター
を含有するクローンが選択される。
（実施例Ｘ）
（さらなる抗腫瘍血管系抗体）
本実施例は、腫瘍血管系と正常な組織の血管系とを区別することにおける使用
のための腫瘍由来内皮細胞「結合因子」に対する抗体の生成を記載する。特に、
血管透過因子（ＶＰＦ）（血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）とも呼ばれる）に
対する抗体およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）に対する抗体の生成を
記載する。
ＦＧＦに関してさらに詳細には、Ｇｏｍｅｚ−ＰｉｎｉｌｌａおよびＣｏｔｍ
ａｎ（１９９２）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、（１９９２）（塩基性線維芽細胞増
殖因子の局在化を記載している）；Ｘｕら、（１９９２）（ＦＧＦの発現および
免疫化学的分析に関する）；Ｒｅｉｌｌｙら、（１９８９）（モノクローナル抗
体に関する）；Ｄｉｘｏｎら、（１９８９）（ＦＧＦ検出および特徴付けに関す
る）；Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、（１９８９）（ヘパリン結合成長因子に対するモ
ノクローナル抗体に関する）；ならびにＨｅｒｂｌｉｎおよびＧｒｏｓｓ（１９
９２）（血管系に関連した固形腫瘍におけるｂＦＧＦについての結合部位を議論
している）を引用し得る。
本研究において、ウサギを、ツベルクリン（精製されたタンパク質誘導体、Ｐ
ＰＤ）またはチログロブリンキャリアーとカップリングした、ヒトＶＥＧＦ、マ
ウスＶＥＧＦ、モルモットＶＥＧＦ、ヒトｂＦＧＦ、マウスｂＦＧＦ、またはモ
ルモットｂＦＧＦのＮ末端ペプチドで過免疫した。これらのペプチドは、２５〜
２６アミノ酸の長さであり、そしてＣ末端残基としてシステインを用いてペプチ
ド合成機で合成した。抗血清を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリックスにカップリン
グしたペプチドのカラムにおいてアフィニティー精製した。
ＶＥＧＦに対する抗体を、ＥＬＩＳＡならびにモルモットの腫瘍および正常組
織の凍結切片におけるそれらの染色パターンにより同定した。モルモットＶＥＧ
ＦおよびヒトＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体は、それぞれ、モルモットＬ
１０腫瘍および種々のヒト腫瘍（耳下腺ガン、卵巣ガン、乳ガン）の凍結切片上
の大多数の血管内皮細胞と反応した。抗ヒトＶＥＧＦ抗体は、正常なヒト腎臓糸
球体における内皮細胞を取り囲む糸球体間質細胞および肝臓における内皮細胞を
染色したが、しかし正常なヒトの胃、脚の筋肉、および脾臓における血管を染色
しなかった。抗モルモットＶＥＧＦ抗体は、腎臓、脳、脾臓、心臓、精嚢、肺、
大腸、胸腺、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、肝臓、精巣、および骨格筋を含む
正常な組織のいずれにおいても内皮細胞を染色しなかった。
ヒトＦＧＦに対するポリクローナル抗体は、耳下腺ガンおよび卵巣ガンにおけ
る内皮細胞を染色したが、しかし乳ガンにおける内皮細胞を染色しなかった。抗
ヒトＦＧＦ抗体は、ヒト腎臓における糸球体内皮細胞を染色したが、しかし正常
な胃、脚の筋肉、および脾臓における内皮細胞を染色しなかった。
モルモットＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦおよびモルモットｂＦＧＦに対するモノク
ローナル抗体を、ＰＰＤまたはチログロブリンにカップリングしたＮ末端配列ペ
プチド（ペプチドのＣ末端にシステインを有する）でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫
することにより調製した。規定された配列の合成ペプチド免疫原は、以下に示さ
れ、そしてそれぞれ配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２で表され
る：
Figure 2009298805
 ペプチドを、スクシミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）でチログロブリンを誘導体化し、そして誘導体
とペプチドを反応させることにより、チログロブリンまたはＰＰＤに接合させた
。これは、チログロブリンへのチオエーテル結合により連結される１つ以上のペ
プチド配列を有する接合体を与える。
特に、上記配列に対するモノクローナル抗体の生成を、以下の手順を用いて達
成した：ＢＡＬＢ／ｃマウスを、いくつかの部位へのペプチド−ＰＰＤまたはペ
プチド−チログロブリンでの連続した注射により免疫した。最後の注射の４また
は５日後に、脾臓を取り出し、そして脾細胞を、Ｍｏｒｒｏｗら、（１９９１）
に刊行された手順に従ってポリエチレングリコールを用いて、Ｐ３ｘＧ３Ａｇ８
．６５３骨髄腫細胞と融合した。
個々のハイブリドーマ上清を以下のようにスクリーニングした：
第１のスクリーニング：ペプチド−チログロブリン被覆したプレートにおけるＥ
ＬＩＳＡ。
第２のスクリーニング：チログロブリンへのＳＭＣＣにより連結されたシステイ
ンにおけるＥＬＩＳＡ。
第３のスクリーニング：モルモット株１０腫瘍またはヒト耳下腺ガンの凍結切片
の間接的免疫ペルオキシダーゼ染色。
第４のスクリーニング：種々の悪性および正常なモルモットおよびヒトの組織の
凍結切片の間接的免疫ペルオキシダーゼ染色。
ペプチド−チログロブリンに結合するが、しかしシステイン−チログロブリン
に結合しない抗体を選択した。これらの抗体は、正常な組織における内皮細胞に
結合するよりも強力に悪性腫瘍における内皮細胞に結合した（表ＶＩＩＩ）。
Figure 2009298805
 （Ａ．ヒトおよびモルモット組織切片のＧＶ９７染色）
モルモットＶＥＧＦ Ｎ末端に対するＧＶ９７抗体は、種々のヒト悪性組織（
表ＩＸ）および正常組織（表Ｘ）における内皮細胞に結合した。
悪性腫瘍における内皮細胞への結合は、正常組織における内皮細胞への結合を
超過する傾向があった。
モルモット腫瘍（株１０肝細胞性ガン）および正常組織における内皮細胞の染
色は、分布および強度においてヒト組織に観察された染色と類似した（表ＸＩ）
。
表において、＋は、ネガティブな結果に対立するものとしてのポジティブな結
果を示す。数値２＋、３＋、および４＋は、当該研究分野で日常的に理解される
ように、増大する強度のポジティブシグナルをいう。
Figure 2009298805
Figure 2009298805
Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805
Figure 2009298805
Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805
Figure 2009298805
Figure 2009298805
Figure 2009298805

Figure 2009298805
（Ｂ．ＧＶ９７の可溶性ヒトＶＥＧＦとの反応性の欠失）
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター（Ｆｌｋ−１）またはレセプターに結合（また
は複合体化）したＶＥＧＦに特異的である抗体を同定するために、ＥＬＩＳＡス
クリーニングプロトコルを開発した。手順は以下の通りである：
最初に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（丸底）を、感作緩衝液中の１０μｇ
／ｍｌの１００μｌ／ウェルのＦＬＫ／ｓｅａｐで被覆した（外側のウェルはブ
ランクのままにした）。一晩のインキュベーション後、このプレートを、一晩の
間４℃にて、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、ＦＬＫ／Ｓｅａｐ被覆したプレート
を、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋ＣＡＨ（５％）溶液で１時間３７℃にてブロ
ックした。ブロッキング溶液を除去し、プレートを、ペーパータオル上で勢いよ
く叩いた。
次いでブロックしたプレートを、結合において２μｇ／ｍｌで１００μｌ／ウ
ェルのＶＥＧＦ−１６５（Ｄｒ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手した酵母において生成されたＶＥＧＦ
１６５ ａａ形態）＋０．１μｇ／ｍｌヘパリンとともに室温で４時間または
４℃で一晩インキュベートした。ＶＥＧＦ溶液を回収し、そしてプレートをＰＢ
Ｓ−ｔｗｅｅｎ（０．１０％）で２回洗浄した。次に、１００μｌ／ウェルのハ
イブリドーマ融合上清をウェルに添加し、そして１時間３２℃にてインキュベー
トした。この上清のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ ｔｗｅｅｎで
３回洗浄し、次いでＰＢＳ ｔｗｅｅｎ＋ＣＡＨ（５％）中に１：１０００で、
１００μｌウェルの二次抗体（ＫＰＬ，Ｇｔ抗マウスＩｇＧ）とともに１時間３
７℃にてインキュベートした。
二次抗体とのインキュベーションの後、プレートを、ＰＢＳ ｔｗｅｅｎで４
回洗浄し、１００μｌ／ウェルの基質（クエン酸緩衝液＋Ｈ２Ｏ２に溶解したＳ
ｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｉｇｍａ ＯＰＤ）とともに２０分間インキュベートし、
そしてＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒ
ｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ７５２０）において４９０ｎｍで読み取った。適切な
コントローウェルより高い吸光度を有するウェルを、ポジティブとして選択し、
そしてさらに特徴付けた。
ＧＶ９７は、組換えＶＥＧＦ被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合せず、しかも組換
えヒトＶＥＧＦは、ＧＶ９７被覆したＥＬＩＳＡプレートに結合しないことを見
出した。可溶性組換えヒトＶＥＧＦは、５０μｇ／ｍｌで添加された場合でさえ
、組織学的な切片における腫瘍内皮への５μｇ／ｍｌ ＧＶ９７の結合をブロッ
クしなかった。
これらのデータは、組換えヒトＶＥＧＦにおいて隠されるが、ＶＥＧＦが内皮
細胞上のそのレセプターに結合すると接近可能になるＶＥＧＦのエピトープを、
ＧＶ９７が認識することを示唆している。
（Ｃ．株１０保有モルモットにおけるＧＶ９７局在化）
組織学的切片から得られた染色データとは対照的に、ＧＶ９７抗体は、株１０
腫瘍保有モルモットへの注射の後、腫瘍内皮細胞に選択的に局在化した（表ＸＩ
Ｉ）。この腫瘍における内皮細胞の染色は、中程度の強さであったが、一方、種
々の器官における正常な内皮の染色は、検出不能であった。
（Ｄ．抗−ｂＦＧＦは、腫瘍内皮細胞に選択的に結合する）
ＧＶ９７およびＧＦ８２（これらは、モルモットｂＦＧＦのＮ末端に対して惹
起された）は、モルモット株１０腫瘍の凍結反応における内皮細胞および２つの
型のヒト悪性腫瘍における内皮細胞に強く結合した（表ＸＩＩＩ）。対照的に、
種々のモルモット正常組織における内皮細胞の比較的弱い染色が観察された。

Figure 2009298805
Figure 2009298805
Figure 2009298805
 （実施例ＸＩ）
（ヒト処置プロトコル）
本実施例は、本発明の二重特異性結合および凝固リガンドを用いるヒト処置プ
ロトコルに関する。これらのリガンドは、種々のヒトのガンおよびさらに他の疾
患（例えば、中期またはより長期の血流の停止が有利である、良性前立腺肥大症
および慢性関節リウマチ）の臨床的処置における使用が意図される。
二重特異性リガンドは、抗腫瘍治療において特に有用な道具であると考えられ
ている。動物研究を含む本明細書に示されるデータ、ならびにリンパ腫の処置（
Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８８）、Ｔ細胞標的化（ＮｏｌａｎおよびＫｅｎｎｅｄ
ｙ，１９９０）および薬物標的化（Ｐａｕｌｕｓ，１９８５）に関する当該分野
における知識から、適切な用量および処置法は、容易に開発され得る。
当然、広範な使用の前に、さらなる動物研究および臨床治験が行われる。患者
の処置およびモニタリングを含む、臨床治験を行うための種々の要素は、本開示
の見解から当業者に公知である。以下の情報は、このような治験を確立すること
における使用のための一般的な指針として示されている。
研究のために選択される患者は、従来の治療の少なくとも１つの課程に応答し
得ず、そして身体検査、研究室技術、またはＸ線撮影手順により決定される客観
的に測定され得る疾患を有しなければならないことが意図される。マウスモノク
ローナル抗体部分が用いられる場合、患者は、マウス免疫グロブリンに対するア
レルギーの病歴を有していないべきである。いかなる化学療法も、研究に入る少
なくとも２週間前に止められるべきである。
二重特異性リガンド投与に関して、３つの管腔ポートを備える留置中心静脈カ
テーテル（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｎｏｕｓ ｃａｔｈｅ
ｔｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｔｒｉｐｌｅ ｌｕｍｅｎ ｐｏｒｔ）の使用において
特定の利点が見出されると考えられる。二重特異性リガンドは、例えば、０．２
２μｍフィルターを用いて濾過され、そして例えば、生理食塩水で、１００ｍｌ
の最終用量まで適切に希釈されるべきである。使用前に、試験試料もまた、同様
の方法で濾過され、そしてその濃度は、Ａ２８０を測定することにより濾過の前
および後に評価されるべきである。予測される回収率は、８７〜９９％の範囲内
であるべきであり、次いでタンパク質損失のための調整が説明され得る。
二重特異性リガンドは、各患者に２〜７日間隔に２〜４回の注入で、約４〜２
４時間の期間にわたって投与され得る。投与はまた、７日間にわたる定常速度の
注入により実施され得る。任意の用量レベルで与えられる注入は、観察される任
意の毒性に依存するべきである。従って、グレードＩＩ毒性が、任意の単回の注
入後、または定常速度の注入の特定の期間に達成された場合、毒性が改善されな
い限り、さらなる用量は差し控えられるか、または定常速度の注入は停止される
べきである。増加した用量の二重特異性凝固リガンドは、任意のカテゴリーにお
いて、患者の約６０％が受容し得ないグレードＩＩＩまたはグレードＩＶ毒性を
示すまで患者の群に投与されるべきである。この値の２／３である用量は、安全
な用量として定義され得る。
身体検査、腫瘍測定、および臨床検査は、勿論、処置の前にそして一ヶ月後ま
での間隔で実施されるべきである。臨床試験は、全血球数、血清クレアチニン、
クレアチンキナーゼ、電解質、尿素、窒素、ＳＧＯＴ、ビリルビン、アルブミン
、および総血清タンパク質を含むべきである。処置後６０日までに採取される血
清試料は、完全な二重特異性リガンドまたはその成分およびリガンドのいずれか
または両方の部分に対する抗体の存在についてラジオイムノアッセイにより評価
されるべきである。任意の標準的なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ
）を用いる、血清の免疫学的分析は、治療薬剤の薬物動態学およびクリアランス
の評価を可能にする。
抗腫瘍応答を評価するために、患者は、最後の注入から４８時間〜１週間に検
査され、そして３０日後に再び検査されるべきであることが意図される。触知可
能な疾患が存在する場合、全ての塊の２つの垂直直径は、処置の間毎日、治療の
完了後１週間以内、および３０日目に測定されるべきである。触知不可能な疾患
を測定するために、一連のＣＴスキャンが、４８時間〜１週間目に、そして３０
日目に再び、胸部、腹部、および骨盤を通して１−ｃｍ間隔で実施され得る。組
織試料はまた、疾患部位からの生検、あるいは適切である場合は、血液または液
体試料までも用いて、組織学的に、および／またはフローサイトメトリーにより
評価されるべきである。
臨床的な応答は、条件にあった尺度により定義され得る。例えば、完全な応答
は、処置１ヶ月後の全ての測定可能な腫瘍の消失により定義され得る。一方、部
分的な応答は、全ての腫瘍部位が拡大を示さない、処置１ヶ月後の全ての評価し
得る腫瘍結節の直角をなす直径の積の合計の５０％以上の減少により定義され得
る。同様に、混合応答は、１つ以上の部位における進行を伴って、処置１ヶ月後
の全ての測定可能な病巣の直角をなす直径の積の５０％以上の減少により定義さ
れ得る。
本明細書中で開示および請求される全ての組成物および方法は、本開示の見解
から、過度の実験を要することなく作製および遂行され得る。本発明の組成物お
よび方法は、好ましい実施態様に関して記載されているが、改変が、本発明の概
念、精神、および範囲を逸脱することなく、本明細書中に開示される組成物、方
法、および方法の工程または一連の工程に適用され得ることは当業者に明らかで
ある。さらに詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤が、
同一または類似した結果が達成されながら本明細書中に記載される薬剤に代用さ
れ得ることは明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似した置換お
よび改変は、添付の請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概
念内にあると考えられる。
（参考文献）
以下の参考文献は、これらの文献が本明細書に述べられている事柄の例示的な
手順または他の詳細な追加事項を提供する範囲で、本明細書中に参考として援用
される。
Figure 2009298805
Figure 2009298805
Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805

Figure 2009298805
〔配列表〕
(1)一般的情報：

(i)出願人：
名称：ボード オブ リージェンツ, ザ ユニバーシティ オブ
テキサス システム
番地：201 ウエストセブンス ストリート
市：オースティン
州：テキサス
国：アメリカ合衆国
郵便番号：7870
電話番号：(512)499-4462
テレファックス：(512)499-4523

および

名称：ザ スクリプス リサーチ インスティチュート
番地：10666ノース トレイ パインズ ロード
市：ラホヤ
州：カリフォルニア
国：アメリカ合衆国 郵便番号：92037

(ii)発明者：トープ, フィリップイー.
エジントン,トーマス エス.

(iii)発明の名称：血管系の特異的凝固のための方法および組成物

(iv)配列数：３２

(v)連絡住所：
(A)名称：アーノルド,ホワイト アンド ダーキー
(B)番地：ピー.オー. ボックス 4433
(C)市：ヒューストン
(D)州：テキサス
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：77210

(vi)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピー（登録商標）ディスク
(B)コンピューター：IBM PC 互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS, ASCII

(vii)現在の出願データ：
(A)出願番号：PCT/US95/07439
(B)出願日：1995年6月7日
(C)分類：不明

(viii)先願データ：
(A)出願番号：US08/273,567
(B)出願日：1994年7月11日

(ix)代理人／事務所情報：
(A)氏名：パーカー, デビットエル.
(B)登録番号：32,165
(C)照会／記録番号：UTFD433P---

（x)電話回線情報：
(A)電話：(512)418-3000
(B)テレファックス：(713)789-2679
(C)テレックス：79-0924

(2) 配列番号１の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 27 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１:GTCATGCCAT GGCCTCAGGCACTACAA 27

(2) 配列番号２の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 32 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号２:
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTTCT 32

(2) 配列番号３の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 47 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号３:
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGCTT CTGGCACTACAAATACT 47

(2) 配列番号４の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 38 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D)トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号４:
GTCATGCCAT GGCCTGCTCA GGCACTACAAATACTGTG 38

(2) 配列番号５の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 50 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号５:
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCACTACAAATACT 50

(2) 配列番号６の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 35 塩基対
(B) 型： 核酸
(C)鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号６:
TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCCTTTCT 35

(2) 配列番号７の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 50 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号７:
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCGGAGGCGGTGGATCAGGC 50

(2) 配列番号８の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 36 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号8:
AGTATTTGTA GTGCCTGAGG ATCCGCCACCTCCACT 36

(2) 配列番号９の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 45 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号9:
GGAGGCGGTG GATCAGGCGG TGGAGGTAGT GGAGGTGGCGGATCC 45

(2) 配列番号１０の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 17 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１０:
GTCATGCCATGGCCCTG 17
(2) 配列番号１１の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 32 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１１:
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTTCT 32

(2) 配列番号１２の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 50 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１２:
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCACTACAAATACT 50

(2) 配列番号１３の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 53 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１３:
CGCGGATCCA CCGCCACCAG ATCCACCGCC TCCTTCTCTGAATTCCCCTT TCT 53

(2) 配列番号１４の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 44 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１４:
CGCGGATCCG GCGGTGGAGG CTCTTCAGGC ACTACAAATACTGT 44

(2) 配列番号１５の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 31 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１５:
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTCT 31

(2) 配列番号１６の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 50 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１６:
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCACTACAAATACT 50

(2) 配列番号１７の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 31 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号17:
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTCT 31

(2) 配列番号１８の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 44 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１８:
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCACTACAAATACT 44

(2) 配列番号１９の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 34 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号１９:
TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCTTTCT 34

(2) 配列番号２０の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 19 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A)説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号２０:
CAAGTTCAGCCAAGAAAAC 19

(2) 配列番号２１の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 36 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号２１:
ACACTTTATT ATCGGAAATC TTCAGCTTCAGGAAAG 36

(2) 配列番号２２の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 657 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(xi) 配列：配列番号２２:
TCAGGCACTA CAAATACTGT GGCAGCATAT AATTTAACTTGGAAATCAAC TAATTTCAAG 60
ACAATTTTGG AGTGGGAACC CAAACCCGTC AATCAAGTCTACACTGTTCA AATAAGCACT 120
AAGTCAGGAG ATTGGAAAAG CAAATGCTTT TACACAACAGACACAGAGTG TGACCTCACC 180
GACGAGATTG TGAAGGATGT GAAGCAGACG TACTTGGCACGGGTCTTCTC CTACCCGGCA 240
GGGAATGTGG AGAGCACCGG TTCTGCTGGG GAGCCTCTGTATGAGAACTC CCCAGAGTTC 300
ACACCTTACC TGGAGACAAA CCTCGGACAG CCAACAATTCAGAGTTTTGA ACAGGTGGGA 360
ACAAAAGTGA ATGTGACCGT AGAAGATGAA CGGACTTTAGTCAGAAGGAA CAACACTTTC 420
CTAAGCCTCC GGGATGTTTT TGGCAAGGAC TTAATTTATACACTTTATTA TTGGAAATCT 480
TCAAGTTCAG GAAAGAAAAC AGCCAAAACA AACACTAATGAGTTTTTGAT TGATGTGGAT 540
AAAGGAGAAA ACTACTGTTT CAGTGTTCAA GCAGTGATTCCCTCCCGAAC AGTTAACCGG 600
AAGAGTACAG ACAGCCCGGT AGAGTGTATG GGCCAGGAGAAAGGGGAATT CAGAGAA 657

(2) 配列番号２３の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 219 アミノ酸
(B) 型： アミノ酸
(C) 鎖の数：
(D) トポロジー： 直鎖状
(xi) 配列：配列番号２３:
Ser Gly Thr ThrAsn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn PheLysThr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr ValGln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr ThrThr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val LysGln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val GluSer Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu PheThr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser PheGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg ThrLeu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe GlyLys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser GlyLys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val AspLys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser ArgThr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly GlnGlu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215

(2) 配列番号２４の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 1947 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(xi) 配列：配列番号２４:
TGCAGCTGCC TGGCTGCCTG GCCCTGGCTG CCCTGTGTAGCCTTGTGCAC AGCCAGCATG 60
TGTTCCTGGC TCCTCAGCAA GCACGGTCGC TGCTCCAGCGGGTCCGGCGA GCCAACACCT 120
TCTTGGAGGA GGTGCGCAAG GGCAACCTAG AGCGAGAGTGCGTGGAGGAG ACGTGCAGCT 180
ACGAGGAGGC CTTCGAGGCT CTGGAGTCCT CCACGGCTACGGATGTGTTC TGGGCCAAGT 240
ACACAGCTTG TGAGACAGCG AGGACGCCTC GAGATAAGCTTGCTGCATGT CTGGAAGGTA 300
ACTGTGCTGA GGGTCTGGGT ACGAACTACC GAGGGCATGTGAACATCACC CGGTCAGGCA 360
TTGAGTGCCA GCTATGGAGG AGTCGCTACC CACATAAGCCTGAAATCAAC TCCACTACCC 420
ATCCTGGGGC CGACCTACAG GAGAATTTCT GCCGCAACCCCGACAGCAGC AACACGGGAC 480
CCTGGTGCTA CACTACAGAC CCCACCGTGA GGAGGCAGGAATGCAGCATC CCTGTCTGTG 540
GCCAGGATCA AGTCACTGTA GCGATGACTC CACGCTCCGAAGGCTCCAGT GTGAATCTGT 600
CACCTCCATT GGAGCAGTGT GTCCCTGATC GGGGGCAGCAGTACCAGGGG CGCCTGGCGG 660
TGACCACACA TGGGCTCCCC TGCCTGGCCT GGGCCAGCGCACAGGCCAAG GCCCTGAGCA 720
AGCACCAGGA CTTCAACTCA GCTGTGCAGC TGGTGGAGAACTTCTGCCGC AACCCAGACG 780
GGGATGAGGA GGGCGTGTGG TGCTATGTGG CCGGGAAGCCTGGCGACTTT GGGTACTGCG 840
ACCTCAACTA TTGTGAGGAG GCCGTGGAGG AGGAGACAGGAGATGGGCTG GATGAGGACT 900
CAGACAGGGC CATCGAAGGG CGTACCGCCA CAAGTGAGTACCAGACTTTC TTCAATCCGA 960
GGACCTTTGGCTCGGGAGAG GCAGACTGTG GGCTGCGACCTCTGTTCGAG AAGAAGTCGC 1020
TGGAGGACAA AACCGAAAGA GAGCTCCTGG AATCCTACATCGACGGGCGC ATTGTGGAGG 1080
GCTCGGATGC AGAGATCGGC ATGTCACCTT GGCAGGTGATGCTTTTCCGG AAGAGTCCCC 1140
AGGAGCTGCT GTGTGGGGCC AGCCTCATCA GTGACCGCTGGGTCCTCACC GCCGCCCACT 1200
GCCTCCTGTA CCCGCCCTGG GACAAGAACT TCACCGAGAATGACCTTCTG GTGCGCATTG 1260
GCAAGCACTC CCGCACCAGG TACGAGCGAA ACATTGAAAAGATATCCATG TTGGAAAAGA 1320
TCTACATCCA CCCCAGGTAC AACTGGCGGG AGAACCTGGACCGGGACATT GCCCTGATGA 1380
AGCTGAAGAA GCCTGTTGCC TTCAGTGACT ACATTCACCCTGTGTGTCTG CCCGACAGGG 1440
AGACGGCAGC CAGCTTGCTC CAGGCTGGAT ACAAGGGGCGGGTGACAGGC TGGGGCAACC 1500
TGAAGGAGAC GTGGACAGCC AACGTTGGTA AGGGGCAGCCCAGTGTCCTG CAGGTGGTGA 1560
ACCTGCCCAT TGTGGAGCGG CCGGTCTGCA AGGACTCCACCCGGATCCGC ATCACTGACA 1620
ACATGTTCTG TGCTGGTTAC AAGCCTGATG AAGGGAAACGAGGGGATGCC TGTGAAGGTG 1680
ACAGTGGGGG ACCCTTTGTC ATGAAGAGCC CCTTTAACAACCGCTGGTAT CAAATGGGCA 1740
TCGTCTCATG GGGTGAAGGC TGTGACCGGG ATGGGAAATATGGCTTCTAC ACACATGTGT 1800
TCCGCCTGAA GAAGTGGATA CAGAAGGTCA TTGATCAGTTTGGAGAGTAG GGGGCCACTC 1860
ATATTCTGGG CTCCTGGAAC CAATCCCGTG AAAGAATTATTTTTGTGTTT CTAAAACTAT 1920
GGTTCCCAAT AAAAGTGACTCTCAGCG 1947

(2) 配列番号２５の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 2462 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(xi) 配列：配列番号２５:
TCAACAGGCA GGGGCAGCAC TGCAGAGATT TCATCATGGTCTCCCAGGCC CTCAGGCTCC 60
TCTGCCTTCT GCTTGGGCTT CAGGGCTGCC TGGCTGCAGGCGGGGTCGCT AAGGCCTCAG 120
GAGGAGAAAC ACGGGACATG CCGTGGAAGC CGGGGCCTCACAGAGTCTTC GTAACCCAGG 180
AGGAAGCCCA CGGCGTCCTG CACCGGCGCC GGCGCGCCAACGCGTTCCTG GAGGAGCTGC 240
GGCCGGGCTC CCTGGAGAGG GAGTGCAAGG AGGAGCAGTGCTCCTTCGAG GAGGCCCGGG 300
AGATCTTCAA GGACGCGGAG AGGACGAAGC TGTTCTGGATTTCTTACAGT GATGGGGACC 360
AGTGTGCCTC AAGTCCATGC CAGAATGGGG GCTCCTGCAAGGACCAGCTC CAGTCCTATA 420
TCTGCTTCTG CCTCCCTGCC TTCGAGGGCC GGAACTGTGAGACGCACAAG GATGACCAGC 480
TGATCTGTGT GAACGAGAAC GGCGGCTGTG AGCAGTACTGCAGTGACCAC ACGGGCACCA 540
AGCGCTCCTG TCGGTGCCAC GAGGGGTACT CTCTGCTGGCAGACGGGGTG TCCTGCACAC 600
CCACAGTTGA ATATCCATGT GGAAAAATAC CTATTCTAGAAAAAAGAAAT GCCAGCAAAC 660
CCCAAGGCCG AATTGTGGGG GGCAAGGTGT GCCCCAAAGGGGAGTGTCCA TGGCAGGTCC 720
TGTTGTTGGT GAATGGAGCT CAGTTGTGTG GGGGGACCCTGATCAACACC ATCTGGGTGG 780
TCTCCGCGGC CCACTGTTTC GACAAAATCA AGAACTGGAGGAACCTGATC GCGGTGCTGG 840
GCGAGCACGA CCTCAGCGAG CACGACGGGG ATGAGCAGAGCCGGCGGGTG GCGCAGGTCA 900
TCATCCCCAG CACGTACGTC CCGGGCACCA CCAACCACGACATCGCGCTG CTCCGCCTGC 960
ACCAGCCCGT GGTCCTCACT GACCATGTGG TGCCCCTCTGCCTGCCCGAA CGGACGTTCT 1020
CTGAGAGGAC GCTGGCCTTC GTGCGCTTCT CATTGGTCAGCGGCTGGGGC CAGCTGCTGG 1080
ACCGTGGCGC CACGGCCCTG GAGCTCATGG TGCTCAACGTGCCCCGGCTG ATGACCCAGG 1140
ACTGCCTGCA GCAGTCACGG AAGGTGGGAG ACTCCCCAAATATCACGGAG TACATGTTCT 1200
GTGCCGGCTA CTCGGATGGC AGCAAGGACT CCTGCAAGGGGGACAGTGGA GGCCCACATG 1260
CCACCCACTA CCGGGGCACG TGGTACCTGA CGGGCATCGTCAGCTGGGGC CAGGGCTGCG 1320
CAACCGTGGG CCACTTTGGG GTGTACACCA GGGTCTCCCAGTACATCGAG TGGCTGCAAA 1380
AGCTCATGCG CTCAGAGCCA CGCCCAGGAG TCCTCCTGCGAGCCCCATTT CCCTAGCCCA 1440
GCAGCCCTGG CCTGTGGAGA GAAAGCCAAG GCTGCGTCGAACTGTCCTGG CACCAAATCC 1500
CATATATTCTTCTGCAGTTA ATGGGGTAGA GGAGGGCATGGGAGGGAGGG AGAGGTGGGG 1560
AGGGAGACAG AGACAGAAAC AGAGAGAGAC AGAGACAGAGAGAGACTGAG GGAGAGACTC 1620
TGAGGACATG GAGAGAGACT CAAAGAGACT CCAAGATTCAAAGAGACTAA TAGAGACACA 1680
GAGATGGAAT AGAAAAGATG AGAGGCAGAG GCAGACAGGCGCTGGACAGA GGGGCAGGGG 1740
AGTGCCAAGG TTGTCCTGGA GGCAGACAGC CCAGCTGAGCCTCCTTACCT CCCTTCAGCC 1800
AAGCCCCACC TGCACGTGAT CTGCTGGCCC TCAGGCTGCTGCTCTGCCTT CATTGCTGGA 1860
GACAGTAGAG GCATGAACAC ACATGGATGC ACACACACACACGCCAATGC ACACACACAG 1920
AGATATGCAC ACACACGGAT GCACACACAG ATGGTCACACAGAGATACGC AAACACACCG 1980
ATGCACACGC ACATAGAGAT ATGCACACAC AGATGCACACACAGATATAC ACATGGATGC 2040
ACGCACATGC CAATGCACGC ACACATCAGT GCACACGGATGCACAGAGAT ATGCACACAC 2100
CGATGTGCGC ACACACAGAT ATGCACACAC ATGGATGAGCACACACACAC CAAGTGCGCA 2160
CACACACCGA TGTACACACA CAGATGCACA CACAGATGCACACACACCGA TGCTGACTCC 2220
ATGTGTGCTG TCCTCTGAAG GCGGTTGTTT AGCTCTCACTTTTCTGGTTC TTATCCATTA 2280
TCATCTTCAC TTCAGACAAT TCAGAAGCAT CACCATGCATGGTGGCGAAT GCCCCCAAAC 2340
TCTCCCCCAA ATGTATTTCT CCCTTCGCTG GGTGCCGGGCTGCACAGACT ATTCCCCACC 2400
TGCTTCCCAG CTTCACAATA AACGGCTGCG TCTCCTCCGCACACCTGTGG TGCCTGCCAC 2460
CC 2462

(2) 配列番号２６の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 1437 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(xi) 配列：配列番号２６:
ATGCAGCGCG TGAACATGAT CATGGCAGAA TCACCAAGCCTCATCACCAT CTGCCTTTTA 60
GGATATCTAC TCAGTGCTGA ATGTACAGTT TTTCTTGATCATGAAAACGC CAACAAAATT 120
CTGAATCGGC CAAAGAGGTA TAATTCAGGT AAATTGGAAGAGTTTGTTCA AGGGAACCTT 180
GAGAGAGAAT GTATGGAAGA AAAGTGTAGT TTTGAAGAACCACGAGAAGT TTTTGAAAAC 240
ACTGAAAAGA CAACTGAATT TTGGAAGCAG TATGTTGATGGAGATCAGTG TGAGTCCAAT 300
CCATGTTTAA ATGGCGGCAG TTGCAAGGAT GACATTAATTCCTATGAATG TTGGTGTCCC 360
TTTGGATTTG AAGGAAAGAA CTGTGAATTA GATGTAACATGTAACATTAA GAATGGCAGA 420
TGCGAGCAGT TTTGTAAAAA TAGTGCTGAT AACAAGGTGGTTTGCTCCTG TACTGAGGGA 480
TATCGACTTG CAGAAAACCA GAAGTCCTGT GAACCAGCAGTGCCATTTCC ATGTGGAAGA 540
GTTTCTGTTT CACAAACTTC TAAGCTCACC CGTGCTGAGGCTGTTTTTCC TGATGTGGAC 600
TATGTAAATC CTACTGAAGC TGAAACCATT TTGGATAACATCACTCAAGG CACCCAATCA 660
TTTAATGACT TCACTCGGGT TGTTGGTGGA GAAGATGCCAAACCAGGTCA ATTCCCTTGG 720
CAGGTTGTTT TGAATGGTAA AGTTGATGCA TTCTGTGGAGGCTCTATCGT TAATGAAAAA 780
TGGATTGTAA CTGCTGCCCA CTGTGTTGAA ACTGGTGTTAAAATTACAGT TGTCGCAGGT 840
GAACATAATA TTGAGGAGAC AGAACATACA GAGCAAAAGCGAAATGTGAT TCGAGCAATT 900
ATTCCTCACC ACAACTACAA TGCAGCTATT AATAAGTACAACCATGACAT TGCCCTTCTG 960
GAACTGGACG AACCCTTAGT GCTAAACAGC TACGTTACACCTATTTGCAT TGCTGACAAG 1020
GAATACACGA ACATCTTCCT CAAATTTGGA TCTGGCTATGTAAGTGGCTG GGCAAGAGTC 1080
TTCCACAAAG GGAGATCAGC TTTAGTTCTT CAGTACCTTAGAGTTCCACT TGTTGACCGA 1140
GCCACATGTC TTCGATCTAC AAAGTTCACC ATCTATAACAACATGTTCTG TGCTGGCTTC 1200
CATGAAGGAG GTAGAGATTC ATGTCAAGGA GATAGTGGGGGACCCCATGT TACTGAAGTG 1260
GAAGGGACCA GTTTCTTAAC TGGAATTATT AGCTGGGGTGAAGAGTGTGC AATGAAAGGC 1320
AAATATGGAA TATATACCAA GGTATCCCGG TATGTCAACTGGATTAAGGA AAAAACAAAG 1380
CTCACTTAAT GAAAGATGGA TTTCCAAGGT TAATTCATTGGAATTGAAAA TTAACAG 1437

(2) 配列番号２７の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 1126 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(xi) 配列：配列番号２７:
GGATTCGAAG GCAAAAACTG TGAATTATTC ACACGGAAGCTCTGCAGCCT GGACAACGGG 60
GACTGTGACC AGTTCTGCCA CGAGGAACAG AACTCTGTGGTGTGCTCCTG CGCCCGCGGG 120
TACACCCTGG CTGACAACGG CAAGGCCTGC ATTCCCACAGGGCCCTACCC CTGTGGGAAA 180
CAGACCCTGG AACGCAGGAA GAGGTCAGTG GCCCAGGCCACCAGCAGCAG CGGGGAGGCC 240
CCTGACAGCA TCACATGGAA GCCATATGAT GCAGCCGACCTGGACCCCAC CGAGAACCCC 300
TTCGACCTGC TTGACTTCAA CCAGACGCAG CCTGAGAGGGGCGACAACAA CCTCACCAGG 360
ATCGTGGGAG GCCAGGAATG CAAGGACGGG GAGTGTCCCTGGCAGGCCCT GCTCATCAAT 420
GAGGAAAACG AGGGTTTCTG TGGTGGAACC ATTCTGAGCGAGTTCTACAT CCTAACGGCA 480
GCCCACTGTC TCTACCAAGC CAAGAGATTC GAAGGGGACCGGAACACGGA GCAGGAGGAG 540
GGCGGTGAGG CGGTGCACGA GGTGGAGGTG GTCATCAAGCACAACCGGTT CACAAAGGAG 600
ACCTATGACT TCGACATCGC CGTGCTCCGG CTCAAGACCCCCATCACCTT CCGCATGAAC 660
GTGGCGCCTG CCTGCCTCCC CGAGCGTGAC TGGGCCGAGTCCACGCTGAT GACGCAGAAG 720
ACGGGGATTG TGAGCGGCTT CGGGCGCACC CACGAGAAGGGCCGGCAGTC CACCAGGCTC 780
AAGATGCTGG AGGTGCCCTA CGTGGACCGC AACAGCTGCAAGCTGTCCAG CAGCTTCATC 840
ATCACCCAGA ACATGTTCTG TGCCGGCTAC GACACCAAGCAGGAGGATGC CTGCCAGGGG 900
GACAGCGGGG GCCCGCACGT CACCCGCTTC AAGGACACCTACTTCGTGAC AGGCATCGTC 960
AGCTGGGGAG AGGGCTGTGC CCGTAAGGGG AAGTACGGGATCTACACCAA GGTCACCGCC 1020
TTCCTCAAGT GGATCGACAG GTCCATGAAA ACCAGGGGCTTGCCCAAGGC CAAGAGCCAT 1080
GCCCCGGAGG TCATAACGTC CTCTCCATTA AAGTGAGATCCCACTC 1126

(2) 配列番号２８の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 45 塩基対
(B)型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号２８:
GAAGAAGGGA TCCTGGTGCC TCGTGGTTCT GGCACTACAAATACT 45

(2) 配列番号２９の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 30 塩基対
(B) 型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸
(A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」
(xi) 配列：配列番号２９:
CTGGCCTCAA GCTTAACGGAATTCACCTTT 30

(2) 配列番号３０の情報:
(i) 配列の特色：
(A)長さ： 25 アミノ酸
(B) 型： アミノ酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： ペプチド
(xi) 配列：配列番号３０:
Ala Pro Met AlaGlu Gly Glu Gln Lys Pro Arg Glu Val Val Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val TyrLys Arg Ser Tyr Cys
20 25

(2) 配列番号３１の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 26 アミノ酸
(B) 型： アミノ酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： ペプチド
(xi) 配列：配列番号３１:
Ala Pro Met AlaGlu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp ValTyr Gln Arg Ser Tyr Cys
20 25

(2) 配列番号３２の情報:
(i) 配列の特色：
(A) 長さ： 25 アミノ酸
(B) 型： アミノ酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： ペプチド
(xi) 配列：配列番号３２:
Met Ala Ala GlySer Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Gly Gly
1 5 10 15
Asp Gly Gly AlaPhe Ala Pro Gly Cys
20 25

Claims (11)

  1. 以下の（ａ）および（ｂ）を含む、腫瘍血管系における凝固を刺激するための結合リガンド：
    （ａ）腫瘍血管系に結合する第１結合領域であって、ここで該第１結合領域は腫瘍血管系における細胞表面ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプターに結合するＶＥＧＦ／ＶＰＦであり、（ｂ）に作動可能に連結している、領域；
    （ｂ）可溶性組織因子、または可溶性組織因子に結合する第２結合領域であって、該第２結合領域は、抗体または該可溶性組織因子に結合する抗体の抗原結合性領域である、領域。
  2. 前記第１結合領域が、前記可溶性組織因子に作動可能に連結する、請求項１に記載の結合リガンド。
  3. 前記第１結合領域が、前記可溶性組織因子に結合する前記第２結合領域に作動可能に連結する、請求項１に記載の結合リガンド。
  4. 前記第２結合領域に結合した前記可溶性組織因子をさらに含む、請求項３に記載の結合リガンド。
  5. 前記第１結合領域が、共有結合を介して前記可溶性組織因子または前記第２結合領域に作動可能に連結する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合リガンド。
  6. 前記第１結合領域が、選択的に切断可能なペプチド結合を介して前記可溶性組織因子に連結する、請求項５に記載の結合リガンド。
  7. 前記結合リガンドは、宿主細胞中で組換えベクターを発現させることによって調製される融合タンパク質であり、該ベクターは、同じリーディングフレーム中に、前記可溶性組織因子または第２結合領域をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結した前記第１結合領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合リガンド。
  8. 前記可溶性組織因子は、ＶＩＩ因子を活性化する能力が欠損した変異組織因子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合リガンド。
  9. 前記変異組織因子は、１５８位のＴｒｐがＡｒｇに変化し；１６２位のＳｅｒがＡｌａに変化し；１６４位のＧｌｙがＡｌａに変化し；または１５８位のＴｒｐがＡｒｇに変化し、かつ１６２位のＳｅｒがＡｌａに変化する変異組織因子である、請求項８に記載の結合リガンド。
  10. 腫瘍血管系に可溶性組織因子を送達することにより、治療において使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の結合リガンド。
  11. 明細書に記載の結合リガンド。
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