JP2009296907A - 抗体を選別するためのベクター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(i)抗体の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)が、互いに会合可能な第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドとそれぞれ融合した2種の融合タンパク質からなるヘテロ会合体を、分泌またはファージのコートタンパクの融合タンパク質として発現可能な塩基配列を含み、(ii)かつ上記第一ポリペプチド又は第二ポリペプチドコードする塩基配列内もしくはその周辺に少なくとも2箇所の制限酵素認識配列を有する、組み換えベクター。
【選択図】なし
Description
好ましくは、ヘテロ会合体は、F(ab')2断片である。
好ましくは、ヘテロ会合体は、IgGである。
(1)翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → CL遺伝子配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CH1遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン
(2)翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CH1遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → CL遺伝子配列 → 終止コドン
(3)翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → CH1遺伝子配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン
(4)翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → CH1遺伝子配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → 終止コドン
好ましくは、ロイシンジッパー蛋白質が、Fos及びJunである。
好ましくは、第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドがそれぞれ、プロテアーゼまたはその不活性変異体及びプロテアーゼインヒビターの一方と他方である。
好ましくは、Fab断片の混合物中から目的抗原に対する親和性の高いFab断片混合物を選択した後に、相互作用の少ない抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)を選択する。
本発明の一例を示す本明細書の実施例においては、繊維状ファージのコートタンパク質上に、測定に供する抗体のFab断片、即ち、抗原認識部位を構成する重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を、それぞれ重鎖定常領域(CH1)と軽鎖定常領域(CL)と結合させた形のヘテロニ量体として提示させている。特に、本発明においては、ファージミドベクター上において、CH1領域をコードする遺伝子配列の両側に特異性の高い制限酵素切断部位を組み込んでおく。これにより、Fab提示ファージとして抗原結合により選択されたファージよりファージミドDNAを抽出し、これを制限酵素処理してセルフライゲーションさせ、再度大腸菌に形質転換してファージを調製することにより、抗原特異的L鎖とVH断片提示ファージの両方を含む培養上清を得ることができる。この培養上清を、L鎖特異的結合タンパク質を固定化したマイクロプレートに接触させ、さらに抗原を加えた場合と加えない場合でファージのプレートへの結合量を酵素標識抗ファージ抗体で評価することにより、抗原非存在下でのVHとVLの相互作用が小さく、抗原存在下でVHとVLの会合定数が大きくなるVHとVLを選択することができる。
(1)翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → CL遺伝子配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CH1遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン
(2)翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CH1遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → CL遺伝子配列 → 終止コドン
(3)翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → CH1遺伝子配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン
(4)翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → CH1遺伝子配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → 終止コドン
4057-4064 (2003);上田 宏. 小分子を非競合的に測定可能な新しい免疫測定法 Bio Medical Quick Review Nets No.027 (2004);及び上田 宏. "競合法によらない小分子の免疫測定". 生化学, 76(7), 670-674 (2004))。市販のファージ抗体システムに良く似たこの方法(split Fvシステム)を用いれば、手持ちのハイブリドーマの抗体可変領域の抗原結合能とVH/VL相互作用の強弱の両方を、ファージを作る大腸菌を変えることで手軽に調べることができ、またより良い性質の抗体の選択ができる。
(1)VL断片をビオチン・アビジン相互作用を利用して、または物理的吸着を利用してチューブあるいはマイクロプレートに固定化する。
(2)VH断片とレポーター酵素(例えばアルカリフォスファターゼ)との融合蛋白質を作製しておき、これをサンプルと共にVLを固定化した固相と一定時間接触させる。
(3)洗浄後、固相化された酵素活性を測定し、サンプル中の抗原濃度の指標とする。
(1)VH断片とVL断片を互いに吸収・蛍光スペクトル重なる二種類の蛍光色素(例えばフルオレセインとローダミン)で標識しておく。
(2)これらをサンプルと混合し、5分程度おいて短波長側の蛍光色素のみを励起光で励起する。二種類の蛍光色素由来の蛍光強度を測定することで、VH/VLの会合による蛍光エネルギー移動現象を検出することができる。二つの蛍光強度の比をサンプル中の抗原濃度の指標とする。この方法では前の方法に比べて、短時間で洗浄操作なしに抗原濃度が測定できる。
(1)VH断片とVL断片を、それぞれ単体では活性がないか、低いが近接させると活性の増大する二種類の酵素断片(例えばLacZ△αおよびLacZ△ω)との融合蛋白質として大腸菌で発現させ、精製しておく。
(2)二種類の融合蛋白質とサンプルを混合し、一定時間おいたのち基質(例えば発光基質Galacton Plus, Tropix, Bedford, MA)と混合し、融合蛋白質複合体の活性を測定することでサンプル中の抗原濃度の指標とする。この方法では、前の2つの方法に比べてはるかに高感度に抗原濃度を測定することが可能であり、また洗浄操作を含まない(Yokozeki et al.,Anal.Chem.74(11),2500-2504,2002)。
Fab型抗体断片提示用ベクター(Fab/pDong1)は、図1のように作製した。プライマー配列は表1に示す。提示するFab断片の定常領域はヒトIgのCH1とCkを、可変領域(VH/VL)はニワトリ卵白リゾチーム(HEL)を認識するマウス抗体であるHyHEL10のVH/VLを用いた。
これまでに、Fab/pDong1を導入したTG-1大腸菌をヘルパーファージKM13により感染させることで調製した、HyHEL10由来Fab抗体提示ファージの抗原及び各タグ抗体との結合能をELISAによって確認した。
本システムのFab提示ファージが、ライブラリのパニングに応用できることを確認するため、モデルライブラリからのパニングを行った。
10μg/mlのHELを含む50 mM NaHCO3溶液(pH 9.6)、10μg/mlのBSAを含むPBS溶液、1 μg/mlの抗c-Myc抗体を含むPBS溶液、PBS溶液をそれぞれFalcon 3912マイクロプレートに1ウェルあたり100μlずつ分注し、4℃で16時間静置した。このプレートにパニング前と後それぞれのファージを1ウェルあたり5 x 109 cfuで反応させ、3と同じ条件でELISAを行った。その結果、図4に示したように、パニング後では、HELに対してシグナルは著しく増加した。更にラウンド1のパニング後、得たクローンの含むプラスミドの種類を調べるために、コロニーPCRを行った。コロニーPCRでは、GoTaq Green Master Mix (Promega Co., Madison, WI)に、プライマーM13RVとpHENSEQをそれぞれ5 pmolを加えた後、水を加えて全量を10μlとし、コロニー片の付着した爪楊枝で攪拌後、アニーリング温度50℃にて、PCR反応を行った。配列上の計算で得た増幅断片のサイズは、Fab/pDong1(HyHEL-10)由来の増幅断片のサイズは852 bpであるのに対し、抗BSA scFv提示ベクターpIT2(13CG2)からの増幅断片のサイズは902 bpである。コロニーPCRの結果、図5に示したように、16個のクローンの中には、Fab/pDong1(HyHEL-10)は10個であるのに対し、pIT2(13CG2)は5個であった。即ち、HyHEL10のFab断片を提示したファージはHELによるパニングで約10,000倍濃縮できた。
約50 ngのFab/pDong1(HyHEL-10)を制限酵素SgrAIで添付反応液を用いて37℃3時間処理し、精製した後に、DNA Ligation high ver.2を加えて、16℃30分間セルフライゲーションさせ、TG-1ケミカルコンピテントセルに加えて形質転換した。形質転換株を100μg/ml Amp、1% グルコースを含むLB寒天培地にて37℃一晩培養し、得られたコロニーから、CH1遺伝子が欠失したベクターOS/pDong1を有するクローンをコロニーPCRによって選択した。コロニーPCRは、プライマーhCkNarForとM13RVを用いて、上記と同様に行った。
Claims (12)
- (i)抗体の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)が、互いに会合可能な第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドとそれぞれ融合した2種の融合タンパク質からなるヘテロ会合体を、分泌またはファージのコートタンパクの融合タンパク質として発現可能な塩基配列を含み、かつ(ii)上記第一ポリペプチド又は第二ポリペプチドコードする塩基配列内もしくはその周辺に少なくとも2箇所の制限酵素認識配列を有する、組み換えベクター。
- 上記ヘテロ会合体が、抗体の重鎖可変領域(VH)と重鎖定常領域1(CH1)からなる融合タンパク質と、抗体の軽鎖可変領域(VL)と軽鎖定常領域(CL)からなる融合タンパク質とのヘテロ二量体であるFab断片である、請求項1に記載の組み換えベクター。
- ヘテロ会合体が、F(ab')2断片である、請求項1に記載の組み換えベクター。
- ヘテロ会合体が、IgGである、請求項1に記載の組み換えベクター。
- 5’から3’方向に各塩基配列を以下の(1)から(4)の何れかに記載の順番で含む、請求項2から4の何れかに記載の組み換えベクター。
(1)翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → CL遺伝子配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CH1遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン
(2)翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CH1遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → CL遺伝子配列 → 終止コドン
(3)翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → CH1遺伝子配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン
(4)翻訳開始配列 → VH遺伝子配列 → CH1遺伝子配列 → ファージのコートタンパク配列 → 終止コドン → 翻訳開始配列 → VL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → CL遺伝子配列 → 制限酵素認識配列 → 終止コドン - 第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドがそれぞれ、ロイシンジッパー蛋白質である、請求項1に記載の組み換えベクター。
- ロイシンジッパー蛋白質が、Fos及びJunである、請求項6に記載の組み換えベクター。
- 第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドがそれぞれ、プロテアーゼまたはその不活性変異体及びプロテアーゼインヒビターの一方と他方である、請求項1に記載の組み換えベクター。
- (i)請求項1から8の何れかに記載の組み換えベクターを、第一ポリペプチド又は第二ポリペプチドコードする塩基配列内もしくはその周辺に存在する制限酵素認識配列を切断できる制限酵素で処理する工程、(ii)上記工程(i)で得られたベクターを環状化することによって、第一ポリペプチド又は第二ポリペプチドコードする塩基配列が除かれた組み換えベクターを構築する工程を含む、抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)の一方を含むタンパク質を細胞外へ分泌することができ、かつ、抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)の他方を含むタンパク質を分泌またはファージのコートタンパク質との融合タンパク質として発現することが可能な組み換えベクターを製造する方法。
- 請求項9に記載の方法により製造された組み換えベクターを用いて、抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)の一方を含むタンパク質を細胞外へ分泌させ、かつ、抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)の他方を含むタンパク質を分泌またはファージのコートタンパク質との融合タンパク質として発現させることを含む、抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)との相互作用を評価する方法。
- 相互作用の少ない抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)を選択する、請求項10に記載の方法。
- Fab断片の混合物中から目的抗原に対する親和性の高いFab断片混合物を選択した後に、相互作用の少ない抗体の重鎖可変領域(VH)又は軽鎖可変領域(VL)を選択する、請求項11に記載の方法。
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JPN6013029716; 第8回日本蛋白質科学年会 プログラム・要旨集 , 20080523, p.101 * |
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