JP2009296889A

JP2009296889A - Method for culturing hematopoietic stem cell

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Publication number: JP2009296889A
Application number: JP2008151193A
Authority: JP
Inventors: Shin Kawamata; 伸川真田; Fumiko Nagahashi; 文子永橋; Lucia Barerin Chavez Ana; ルチアバレリンチャベスアナ; Nozomi Takada; のぞみ高田
Original assignee: Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Current assignee: Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2009-12-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for culturing hematopoietic stem cells, by which the hematopoietic stem cells can easily be amplified, and/or GLV can be avoided, and the safer transplantation of the cells is possible. <P>SOLUTION: CD34 positive cells having purity of ≥95% have been cultured in a differentiation culture medium prepared by adding hF1t3/4Ligand, hSCF, hTPO, and trehalose to X-VIVO10 (BioWhittaker, Gaitherburg MD) culture medium as a base culture medium. As the culture result, it has been confirmed that a counted value of CFU-GEMM at 5 ng/mL of trehalose is larger by about 17% than a counted value of CFU-GEMM at Nakahata protocol. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、造血幹細胞を培養する方法に関し、特にトレハロースを用いて造血幹細胞を増幅培養するものに関する。また、本発明は臍帯血由来のフィーダー細胞を用いた造血幹細胞の増幅培養に関する。 The present invention relates to a method for culturing hematopoietic stem cells, and particularly relates to a method for amplifying and culturing hematopoietic stem cells using trehalose. The present invention also relates to amplification culture of hematopoietic stem cells using umbilical cord blood-derived feeder cells.

生体内を流れる成熟血液細胞は、短期間の寿命（ヒトでは赤血球で約１２０日、血小板で約７日）しかなく、成熟血液細胞は造血前駆細胞から毎日分化増殖し、末梢血の成熟血液細胞の恒常性を保っている。造血幹細胞は、すべての血液細胞に分化する能力を持ち、その分化の多能性を維持しながら自己複製することが可能な細胞と想定されている。そして、この造血幹細胞が生体内に維持され続けることで、個体の生涯を通じて血液細胞が供給されるものと考えられる。 Mature blood cells flowing through the living body have a short life span (about 120 days for erythrocytes and about 7 days for platelets in humans), and mature blood cells differentiate and proliferate daily from hematopoietic progenitor cells. The homeostasis is maintained. Hematopoietic stem cells are assumed to have the ability to differentiate into all blood cells and are capable of self-replication while maintaining the pluripotency of differentiation. And it is thought that blood cells are supplied throughout the life of an individual by maintaining these hematopoietic stem cells in the living body.

造血細胞を増殖させる因子としては、SCF（stem cell factor）、flt-3/flk-2リガンドや、インターロイキン、コロニー刺激因子などが知られている。これらのサイトカイン等を用いて造血幹細胞を培養すると、造血幹細胞は多分化能を失い、幹細胞としての性質が消失する。分化を抑制することで幹細胞、あるいは造血前駆細胞を未分化な状態に保ち、造血幹細胞、あるいは造血前駆細胞を増殖あるいは維持することが可能なのではないかと考えられる。
造血幹細胞を未分化なまま体外増幅培養する方法としては、京都大学の中畑が開発したいわゆる中畑プロトコール(培養培地に、所定量のＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒを含む)が高い増幅効果が認められることが報告されている。［非特許文献１記載］
現在、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の難治性血液疾患に対し、骨髄移植治療が施されている。骨髄移植治療では、一生涯にわたり各種血球細胞を産生する造血幹細胞を提供者（ドナー）から取得し、取得した造血幹細胞を受容者（レシピエント）の骨髄に定着させる。この骨髄移植治療では、大量の骨髄細胞をドナーから取得する必要があるため、ドナーの心身への負担が大きいという問題がある。また、骨髄移植治療においては、ドナー由来のＴ細胞の混入による急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症や、自己移植の際のがん細胞の混入による再発という問題もある。 Known factors for proliferating hematopoietic cells include SCF (stem cell factor), flt-3 / flk-2 ligand, interleukin, and colony stimulating factor. When hematopoietic stem cells are cultured using these cytokines or the like, the hematopoietic stem cells lose pluripotency and the properties as stem cells disappear. By suppressing differentiation, it may be possible to keep stem cells or hematopoietic progenitor cells in an undifferentiated state and to proliferate or maintain hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells.
As a method for in vitro amplification culture of hematopoietic stem cells in an undifferentiated manner, a so-called Nakabata protocol (including a predetermined amount of SCF, TPO, FL, IL-6, and sIL-6R in the culture medium) developed by Nakabata of Kyoto University is available. It has been reported that a high amplification effect is observed. [Described in Non-Patent Document 1]
Currently, bone marrow transplantation is being performed for neoplastic blood diseases such as acute leukemia, intractable blood diseases such as severe immunodeficiency, adenosine deaminase deficiency, and aplastic anemia. In bone marrow transplantation treatment, hematopoietic stem cells that produce various blood cells for a lifetime are acquired from a donor (donor), and the acquired hematopoietic stem cells are established in the recipient's (recipient) bone marrow. In this bone marrow transplantation treatment, a large amount of bone marrow cells need to be obtained from the donor, which causes a problem that the burden on the mind and body of the donor is large. In addition, bone marrow transplantation treatment also has problems such as the development of acute graft-versus-host disease (GVHD) due to contamination of donor-derived T cells and recurrence due to contamination of cancer cells during autotransplantation.

このような状況の中、最近になって、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた。臍帯血を用いた造血幹細胞の移植治療では、骨髄や末梢血と比べて重症のＧＶＨＤの発生率が低いという利点がある。しかし、臍帯血を用いた造血幹細胞の移植治療には、臍帯から取得できる臍帯血の採取量が少ないという問題がある。このため、１個体に由来する臍帯血では体重４０ｋｇ程度までのレシピエントに移植可能とされている。
また、末梢血にも造血幹細胞が含まれていることが明らかになっている。そこで、少量の造血細胞を未分化なまま効率よく増幅させることができれば、上記の問題点が解決される。
例えば臍帯血については、取得した臍帯血に含まれる造血幹細胞を効率的に増幅培養する以下のような試みが行われている。 Recently, it has been revealed that umbilical cord blood contains hematopoietic stem cells similar to bone marrow, and is useful for transplantation treatment. Hematopoietic stem cell transplantation treatment using umbilical cord blood has the advantage that the incidence of severe GVHD is low compared to bone marrow and peripheral blood. However, transplantation treatment of hematopoietic stem cells using cord blood has a problem that the amount of cord blood collected from the cord is small. For this reason, umbilical cord blood derived from one individual can be transplanted to a recipient weighing up to about 40 kg.
It has also been clarified that peripheral blood contains hematopoietic stem cells. Therefore, if a small amount of hematopoietic cells can be efficiently amplified while remaining undifferentiated, the above-described problems can be solved.
For example, with respect to cord blood, the following attempts have been made to efficiently amplify and culture hematopoietic stem cells contained in the obtained cord blood.

このような造血幹細胞の増幅培養方法の一つに、胎盤組織および臍帯組織由来のストローマ細胞を、造血幹細胞を含むヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅培養に応用する造血幹細胞の培養方法（以下、組織由来増幅培養方法とする。）がある。組織由来増幅培養方法は、以下のように行われる。
（１）ヒト胎盤からの造血ストローマ細胞の分離回収
臍帯血採取後の胎盤から臍帯と羊膜を除去した後、母体側からハサミで組織を採取し、血液を可及的に取り除く。このようにして１個の胎盤より２００ｇ〜３００ｇの胎盤の組織切片を採取する。そして、これら組織切片を、培養皿に張り付け、所定の条件で１０日〜１４日培養した後、回収する。
（２）ヒト臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞の採取及び調製
採取したヒト臍帯血から単核細胞を回収する。回収した臍帯血単核細胞からＣＤ３４陽性細胞を分画する。
（３）臍帯血ＣＤ３４陽性細胞と胎盤由来造血ストローマ細胞との共培養
回収した組織切片と分画して得られた臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞とを、所定のサイトカインの存在下、所定条件で、１０日間、共培養する。なお、共培養の際に用いる組織切片は、ヒト胎盤由来の造血ストローマ細胞として機能する。
このような組織由来増幅培養方法により、ヒトＣＤ３４陽性幹細胞を簡便にしかも安全に増幅することが可能となる。よって、少量の臍帯血であっても、任意の成人患者に移植できる上に、数回にわたる継続投与が可能となる。
また、臍帯血を一度採取しておけば必要なときに必要な量だけ造血幹細胞を供給することが可能となる。 One such hematopoietic stem cell amplification culture method is a method of culturing hematopoietic stem cells (hereinafter referred to as tissue-derived amplification) in which stromal cells derived from placenta tissue and umbilical cord tissue are applied to amplification culture of human CD34-positive cells including hematopoietic stem cells. A culture method). The tissue-derived amplification culture method is performed as follows.
(1) Separation and collection of hematopoietic stromal cells from human placenta After removing the umbilical cord and amniotic membrane from the placenta after collecting umbilical cord blood, the tissue is collected from the maternal side with scissors and blood is removed as much as possible. In this way, 200 g to 300 g of placenta tissue sections are collected from one placenta. Then, these tissue sections are attached to a culture dish, cultured for 10 to 14 days under predetermined conditions, and then collected.
(2) Collection and preparation of CD34 positive cells from human umbilical cord blood Mononuclear cells are collected from the collected human umbilical cord blood. CD34 positive cells are fractionated from the collected cord blood mononuclear cells.
(3) Co-culture of umbilical cord blood CD34-positive cells and placenta-derived hematopoietic stromal cells Collected tissue sections and fractionated umbilical cord blood-derived CD34-positive cells in the presence of a predetermined cytokine under predetermined conditions Co-culture for 10 days. The tissue section used for co-culture functions as a hematopoietic stromal cell derived from human placenta.
By such a tissue-derived amplification culture method, human CD34-positive stem cells can be amplified easily and safely. Therefore, even a small amount of umbilical cord blood can be transplanted to any adult patient and can be continuously administered several times.
In addition, once cord blood is collected, hematopoietic stem cells can be supplied in a necessary amount when necessary.

さらに、骨髄移植においても大量の骨髄細胞を必要としない。よって、骨髄の採取に伴うドナーの心身への負担を低減することができる。
さらに、出産に伴って世界中で廃棄されている臍帯血を有効に活用することができる。現在、廃棄されている臍帯血を保有することによって、幅の広い移植抗原を有する造血幹細胞を保有することが可能となり、結果的に、移植抗原の適合する移植が可能となる。よって、重症のＧＶＨＤが発症するリスクを低減することが可能となる。
さらに、臍帯血由来の造血幹細胞を増幅する際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ
ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ、ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いれば、造血幹細胞の増幅後もストローマ細胞を分離する必要がなく、極めて容易に増幅した細胞を採取することができ、増幅させた細胞を、直接、輸注することができる。[特許文献１記載] Furthermore, bone marrow transplantation does not require a large amount of bone marrow cells. Therefore, the burden on the mind and body of the donor accompanying the collection of bone marrow can be reduced.
In addition, umbilical cord blood that is discarded all over the world with childbirth can be used effectively. By holding umbilical cord blood that is currently discarded, it is possible to hold hematopoietic stem cells having a wide range of transplanted antigens, and as a result, transplantation suitable for transplanted antigens becomes possible. Therefore, it becomes possible to reduce the risk of developing severe GVHD.
Furthermore, when amplifying umbilical cord blood-derived hematopoietic stem cells, human leukocyte antigens isolated from the same placenta (Human
Leukocyte Antigen (HLA) -adapted stromal cells do not require separation of stromal cells even after hematopoietic stem cell amplification, and the amplified cells can be collected very easily. Can be infused. [Patent Document 1]

さらに、現在、移植臍帯血幹細胞数不足を補う解決策として数種の臍帯血を同時に移植する複数臍帯血移が試みられており、所定の大学を中心に４０例以上の複数（ｄｏｕｂｌｅ)臍帯血移植が行われている。複数臍帯血移植では、白血病再発率が低いという利点がある。
特開平２００４−２２２５０２号公報 Ueda et al., “Expansion of human NOD/SCID-repopulating cells by stem cell factor,Flk2/Flt3 ligand, thrombopoientin, IL-6 and soluble IL-6 receptor”, The Journal of ClinicalInvestigation, April 2000, volume 105, Number 7, p1013-1021 Furthermore, as a solution to compensate for the shortage of transplanted cord blood stem cells, multiple umbilical cord blood transfusions in which several types of umbilical cord blood are transplanted at the same time have been attempted, and more than 40 cases of multiple umbilical cord blood centered on a predetermined university. A transplant has been made. Multiple cord blood transplantation has the advantage of a low leukemia recurrence rate.
JP-A-2004-222502 Ueda et al., “Expansion of human NOD / SCID-repopulating cells by stem cell factor, Flk2 / Flt3 ligand, thrombopoientin, IL-6 and soluble IL-6 receptor”, The Journal of Clinical Investment, April 2000, volume 105, Number 7, p1013-1021

造血幹細胞の増幅方法は数多く知られているが、その多くは分化を伴い、未分化なまま増幅させることができる方法であっても、多種の増殖因子等の生体成分を必要とし、非常に高価なものであった。
また、前述の臍帯血の増殖方法の１つである組織由来増幅培養方法には、次のような改善すべき点がある。
１．組織由来増幅培養方法では、胎盤から組織切片を取得し、造血幹細胞に対するストローマ細胞として、造血幹細胞と共培養している。一方、造血幹細胞は、臍帯から取得している。つまり、造血幹細胞を取得する臍帯とは異なる組織である胎盤を必ず必要とする。このため、取得した胎盤を保存しなければならないという改善すべき点がある。
また、胎盤自体を保存せずに胎盤から取得したストローマ細胞を保存するとしても、当該ストローマ細胞をセル・ライン化（株化）しなければならないという問題がある。セルライン化に際しては新たに遺伝子を導入等する必要があることから、遺伝子の選択や導入する遺伝子が幹細胞の増幅能や造血能等に与える影響を考えなければならないという新たな問題が発生する。 Many methods for amplifying hematopoietic stem cells are known, but many of them involve differentiation, and even methods that can be amplified undifferentiated require a large amount of biological components such as growth factors and are very expensive. It was something.
In addition, the tissue-derived amplification culture method, which is one of the above-described umbilical cord blood growth methods, has the following points to be improved.
1. In the tissue-derived amplification culture method, a tissue section is obtained from the placenta and co-cultured with hematopoietic stem cells as stromal cells for hematopoietic stem cells. On the other hand, hematopoietic stem cells are obtained from the umbilical cord. In other words, the placenta, which is a tissue different from the umbilical cord from which hematopoietic stem cells are obtained, is necessarily required. For this reason, there is a point to be improved that the obtained placenta must be preserved.
Moreover, even if the stromal cells obtained from the placenta are preserved without preserving the placenta itself, there is a problem that the stromal cells must be cell-lined (stocked). Since it is necessary to introduce a new gene or the like when making a cell line, there arises a new problem that the selection of the gene and the influence of the introduced gene on the ability of stem cells to amplify and hematopoiesis must be considered.

さらに、胎盤若しくは当該胎盤から取得したストローマ細胞を保存せずに、臍帯血の造血幹細胞を増幅させる必要が生じた時、つまり造血幹細胞の移植が必用となった時に取得できた胎盤を用いる場合には、造血幹細胞に対して同種異系のストローマ細胞と共培養し、得られた造血幹細胞を移植することとなる。よって、ストローマ細胞の生成の際に取り除けなかった病原菌や知られていないアレルゲンをも移植してしまう可能性があるという安全性の問題がある。
さらに、造血幹細胞を同種異系のストローマ細胞と共培養する場合、共培養結果得られた造血幹細胞とストローマ細胞との混合細胞から、ストローマ細胞を取り除かなければならない。このため、臍帯血由来の造血幹細胞の増幅の際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ
ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いる方法が考えられるが、造血幹細胞の増幅の際、つまり、造血幹細胞の移植の際に、ＨＬＡが適合するストローマ細胞を生成できる胎盤を必ず得られるかという問題がある。 Furthermore, when it is necessary to amplify hematopoietic stem cells of umbilical cord blood without storing the placenta or stromal cells obtained from the placenta, that is, when using the placenta obtained when transplantation of hematopoietic stem cells is necessary Will co-culture with allogeneic stromal cells for hematopoietic stem cells and transplant the obtained hematopoietic stem cells. Therefore, there is a safety problem that pathogens that could not be removed during the generation of stromal cells and unknown allergens may be transplanted.
Furthermore, when co-culturing hematopoietic stem cells with allogeneic stromal cells, stromal cells must be removed from the mixed cells of hematopoietic stem cells and stromal cells obtained as a result of co-culture. For this reason, human leukocyte antigens (Human isolated from the same placenta during the amplification of cord blood-derived hematopoietic stem cells)
Although a method using stromal cells compatible with Leukocyte Antigen (HLA) can be considered, is it possible to always obtain a placenta that can generate stromal cells compatible with HLA when hematopoietic stem cells are amplified, that is, when hematopoietic stem cells are transplanted? There is a problem.

さらに、同種異系のストローマ細胞を生成する胎盤が得られない場合に、異種のストローマ細胞を生成する組織を用いるとなれば、前述の安全性の問題がさらにクローズ・アップされることになる。
さらに、胎盤は、子宮（母親）由来の組織と胎児由来組織が混在することで、胎児に栄養を補給している。胎盤由来の間葉系細胞から作られたストローマ細胞で、他家由来の骨髄細胞を培養する場合はもちろんのこと、胎児由来の臍帯血を培養する場合でも、非自己組織(母親由来組織)に対するリンパ球活性化・免疫拒絶反応が引き起こされ、幹細胞の増幅以外に免疫担当細胞の増加と活性化が想定される。それゆえ胎盤由来のストローマ細胞で増幅された造血細胞を、骨髄移植に使用する場合、ＧＶＬ（移植細胞による免疫拒絶反応）を起こす可能性があり、移植細胞の十分な生着が見込まれない可能性がある。 Furthermore, if a placenta that produces allogeneic stromal cells cannot be obtained, the use of a tissue that produces heterologous stromal cells will further raise the above-mentioned safety issue.
Furthermore, the placenta replenishes the fetus with a mixture of uterine (mother) -derived tissue and fetal-derived tissue. Stromal cells made from placenta-derived mesenchymal cells, not only when culturing bone marrow cells derived from other families, but also when culturing fetal-derived umbilical cord blood, against non-self tissue (maternal tissue) Lymphocyte activation and immune rejection are caused, and the increase and activation of immunocompetent cells are expected in addition to stem cell amplification. Therefore, when hematopoietic cells amplified with placenta-derived stromal cells are used for bone marrow transplantation, GVL (immune rejection by transplanted cells) may occur, and sufficient engraftment of transplanted cells may not be expected There is sex.

この点自家組織である同一の臍帯血から作成されたストローマ細胞を造血幹細胞増幅に使うことは、上記のＧＬＶを回避でき、より安全な移植が可能であると考えられる。
ここで、胎盤ではなく臍帯を用いて、臍帯の間葉系組織からストローマを作成することによりこの問題を避けることが出来る。しかし、臍帯を臍帯血と同時に、セットで採取し保存するのは、採取ボランティアの手間・細胞分離技術・経費・時間・保管スペースの面で現実的でない。例えば、臍帯血については、臍帯血１００ｍｌ入りの輸血バッグから１．５ｍｌの液体チッソ保存用チューブに保管し直す必要がある。さらに、臍帯については、臍帯３０ｇをコラゲナーゼ処理した後、細胞を採取し、別の１．５ｍｌの保存用チューブに保管し直す必要がある。 In this regard, it is considered that the use of stromal cells prepared from the same umbilical cord blood that is an autologous tissue for hematopoietic stem cell amplification can avoid the GLV described above, and enables safer transplantation.
Here, this problem can be avoided by creating stroma from umbilical mesenchymal tissue using the umbilical cord instead of the placenta. However, it is not realistic to collect and store the umbilical cord together with the umbilical cord blood in terms of labor, cell separation technology, cost, time, and storage space of the collecting volunteer. For example, umbilical cord blood needs to be stored again in a 1.5 ml liquid tissue storage tube from a transfusion bag containing 100 ml of umbilical cord blood. Further, for the umbilical cord, after 30 g of the umbilical cord is subjected to collagenase treatment, the cells must be collected and stored again in another 1.5 ml storage tube.

２．前述の複数臍帯血移植では、血小板が６万以上にならないケースが数多く報告されており、移植細胞の生着という点では課題が残っている。
また、中畑プロトコールによる増殖では、ＣＤ３４陽性細胞の増幅効果が認められるが、主に、ＣＦＵ−ＧやＣＦＵ−ＧＭコロニー形成能を有するＣＤ３４陽性骨髄前駆細胞が増え、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー形成能を有する造血幹細胞の増幅に繋がっているかどうか不明である。
さらに、中畑プロトコールによる増殖では、骨髄移植で最も期待されるＧＶＬ（移植細胞による免疫拒絶反応）効果は不明であり、白血病再発率抑制も懸案の１つである。
そこで、本発明は、造血幹細胞を容易に増幅でき、又は／及びＧＬＶを回避でき、より安全な移植を可能とする造血幹細胞の培養方法を提供することを目的とする。 2. In the above-mentioned multiple cord blood transplantation, many cases where platelets do not reach 60,000 or more have been reported, and problems remain in terms of engraftment of transplanted cells.
Further, in the proliferation by the Nakabata protocol, an amplification effect of CD34 positive cells is observed, but mainly CD34 positive bone marrow progenitor cells having CFU-G and CFU-GM colony forming ability increase and have CFU-GEMM colony forming ability. It is unclear whether this has led to the expansion of hematopoietic stem cells.
Furthermore, in the growth by Nakabata protocol, the most expected GVL (immune rejection by transplanted cells) effect in bone marrow transplantation is unknown, and suppression of leukemia recurrence rate is one of the concerns.
Therefore, an object of the present invention is to provide a method for culturing hematopoietic stem cells that can easily amplify hematopoietic stem cells and / or avoid GLV and enable safer transplantation.

本発明における課題を解決するための手段及び発明の効果を以下に示す。
本発明に係る造血幹細胞の培養方法では、造血幹細胞を、トレハロースの存在下で培養する。
これにより、造血幹細胞の多分化能力を維持したまま当該造血幹細胞を増幅することができる。また、トレハロースは人体への安全性が高いと考えられることから、造血幹細胞としてヒト造血幹細胞を用いる場合には、人体への安全性が高い造血幹細胞を培養することができる。 Means for solving the problems in the present invention and the effects of the invention will be described below.
In the method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention, hematopoietic stem cells are cultured in the presence of trehalose.
Thereby, the hematopoietic stem cell can be amplified while maintaining the multi-differentiation ability of the hematopoietic stem cell. Since trehalose is considered to be highly safe to the human body, when human hematopoietic stem cells are used as hematopoietic stem cells, hematopoietic stem cells having high safety to the human body can be cultured.

本発明に係る造血幹細胞の培養方法では、ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ１３３陽性細胞である造血幹細胞を用いて造血幹細胞を培養する。
これにより、ＣＤ３４及びＣＤ１３３をマーカーとする造血幹細胞を容易に得て、培養することができる。
本発明に係る造血幹細胞の培養方法では、造血幹細胞が、臍帯血、骨髄、又は末梢血に由来する。
これにより、臍帯血、骨髄、末梢血を用いて造血幹細胞を容易に培養することができる。
本発明に係る造血幹細胞の培養方法では、造血幹細胞がヒト由来である。
これにより、ヒト由来の造血幹細胞を容易に培養することができる。
本発明に係る造血幹細胞の培養方法では、増幅された造血幹細胞が、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー形成能を有する細胞を含む集団である。
これにより、顆粒球-赤血球-マクロファージ-巨核芽球に分化することができるヒト造血幹細胞を容易に培養することができる。 In the method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention, hematopoietic stem cells are cultured using hematopoietic stem cells that are CD34-positive cells or CD133-positive cells.
Thereby, hematopoietic stem cells using CD34 and CD133 as markers can be easily obtained and cultured.
In the method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention, the hematopoietic stem cells are derived from umbilical cord blood, bone marrow, or peripheral blood.
Thereby, hematopoietic stem cells can be easily cultured using umbilical cord blood, bone marrow, and peripheral blood.
In the method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention, the hematopoietic stem cells are derived from a human.
Thereby, human-derived hematopoietic stem cells can be easily cultured.
In the method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention, the amplified hematopoietic stem cells are a population containing cells having CFU-GEMM colony forming ability.
As a result, human hematopoietic stem cells that can differentiate into granulocytes-erythrocytes-macrophages-megakaryoblasts can be easily cultured.

本発明に係る造血幹細胞の培養方法では、造血幹細胞として、造血幹細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養したものを用いる。
これにより、血液からストローマ細胞を取得するので、プライマリ・ストローマ細胞を容易に得ることができる。よって、プライマリ・ストローマ細胞を用いてヒト造血幹細胞を増幅することができるので、増幅したヒト造血幹細胞を用いた移植では、安全性が担保される。また、血液は容易に保存することができるので、ストローマ細胞のセル・ライン化（株化）といった問題が生じないことから、安全性が高いヒト造血幹細胞の移植が可能となる。
本発明に係る造血幹細胞の培養方法では、造血幹細胞とストローマ細胞が、同種同系のヒト臍帯血に由来する。
これにより、例えば臍帯血からヒト造血細胞及びストローマ細胞を取得することとすれば、臍帯血以外の組織を必要としない。臍帯血の保存は、現在、既に臍帯血バンクとして行われていることから、結果的に、必要なときに保存された臍帯血を用いてヒト造血幹細胞を増幅することができる。 In the method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention, a hematopoietic stem cell that has been cultured in the presence of blood-derived stromal cells obtained from the same strain as the hematopoietic stem cell is used.
Thereby, since a stromal cell is acquired from the blood, a primary stromal cell can be obtained easily. Accordingly, since human hematopoietic stem cells can be amplified using primary stromal cells, safety is ensured in transplantation using amplified human hematopoietic stem cells. In addition, since blood can be easily stored, there is no problem of cell line formation (establishment) of stromal cells. Therefore, it is possible to transplant human hematopoietic stem cells with high safety.
In the method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention, the hematopoietic stem cells and stromal cells are derived from allogeneic human umbilical cord blood.
Thus, for example, if human hematopoietic cells and stromal cells are obtained from umbilical cord blood, no tissue other than umbilical cord blood is required. Since umbilical cord blood is currently stored as an umbilical cord blood bank, human hematopoietic stem cells can be amplified using umbilical cord blood that is stored when necessary.

さらに、臍帯血からストローマ細胞を取得することとすれば、現在、移植に必要とされるヒト造血幹細胞が少ないために破棄されている臍帯血であっても、当該臍帯血から容易にヒト造血幹細胞を増幅することができる。これにより、現在破棄されている臍帯血を、臍帯血バンクにおけるコレクションとして利用することができる。よって、臍帯血バンクにおけるコレクションの数が多くなるので、
移植を必要とするレシピエントとＨＬＡが適合する臍帯血が見つかる可能性を高めることができ、移植の成功率を向上させることができる。 Furthermore, if stromal cells are obtained from umbilical cord blood, human hematopoietic stem cells can be easily obtained from the umbilical cord blood even if the umbilical cord blood is discarded because there are few human hematopoietic stem cells currently required for transplantation. Can be amplified. Thereby, cord blood currently discarded can be used as a collection in the cord blood bank. Therefore, as the number of collections in the cord blood bank increases,
It can increase the likelihood of finding umbilical cord blood that is compatible with HLA and recipients in need of transplant, and can improve the success rate of transplant.

本発明の発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト造血幹細胞を、トレハロースの存在下で培養することにより、多分化能を有するヒト造血幹細胞を効率的に増幅することができることをみいだし、本発明を完成するに至った。
以下、本発明について詳細に説明する。 The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above problems, and as a result, human hematopoietic stem cells having multipotency are efficiently amplified by culturing human hematopoietic stem cells in the presence of trehalose. As a result, the present invention has been completed.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明にかかるヒト造血幹細胞の培養方法は、ヒト造血幹細胞を、トレハロースの存在下で培養することを特徴とする方法である。
「造血幹細胞」とは、全ての血球系細胞に分化可能な、自己再生能をもつ多能性幹細胞であって、具体的には、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー形成能を有する細胞を含む集団の意味に用いる。例えば、ヒト造血幹細胞には、細胞表面マーカーがＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−からなる長期造血幹細胞（ＬＴＨＳＣ）、及びＣＤ３４−、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０−、ＣＤ４５ＲＡ＋からなる短期造血幹細胞（ＳＴＨＳＣ）が含まれる。
また、造血幹細胞は、ヒト由来のものに限定されず、マウス等の哺乳動物由来のものも含む概念である。さらに、造血幹細胞は、特定の組織由来に限定されず、例えば、骨髄由来、末梢血由来、臍帯血由来であってもよい。 The method for culturing human hematopoietic stem cells according to the present invention is a method characterized by culturing human hematopoietic stem cells in the presence of trehalose.
“Hematopoietic stem cell” is a pluripotent stem cell capable of differentiating into all hematopoietic cells and capable of self-renewal, specifically, a group including cells having CFU-GEMM colony forming ability. Use. For example, human hematopoietic stem cells include long-term hematopoietic stem cells (LTHSC) comprising cell surface markers CD34 +, CD38-, CD90 +, CD45RA-, and short-term hematopoietic stem cells (STHSC) comprising CD34-, CD38 +, CD90-, CD45RA +. It is.
Moreover, hematopoietic stem cells are not limited to those derived from humans, but are also concepts including those derived from mammals such as mice. Furthermore, hematopoietic stem cells are not limited to a specific tissue, and may be derived from bone marrow, peripheral blood, or umbilical cord blood, for example.

「ヒト造血幹細胞」とは、あらゆる種類若しくは系統の血液成分に分化する多分化能力を有するとともに自己を複製する自己複製能力を有する細胞をいう。ヒト造血幹細胞は、例えば、ヒト骨髄、ヒト臍帯血、ヒト末梢血に存在する。
「トレハロースの存在下で培養する」とは、トレハロースの存在がヒト造血幹細胞の培養に影響が及ぶ状況で培養することをいう。
「トレハロースを含む培地」とは、培地にトレハロースが含まれていればよく、何らかの反応の有無、混合量、混合状態等を問うものではない。
「未分化」とは、ある段階の細胞から次の段階の細胞に分化することができる能力を有する幹細胞について、最初の段階からいずれの段階へも分化していないことをいう。
ここで、分化とは、細胞の表面に現れる表面抗原分子が変化して、次の成熟段階の細胞になることをいう。前記分化には、例えば、ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４陽性）からリンパ系幹細胞または骨髄系幹細胞または赤芽球になること等が含まれる。 “Human hematopoietic stem cells” refer to cells that have the ability to differentiate into blood components of all types or strains and have the ability to replicate themselves. Human hematopoietic stem cells are present, for example, in human bone marrow, human umbilical cord blood, and human peripheral blood.
“Culturing in the presence of trehalose” means culturing in a situation where the presence of trehalose affects the culture of human hematopoietic stem cells.
The “medium containing trehalose” is not particularly limited as long as trehalose is contained in the medium, and does not ask for the presence or absence of any reaction, the mixing amount, the mixing state, or the like.
“Undifferentiated” means that a stem cell having the ability to differentiate from a cell at one stage to a cell at the next stage has not differentiated from the first stage to any stage.
Here, differentiation means that a surface antigen molecule appearing on the surface of a cell changes to become a cell at the next mature stage. The differentiation includes, for example, the conversion from human hematopoietic stem cells (CD34 positive) to lymphoid stem cells, myeloid stem cells, or erythroblasts.

ヒト造血幹細胞は、特定の抗原表現型を発現している細胞である。よって、臍帯血、または臍帯血から抽出した有核細胞から、特定の抗原表現型を発現している細胞を抽出することによって、結果的にヒト造血幹細胞を得ることができる。
特定の抗原表現型としては、例えば、ＣＤ３４がある。したがって、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性細胞といえる。
ＣＤ３４陽性細胞は、例えば、臍帯血から分離抽出することによって得ることができる。具体的には、（１）臍帯血から有核細胞を分離抽出する工程、（２）抽出した有核細胞からマイクロビーズをコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）した抗ＣＤ３４抗体を用いてＣＤ３４陽性細胞を分離抽出する工程からなる。マイクロビーズをコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）した抗ＣＤ３４抗体としてＣＤ３４ＭＡＣＳビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製、ベルギッシュ・グラッドバッハ、ドイツ）を用い、マイクロビーズを用いてＣＤ３４陽性幹細胞を採取する装置として自動ＭＡＣＳ装置（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）及び自動ＭＡＣＳプログラムＰＯＳＳＥＬＤ２を用いる。 Human hematopoietic stem cells are cells that express a specific antigen phenotype. Therefore, human hematopoietic stem cells can be obtained as a result by extracting cells expressing a specific antigen phenotype from cord blood or nucleated cells extracted from cord blood.
An example of a specific antigen phenotype is CD34. Therefore, human hematopoietic stem cells can be said to be CD34 positive cells.
CD34 positive cells can be obtained, for example, by separating and extracting from umbilical cord blood. Specifically, (1) a step of separating and extracting nucleated cells from umbilical cord blood; (2) separating and extracting CD34 positive cells from the extracted nucleated cells using an anti-CD34 antibody conjugated with microbeads. Process. CD34MACS beads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) were used as anti-CD34 antibodies conjugated with microbeads, and an automatic MACS device (Miltenyi Biotec) was used as a device for collecting CD34-positive stem cells using microbeads. And automatic MACS program POSSELD2.

なお、特定の抗原表現型としては、ＣＤ３４の他に、他の造血幹細胞マーカーを使用することも、若しくはＣＤ３４に加えて複数併用することも可能である。他の造血幹細胞マーカーとしては、例えば、ＣＤ３８、ＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３があり、好ましくはＣＤ１３３である。
ヒト造血幹細胞が、いずれの幹細胞マーカーを発現しているかは、ＦＡＣＳを用いる方法等、公知の方法により測定することができる。
「ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー形成能」とは、ヒト造血幹細胞の分化の過程において、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成単位-顆粒球-赤血球-マクロファージ-巨核芽球）コロニーを形成することができる能力をいう。
また、多分化能力とは、ヒト造血幹細胞において、あらゆる細胞、系統、方向へ分化することができる能力をいい、特定の細胞、系統、方向へのみ分化することができる能力は含まない概念をいう。 As a specific antigen phenotype, in addition to CD34, other hematopoietic stem cell markers can be used, or a plurality can be used in combination with CD34. Other hematopoietic stem cell markers include, for example, CD38, DR, CD45, CD90, CD117, CD123, and CD133, preferably CD133.
Which stem cell marker the human hematopoietic stem cell expresses can be measured by a known method such as a method using FACS.
The “CFU-GEMM colony forming ability” refers to the ability to form CFU-GEMM (colony forming unit-granulocyte-erythrocyte-macrophage-megakaryroblast) colony in the process of differentiation of human hematopoietic stem cells.
Multipotency refers to the ability of human hematopoietic stem cells to differentiate into any cell, lineage, or direction, and not to include the ability to differentiate only in specific cells, lineages, or directions. .

「有核細胞」とは、核を有する細胞をいう。臍帯血から抽出できる有核細胞には、例えば、総ての系列に分化しうるヒト造血幹細胞、リンパ系幹細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄系幹細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、巨核球、単球、好中球、または赤芽球などが含まれる。
臍帯血からの有核細胞の抽出は、例えば、ＨＥＳ４０（ニプロ社製＃８９−１２０−５）を用いることによって実現できる。
ストローマ細胞とは、基質細胞または間質細胞をいう。ストローマ細胞及びストローマ細胞を含むヒト造血細胞造血用の補助剤は、例えば、ヒト造血幹細胞と同種同系から取得した血液から生成することが可能である。
ヒト造血幹細胞と同種同系から取得した血液とは、ヒト造血幹細胞の由来元の個体と同一の個体から取得する血液をいい、好ましくは、ヒト臍帯血、ヒト骨髄由来血液、若しくはヒト末梢血であり、さらに好ましくはヒト臍帯血である。
ストローマ細胞及びストローマ細胞を含むヒト造血幹細胞造血用の補助剤の生成は、例えば（１）臍帯血から、ＨＥＳ４０（ニプロ社製＃８９−１２０−５）を用いて有核細胞を分離抽出する工程、（２）有核細胞を平皿で培養し、付着細胞を選択的に増殖させセミ・コンフルエントな状態まで育成させる工程、により行われる。 “Nucleated cell” refers to a cell having a nucleus. Nucleated cells that can be extracted from umbilical cord blood include, for example, human hematopoietic stem cells, lymphoid stem cells, T precursor cells, B precursor cells, T cells, B cells, myeloid stem cells, mast cells that can differentiate into all lineages, Examples include basophils, eosinophils, neutrophils, macrophages, megakaryocytes, monocytes, neutrophils, or erythroblasts.
Extraction of nucleated cells from umbilical cord blood can be realized by using, for example, HES40 (Nipro # 89-120-5).
Stromal cells refer to matrix cells or stromal cells. Stromal cells and human hematopoietic cell hematopoietic adjuvants, including stromal cells, can be produced from blood obtained from the same strain as human hematopoietic stem cells, for example.
The blood obtained from allogeneic with human hematopoietic stem cells refers to blood obtained from the same individual as the origin of human hematopoietic stem cells, preferably human umbilical cord blood, human bone marrow-derived blood, or human peripheral blood More preferably, it is human umbilical cord blood.
For example, (1) a step of separating and extracting nucleated cells from cord blood using HES40 (Nipro # 89-120-5) from umbilical cord blood. (2) The step of culturing nucleated cells in a flat dish and selectively growing the adherent cells to a semi-confluent state.

なお、ストローマ細胞を含むヒト造血幹細胞造血用の補助剤とは、ヒト造血幹細胞を造血するために用いられる材料であって、ストローマ細胞を含むものであればよい。
有核細胞のセミ・コンフルエントな状態での培養とは、所定の領域において、有核細胞若しくは有核細胞から分化した細胞若しくはそれらの細胞群の全部若しくは一部が、所定の領域内で固定され、かつ、固定された有核細胞若しくは有核細胞から分化した細胞若しくはそれらの細胞群が、平皿で増殖期の細胞***頻度を保ちながら増殖している状態をさす。具体的には、有核細胞を２４ウェル細胞培養プレートに播種し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の湿潤雰囲気中で１０日〜１２日間培養することによって、２４ウェル細胞培養プレートにおいてセミ・コンフルエントな状態となったストローマ細胞を得ることができる。
「ヒト造血幹細胞をストローマ細胞の共存下で培養する」とは、ストローマ細胞の存在がヒト造血幹細胞の培養に影響が及ぶ状況で培養することをいう。 In addition, the adjuvant for human hematopoietic stem cell hematopoiesis containing stromal cells is a material used for hematopoiesis of human hematopoietic stem cells and may be any material containing stromal cells.
Culture of nucleated cells in a semi-confluent state means that nucleated cells, cells differentiated from nucleated cells, or all or part of those cell groups are fixed in a predetermined region. And the fixed nucleated cell, the cell differentiated from the nucleated cell, or those cell groups are growing in a flat dish while maintaining the cell division frequency in the growth phase. Specifically, nucleated cells are seeded in a 24-well cell culture plate and cultured in a humid atmosphere of 5% CO 2 concentration and 37 ° C. for 10 to 12 days, so that they are semi-confluent in the 24-well cell culture plate. A stromal cell in a state can be obtained.
“Culturing human hematopoietic stem cells in the presence of stromal cells” means culturing in a situation where the presence of stromal cells affects the culture of human hematopoietic stem cells.

ストローマ細胞の存在がヒト造血幹細胞の培養に影響が及ぶとは、ヒト造血幹細胞の造血能力をストローマ細胞がサポートする状況という。例えば、臍帯血由来のヒト造血幹細胞やストローマ細胞、若しくはサイトカインやケモカイン等に存在する共通の接着分子が、ヒト造血幹細胞の自己再生能力をサポートし、増幅の仲立ちをし得る状況や、臍帯血由来のストローマ細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕｍａｎＵｍｂｉｌｉｃａｌＶｅｎｕｓＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）類似の性質を示し、臍帯血中のヒト造血幹細胞が臍帯中に存在するときの微環境をｅｘｖｉｖｏにおいても模倣し得る状況がある。 The presence of stromal cells affects the culture of human hematopoietic stem cells, which means that stromal cells support the hematopoietic ability of human hematopoietic stem cells. For example, human hematopoietic stem cells and stromal cells derived from umbilical cord blood, or common adhesion molecules present in cytokines, chemokines, etc., can support the self-renewal ability of human hematopoietic stem cells and mediate amplification, Stromal cells exhibit similar properties to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and can mimic the microenvironment when human hematopoietic stem cells in umbilical cord blood are present in the umbilical cord even ex vivo There is a situation.

「凍結保存」とは、ヒト造血幹細胞の性質を変化させるものでなければ、いかなる方法も用いることができる。凍結保存の方法としては、例えば、保存しようとする細胞を培地と共に保存容器に納め、必要に応じて、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの凍結防御剤を加えて、プログラムフリーザーなどを用い緩速凍結を行い、その後液体窒素などの中に保存する方法を用いることができる。なお、培地（培養液）には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素などの無機物、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、サイトカイン、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含めてもよい。 “Cryopreservation” can be any method as long as it does not change the properties of human hematopoietic stem cells. As a cryopreservation method, for example, cells to be preserved are placed in a preservation container together with a medium, and if necessary, freezing such as glycerin, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), sucrose, glucose, polyvinylpyrrolidone (PVP), etc. A method of adding a protective agent, performing slow freezing using a program freezer, etc., and then storing it in liquid nitrogen or the like can be used. In addition, the medium (culture solution) includes inorganic substances such as sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, and chlorine, amino acids, vitamins, hormones, antibiotics, cytokines, fatty acids, sugars, or other chemical components or serum depending on the purpose. A biological component such as

「ヒト臍帯血」とは、ヒトの臍帯から取得できる血液のことをいう。ヒト臍帯血は、例えば、兵庫臍帯血バンク等の臍帯血バンクから取得することができる。
「ヒト骨髄由来血液」とは、ヒトの骨髄中に存在する髄液に含まれる血液をいう。ヒトの骨髄は、一般的な、骨髄バンクから取得することができる。
「培養」とは、常法に従って、例えば、以下のように実施することができる。培養容器中で、必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有したα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などの培地中に、あるいは、Ｘ−ＶＩＶＯ１０やＸ−ＶＩＶＯ１５などの培地中に、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、
ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＥＰＯ、ＴＰＯなどのサイトカインの存在下、ストローマ細胞及びＣＤ３４陽性細胞を加えて、３０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で培養する。培養期間は、数時間レベルの短期間のものから、おおよそ１年間にわたって行うような長期間のものまでを挙げることができる。長期間の場合は、定期的な培地交換を行い、温度、湿度、二酸化炭素濃度等をモニタリングして培養維持することにより、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞を増幅可能である。なお、培養は、開放条件下で行うことも可能であるし、閉鎖（密閉）条件下で行うことも可能である。 “Human umbilical cord blood” refers to blood that can be obtained from a human umbilical cord. Human umbilical cord blood can be obtained from an umbilical cord blood bank such as the Hyogo umbilical cord blood bank, for example.
“Human bone marrow-derived blood” refers to blood contained in cerebrospinal fluid present in human bone marrow. Human bone marrow can be obtained from a common bone marrow bank.
“Cultivation” can be performed according to a conventional method, for example, as follows. In a culture vessel, if necessary, biological components such as sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, amino acids, vitamins, hormones, antibiotics, fatty acids, sugars or other chemical components or serum depending on the purpose. In the medium such as α-MEM medium, RPMI-1640 medium or MEM basal medium, or in the medium such as X-VIVO10 or X-VIVO15, IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17,
In the presence of cytokines such as IL-18, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, SCF, FL, EPO, TPO, stromal cells and CD34 positive cells were added, and 30 ° C Culturing is performed at ˜40 ° C., preferably 37 ° C. The culture period can range from a short period of several hours to a long period of time over approximately one year. In the case of a long period of time, hematopoietic stem cells and progenitor cells including CD34 positive cells can be amplified by periodically changing the medium, monitoring the temperature, humidity, carbon dioxide concentration, etc. and maintaining the culture. The culture can be performed under open conditions or under closed (sealed) conditions.

培地（培養液）については、ストローマ細胞の維持・生存、及び、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる培地を用いてもよい。培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としては、ストローマ細胞の維持・生存、及び、ＣＤ３４陽性細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる環境条件を選択してもよい。なお、物理的条件における温度については、具体的には、３０℃〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。 Any medium may be used as long as it does not inhibit the maintenance / survival of stromal cells and the maintenance / survival / differentiation / maturation / self-replication of hematopoietic stem cells including CD34 positive cells. In culturing, physical environmental conditions such as temperature, osmotic pressure, and light, and chemical environmental conditions such as oxygen, carbon dioxide, pH, and oxidation-reduction potential include stromal cell maintenance / survival and CD34 positive cell maintenance. Any environmental condition may be selected as long as it does not inhibit survival, differentiation, maturation, or self-replication. In addition, about the temperature in physical conditions, it is 30 to 40 degreeC specifically, Preferably it is 37 degreeC.

サイトカインとは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増幅・分化の調節作用などを示す物質をいう。サイトカインには、具体的には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７，
ＩＬ−１８インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＦＬ（Ｆｌｔ‐３／４リガンド）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）等が含まれる。ヒト造血幹細胞を増幅する際に用いられるサイトカインとしては、例えば、ｈｕ−ＳＣＦ、ｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド、ｈｕ−ＴＰＯ等がある。 Cytokines are proteinaceous factors that are released from cells and mediate cell-cell interactions, and indicate substances that control immune responses, have antitumor effects, antiviral effects, and regulate cell amplification / differentiation. Specifically, cytokines include IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL. -11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17,
IL-18 interferon α (IFN-α), interferon β (IFN-β), interferon γ (IFN-γ), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), SCF (stem cell factor), FL (Flt-3 / 4 ligand), EPO (erythropoietin), TPO (thrombopoietin) and the like are included. Examples of cytokines used when amplifying human hematopoietic stem cells include hu-SCF, hu-Flt-3 / 4 ligand, hu-TPO and the like.

細胞培養に用いる培養容器には、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細が維持・生存・分化・成熟・自己複製することを阻害するものでなければいかなる素材・形状のものを用いることができる。例えば、支持台の素材としては、ガラス、合成樹脂、天然樹脂または金属等がある。また、培養容器は、ストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製することを阻害するものでなければいかなる素材、形状のものを用いることができる。例えば、培養容器の素材としては、ガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂、または金属等がある。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等がある。
本発明にかかるヒト造血幹細胞の培養方法は、ヒト造血幹細胞を、前記ヒト造血細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする方法である。 The culture vessel used for cell culture can be of any material and shape as long as it does not inhibit the maintenance, survival, differentiation, maturation, and self-replication of hematopoietic stem cells containing CD34-positive cells. For example, the material of the support base includes glass, synthetic resin, natural resin, metal, or the like. The culture vessel should be of any material and shape as long as it can maintain and survive stromal cells and does not inhibit the maintenance, survival, differentiation, maturation or self-replication of hematopoietic stem cells including CD34 positive cells. Can do. For example, the material of the culture container includes glass, synthetic resin including a non-woven fabric, natural resin, or metal. In addition, the shape of the culture vessel may be a polygonal prism such as a triangular prism, cube or cuboid, a polygonal pyramid such as a triangular pyramid or a quadrangular pyramid, an arbitrary shape such as a gourd, a sphere, a hemisphere, a circle, an ellipse, a semicircle, etc. There is.
The method for culturing human hematopoietic stem cells according to the present invention is a method characterized by culturing human hematopoietic stem cells in the coexistence of blood-derived stromal cells obtained from the same syngeneic strain as the human hematopoietic cells.

「培養物」とは、所定の細胞を培養した結果、得られるものであればよい。例えば、ＣＤ３４陽性細胞を所定のストローマ細胞の存在下において培養する方法であれば、培養物に当該ストローマ細胞が含まれていてもよい。また、サイトカイン存在下において培養する方法の場合も同様に、培養物に当該サイトカインが含まれていてもよい。
以下に、実施例により、本発明をより具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を具体的に説明のためのものであり、本発明を実施例に限定するものではない。 The “culture” may be any one obtained as a result of culturing predetermined cells. For example, if it is a method of culturing CD34 positive cells in the presence of a predetermined stromal cell, the stromal cell may be contained in the culture. Similarly, in the case of a method of culturing in the presence of cytokines, the culture may contain the cytokines.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the present invention.

以下において、本発明を具体的に説明する。なお、以下に示す実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明を実施例の範囲に限定するものではない。
第一培養実験の内容
（１）純度９５％以上のＣＤ３４陽性細胞を用意した。
（２）（１）のＣＤ３４陽性細胞を、２４ウェル細胞培養プレート（ＦＡＬＣＯＭ社製、ＳａｎＪｏｓｅＣＡ)を用いて培養する。培養に際して、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、５×１０３個のＣＤ３４陽性細胞が含まれるように調整し、さらに、分化培地を0.5ml加えた。 Hereinafter, the present invention will be specifically described. In addition, the Example shown below is for demonstrating this invention concretely, This invention is not limited to the range of an Example.
Contents of the first culture experiment (1) CD34 positive cells having a purity of 95% or more were prepared.
(2) The CD34-positive cells in (1) are cultured using a 24-well cell culture plate (manufactured by FALCOM, San Jose CA). At the time of culture, each well of a 24-well cell culture plate was adjusted to contain 5 × 10 3 CD34 positive cells, and 0.5 ml of differentiation medium was further added.

分化培地としては、Ｘ−ＶＩＶＯ１０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ＧａｉｔｈｅｒｂｕｒｇＭＤ）培地をベース培地として、ｈＦｌｔ３／４Ｌｉｇａｎｄ（Ｐｅｒｏｔｅｃｈ社製、ＬｏｎｄｏｎＵＫ）、ｈＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ｈＴＰＯ
（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、さらにトレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）（ＳｉｇｍａＪａｐａｎ社製、ＴｏｋｙｏＪａｐａｎ）を添加し、表１のように調整した分化培地１〜分化培地６を用いた。また、コントロールとしてトレハロースのみを加えなかった分化培地７（ベース・ファクター）、さらに、トレハロースを加えずｈＩＬ−６及びｈｓＩＬ−６Ｒを加えた分化培地７(フル・ファクター)を用いた。なお、分化培地８（フル・ファクター）を用いた培養は、造血幹細胞の増幅効果が高いとして知られる、いわゆる中畑プロトコルに沿うものである。 As a differentiation medium, X-VIVO10 (BioWhittaker, Gaitherburg MD) medium is used as a base medium, hFlt3 / 4 Ligand (Perotech, London UK), hSCF (Peprotech), hTPO
(Peprotech) and trehalose (Sigma Japan, Tokyo Japan) were added, and differentiation medium 1 to differentiation medium 6 prepared as shown in Table 1 were used. Further, as a control, differentiation medium 7 (base factor) in which only trehalose was not added, and differentiation medium 7 (full factor) in which hIL-6 and hsIL-6R were added without addition of trehalose were used. The culture using differentiation medium 8 (full factor) is in accordance with the so-called Nakabata protocol, which is known to have a high effect of hematopoietic stem cell amplification.

（３）培養開始後３日目に分化培地を交換した。
（４）培養開始後６日目と８日目に培養容量を２倍にし、さらに、分化培地の交換を行った。
（５）（４）の後、さらに２日間、培養開始後１０日目まで培養を継続した。
（６）培養開始後１０日目に、造血幹細胞に対するマーカであるＣＤ３４陽性細胞とＣＤ１３３陽性細胞の発現を測定した。測定方法及び測定結果については、後述する。
（７）培養開始後１０日目の造血幹細胞も用いて、培養の結果として得られた細胞の分化能を評価するためのメチルセルロース・アッセイを用いた培養を行った。メチルセルロース・アッセイを用いた培養方法については後述する。 (3) The differentiation medium was changed on the third day after the start of the culture.
(4) The culture volume was doubled on the 6th and 8th days after the start of the culture, and the differentiation medium was replaced.
(5) After (4), the culture was continued for another 2 days until the 10th day after the start of the culture.
(6) On the 10th day after the start of culture, the expression of CD34 positive cells and CD133 positive cells, which are markers for hematopoietic stem cells, was measured. The measurement method and measurement results will be described later.
(7) Using hematopoietic stem cells on day 10 after the start of culture, culture was performed using a methylcellulose assay for evaluating the differentiation potential of the cells obtained as a result of the culture. The culture method using the methylcellulose assay will be described later.

第二ＣＤ３４陽性細胞・ＣＤ１３３陽性細胞の発現測定
造血幹細胞に対するマーカーであるＣＤ３４陽性細胞とＣＤ１３３陽性細胞の発現の確認は、培養後１０日目に、ＦＡＣＳＡｒｉａｌ（ＢＤＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＳａｎＪｏｓｅＣＡ）を用いて、各分化培地において培養した細胞について、ＣＤ３４陽性細胞及びＣＤ１３３陽性細胞の発現を測定するFACS解析によって行った。
ＦＡＣＳ解析の結果の一つを図１に示す。図１Ａは、一つのウェル（対象ウェル）に含まれる細胞の総細胞数を示している。また、図１Ｂは、対象ウェルに含まれるＣＤ３４陽性細胞の細胞数を示している。図１Ａ及び図１Ｂから明らかなように、分化培地８（フル・ファクター）を用いた造血幹細胞の培養は、細胞増幅効果が高い。
一方、ＦＡＣＳ解析におけるＣＤ３４陽性細胞及びＣＤ１３３陽性細胞の発現解析結果を図２Ａ〜Ｈに示す。ここで、図２Ａ〜Ｆは、それぞれ、分化培地１〜分化培地６に対するＦＡＣＳ解析を示し、図２Ｇは分化培地７（ベース・ファクター）に対するＦＡＣＳ解析を、図２Ｈは分化培地８（フル・ファクター）に対するＦＡＣＳ解析を、それぞれ、示す。図２Ａ〜Ｈから明らかなように、図２Ａ〜Ｆは図２Ｈと同様の分布を示しており、トレハロースを添加した分化培地を用いて造血幹細胞を培養する方法には、ＣＤ３４陽性細胞の増幅効果があることが確認できる。 Measurement of expression of second CD34 positive cells / CD133 positive cells Expression of CD34 positive cells and CD133 positive cells, which are markers for hematopoietic stem cells, was confirmed using FACS Arial (BD BioScience San Jose CA) on the 10th day after culture. The cells cultured in each differentiation medium were subjected to FACS analysis for measuring the expression of CD34 positive cells and CD133 positive cells.
One of the results of FACS analysis is shown in FIG. FIG. 1A shows the total number of cells contained in one well (target well). FIG. 1B shows the number of CD34 positive cells contained in the target well. As is clear from FIGS. 1A and 1B, the culture of hematopoietic stem cells using differentiation medium 8 (full factor) has a high cell amplification effect.
On the other hand, the expression analysis results of CD34 positive cells and CD133 positive cells in FACS analysis are shown in FIGS. 2A to F show FACS analysis for differentiation medium 1 to differentiation medium 6, respectively, FIG. 2G shows FACS analysis for differentiation medium 7 (base factor), and FIG. 2H shows differentiation medium 8 (full factor). The FACS analysis for) is shown respectively. As is clear from FIGS. 2A to H, FIGS. 2A to F show the same distribution as FIG. 2H, and the method of culturing hematopoietic stem cells using a differentiation medium supplemented with trehalose has the effect of amplifying CD34 positive cells. It can be confirmed that there is.

第三ヒト造血幹細胞の分化能の評価
１．メチルセルロース・アッセイ
次に、培養されたヒト造血幹細胞の分化能を評価するために、培養のされたヒト造血幹細胞についてメチルセルロース・アッセイを施した。メチルセルロース・アッセイは、以下の手順で行った。
（１）培養１０日目に、各分化培地から１．２×１０３個の細胞を抽出する。
（２）（１）で抽出した細胞を３ｃｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＭ社製）上で培養した。培養にあたり、１．２ｍｌのＭＥＴＨＯＣＵＬＴ（Ｈ４３３０、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した。ＭＥＴＨＯＣＵＬＴＨ４３３０には、ｈＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ｈＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ｈＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ｈＧ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を、培養開始時に、添加し、表２のように調整した。 3. Evaluation of the differentiation potential of human hematopoietic stem cells Methylcellulose assay Next, in order to evaluate the differentiation ability of the cultured human hematopoietic stem cells, the cultured human hematopoietic stem cells were subjected to a methylcellulose assay. The methylcellulose assay was performed according to the following procedure.
(1) On the 10th day of culture, 1.2 × 10 3 cells are extracted from each differentiation medium.
(2) The cells extracted in (1) were cultured on a 3 cm dish (manufactured by FALCOM). For the culture, 1.2 ml of METHOCULT (H4330, manufactured by StemCell Technologies) was added. In METHOCULT H4330, hSCF (manufactured by Peprotech), hIL-6 (manufactured by Peprotech), hIL-3 (manufactured by Peprotech), hG-CSF (manufactured by Peprotech), and hGM-CSF (manufactured by Peprotech) are cultured. At the start, added and adjusted as in Table 2.

（３）メチルセルロース・アッセイによる培養開始後１４日目に、生成されるコロニーのタイプをＯｌｙｍｐｕｓＤＢ−１０（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてコロニータイプ毎に細胞数を計数した。 (3) On the 14th day after the start of culture by methylcellulose assay, the number of cells was counted for each colony type using Olympus DB-10 (Tokyo, Japan).

２．分化能の評価
メチルセルロース・アッセイによる培養によって形成されたコロニーの計数結果を図３に示す。図３Ａは、計数の実数を、図３Ｂは図３Ａを分化培地毎に棒グラフ化したものを示している。
図３Ａ、Ｂから明らかなように、分化培地３（トレハロース５ｎｇ／ｍｌ）におけるＣＦＵ−ＧＥＭＭの計数値は、分化培地８（フル・ファクター：中畑プロトコル）におけるＣＦＵ−ＧＥＭＭの計数値に対して、約１７％上まわっている。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、コロニー形成単位−顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核芽球とよばれ、将来的に赤血球、血小板、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球等、血液の根幹となる細胞へ分化していく能力を有している。従って、ＣＦＵ−ＧＥＭＭが多く形成されるということは、メチルセルロース・アッセイに用いたヒト造血幹細胞の多分化能を高いレベルで維持できることを意味している。 2. Evaluation of differentiation potential FIG. 3 shows the results of counting colonies formed by culturing by the methylcellulose assay. FIG. 3A shows the real number of the count, and FIG. 3B shows a bar graph of FIG. 3A for each differentiation medium.
As apparent from FIGS. 3A and 3B, the CFU-GEMM count in differentiation medium 3 (trehalose 5 ng / ml) is compared to the CFU-GEMM count in differentiation medium 8 (full factor: Nakabata Protocol). It is about 17% higher. CFU-GEMM is called colony forming unit-granulocyte-erythrocyte-macrophage-megakaryoblast, and in the future red blood cells, platelets, monocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils, etc. It has the ability to differentiate into the basic cells. Therefore, the formation of a large amount of CFU-GEMM means that the pluripotency of human hematopoietic stem cells used in the methylcellulose assay can be maintained at a high level.

つまり、図３Ａ、Ｂから、本実施例における分化培地３を用いてヒト造血幹細胞を培養することによって、多分化能を高いレベルで維持するヒト造血幹細胞を培養できることが確認された。
なお、トレハロースを添加した分化培地１〜分化培地６を用いたヒト造血幹細胞の培養において、分化培地３についてのみＣＦＵ−ＧＥＭＭの計数値が高いことから、培養に用いたヒト造血幹細胞、トレハロース、及びその他の添加物の間に分子レベルの特異的な相互作用介した何らかのメカニズムが存在していると考えられる。
That is, from FIGS. 3A and B, it was confirmed that human hematopoietic stem cells that maintain pluripotency at a high level can be cultured by culturing human hematopoietic stem cells using differentiation medium 3 in this example.
In addition, in the culture of human hematopoietic stem cells using differentiation medium 1 to differentiation medium 6 to which trehalose was added, only the differentiation medium 3 had a high CFU-GEMM count, so that the human hematopoietic stem cells, trehalose, and It is considered that some mechanism exists through specific interaction at the molecular level between other additives.

臍帯血由来有核細胞から抽出したＣＤ３４陽性細胞を用いて、ヒト造血幹細胞を培養した結果を以下に示す。
第一培養実験の内容
１．臍帯血の取得
研究使用目的に対するインフォームド・コンセントが得られた臍帯血を、兵庫臍帯血バンクから取得した。なお、ヒト材料を用いる全ての実験手続については、実験を行う前に、財団法人先端医療振興財団の倫理委員会による審査及び承認を得た。 The results of culturing human hematopoietic stem cells using CD34 positive cells extracted from cord blood-derived nucleated cells are shown below.
Contents of the first culture experiment Umbilical cord blood acquisition Umbilical cord blood with informed consent for research use was obtained from the Hyogo cord blood bank. All experimental procedures using human materials were reviewed and approved by the Ethics Committee of the Foundation for Advanced Medical Promotion before conducting the experiment.

２．臍帯血からのストローマ細胞の生成
（１）５０ｍｌ〜１００ｍｌの臍帯血から、有核細胞を分離抽出する。有核細胞の分離抽出に際しては、ＨＥＳ４０（ニプロ社製＃８９−１２０−５）を使用した。ＨＥＳ４０を臍帯血と、容量にして５対１の割合で混合した。混合の後、約１時間放置し赤血球を沈殿させた。有核細胞は上精中に存在しているので、有核細胞を含むＨＥＳ４０混合液（以下、ＨＥＳ４０ソリューションとする。）を上清液として回収した。
（２）分離抽出の結果得られたＨＥＳ４０ソリューションから、５００μｌのＨＥＳ４０ソリューションを、７分間、４００Ｇ、１０℃で遠心分離器にかけた。遠心分離の結果、上清のＨＥＳ４０を取り除き、有核細胞を得た。ウシ血清を１０％容量添加した５００μｌの培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）を有核細胞に加えて再懸濁する。
（３）その後、有核細胞を、２４ウェル細胞培養プレートに播種する。有核細胞を５％ＣＯ２濃度、３７℃の湿潤雰囲気中で１２日間培養し、セミ・コンフルエントなストローマ細胞を生成する。 2. Generation of stromal cells from umbilical cord blood (1) Nucleated cells are separated and extracted from 50 to 100 ml of umbilical cord blood. For separation and extraction of nucleated cells, HES40 (Nipro # 89-120-5) was used. HES40 was mixed with cord blood in a volume ratio of 5: 1. After mixing, the cells were left for about 1 hour to precipitate red blood cells. Since nucleated cells are present in the upper spermatozoon, the HES40 mixed solution containing nucleated cells (hereinafter referred to as HES40 solution) was collected as a supernatant.
(2) From the HES40 solution obtained as a result of the separation and extraction, 500 μl of the HES40 solution was centrifuged for 7 minutes at 400 G and 10 ° C. As a result of centrifugation, HES40 in the supernatant was removed, and nucleated cells were obtained. 500 μl medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) supplemented with 10% volume of bovine serum is added to the nucleated cells and resuspended.
(3) Thereafter, nucleated cells are seeded in a 24-well cell culture plate. Nucleated cells are cultured for 12 days in a humid atmosphere at 37 ° C. with 5% CO 2 concentration to produce semi-confluent stromal cells.

３．臍帯血由来有核細胞からのＣＤ３４陽性細胞の抽出
（１）上記２．（２）で得た有核細胞を７分間、４００Ｇ，１０℃で遠心しＨＥＳ４０ソリューションを除き、サリンへス液（杏林製薬社製＃８７３３１９）に１×１０９個/ｍｌとなるように再懸濁した。
（２）１×１０９個／ｍｌに調整した有核細胞に対して１ｍｌ当たり、１００μｌのＦｃＢｌｏｃｋ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ＃２７７６０３）、２００ｍｌの牛血清、１００μｌのＣＤ３４マイクロビーズ(ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製、＃２７７６０３）を添加し、ローテータを用いて、１０℃、３０分間で攪拌させた。
（３）有核細胞からＣＤ３４陽性細胞の抽出については、自動ＭＡＣＳ装置（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）、及び自動ＭＡＣＳプログラムＰＯＳＳＥＬＤ２を用いて行った。
（４）分離したＣＤ３４陽性細胞の純度を、ＦＡＣＳキャリブバー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、サン・ホセ、ＵＳ）を用いて測定し、純度９５％以上であることを確認した。
（５）抽出したＣＤ３４陽性細胞を、再びセルバンカー液（日本全薬工業社製＃ＢＣＬ−１）に１．５×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁させ、―８０℃、−１５０℃の冷凍庫または液体窒素下で冷凍保存した。 3. 1. Extraction of CD34 positive cells from cord blood-derived nucleated cells (1) The nucleated cells obtained in (2) are centrifuged at 400 G, 10 ° C. for 7 minutes, the HES40 solution is removed, and the suspension is resuspended in sarin hess solution (# 873319 manufactured by Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd.) at 1 × 10 9 cells / ml. It became cloudy.
(2) 100 μl FcBlock (Miltenyi Biotec # 277603), 200 ml bovine serum, 100 μl CD34 microbeads (Miltenyi Biotec, # 277603) per ml for nucleated cells adjusted to 1 × 10 9 cells / ml And stirred with a rotator at 10 ° C. for 30 minutes.
(3) Extraction of CD34 positive cells from nucleated cells was performed using an automatic MACS apparatus (Miltenyi Biotec) and an automatic MACS program POSSELD2.
(4) The purity of the separated CD34-positive cells was measured using a FACS caliber bar (manufactured by BD Bioscience, San Jose, US), and it was confirmed that the purity was 95% or more.
(5) The extracted CD34-positive cells are resuspended again in a cell banker solution (# BCL-1 manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) at a concentration of 1.5 × 10 6 cells / ml, −80 ° C., −150 ° C. Stored in a freezer or under liquid nitrogen.

４．臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞とストローマ細胞との共培養
（１）冷凍保存したＣＤ３４陽性細胞を、３７℃のウオーターバスに漬け解凍した。
（２）解凍したＣＤ３４陽性細胞を５×１０３個／５００μｌのＣＤ３４陽性細胞となるように調整した。このときの培養溶液は、Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地（ＣＡＭＢＲＥＸ社製、＃０４−３８０Ｑ、ボルチモア、ＵＳ）である。
（３）セミ・コンフルエントなストローマ細胞を有する２４ウェル細胞培養プレートを、ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製＃１４１９０）で３回洗浄し、２４ウェル細胞培養プレートに付着したストローマ細胞のみ得た。
（４）５００μｌに調整したＣＤ３４陽性細胞を、上記（３）で得たストローマ細胞が付着した２４ウェル細胞培養プレートに加えて共培養する。さらに５０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、ロンドン、ＵＫ）、２０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−Ｆｌｔ−３／４リガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及び１０ｎｇ／ｍｌのｈｕ−ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（以下、サイトカイン混合液とする。）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２濃度雰囲気下で培養した。
（５）培地及びサイトカイン混合液を、共培養の間、３日に一度追加しながら、１４日間、共培養した。 4). Co-culture of umbilical cord blood-derived CD34 positive cells and stromal cells (1) Cryopreserved CD34 positive cells were immersed in a 37 ° C. water bath and thawed.
(2) The thawed CD34 positive cells were adjusted to 5 × 10 3/500 μl of CD34 positive cells. The culture solution at this time is X-VIVO10 medium (CAMBREX, # 04-380Q, Baltimore, US).
(3) A 24-well cell culture plate having semi-confluent stromal cells was washed three times with DPBS (GIBCO # 14190) to obtain only stromal cells attached to the 24-well cell culture plate.
(4) The CD34-positive cells adjusted to 500 μl are added to the 24-well cell culture plate to which the stromal cells obtained in (3) above are attached and co-cultured. Furthermore, 50 ng / ml hu-SCF (Peprotech, London, UK), 20 ng / ml hu-Flt-3 / 4 ligand (Peprotech), and 10 ng / ml hu-TPO (Peprotech) ( In the following, a mixture of cytokines was added) and cultured in an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
(5) The medium and the cytokine mixture were co-cultured for 14 days while being added once every 3 days during the co-culture.

５．トレハロースを用いた培養
（１）上記４．（５）で培養した臍帯血由来有核細胞からＣＤ３４陽性細胞を抽出する。
（２）Ａ：ストローマ細胞と共に培養したＣＤ３４陽性細胞の培養
（１）で抽出したＣＤ３４陽性細胞を、２４ウェル細胞培養プレート（ＦＡＬＣＯＭ社製、ＳａｎＪｏｓｅＣＡ）を用いて培養する。培養に際して、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、５×１０３個のＣＤ３４陽性細胞が含まれるように調整し、さらに、分化培地を0.5ml加えた。
分化培地としては、Ｘ−ＶＩＶＯ１０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ＧａｉｔｈｅｒｂｕｒｇＭＤ）培地をベース培地として、ｈＦｌｔ３／４Ｌｉｇａｎｄ（Ｐｅｒｏｔｅｃｈ社製、ＬｏｎｄｏｎＵＫ）、ｈＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ｈＴＰＯ
（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、さらにトレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）（ＳｉｇｍａＪａｐａｎ社製、ＴｏｋｙｏＪａｐａｎ）を添加し、表１のように調整した分化培地１１、分化培地１２を用いた。また、コントロールとしてトレハロースのみを加えなかった分化培地１３（ベース・ファクター）、さらに、トレハロースを加えずhIL-6及びhsIL-6Rを加えた分化培地１４(フル・ファクター)を用いた。なお、分化培地１４（フル・ファクター）を用いた培養は、造血幹細胞の増幅効果が高いとして知られる、いわゆる中畑プロトコルに沿うものである。 5. Culture using trehalose (1) 4. CD34 positive cells are extracted from the cord blood-derived nucleated cells cultured in (5).
(2) A: Culture of CD34 positive cells cultured with stromal cells The CD34 positive cells extracted in (1) are cultured using a 24-well cell culture plate (manufactured by FALCOM, San Jose CA). At the time of culture, each well of a 24-well cell culture plate was adjusted to contain 5 × 10 3 CD34 positive cells, and 0.5 ml of differentiation medium was further added.
As a differentiation medium, an X-VIVO10 (BioWhittaker, Gaitherburg MD) medium is used as a base medium, hFlt3 / 4 Ligand (Perotech, London UK), hSCF (Peprotech), hTPO
(Peprotech) and trehalose (Sigma Japan, Tokyo Japan) were added, and differentiation medium 11 and differentiation medium 12 prepared as shown in Table 1 were used. Further, as a control, differentiation medium 13 (base factor) in which only trehalose was not added, and differentiation medium 14 (full factor) in which hIL-6 and hsIL-6R were added without addition of trehalose were used. Note that the culture using differentiation medium 14 (full factor) is in accordance with the so-called Nakabata protocol, which is known to have a high amplification effect of hematopoietic stem cells.

Ｂ：ストローマ細胞を用いずに培養したＣＤ３４陽性細胞の培養
上記３．（５）で冷凍保存したＣＤ３４陽性細胞を解凍する。解凍したＣＤ３４陽性細胞を、24ウェル細胞培養プレート（ＦＡＬＣＯＭ社製、ＳａｎＪｏｓｅＣＡ)を用いて培養する。培養に際して、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、５×１０３個のＣＤ３４陽性細胞が含まれるように調整し、さらに、上記分化培地１１〜分化培地１４を、それぞれ0.5ml加えた。
（３）培養開始後３日目に分化培地を交換した。
（４）培養開始後６日目と８日目に培養容量を２倍にし、さらに、分化培地の交換を行った。
（５）（４）の後、さらに２日間、培養開始後１０日目まで培養を継続した。
（６）培養開始後１０日目に、造血幹細胞に対するマーカーであるＣＤ３４陽性細胞とＣＤ１３３陽性細胞の発現を測定した。測定方法及び測定結果については、後述する。
（７）培養開始後１０日目の造血幹細胞も用いて、培養の結果として得られた細胞の分化能を評価するためのメチルセルロース・アッセイを用いた培養を行った。メチルセルロース・アッセイを用いた培養方法については後述する。 B: Culture of CD34-positive cells cultured without using stromal cells Thaw the CD34 positive cells stored frozen in (5). The thawed CD34-positive cells are cultured using a 24-well cell culture plate (manufactured by FALCOM, San Jose CA). At the time of culture, each well of a 24-well cell culture plate was adjusted to contain 5 × 10 3 CD34 positive cells, and 0.5 ml of each of the differentiation medium 11 to differentiation medium 14 was added.
(3) The differentiation medium was changed on the third day after the start of the culture.
(4) The culture volume was doubled on the 6th and 8th days after the start of the culture, and the differentiation medium was replaced.
(5) After (4), the culture was continued for another 2 days until the 10th day after the start of the culture.
(6) On day 10 after the start of culture, the expression of CD34 positive cells and CD133 positive cells, which are markers for hematopoietic stem cells, was measured. The measurement method and measurement results will be described later.
(7) Using hematopoietic stem cells on day 10 after the start of culture, culture was performed using a methylcellulose assay for evaluating the differentiation potential of the cells obtained as a result of the culture. The culture method using the methylcellulose assay will be described later.

第二ヒト造血幹細胞の分化能の評価
１．メチルセルロース・アッセイ
次に、培養されたヒト造血幹細胞の分化能を評価するために、培養のされたヒト造血幹細胞についてメチルセルロース・アッセイを施した。メチルセルロース・アッセイの手順については、実施例１と同様である。
２．分化能の評価
メチルセルロース・アッセイによる培養によって形成されたコロニーの計数結果を図４に示す。図４はコロニー計数の実数を分化培地毎に棒グラフ化して示している。
図４において、左側４つはストローマ細胞と共に培養したＣＤ３４陽性細胞を培養した結果を、右側４つはストローマ細胞を用いずに培養したＣＤ３４陽性細胞を培養した結果を、それぞれ示している。
図４に示す左側４つの結果から明らかなように、分化培地１１（トレハロース 5ng/ml）におけるＣＦＵ−ＧＥＭＭの計数値は、分化培地１４（フル・ファクター：中畑プロトコール）におけるＣＦＵ−ＧＥＭＭの計数値に対して、約３５％上まわっている。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、コロニー形成単位−顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核芽球とよばれ、将来的に赤血球、血小板、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球等、あらゆる血液の根幹となる細胞へ分化していく能力を有している。従って、ＣＦＵ−ＧＥＭＭが多く形成されるということは、本実施例における培養方法を用いることによって、多分化能が高いヒト造血幹細胞を培養できることを意味している。
つまり、図４から、本実施例における分化培地１１を用いてヒト造血幹細胞を培養することによって、多分化能が高いヒト造血幹細胞を培養できることが確認された。
また、図４に示す左側４つの結果と右側４つの結果との比較から、ＣＤ３４陽性臍帯血由来造血幹細胞の培養で、自己臍帯血由来のストローマ細胞をフィーダー細胞（支持細胞
）として共培養することで、フィーダー細胞なしの培養系と比べて造血幹細胞の増幅を確認できた。さらに、自己臍帯血由来のストローマ細胞をフィーダー細胞として用いる培養系において分化培地１１（トレハロース（５ｎｇ／ｍｌ）をＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３／４Ｌに添加）を用いた場合、分化培地１４（フル・ファクター（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３／４Ｌ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒを添加）を上回る、造血幹細胞の増幅効果が確認できた。 2. Evaluation of differentiation potential of human hematopoietic stem cells Methylcellulose assay Next, in order to evaluate the differentiation ability of the cultured human hematopoietic stem cells, the cultured human hematopoietic stem cells were subjected to a methylcellulose assay. The procedure for the methylcellulose assay is the same as in Example 1.
2. Evaluation of differentiation potential FIG. 4 shows the results of counting colonies formed by culturing using a methylcellulose assay. FIG. 4 shows the number of colonies counted as a bar graph for each differentiation medium.
In FIG. 4, the left four show the results of culturing CD34 positive cells cultured with stromal cells, and the right four show the results of culturing CD34 positive cells cultured without using stromal cells.
As is clear from the four results on the left side shown in FIG. 4, the CFU-GEMM count in differentiation medium 11 (trehalose 5 ng / ml) is the CFU-GEMM count in differentiation medium 14 (full factor: Nakabata Protocol). Compared to about 35%. CFU-GEMM is called colony forming unit-granulocyte-erythrocyte-macrophage-megakaryoblast, and in the future any blood such as erythrocyte, platelet, monocyte, macrophage, neutrophil, eosinophil, basophil etc. It has the ability to differentiate into cells that are the basis of Therefore, the fact that a large amount of CFU-GEMM is formed means that human hematopoietic stem cells with high pluripotency can be cultured by using the culture method in this example.
That is, it was confirmed from FIG. 4 that human hematopoietic stem cells with high pluripotency can be cultured by culturing human hematopoietic stem cells using the differentiation medium 11 in this example.
Further, from the comparison of the four results on the left side and the four results on the right side shown in FIG. 4, the stromal cells derived from autologous cord blood are co-cultured as feeder cells (supporting cells) in the culture of CD34 positive cord blood-derived hematopoietic stem cells. Thus, hematopoietic stem cell amplification was confirmed as compared with the culture system without feeder cells. Furthermore, when differentiation medium 11 (added trehalose (5 ng / ml) to SCF, TPO, Flt3 / 4L) in a culture system using stromal cells derived from autologous cord blood as feeder cells, differentiation medium 14 (full factor) The effect of amplifying hematopoietic stem cells could be confirmed, exceeding (added with SCF, TPO, Flt3 / 4L, IL-6, and sIL-6R).

本発明に係る造血幹細胞の培養方法は、例えば、自己由来の臍帯血から造血幹細胞を増幅培養することに用いることができる。 The method for culturing hematopoietic stem cells according to the present invention can be used, for example, for amplifying and culturing hematopoietic stem cells from autologous umbilical cord blood.

ヒト造血幹細胞の培養方法によって得られた培養物に関するＦＡＣＳ解析の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the FACS analysis regarding the culture obtained by the culture method of the human hematopoietic stem cell. ＦＡＣＳ解析におけるＣＤ３４陽性細胞及びＣＤ１３３陽性細胞の発現解析結果を示す図である。It is a figure which shows the expression-analysis result of CD34 positive cell and CD133 positive cell in FACS analysis. メチルセルロース・アッセイによる培養によって形成されたコロニーの計数結果を示す図である。It is a figure which shows the count result of the colony formed by culture | cultivation by a methylcellulose assay. メチルセルロース・アッセイによる培養によって形成されたコロニーの計数結果を示す図である。It is a figure which shows the count result of the colony formed by culture | cultivation by a methylcellulose assay.

Claims

造血幹細胞を、トレハロースの存在下で培養する造血幹細胞の培養方法。 A method for culturing hematopoietic stem cells, comprising culturing hematopoietic stem cells in the presence of trehalose.

ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ１３３陽性細胞であるヒト造血幹細胞を用いて造血幹細胞を培養する請求項１記載の造血幹細胞の培養方法。 The method for culturing hematopoietic stem cells according to claim 1, wherein the hematopoietic stem cells are cultured using human hematopoietic stem cells which are CD34 positive cells or CD133 positive cells.

造血幹細胞が、臍帯血、骨髄、又は末梢血に由来する請求項１又は２記載の造血幹細胞の培養方法。 The method for culturing hematopoietic stem cells according to claim 1 or 2, wherein the hematopoietic stem cells are derived from umbilical cord blood, bone marrow, or peripheral blood.

造血幹細胞がヒト由来である請求項１〜３のいずれかの項に記載の造血幹細胞の培養方法。 The method for culturing hematopoietic stem cells according to any one of claims 1 to 3, wherein the hematopoietic stem cells are derived from a human.

請求項１〜請求項４に係るいずれかの方法により増幅された造血幹細胞が、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー形成能を有する細胞を含む集団である請求項１〜請求項４に係るいずれかの造血幹細胞の培養方法。 The hematopoietic stem cell amplified by any one of the methods according to claims 1 to 4 is a population comprising cells having CFU-GEMM colony forming ability. Culture method.

造血幹細胞として、造血幹細胞と同種同系から取得した血液由来のストローマ細胞の共存下で培養したものを用いる請求項１〜請求項５に係るいずれかの造血幹細胞の培養方法。 6. The method for culturing hematopoietic stem cells according to any one of claims 1 to 5, wherein the hematopoietic stem cells used are those cultured in the coexistence of blood-derived stromal cells obtained from the same strain as the hematopoietic stem cells.

造血幹細胞とストローマ細胞が、同種同系のヒト臍帯血に由来する請求項６記載の造血幹細胞の培養方法。 The method for culturing hematopoietic stem cells according to claim 6, wherein the hematopoietic stem cells and stromal cells are derived from allogeneic human umbilical cord blood.

請求項１〜請求項７に係るいずれかの方法により得られる造血幹細胞培養物。 A hematopoietic stem cell culture obtained by any one of the methods according to claims 1 to 7.

トレハロースを含む造血幹細胞用の培地。 A medium for hematopoietic stem cells containing trehalose.