JP2009278942A - Reagent for assaying tyrosine kinase activity in bcr-abl - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の化合物により修飾された、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬と、それを用いた慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び一部の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者からの検体に含まれるチロシンキナーゼの薬物感受性を確認する方法に関する。 The present invention relates to a reagent for detecting tyrosine kinase activity of BCR-ABL modified with two or more compounds that enable fluorescence resonance energy transfer, chronic myeloid leukemia (CML) and one using the same. The present invention relates to a method for confirming drug sensitivity of tyrosine kinases contained in specimens from patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL).
白血病は、これを放置すると重大な合併症により死に至る血液腫瘍性疾患である。白血病の一種である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および一部の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）においては、９・２２番染色体の相互転座により生じる特徴的なフィラデルフィア（Ｐｈ１）染色体転座によりｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が形成され、この遺伝子から恒常的なチロシンキナーゼ活性をもつ細胞質タンパク質（ＢＣＲ−ＡＢＬ）が発現されること、そしてこのＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性によって種々のタンパク質がリン酸化されることが発症に関連していること、等が知られている。 Leukemia is a blood neoplastic disease that, if left unattended, leads to death due to serious complications. In chronic myelogenous leukemia (CML), which is a type of leukemia, and some acute lymphoblastic leukemias (ALL), a characteristic Philadelphia (Ph 1 ) chromosomal translocation caused by reciprocal translocation of chromosomes 9 and 22 occurs. A bcr-abl fusion gene is formed, a cytoplasmic protein (BCR-ABL) having constitutive tyrosine kinase activity is expressed from this gene, and various proteins are phosphorylated by the tyrosine kinase activity of this BCR-ABL. Is known to be related to the onset.
白血病の治療法としては、一般に、抗癌剤等の投与による薬学的治療又は造血幹細胞移植等の移植治療のいずれか、あるいはその両方が選択される。特に、ＣＭＬの薬学的治療は、２−フェニルアミノピリミジン系化合物であるチロシンキナーゼ阻害剤の投与を中心に行われており、現在では、登録商標名「イマニチブ」（ｉｍａｔｉｎｉｂ、ＳＴＩ−５７１又は登録商標名グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）とも呼ばれる）の投与が標準的な薬学的治療法となりつつある。 As a treatment method for leukemia, generally, either a pharmaceutical treatment by administration of an anticancer agent or the like, a transplantation treatment such as hematopoietic stem cell transplantation, or both is selected. In particular, the pharmaceutical treatment of CML is centered on the administration of a tyrosine kinase inhibitor, which is a 2-phenylaminopyrimidine-based compound, and is currently registered trademark “imatinib” (STI-571 or registered trademark). Administration of the name Gleevec) is becoming the standard pharmaceutical treatment.
イマニチブは、ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼドメインにおけるＡＴＰ結合部位を標的とする、選択性の高い分子標的薬物の一種である。一般に、分子標的薬物の使用は、その特異性から高い安全性と効果が期待される、理想の治療法の一つである。しかし同時に、分子標的薬物の使用は、突然変異を有する標的分子を持つ患者に対してはその期待される薬効が発揮され難いという問題を伴うことが多く、イマニチブを代表とするＢＣＲ−ＡＢＬを標的分子とした２−フェニルアミノピリミジン系化合物であるチロシンキナーゼ阻害剤もその例外ではない。 Imanitiv is a type of highly selective molecular target drug that targets the ATP binding site in the kinase domain of BCR-ABL. In general, the use of a molecular target drug is one of the ideal treatments that is expected to be highly safe and effective due to its specificity. At the same time, however, the use of molecularly targeted drugs is often accompanied by the problem that it is difficult for patients with target molecules having mutations to exhibit their expected efficacy, and target BCR-ABL, which is representative of Imanitiv. A tyrosine kinase inhibitor that is a 2-phenylaminopyrimidine compound as a molecule is no exception.
標準的な治療法であるイマチニブの投与によっても症状の改善を期待することが出来ない白血病患者にとって、イマニチブ以外の白血病治療薬の投与へと治療方針を速やかに変更すること、或いは白血病と診断された初期の段階から治療効果が望まれるイマニチブ以外の適切な薬物を選択して投与することは極めて重要であり、それは当該患者のイマニチブ耐性を検査することの重要性に通ずる。 For leukemia patients for whom improvement of symptoms cannot be expected even by administration of imatinib, which is a standard treatment, change the treatment policy promptly to administration of leukemia drugs other than imatinib, or leukemia is diagnosed It is extremely important to select and administer an appropriate drug other than imatinib for which a therapeutic effect is desired from an early stage, which leads to the importance of examining the patient's imatinib resistance.
現在、白血病患者のイマニチブ耐性の検査は、主に、患者のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の塩基配列を決定してＢＣＲ−ＡＢＬの変異の種類を確認する方法（例えば非特許文献１）又はＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質であるＣｒｋＬのリン酸化をイムノブロッティングで検出する方法（例えば非特許文献２）によって、行われている。 Currently, examination of imatinib resistance in leukemia patients is mainly performed by determining the base sequence of the patient's bcr-abl gene and confirming the type of BCR-ABL mutation (eg, Non-Patent Document 1) or BCR-ABL. This is performed by a method of detecting phosphorylation of CrkL, which is a substrate protein, by immunoblotting (for example, Non-Patent Document 2).
しかし、前記２つの方法は何れも比較的多量の検体（腫瘍細胞）を必要とする他に、感度やダイナミックレンジの点で十分とは言えないこと、さらにイムノブロッティングでは細胞の可溶化が必要であることから、再解析のためには採血や骨髄穿刺を繰り返す必要があること、などの問題が指摘されている。
本発明は、ＣＭＬ患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬの薬剤抵抗性を調べる際に有用な、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬と、それを用いたＢＣＲ−ＡＢＬの薬剤抵抗性の確認方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to a reagent for detecting tyrosine kinase activity of BCR-ABL useful for examining drug resistance of BCR-ABL in CML patients, and a method for confirming drug resistance of BCR-ABL using the same The purpose is to provide.
本発明者らは、２種の蛍光マーカーで修飾したＣｒｋＬを基質としてＢＣＲ−ＡＢＬに作用させることによって、高感度かつ広いダイナミックレンジを伴って、ＢＣＲ−ＡＢＬ のチロシンキナーゼ活性を検出できることを見いだし、下記の各発明を完成した。 The present inventors have found that tyrosine kinase activity of BCR-ABL can be detected with high sensitivity and a wide dynamic range by acting on BCR-ABL using CrkL modified with two kinds of fluorescent markers as a substrate, The following inventions have been completed.
（１）蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の分子により修飾された、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片からなる、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬。 (1) A tyrosine kinase of BCR-ABL comprising a substrate protein phosphorylated by BCR-ABL or a peptide fragment thereof containing a phosphorylated site, modified with two or more types of molecules capable of fluorescence resonance energy transfer Reagent for detecting activity.
（２）前記基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる基質タンパク質又はその１〜２２２番目までのアミノ酸配列からなるペプチド断片である、（１）に記載の試薬。 (2) The substrate protein or a peptide fragment thereof containing a phosphorylated site is a substrate protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a peptide fragment consisting of the amino acid sequence from 1 to 222, (1) The reagent according to 1.
（３）前記タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片のＮ末端とＣ末端がそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の分子により修飾された、（１）又は（２）に記載の試薬。 (3) The N-terminal and C-terminal of the peptide fragment containing the protein or the phosphorylated site are each modified with two or more kinds of molecules that enable fluorescence resonance energy transfer, according to (1) or (2) Reagent.
（４）蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の分子が、前記タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片のＮ末端及びＣ末端に融合タンパク質として連結された蛍光タンパク質である、（１）〜（３）に記載の試薬。 (4) Two or more kinds of molecules capable of fluorescence resonance energy transfer are fluorescent proteins linked as fusion proteins to the N-terminal and C-terminal of the protein or peptide fragment containing a phosphorylated site (1 ) To (3).
（５）蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ及びそれらの変異体よりなる群から選ばれる蛍光タンパクである、（４）に記載の試薬。 (5) The reagent according to (4), wherein the fluorescent protein is a fluorescent protein selected from the group consisting of GFP, eGFP, YFP, CFP, DsRed, and variants thereof.
（６）前記融合タンパク質が、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、（４）又は（５）に記載の試薬。 (6) The reagent according to (4) or (5), wherein the fusion protein is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8.
（７）チロシンキナーゼ阻害剤と請求項１〜６の何れかに記載の試薬と患者から採取された検体とをインキュベートする工程、及び前記試薬からの蛍光発光を検出する工程を含む、前記検体に含まれるチロシンキナーゼの前記阻害剤に対する抵抗性を確認する方法。 (7) Incubating the tyrosine kinase inhibitor with the reagent according to any one of claims 1 to 6 and a specimen collected from a patient, and detecting fluorescence emitted from the reagent, A method for confirming the resistance of the contained tyrosine kinase to the inhibitor.
（８）蛍光発光が、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の分子間における蛍光共鳴エネルギー移動により生ずる蛍光発光である、（７）に記載の方法。 (8) The method according to (7), wherein the fluorescence emission is fluorescence emission caused by fluorescence resonance energy transfer between two or more types of molecules that enable fluorescence resonance energy transfer.
（９）検体が腫瘍細胞であり、インキュベートが当該腫瘍細胞の内部で行われる、（７）又は（８）に記載の方法。 (9) The method according to (7) or (8), wherein the specimen is a tumor cell, and the incubation is performed inside the tumor cell.
（１０）試験化合物の存在下で請求項１〜６の何れかに記載の試薬とＢＣＲ−ＡＢＬとを反応させる工程、及び前記試薬からの蛍光発光を測定する工程を含む、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法。 (10) A tyrosine of BCR-ABL, comprising a step of reacting the reagent according to any one of claims 1 to 6 with BCR-ABL in the presence of a test compound, and a step of measuring fluorescence emission from the reagent. A method of screening for an inhibitor of kinase activity.
（１１）試験化合物の存在下で請求項１〜６の何れかに記載の試薬とＢＣＲ−ＡＢＬとを反応させる工程が、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現することのできる細胞の内部で行われる、（１０）に記載の方法。 (11) The step of reacting the reagent according to any one of claims 1 to 6 with BCR-ABL in the presence of a test compound is performed inside a cell capable of expressing BCR-ABL. ) Method.
（１２）ＳＨ２ドメインを含むタンパク質とＢＣＲ−ＡＢＬによって認識される被リン酸化部位を含むタンパク質の２種のタンパク質からなる、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬であって、前記２種のペプチドがそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子により修飾されていることを特徴とする、前記試薬。 (12) A reagent for detecting tyrosine kinase activity of BCR-ABL, comprising two kinds of proteins, a protein containing an SH2 domain and a protein containing a phosphorylated site recognized by BCR-ABL, Said reagent, characterized in that each peptide of the species is modified by a different molecule allowing fluorescence resonance energy transfer.
（１３）前記ＳＨ２ドメインを含むタンパク質及び前記被リン酸化部位を含むタンパク質がいずれも配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、（１２）に記載の試薬。 (13) The reagent according to (12), wherein both the protein containing the SH2 domain and the protein containing the phosphorylated site contain the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
（１４）前記ＳＨ２ドメインを含むタンパク質が配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる、（１２）に記載の試薬。 (14) The reagent according to (12), wherein the protein comprising the SH2 domain consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
（１５）前記被リン酸化部位が配列番号２に示されるアミノ酸配列の２０４〜２１１番目のアミノ酸配列である、（１２）〜（１４）の何れかに記載の試薬。 (15) The reagent according to any one of (12) to (14), wherein the phosphorylated site is the 204th to 211st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
（１６）蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子が、前記ＳＨ２ドメインを含むタンパク質のＮ末端と前記被リン酸化部位を含むペプチドのＣ末端に融合タンパク質として連結された異なる蛍光タンパク質である、（１２）〜（１５）の何れかに記載の試薬。 (16) The different molecules enabling fluorescence resonance energy transfer are different fluorescent proteins linked as fusion proteins to the N-terminus of the protein containing the SH2 domain and the C-terminus of the peptide containing the phosphorylated site. The reagent according to any one of 12) to (15).
（１７）蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ及びそれらの変異体よりなる群から互いに異なって選ばれる蛍光タンパクである、（１６）に記載の試薬。 (17) The reagent according to (16), wherein the fluorescent protein is a fluorescent protein selected from a group consisting of GFP, eGFP, YFP, CFP, DsRed, and variants thereof.
（１８）チロシンキナーゼ阻害剤と請求項１２〜１７の何れかに記載の試薬と患者から採取された検体とをインキュベートする工程、及び前記試薬からの蛍光発光を検出する工程を含む、前記検体に含まれるチロシンキナーゼの前記阻害剤に対する抵抗性を確認する方法。 (18) Incubating the tyrosine kinase inhibitor, the reagent according to any one of claims 12 to 17 with a specimen collected from a patient, and detecting fluorescence emitted from the reagent, A method for confirming the resistance of the contained tyrosine kinase to the inhibitor.
（１９）蛍光発光が、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の分子間における蛍光共鳴エネルギー移動により生ずる蛍光発光である、（１８）に記載の方法。 (19) The method according to (18), wherein the fluorescence emission is fluorescence emission caused by fluorescence resonance energy transfer between two or more kinds of molecules enabling fluorescence resonance energy transfer.
（２０）検体が腫瘍細胞であり、インキュベートが当該腫瘍細胞の内部で行われる、（１８）又は（１９）に記載の方法。 (20) The method according to (18) or (19), wherein the specimen is a tumor cell, and the incubation is performed inside the tumor cell.
（２１）試験化合物の存在下で（１２）〜（１７）の何れかに記載の試薬とＢＣＲ−ＡＢＬとを反応させる工程、及び前記試薬からの蛍光発光を測定する工程を含む、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法。 (21) A step of reacting the reagent according to any one of (12) to (17) with BCR-ABL in the presence of a test compound, and a step of measuring fluorescence emission from the reagent, BCR-ABL A method for screening an inhibitor of tyrosine kinase activity.
（２２）試験化合物の存在下で（１２）〜（１７）の何れかに記載の試薬とＢＣＲ−ＡＢＬとを反応させる工程が、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現することのできる細胞の内部で行われる、（２１）に記載の方法。 (22) The step of reacting the reagent according to any of (12) to (17) with BCR-ABL in the presence of a test compound is performed inside a cell capable of expressing BCR-ABL. The method according to (21).
本発明の試薬は、患者から採取される血液検体に含まれる微量の腫瘍細胞を用いてＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出することができる。またその検出は核酸の塩基配列決定やイムノブロッティングなどのような多段各かつ複雑な工程を必要とせず簡便迅速であり、かつ高感度で広いダイナミックレンジにおいて行うことができる。 The reagent of the present invention can detect the tyrosine kinase activity of BCR-ABL using a small amount of tumor cells contained in a blood sample collected from a patient. In addition, the detection can be carried out simply and quickly without requiring multi-step and complicated steps such as determination of nucleic acid base sequence and immunoblotting, and can be performed with high sensitivity and a wide dynamic range.
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の分子により修飾された、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片からなる、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬に関する。 The present invention relates to a tyrosine of BCR-ABL comprising a substrate protein phosphorylated by BCR-ABL or a peptide fragment thereof containing a phosphorylated site, which is modified by two or more kinds of molecules enabling fluorescence resonance energy transfer The present invention relates to a reagent for detecting kinase activity.
本発明の試薬は、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする２種以上の分子により修飾されている。蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、以下ＦＲＥＴと表す）は、電子励起状態の異なる２種以上の分子間の相互作用であり、一方の分子（ドナー分子）が外部の光源による励起の後、他方の分子（アクセプター分子）にそのエネルギーが転移される現象である。 The reagents of the present invention are modified with two or more molecules that allow fluorescence resonance energy transfer. Fluorescence resonance energy transfer (hereinafter referred to as FRET) is an interaction between two or more kinds of molecules having different electronic excited states, and one molecule (donor molecule) is excited by an external light source, This is a phenomenon in which the energy is transferred to the other molecule (acceptor molecule).
一般的に、ＦＲＥＴを利用する場合、ドナー分子とアクセプター分子は互いに異なる分子が使用される。この場合において、ＦＲＥＴはアクセプターの増感蛍光の出現によって、またはドナー分子からの蛍光消光によって検出され得る。また、ＦＲＥＴを達成するためには、ドナー分子は、光を吸収するとともにアクセプター分子に対して励起された電子の共鳴を通じて転移させることのできる分子であることが必要である。さらに、ＦＲＥＴを生じさせるために、ドナー分子の発光波長はアクセプター分子の励起波長よりも低いことが必要である。 In general, when FRET is used, donor molecules and acceptor molecules are different from each other. In this case, FRET can be detected by the appearance of acceptor-sensitized fluorescence or by fluorescence quenching from the donor molecule. In order to achieve FRET, the donor molecule needs to be a molecule that can absorb light and can be transferred through resonance of electrons excited with respect to the acceptor molecule. Furthermore, in order to cause FRET, the emission wavelength of the donor molecule needs to be lower than the excitation wavelength of the acceptor molecule.
本発明における２種以上の分子は、上記の条件を満たすＦＲＥＴを可能とするドナー分とアクセプター分子の組合せとして選択され、使用される。かかるドナー分子とアクセプター分子としては、一般的にはいずれも蛍光色素が選択される。 Two or more types of molecules in the present invention are selected and used as a combination of a donor component and an acceptor molecule that enables FRET that satisfies the above conditions. As the donor molecule and the acceptor molecule, a fluorescent dye is generally selected for both.
本発明における好適なドナー分子とアクセプター分子は、例えばカルボキシフルオレセイン、６−(フルオレセイン)−５，６−カルボキサミドヘキサン酸又はフルオレセインイソチオシアネート等のフルオレセイン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４等のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＣｙ７などのシアニン色素、クマリン、Ｒ−フィコエリトリン、アロフィコエリトリン、ＸＬ６６５などの修飾アロフィコシアニン、テキサスレッド、プリンストンレッド、フィコビリプロテイン、ユーロピウムクリプテート、ＸＬ６６５、アビジン、ストレプトアビジン、ローダミン、エオシン、エリスロシン、ナフタレン、ピレン、ピリジルオキサゾール、ベンゾオキサジアゾールおよびスルホインドシアニン、それらの誘導体又はそれらの複合体等を挙げることができる。本発明においては、これらに代表されるドナー分子とアクセプター分子の中からＦＲＥＴを可能とする上記の要件を満たす組合せを選択して使用すればよい。 Suitable donor and acceptor molecules in the present invention include, for example, fluorescein such as carboxyfluorescein, 6- (fluorescein) -5,6-carboxamidohexanoic acid or fluorescein isothiocyanate, Alexa Fluor dye such as Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 594, Cyanine dyes such as Cy2, Cy3, Cy5 or Cy7, modified allophycocyanin such as coumarin, R-phycoerythrin, allophycoerythrin, XL665, Texas red, Princeton red, phycobiliprotein, europium cryptate, XL665, avidin, streptavidin, rhodamine , Eosin, erythrosine, naphthalene, pyrene, pyridyloxazole, benzooxadiazole and sulfo Examples thereof include indocyanine, derivatives thereof, and complexes thereof. In the present invention, a combination satisfying the above requirements that enables FRET may be selected from donor molecules and acceptor molecules represented by these.
本発明で使用される前記分子の適当な組合せの例としては、ローダミンＢスルホニルクロリドおよびフルオレセインマレイミド、Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ′−（５−スルホ−１−ナフチル）エチル−エンジアミン（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）又はヨードアセトアミドとスシンイミジル６−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノエート（ＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ）、（ジエチルアミノ）クマリン（ＤＥＡＣ）又はＮ−メチル−アントラニロイルデオキシグアニンヌクレオチド（例えばＭａｎｔｄＧＤＰ又はＭａｎｔｄＧＴＰ）とｓＮＢＤ（スクシンイミジル６−［（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノエート）などを挙げることができる。 Examples of suitable combinations of the molecules used in the present invention include rhodamine B sulfonyl chloride and fluorescein maleimide, N-iodoacetyl-N ′-(5-sulfo-1-naphthyl) ethyl-enediamine (1,5- IAEDANS) or iodoacetamide and succinimidyl 6- (N- (7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino) hexanoate (NBD-X, SE), (diethylamino) coumarin (DEAC) or N-methyl-anthraniloyldeoxyguanine nucleotides (eg MantdGDP or MantdGTP) and sNBD (succinimidyl 6-[(7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] hexanoate) Can do.
また、基質タンパク質を効率的に修飾するために、前記分子はアミンまたはチオール反応性試薬、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、アルデヒド、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アルキル、ハロアセトアミド、マレイミド、アジリジン、またはエポキシドの形態を有することが好ましく、それぞれによるＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質の修飾は、分子毎に当業者に知られたタンパク質の化学修飾法に従って行えばよい。 Also, in order to efficiently modify the substrate protein, the molecule may be an amine or thiol reactive reagent such as isothiocyanate, succinimidyl ester, aldehyde, sulfonyl halide, alkyl halide, haloacetamide, maleimide, aziridine, or It is preferable to have the form of epoxide, and the modification of the BCR-ABL substrate protein by each may be carried out according to the chemical modification method of protein known to those skilled in the art for each molecule.
また本発明では、ＦＲＥＴを可能とする２種以上の分子として、いわゆる蛍光タンパク質を使用することができる。本発明においては種々の生物由来の蛍光タンパク質を利用することができるが、特に発光クラゲの一種であるイクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する蛍光タンパク質、いわゆるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）とその変異体の使用が好ましい。 In the present invention, so-called fluorescent proteins can be used as two or more kinds of molecules enabling FRET. In the present invention, fluorescent proteins derived from various organisms can be used. In particular, a fluorescent protein derived from Aequorea victoria, a kind of luminescent jellyfish, so-called GFP (Green Fluorescent Protein) and its mutants. Is preferred.
ＧＦＰは、３９５ｎｍに励起極大を示す励起スペクトルと５０９ｎｍに発光極大を示す発光スペクトルを有し、緑色に発光するタンパク質である（Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、第２６３巻、第８０２−８０５頁）が、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換させた、ＧＦＰとは異なる励起・発光極大を有する人為的変異体であるＢＦＰ（Ｈｅｉｍら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、第１２５０１−１２５０４頁）、ＣＦＰ（Ｈｅｉｍら、Ｃｕｒｒ. Ｂｉｏｌ．、１９９６年、第６巻、第１７８−１８２頁）、ＹＦＰ（Ｏｒｍｏら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７３巻、第１３９２−１３９５）などが開発されている。また、それぞれの蛍光強度が高められたさらなる変異体も開発されている。さらに、発光クラゲとは異なる種由来の蛍光タンパク質としてＤｓＲｅｄ（Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９０巻、第１５８５−１５８８頁）も単離されている。 GFP has an excitation spectrum showing an excitation maximum at 395 nm and an emission spectrum showing an emission maximum at 509 nm, and is a protein that emits green light (Chalfi et al., Science, 1994, Vol. 263, pages 802-805). However, BFP (Heim et al., 1994, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, which is an artificial variant having excitation and emission maxima different from GFP, in which a specific amino acid residue is substituted with another amino acid. 91, 12501-12504), CFP (Heim et al., Curr. Biol., 1996, 6, 178-182), YFP (Ormo et al., 1994, Science, 273, vol. 1392-1395) have been developed. In addition, further mutants with increased fluorescence intensity have been developed. Furthermore, DsRed (Terskikh et al., 2000, Science, 290, 1585-1588) has also been isolated as a fluorescent protein derived from a species different from the luminescent jellyfish.
本発明の試薬においては、上記に例示される蛍光タンパク質の中から、前記のＦＲＥＴを可能とする要件を満たす組合せを選択して使用することが好ましい。本発明の試薬において好ましい蛍光タンパク質の組合せは、ＣＦＰ（ドナー分子）とＹＦＰ（アクセプター分子）である。 In the reagent of the present invention, it is preferable to select and use a combination satisfying the requirements for enabling FRET from the fluorescent proteins exemplified above. A preferred fluorescent protein combination in the reagent of the present invention is CFP (donor molecule) and YFP (acceptor molecule).
ＦＲＥＴを生じさせるもう一つの条件は、ドナー分子とアクセプター分子の間の距離である。ＦＲＥＴの効率、つまりアクセプター分子からの発光強度乃至ドナー分子の蛍光消失の程度は、両分子間の距離の６乗に反比例し、一般的に１００オングストローム以下、好ましくは５０オングストローム以下であることが必要と考えられている。本発明では、この「距離」の問題は、ＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質にＦＲＥＴを可能とする２種以上の分子を結合させる、つまりＦＲＥＴを可能とする２種以上の分子で修飾された、ＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質を使用することで解決される。 Another condition that causes FRET is the distance between the donor and acceptor molecules. The efficiency of FRET, that is, the intensity of emission from the acceptor molecule or the degree of fluorescence loss of the donor molecule, is inversely proportional to the sixth power of the distance between the two molecules, and generally needs to be 100 angstroms or less, preferably 50 angstroms or less. It is believed that. In the present invention, the problem of “distance” is that the BCR-ABL substrate protein binds two or more molecules capable of FRET, that is, modified with two or more molecules capable of FRET. -It is solved by using the substrate protein of ABL.
ＢＣＲ−ＡＢＬは、先に述べたように、フィラデルフィア（Ｐｈ１）染色体転座の結果として得られるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子にコードされる、恒常的なチロシンキナーゼ活性をもつ細胞質タンパク質であり、生体内の種々のタンパク質を基質として認識してそのチロシン残基をリン酸化する、チロシンキナーゼ活性を有する。このＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される基質タンパク質の代表的な例が、ＣｒｋＬ（配列番号２）である。 BCR-ABL is a cytoplasmic protein having constitutive tyrosine kinase activity encoded by a bcr-abl fusion gene obtained as a result of Philadelphia (Ph 1 ) chromosomal translocation, as described above. It has tyrosine kinase activity that recognizes various proteins in the body as substrates and phosphorylates tyrosine residues. A typical example of a substrate protein that is phosphorylated by BCR-ABL is CrkL (SEQ ID NO: 2).
ＣｒｋＬは、シグナル伝達タンパク質に多く見られるドメインの代表例であるＳＨ２（Ｓｒｃ相同性２）ドメインとＳＨ３（Ｓｒｃ相同性３）ドメインとを有するアダプタータンパク質である。ＳＨ２ドメインはリン酸化チロシンを含む配列を、ＳＨ３ドメインはプロリンに富む配列を認識する機能を有すると理解されている。また、ＣｒｋＬの２０７番目のチロシン残基がＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化される。 CrkL is an adapter protein having an SH2 (Src homology 2) domain and an SH3 (Src homology 3) domain, which are typical examples of domains frequently found in signal transduction proteins. It is understood that the SH2 domain has a function of recognizing a sequence containing phosphorylated tyrosine, and the SH3 domain has a function of recognizing a proline-rich sequence. In addition, the 207th tyrosine residue of CrkL is phosphorylated by BCR-ABL.
意外なことに、ＦＲＥＴを可能とする２種以上の分子である２種の蛍光タンパク質（前記ＹＦＰとＣＦＰ）を融合させたＣｒｋＬをＢＣＲ−ＡＢＬでリン酸化し、これに励起光を照射することで、蛍光タンパク質間のＦＲＥＴが観測されることが見いだされた。 Surprisingly, phosphorylating CrkL fused with two kinds of fluorescent proteins (YFP and CFP), which are two or more kinds of molecules capable of FRET, with BCR-ABL and irradiating it with excitation light Thus, it was found that FRET between fluorescent proteins was observed.
推論ではあるが、ＢＣＲ−ＡＢＬによってリン酸化されたＣｒｋＬの２０７番目のチロシン残基をＣｒｋＬのＳＨ２ドメインが認識して結合することで、ＣｒｋＬのＮ末端とＣ末端に位置する２つの蛍光タンパク質が、ＦＲＥＴが可能となる距離内に近接するようになる結果、ＦＲＥＴが観察されるものと考えられる。 Inferringly, the CrkL SH2 domain recognizes and binds to the 207th tyrosine residue of CrkL phosphorylated by BCR-ABL, so that two fluorescent proteins located at the N-terminus and C-terminus of CrkL can be obtained. As a result, it is considered that FRET is observed as a result of being close within a distance where FRET is possible.
さらに、ＣｒｋＬをＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質として利用する場合において、非リン酸化部位である２０７番目のチロシン残基のＣ末端側のアミノ酸残基の殆どがトランケートされたペプチド断片、具体的にはＣｒｋＬの１〜２２２番目のアミノ酸残基からなるペプチド断片を用いることが好ましい。このペプチド断片の両末端に上記の蛍光タンパク質を融合させた融合タンパク質を用いた場合のＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性の検出感度は、ＣｒｋＬ全長の両末端に上記の蛍光タンパク質を融合させた融合タンパク質を用いた場合と比較して、３３％程上昇する。 Furthermore, when CrkL is used as a substrate protein for BCR-ABL, a peptide fragment in which most of the amino acid residues on the C-terminal side of the 207th tyrosine residue, which is a non-phosphorylated site, are truncated, specifically CrkL It is preferable to use a peptide fragment consisting of amino acid residues 1 to 222 of the above. The detection sensitivity of the tyrosine kinase activity of BCR-ABL when using a fusion protein in which the above fluorescent protein is fused to both ends of this peptide fragment is a fusion protein in which the above fluorescent protein is fused to both ends of CrkL. Compared to the case where is used, it rises by about 33%.
また、ＣｒｋＬ全長又は前記ペプチド断片のＣ末端側に融合させる蛍光タンパク質のアミノ酸配列の順序を変更することでも、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性の検出感度が上昇することが見いだされた。具体的には、ＣＦＰ（前記Ｈｅｉｍら）の１〜１７２番目までのアミノ酸配列と１７３〜２３８番目までのアミノ酸配列を前後するように入れ替えた、すなわちＣＦＰの１７３番目のアミノ酸が新たにＮ末端となり、１７２番目のアミノ酸が新たにＣ末端となる様にアミノ酸配列が入れ替えたＣＦＰの変異体（以下、ＣＦＰ変異体とする）を、ＣｒｋＬ全長又は前記ペプチド断片のＣ末端側に連結させた融合タンパク質とすることで、ＣｒｋＬ全長の両末端に上記の蛍光タンパク質を融合させた融合タンパク質を用いた場合と比較して検出感度が８６％上昇する。 It was also found that the detection sensitivity of the tyrosine kinase activity of BCR-ABL is increased by changing the order of the amino acid sequence of the fluorescent protein fused to the full length of CrkL or the C-terminal side of the peptide fragment. Specifically, the amino acid sequence from the 1st to the 172nd position of CFP (Heim et al.) And the amino acid sequence from the 173rd to 238th positions were replaced, that is, the 173rd amino acid of the CFP became the new N-terminal. , A fusion protein in which a CFP variant (hereinafter referred to as CFP variant) in which the amino acid sequence is replaced so that the 172nd amino acid is newly C-terminal is linked to the CrkL full length or the C-terminal side of the peptide fragment As a result, the detection sensitivity is increased by 86% compared to the case of using a fusion protein in which the above-mentioned fluorescent protein is fused to both ends of the full length of CrkL.
この様に、本発明においてＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質としてＣｒｋＬを選択し、さらにＦＲＥＴを可能とする２種以上の分子として蛍光タンパク質を選択して前記基質タンパク質に融合させた融合タンパク質を使用する場合の好ましい態様は、Ｎ末端から順に、ＹＦＰ−ＣｒｋＬ−ＣＦＰ（配列番号４）、ＹＦＰ−ＣｒｋＬ−ＣＦＰ変異体、ＹＦＰ−ＣｒｋＬの１〜２２２アミノ酸残基からなるペプチド断片−ＣＦＰ（配列番号６）、及びＹＦＰ−ＣｒｋＬの１〜２２２アミノ酸残基からなるペプチド断片−ＣＦＰ変異体（配列番号８）という構成を有する融合タンパク質である。特に好ましい態様は、ＹＦＰ−ＣｒｋＬの１〜２２２アミノ酸残基からなるペプチド断片−ＣＦＰ変異体（配列番号８）という構成を有する融合タンパク質である。なお、Ｎ末端とＣ末端に連結させる蛍光タンパク質は、相互に位置を入れ替えて使用してもよい。 Thus, in the present invention, when CrkL is selected as a substrate protein for BCR-ABL and a fluorescent protein is selected as two or more types of molecules capable of FRET and a fusion protein fused with the substrate protein is used. A preferred embodiment of YFP-CrkL-CFP (SEQ ID NO: 4), YFP-CrkL-CFP mutant, and YFP-CrkL peptide fragment-CFP (SEQ ID NO: 6) in this order from the N-terminus And a peptide fragment-CFP variant (SEQ ID NO: 8) consisting of 1-222 amino acid residues of YFP-CrkL. A particularly preferred embodiment is a fusion protein having a configuration of peptide fragment-CFP variant (SEQ ID NO: 8) consisting of 1-222 amino acid residues of YFP-CrkL. In addition, you may use the fluorescent protein connected with an N terminal and a C terminal, changing a position mutually.
また本発明は、上記とは異なる別態様として、ＳＨ２ドメインを含むタンパク質とＢＣＲ−ＡＢＬによって認識される被リン酸化部位を含むタンパク質の２種のタンパク質からなる、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬であって、前記２種のタンパク質がそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子により修飾されていることを特徴とする、前記試薬を提供する。ここで、ＳＨ２ドメイン、ＢＣＲ−ＡＢＬ、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能とする分子については、先に説明したとおりである。 In another aspect different from the above, the present invention detects tyrosine kinase activity of BCR-ABL, which is composed of two proteins, a protein containing an SH2 domain and a protein containing a phosphorylated site recognized by BCR-ABL. The reagent is characterized in that each of the two kinds of proteins is modified with a different molecule that enables fluorescence resonance energy transfer. Here, the SH2 domain, BCR-ABL, and molecules that enable fluorescence resonance energy transfer (FRET) are as described above.
上記別態様におけるＳＨ２ドメインを含むペプチドとＢＣＲ−ＡＢＬによって認識される被リン酸化部位を含むタンパク質は、いずれも配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、すなわちＣｒｋＬか、又はその非リン酸化部位である２０７番目のチロシン残基のＣ末端側のアミノ酸残基の殆どがトランケートされたペプチド断片、具体的にはＣｒｋＬの１〜２２２番目のアミノ酸残基からなるペプチド断片であってよい。 In the above alternative embodiment, the peptide containing the SH2 domain and the protein containing the phosphorylated site recognized by BCR-ABL are both proteins consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, ie, CrkL, or a non-phosphorylated site thereof A peptide fragment in which most of the amino acid residues on the C-terminal side of the 207th tyrosine residue are truncated, specifically, a peptide fragment consisting of the 1st to 222nd amino acid residues of CrkL.
すなわち、上記別態様は、アミノ酸配列レベルでは同一であるが、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子により修飾された点で相違する２種のタンパク質からなる、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬に関する。 That is, the above-mentioned alternative embodiment detects tyrosine kinase activity of BCR-ABL consisting of two types of proteins that are the same at the amino acid sequence level but differ in that they are modified by different molecules that enable fluorescence resonance energy transfer. It is related with the reagent for doing.
この態様における好ましい例は、上記に説明したＦＲＥＴのドナー分子で修飾されたＣｒｋＬとアクセプター分子で修飾されたＣｒｋＬからなる試薬、ＦＲＥＴのドナー分子で修飾された前記ペプチド断片とアクセプター分子で修飾された前記ペプチド断片とからなる試薬である。特に、ＹＦＰとＣｒｋＬとの融合タンパク質とＣｒｋＬとＣＦＰとの融合タンパク質とからなる試薬、又はＹＦＰと前記ペプチド断片との融合タンパク質と前記ペプチド断片とＣＦＰとの融合タンパク質とからなる試薬が好ましい。 Preferred examples in this embodiment include a reagent comprising CrkL modified with the FRET donor molecule described above and CrkL modified with the acceptor molecule, the peptide fragment modified with the FRET donor molecule and the acceptor molecule modified with the acceptor molecule. A reagent comprising the peptide fragment. In particular, a reagent comprising a fusion protein of YFP and CrkL and a fusion protein of CrkL and CFP, or a reagent comprising a fusion protein of YFP and the peptide fragment, and a fusion protein of the peptide fragment and CFP is preferred.
さらに上記別態様は、実質的にＳＨ２ドメインからなるタンパク質と、実質的にＢＣＲ−ＡＢＬによって認識されリン酸化される最小単位を構成するアミノ酸配列とからなるタンパク質の２種類のタンパク質からなり、前記タンパク質がそれぞれＦＲＥＴを可能にする異なる分子で修飾されている、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬も提供する。 Further, the above-mentioned another aspect is composed of two types of proteins consisting of a protein consisting essentially of an SH2 domain and a protein consisting essentially of an amino acid sequence constituting the smallest unit that is recognized and phosphorylated by BCR-ABL. Also provided are reagents for detecting tyrosine kinase activity of BCR-ABL, each modified with a different molecule that allows FRET.
この別態様における好ましい例は、上記に説明したＦＲＥＴのアクセプター分子で修飾されたＳＨ２ドメインからなるタンパク質とドナー分子で修飾されたＢＣＲ−ＡＢＬによって認識されリン酸化される最小単位を構成するアミノ酸配列からなるタンパク質とからなる試薬である。ここで実質的にＳＨ２ドメインからなるタンパク質は、例えば配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり得、またＢＣＲ−ＡＢＬによって認識されリン酸化される最小単位を構成するアミノ酸配列は、ＣｒｋＬの２０４〜２１１番目のアミノ酸配列であり得る。 Preferred examples in this alternative embodiment include a protein consisting of the SH2 domain modified with the FRET acceptor molecule described above and an amino acid sequence constituting the smallest unit that is recognized and phosphorylated by BCR-ABL modified with the donor molecule. A reagent consisting of a protein. Here, the protein consisting essentially of the SH2 domain can be, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence constituting the smallest unit that is recognized and phosphorylated by BCR-ABL is CrkL It may be the 204th to 211nd amino acid sequence.
上記の別態様における特に好ましい態様は、ＹＦＰとＳＨ２ドメインからなるタンパク質との融合タンパク質とＣｒｋＬの２０４〜２１１番目のアミノ酸配列からなるタンパク質とＣＦＰとの融合タンパク質とからなる試薬、及びＹＦＰとＳＨ２ドメインからなるタンパク質との融合タンパク質とＣｒｋＬの２０４〜２１１番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と前記ＣＦＰ変異体との融合タンパク質である。 A particularly preferred embodiment in the above-described another embodiment is a reagent comprising a fusion protein of a protein comprising a YFP and a SH2 domain, a protein comprising a 204 to 211 amino acid sequence of CrkL and a fusion protein of CFP, and a YFP and SH2 domain A fusion protein of the above protein, a protein comprising the 204th to 211st amino acid sequence of CrkL, and the CFP variant.
上記に述べた本発明における試薬はいずれも、ＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片、ＳＨ２ドメインを含むタンパク質、又はＢＣＲ−ＡＢＬによって認識される被リン酸化部位を含むタンパク質を、遺伝子組み換え技術により作製し、これらを先に説明したＦＲＥＴを可能とする分子を用いて修飾することにより製造することができる。あるいは、ＦＲＥＴを可能とする分子として蛍光タンパク質が選択される本発明の好ましい態様は、ＢＣＲ−ＡＢＬの基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片、ＳＨ２ドメインを含むタンパク質、又はＢＣＲ−ＡＢＬによって認識される被リン酸化部位を含むタンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を、当業者に広く知られた一般的な融合タンパク質の製造方法に従って作ることができる。 Any of the reagents in the present invention described above is a BCR-ABL substrate protein or a peptide fragment thereof containing a phosphorylated site, a protein containing an SH2 domain, or a protein containing a phosphorylated site recognized by BCR-ABL. Can be produced by gene recombination techniques and modified with molecules that allow FRET as described above. Alternatively, a preferred embodiment of the present invention in which a fluorescent protein is selected as a molecule that allows FRET is a BCR-ABL substrate protein or peptide fragment thereof containing a phosphorylated site, a protein containing an SH2 domain, or BCR-ABL. A fusion protein of a protein containing a recognized phosphorylated site and a fluorescent protein can be prepared according to a general method for producing a fusion protein well known to those skilled in the art.
基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片、ＳＨ２ドメインを含むタンパク質、又はＢＣＲ−ＡＢＬによって認識される被リン酸化部位を含むタンパク質、あるいは本発明の好ましい態様である融合タンパク質（以下、本発明に係るタンパク質と表す）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）その他の、遺伝子工学に関する実験操作法を紹介したマニュアルに記載された種々の方法を用いて、いわゆる組み換えタンパク質として製造することができる。 A substrate protein or a peptide fragment containing a phosphorylated site, a protein containing an SH2 domain, or a protein containing a phosphorylated site recognized by BCR-ABL, or a fusion protein which is a preferred embodiment of the present invention (hereinafter, the present invention) The molecular cloning (Maniatis T., et al., A Laboratory Manual, Cold Spring laboratory, New York, 1982) and other various manuals that introduced experimental procedures related to genetic engineering were described in Molecular Cloning (Maniatis T. et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Using the method, it can be produced as a so-called recombinant protein.
典型的には、本発明に係るタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを構築し、適当な宿主に当該ベクターを組み込んで形質転換細胞を作製し、この細胞に本発明に係るタンパク質を発現させ、公知の方法によって本発明に係るタンパク質を回収し、さらに必要に応じて精製して使用すればよい。 Typically, an expression vector containing a nucleic acid encoding the protein according to the present invention is constructed, the vector is incorporated into an appropriate host to produce a transformed cell, and the protein according to the present invention is expressed in this cell. The protein according to the present invention may be recovered by a known method and further purified and used as necessary.
前記本発明に係るタンパク質をコードする核酸は、本願配列表に記載された塩基配列情報を基に、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により、あるいは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて製造することができる。また、ＣｒｋＬや蛍光タンパク質は何れも公知のタンパク質であることから、これらタンパク質をコードする当業者が入手可能な核酸又はその核酸を含むベクター等から、ＰＣＲその他の方法によって適宜増幅して利用してもよい。 The nucleic acid encoding the protein according to the present invention can be produced by a chemical synthesis method such as a phosphoramidite method or a commercially available DNA synthesizer based on the base sequence information described in the sequence listing of the present application. it can. In addition, since CrkL and fluorescent proteins are known proteins, they can be appropriately amplified by PCR or other methods from nucleic acids that are available to those skilled in the art encoding these proteins or vectors containing the nucleic acids. Also good.
前記本発明に係るタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる発現ベクターは、前記本発明に係るタンパク質をコードする核酸の塩基配列の他に、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。 The expression vector containing the nucleic acid encoding the protein according to the present invention may be in any form such as circular or linear. Such an expression vector may have other base sequences as required in addition to the base sequence of the nucleic acid encoding the protein of the present invention. Other base sequences include an enhancer sequence, a promoter sequence, a ribosome binding sequence, a base sequence used for the purpose of amplification of copy number, a base sequence encoding a signal peptide, a base sequence encoding another polypeptide, poly A Additional sequences, splicing sequences, replication origins, base sequences of genes that serve as selection markers, and the like.
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明に係るタンパク質をコードする核酸に付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者は本発明に係るタンパク質をコードする核酸を基に任意かつ容易に加工することができる。 For gene recombination, a translation initiation codon or translation termination codon is added to the nucleic acid encoding the protein of the present invention using an appropriate synthetic DNA adapter, or a suitable restriction enzyme cleavage sequence is newly generated in the base sequence. It is also possible to make it disappear or disappear. These are within the scope of operations usually performed by those skilled in the art, and those skilled in the art can arbitrarily and easily process them based on the nucleic acid encoding the protein of the present invention.
また本発明に係るタンパク質をコードする核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることが可能であるが、利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐＥＴ―２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＥＴ―２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、等を例示することができる。 In addition, the vector holding the nucleic acid encoding the protein according to the present invention may be used by selecting an appropriate vector according to the host to be used. In addition to the plasmid, bacteriophage, baculovirus, retrovirus, vaccinia virus, etc. However, examples of commercially available expression vectors that can be used include pET-23d (manufactured by Novagen), pET-28a (manufactured by Novagen), and the like.
本発明に係るタンパク質をコードする核酸は、適当な発現プロモーターに連結させて使用することが好ましい。その様な発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主がエシェリヒア属細菌、好ましくは大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属細菌、好ましくはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓである場合にはＰ４３プロモーター，ｖｅｇＩプロモーター、ｘｙｌｏｓｅ―ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ プロモーター、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ プロモーター等を挙げることができる。また、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。 The nucleic acid encoding the protein according to the present invention is preferably used by being linked to an appropriate expression promoter. Such an expression promoter may be appropriately selected according to the host and the purpose of expression. For example, when the host is an Escherichia bacterium, preferably E. coli, a T7 promoter, a lac promoter, a trp promoter, a λPL promoter, etc. The host is a Bacillus bacterium, preferably B. In the case of subtilis, there can be mentioned P43 promoter, vegI promoter, xylose-inducible promoter, tetracycline inducible promoter and the like. Further, when the host is yeast, PHO5 promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc., and when the host is animal cells, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) ) Gene promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter and the like.
本発明に係るタンパク質は、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできるが、遺伝子組換え技術によって、前記の核酸、特に発現ベクターに組み込まれたＤＮＡを原核生物もしくは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた好適な発現系に導入することによって製造することが好ましい。 The protein according to the present invention may be obtained by using an organic chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), or a suitable commercially available peptide synthesizer. However, by means of gene recombination technology, the nucleic acid, particularly DNA incorporated into an expression vector, can be converted into a suitable expression system using a suitable host cell selected from prokaryotes or eukaryotes. It is preferable to manufacture by introducing.
宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の他に、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エルウニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等の微生物を挙げることができる。またカイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等の動物細胞も利用可能である。 Examples of host cells include Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria, Brevibacterium bacteria, Serratia bacteria, Pseudomonas (Pseudomonas genus bacteria, Arthrobacter genus bacteria, Erwinia genus bacteria, Methylobacterium genus bacteria, Rhodobacter genus bacteria, Streptomyces genus Streptomyces genus Streptomyces genus ) Microorganisms such as genus microorganisms, Saccharomyces yeasts It can be mentioned. Insect cells such as silkworms, HEK293 cells, MEF cells, Vero cells, Hela cells, CHO cells, WI38 cells, BHK cells, COS-7 cells, MDCK cells, C127 cells, HKG cells, human kidney cell lines and other animal cells Is also available.
宿主細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記のＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．らを初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞の利用については、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）やＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８年、第６巻、第４７頁等に記載されている。 As a method for introducing an expression vector into a host cell, Maniatis T. et al. And the like, for example, electroporation method, protoplast method, alkali metal method, calcium phosphate precipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, particle gun method, etc. it can. Regarding the use of insect cells such as Sf9 and Sf21, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York, 1992). And Bio / Technology, 1988, Vol. 6, p. 47, and the like.
本発明に係るタンパク質は、前記の発現ベクターを上記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。 The protein according to the present invention can be obtained by expressing the above expression vector in the above host cell, collecting the target protein from the host cell or culture medium, and purifying it. As a method for purifying a protein, an appropriate method can be appropriately selected from methods usually used for protein purification. That is, salting-out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, various affinity chromatography such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography and antibody chromatography, chromatofocusing method, adsorption An appropriate method may be appropriately selected from commonly used methods such as chromatography and reverse phase chromatography, and purification may be performed in an appropriate order using an HPLC system if necessary.
なお、本発明におけるタンパク質は、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、さらにＣｒｋＬ以外の機能性タンパク質又はポリペプチドを付加させて作製してもよい。特にＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ又はキチン結合配列のように、組み換えタンパク質の製造、特に組み換えタンパク質の精製を容易にする機能性ポリペプチドの利用が好ましい。 In addition, you may produce the protein in this invention by adding functional protein or polypeptide other than CrkL to the N terminal and / or C terminal further. In particular, the use of a functional polypeptide that facilitates the production of a recombinant protein, particularly the purification of the recombinant protein, such as a FLAG tag, histidine tag or chitin binding sequence is preferred.
本発明に係るタンパク質を他の機能性タンパク質やタグ等との融合タンパク質として発現させた場合には、その機能性タンパク質やポリペプチドに特徴的な精製法を採用することが好ましい。融合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて切断し、本発明のタンパク質を回収することができる。また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。 When the protein according to the present invention is expressed as a fusion protein with another functional protein or tag, it is preferable to employ a purification method characteristic of the functional protein or polypeptide. The fusion protein can be cleaved using an appropriate protease (thrombin, trypsin, etc.) to recover the protein of the present invention. In addition, a method obtained by a cell-free synthesis method using a recombinant DNA molecule is one of the methods for producing by genetic engineering.
さらに本発明は、上記のいずれかの試薬とチロシンキナーゼ阻害剤と患者から採取された検体とをインキュベーションする工程、及び前記試薬からの蛍光発光を検出する工程を含む、前記検体に含まれるチロシンキナーゼの前記阻害剤に対する抵抗性を確認する方法を提供する。 Furthermore, the present invention includes a step of incubating any of the above-described reagents, a tyrosine kinase inhibitor and a sample collected from a patient, and a step of detecting fluorescence emitted from the reagent, and a tyrosine kinase contained in the sample Provides a method for confirming resistance to the inhibitor.
本発明の試薬は、先に説明した様に、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性により所定のチロシン残基がリン酸化されると、試薬に含まれる２種以上の分子は蛍光共鳴エネルギー移動が可能となる距離に接近する。ここに前記分子の一方（ドナー分子）に対する励起波長の光を照射することによってＦＲＥＴが生じ、もう一方の分子（アクセプター分子）からの蛍光発光が観察される。例えば、本発明に係る好適な試薬である配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質を用いる場合、ドナー分子であるＣＦＰの励起波長である４４０ｎｍの光を照射することによって、アクセプター分子であるＹＦＰから５３０ｎｍの発光を測定する。 As described above, when a predetermined tyrosine residue is phosphorylated by the tyrosine kinase activity of BCR-ABL, the reagent of the present invention enables two or more kinds of molecules contained in the reagent to perform fluorescence resonance energy transfer. Approach the distance. By irradiating light of an excitation wavelength with respect to one of the molecules (donor molecule), FRET is generated, and fluorescence emission from the other molecule (acceptor molecule) is observed. For example, when using a fusion protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, which is a suitable reagent according to the present invention, it is an acceptor molecule by irradiating light of 440 nm which is the excitation wavelength of CFP which is a donor molecule. Measure 530 nm emission from YFP.
この反応系において、ＢＣＲ−ＡＢＬが含まれると想定される患者から採取された検体とチロシンキナーゼ阻害剤とを共存させると、チロシンキナーゼ阻害剤がＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を阻害し得るものである場合には、所定のチロシン残基のリン酸化が阻害される結果、ＦＲＥＴによる蛍光強度が減少あるいは観測されなくなる。したがって、このＦＲＥＴを測定することで、患者から採取された検体に含まれると想定されるＢＣＲ−ＡＢＬが当該チロシンキナーゼ阻害剤に抵抗性を示すか否かを確認することができる。 In this reaction system, when a sample collected from a patient assumed to contain BCR-ABL and a tyrosine kinase inhibitor coexist, the tyrosine kinase inhibitor can inhibit the tyrosine kinase activity of BCR-ABL. In some cases, phosphorylation of a given tyrosine residue is inhibited, resulting in a decrease or no longer observed fluorescence intensity due to FRET. Therefore, by measuring this FRET, it can be confirmed whether or not BCR-ABL assumed to be contained in a sample collected from a patient exhibits resistance to the tyrosine kinase inhibitor.
本発明の方法は、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を直接測定することでＢＣＲ−ＡＢＬの薬剤への抵抗性を確認するため、任意の変異が生じたＢＣＲ−ＡＢＬであっても薬剤抵抗性の評価を行うことができる。また、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の塩基配列を解析する方法やイムノブロッティングを用いた方法では、それらの実施に際して１０４個又はそれ以上の腫瘍細胞が必要となるのに対して、本発明の方法の実施に必要とされる腫瘍細胞の数はわずかに１０個程度で足り、よりも少ない検体量（細胞数）で実施可能である。
また、既存の方法、例えばイムノブロッティングを用いた方法におけるＢＣＲ−ＡＢＬの薬剤抵抗性を判定する際の、当該薬剤の有効濃度は、概ね１μＭ以上、特に１０μＭ以上であるのに対して、本発明の方法は、薬剤の濃度が０．１μＭ以下であっても、また１０μＭ以上であっても、その薬剤に対するＢＣＲ−ＡＢＬの抵抗性を判定することができる。このことは本発明の方法は、既存の方法よりも広いダイナミックレンジを有する方法として、既存の方法よりも定量的な情報を取得することが可能である点で有利な方法であることを意味する。
Since the method of the present invention confirms the resistance of BCR-ABL to a drug by directly measuring the tyrosine kinase activity of BCR-ABL, even if BCR-ABL having any mutation is produced, the drug resistance Evaluation can be made. In the method of using the methods and immunoblotting analysis of the nucleotide sequence of the bcr-abl gene, whereas 10 4 or more of tumor cells upon their implementation are required, implementation of the method of the present invention The number of tumor cells required for this is only about 10 and can be carried out with a smaller amount of specimen (number of cells).
In addition, when determining the drug resistance of BCR-ABL in an existing method, for example, a method using immunoblotting, the effective concentration of the drug is approximately 1 μM or more, particularly 10 μM or more. This method can determine the resistance of BCR-ABL to a drug regardless of whether the drug concentration is 0.1 μM or less or 10 μM or more. This means that the method of the present invention is an advantageous method in that quantitative information can be acquired as compared with the existing method as a method having a wider dynamic range than the existing method. .
本発明の方法は、患者から採取された検体中の腫瘍細胞から適当な方法によって細胞抽出液を調製し、これをＢＣＲ−ＡＢＬとして使用してもよい。また、細胞抽出液を調製する代わりに、本発明の試薬を検体中の腫瘍細胞に導入し、生きた腫瘍細胞内でＢＣＲ−ＡＢＬと反応させて、腫瘍細胞内でのＦＲＥＴを観測ないし測定することもできる。本発明の試薬として好適な例として先に説明した融合タンパク質を使用する場合には、前記融合タンパク質をコードする核酸を含み、前記融合タンパク質を適当な条件下で発現することのできる発現ベクターを用いて腫瘍細胞を形質転換させ、前記融合タンパク質の発現を誘導することで、腫瘍細胞内でのＦＲＥＴを観測ないし測定することができる。 In the method of the present invention, a cell extract may be prepared from tumor cells in a specimen collected from a patient by an appropriate method and used as BCR-ABL. Further, instead of preparing a cell extract, the reagent of the present invention is introduced into tumor cells in a specimen and reacted with BCR-ABL in living tumor cells to observe or measure FRET in the tumor cells. You can also. When the above-described fusion protein is used as a preferred example of the reagent of the present invention, an expression vector containing a nucleic acid encoding the fusion protein and capable of expressing the fusion protein under appropriate conditions is used. Thus, FRET in the tumor cell can be observed or measured by transforming the tumor cell and inducing the expression of the fusion protein.
また本発明の試薬を用いることで、蛍光強度の変化からＢＣＲ−ＡＢＬの当該チロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を定量化することができる。このことは、チロシンキナーゼ阻害剤又はチロシンキナーゼ活性を阻害すると期待される物質のＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性に対する阻害作用を検出し、さらにはその阻害作用を定量化することもできることを意味する。この様に、本発明は、本発明に係る試薬を用いて、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法も提供するものである。 Moreover, by using the reagent of this invention, the resistance with respect to the said tyrosine kinase inhibitor of BCR-ABL can be quantified from the change of fluorescence intensity. This means that a tyrosine kinase inhibitor or a substance expected to inhibit tyrosine kinase activity can be detected for its inhibitory effect on the tyrosine kinase activity of BCR-ABL, and the inhibitory action can also be quantified. Thus, the present invention also provides a method of screening for an inhibitor of BCR-ABL tyrosine kinase activity using the reagent according to the present invention.
本発明のスクリーニング方法は、必要とされる構成物が少なく、また反応も比較的単純な工程で終了するため、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＰ）への応用が可能であり、ＣＭＬやＡＬＬに対する治療薬の探索や開発に利用することができる。 Since the screening method of the present invention requires few components and the reaction is completed in a relatively simple process, it can be applied to high-throughput screening (HTP), and therapeutic agents for CML and ALL can be used. Can be used for exploration and development.
以下、非限定的な実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to non-limiting examples.
＜実施例１＞
（１）発現カセットを有するベクターの構築
ＥＹＦＰの変異体であるＶｅｎｕｓをコードする塩基配列を含むＤＮＡ（理化学研究所 宮脇敦史博士から譲渡を受けた）に対して、増幅後のＤＮＡ断片が、当該塩基配列の終止コドンが欠失され、かつ増幅後のｃＤＮＡの５’及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーＤＮＡを用いて、前記ＶｅｎｕｓをコードするＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片１を得た。
<Example 1>
(1) Construction of a vector having an expression cassette For DNA containing a nucleotide sequence encoding Venus, a mutant of EYFP (transferred from Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN), the amplified DNA fragment is Primer DNA designed and synthesized so that the stop codon of the base sequence has been deleted and the 5 'and 3' ends of the amplified cDNA have base sequences introduced with restriction enzyme EcoRI and XhoI recognition sequences, respectively. The amplified DNA fragment 1 was obtained by performing a PCR reaction on the DNA encoding the Venus.
また、ベクターｐＥＣＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＥＣＦＰをコードする領域に対して、増幅後のｃＤＮＡが、その５’及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩとＢｇｌＩＩの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーＤＮＡを用いて、前記ベクターｐＥＣＦＰ−Ｃ１に対してＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片２を得た。 In addition, with respect to the region encoding the ECFP of the vector pECFP-C1 (Clontech), the amplified cDNA has a nucleotide sequence in which recognition sequences of restriction enzymes NotI and BglII are introduced at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively. A PCR reaction was performed on the vector pECFP-C1 using the primer DNA designed and synthesized to have amplified DNA fragment 2.
前記増幅ＤＮＡ断片１を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで開環させた真核生物発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｇｅｎｅ、１９８９年、第７９巻、第２号、第２６９‐２７７頁）に組み換えて、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓを得た。さらにこのｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓを制限酵素ＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで開環させ、上記増幅ＤＮＡ断片２を組み換えて、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＥＣＦＰを得た。 Recombining the amplified DNA fragment 1 with a eukaryotic expression vector pCAGGS (Miyazaki et al., Gene, 1989, 79, No. 2, pages 269-277) which has been opened with restriction enzymes EcoRI and XhoI. pCAGGS-Venus was obtained. Further, this pCAGGS-Venus was opened with restriction enzymes NotI and BglII, and the amplified DNA fragment 2 was recombined to obtain pCAGGS-Venus-ECFP.
（２）ＹＦＰ−ＣｒｋＬ−ＣＦＹ用発現ベクターの構築
ＣｒｋＬの全長アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むベクターｐＣＸＮ２−ＦＬＡＧ−ＣｒｋＬ（ロックフェラー大学Ｋｎｕｄｓｅｎ博士から分与を受けた）に対して、増幅後のｃＤＮＡが、当該塩基配列の終止コドンが欠失され、かつ５’及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片３を得た。
(2) Construction of expression vector for YFP-CrkL-CFY After amplification with respect to vector pCXN2-FLAG-CrkL (provided by Dr. Knudsen of Rockefeller University) containing a base sequence encoding the full-length amino acid sequence of CrkL A primer DNA designed and synthesized so that the cDNA has a base sequence in which the stop codon of the base sequence is deleted and the recognition sequences of restriction enzymes XhoI and NotI are introduced at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively. PCR reaction was carried out to obtain amplified DNA fragment 3.
この増幅ＤＮＡ断片３を、制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで開環させたｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＥＣＦＰに組み換えて、ＥＹＦＰとＣＦＰがそれぞれＣｒｋＬのＮ末端とＣ末端に連結された融合タンパク質を発現することのできるベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣｒｋＬ−ＥＣＦＰを得た。以下、このベクターをｐＰｉｃｋｌｅ＿１．０と、またこれにコードされる融合タンパク質をＰｉｃｋｌｅｓ１．０と表す。 This amplified DNA fragment 3 can be recombined with pCAGGS-Venus-ECFP opened with restriction enzymes XhoI and NotI to express a fusion protein in which EYFP and CFP are linked to the N-terminus and C-terminus of CrkL, respectively. The vector pCAGGS-Venus-CrkL-ECFP was obtained. Hereinafter, this vector is represented as pPickle_1.0, and the fusion protein encoded thereby is represented as Pickles 1.0.
（３）ＹＦＰ−ＣｒｋＬ１〜２２２−ＣＦＰ用発現ベクターの構築
ＣｒｋＬの全長アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むベクターｐＣＸＮ２−ＦＬＡＧ−ＣｒｋＬに対して、増幅後のｃＤＮＡがＣｒｋＬの１〜２２２番目までのアミノ酸配列をコードし、かつ５’及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片４を得た。
(3) Construction of expression vector for YFP-CrkL1-222-CFP
For the vector pCXN2-FLAG-CrkL containing the base sequence encoding the full-length amino acid sequence of CrkL, the amplified cDNA encodes the amino acid sequence from 1 to 222 of CrkL, and at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively. A PCR reaction was carried out using a primer DNA designed and synthesized so as to have a base sequence into which the recognition sequences of restriction enzymes XhoI and NotI were introduced, whereby amplified DNA fragment 4 was obtained.
この増幅ＤＮＡ断片４を、制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩで開環させたｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＥＣＦＰに組み換えて、ＥＹＦＰとＣＦＰがそれぞれＣｒｋＬの１〜２２２番目までのアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端に連結された融合タンパク質を発現することのできるベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣｒｋＬ２２２−ＥＣＦＰを得た。以下、このベクターをｐＰｉｃｋｌｅ＿２．０と、またこれにコードされる融合タンパク質をＰｉｃｋｌｅｓ２．０と表す。 This amplified DNA fragment 4 was recombined with pCAGGS-Venus-ECFP opened with restriction enzymes XhoI and NotI, and EYFP and CFP were ligated to the N-terminal and C-terminal of the amino acid sequences from 1 to 222 of CrkL, respectively. The vector pCAGGS-Venus-CrkL222-ECFP capable of expressing the fusion protein was obtained. Hereinafter, this vector is referred to as pPickle_2.0, and the fusion protein encoded thereby is referred to as Pickles 2.0.
（４）ＹＦＰ−Ｃｒｋｌ２２２−ＣＦＰ変異体用発現ベクターの構築
ベクターｐＥＣＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＥＣＦＰをコードする領域に対して、増幅後のｃＤＮＡが、当該領域の終止コドンが欠失され、かつ５’及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩとＢｇｌＩＩの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行って増幅ＤＮＡ断片５を得た。
(4) Construction of expression vector for YFP-Ckr222-CFP mutant The amplified cDNA is deleted from the region encoding the ECFP of the vector pECFP-C1 (Clontech), and the stop codon of the region is deleted. An amplified DNA fragment 5 was obtained by performing a PCR reaction using a primer DNA designed and synthesized so as to have a base sequence into which recognition sequences of restriction enzymes NotI and BglII were introduced at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively.
この増幅ＤＮＡ断片５を、制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで開環させた市販のクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に組み換えて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＥＣＦＰを得た。 This amplified DNA fragment 5 was recombined with a commercially available cloning vector pBluescript SKII (+) (Stratagene), which was opened with restriction enzymes NotI and BamHI, to obtain pBluescript-ECFP.
同様に、増幅後のｃＤＮＡが、その５’および３’末端にそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの認識配列が挿入された塩基配列を有するように設計合成されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡ断片６を得、制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで開環させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＥＣＦＰに組み換えて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＥＣＦＰ−ＥＣＦＰを得た。 Similarly, PCR is performed using primer DNA designed and synthesized so that the amplified cDNA has a base sequence in which recognition sequences of restriction enzymes BamHI and BglII are inserted at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively. Amplified DNA fragment 6 was obtained and recombined with pBluescript-ECFP opened by restriction enzymes BamHI and BglII to obtain pBluescript-ECFP-ECFP.
さらに、ＹＦＰの変異体であるＶｅｎｕｓに対して行われたＮａｇａｉらの方法（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００４年、第１０１巻、第２９号、第１０５５４−９頁）に従い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＥＣＦＰ−ＥＣＦＰを鋳型として、ＣＦＰ変異体をコードする塩基配列及び５’並びに３’末端に制限酵素ＮｏｔＩとＢｇｌＩＩの認識配列が挿入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。 Furthermore, the method of Nagai et al. (Nagai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, Vol. 101, No. 29, No. 10554-9) performed on Venus, a mutant of YFP. Designed and synthesized using pBluescript-ECFP-ECFP as a template and a base sequence encoding a CFP variant and a base sequence in which restriction enzyme NotI and BglII recognition sequences are inserted at the 3 'end. PCR reaction was performed using the prepared primer DNA.
この方法により得られる塩基配列がコードするＣＦＰ変異体は、全２３８アミノ酸残基からなる変異前のＣＦＰをＣＦＰ１−２３８と表すと、下記の通りとなる。 The CFP variant encoded by the base sequence obtained by this method is as follows when the CFP before mutation consisting of all 238 amino acid residues is represented as CFP1-238.
Ｐｉｃｋｌｅ２．１：ＣＦＰ４９−２３８・１−４８
Ｐｉｃｋｌｅ２．２：ＣＦＰ１５７−２３８・１−１５６
Ｐｉｃｋｌｅ２．３：ＣＦＰ１７３−２３８・１−１７２
Ｐｉｃｋｌｅ２．４：ＣＦＰ１９５−２３８・１−１９４
Ｐｉｃｋｌｅ２．５：ＣＦＰ２２９−２３８・１−２２８
Pickle 2.1: CFP49-238 / 1-48
Pickle 2.2: CFP157-238 / 1-156
Pickle 2.3: CFP173-238 / 1-172
Pickle 2.4: CFP195-238 / 1-194
Pickle2.5: CFP229-238 / 1-228
なお、ＣＦＰ４９−２３８・１−４８は、そのＣＦＰ変異体のアミノ酸配列が、変異前のＥＣＦＰの４９番目のアミノ酸から２３８番目のアミノ酸がＮ末端側となり、これに続いて変異前のＥＣＦＰの１−４８番目のアミノ酸配列がＣ末端部分のアミノ酸配列として連結されたアミノ酸配列であることを示す。その他のＣＦＰ変異体も、この表記に倣う。 In addition, CFP49-238 and 1-48 have an amino acid sequence of the CFP variant in which the amino acid sequence from the 49th amino acid to the 238th amino acid of ECFP before mutation is N-terminal, followed by 1 of ECFP before mutation. It shows that the -48th amino acid sequence is an amino acid sequence linked as the amino acid sequence of the C-terminal part. Other CFP variants follow this notation.
このようにして得たＰｉｃｋｌｅ２．１〜２．５をコードする増幅ＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで開環させた発現ベクターｐＰｉｃｋｌｅ２．０に組み換えて、それぞれｐＰｉｃｋｌｅ２．１〜２．５を作製した。 The amplified DNA fragments encoding Pickle2.1 to 2.5 thus obtained are recombined into the expression vector pPickle2.0 opened with restriction enzymes NotI and BglII to produce pPickle2.1 to 2.5, respectively. did.
（５）ＢＣＲ−ＡＢＬ発現ベクターの構築
ＢＣＲ−ＡＢＬ全長の翻訳領域を含むｃＤＮＡ（カリフォルニア工科大学Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ博士より分与を受けた）には、ｂｃｒ−ａｂｌの開始コドンの５’側にＥｃｏＲＩの認識配列、８７０−８７１番目のアミノ酸に相当する部位にＨｉｎｄＩＩＩの認識配列、及び終止コドンの３’側にＳｐｅＩの認識配列が存在する。このｃＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、ｄＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を反応させて平滑末端化した後、ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ｃＤＮＡ断片（ＢＣＲ−ＡＢＬ（３’））を調製した。
(5) Construction of BCR-ABL expression vector cDNA containing the full-length BCR-ABL translation region (provided by Dr. Baltimore, California Institute of Technology) recognizes EcoRI on the 5 'side of the start codon of bcr-abl. There is a HindIII recognition sequence at a site corresponding to the amino acid at positions 870-871, and a SpeI recognition sequence 3 ′ to the stop codon. This cDNA was digested with SpeI, reacted with DNA polymerase I (Klenow enzyme, Invitrogen) in the presence of dNTP to make blunt ends, digested with HindIII, and the cDNA fragment (BCR-ABL (3 ′)) was obtained. Prepared.
市販の発現ベクターｐＣＭＶ−３Ｍｙｃ−２Ａ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社）をＸｈｏＩによる消化し、ｄＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼＩによる平滑末端化を行い、さらにＨｉｎｄＩＩＩによる消化を行って開環させた。この開環させた発現ベクターにＢＣＲ−ＡＢＬ（３’）を組み換えて、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＢＣＲ−ＡＢＬ（３’）を作製した。 A commercially available expression vector pCMV-3Myc-2A (Invitrogene) was digested with XhoI, blunt-ended with DNA polymerase I in the presence of dNTP, and further digested with HindIII to open the ring. BCR-ABL (3 ') was recombined with the opened expression vector to prepare pCMV-Myc-BCR-ABL (3').
次に、ＢＣＲ−ＡＢＬ全長の翻訳領域を含むｃＤＮＡをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＢＣＲ−ＡＢＬの翻訳領域の５’末端側の一部を含むｃＤＮＡ断片（ＢＣＲ−ＡＢＬ（５’））を得た。このｃＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで開環させたｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＢＣＲ−ＡＢＬ（３’）に組み換えて、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＢＣＲ−ＡＢＬを作製した。 Next, cDNA containing the translation region of the full length of BCR-ABL is digested with EcoRI and HindIII, and a cDNA fragment (BCR-ABL (5 ′)) containing a part of the 5 ′ terminal side of the translation region of BCR-ABL is obtained. Obtained. This cDNA fragment was recombined with pCMV-Myc-BCR-ABL (3 ') opened with EcoRI and HindIII to prepare pCMV-Myc-BCR-ABL.
（６）遺伝子導入
２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ社）をＦｒｅｅ ｓｔｙｌｅ ２９３ ｍｅｄｉｕｍ（同社）中で培養し、２９３ｆｅｃｔｉｏｎ（同社）に添付されたプロトコールに従って、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＢＣＲ−ＡＢＬとｐＰｉｃｋｌｅ１．０〜２．５を導入し、前記培地中で２４〜３６時間インキュベーション後、遠心分離で細胞を回収した。細胞を可溶化バッファー（１５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で溶解し、遠心分離後の上清をサンプルとして、分光光度計ＦＰ−７５０（日本分光社）を用いて、４２０ｎｍの励起光により生じる蛍光発光（５３０ｎｍ）を測定した。蛍光強度の比較は、ｐＰｉｃｋｌｅ１．０〜２．５のみを導入した各コントロールとの間で行った。
(6) Gene transfer 293F cells (Invitrogen) were cultured in Free style 293 medium (Company), and pCMV-Myc-BCR-ABL and pPickle 1.0 to 2.5 in accordance with the protocol attached to 293fection (Company). After incubation for 24 to 36 hours in the medium, the cells were collected by centrifugation. The cells were lysed with a solubilization buffer (15 mM NaCl, 0.5 mM Triton X-100-containing 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5), and the supernatant after centrifugation was used as a sample with a spectrophotometer FP-750 (JASCO) Was used to measure fluorescence emission (530 nm) generated by 420 nm excitation light. The comparison of fluorescence intensity was performed with each control into which only pPickle 1.0 to 2.5 was introduced.
この結果、Ｐｉｃｋｌｅ１．０、２．０及び２．３において、各コントロール細胞に対してＢＣＲ−ＡＢＬ依存的な蛍光発光の上昇が確認された（図１）。特に、Ｐｉｃｋｌｅ２．０ではコントロールに対して２０％、Ｐｉｃｌｅ２．３ではコントロールに対して１００％の上昇が見られた。また、Ｐｉｃｋｌｅ１．０に対してＰｉｃｋｌｅ２．０は１．３３倍、Ｐｉｃｋｌｅ１．０に対してＰｉｃｋｌｅ２．３は１．８６倍、それぞれ強度が上昇した。 As a result, in Pickle 1.0, 2.0, and 2.3, an increase in BCR-ABL-dependent fluorescence emission was confirmed for each control cell (FIG. 1). In particular, Pickle 2.0 showed an increase of 20% with respect to the control, and Pickle 2.3 showed an increase of 100% with respect to the control. In addition, the strength of Pickle 2.0 was 1.33 times that of Pickle 1.0, and that of Pickle 2.3 was 1.86 times that of Pickle 1.0.
＜実施例２＞
実施例１の（６）と同様にして２９３Ｆ細胞にｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＢＣＲ−ＡＢＬとｐＰｉｃｋｌｅ２．０を導入して、前記培地中で２４〜３６時間培養した。ＢＣＲ−ＡＢＬの発現量を導入するベクター量の調整を行うことによって段階的に調節し、それぞれのロットにおける蛍光発光を、（６）と同様にして測定した。また、各ロットの細胞抽出物を、ＳＤＳゲルを用いて電気泳動した後、抗ＣｒｋＬ抗体、抗リン酸化ＣｒｋＬ抗体（いずれもＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ｃ−Ａｂｌ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてウエスタンブロッティングを行った。
<Example 2>
In the same manner as in Example 6 (6), pCMV-Myc-BCR-ABL and pPickle 2.0 were introduced into 293F cells and cultured in the medium for 24-36 hours. The expression level of BCR-ABL was adjusted stepwise by adjusting the amount of vector introduced, and the fluorescence emission in each lot was measured in the same manner as in (6). In addition, after each cell extract of each lot was electrophoresed using an SDS gel, an anti-CrkL antibody, an anti-phosphorylated CrkL antibody (both Cell Signaling Technology) and an anti-c-Abl antibody (Santa Cruz Biotechnology) were used. Western blotting was performed.
その結果、Ｐｉｃｋｌｅ２．０からの蛍光発光は、ＢＣＲ−ＡＢＬの容量に依存して上昇することが確認された（図２）。またこの蛍光発光の上昇とＰｉｃｋｌｅのリン酸化に正の相関があることも確認された（図３）。 As a result, it was confirmed that the fluorescence emission from Pickle 2.0 increased depending on the capacity of BCR-ABL (FIG. 2). It was also confirmed that there was a positive correlation between this increase in fluorescence and the phosphorylation of Pickle (FIG. 3).
＜実施例３＞
実施例１の（６）と同様にして２９３Ｆ細胞にｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＢＣＲ−ＡＢＬとｐＰｉｃｋｌｅ２．０を導入して、さらに所定量（０．０１〜１０μＭ）のイマニチブ（ノバルティス社から供与を受けた）を培地に添加して、２４〜４８時間培養を行った。各ロットにおける蛍光発光を、実施例１の（６）と同様にして測定した。また、実施例２と同様にしてウエスタンブロッティングを行った。
<Example 3>
In the same manner as in Example 6 (6), pCMV-Myc-BCR-ABL and pPickle 2.0 were introduced into 293F cells, and a predetermined amount (0.01 to 10 μM) of Imanitiv (provided by Novartis) ) Was added to the medium and cultured for 24-48 hours. The fluorescence emission in each lot was measured in the same manner as in Example 1 (6). Further, Western blotting was performed in the same manner as in Example 2.
その結果、Ｐｉｃｋｌｅ２．０からの蛍光発光は、イマニチブの添加に対して時間依存的に抑制されること（図４）、イマニチブの容量依存的に抑制されること（図５）が確認された。一方、イムノブロッティングによるリン酸化されたＰｉｃｋｌｅの量の検出では、高濃度（１〜１０μＭ以上）のイマニチブにおいて確認可能であり（図６）、本発明の試薬を用いた検出がイムノブロッティング方よりも高感度であることが確認された。 As a result, it was confirmed that the fluorescence emission from Pickle 2.0 was suppressed in a time-dependent manner with respect to the addition of the artificial (FIG. 4) and suppressed in a capacity-dependent manner with respect to the artificial (FIG. 5). On the other hand, in the detection of the amount of Pickle phosphorylated by immunoblotting, it can be confirmed at a high concentration (1 to 10 μM or more) of Immanitib (FIG. 6), and the detection using the reagent of the present invention is more effective than the immunoblotting method. It was confirmed that the sensitivity was high.
＜実施例４＞
ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性であるヒト慢性骨髄性白血病由来Ｋ５６２細胞を、１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した後、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴ−０２０ ＳｏｌｕｔｉｏｎＶ（Ａｍａｘａ社）を用いてｐＰｉｃｋｌｅ２．０を導入した。細胞を１μＭのイマニチブを含む前記培地／ポリＬリジンコートした３５ｍｍガラス底培養皿に移し、提示毎にタイムラプス顕微鏡で観察を行いながら、４８時間インキュベートした。観察法およびＦＲＥＴの計算は、Ｏｈｂａらの方法（ＥＭＢＯ Ｊ．、２００３年、第２２巻、第４号、第８５９−８６９頁）に従って行った。
<Example 4>
BCR-ABL-positive human chronic myeloid leukemia-derived K562 cells were cultured in RPMI 1640 medium (Sigma) supplemented with 10% fetal calf serum for 24 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 , then Nucleofector T- PPickle 2.0 was introduced using 020 Solution V (Amaxa). The cells were transferred to the medium / poly L lysine-coated 35 mm glass bottom culture dish containing 1 μM imatinib, and incubated for 48 hours while observing with a time-lapse microscope at each presentation. The observation method and the calculation of FRET were performed according to the method of Ohba et al. (EMBO J., 2003, Vol. 22, No. 4, pages 859-869).
その結果、腫瘍細胞の内部におけるＢＣＲ−ＡＢＬ、イマニチブ及びＰｉｃｋｌｅ２．０のインキュベーションにより、時間依存的にＰｉｃｋｌｅ２．０からの蛍光発光が低下することが確認された（図７） As a result, it was confirmed that the fluorescence emission from Pickle 2.0 decreased in a time-dependent manner by incubation of BCR-ABL, Immanitive and Pickle 2.0 inside the tumor cells (FIG. 7).
また、イマニチブの投与量を０．０１〜１０μＭの範囲で段階的に変化させて上記と同様にしてインキュベーションした細胞から、（６）と同様にして細胞抽出液を調製し、抗ＣｒｋＬ抗体と抗リン酸化ＣｒｋＬ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ、リン酸化されたＰｉｃｋｌｅ２．０の検出量の低下は、イマニチブの濃度が１０μＭの場合において観察された（図８）。 In addition, a cell extract was prepared in the same manner as in (6) from cells incubated in the same manner as described above by gradually changing the dose of imatinib within the range of 0.01 to 10 μM, and anti-CrkL antibody and anti-antibody When Western blotting was performed using a phosphorylated CrkL antibody, a decrease in the detected amount of phosphorylated Pickle 2.0 was observed when the concentration of imatinib was 10 μM (FIG. 8).
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