JP2009278939A - Method and apparatus for adding reagent - Google Patents

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Kazunobu Okano
和宣 岡野
Yoichiro Hosokawa
陽一郎 細川
Takayuki Uwada
貴之 宇和田
Hiroshi Masuhara
宏 増原
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for adding a reagent in a trace amount to a specific cell or a specified region in a cell population in a liquid. <P>SOLUTION: The method for adding the reagent to a biological sample includes: a step (a) for preparing a reagent-including body including a substrate for immobilizing a biological sample, the biological sample immobilized on the surface for immobilizing the biological sample on the substrate for immobilizing the biological sample, a liquid layer in contact with the biological sample, and the reagent; a step (b) for separating reagent fine particles including the reagents by breaking the reagent-including body; a step (c) for adding the reagent fine particles to the biological sample by imparting force in the biological sample direction to the reagent fine particles. In the step (a), the reagent-including body is arranged so as to be included in the liquid layer or so as to come into contact with the liquid layer, and the steps (b) and (c) are carried out by irradiating the reagent-including body with a laser beam. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、生体試料に微量の試薬を添加する方法と装置に関する。   The present invention relates to a method and apparatus for adding a trace amount of a reagent to a biological sample.

種々生命現象の検討には、実際の生命体を扱う必要がある。特に創薬分野では薬剤の薬効や副作用を調べるために、マウスやラット、ミドリザルなどの哺乳類個体を利用するケースが多い。しかしながら、創薬に関して言えば、ヒトとそれ以外の動物では種の壁があり、同一成分の物質であってもその薬効が異なるケースが多い。本来ならば、動物ではなく、ヒトの個体で実験を行うのがよいが、予期せぬ効果により個体にダメージを与えるリスクがかなり低いとのデータを動物実験で得た後で無ければ、当然のことながらヒトでの実験を行うことはできない。最近では薬効が期待できる量の1/1000の薬剤を実際にヒトに投与して、薬物の代謝を追跡するマイクロドージングを実施するケースが多くなったが、ヒトへの毒性が保障されるわけではない。したがって、ヒト個体を用いるのではなく、ヒト培養細胞を用いて研究を進めるケースが今後増えると予想される。また、動物愛護の観点からも動物を極力使用しない実験系が要求されるようになっている。実際ヒト細胞そのものをセンサーに見立てて、極微量物質を検出するバイオアッセイの研究が盛んになりつつあり、多細胞系を基板上に再構築する研究も行われている。将来、このような研究成果をもとに動物実験のかなりの部分が細胞ベースでのアッセイに移行することは時代の趨勢である。   To examine various life phenomena, it is necessary to deal with actual life forms. In particular, in the field of drug discovery, mammalian individuals such as mice, rats and green monkeys are often used to investigate the efficacy and side effects of drugs. However, when it comes to drug discovery, there are many species barriers between humans and other animals. Originally, it is better to conduct experiments with human individuals rather than animals, but it is natural that if there is no data obtained from animal experiments that the risk of damaging individuals due to unexpected effects is considerably low In particular, human experiments are not possible. Recently, there have been many cases where 1/1000 drugs that are expected to have a medicinal effect are actually administered to humans and microdosing is performed to track the metabolism of the drug, but toxicity to humans is not guaranteed. Absent. Therefore, it is expected that the number of cases of research using human cultured cells rather than human individuals will increase in the future. In addition, from the viewpoint of animal welfare, an experimental system that uses animals as little as possible is required. In fact, research on bioassays that detect extremely small amounts of substances using human cells themselves as sensors has become active, and research on restructuring a multicellular system on a substrate is also being conducted. In the future, it is a trend of the times that a large part of animal experiments will shift to cell-based assays based on such research results.

また、基礎的な生命科学研究においても、動物実験では個体毎の状態をコントロールすることが難しいことが生命現象追求を行う上でネックとなっている。もちろん、生育条件が管理された純系統の動物を用いて実験を行うわけであるが、それでも、実験結果のバラつきがかなりある。その点培養細胞では、個体と違って特定の特徴を持つ均一な細胞での実験が可能なため、薬効や毒性がダイレクトに計測できる可能性がある。特に、ヒトへの利用を目標とする創薬分野では、ヒトの培養細胞を用いることで種の壁を越えることができるので今後ますます発展すると考えられる。しかしながら、多くの場合、培養細胞系は単一細胞のクローンで構成される。ヒトを初めとする哺乳類は多細胞系であり、個々の臓器、個々の細胞が役割を分担するとともに協調して固体としての生命現象を維持している。このため、単一細胞系からなる培養細胞では、評価の範囲が限定される。   Also, in basic life science research, it is difficult to control the state of each individual animal experiment in order to pursue life phenomena. Of course, experiments are conducted using pure strains of animals with controlled growth conditions, but there are still considerable variations in experimental results. In contrast, in contrast to individual individuals, cultured cells can be tested with uniform cells that have specific characteristics, so there is a possibility that drug efficacy and toxicity can be measured directly. In particular, in the field of drug discovery aimed at human use, the use of cultured human cells can overcome the barriers of species, and is expected to develop further in the future. In many cases, however, cultured cell lines are composed of single cell clones. Mammals, including humans, are multicellular. Individual organs and individual cells share roles and cooperate to maintain life phenomena as solids. For this reason, the range of evaluation is limited in cultured cells consisting of a single cell line.

そこで多細胞系を再構築して、細胞のネットワークパターンを化学的、あるいは物理的な手法を用いて制御する技術について古くから多くの研究がなされている。たとえば、化学的方法では、Letourneau達が神経細胞を培養する基板表面にラミニンなどの細胞接着性の基質でパターンを描き、神経突起をパターンに沿って伸展させることに成功している（例えば、非特許文献４参照）。物理学的方法では、基板表面に神経細胞の伸展にとって障壁となる段差を構築した基板上で培養することで、障壁の高さが１０μｍ程度以上であれば神経細胞の伸展・移動を制限することが可能という報告がある（例えば、非特許文献５、６参照）。   Therefore, many researches have been conducted for a long time on technologies for restructuring multicellular systems and controlling cell network patterns using chemical or physical techniques. For example, in chemical methods, Letourneau et al. Succeeded in drawing a pattern with a cell-adhesive substrate such as laminin on the surface of a substrate on which neurons are cultured, and extending neurites along the pattern (for example, non- (See Patent Document 4). In the physical method, the growth and movement of nerve cells are restricted if the height of the barrier is about 10 μm or more by culturing on a substrate on which a step that becomes a barrier for the extension of nerve cells is constructed on the substrate surface. (For example, refer to Non-Patent Documents 5 and 6).

関連技術として、特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術、及び細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術が開発されている（例えば、特許文献１参照）。また、細胞培養を行いながら集束光を照射して加熱した領域の細胞培養容器の形状を自在に変化させることが可能な細胞培養マイクロチャンバーが開発されている（例えば、特許文献２参照）。さらには、近年の再生医療に係り、細胞を培養して細胞を組織的な構造体に構築することも試みられている。すでに上皮細胞を培養し、シート状にする技術などが確立している。   As related technologies, only one specific cell is selected, the cell is cultured as a cell line, and when observing the cell, the solution environmental condition of the cell is controlled, and the cell concentration in the container is controlled. A technique for controlling the culture constant or a technique for culturing and observing the cells while identifying interacting cells has been developed (for example, see Patent Document 1). In addition, a cell culture microchamber has been developed that can freely change the shape of a cell culture container in a region heated by irradiation with focused light while performing cell culture (see, for example, Patent Document 2). Furthermore, in recent regenerative medicine, attempts have been made to cultivate cells and construct the cells in a structured structure. Techniques for culturing epithelial cells and making them into sheets have already been established.

しかし、多くの場合、細胞培養で行われる細胞は均一なクローンであり、細胞間のインタラクションや細胞接触による高次細胞構築に関しては、我々の知識的蓄積はそれほど多くないのが現状である。このため、細胞群を再構築して機能的な構造体を得ようとする試みは新しい生物学を切り開くとともに、これからの再生医療分野の重要な課題となると言える。細胞群の再構築に関しては、たとえば、神経細胞において、人工的に少数の神経細胞からなる比較的単純な神経回路網を構築し、制御された環境下で、細胞ネットワークの情報処理機能を明らかにしようとする研究も盛んに行われている（例えば、非特許文献１、２、３参照）。   However, in many cases, the cells used in cell culture are homogeneous clones, and there is not much knowledge accumulated about higher order cell construction by interaction between cells or cell contact. For this reason, it can be said that an attempt to reconstruct a cell group to obtain a functional structure opens up new biology and is an important issue in the field of regenerative medicine in the future. Regarding the reconstruction of cell groups, for example, in neurons, a relatively simple neural network consisting of a small number of neurons is artificially constructed, and the information processing function of the cell network is revealed in a controlled environment. Research to try is also actively conducted (for example, see Non-Patent Documents 1, 2, and 3).

基板上に配した細胞アレイの特定の細胞を薬剤で刺激する方法としては、毛細管を用いて刺激したい細胞の近傍や細胞内に物理的に薬剤を添加する方法がとられている。あるいは、使用できる物質に制限があるが、ケージドＡＴＰのように生理活性物質のケージド化合物を添加し、刺激したい細胞のみに紫外光を照射して局在的に生理活性物質をリリースする方法が開発されている。ケージド化合物を用いる方法は、毛細管を用いる方法にくらべて、空間的により狭い領域のみに生理活性物質を添加することができるので、今後適用できる物質が増えるものと期待される。
特開２００４−８１０８６号公報 特開２００４−８１０８５号公報 Dichter, M.A. Brain Res., 149, 279-293 (1978) や、Mains R.E., Patterson P. H. J. Cell. Biol., 59, 329-345 (1973) Potter S.M., DeMarse T.B., J. Neurosci. Methods, 110, 17-24 (2001) Jimbo Y., Tateno T., Robinson H.P.C., Biophys. J. 76, 670-678 (1999) Letourneau P.C.: Dev. Biol., 66, 183-196 (1975) Stopak D. et al.: Dev. Biol., 90, 383-398 (1982) Hirono T.,Torimitsu K., Kawana A., Fukuda J., Brain Res., 446, 189-194 (1988) As a method of stimulating specific cells in a cell array arranged on a substrate with a drug, a method of physically adding the drug in the vicinity of the cell to be stimulated or using a capillary is used. Alternatively, there is a limit to the substances that can be used, but a method has been developed in which a caged compound of a physiologically active substance such as caged ATP is added, and only the cells to be stimulated are irradiated with ultraviolet light to locally release the physiologically active substance. Has been. In the method using a caged compound, a physiologically active substance can be added only to a spatially narrower area, compared to the method using a capillary tube, so that it is expected that more substances can be applied in the future.
JP 2004-81086 A JP 2004-81085 A Dichter, MA Brain Res., 149, 279-293 (1978) and Mains RE, Patterson PHJ Cell. Biol., 59, 329-345 (1973) Potter SM, DeMarse TB, J. Neurosci. Methods, 110, 17-24 (2001) Jimbo Y., Tateno T., Robinson HPC, Biophys. J. 76, 670-678 (1999) Letourneau PC: Dev. Biol., 66, 183-196 (1975) Stopak D. et al .: Dev. Biol., 90, 383-398 (1982) Hirono T., Torimitsu K., Kawana A., Fukuda J., Brain Res., 446, 189-194 (1988)

多細胞生物は、数多くの細胞が役割を分担すると同時に、全体がオーケストラのように調和して活動することで成り立っている。生命現象を生身の体として理解するには、オーケストレーションしている様々な細胞が時々刻々変化する活動状況を解析する必要がある。細胞はお互いに相互作用しているのであるから、細胞間の空間的な位置関係を考慮して各細胞の生理的挙動を記述することが必要である。これは、臓器組織をそのまま利用しようが、基盤の上に複数の細胞を再構成した細胞チップを用いようが同じである。細胞からの情報は、たとえば、形状変化や、心筋細胞の拍動のような挙動の変化や、神経細胞での電気生理学的な信号検出で得ることができる。   Multicellular organisms are composed of many cells that share their roles and at the same time act in harmony like an orchestra. To understand life phenomena as a living body, it is necessary to analyze the activity of various orchestrating cells that change from moment to moment. Since the cells interact with each other, it is necessary to describe the physiological behavior of each cell in consideration of the spatial positional relationship between the cells. This is the same whether an organ tissue is used as it is or a cell chip in which a plurality of cells are reconstructed on a base is used. Information from cells can be obtained by, for example, shape change, behavior change such as heartbeat pulsation, or electrophysiological signal detection in nerve cells.

問題は、複数種の細胞からなる集合体の特定の細胞のみを薬剤で刺激する万能な手段が無い点にある。前記したとおり、微小領域への薬剤添加法としては、毛細管を用いる方法とケージド化合物を利用する方法がある。毛細管ピペットを用いる方法では、毛細管ピペット先端を特定領域に接近させて薬剤を添加するため、複数の薬剤を逐次添加しようとするとそのつど毛細管ピペットを細胞近傍に接近したり放したりする必要があり、操作が煩雑で時間がかかり、熟練を要する作業となる。添加できる液量に関しても制約がある。細胞の大きさはせいぜい１０μｍ四方、すなわち１ピコリットルである。多細胞系の特定の細胞のみを薬剤刺激しようとすると、実質的に細胞サイズの１/10のサイズの１μｍ四方すなわち薬剤の体積は１フェムトリットル以下である必要がある。このような極微量試薬を取り扱うにはキャピラリーは必ずしも適しているとはいえない。ケージド化合物を用いる系では、使用できる薬剤に制限がある。また、ピコリットルオーダーの液滴を添加する方法としてインクジェット方式があるが、液滴体積が要求の１０００倍以上もある上、基本的に気相での使用に限られ、溶液中での試薬添加は困難である。このため、細胞試料に対して使用するケースは多くない。   The problem is that there is no universal means for stimulating only specific cells of an aggregate consisting of multiple types of cells with a drug. As described above, there are two methods for adding a drug to a microscopic region: a method using a capillary and a method using a caged compound. In the method using a capillary pipette, a capillary pipette tip is brought close to a specific region to add a drug, so when a plurality of drugs are added sequentially, the capillary pipette needs to approach or release the vicinity of the cell each time. The operation is cumbersome, time consuming and requires skill. There are also restrictions on the amount of liquid that can be added. The cell size is at most 10 μm square, ie 1 picoliter. When only a specific cell of a multi-cell system is to be stimulated with a drug, the 1 μm square of the size substantially 1/10 of the cell size, that is, the volume of the drug needs to be 1 femtoliter or less. Capillaries are not always suitable for handling such trace reagents. In systems using caged compounds, there are limitations on the drugs that can be used. In addition, there is an ink jet method as a method for adding droplets of picoliter order, but the droplet volume is more than 1000 times the required volume, and it is basically limited to use in the gas phase, and reagent addition in solution It is difficult. For this reason, there are not many cases used for a cell sample.

本発明は、細胞集団（組織の役割分担を行っていると思われる細胞群）の特定細胞ないし特定領域に液中でアットリットルないしフェムトリットルの試薬を添加できるユニバーサルな方法を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a universal method in which an at-liter or femtoliter reagent can be added in a liquid to a specific cell or a specific region of a cell population (a group of cells considered to share the role of tissue). And

本発明は、上記目的を達成するためになされたものであり、生体試料固定用基板、前記生体試料固定用基板の生体試料固定用表面上に固定された生体試料、前記生体試料に接する液層、および試薬を含む試薬含有体を準備する工程（ａ）、前記試薬含有体を破壊し、前記試薬を含む試薬微粒子を分離する工程（ｂ）、前記試薬微粒子に前記生体試料方向への力を付与し、前記試薬微粒子を前記生体試料に添加する工程（ｃ）を有し、前記工程（ａ）において、前記試薬含有体は前記液層内に含まれるように、または前記液層に接するように配置され、前記工程（ｂ）と前記工程（ｃ）とは、前記試薬含有体にレーザー光を照射することによる、生体試料に試薬を添加する方法である。 The present invention has been made to achieve the above object, and includes a biological sample fixing substrate, a biological sample fixed on the biological sample fixing surface of the biological sample fixing substrate, and a liquid layer in contact with the biological sample. And a step (a) of preparing a reagent-containing body containing a reagent, a step (b) of destroying the reagent-containing body and separating reagent fine particles containing the reagent, and applying a force toward the biological sample to the reagent fine particles. And (c) adding the reagent fine particles to the biological sample, and in the step (a), the reagent-containing body is included in the liquid layer or is in contact with the liquid layer. The step (b) and the step (c) are methods for adding a reagent to a biological sample by irradiating the reagent-containing body with laser light.

前記工程（ｂ）と前記工程（ｃ）とは、好ましくは、前記レーザー光の照射により誘起される物理的な力により行われる、より好ましくは、集光光学系によるレーザー光の集光により誘起される力である。   The step (b) and the step (c) are preferably performed by a physical force induced by irradiation with the laser beam, and more preferably induced by condensing the laser beam by a condensing optical system. Is the power to be.

本発明の一形態において、前記工程（ｂ）で、前記試薬微粒子の表面に前記試薬が露出する。   In one embodiment of the present invention, in the step (b), the reagent is exposed on the surface of the reagent fine particles.

また、本発明の一形態において、前記工程（ａ）で、前記試薬含有体を試薬固定用基板の試薬固定用表面に固定し、前記生体試料固定用基板と前記試薬固定用基板とを前記生体試料固定用表面と前記試薬固定用表面とが前記液層を介して対向するように配置する。   In one embodiment of the present invention, in the step (a), the reagent-containing body is fixed to a reagent fixing surface of a reagent fixing substrate, and the biological sample fixing substrate and the reagent fixing substrate are fixed to the living body. The sample fixing surface and the reagent fixing surface are arranged so as to face each other with the liquid layer interposed therebetween.

上記方法を、例えば、前記生体試料が細胞であり、前記液層が培養液からなる系に適用することができる。   The above method can be applied to, for example, a system in which the biological sample is a cell and the liquid layer is a culture solution.

また、本発明は、生体試料固定用基板、液層、試薬が固定されている試薬固定用基板、レーザー照射手段、集光光学系を有し、前記生体試料固定用基板、前記液層、前記試薬固定用基板がこの順で積層され、前記集光光学系と、前記レーザー照射手段とが、前記レーザー照射手段から照射されたレーザー光が前記集光光学系を介して前記試薬固定用基板に固定されている前記試薬の近傍に照射されるように配置されている、試薬添加装置である。   The present invention also includes a biological sample fixing substrate, a liquid layer, a reagent fixing substrate on which a reagent is fixed, laser irradiation means, and a condensing optical system, and the biological sample fixing substrate, the liquid layer, Reagent-fixing substrates are stacked in this order, and the condensing optical system and the laser irradiating means are configured such that the laser light emitted from the laser irradiating means is applied to the reagent-fixing substrate via the condensing optical system. It is a reagent addition apparatus arrange | positioned so that it may irradiate to the vicinity of the said reagent currently fixed.

また、本発明は、生体試料固定用基板、液層、試薬が固定されている試薬固定用基板、レーザー照射手段、集光光学系を有する試料添加装置により、生体試料に試薬を添加する方法であって、前記試料添加装置は、前記生体試料固定用基板、前記液層、前記試薬固定用基板がこの順で積層され、前記集光光学系と、前記レーザー照射手段とが、前記レーザー照射手段から照射されたレーザー光が前記集光光学系を介して前記試薬固定用基板に固定されている前記試薬の近傍に集光されるように配置され、前記方法は、前記生体試料固定用基板に生体試料を固定する工程（Ａ）、前記レーザー照射手段によりレーザー光を照射し、前記集光光学系を介して前記試薬の近傍に集光させる工程（Ｂ）を有し、前記工程（Ｂ）により前記試薬が前記生体試料に添加される、生体試料に試薬を添加する方法である。   The present invention also relates to a method of adding a reagent to a biological sample by a sample adding apparatus having a biological sample fixing substrate, a liquid layer, a reagent fixing substrate on which a reagent is fixed, laser irradiation means, and a condensing optical system. In the sample addition apparatus, the biological sample fixing substrate, the liquid layer, and the reagent fixing substrate are laminated in this order, and the condensing optical system and the laser irradiation unit include the laser irradiation unit. Is arranged so that the laser beam emitted from the laser beam is condensed in the vicinity of the reagent fixed to the reagent fixing substrate via the condensing optical system, and the method is applied to the biological sample fixing substrate. A step (A) of fixing a biological sample, a step (B) of irradiating a laser beam by the laser irradiation means and condensing the sample in the vicinity of the reagent via the condensing optical system, and the step (B) The reagent is It is added to the sample, a method of adding a reagent to the biological sample.

本発明の液中極微量試薬添加装置と方法を用いることで、液中でのアットリットルからフェムトリットルの極微量試薬添加が可能となる。また、本発明では溶液内の任意の空間領域にのみ極技量試薬を添加することが可能となる。   By using the apparatus and method for adding a very small amount of reagent in the liquid of the present invention, it is possible to add a very small amount of reagent from at liter to femtoliter in the liquid. In the present invention, the extreme skill reagent can be added only to an arbitrary space region in the solution.

以下、本発明について、より詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

本発明は生体試料への試薬添加方法であって、生体試料固定用基板、前記生体試料固定用基板の生体試料固定用表面上に固定された生体試料、前記生体試料に接する液層、および試薬を含む試薬含有体を準備する工程（ａ）、前記試薬含有体を破壊し、前記試薬を含む試薬微粒子を分離する工程（ｂ）、前記試薬微粒子に前記生体試料方向への力を付与し、前記試薬微粒子を前記生体試料に添加する工程（ｃ）を有し、前記工程（ａ）において、前記試薬含有体は前記液層内に含まれるように、または前記液層に接するように配置され、前記工程（ｂ）と前記工程（ｃ）とは、前記試薬含有体にレーザー光を照射することにより実施される。   The present invention is a method for adding a reagent to a biological sample, the biological sample fixing substrate, the biological sample fixed on the biological sample fixing surface of the biological sample fixing substrate, the liquid layer in contact with the biological sample, and the reagent Preparing a reagent-containing body containing (a), destroying the reagent-containing body and separating the reagent fine particles containing the reagent (b), applying a force in the direction of the biological sample to the reagent fine particles, A step (c) of adding the reagent fine particles to the biological sample, and in the step (a), the reagent-containing body is disposed so as to be included in or in contact with the liquid layer. The step (b) and the step (c) are performed by irradiating the reagent-containing body with laser light.

本発明の方法において、前記工程（ｂ）と前記工程（ｃ）とは、レーザー光の照射で誘起される物理的な力によることが好ましく、レンズを含む光学システムの集光により誘起される物理的な力であることがさらに好ましい。レーザー光の集光位置は、分離させる試薬微粒子そのもの、または分離させる試薬微粒子近傍であることが好ましく、試薬微粒子近傍がより好ましい。分離させる試薬微粒子の近傍としては、例えば試薬含有体または液層中の領域が挙げられる。   In the method of the present invention, the step (b) and the step (c) are preferably performed by a physical force induced by laser light irradiation, and are induced by light collection by an optical system including a lens. More preferably, the force The condensing position of the laser light is preferably in the vicinity of the reagent fine particles to be separated or in the vicinity of the reagent fine particles to be separated, and more preferably in the vicinity of the reagent fine particles. Examples of the vicinity of the reagent fine particles to be separated include a reagent-containing body or a region in the liquid layer.

本発明の試薬微粒子を分離する工程（ｂ）と前記試薬微粒子を生体試料に添加する工程（ｃ）において、レーザー光の集光により誘起される物理的な力は、レーザーアブレーションに基づく力学的な力であることが好ましい。前記レーザーアブレーションに基づき力学的な力を試薬含有体に接触させることで、試薬含有体を破壊し、破壊により複数の試薬微粒子を形成し、そして試薬微粒子を分離させる。また、レーザーアブレーションは、衝撃波、気泡、及び対流の少なくとも一つの発生を含むものであることが好ましい。さらに、レーザーアブレーションにより、各試薬微粒子に生体試料方向へ移動する力が付与され、工程（ｃ）が実行されることが好ましい。   In the step (b) of separating the reagent fine particles of the present invention and the step (c) of adding the reagent fine particles to the biological sample, the physical force induced by the focusing of the laser beam is a mechanical force based on laser ablation. Preferably it is force. By bringing a mechanical force into contact with the reagent-containing body based on the laser ablation, the reagent-containing body is destroyed, a plurality of reagent fine particles are formed by the destruction, and the reagent fine particles are separated. Laser ablation preferably includes generation of at least one of shock waves, bubbles, and convection. Furthermore, it is preferable that a force that moves in the direction of the biological sample is applied to each reagent fine particle by laser ablation, and step (c) is performed.

本発明において、前記レーザー光は、赤外光、可視光及び紫外光からなる群から選択される光であることが好ましい。また、前記レーザー光は、ナノ秒レーザー光、ピコ秒レーザー光及びフェムト秒レーザー光からなる群から選択されるパルスレーザー光、または連続波発振レーザー光であることが好ましい。   In the present invention, the laser light is preferably light selected from the group consisting of infrared light, visible light, and ultraviolet light. The laser light is preferably pulse laser light selected from the group consisting of nanosecond laser light, picosecond laser light, and femtosecond laser light, or continuous wave laser light.

本発明において、前記試薬含有体は、生体試料添加用の試薬と担体とからなることが好ましい。担体は、例えば、高分子、金属、半導体、生体分子の集合体、これらの結晶、またはこれらの組合せからなる群から選択される。   In the present invention, the reagent-containing body preferably comprises a biological sample addition reagent and a carrier. The carrier is selected from the group consisting of, for example, a polymer, a metal, a semiconductor, an assembly of biomolecules, a crystal thereof, or a combination thereof.

本発明において、前記生体試料としては、細胞または組織であることが好ましく、前記液層はこれらの培養液からなることが好ましい。   In the present invention, the biological sample is preferably a cell or tissue, and the liquid layer is preferably composed of these culture solutions.

本発明は、従来の毛細管を用いる方法やケージド化合物を用いる方法とは根本的に異なる方法となっている。細胞を取り扱う上で特に考慮する必要があるのは、組織断片であっても細胞チップであっても、細胞群は培養液中に存在することである。したがって、培養液中で極微量試薬を添加し、特定の細胞の存在する空間ないし特定の細胞内に運ぶ必要がある。また、添加する試薬は有機物で、タンパク質や糖鎖からなるものであることを考えると、温和な条件で添加ができる必要がある。   The present invention is fundamentally different from conventional methods using capillaries and methods using caged compounds. A particular consideration in handling cells is that groups of cells, whether tissue fragments or cell chips, are present in the culture medium. Therefore, it is necessary to add a very small amount of reagent in the culture medium and transport it into a space where a specific cell exists or into a specific cell. Moreover, considering that the reagent to be added is an organic substance and is composed of a protein or a sugar chain, it must be able to be added under mild conditions.

したがって、添加すべき試薬そのものは、細胞の存在するのと同じ環境、具体的には培地中に接した状態であるが細胞とは隔離された状態で存在し、必要に応じて必要な細胞に対してのみ接触できるように試薬を移動させることとする。このとき、移動させる試薬は液体でも良いし、実質的に液体として振舞うことのできるサイズまで微小化したナノ粒子の形状を採用することにより実現することができる。本発明では、当初は基板や巨大粒子に試薬を実質固相として保持しておき、必要に応じて溶液やナノ粒子の形に変換することで、フェムトリットル以下の試薬の自在な溶液中での移動すなわち添加を可能としている。   Therefore, the reagent itself to be added exists in the same environment as the cell exists, specifically in a state where it is in contact with the culture medium but isolated from the cell, and is added to the necessary cell as necessary. The reagent is moved so that it can be contacted only. At this time, the reagent to be moved may be a liquid, or can be realized by adopting a nanoparticle shape that is miniaturized to a size that can behave substantially as a liquid. In the present invention, the reagent is initially held as a substantially solid phase on a substrate or a giant particle, and converted into a solution or nanoparticle form as necessary, so that a reagent of femtoliter or less in a free solution can be obtained. Transfer or addition is possible.

フェムトリットル以下の試薬を液体として液中において添加することはもはや困難であるとの認識から、本発明では添加する物質を固体として扱う。液体の場合でも、固体の担体に吸着ないし包摂させることで、個体として扱うことが好ましい。   Recognizing that it is no longer difficult to add a femtoliter or less reagent in liquid as a liquid, the present invention treats the substance to be added as a solid. Even in the case of a liquid, it is preferable to treat it as an individual by adsorbing or including it in a solid carrier.

本発明の一形態では、添加用試薬をコーティングにより固相に保持した担体を一面に固定した試薬基板あるいは棒状の部材を使用する。担体としてはマイクロカプセルの形で液体試薬を保持した粒子状の担体、基板上に固体の担体相を設け、この担体相の表面に試薬を吸着させたものないし担体相の内部に包摂させてあたかも固体のような状態にして用いることができる。あるいは固体試薬の場合はそのまま基板上に塗布してもよく、また基板上に担体相を形成し、その上に固体試薬相を塗布した構成のいずれでも可能である。いずれも、1枚の基板上に1種類の試薬を固定した状態でも、ドット状にしたり、粒子毎に異なる試薬を固定したりしたものを基板上に配することで、1枚の基板上に複数種の試薬を配した構成としてもよい。複数の試薬を配した基板では、異なる試薬を同じ細胞あるいは異なる位置の細胞に対して順次添加することが可能となる利点がある。   In one embodiment of the present invention, a reagent substrate or a rod-like member is used in which a carrier holding an additive reagent in a solid phase by coating is fixed on one surface. As a carrier, a particulate carrier holding a liquid reagent in the form of a microcapsule, a solid carrier phase provided on a substrate, and a reagent adsorbed on the surface of the carrier phase or as if contained in the carrier phase It can be used in a solid state. Alternatively, in the case of a solid reagent, it may be applied on the substrate as it is, or any configuration in which a carrier phase is formed on the substrate and the solid reagent phase is applied thereon is possible. In either case, even when one type of reagent is fixed on a single substrate, dots can be placed on the substrate, or a different reagent fixed for each particle can be placed on the substrate. It is good also as a structure which has arranged the multiple types of reagent. A substrate on which a plurality of reagents are arranged has an advantage that different reagents can be sequentially added to the same cells or cells at different positions.

本発明の他の形態では、試薬を実質固相のように保持した担体相を破壊して試薬を溶液中に放出する構成を採用する。放出する試薬や試薬が添加される細胞に決定的なダメージを与えることが無いように、担体相の破壊には高出力の超短パルスレーザー光を使用することが好ましい。レーザー出力が多光子吸収を起こす領域にすることで、焦点面の限られた３次元領域（実質的にサブマイクロメータ四方）のみに可視光を照射したのと同じ効果が得られる。パルス幅が２００フェムト秒以下であれば、照射時間が短いので焦点面が細胞の特定位置に一致しない限り実質細胞に影響を与えることはない。しかしこのような条件のレーザーを水溶液に照射すると、焦点位置で衝撃波が発生するので、焦点位置近傍に存在する物質は破壊される。焦点位置あるいはその近傍に固体が存在する場合は、固体が衝撃波により粉々になり、微粒子を形成する。したがって、試薬を保持した担体相を超短パルスレーザーの焦点位置あるいはその近傍に一致させると、サブマイクロメータの範囲の担体相が破壊されて、そこに固定されていた試薬が放出される。   In another embodiment of the present invention, a configuration is adopted in which the carrier phase holding the reagent like a substantially solid phase is broken to release the reagent into the solution. It is preferable to use a high-power ultrashort pulse laser beam for destroying the carrier phase so as not to cause decisive damage to the reagent to be released and the cells to which the reagent is added. By making the laser output a region where multiphoton absorption occurs, the same effect as that obtained by irradiating visible light only to a three-dimensional region (substantially in the four directions of the submicrometer) having a limited focal plane can be obtained. If the pulse width is 200 femtoseconds or less, since the irradiation time is short, the cells are not affected unless the focal plane coincides with the specific position of the cell. However, when the aqueous solution is irradiated with the laser under such conditions, a shock wave is generated at the focal position, so that the substance existing near the focal position is destroyed. When a solid exists at or near the focal position, the solid is shattered by shock waves to form fine particles. Therefore, when the carrier phase holding the reagent coincides with the focal position of the ultrashort pulse laser or the vicinity thereof, the carrier phase in the submicrometer range is destroyed, and the reagent fixed there is released.

焦点面を固液界面より少し離れた液相位置に合わせることで、垂直方向に照射される衝撃波により限られた領域が破壊されると同時に、周りの担体相が障壁となり、ナノ粒子化した試薬を液中にある細胞ターゲットに向けてコーン状に放出することができる。焦点面と固液界面の距離は、２０μｍ以内、より好ましくは５μｍ以内である。焦点面と固液界面の距離が１０μｍのときの焦点面におけるパルスレーザー強度は２ ｎＪ／パルス〜８μＪ／パルスが好ましい。パルスレーザーの波長は、基板の透過特性を確保し、実質的な水溶液における多光子吸収による衝撃波発生に適した波長として６００〜１１００ｎｍを用いることができる。   By aligning the focal plane with the liquid phase position slightly away from the solid-liquid interface, a limited area is destroyed by the shock wave irradiated in the vertical direction, and at the same time, the surrounding carrier phase acts as a barrier, making it a nanoparticulate reagent Can be released in a cone toward the cell target in the liquid. The distance between the focal plane and the solid-liquid interface is within 20 μm, more preferably within 5 μm. The pulse laser intensity at the focal plane when the distance between the focal plane and the solid-liquid interface is 10 μm is preferably 2 nJ / pulse to 8 μJ / pulse. As the wavelength of the pulse laser, 600 to 1100 nm can be used as a wavelength suitable for shock wave generation by multiphoton absorption in a substantial aqueous solution while ensuring the transmission characteristics of the substrate.

担体相がマイクロカプセルの状態では、中に詰まっている液体試薬が放出されることになる。毛細管による従来の試薬添加と違う点は、ある程度の距離なら方向性を持って試薬を液中放出することができる点である。本発明では特定の細胞に対して試薬を添加する必要性から、超短パルスレーザー光の収束光の照射位置に照準を合わせる機構を設けることが好ましい。すなわち、あらかじめ画像として取り込んだ組織細胞像の特定細胞位置を指定すると、標的細胞位置に基板を保持している二次元ステージが移動し、自動焦点機構により試薬キャリアー相にＺ軸方向に長短パルスレーザー光の焦点が移動する。細胞試料基板面か試薬基板のどちらかを自動焦点機構で認識し、そこから一定の距離面をレーザー照射用焦点面とする。レーザー光を照射して試薬担体相の破壊の度合いを画像としてモニターしながら必要な領域の担体相が破壊されたとところでレーザー光の照射を停止する。レーザー光の照射位置が設定した焦点面に対してずれることもありえるので、Ｚ軸方向のレーザー光の照射面を画像による試薬担体相の破壊計測を行いながら移動する機構も設けることとする。本発明の方法により、生体試料を保持した基板上の微小空間に添加用試薬を添加することを可能となる。   When the carrier phase is in a microcapsule state, the liquid reagent packed therein is released. The difference from the conventional reagent addition by means of capillaries is that the reagent can be released into the liquid with directionality at a certain distance. In the present invention, since it is necessary to add a reagent to a specific cell, it is preferable to provide a mechanism for aiming at the irradiation position of the convergent light of the ultrashort pulse laser beam. In other words, when a specific cell position of a tissue cell image captured in advance as an image is designated, the two-dimensional stage holding the substrate moves to the target cell position, and a long and short pulse laser in the Z-axis direction is moved to the reagent carrier phase by an automatic focusing mechanism. The focus of light moves. Either the cell sample substrate surface or the reagent substrate is recognized by the automatic focusing mechanism, and a fixed distance plane is set as a focal plane for laser irradiation. While irradiating the laser beam and monitoring the degree of destruction of the reagent carrier phase as an image, the irradiation of the laser beam is stopped when the carrier phase in the necessary region is destroyed. Since the irradiation position of the laser beam may deviate from the set focal plane, a mechanism for moving the irradiation surface of the laser beam in the Z-axis direction while measuring the destruction of the reagent carrier phase by an image is provided. According to the method of the present invention, it is possible to add an addition reagent to a minute space on a substrate holding a biological sample.

本発明の他の形態として、試薬を固定する固相として液中すなわち培地中を浮遊する粒子の形状とすることもできる。粒子としては、粒径が０．０５〜２マイクロメータで固体粒子の表面に試薬が固定されている構造となっている。あるいは表面から芯まで添加したい試薬でできていても、試薬そのものが非水溶性であれば可能である。マイクロカプセルとして内部に試薬を詰めたものでも良い。これら粒子状の試薬はいわゆるレーザーピンセットや超音波輻射圧で所定の位置まで搬送する。標的細胞の近傍に試薬が来たところで、長短パルスレーザー光を照射し、ナノ粒子化した試薬あるいはマイクロカプセル内の液体試薬を放出する。この系では試薬は全方向に広がる可能性がある。溶液中に浮遊する試薬粒子を用いる系では、細胞の存在する試薬を添加したい特定微小領域に存在する粒子担体を画像検出して標的細胞の近傍に存在する粒子に照準を合わせることでも同様の目的を達成できる。しかし、この場合、標的細胞との位置関係を前記方法ほど厳密にすることができないが、粒子搬送機構が不要となるので装置としてはコンパクトに仕上げることができる利点がある。また、粒子担体を用いると、あらかじめファゴトーシスやエンドサイトーシスで粒子担体を細胞内に取り込ませた後で、超短パルスレーザー光を照射して、細胞内で薬剤を任意の時間に細胞内で放出させることができる。   As another form of the present invention, the solid phase for immobilizing the reagent may be in the form of particles floating in the liquid, that is, in the medium. The particle has a structure in which a reagent is fixed on the surface of a solid particle having a particle size of 0.05 to 2 micrometers. Alternatively, even if it is made of a reagent to be added from the surface to the core, it is possible if the reagent itself is insoluble in water. A microcapsule filled with a reagent may be used. These particulate reagents are conveyed to a predetermined position by so-called laser tweezers or ultrasonic radiation pressure. When the reagent arrives in the vicinity of the target cell, it is irradiated with a long / short pulse laser beam to release the nanoparticulate reagent or the liquid reagent in the microcapsule. In this system, reagents can spread in all directions. In a system using reagent particles suspended in a solution, it is also possible to detect the particle carrier in a specific microregion to which a reagent containing cells is added and to aim at the particles existing in the vicinity of the target cell. Can be achieved. However, in this case, the positional relationship with the target cell cannot be made as strict as the above method, but there is an advantage that the apparatus can be made compact because the particle transport mechanism is unnecessary. In addition, when a particle carrier is used, after the particle carrier is taken into the cell in advance by phagotosis or endocytosis, the drug is released inside the cell at any time by irradiating an ultrashort pulse laser beam. Can be made.

溶液中の細胞等生体試料存在する特定空間領域に微量液体試薬を添加する装置と方法の態様としては、無数に空いたマイクロメーターレベルの径を有するポーラス基板の穴に添加用試薬を保持した試薬基板を用いることもできる。ポーラス基板の穴は基板に対して貫通していても良いし、井戸のような穴でも良い。基板としてはシリコンが加工性に優れており、陽極エッチングで無数の穴を開けたポーラスシリコンを作成することができる。長短パルスレーザーを貫通孔あるいは凹部内の試薬溶液に照射することで衝撃波を発生させ、内部に保持した液体試薬を基板面に対して垂直方向に方向性を持って放出することができる。ポーラス基板そのものに焦点面を合わせても良い。また、ポーラスシリコンの部位を区切って異なる試薬を保持させることで、複数の試薬を特定細胞に逐次添加することが可能である。細胞試料面に対して、試薬を保持したポーラスシリコンを移動させることで、任意の細胞に対して任意の試薬を１枚のポーラスシリコンを用いて添加することが可能となる。   As an aspect of an apparatus and method for adding a trace amount of liquid reagent to a specific space region where a biological sample such as a cell in a solution is present, a reagent that holds an addition reagent in a hole of a porous substrate having an infinite number of micrometer-level diameters A substrate can also be used. The hole of the porous substrate may penetrate the substrate or may be a hole like a well. As the substrate, silicon is excellent in workability, and porous silicon having innumerable holes formed by anodic etching can be produced. By irradiating a reagent solution in a through-hole or a recess with a long / short pulse laser, a shock wave is generated, and the liquid reagent held inside can be emitted in a direction perpendicular to the substrate surface. The focal plane may be aligned with the porous substrate itself. In addition, it is possible to sequentially add a plurality of reagents to specific cells by separating porous silicon parts and holding different reagents. By moving the porous silicon holding the reagent with respect to the cell sample surface, it becomes possible to add an arbitrary reagent to an arbitrary cell using one porous silicon.

本発明で使用する超短パルスレーザーとしては、発振周波数が１Ｈｚ以上２０Ｈｚ以下でパルス幅が５００ピコ秒以下、より好ましい条件としては発振周波数が１０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下でパルス幅が５００フェムト秒以下である。発振周波数が１０Ｈｚより大幅に低いと処理できる試薬担体が少なく、すなわち放出するナノ担体粒子が少なくなる。また、パルス幅が長いと、多光子吸収に必要なレーザー光密度が高くなるために、生体試料に対する影響が無視できなくなるし、必然的に対流の問題が発生する。   The ultrashort pulse laser used in the present invention has an oscillation frequency of 1 Hz to 20 Hz and a pulse width of 500 picoseconds or less, and more preferably, the oscillation frequency is 10 Hz to 10 kHz and the pulse width of 500 femtoseconds or less. . When the oscillation frequency is significantly lower than 10 Hz, the amount of reagent carrier that can be processed is small, that is, the number of nanocarrier particles to be released is small. Also, if the pulse width is long, the laser light density necessary for multiphoton absorption becomes high, so the influence on the biological sample cannot be ignored, and convection problems inevitably occur.

また、本発明の方法に用いられる、生体試料を保持した試料基板の生体試料を保持した面に溶液を介して相対する位置に試薬含有体が固定されている基板をセットとして試料添加キットで供給されることが好ましい。   In addition, a sample addition kit is supplied as a set with a substrate in which a reagent-containing body is fixed at a position facing the surface of the sample substrate holding the biological sample, which is used in the method of the present invention, through the solution. It is preferred that

以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながらより詳細に説明する。   Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.

（第１の実施形態）
第１の実施形態は、基板上で培養してネットワークを形成している細胞群の特定の細胞に異なる試薬を添加する試薬添加方法である。ここでは、細胞はラット神経細胞を用いてニューラルネットワークを形成している細胞群の特定細胞に異なる３種の試薬を添加する。 (First embodiment)
The first embodiment is a reagent addition method in which different reagents are added to specific cells of a group of cells that are cultured on a substrate to form a network. Here, three different reagents are added to specific cells in a group of cells that form a neural network using rat neurons.

本実施形態を図１と図２を用いて説明する。図１は、本実施形態で用いる試薬添加装置の準備工程を模式的に示す図である。図１に示すように、試薬添加装置１の準備工程において、細胞基板２と試薬基板８とを用意し、細胞基板２の細胞固定用表面２ａの上にはスペーサ３を設ける。試薬基板８をスペーサ３の上に載せることで、細胞基板２と試薬基板８の間に培地保持部４が形成される。細胞基板２の細胞固定用表面２ａには、神経細胞５ａ、５ｂ、５ｃが着床し、ネットワーク６を形成している。   This embodiment will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a preparation process of the reagent addition apparatus used in the present embodiment. As shown in FIG. 1, in the preparation step of the reagent adding device 1, a cell substrate 2 and a reagent substrate 8 are prepared, and a spacer 3 is provided on the cell fixing surface 2 a of the cell substrate 2. By placing the reagent substrate 8 on the spacer 3, the culture medium holding unit 4 is formed between the cell substrate 2 and the reagent substrate 8. On the cell fixing surface 2a of the cell substrate 2, nerve cells 5a, 5b and 5c are implanted to form a network 6.

次に、神経細胞の調製方法、および試薬添加装置の準備工程の詳細について述べる。ラット大脳半球由来の細胞を培地に分散し、一旦ポリ−Ｌ−リジンコートした１０ｃｍ径のプラスティック製ペトリディッシュに播種し、５％ＣＯ2、飽和水蒸気雰囲気下、３７℃で一週間培養すると、ところどころに細胞塊を形成する。細胞塊を形成した状態で、スクレイパーを用いて細胞を回収し、細胞塊をほぐして細胞分散液として浮遊培養する。浮遊培養で得られるマイクロスフェアーを３０００ｒｐｍで遠心して回収する。この時点で、回収される細胞は神経幹細胞由来の細胞である。分化した細胞は、浮遊培養中に死滅する。 Next, the details of the preparation method of the nerve cell preparation method and the reagent addition apparatus will be described. Rat cerebral hemisphere-derived cells are dispersed in a medium, seeded once in a 10 cm diameter plastic Petri dish coated with poly-L-lysine, and cultured for one week at 37 ° C. in a saturated water vapor atmosphere with 5% CO 2 . To form a cell mass. In a state where the cell mass is formed, the cells are collected using a scraper, and the cell mass is loosened and suspended as a cell dispersion. Microspheres obtained by suspension culture are collected by centrifugation at 3000 rpm. At this point, the recovered cells are neural stem cell-derived cells. Differentiated cells die during suspension culture.

回収したマイクロスフェアーを０．２５％トリプシンで約１分間処理して分散させた細胞懸濁液に、大豆由来トリプシンインヒビターを添加してトリプシン活性を阻害させる。遠心して培地を交換した後に細胞基板２の細胞固定用表面２ａに細胞分散液の一部を播種し、1〜３週間５％ＣＯ2で飽和水蒸気雰囲気下、３７℃で培養する。この状態では細胞固定用表面２ａは上部開放の状態で、一般的にはペトリディッシュに細胞基板２をのせて培養する。残りの細胞懸濁液に関しては、浮遊培養を続けて神経幹細胞を経代培養する。細胞基板２上で培養を続けると1〜3週間で神経細胞ネットワーク６を形成する。 A trypsin activity is inhibited by adding a soybean-derived trypsin inhibitor to a cell suspension in which the collected microspheres are dispersed by treatment with 0.25% trypsin for about 1 minute. After centrifuging and exchanging the medium, a part of the cell dispersion is seeded on the cell fixing surface 2a of the cell substrate 2, and cultured at 37 ° C. in a saturated water vapor atmosphere with 5% CO 2 for 1 to 3 weeks. In this state, the cell fixing surface 2a is in an open state, and the cell substrate 2 is generally placed on a petri dish and cultured. Regarding the remaining cell suspension, suspension culture is continued and neural stem cells are subcultured. When the culture is continued on the cell substrate 2, the nerve cell network 6 is formed in 1 to 3 weeks.

その後、細胞基板２の細胞固定用表面２ａの細胞培養領域から外れた位置にスペーサ３を接着させ、スペーサ３の上部に試薬基板８を設置する。以上の工程を経て、細胞基板２の細胞ネットワーク６の存在する細胞固定用表面２ａは培地保持部４に満たされている培地を介して添加用試薬を固定した試薬基板８と向かい合っている。   Thereafter, the spacer 3 is adhered to a position outside the cell culture region of the cell fixing surface 2 a of the cell substrate 2, and the reagent substrate 8 is set on the spacer 3. Through the above steps, the cell fixing surface 2a where the cell network 6 of the cell substrate 2 is present faces the reagent substrate 8 on which the reagent for addition is fixed via the medium filled in the medium holding part 4.

細胞基板２と試薬基板８はいずれも350〜1100 nmで実質的に吸収を持たない石英ガラス（厚み0.11 mm）でできている。細胞基板２と試薬基板８はスペーサ３を介して、0.1 mmのギャップを形成している。   Both the cell substrate 2 and the reagent substrate 8 are made of quartz glass (thickness: 0.11 mm) having substantially no absorption at 350 to 1100 nm. The cell substrate 2 and the reagent substrate 8 form a gap of 0.1 mm via the spacer 3.

試薬基板８の細胞基板２と対向する面８ａには異なる試薬Ａ、Ｂ、Ｃがそれぞれ含まれるようにドット列状に塗布された試薬ドット９ａ、９ｂ、９ｃが形成されている。ここでは試薬Ａとしてphthalocyanine Cd、試薬Ｂとしてphthalocyanine Fe(III)、試薬Ｃとしてphthalocyanine を用いる例について述べる。本実施形態において、試薬Ａ、Ｂ、Ｃはいずれも非水溶性であり試薬基板８の表面８ａに固定されているため、そのままの状態では、培地保持部４に溶出することはない。   On the surface 8a of the reagent substrate 8 facing the cell substrate 2, reagent dots 9a, 9b, and 9c are formed so as to be applied in a dot row so that different reagents A, B, and C are included. Here, an example using phthalocyanine Cd as the reagent A, phthalocyanine Fe (III) as the reagent B, and phthalocyanine as the reagent C will be described. In the present embodiment, all of the reagents A, B, and C are water-insoluble and are fixed to the surface 8a of the reagent substrate 8, so that the reagents A, B, and C are not eluted into the medium holding unit 4 as they are.

図２は、細胞基板２の上に試薬基板８がセットされた状態を示す断面図である。試薬基板８は細胞基板２に対して、スペーサ３で一定のギャップを保ちながらスライドできる構成となっている。これにより、試薬ドット９ａ、９ｂ、９ｃのいずれかを標的細胞の上部に一致させることができる。たとえば、神経細胞ネットワーク６の細胞５ａに試薬ドット９ｃを、試薬基板１０の位置を調整することで一致させる。   FIG. 2 is a cross-sectional view showing a state in which the reagent substrate 8 is set on the cell substrate 2. The reagent substrate 8 is configured to slide with respect to the cell substrate 2 while maintaining a certain gap with the spacer 3. Thereby, any of reagent dots 9a, 9b, and 9c can be made to correspond to the upper part of a target cell. For example, the reagent dot 9 c is matched with the cell 5 a of the nerve cell network 6 by adjusting the position of the reagent substrate 10.

以上のように、試薬添加装置の準備工程が終了したら、レーザー光照射工程に移行する。サファイアチタンパルスレーザー１１からのレーザー光（800 nm、150 fsパルス、1 mJ/パルス、1 kHz）をポラライザー１２、コリメータレンズ１３、対物レンズ１４からなる光学系で収束光１５を作成し、収束光１５を試料ドット９ｃに照射する。収束光１５の焦点では衝撃波１８が発生し、試薬ドット９ｃが破壊され一部が試薬基板８から分離されて試薬微粒子となって溶液中に飛び散る。試薬ドット９ｃの内、飛散せずに試薬固定用基板８に固定されたままの部分は飛散する試薬微粒子の飛散方向を規定する。すなわち、試薬微粒子の飛び散る方向は、試薬基板８に固定されたままの試薬ドット９ｃによって規定される円錐エリア１９に限られる。したがって、所望の細胞５ａに試薬微粒子が添加される。   As described above, when the preparation process of the reagent addition apparatus is completed, the process proceeds to the laser beam irradiation process. The convergent light 15 is generated from the laser beam (800 nm, 150 fs pulse, 1 mJ / pulse, 1 kHz) from the sapphire titanium pulse laser 11 by the optical system including the polarizer 12, the collimator lens 13, and the objective lens 14. 15 is irradiated to the sample dot 9c. A shock wave 18 is generated at the focal point of the convergent light 15, the reagent dots 9 c are broken and a part is separated from the reagent substrate 8 to be scattered as reagent fine particles. Of the reagent dots 9c, the portion that is fixed to the reagent fixing substrate 8 without being scattered defines the scattering direction of the scattered reagent fine particles. That is, the scattering direction of the reagent fine particles is limited to the conical area 19 defined by the reagent dots 9 c that are fixed to the reagent substrate 8. Therefore, reagent fine particles are added to desired cells 5a.

（第２の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第１の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置における試薬基板の構成のみが異なる。 (Second Embodiment)
The reagent addition method of the present embodiment differs from the reagent addition method of the first embodiment only in the configuration of the reagent substrate in the reagent addition device.

図３は、本実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子２４が細胞５ａに添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置２１において、試薬基板２３の試薬固定用表面２３ａには試薬層２２が形成されている。試薬層２２は試薬のみ、または試薬と担体とからなる。   FIG. 3 is a cross-sectional view schematically showing how the reagent fine particles 24 are added to the cells 5a by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent adding device 21 of the present embodiment, a reagent layer 22 is formed on the reagent fixing surface 23 a of the reagent substrate 23. The reagent layer 22 is composed of only a reagent or a reagent and a carrier.

レーザー光の照射工程において、収束光１５の焦点は試薬層２２近傍の培地保持部４内の培地に一致するように調整することが好ましい。収束光１５の焦点では衝撃波１８が発生し、その衝撃波１８により試薬層２２が破壊されその一部が試薬基板２３から分離されて試薬微粒子２４として飛び散る。試薬微粒子２４が飛び散る方向は、固定された状態の試薬層２２によって規定される。すなわち、試薬微粒子２４は細胞５ａを含む円錐エリア１９の方向に飛び散り、所望の細胞５ａに試薬微粒子２４が添加される。
（第３の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第１の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置における試薬基板の構成のみが異なる。 In the laser light irradiation step, it is preferable to adjust the focal point of the convergent light 15 so as to coincide with the medium in the medium holding unit 4 in the vicinity of the reagent layer 22. A shock wave 18 is generated at the focal point of the convergent light 15, and the reagent layer 22 is broken by the shock wave 18, and a part thereof is separated from the reagent substrate 23 and scattered as reagent fine particles 24. The direction in which the reagent fine particles 24 scatter is defined by the reagent layer 22 in a fixed state. That is, the reagent fine particles 24 scatter in the direction of the conical area 19 containing the cells 5a, and the reagent fine particles 24 are added to the desired cells 5a.
(Third embodiment)
The reagent addition method of the present embodiment differs from the reagent addition method of the first embodiment only in the configuration of the reagent substrate in the reagent addition device.

図４は、本実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子３６が細胞５ａに添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置３１において、試薬基板３２の試薬固定用表面３２ａには試薬層３３が形成されている。試薬層３３は、試薬分子３５が担体３４に分散されてなる。担体３４としては、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、架橋セルロース、ポリアルギン酸などの高分子膜やゼラチン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロイン等の架橋タンパク質膜、PMMAやPVAなどのプラスチック類を試薬分子３５の種類に応じて選択して使用することができる。   FIG. 4 is a cross-sectional view schematically showing how reagent fine particles 36 are added to the cells 5a by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent adding device 31 of the present embodiment, a reagent layer 33 is formed on the reagent fixing surface 32 a of the reagent substrate 32. The reagent layer 33 is formed by dispersing reagent molecules 35 on a carrier 34. As the carrier 34, polymer membranes such as polyacrylamide, crosslinked dextran, crosslinked cellulose and polyalginic acid, crosslinked protein membranes such as gelatin, albumin, fibrinogen and fibroin, and plastics such as PMMA and PVA are used depending on the type of reagent molecule 35. Can be selected and used.

レーザー光の照射工程において、収束光１５の焦点が試薬層３３の近傍に位置するように照射する。収束光１５の焦点近傍では衝撃波１８が発生し、その衝撃波１８により試薬層３３が破壊されその一部が試薬基板３２から分離されて試薬微粒子３６として飛び散る。試薬微粒子３６が飛び散る方向は、固定された状態の試薬層３３によって規定される。すなわち、試薬微粒子３６は細胞５ａを含む円錐エリア１９の方向に飛び散り、所望の細胞５ａに試薬微粒子３６が添加される。   In the laser light irradiation step, irradiation is performed so that the focal point of the convergent light 15 is located in the vicinity of the reagent layer 33. A shock wave 18 is generated in the vicinity of the focal point of the convergent light 15, the reagent layer 33 is broken by the shock wave 18, and a part thereof is separated from the reagent substrate 32 and scattered as reagent fine particles 36. The direction in which the reagent fine particles 36 scatter is defined by the reagent layer 33 in a fixed state. That is, the reagent fine particles 36 scatter in the direction of the conical area 19 containing the cells 5a, and the reagent fine particles 36 are added to the desired cells 5a.

試薬微粒子３６は、試薬層３３の一部から形成されるので、担体３４中に試薬分子３５が包含されている構成である。したがって、試薬微粒子３６が細胞５ａに添加されることにより、試薬分子３５が細胞に添加される。   Since the reagent fine particles 36 are formed from a part of the reagent layer 33, the reagent molecules 35 are included in the carrier 34. Therefore, the reagent molecules 35 are added to the cells by adding the reagent fine particles 36 to the cells 5a.

（第４の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第１の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置における試薬基板の構成のみが異なる。 (Fourth embodiment)
The reagent addition method of the present embodiment differs from the reagent addition method of the first embodiment only in the configuration of the reagent substrate in the reagent addition device.

図５は、本実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子４５が細胞５ａに添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置４１において、試薬基板４２の試薬固定用表面４２ａには試薬層４３が形成され、さらにその上には試薬保護層４４が形成されている。試薬層４３は、添加用の試薬を含有する。試薬保護層４４は、試薬層４３の培地への溶出を防ぎ、また試薬層４３の試薬基板４２への固定を補助する。したがって、本実施形態は、培地に溶出しやすい試薬を用いる場合に特に有用である。   FIG. 5 is a cross-sectional view schematically showing how the reagent fine particles 45 are added to the cells 5a by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent addition apparatus 41 of this embodiment, a reagent layer 43 is formed on the reagent fixing surface 42a of the reagent substrate 42, and a reagent protective layer 44 is further formed thereon. The reagent layer 43 contains a reagent for addition. The reagent protective layer 44 prevents the reagent layer 43 from eluting into the medium, and assists in fixing the reagent layer 43 to the reagent substrate 42. Therefore, this embodiment is particularly useful when using a reagent that is easily eluted in the medium.

レーザー光の照射工程において、収束光１５の焦点が試薬層４３の近傍に位置するように照射する。収束光１５の焦点近傍では衝撃波１８が発生し、その衝撃波１８により試薬層４３および試薬保護層４４が破壊されその一部が試薬基板４２から分離されて試薬微粒子４５として飛び散る。試薬微粒子４５が飛び散る方向は、固定された状態の試薬層４３および試薬保護層４４によって規定される。すなわち、試薬微粒子４５は細胞５ａを含む円錐エリア１９の方向に飛び散り、所望の細胞５ａに試薬微粒子４５が添加される。   In the laser light irradiation step, irradiation is performed so that the focal point of the convergent light 15 is located in the vicinity of the reagent layer 43. A shock wave 18 is generated near the focal point of the convergent light 15, and the reagent layer 43 and the reagent protective layer 44 are broken by the shock wave 18, and a part of them is separated from the reagent substrate 42 and scattered as reagent fine particles 45. The direction in which the reagent fine particles 45 are scattered is defined by the reagent layer 43 and the reagent protective layer 44 in a fixed state. That is, the reagent fine particles 45 scatter in the direction of the conical area 19 including the cells 5a, and the reagent fine particles 45 are added to the desired cells 5a.

試薬微粒子４５は、試薬保護層４４のみからなるものもあるが、試薬含有層４３を含む場合、これが再表面に露出することになるので、試薬４３によりもたらされる細胞または細胞のネットワークに与える影響を観察することができる。   Some of the reagent fine particles 45 are composed only of the reagent protective layer 44. However, when the reagent containing layer 43 is included, the reagent fine particle 45 is exposed to the resurface, so that the effect on the cell or the cell network brought about by the reagent 43 is reduced. Can be observed.

（第５の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第１の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置における試薬基板の構成のみが異なる。 (Fifth embodiment)
The reagent addition method of the present embodiment differs from the reagent addition method of the first embodiment only in the configuration of the reagent substrate in the reagent addition device.

図６は、本実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子５５が細胞５ａに添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置５１において、試薬基板５２の試薬固定用表面５２ａには試薬を含有する複数の粒子状の試薬含有体５３が固定されている。   FIG. 6 is a cross-sectional view schematically showing how the reagent fine particles 55 are added to the cells 5a by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent adding device 51 of the present embodiment, a plurality of particulate reagent containing bodies 53 containing a reagent are fixed to the reagent fixing surface 52 a of the reagent substrate 52.

試薬含有体５３は、粒子状の担体５４の中に試薬微粒子５５が包摂されている。担体としては、ミセルやエマルジョン状のものや、高分子からなる固体を用いることができる。
レーザー光の照射工程において、収束光１５の焦点が試薬含有体５３の近傍に位置するように照射する。収束光１５の焦点近傍では衝撃波１８が発生し、その衝撃波１８により試薬含有体５３が破壊されその内部から試薬微粒子５５が流出する。または、試薬含有体５３が破壊され、試薬微粒子５５と担体５４とからなる微粒子が形成されて流出する。流出する試薬微粒子５５には、衝撃波１８により細胞方向への力が付与され、かかる力により試薬微粒子５５が所望の細胞５ａに添加される。担体５４がミセルやエマルジョンの場合はレーザー光の照射によりミセルやエマルジョンが破壊され内包されている試薬５５が流出する。 In the reagent-containing body 53, reagent fine particles 55 are included in a particulate carrier 54. As the carrier, micelles, emulsions, and solids made of polymers can be used.
In the laser light irradiation step, irradiation is performed so that the focal point of the convergent light 15 is located in the vicinity of the reagent-containing body 53. A shock wave 18 is generated in the vicinity of the focal point of the convergent light 15, and the reagent containing body 53 is destroyed by the shock wave 18, and reagent fine particles 55 flow out from the inside. Alternatively, the reagent-containing body 53 is destroyed, and fine particles composed of the reagent fine particles 55 and the carrier 54 are formed and flow out. A force in the cell direction is applied to the flowing out reagent fine particles 55 by the shock wave 18, and the reagent fine particles 55 are added to the desired cells 5a by the force. When the carrier 54 is a micelle or an emulsion, the micelle or emulsion is destroyed by the irradiation of the laser beam, and the contained reagent 55 flows out.

（第６の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第５の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置において試薬基板を有さず試薬含有体が培地に浮遊している点が異なる。 (Sixth embodiment)
The reagent addition method of the present embodiment is different from the reagent addition method of the fifth embodiment in that the reagent-containing body does not have a reagent substrate in the reagent addition apparatus and the reagent-containing body floats in the medium.

図７は、本実施形態の試薬添加方法により試薬６２が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置６１において、試薬含有体６４は、第５の試薬含有体５３と同様の構成であり、粒子状の担体６３の中に試薬微粒子６２が内包されている。試薬含有体６４は基板には固定されておらず、培地４に添加され、培地４中に浮遊している。   FIG. 7 is a cross-sectional view schematically showing how the reagent 62 is added to cells by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent addition device 61 of this embodiment, the reagent containing body 64 has the same configuration as the fifth reagent containing body 53, and reagent fine particles 62 are encapsulated in a particulate carrier 63. The reagent-containing body 64 is not fixed to the substrate but is added to the medium 4 and floats in the medium 4.

レーザー光の照射工程において、レーザー光の照射で所定領域（レーザーピンセット）６５ａ内に試薬含有体６４をトラップする効果を生じさせる。その後、生じたレーザーピンセット６５ａをレーザーの照射位置を矢印６６の方向にしたがって移動させて、これに伴い試薬含有体６４を移動させる。そして、所望の細胞５ａの上にレーザーピンセット６５ｂにより試薬含有体６４が保持されている状態とする。この状態から、パルスレーザー光１５を照射して試薬含有体６４を破壊する。なお、レーザーピンセットは、連続波レーザー光を照射することにより生じさせることができる。
図７ではレーザーピンセット６５ａ、６５ｂとパルスレーザー光１５を独立に記載しているが、レーザーピンセットとパルスレーザーを同軸に配置することで、確実に細胞５ａに対して試薬含有体６４を搬送して破壊することができる。上記例においては、試薬６２はレーザーピンセット６５ｂの軸方向に拡散する。すなわち図７では上下方向に試薬６２が飛び散るが、横方向にはレーザーピンセット６５ｂの光圧力が働くので光軸方向に比べて拡散量を少なくすることができる。このようにして、試薬６２を所望の細胞５ａに添加することができる。なお、第１〜第５の実施形態においても、試薬含有体を破壊させるためのレーザー光（例えば、フェムト秒パルスレーザー光による）と、レーザーピンセット（例えば、連続波レーザー光による）とを組み合わせることで、試薬含有体を破壊させた後の試薬の横方向への拡散を防止することができる。 In the laser light irradiation step, the effect of trapping the reagent-containing body 64 in the predetermined region (laser tweezers) 65a is generated by the laser light irradiation. Thereafter, the generated laser tweezers 65a is moved in accordance with the direction of the arrow 66, and the reagent containing body 64 is moved accordingly. Then, the reagent-containing body 64 is held on the desired cell 5a by the laser tweezers 65b. From this state, the reagent-containing body 64 is destroyed by irradiating the pulse laser beam 15. Laser tweezers can be generated by irradiating continuous wave laser light.
In FIG. 7, the laser tweezers 65a and 65b and the pulse laser beam 15 are described independently. However, by arranging the laser tweezers and the pulse laser coaxially, the reagent-containing body 64 can be reliably conveyed to the cell 5a. Can be destroyed. In the above example, the reagent 62 diffuses in the axial direction of the laser tweezers 65b. That is, in FIG. 7, the reagent 62 scatters in the vertical direction, but since the optical pressure of the laser tweezers 65b acts in the horizontal direction, the amount of diffusion can be reduced compared to the optical axis direction. In this way, the reagent 62 can be added to the desired cell 5a. In the first to fifth embodiments, a combination of laser light (for example, using femtosecond pulse laser light) for destroying the reagent-containing body and laser tweezers (for example, using continuous wave laser light) is combined. Thus, the lateral diffusion of the reagent after the reagent-containing body is destroyed can be prevented.

（第７の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第１の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置において、試薬基板の構成のみが異なる。 (Seventh embodiment)
The reagent addition method of the present embodiment differs from the reagent addition method of the first embodiment only in the configuration of the reagent substrate in the reagent addition apparatus.

図８は、本実施形態の試薬添加方法により試薬７５が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置７１において、試薬基板７２として、複数の貫通孔７３を有する基板を用いる。試薬基板７２の貫通孔７３内には、試薬７５を含有する溶液７４が充填されている。複数の貫通孔７３を有する試薬基板７２として、多孔質基板を用いることができる。多孔質基板の材質には、シリコンに陽極エッチングの技術で無数の穴をあけたいわゆるポーラスシリコンや酸化アルミニウムなどを使用することができる。貫通孔７３に試薬７５を含有する溶液７４を充填した後、試薬基板７２の両面を脂質膜７６で覆うことが好ましい。このような構成とすることにより、貫通孔７３内から溶液７４がもれ出ることを防ぐことができる。   FIG. 8 is a cross-sectional view schematically showing how the reagent 75 is added to cells by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent adding device 71 of the present embodiment, a substrate having a plurality of through holes 73 is used as the reagent substrate 72. A solution 74 containing a reagent 75 is filled in the through hole 73 of the reagent substrate 72. As the reagent substrate 72 having a plurality of through holes 73, a porous substrate can be used. As the material of the porous substrate, so-called porous silicon or aluminum oxide in which countless holes are formed in silicon by an anodic etching technique can be used. After filling the through hole 73 with the solution 74 containing the reagent 75, it is preferable to cover both surfaces of the reagent substrate 72 with the lipid film 76. By setting it as such a structure, it can prevent that the solution 74 leaks out from the inside of the through-hole 73. FIG.

貫通孔７３への試薬７５を含有する溶液７４の充填および脂質膜７６の作成方法の一例について説明する。まず試薬７５を含む溶液７４が入った容器に試薬基板７２を浸漬し、減圧脱気した後に常圧に戻す。試薬溶液の表面にたとえばステアリン酸の単層を形成する。次に、表面にステアリン酸の単層を界面にはった液層から空気層にむかって試薬基板７２を引き上げる。この一連の操作はラングミュアーの装置を用いれば容易に多孔質基板である試薬基板７２の貫通孔７３内に試薬が入り貫通孔７３の出口がステアリン酸の膜で覆われた基板７２を作成することができる。必要に応じて試薬基板７２を液界面から出し入れすることで多層のステアリン酸膜で貫通孔７３をふさぐこともできる。この方法は、本実施形態のように貫通孔７３を持つ基板７２でも、また、後述する第８の実施形態のように凹部を有する基板にも適用することができる。   An example of a method for filling the through hole 73 with the solution 74 containing the reagent 75 and creating the lipid film 76 will be described. First, the reagent substrate 72 is immersed in a container containing the solution 74 containing the reagent 75, degassed under reduced pressure, and then returned to normal pressure. For example, a monolayer of stearic acid is formed on the surface of the reagent solution. Next, the reagent substrate 72 is pulled up from the liquid layer having a monolayer of stearic acid on the surface to the air layer. In this series of operations, if a Langmuir apparatus is used, a substrate 72 in which a reagent enters the through hole 73 of the reagent substrate 72 which is a porous substrate and the outlet of the through hole 73 is covered with a stearic acid film is easily formed. be able to. If necessary, the through hole 73 can be closed with a multi-layered stearic acid film by inserting and removing the reagent substrate 72 from the liquid interface. This method can be applied to a substrate 72 having a through hole 73 as in the present embodiment, or a substrate having a recess as in an eighth embodiment to be described later.

レーザー光照射工程において、貫通孔７３の一つにレーザー光の収束光１５を照射すると貫通孔７３の内部の試薬７５を含有する溶液７４が脂質膜７５を破り、試薬７５が放出される。放出された試薬７５は対象の細胞５ａに添加される。レーザー光の収束光１５の焦点が、貫通光７３の試薬基板７２の培地とは反対側の面と一致するようにすることで、試薬７５が効率よく対象の細胞５ａの方向に放出される。   In the laser light irradiation step, when one of the through holes 73 is irradiated with the convergent light 15 of the laser light, the solution 74 containing the reagent 75 inside the through hole 73 breaks the lipid film 75 and the reagent 75 is released. The released reagent 75 is added to the target cell 5a. By making the focal point of the convergent light 15 of the laser light coincide with the surface of the penetrating light 73 opposite to the medium of the reagent substrate 72, the reagent 75 is efficiently emitted in the direction of the target cell 5a.

（第８の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第７の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置において試薬基板の構成のみが異なる。 (Eighth embodiment)
The reagent addition method of this embodiment is different from the reagent addition method of the seventh embodiment only in the configuration of the reagent substrate in the reagent addition apparatus.

図９は、本実施形態の試薬添加方法により試薬８５が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置８１において、試薬基板８２として、複数の凹部８３を有する基板を用いる。複数の凹部８３を有する基板８２は、基板をエッチング加工することにより製造することができる。凹部１１２内には試薬８５を含有する溶液８４が充填されている。凹部８３への溶液８４の充填方法および凹部の開口端への脂質膜の形成は、上述の第７の実施形態の方法にしたがう。
レーザー光照射工程において、凹部８３の底面近傍に集光するように収束光１５を照射すると、凹部８３内の試薬８５を含有する溶液８４が脂質膜を破り、試薬８５が放出される。放出された試薬８５は対象の細胞５ａに添加される。 FIG. 9 is a cross-sectional view schematically showing how the reagent 85 is added to cells by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent adding device 81 of the present embodiment, a substrate having a plurality of recesses 83 is used as the reagent substrate 82. The substrate 82 having the plurality of recesses 83 can be manufactured by etching the substrate. The recess 112 is filled with a solution 84 containing a reagent 85. The method for filling the recess 83 with the solution 84 and the formation of the lipid film at the open end of the recess are in accordance with the method of the seventh embodiment described above.
In the laser light irradiation step, when the convergent light 15 is irradiated so as to be condensed near the bottom surface of the recess 83, the solution 84 containing the reagent 85 in the recess 83 breaks the lipid film, and the reagent 85 is released. The released reagent 85 is added to the target cell 5a.

（第９の実施形態）
本実施形態の試薬添加方法は、第７の実施形態の試薬添加方法とは、試薬添加装置において試薬基板の構成のみが異なる。
図１０は、本実施形態の試薬添加方法により試薬９６が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。本実施形態の試薬添加装置９１において、試薬基板９２として、複数の凸部９３を有する基板を用いる。複数の凸部９３を有する基板９２は、基板をエッチング加工することにより製造することができる。凸部９３の先端部には、試薬層９４が形成されている。そして、試薬層９４さらには凸部９３の全体を覆うように脂質膜９５が形成されている。このような構成とすることにより、凸部９３の先端部に試薬層９４が固定され、培地内に試薬がもれ出ることを防ぐことができる。 (Ninth embodiment)
The reagent addition method of this embodiment is different from the reagent addition method of the seventh embodiment only in the configuration of the reagent substrate in the reagent addition apparatus.
FIG. 10 is a cross-sectional view schematically showing how the reagent 96 is added to cells by the reagent addition method of the present embodiment. In the reagent adding device 91 of the present embodiment, a substrate having a plurality of convex portions 93 is used as the reagent substrate 92. The substrate 92 having the plurality of convex portions 93 can be manufactured by etching the substrate. A reagent layer 94 is formed at the tip of the convex portion 93. And the lipid film 95 is formed so that the reagent layer 94 and also the whole convex part 93 may be covered. By setting it as such a structure, the reagent layer 94 is fixed to the front-end | tip part of the convex part 93, and it can prevent that a reagent leaks out in a culture medium.

例えば、試薬基板９２は、平面状ガラス基板（２×１０×０．５ ｍｍ（ｔ））を用いて形成することができ、この表面に多数の凸部９３を形成する。凸部９３の形成方法は、公知の方法を用いることができる。例えば、ガラス基板上にマスクを作成し、ガラス基板をエッチングして作成する。凸部９３は、例えば、直径１００μｍ、高さは１００μｍの円柱形状を有し、間隔は５００μｍでガラス基板上に規則正しく配列されている構成とすることができる。   For example, the reagent substrate 92 can be formed using a planar glass substrate (2 × 10 × 0.5 mm (t)), and a large number of convex portions 93 are formed on this surface. A known method can be used as a method of forming the convex portion 93. For example, a mask is created on a glass substrate, and the glass substrate is etched. For example, the protrusions 93 may have a cylindrical shape with a diameter of 100 μm and a height of 100 μm, and a spacing of 500 μm, which is regularly arranged on the glass substrate.

試薬層１５３の形成には、あらかじめアセチルコリンあるいはエピネフリンを１ｍMの濃度で含むポリエチレングリコールをスピンコーターで他のガラス基板上（２５×２５ ｍｍ）にあらかじめ塗布した基板を準備する。ここでは、２００ｒｐｍで３０秒間の条件で基板上に塗布する。試薬を含むポリエチレングリコールが乾く前に上記凸部９３を有するガラス基板の凸部９３の形成面を押し付けて、凸部９３の先端部に試薬付ポリエチレングリコールを転写する。乾燥後、ステアリン酸膜９５を作成し、純水でリンスして、試薬基板９２を得る。   For the formation of the reagent layer 153, a substrate in which polyethylene glycol containing acetylcholine or epinephrine at a concentration of 1 mM is previously applied onto another glass substrate (25 × 25 mm) by a spin coater is prepared. Here, the coating is performed on the substrate at 200 rpm for 30 seconds. Before the polyethylene glycol containing the reagent dries, the forming surface of the convex portion 93 of the glass substrate having the convex portion 93 is pressed to transfer the polyethylene glycol with reagent to the tip portion of the convex portion 93. After drying, a stearic acid film 95 is formed and rinsed with pure water to obtain a reagent substrate 92.

レーザー照射工程においては、細胞基板２の上に試薬基板９２を設置し、標的細胞塊の近傍に凸部９３の先端部が位置するように試薬基板９２を移動させ、フェムト秒レーザー光を凸部９３に直接又はその近傍の培養液中に焦点を合わせて照射すると試薬層９４が崩壊し、試薬微粒子９６が標的細胞に添加される。   In the laser irradiation step, the reagent substrate 92 is placed on the cell substrate 2, the reagent substrate 92 is moved so that the tip of the convex portion 93 is positioned in the vicinity of the target cell mass, and the femtosecond laser light is projected to the convex portion. When 93 is irradiated with focusing on the culture solution directly or in the vicinity thereof, the reagent layer 94 is collapsed, and the reagent fine particles 96 are added to the target cells.

本実施形態の試薬添加方法により、エプネフリン、またはアセチルコリンを添加すると、後述する実施例２と同様にエピネフリンでは拍動が増強され、アセチルコリンでは５〜６分間心拍が停止した後、拍動が再開する現象が確認できる。   When apnephrine or acetylcholine is added by the reagent addition method of the present embodiment, pulsation is enhanced with epinephrine as in Example 2 described later, and after pulsation is stopped with acetylcholine for 5 to 6 minutes, pulsation resumes. The phenomenon can be confirmed.

本実施形態の試薬添加方法では、試薬基板の凸部９３間に隙間があるので、細胞基板２の上に試薬基板９２を設置したままで長時間培養を続けても、細胞培養中の細胞に対する酸素や養分供給や細胞の代謝産物の拡散が容易になり、細胞育成がより確実になるメリットがある。実際本実施形態の試薬添加装置９１では、細胞基板２と試薬基板９２とを設置したままで、周辺の培地を交換するだけで、２週間以上の連続培養が可能である。   In the reagent addition method of the present embodiment, since there is a gap between the convex portions 93 of the reagent substrate, even if the culture is continued for a long time with the reagent substrate 92 placed on the cell substrate 2, There is an advantage that oxygen and nutrient supply and diffusion of cellular metabolites are facilitated, and cell growth is more reliable. In fact, in the reagent adding apparatus 91 of this embodiment, continuous culture for two weeks or more is possible by simply replacing the surrounding medium while the cell substrate 2 and the reagent substrate 92 are installed.

（実施例１）
本実施例では、第１の実施形態に記載の試薬添加方法により、細胞基板上でネットワークを構築している細胞に試薬を添加した後、細胞の活動に由来する信号を取得する細胞信号取得方法を行う。 Example 1
In this example, a cell signal acquisition method for acquiring a signal derived from the activity of a cell after adding the reagent to the cells constructing the network on the cell substrate by the reagent addition method described in the first embodiment. I do.

細胞基板上の細胞の培養を続けながら、試薬を添加した細胞５ａと隣接細胞５ｂ、遠隔細胞５ｃから得られる信号を取得する。信号取得には、公知の方法を用いることができる。本実施例では、特開２００６−１９８６１０号公報に記載の色素センサーアレイからなる細胞解析用センサーアレイ基板を用いる。図１１は、本実施例の細胞信号取得方法により細胞５ａ、５ｂ、５ｃの活動に由来する信号を取得する様子を模式的に示す断面図である。   While continuing to culture the cells on the cell substrate, signals obtained from the cells 5a to which the reagent is added, the adjacent cells 5b, and the remote cells 5c are acquired. A known method can be used for signal acquisition. In this example, a cell analysis sensor array substrate comprising a dye sensor array described in JP-A-2006-198610 is used. FIG. 11 is a cross-sectional view schematically illustrating how signals derived from the activities of the cells 5a, 5b, and 5c are acquired by the cell signal acquisition method of the present embodiment.

細胞解析用センサーアレイ１００は、厚み０．１１ｍｍの石英基板１０１の表面１０１ａに、複数の種類の検出用化合物を固定した６４種の検出用粒子をランダムに配置した構造となっている。図１１では、４種の検出用粒子１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ、１０２ｄを模式的に示している。検出用粒子１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ、１０２ｄの表面は低分子物質透過性のフルオロカーボン系の分子膜１０３で覆われている。細胞の発する低分子代謝産物のうち、低沸点の化合物は分子膜１０３を透過して検出用粒子１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ、１０２ｄまで到達する。分子膜１０３を透過した低分子代謝産物は粒子に固定されている検出用化合物と相互作用する。検出用化合物には、特定の低分子代謝産物と相互作用すると、その光学的なスペクトルが変化するものを用いる。検出用化合物としては、例えば６４種の金属配位ポルフィリン誘導体を用いることができる。細胞解析用センサーアレイ１００の製造方法は、特開２００６−１９８６１０号公報に記載の方法による。本実施例で用いる金属配位ポルフィリン色素の中には、Sn(TPP)Cl2、Co(TPP)Cl、Cr(TPP)Cl、Mn(TPP)Cl、Co(TPP)、Cu(TPP)、Ru(TPP)、Zn(TPP)、Ag(TPP)、Fe(TFPP)Clなどが含まれる。 The cell analysis sensor array 100 has a structure in which 64 types of detection particles having a plurality of types of detection compounds immobilized thereon are randomly arranged on the surface 101a of a quartz substrate 101 having a thickness of 0.11 mm. FIG. 11 schematically shows four types of detection particles 102a, 102b, 102c, and 102d. The surfaces of the detection particles 102a, 102b, 102c, and 102d are covered with a low-molecular substance-permeable fluorocarbon-based molecular film 103. Of the low-molecular metabolites emitted from the cells, the low-boiling compound passes through the molecular film 103 and reaches the detection particles 102a, 102b, 102c, and 102d. The low molecular weight metabolite that has passed through the molecular film 103 interacts with the detection compound immobilized on the particle. As the detection compound, a compound whose optical spectrum changes when interacting with a specific low molecular weight metabolite is used. As the detection compound, for example, 64 kinds of metal coordination porphyrin derivatives can be used. The method for producing the cell analysis sensor array 100 is based on the method described in JP-A-2006-198610. Some metal coordinating porphyrin dye used in the present embodiment, Sn (TPP) Cl 2, Co (TPP) Cl, Cr (TPP) Cl, Mn (TPP) Cl, Co (TPP), Cu (TPP), Ru (TPP), Zn (TPP), Ag (TPP), Fe (TFPP) Cl and the like are included.

本実施例では、第１の実施形態の方法により、試薬を添加した後に試薬基板を取り外し、スペーサ３上に細胞解析用センサーアレイ１００を装着する。試薬を添加する細胞５ａとその隣接細胞５ｂ、遠隔細胞５ｃが固定された生体試料固定用基板１に対しておおよそ１０μｍのギャップをおいて細胞解析用センサーアレイ１００を装着する。ギャップ４０３の部分には培地が充填されている。培地は必要に応じて交換することができる。連続して、すべての検出用粒子の３８０〜９００ｎｍにおけるスペクトルを３０分間間隔で測定する。   In this example, the reagent substrate is removed after the reagent is added by the method of the first embodiment, and the cell analysis sensor array 100 is mounted on the spacer 3. The cell analysis sensor array 100 is mounted with a gap of approximately 10 μm with respect to the biological sample fixing substrate 1 on which the cells 5a to which the reagent is added, the adjacent cells 5b, and the remote cells 5c are fixed. A medium is filled in the gap 403. The medium can be changed as necessary. Continuously, the spectra at 380 to 900 nm of all the detection particles are measured at 30 minute intervals.

図１２Ａ、図１２Ｂは、試薬Ａの添加前後における、各検出用粒子のスペクトルの波長ピークでの光信号変化量を示す。ここでスペクトルとは、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、多光子吸収に由来する遷移スペクトルをあらわし、光信号変化量とは、これらスペクトルの極大波長あるいはその近傍の信号変化量を示す。図１２Ａは、試薬を添加した細胞５ａ近傍の粒子から得られる典型的な光信号変化を、図１２Ｂは、遠隔細胞５ｃ近傍の粒子から得られる光信号変化のグラフとして示す。試薬を添加した細胞５ａから得られる光信号曲線２００ａと遠隔細胞５ｃから得られる光信号曲線２００ｃ、同じく光信号曲線２０１ａと２０１ｃ、光信号曲線２０２ａと２０２ｃ、光信号曲線２０３ａと２０３ｃは、それぞれ同一種類の金属配位ポルフィリン誘導体を有する検出用粒子からの光信号変化である。すなわち、図１２Ａの曲線２００ａと図１２Ｂの曲線２００ｃはそれぞれ試薬Ａを添加した細胞５ａの近傍と遠隔細胞５ｃの近傍における第１の特定金属配位ポルフィリン誘導体を有する粒子の信号の経時変化、曲線２０１ａと曲線２０１ｃはそれぞれ第２の特定金属配位ポルフィリン誘導体を有する検出用粒子の信号変化を、曲線２０２ａと曲線２０２ｃは第３の特定金属配位ポルフィリン誘導体を有する粒子の信号変化を表し、Ｔ１は試薬Ａを添加した時刻である。   12A and 12B show the amount of change in the optical signal at the wavelength peak of the spectrum of each detection particle before and after addition of reagent A. FIG. Here, the spectrum indicates an absorption spectrum, a fluorescence spectrum, and a transition spectrum derived from multiphoton absorption, and the optical signal change amount indicates a signal change amount at or near the maximum wavelength of these spectra. FIG. 12A shows a typical optical signal change obtained from particles in the vicinity of the cell 5a to which a reagent has been added, and FIG. 12B shows a graph of optical signal changes obtained from particles in the vicinity of the remote cell 5c. The optical signal curve 200a obtained from the cell 5a to which the reagent is added and the optical signal curve 200c obtained from the remote cell 5c, the optical signal curves 201a and 201c, the optical signal curves 202a and 202c, and the optical signal curves 203a and 203c are the same. It is an optical signal change from the particle for detection which has a metal coordination porphyrin derivative of a kind. That is, the curve 200a in FIG. 12A and the curve 200c in FIG. 12B are the time-dependent change and curve of the signal of the particles having the first specific metal coordinated porphyrin derivative in the vicinity of the cell 5a to which the reagent A is added and in the vicinity of the remote cell 5c, respectively. 201a and curve 201c each represent a signal change of the detection particle having the second specific metal coordination porphyrin derivative, and curves 202a and 202c represent a signal change of the particle having the third specific metal coordination porphyrin derivative, T1 Is the time when reagent A was added.

試薬を時刻Ｔ１に細胞５ａに添加すると、試薬を添加した細胞５ａと遠隔細胞５ｃで光信号強度が変化する曲線２００ａ、２００ｃ（検出用粒子１０２ａ由来）および曲線２０２ａ、２０２ｃ（検出用粒子１０２ｂ由来）のようなケースと、光信号強度が変化しない曲線２０３ａ、２０３ｃ（検出用粒子１０２ｃ由来）、試薬添加に関係なくゆるやかに光信号強度が変化する曲線２０１ａや２０１ｃ（検出用粒子１０２ｄ由来）が得られる。   When the reagent is added to the cell 5a at time T1, the curves 200a and 200c (derived from the detection particle 102a) and the curves 202a and 202c (derived from the detection particle 102b) change in the optical signal intensity between the cell 5a to which the reagent is added and the remote cell 5c. ), Curves 203a and 203c (derived from the detection particle 102c) in which the optical signal intensity does not change, and curves 201a and 201c (derived from the detection particle 102d) in which the optical signal intensity gradually changes regardless of the reagent addition. can get.

検出用粒子１０２ａ由来の曲線２００ａ、２００ｃと、粒子１０２ｂ由来の曲線２０２ａ、２０２ｃは、試薬を添加した細胞５ａで信号変化が検出された後、時間遅れを持って細胞５ｃで信号変化が見られる。検出用粒子１０２ｃ由来の曲線２０３ａ、２０３ｃではいずれの細胞でも変化は揺らぎレベルである。検出用粒子１０２ｄ由来の曲線２０１ａ、２０１ｃでは細胞５ａと遠隔細胞５ｃで差が見られない。   In the curves 200a and 200c derived from the detection particle 102a and the curves 202a and 202c derived from the particle 102b, the signal change is observed in the cell 5c with a time delay after the signal change is detected in the cell 5a to which the reagent is added. . In the curves 203a and 203c derived from the detection particle 102c, the change is the fluctuation level in any cell. In the curves 201a and 201c derived from the detection particle 102d, there is no difference between the cell 5a and the remote cell 5c.

検出用粒子１０２ａ由来の信号曲線２００ａ、２００ｃからは、細胞５ａに試薬添加後に細胞５ａと遠隔細胞５ｃで時間差をもって同種の代謝活動が行われていることが予想される。   From the signal curves 200a and 200c derived from the detection particle 102a, it is expected that the same kind of metabolic activity is performed with a time difference between the cell 5a and the remote cell 5c after the reagent is added to the cell 5a.

同様にして試薬Ｂ、試薬Ｃを添加した場合に検出される信号の観察を行うが、試薬Ｂと試薬Ｃではいずれの細胞においても差吸光度の変化は試薬Ａの時に比べて小さい。   Similarly, the signals detected when reagent B and reagent C are added are observed, but the difference in absorbance difference between reagent B and reagent C is smaller in both cells than in reagent A.

本発明によると、組織のように複数の細胞から成り立っている系においても、個別の細胞における特定分子群の量的変動の数値的評価が可能となり、組織内の、分子群の経時的マッピングが可能となる。したがって、組織における細胞の役割分担やコミュニケーションが物質レベルで数値化できるようになる。   According to the present invention, even in a system composed of a plurality of cells, such as a tissue, it is possible to numerically evaluate the quantitative variation of a specific molecule group in an individual cell, and the temporal mapping of the molecule group in the tissue can be performed. It becomes possible. Therefore, the division of roles and communication of cells in the tissue can be quantified at the substance level.

（実施例２）
本実施例では、マウスエンブリオカルシノーマ由来のP19CL6を１％DMSO を添加した１０％FBSを含むα−MEM培地で２週間３７℃、５％二酸化炭素雰囲気で培養して、心筋拍動細胞に分化誘導した細胞に対して、アセチルコリンあるいはエピネフリンを添加する方法とその結果について述べる。 (Example 2)
In this example, P19CL6 derived from mouse embryocarcinoma was cultured in an α-MEM medium containing 10% FBS supplemented with 1% DMSO for 2 weeks at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere to differentiate into cardiac pulsatile cells. A method of adding acetylcholine or epinephrine to induced cells and the results thereof will be described.

図５に示す装置を用い、第４の実施形態に示す試薬添加方法で試薬を添加する。試薬基板４２はガラス基板４２の表面４２ａにアセチルコリンあるいはエピネフリンを所定の濃度で含むポリエチレングリコールからなる試薬層４３とアセチルコリンあるいはエピネフリンが培地中に溶け出すのを防止する試薬保護層４４からなる。試薬層４３のサイズは２×１０×０．５ｍｍ（ｔ）である。アセチルコリンあるいはエピネフリンを１ｍMの濃度で含むポリエチレングリコールをスピンコーターでガラス基板４２の表面４２ａ上に塗布して試薬層４３を形成する。スピンコーターの条件は、ガラス基板１ｃｍ2あたり２００μｌの試薬入りポリエチレングリコールを添加し、２０℃で、２０ｒｐｍで３０秒間塗布し、つづいて２０００ｒｐｍで６０秒間行う。次に、ラングミュアーの装置の水槽に水界面にステアリン酸をたらしてほぼ細密状態に分子膜を形成し、その中を水中から空気中に上記ポリエチレングリコールを塗布したガラス基板をくぐらして試薬保護層４４を形成する。その後純水でリンスして、試薬層４３および試薬保護層４４が形成された試薬基板４２を得る。 Using the apparatus shown in FIG. 5, a reagent is added by the reagent addition method shown in the fourth embodiment. The reagent substrate 42 includes a reagent layer 43 made of polyethylene glycol containing acetylcholine or epinephrine at a predetermined concentration on the surface 42a of the glass substrate 42, and a reagent protective layer 44 that prevents acetylcholine or epinephrine from dissolving into the medium. The size of the reagent layer 43 is 2 × 10 × 0.5 mm (t). A reagent layer 43 is formed by applying polyethylene glycol containing acetylcholine or epinephrine at a concentration of 1 mM onto the surface 42a of the glass substrate 42 by a spin coater. The conditions of the spin coater are as follows: 200 μl of polyethylene glycol containing a reagent is added per 1 cm 2 of a glass substrate, applied at 20 ° C. for 30 seconds at 20 rpm, and then at 2000 rpm for 60 seconds. Next, stearic acid is poured into the water tank of Langmuir's apparatus to form a molecular film in an almost fine state, and a glass substrate coated with the above polyethylene glycol is passed through the water from the water to the reagent. A protective layer 44 is formed. Thereafter, rinsing is performed with pure water to obtain a reagent substrate 42 on which the reagent layer 43 and the reagent protective layer 44 are formed.

細胞基板２としては、ここでは底面がガラスでできた市販のガラスボトムディッシュを用いる。細胞基板２の細胞固定用表面２ａにP19CL6細胞を播種し、１％DMSO を添加した１０％FBSを含むα−MEM培地で培養する。２日に一回の頻度で培地を交換する。１週間目から拍動を開始する細胞塊が現れるので、そのまま２日に一回の頻度で培地を交換して培養を続ける。培養開始から２週間後に、上記試薬基板４２を試薬層４３を下にして、培地が挟まるように細胞基板２の上にセットする。試薬基板４２と細胞基板２の間は１００μｍとする。倒立形顕微鏡下で拍動中の細胞塊を探し、試薬を添加する位置を確認する。
フォーカスを試薬基板から５μｍ以内の培地に合わせてフェムト秒レーザー（チタンサファイアパルスレーザー：800 nm、150 fsパルス、1 mJ/パルス）の単パルスを照射する。パルス照射前後の心筋細胞の拍動状態を３０Hzのフレームレートで画像を取得し、標的細胞塊の拍動状況をフレーム毎の輝度差分を測定することで解析する。その結果を図１３と図１４に示す。図１３は試薬層４３にアセチルコリンを含む試薬基板４２を用いた結果であり、図１４は試薬層４３にエピネフリンを含む試薬基板４２を用いた結果である。それぞれの図において、横軸は時間、縦軸は輝度差分に相当する任意値である。アセチルコリンを添加する前はほぼ一定の間隔で拍動しているが、レーザー照射（Ｔ２）後一定時間を置いた後は拍動が停止し、約２０秒後に拍動が再開することがわかる。拍動再開後はレーザー照射前に比べて拍動間隔のバラつきが大きくなることがわかる。エピネフリンを添加するケースでは、レーザー照射（Ｔ２）後に拍動数が上昇することがわかる。図１５は試薬層４３にエピネフリンもアセチルコリンも含まない試薬基板４２を用いた例で、レーザー照射（Ｔ２）しても心筋拍動に変化が無いことがわかる。 Here, as the cell substrate 2, a commercially available glass bottom dish having a bottom made of glass is used. P19CL6 cells are seeded on the cell fixing surface 2a of the cell substrate 2 and cultured in an α-MEM medium containing 10% FBS supplemented with 1% DMSO. The medium is changed once every two days. Since a cell mass that starts to beat from the first week appears, the medium is changed as it is every two days and the culture is continued. Two weeks after the start of culture, the reagent substrate 42 is set on the cell substrate 2 so that the medium is sandwiched with the reagent layer 43 facing down. The distance between the reagent substrate 42 and the cell substrate 2 is 100 μm. Look for the pulsating cell mass under an inverted microscope and confirm the position to add the reagent.
A single pulse of femtosecond laser (titanium sapphire pulse laser: 800 nm, 150 fs pulse, 1 mJ / pulse) is irradiated with the focus on the medium within 5 μm from the reagent substrate. Images of the pulsation state of the cardiomyocytes before and after the pulse irradiation are acquired at a frame rate of 30 Hz, and the pulsation state of the target cell mass is analyzed by measuring the luminance difference for each frame. The results are shown in FIG. 13 and FIG. FIG. 13 shows the result of using the reagent substrate 42 containing acetylcholine for the reagent layer 43, and FIG. 14 shows the result of using the reagent substrate 42 containing epinephrine for the reagent layer 43. In each figure, the horizontal axis represents time, and the vertical axis represents an arbitrary value corresponding to the luminance difference. Before adding acetylcholine, it pulsates at a substantially constant interval, but after a certain time after laser irradiation (T2), the pulsation stops, and it can be seen that the pulsation resumes after about 20 seconds. It can be seen that after the pulsation restarts, the pulsation interval varies more than before the laser irradiation. In the case of adding epinephrine, it can be seen that the number of pulsations increases after laser irradiation (T2). FIG. 15 shows an example in which a reagent substrate 42 containing neither epinephrine nor acetylcholine is used for the reagent layer 43, and it can be seen that there is no change in myocardial pulsation even after laser irradiation (T2).

この結果は、レーザー照射により試薬基板の試薬層が崩壊し、標的細胞塊に試薬が到達することを示している。   This result shows that the reagent layer of the reagent substrate collapses due to laser irradiation, and the reagent reaches the target cell mass.

本発明の試薬添加方法は生命科学分野への応用に有用であり、細胞組織や多細胞系からなる細胞集団の特定細胞に対してのみアットリットルからフェムトリットルの試薬を添加することが可能となるため、薬物投与による遠隔の細胞が受ける影響の解析が可能となる。このため、本発明は生命現象解明や細胞を用いた薬物の影響を調べる上で有用であり、例えば創薬における毒性試験等に有用である。   The reagent addition method of the present invention is useful for application in the life science field, and it is possible to add an at-liter to femto-liter reagent only for specific cells of a cell tissue or a cell population consisting of a multicellular system. Therefore, it is possible to analyze the influence of remote cells on drug administration. Therefore, the present invention is useful for elucidating life phenomena and investigating the effects of drugs using cells, for example, for toxicity tests in drug discovery.

第１の実施形態で用いる試薬添加装置の準備工程を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically the preparatory process of the reagent addition apparatus used in 1st Embodiment. 第１の実施形態で用いる試薬添加装置の断面図である。It is sectional drawing of the reagent addition apparatus used in 1st Embodiment. 第２の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 2nd Embodiment. 第３の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 3rd Embodiment. 第４の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 4th Embodiment. 第５の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 5th Embodiment. 第６の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 6th Embodiment. 第７の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 7th Embodiment. 第８の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 8th Embodiment. 第９の実施形態の試薬添加方法により試薬微粒子が細胞に添加される様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that reagent microparticles | fine-particles are added to a cell with the reagent addition method of 9th Embodiment. 実施例１の細胞信号取得方法により細胞５ａ、５ｂ、５ｃの活動に由来する信号を取得する様子を模式的に示す断面図である。It is sectional drawing which shows typically a mode that the signal originating in the activity of the cells 5a, 5b, 5c is acquired by the cell signal acquisition method of Example 1. FIG. 実施例１で試薬を添加した細胞近傍の検出用粒子から得られる光信号変化を示すグラフである。4 is a graph showing changes in optical signal obtained from detection particles in the vicinity of cells to which a reagent is added in Example 1. 実施例１で試薬を添加した細胞の遠隔細胞近傍の検出用粒子から得られる光信号変化を示すグラフである。It is a graph which shows the optical signal change obtained from the particle for detection near the distant cell of the cell which added the reagent in Example 1. 実施例２でアセチルコリンを添加した細胞塊の活動状況を示すグラフである。It is a graph which shows the activity condition of the cell mass which added acetylcholine in Example 2. FIG. 実施例２でエピネフリンを添加した細胞塊の活動状況を示すグラフである。It is a graph which shows the activity condition of the cell cluster which added epinephrine in Example 2. FIG. 実施例２で添加薬にアセチルコリン、エピネフリンを含まない場合の細胞塊の活動状況を示すグラフである。It is a graph which shows the activity condition of the cell cluster when acetylcholine and epinephrine are not included in the additive in Example 2.

符号の説明Explanation of symbols

１，２１，３１，４１，５１，６１，７１，８１，９１ 試薬添加装置
２ 細胞基板
２ａ 細胞固定用表面
３ スペーサ
４ 培地保持部
５ａ，５ｂ，５ｃ 細胞
８ 試薬基板
１１ サファイアチタンパルスレーザー
１２ ポラライザー
１３ コリメータレンズ
１４ 対物レンズ
１５ 収束光
２２ 試薬層
２３ 試薬基板
２４ 試薬微粒子
３２ 試薬基板
３３ 試薬層
３４ 担体
３５ 試薬分子
４２ 試薬基板
４３ 試薬層
４４ 試薬保護層
５２ 試薬基板
５３ 試薬含有体
５５ 試薬微粒子
６２ 試薬
６４ 試薬含有体
７２ 試薬基板
７３ 貫通孔
７５ 試薬
７６ 脂質膜
８２ 試薬基板
８５ 試薬
９２ 試薬基板
９３ 凸部 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91 Reagent addition device 2 Cell substrate 2a Cell fixing surface 3 Spacer 4 Medium holding part 5a, 5b, 5c Cell 8 Reagent substrate 11 Sapphire titanium pulse laser 12 Polarizer 13 collimator lens 14 objective lens 15 convergent light 22 reagent layer 23 reagent substrate 24 reagent fine particle 32 reagent substrate 33 reagent layer 34 carrier 35 reagent molecule 42 reagent substrate 43 reagent layer 44 reagent protective layer 52 reagent substrate 53 reagent containing body 55 reagent fine particle 62 Reagent 64 Reagent-containing body 72 Reagent substrate 73 Through-hole 75 Reagent 76 Lipid membrane 82 Reagent substrate 85 Reagent 92 Reagent substrate 93 Convex

Claims (8)

生体試料固定用基板、前記生体試料固定用基板の生体試料固定用表面上に固定された生体試料、前記生体試料に接する液層、および試薬を含む試薬含有体を準備する工程（ａ）、
前記試薬含有体を破壊し、前記試薬を含む試薬微粒子を分離する工程（ｂ）、
前記試薬微粒子に前記生体試料方向への力を付与し、前記試薬微粒子を前記生体試料に添加する工程（ｃ）を有し、
前記工程（ａ）において、前記試薬含有体は前記液層内に含まれるように、または前記液層に接するように配置され、
前記工程（ｂ）と前記工程（ｃ）とは、前記試薬含有体にレーザー光を照射することによる、生体試料に試薬を添加する方法。 (A) preparing a biological sample fixing substrate, a biological sample fixed on the biological sample fixing surface of the biological sample fixing substrate, a liquid layer in contact with the biological sample, and a reagent-containing body containing a reagent;
A step (b) of destroying the reagent-containing body and separating reagent fine particles containing the reagent;
Applying a force in the direction of the biological sample to the reagent fine particles, and adding the reagent fine particles to the biological sample (c),
In the step (a), the reagent-containing body is disposed so as to be included in or in contact with the liquid layer,
The step (b) and the step (c) are methods of adding a reagent to a biological sample by irradiating the reagent-containing body with laser light. 前記工程（ｂ）と前記工程（ｃ）とは、前記レーザー光の照射により誘起される物理的な力により行われる、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the step (b) and the step (c) are performed by a physical force induced by irradiation with the laser beam. 前記レーザー光の照射により誘起される物理的な力が、集光光学系によるレーザー光の集光により誘起される力である、請求項２に記載の方法。   The method according to claim 2, wherein the physical force induced by the irradiation of the laser light is a force induced by condensing the laser light by a condensing optical system. 前記工程（ｂ）において、前記試薬微粒子の表面に前記試薬が露出する、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein in the step (b), the reagent is exposed on the surface of the reagent fine particles. 前記工程（ａ）において、前記試薬含有体を試薬固定用基板の試薬固定用表面に固定し、前記生体試料固定用基板と前記試薬固定用基板とを前記生体試料固定用表面と前記試薬固定用表面とが前記液層を介して対向するように配置する、請求項１乃至４いずれかに記載の方法。   In the step (a), the reagent-containing body is fixed to a reagent fixing surface of a reagent fixing substrate, and the biological sample fixing substrate and the reagent fixing substrate are combined with the biological sample fixing surface and the reagent fixing substrate. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the surface is arranged so as to face the liquid layer. 前記生体試料が細胞であり、前記液層が培養液からなる、請求項１乃至５いずれかに記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the biological sample is a cell, and the liquid layer is made of a culture solution. 生体試料固定用基板、液層、試薬が固定されている試薬固定用基板、レーザー照射手段、集光光学系を有し、
前記生体試料固定用基板、前記液層、前記試薬固定用基板がこの順で積層され、
前記集光光学系と、前記レーザー照射手段とが、前記レーザー照射手段から照射されたレーザー光が前記集光光学系を介して前記試薬固定用基板に固定されている前記試薬の近傍に照射されるように配置されている、試薬添加装置。 A biological sample fixing substrate, a liquid layer, a reagent fixing substrate on which a reagent is fixed, a laser irradiation means, a condensing optical system,
The biological sample fixing substrate, the liquid layer, and the reagent fixing substrate are laminated in this order,
The condensing optical system and the laser irradiating means irradiate the laser light emitted from the laser irradiating means in the vicinity of the reagent fixed to the reagent fixing substrate via the condensing optical system. A reagent addition device arranged to be 生体試料固定用基板、液層、試薬が固定されている試薬固定用基板、レーザー照射手段、集光光学系を有する試料添加装置により、生体試料に試薬を添加する方法であって、
前記試料添加装置は、
前記生体試料固定用基板、前記液層、前記試薬固定用基板がこの順で積層され、
前記集光光学系と、前記レーザー照射手段とが、前記レーザー照射手段から照射されたレーザー光が前記集光光学系を介して前記試薬固定用基板に固定されている前記試薬の近傍に集光されるように配置され、
前記方法は、
前記生体試料固定用基板に生体試料を固定する工程（Ａ）、
前記レーザー照射手段によりレーザー光を照射し、前記集光光学系を介して前記試薬の近傍に集光させる工程（Ｂ）を有し、
前記工程（Ｂ）により前記試薬が前記生体試料に添加される、生体試料に試薬を添加する方法。 A biological sample fixing substrate, a liquid layer, a reagent fixing substrate on which a reagent is fixed, a laser irradiation means, a method of adding a reagent to a biological sample by a sample addition device having a condensing optical system,
The sample addition device includes:
The biological sample fixing substrate, the liquid layer, and the reagent fixing substrate are laminated in this order,
The condensing optical system and the laser irradiating means condense the laser light emitted from the laser irradiating means in the vicinity of the reagent fixed to the reagent fixing substrate via the condensing optical system. Arranged to be
The method
Fixing the biological sample to the biological sample fixing substrate (A),
Irradiating laser light by the laser irradiation means, and condensing in the vicinity of the reagent via the condensing optical system (B),
A method of adding a reagent to a biological sample, wherein the reagent is added to the biological sample in the step (B).
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