JP2009256324A - Microparticles and method for producing the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To efficiently produce physiologically active substance-containing microparticles. <P>SOLUTION: A method for producing the physiologically active substance-containing microparticles is provided, which comprises a step of preparing an emulsion by mixing a physiologically active substance-containing volatile organic acid aqueous solution or a volatile organic aid solution of a physiologically active substance with a biodegradable polymer-containing volatile organic solvent, and a step of mixing the resultant emulsion with an aqueous solution of a polymer bearing negative electric charge. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、新規な微粒子およびその製造方法に関する。本発明はまたヒトおよび他の動物での免疫反応を利用したマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発することができるペプチドおよびその類似体を含んだ微粒子、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の増殖を抑える免疫用抗原やマラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物に関する。   The present invention relates to a novel fine particle and a method for producing the same. The present invention also relates to the growth of Plasmodium falciparum, a microparticle containing Peptide and its analogs that can elicit an immunological response against Plasmodium utilizing the immune response in humans and other animals. The present invention relates to a pharmaceutical composition for suppressing immunizing antigen and malaria parasite infection.

[従来技術とその問題点]
（１）感染症としてのマラリアの現況：
マラリアは地球上に於いて最も重大な原虫感染症の一つである。熱帯地域と亜熱帯地域の
流行地域を中心に、毎年3億人の感染者と200万人以上の死亡者が報告されている。また近年は、地球規模での経済活動の拡大により人や物資の移動が盛んになってきている。これに伴い、日本人渡航者が流行地で感染する例や、流行地から日本への入国者が国内で発症する輸入マラリアの症例が、1980年代より急激に増えている（非特許文献１）。このためマラリア対策は、流行地のみならず日本に於いても緊急の課題となっている。 [Prior art and its problems]
(1) Current status of malaria as an infectious disease :
Malaria is one of the most serious protozoal infections on the planet. Each year, more than 300 million infected people and more than 2 million deaths are reported, mainly in tropical and subtropical endemic areas. In recent years, the movement of people and goods has become active due to the expansion of economic activities on a global scale. Along with this, the number of cases where Japanese travelers are infected in endemic areas and the cases of imported malaria in which people entering Japan from endemic areas develop in Japan have increased rapidly since the 1980s (Non-patent Document 1). . For this reason, malaria control has become an urgent issue not only in endemic areas but also in Japan.

ヒトにマラリアを引き起こすPlasmodium属の寄生原虫は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）の4種類である。原虫を媒介する蚊の刺咬により体内に入ったマラリア原虫は血中から速やかに肝細胞に侵入し（一次肝臓内ステージ、図１a）、肝細胞内で***・増殖してから血中に放出され、赤血球内に侵入して***増殖を繰り返し（赤血球内サイクル、図１b）、増殖した原虫は他の蚊によってさらに伝搬されてゆく（図１c）。マラリアによる発熱の症状は赤血球内サイクルによって引き起こされる。特に熱帯熱マラリアは他の3種に比較して治療が遅れると重症化と死亡の危険をもたらす。   Plasmodium parasites that cause malaria in humans include Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium ovale There are four types. Malaria parasites that enter the body due to the bite of mosquitoes that carry protozoa quickly invade hepatocytes from the blood (primary intrahepatic stage, Fig. 1a), divide and proliferate in hepatocytes, and then release into the blood Then, it enters the erythrocytes and repeats division and proliferation (intra-erythrocyte cycle, FIG. 1b), and the proliferated protozoa is further transmitted by other mosquitoes (FIG. 1c). Symptoms of fever from malaria are caused by an intraerythrocyte cycle. In particular, P. falciparum poses a risk of increasing severity and death if treatment is delayed compared to the other three.

またマラリアは健康問題のみならず、アフリカ諸国での経済活動の停滞と社会不安の一因ともなっている。流行地に於ける近年の感染者の増加は、熱帯雨林開発や温暖化との関連も指摘され、International Panel on Climate Change報告（1996 & 1998）によると地球温暖化の場合２℃の温度上昇で5000-8000万人の増加が予測されている。そのため、第二次大戦後にDDT散布と衛生対策によって根絶したはずの日本を含む温帯地域においても、マラリア再流行が懸念されている。   Malaria is not only a health problem but also contributes to the stagnation of economic activity and social unrest in African countries. The recent increase in the number of infected people in endemic areas has been pointed out to be related to tropical rainforest development and global warming. According to the International Panel on Climate Change report (1996 & 1998), in the case of global warming, the temperature rose by 2 ° C. An increase of 50-80 million is predicted. For this reason, there is a concern that malaria recurrence may occur in temperate regions including Japan, which should have been eradicated by DDT spraying and hygiene measures after World War II.

（２）治療薬による薬剤耐性や副作用の問題：
薬剤耐性マラリアの分子メカニズム 1945年代から全世界に普及した特効薬クロロキンへの薬剤耐性が、早くも1957年にコロンビアとタイ-ミャンマー国境から同時に報告された。以後、クロロキン耐性原虫は全世界に拡散し、流行地域に於けるマラリア対策を極めて困難にしている。 (2) Problems of drug resistance and side effects caused by therapeutic drugs:
Molecular mechanism of drug-resistant malaria Drug resistance to the specific drug chloroquine, which has spread throughout the world since the 1945s, was reported from the Colombia-Thailand-Myanmar border as early as 1957. Since then, chloroquine-resistant protozoa have spread throughout the world, making it extremely difficult to combat malaria in endemic areas.

現在クロロキンはほとんど使われないが、その薬剤耐性メカニズムは長い間不明であった。流行地での調査と組み合わせて、熱帯熱マラリア原虫のクロロキン耐性には幾つかの蛋白の遺伝子変異（pfmdr（非特許文献２）、cg2（非特許文献３）、pfcrt（非特許文献４））の関与が示唆され、ようやく分子レベルで理解され始めてきた（非特許文献５）。クロロキンは少ない投与量でも、赤血球内の原虫にある酸性の食胞中へ濃縮される。この食胞はヘモグロビンを消化分解してアミノ酸を利用し、副生物であるヘムをヘモゾインとして無毒化する。クロロキンは栄養とならないヘム副生物であるヘモゾインの形成を阻害する。即ち原虫はヘムを無毒化できずに死滅する。しかし耐性原虫の食胞内ではクロロキ
ンの半減期はわずか数分であり、急速な薬物排出により耐性を発現する。 Chloroquine is currently rarely used, but its drug resistance mechanism has long been unknown. In combination with research in endemic areas, chloroquine resistance of P. falciparum has several protein mutations (pfmdr (Non-patent document 2), cg2 (Non-patent document 3), pfcrt (Non-patent document 4)) Has been suggested and has finally begun to be understood at the molecular level (Non-patent Document 5). Chloroquine is concentrated even in small doses into the acidic phagosome in the protozoa in the erythrocytes. This phagosome digests and degrades hemoglobin and uses amino acids to detoxify the by-product heme as hemozoin. Chloroquine inhibits the formation of hemozoin, a non-nutritive heme by-product. That is, the protozoa die without being able to detoxify heme. However, in the resistant protozoa, the half-life of chloroquine is only a few minutes and develops resistance through rapid drug elimination.

現在のマラリア治療にはベトナム戦争で開発された化合物（メフロキン）が多く使用されている。最新の治療薬は2000年に米国で認可されたマラロンであるが、これも既存薬の転用である。現在は漢方薬の成分から発見された治療薬、アルテミシニンとその誘導体が注目されている（National Geographic誌 2007年7月号； Nature誌 2004年8月19日号（非特許文献６））   A compound developed in the Vietnam War (mefloquine) is often used to treat malaria. The latest treatment is malalone approved in the United States in 2000, which is also a diversion of an existing drug. Currently, artemisinin and its derivatives discovered from ingredients in Chinese herbal medicine are attracting attention (National Geographic 2007 July issue; Nature 2004 August 19 issue (non-patent document 6))

しかしマラリア原虫殺作用のある薬剤は頭痛、吐き気など副作用の非常に強いものが多い。そのため予防内服は一般に薦められていない。実際、既存の化合物（キニーネ、クロロキン）は劇物である。これに対し、抗原ペプチドや生分解性高分子を原料にするワクチンはアミノ酸やヒドロキシカルボン酸を成分とするため、目的の予防免疫反応のみを起こし、既存治療物質に見られる強い毒性がない。   However, many drugs that kill malaria parasites have very strong side effects such as headache and nausea. Therefore, preventive use is not generally recommended. In fact, existing compounds (quinine, chloroquine) are deleterious. In contrast, vaccines using antigenic peptides and biodegradable polymers as raw materials contain amino acids and hydroxycarboxylic acids as components, and thus cause only the desired preventive immune reaction and do not have the strong toxicity seen with existing therapeutic substances.

このように従来技術では、マラリアの予防や治療に多くの問題を抱えている。そのため、予防法として安全で安価なワクチンによる予防接種が望まれている。しかし現在までに市販されたワクチンはない。   As described above, the conventional techniques have many problems in preventing and treating malaria. Therefore, vaccination with a safe and inexpensive vaccine is desired as a preventive method. However, no vaccine has been marketed to date.

（３）マラリアワクチン開発の現況と問題：
マラリアワクチンの開発が始まったのは比較的最近である（１９７８年以降）。現在、国内・海外を含めてワクチンを指向した研究が精力的に進められている。しかし臨床応用されている例は一つもない。報告されている論文によれば、世界中で十数グループが臨床試験へ進みつつある（非特許文献７）。その他に日本国内の研究ではおよそ３グループがワクチンを目指して臨床試験およびその準備を進めている（第７３回日本寄生虫学会大会、シンポジウム「日本のマラリアワクチン研究」、2004年4月24日、前橋市）。 (3) Current status and problems of malaria vaccine development:
The development of malaria vaccines has started relatively recently (since 1978). Currently, vigorous research on vaccines is underway in Japan and overseas. However, there are no examples of clinical application. According to reported papers, more than a dozen groups are proceeding to clinical trials worldwide (Non-patent Document 7). In addition, approximately 3 groups in Japan are pursuing clinical trials and preparations aimed at vaccines (73rd Annual Meeting of the Parasitological Society of Japan, Symposium “Japanese Malaria Vaccine Research”, April 24, 2004, Maebashi City).

これまでのマラリアワクチン開発の研究報告を精査すると、マラリアワクチン開発が困難な理由は、マラリア原虫が進化の過程で獲得された複雑な免疫回避システムを持つことに加えて、マラリアの臨床症状は感染者の免疫状態によって大きく異なるためワクチン効果の判定が難しいこと、が原因と考えられる。すなわち従来技術では、流行地における住民それぞれに異なる免疫状態や、非流行地からの渡航者で免疫の全くない状態など、免疫状態の差を考慮したワクチン開発がされていない点に限界がある。   In reviewing previous research reports on malaria vaccine development, malaria vaccine development is difficult because the malaria parasite has a complex immune evasion system acquired in the course of evolution, and the clinical symptoms of malaria are infections. This is considered to be because it is difficult to determine the vaccine effect because it varies greatly depending on the person's immune status. In other words, the prior art is limited in that it does not develop vaccines that take into account differences in immune status, such as different immunity status among residents in endemic areas and non-endemic travelers.

（４）エマルジョン法による高分子微粒子の現況：
近年、生分解性高分子（ポリ乳酸-グリコール酸共重合体など）を用いた、ダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法によって作製される高分子微粒子が、生理活性物質の封入を目的として多く研究されている。ダブルエマルジョン法では水相-有機相-水相 (W/O/W)の３つの溶液を用いて、薬物を封入した微粒子を形成させる。シングルエマルジョン法では有機相-水相 (O/W)の２つの溶液を用いて、薬物を有機層に溶解、封入した微粒子を形成させる。 (4) Current status of polymer fine particles by emulsion method:
In recent years, polymer fine particles prepared by the double emulsion method or single emulsion method using biodegradable polymers (polylactic acid-glycolic acid copolymer, etc.) have been studied for the purpose of encapsulating bioactive substances. Yes. In the double emulsion method, fine particles encapsulating a drug are formed using three solutions of an aqueous phase, an organic phase and an aqueous phase (W / O / W). In the single emulsion method, two solutions of an organic phase and an aqueous phase (O / W) are used to form fine particles in which a drug is dissolved and encapsulated in an organic layer.

従来のダブルエマルジョン法では、例えば、非特許文献８に記載のように、少量の生理活性物質（25 mg）の水溶液（250μL）を生分解性高分子（ポリ乳酸-グリコール酸共重合体、250 mg）の揮発性有機溶媒溶液（ジクロロメタン、5 mL）と撹拌乳化させる。ここでは生理活性物質を含む内水相が、はげしい攪拌によって微小滴に分散される。このようなW/Oエマルジョンに、大量のポリビニルアルコール水溶液（8〜12％）を注入（25 mL）して撹拌をつづける。すると生分解性高分子を溶かしていた揮発性有機溶媒が蒸発して、溶解度が低下するために、生分解性高分子が内水相をとり囲むように析出して微粒子を形成する。   In the conventional double emulsion method, for example, as described in Non-Patent Document 8, a small amount of an aqueous solution (250 μL) of a physiologically active substance (25 mg) is added to a biodegradable polymer (polylactic acid-glycolic acid copolymer, 250 mg) and volatile organic solvent solution (dichloromethane, 5 mL) and emulsify with stirring. Here, the inner aqueous phase containing the physiologically active substance is dispersed into the microdroplets by vigorous stirring. A large amount of polyvinyl alcohol aqueous solution (8-12%) is poured into such a W / O emulsion (25 mL) and stirring is continued. Then, the volatile organic solvent in which the biodegradable polymer is dissolved evaporates and the solubility is lowered, so that the biodegradable polymer is deposited so as to surround the inner aqueous phase to form fine particles.

従来のシングルエマルジョン法では、例えば少量の生理活性物質（25 mg）を生分解性高分子（ポリ乳酸-グリコール酸共重合体、250 mg）の揮発性有機溶媒溶液（ジクロロメタン、5 mL）と撹拌溶解させる。ここでは生理活性物質が均一なジクロロメタン溶液になる点がダブルエマルジョン法と異なる。このような有機相に、大量のポリビニルアルコール水溶液（1〜20％）を注入（25 mL）して撹拌をつづける。するとここでは生理活性物質と生分解性高分子を含む有機相が、はげしい攪拌によって微小滴に分散される。このようなO/Wエマルジョンにおいて、生分解性高分子を溶かしていた揮発性有機溶媒が蒸発して溶解度が低下するために、生分解性高分子が生理活性物質を含んだまま析出して微粒子を形成する。   In the conventional single emulsion method, for example, a small amount of physiologically active substance (25 mg) is stirred with a volatile organic solvent solution (dichloromethane, 5 mL) of a biodegradable polymer (polylactic acid-glycolic acid copolymer, 250 mg). Dissolve. Here, the point that the physiologically active substance becomes a homogeneous dichloromethane solution is different from the double emulsion method. A large amount of polyvinyl alcohol aqueous solution (1 to 20%) is poured into such an organic phase (25 mL) and stirring is continued. Then, here, the organic phase containing the physiologically active substance and the biodegradable polymer is dispersed into the microdroplets by vigorous stirring. In such an O / W emulsion, since the volatile organic solvent in which the biodegradable polymer was dissolved evaporates and the solubility is lowered, the biodegradable polymer is precipitated while containing the bioactive substance, and the fine particles Form.

ポリビニルアルコールは微粒子の表面を負に帯電させて、形成した微粒子が凝集することを防ぐ役割を持っている。濃度は１〜１０％程度が多く用いられる。しかしながら、ポリビニルアルコールは薬理学的に許容される物質であるが、生分解性にやや乏しいビニルポリマー型の高分子であるため、ワクチンを考える場合はなるべく低濃度であることが望ましい。   Polyvinyl alcohol has a role of negatively charging the surface of the fine particles and preventing the formed fine particles from aggregating. A concentration of about 1 to 10% is often used. However, although polyvinyl alcohol is a pharmacologically acceptable substance, it is a vinyl polymer type polymer slightly poor in biodegradability, and therefore it is desirable that the concentration be as low as possible when considering vaccines.

（５）微粒子を用いたマラリアワクチン開発の現況：
世界で初めてマラリアワクチンのフィールドトライアルを行ったのはコロンビアのManuel E. Patarryoらである（非特許文献９、１０）。これはSPf66抗原と呼ばれ、４５残基のアミノ酸配列からなる化学合成ペプチドを抗原として用いている。 (5) Current status of malaria vaccine development using microparticles:
The world's first field trial of a malaria vaccine was performed by Manuel E. Patarryo et al. In Colombia (Non-Patent Documents 9 and 10). This is called SPf66 antigen, and a chemically synthesized peptide consisting of a 45-residue amino acid sequence is used as the antigen.

SPf66に用いられているアミノ酸配列はメロゾイトやスポロゾイトと呼ばれる赤血球や肝臓へ寄生する段階の原虫が用いているタンパク質の部分アミノ酸配列に由来している。SPf66を含めて、一般にワクチン開発に用いられている標的抗原は、マラリア原虫が、(a)赤血球への侵入するためのタンパク質、(b)原虫や感染赤血球の表面に提示するタンパク質が多く用いられている。このように従来技術では、ワクチン開発は原虫表面や原虫の寄生時の構造形成に関与する構造タンパク質を用いる例が多い。   The amino acid sequence used in SPf66 is derived from a partial amino acid sequence of a protein used by protozoa at the stage of parasitizing erythrocytes and liver called merozoites and sporozoites. Target antigens generally used for vaccine development, including SPf66, are often used by malaria parasites (a) proteins that enter red blood cells and (b) proteins that are displayed on the surface of protozoa and infected red blood cells. ing. Thus, in the prior art, vaccine development often uses structural proteins that are involved in the formation of protozoan surfaces and protozoan parasite structure formation.

SPf66抗原ははじめ、南アメリカ、タンザニアでのフィールドトライアルにおいて感染防御に成功した（非特許文献１１）。しかしながら、その後のガンビアやタンザニアで行われた他のフィールドトライアルでは、防御効果が見られなかった（非特許文献１２）。これは上記のように、マラリアの臨床症状が感染者の免疫状態によって大きく異なるため、ワクチン効果の判定が難しいことに原因している。   SPf66 antigen was successfully protected against infection in field trials in South America and Tanzania (Non-patent Document 11). However, other field trials conducted in Gambia and Tanzania did not show a protective effect (Non-Patent Document 12). This is because, as described above, the clinical symptoms of malaria vary greatly depending on the immune status of the infected person, and thus it is difficult to determine the vaccine effect.

一方Patarroyoらを含む関連研究グループでは、このワクチン効果の差違を、ワクチン接種時に用いるアラムと呼ばれる水酸化アルミニウムの水性懸濁液を、免疫反応を増強するアジュバントとして用いたことに原因があると考えている。   On the other hand, related research groups including Patarroyo et al. Believe that this difference in vaccine efficacy is caused by the use of an aqueous suspension of aluminum hydroxide called alum used at the time of vaccination as an adjuvant to enhance the immune response. ing.

そこでPatarroyoとPedrazらのグループはアラムに代わるアジュバントとして高分子微粒子に着目し、SPf66抗原を蒸留水に溶解させた水溶液を内水相とした、ダブルエマルジョン法によって、マイクロ微粒子の作製と免疫学的性質の研究を行っている（非特許文献１３）。ここで報告されている微粒子の高分子基剤にはポリ乳酸-グリコール酸共重合体（共重合比50:50または75:25、重量平均分子量９〜１０万）を用い、直径およそ0.1〜2.0μｍと分布の広い微粒子（平均1.3〜1.4μｍ）が得られている（非特許文献１４）。また、外水相の8％ポリビニルアルコール水溶液を12％水溶液にすることで平均直径が0.5μｍに縮小した微粒子が報告されている（非特許文献１５）。   Therefore, Patarroyo and Pedraz et al. Focused on polymer microparticles as an alternative to alum, and produced microparticles and immunologically by the double emulsion method using an aqueous solution in which SPf66 antigen was dissolved in distilled water. We are studying properties (Non-Patent Document 13). The polymer base of the fine particles reported here is a polylactic acid-glycolic acid copolymer (copolymerization ratio 50:50 or 75:25, weight average molecular weight 90,000 to 100,000), and has a diameter of about 0.1 to 2.0. Fine particles having a wide distribution of μm (average 1.3 to 1.4 μm) are obtained (Non-patent Document 14). In addition, fine particles having an average diameter reduced to 0.5 μm by making an 8% polyvinyl alcohol aqueous solution of the outer water phase into a 12% aqueous solution have been reported (Non-patent Document 15).

しかしながら、PatarroyoとPedrazらの方法によるワクチン抗原の高分子微粒子を用いたワクチン開発は、(a)構造タンパク質を抗原としている、(b)被験者の免疫状態の差違を考慮していない、(c)蒸留水に抗原を溶解させる必要がある、(d)高濃度のポリビニルアル
コール水溶液を用いている、(e)微粒子の大きさがマイクロメートルサイズのみである、(f)大きさにばらつきが大きい、ことで限界がある。 However, vaccine development using polymer microparticles of vaccine antigens by the method of Patarroyo and Pedraz et al. (A) has structural proteins as antigens, (b) does not consider differences in the immune status of subjects, (c) It is necessary to dissolve the antigen in distilled water, (d) using a high-concentration polyvinyl alcohol aqueous solution, (e) the microparticle size is only a micrometer size, (f) large variation in size, There is a limit in that.

（６）エマルジョン法による高分子ナノ・マイクロ微粒子形成の現況：
エマルジョン法を用いたナノメートルサイズの高分子微粒子の作製法としては、アクリル酸ポリマーを用いた方法（非特許文献１６）とポリ乳酸-グリコール酸共重合体を用いた方法（特許文献１）の２つが知られている。薬物を微粒子に内包させる際に、薬物と高分子の溶解する含水アセトンを用いる点に特徴がある。しかしこの方法では用いることの可能な薬物と高分子に限界がある。 (6) Current status of polymer nano / micro particle formation by emulsion method:
As a method for producing nanometer-sized polymer fine particles using the emulsion method, there are a method using an acrylic acid polymer (Non-patent Document 16) and a method using a polylactic acid-glycolic acid copolymer (Patent Document 1). Two are known. When the drug is encapsulated in fine particles, water-containing acetone in which the drug and polymer are dissolved is used. However, this method has limitations on the drugs and polymers that can be used.

（７）エノラーゼを用いたマラリアワクチン開発の現況：
マラリアの疫学調査資料を精査してゆくと不思議なことにマラリアによる死亡者の多くは「流行地の乳幼児」と「日本人など非流行地からの渡航者」であることに気がつく。一方「流行地の大人」はマラリアに感染しても回復しやすい。これは、流行地の住民は「絶えずマラリアに感染することでマラリアへの免疫を獲得、維持している」ためと考えられる。従ってワクチン開発には、免疫状態の個人差を考慮しなくてはいけないことが明らかである。 (7) Current status of malaria vaccine development using enolase:
Strangely examining the malaria epidemiological survey materials, it is strange that many of the deaths caused by malaria are “infants in endemic areas” and “travelers from non-endemic areas such as Japanese”. On the other hand, “endemic adults” can easily recover from infection with malaria. This is thought to be due to the fact that residents in endemic areas have “obtained and maintained immunity to malaria by constantly infecting malaria”. It is therefore clear that vaccine development must take into account individual differences in immune status.

この疫学研究の過程で、本発明者の鈴木と狩野は、南米と東南アジアの流行地の野外調査から、急性期の熱帯熱マラリア患者が病態の回復に関与する共通の抗原分子として、原虫由来の解糖系酵素・エノラーゼを発見した (非特許文献１７)。すなわち、ヒトに感染した熱帯熱マラリア原虫が産生する解糖系酵素、エノラーゼが熱帯熱マラリアへの防御免疫分子として働いていることを見出し、これを利用したワクチン開発を開始した。   In the course of this epidemiological study, the inventors of the present invention, Suzuki and Kano, found that protozoan-derived antigens are common antigen molecules that are involved in the recovery of pathological conditions in patients with acute P. falciparum from field studies in endemic areas in South America and Southeast Asia. A glycolytic enzyme / enolase was discovered (Non-patent Document 17). That is, we found that a glycolytic enzyme, enolase, produced by Plasmodium falciparum infecting humans acts as a protective immunity molecule against P. falciparum, and started vaccine development using this.

エノラーゼによるワクチン抗原は、原虫のエネルギー産生系を直接阻害して、原虫の増殖を抑制する点で、他に全く例がなく、大きく差別化されている。   The vaccine antigen by enolase is greatly different from the other in that it directly inhibits the energy production system of protozoa and suppresses the growth of protozoa.

先ず、発明者らは熱帯熱マラリア原虫由来のアミノ酸配列を有する組み換え型エノラーゼおよび部分アミノ酸配列を用いた人工抗原ペプチドの分子設計と化学合成の研究を行った。これらのエノラーゼおよび人工抗原ペプチドを用いた免疫学的な研究により、抗エノラーゼ抗体や抗ペプチド抗体は熱帯熱マラリア原虫のin vitroでの増殖を抑制することが明らかとなった（特許文献２）。   First, the inventors studied the molecular design and chemical synthesis of artificial antigenic peptides using recombinant enolase having an amino acid sequence derived from Plasmodium falciparum and a partial amino acid sequence. Immunological studies using these enolases and artificial antigenic peptides have revealed that anti-enolase antibodies and anti-peptide antibodies inhibit the growth of P. falciparum in vitro (Patent Document 2).

続いて熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼおよび部分配列による人工抗原ペプチドを用いて、ヨザル13頭によるワクチン試験を行った（図２）。ヨザル末梢血における、赤血球へのマラリア原虫の寄生率の推移をプロットした。その結果、ワクチンを投与したヨザルは寄生率の急激な上昇が抑えられており、ワクチンとしての効果に優れていることが明らかとなった（日本経済新聞、産経新聞、河北新報、中国新聞、４紙への掲載記事2003/8/25付）。また、血清中には抗エノラーゼ抗体や抗ペプチド抗体の産生していることも明らかとなった。   Subsequently, a vaccine test was conducted using 13 monkeys using an enolase derived from Plasmodium falciparum and an artificial antigen peptide consisting of a partial sequence (FIG. 2). The transition of the parasitism rate of the malaria parasite to the red blood cells in the peripheral blood of the monkey was plotted. As a result, it has been clarified that yolk monkeys administered with the vaccine have suppressed the rapid increase in the parasitism rate and are excellent as vaccines (Nihon Keizai Shimbun, Sankei Shimbun, Hebei Shinpo, Chugoku Shimbun, 4 (Posted on paper 2003/8/25). It was also revealed that anti-enolase antibody and anti-peptide antibody were produced in the serum.

化学合成の観点から、ワクチン分子の合成法についても研究を進め、大量合成法に適したフラグメント縮合法の開発に成功した（特許文献３）。即ち、５つの短鎖ペプチドセグメントを縮合し１本の保護ペプチド鎖とすることにより、目的とするマラリア原虫エノラーゼの部分配列を持つペプチドまたはその類似体の合成を大規模に行う方法を見出した。   From the viewpoint of chemical synthesis, research on vaccine molecule synthesis was also conducted and a fragment condensation method suitable for mass synthesis was successfully developed (Patent Document 3). That is, the present inventors have found a method for synthesizing a peptide having a partial sequence of the target malaria parasite enolase or an analog thereof on a large scale by condensing five short-chain peptide segments into one protected peptide chain.

合成法の開発によって、実験室レベルの小スケールで行っても、約50〜500ミリグラム（ワクチンとして約１千〜１万人分）を一度に得ることができるようになった。実験室規模の合成をわずか２〜４回行うだけで、工業的に世界最大級の遺伝子組換体の生産設備で行うのと同じ規模のペプチドを得ることが可能である。さらに工業スケールで生産が実施
されれば、年間の世界的需要に匹敵する数百万人分のペプチド供給が十分期待されている。 The development of the synthesis method has made it possible to obtain about 50 to 500 milligrams (about 1,000 to 10,000 people as a vaccine) at a time, even on a small scale at the laboratory level. It is possible to obtain peptides of the same scale as industrially produced in the world's largest production facility of genetic recombinants by performing laboratory-scale synthesis only 2 to 4 times. Furthermore, if production is carried out on an industrial scale, the supply of peptides for millions of people is expected, which is comparable to the annual global demand.

一般にタンパク質の部分アミノ酸配列を利用した化学合成ペプチドや遺伝子組み換え型ペプチドは人工抗原を始めとして医薬品や検査材料として様々な利用法が考えられる。これらの部分ペプチドを利用する際の問題点は、有機溶媒や水系溶媒に難溶な化合物の多いことにある。特に蒸留水や揮発性有機溶媒溶液（酢酸エチルやジエチルエーテルやジクロロメタンなど）へのペプチドやタンパク質の溶解性は非常に低い場合が多い。   In general, a chemically synthesized peptide or a recombinant peptide using a partial amino acid sequence of a protein can be used in various ways as a pharmaceutical or a test material including an artificial antigen. A problem in using these partial peptides is that there are many compounds that are hardly soluble in organic solvents and aqueous solvents. In particular, the solubility of peptides and proteins in distilled water and volatile organic solvent solutions (such as ethyl acetate, diethyl ether, and dichloromethane) is often very low.

発明者らのエノラーゼ部分配列に於いても同様に、蒸留水や揮発性有機溶媒溶液（酢酸エチルやジエチルエーテルやジクロロメタンなど）への溶解性は低い。よって既知の方法では、化学合成や遺伝子組み換えによってエノラーゼ部分配列の人工抗原が得られても、ダブルエマルジョン法やシングルエマルジョン法によって高分子微粒子に内包させることは困難があった。   Similarly, the inventor's enolase partial sequence has low solubility in distilled water and volatile organic solvent solutions (such as ethyl acetate, diethyl ether, and dichloromethane). Therefore, in the known method, even if an artificial antigen having an enolase partial sequence is obtained by chemical synthesis or genetic recombination, it is difficult to encapsulate the polymer fine particles by the double emulsion method or the single emulsion method.

特開平5-58882号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-58882 特開2002-371098号公報Japanese Patent Laid-Open No. 2002-371098 WO2006/035815WO2006 / 035815

Kano, S. and Kimura, M., Acta Tropica, 2004, 89, 271-278.Kano, S. and Kimura, M., Acta Tropica, 2004, 89, 271-278. Foote, S. J.; Thompson, J. K.; Cowman, A. F.; Kemp, D. J.; Cell, 1989, 57, 921-930.Foote, S. J .; Thompson, J. K .; Cowman, A. F .; Kemp, D. J .; Cell, 1989, 57, 921-930. Su, X.; Kirkman, L. A.; Fujioka, H.; Wellems, T. E., Cell, 1997, 91, 593-603.Su, X .; Kirkman, L. A .; Fujioka, H .; Wellems, T. E., Cell, 1997, 91, 593-603. Johnson, D. J.; Fidock, D. A.; Mungthin, M.; Lakshmanan, V.; Sidhu, A. B. S.; Bray, P. G.; Ward, S. A., Molecular Cell, 2004, 15, 867-877.Johnson, D. J .; Fidock, D. A .; Mungthin, M .; Lakshmanan, V .; Sidhu, A. B. S .; Bray, P. G .; Ward, S. A., Molecular Cell, 2004, 15, 867-877. 奥浩之, 化学, 2002, 57, 64-65.Oku Hiroyuki, Chemistry, 2002, 57, 64-65. J. L. Vennerstromら、Nature, vol. 430, pp. 900-904.J. L. Vennerstrom et al., Nature, vol. 430, pp. 900-904. Moorthy, V. S.; Good, M.F.; Hill, A. V., Lancet, 2004, vol. 363, pp.150-156.Moorthy, V. S .; Good, M.F .; Hill, A. V., Lancet, 2004, vol. 363, pp. 150-156. Rosasら、Vaccine 2001年、19巻、4445-4451ページRosas et al., Vaccine 2001, 19, 4445-4451 Patarroyoら、Nature 1987年、328巻、629-632ページPatarroyo et al., Nature 1987, 328, 629-632 Valeroら、Lancet 1993年、341巻、705-710ページValero et al., Lancet 1993, 341, 705-710 Noyaら、Journal of Infectious Disease 1994年、170巻、396-402ページNoya et al., Journal of Infectious Disease 1994, 170, 396-402 D'Alessandroら、Lancet 1995年、346巻、462-467ページD'Alessandro et al., Lancet 1995, 346, 462-467 Rosasら、Vaccine 2002年、20巻、1707-1710ページRosas et al., Vaccine 2002, 20, 1707-1710 Carcabosoら、International Journal of Pharmaceutics 2003年、260巻、273-282ページCarcaboso et al., International Journal of Pharmaceutics 2003, 260, 273-282 Carcabosoら、Vaccine 2004年、22巻、1423-1432ページCarcaboso et al., Vaccine 2004, Vol. 22, pages 1423-1432 J. Pharm. Sci. 1989年、78巻、68-72ページJ. Pharm. Sci. 1989, 78, 68-72 Jpn. J. Trop. Med. Hyg. 18, pp. 317-24, pp. 475-481 (1990)Jpn. J. Trop. Med. Hyg. 18, pp. 317-24, pp. 475-481 (1990)

本発明の課題は、タンパク質やペプチドなどの生理活性物質を含む新規な微粒子およびその製造方法を提供することにある。
本発明はまた、ヒトおよび他の動物での免疫反応を利用したマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発することができるペプチドまたはその類似体を含んだ微粒子、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の増殖を抑える免疫用抗原やマラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物を提供することを課題とする。 The subject of this invention is providing the novel microparticles | fine-particles containing physiologically active substances, such as protein and a peptide, and its manufacturing method.
The present invention also provides for the growth of Plasmodium falciparum, a microparticle comprising a peptide or analog thereof capable of inducing an immunological response against Plasmodium utilizing the immune response in humans and other animals. It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing immunizing antigen and malaria parasite infection.

本発明者らは、難溶性の場合が多い人工抗原ペプチドを溶解することの可能な揮発性有機酸水溶液や揮発性有機酸溶液を用いることで、初めてダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法による溶解性の低い抗原ペプチドを内包させたマイクロ微粒子の作製に成功した。ダブルエマルジョン法における微粒子の作製では内水相W₁に用いる揮発性有機酸の選択、有機酸濃度と有機酸水溶液の容量、シングルエマルジョン法における微粒子の作製には有機酸溶液の容量等を検討した。また、生成中のエマルジョンの低温での温度管理、エマルジョン中の有機溶媒除去の方法等を検討した。このようにして難溶性の人工抗原ペプチドを含有する微粒子を得る方法を見出し、本発明を完成したものである。 The inventors of the present invention are the first to use the double emulsion method or the single emulsion method for the solubility by using a volatile organic acid aqueous solution or a volatile organic acid solution that can dissolve artificial antigen peptides, which are often poorly soluble. We succeeded in producing microparticles encapsulating a low antigenic peptide. Selection of the production of fine particles in the double emulsion method the volatile organic acid used in the internal aqueous phase W _1, organic acid concentration and volume of the organic acid aqueous solution, the production of fine particles in the single emulsion method was investigated the capacity of the organic acid solution . In addition, the temperature control of the emulsion being produced at low temperature, the method of removing the organic solvent in the emulsion, etc. were studied. Thus, the present invention has been completed by finding a method for obtaining fine particles containing a hardly soluble artificial antigenic peptide.

本発明は以下のとおりである。
（１）生理活性物質と生分解性高分子を含む微粒子であって、該生理活性物質を含む揮発性有機酸水溶液または生理活性物質の揮発性有機酸溶液を用いたダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法によって作製された微粒子。
（２）前記揮発性有機酸が酢酸または酢酸を含む混合物である、（１）に記載の微粒子。（３）前記揮発性有機酸がギ酸またはギ酸を含む混合物である、（１）に記載の微粒子。（４）前記生分解性高分子がポリ乳酸−グリコール酸共重合体である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の微粒子。
（５）前記生分解性高分子がポリ乳酸である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の微粒子。
（６）前記生分解性高分子がポリデプシペプチドである、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の微粒子。
（７）前記生理活性物質がタンパク質またはペプチドである、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の微粒子。
（８）前記タンパク質またはペプチドが熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはペプチドである、（７）に記載の微粒子。
（９）前記熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはペプチドが熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼまたはその部分ペプチドである、（８）に記載の微粒子。
（１０）前記部分ペプチドが配列番号１と配列番号２との構造的差違部分を含み、熱帯熱マラリア原虫に対する細胞性または体液性の免疫学的応答を誘発しうるペプチドである、（９）に記載の微粒子。
（１１）前記部分ペプチドが、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、（１０）に記載の微粒子。
（１２）（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の微粒子と、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
（１３）（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の微粒子と、医薬的に許容可能な担体を含む、マラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物。
（１４）（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の微粒子を有効成分として含有する、マラリア原虫の増殖を抑えるための免疫用抗原。
（１５）生理活性物質を含む有機酸水溶液または生理活性物質の有機酸溶液を、生分解性高分子を含む揮発性有機溶媒と混合してエマルジョンを作製する工程、及び得られたエマルジョンを負電荷を有するポリマーの水溶液と混合する工程を含む、生理活性物質含有微粒子の製造方法。 The present invention is as follows.
(1) Double emulsion method or single emulsion method using a volatile organic acid aqueous solution containing a physiologically active substance or a volatile organic acid solution of the physiologically active substance, which is a fine particle containing a physiologically active substance and a biodegradable polymer Fine particles made by
(2) The fine particles according to (1), wherein the volatile organic acid is acetic acid or a mixture containing acetic acid. (3) The fine particles according to (1), wherein the volatile organic acid is formic acid or a mixture containing formic acid. (4) The fine particles according to any one of (1) to (3), wherein the biodegradable polymer is a polylactic acid-glycolic acid copolymer.
(5) The fine particles according to any one of (1) to (3), wherein the biodegradable polymer is polylactic acid.
(6) The fine particles according to any one of (1) to (3), wherein the biodegradable polymer is a polydepsipeptide.
(7) The fine particles according to any one of (1) to (6), wherein the physiologically active substance is a protein or a peptide.
(8) The microparticle according to (7), wherein the protein or peptide is a protein or peptide derived from Plasmodium falciparum.
(9) The microparticle according to (8), wherein the P. falciparum protein or peptide is P. falciparum-derived enolase or a partial peptide thereof.
(10) The peptide according to (9), wherein the partial peptide contains a structural difference between SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and can induce a cellular or humoral immunological response against Plasmodium falciparum. The fine particles described.
(11) The fine particles according to (10), wherein the partial peptide is a peptide consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 6.
(12) A pharmaceutical composition comprising the microparticles according to any one of (1) to (11) and a pharmaceutically acceptable carrier.
(13) A pharmaceutical composition for preventing malaria parasite infection, comprising the microparticle according to any one of (8) to (11) and a pharmaceutically acceptable carrier.
(14) An antigen for immunization containing the fine particles according to any one of (8) to (11) as an active ingredient for suppressing the growth of malaria parasites.
(15) A step of preparing an emulsion by mixing an organic acid aqueous solution containing a bioactive substance or an organic acid solution of a bioactive substance with a volatile organic solvent containing a biodegradable polymer, and the resulting emulsion is negatively charged. A method for producing bioactive substance-containing microparticles, which comprises a step of mixing with an aqueous solution of a polymer having a salt.

本発明で述べている「揮発性有機酸」とは、カルボン酸基を有する有機化合物、または
そのアンモニウム塩もしくはエステル誘導体であって、減圧下に除去できる有機酸のことをいう。
揮発性有機酸としては常温で液体のカルボン酸基を有する有機化合物から選択することができる。酢酸やギ酸が例示され、その他にも、カルボン酸以外の官能基として水酸基を有する乳酸、カルボン酸基を複数有するフマル酸、マロン酸、リンゴ酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ここで、揮発性有機酸の利用方法として、抗原となるペプチドや蛋白質を溶解させる効果、作成した微粒子を凍結乾燥する際に容易に除去できることが考えられるが、これらに限定されるものではない。 The “volatile organic acid” described in the present invention refers to an organic compound having a carboxylic acid group, or an ammonium salt or ester derivative thereof, which can be removed under reduced pressure.
The volatile organic acid can be selected from organic compounds having a carboxylic acid group that is liquid at room temperature. Examples include acetic acid and formic acid, and other examples include lactic acid having a hydroxyl group as a functional group other than carboxylic acid, fumaric acid having a plurality of carboxylic acid groups, malonic acid, malic acid, and the like. Absent.
Here, as a method of using the volatile organic acid, it is considered that the peptide or protein serving as an antigen can be dissolved, and that the prepared fine particles can be easily removed when freeze-dried, but is not limited thereto.

本発明で述べている「タンパク質やペプチドの誘導体」とは、それらを構成するアミノ酸が１〜数個置換、欠失および/また挿入することにより生成されるタンパク質やペプチドであって、免疫学的応答に関して元のタンパク質やペプチドと同様の活性を有するペプチドのことをいう。
例えば、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドは、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸が置換、欠失および/また挿入されたものであってもよい。
ここで、誘導体の利用方法として、微粒子作製に於ける溶解性・結晶性、免疫反応に使用する際の溶解性、免疫学的応答をより効果的にすることが考えられるが、これらに限定されるものではない。 “Derivatives of proteins and peptides” described in the present invention are proteins and peptides produced by substitution, deletion and / or insertion of one to several amino acids constituting them, and are immunological A peptide having the same activity as the original protein or peptide with respect to the response.
For example, in the peptide consisting of any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 6, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 amino acids are substituted, deleted, and / or inserted. It may be a thing.
Here, as a method of using the derivative, it is conceivable to make the solubility and crystallinity in fine particle preparation, the solubility in use in an immune reaction, and the immunological response more effective, but it is not limited to these. It is not something.

本発明において「免疫学的応答」とは細胞性免疫学的応答と体液性免疫学的応答の両方を含む概念である。このうち、細胞性免疫学的応答とは、例えばマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）、好酸球、T細胞などにより引き起こされる免疫のことをいい、熱帯熱マラリア原虫に対する細胞性免疫学的応答としては、キラーT細胞が関与するものが知られている。また、体液性免疫学的応答としては、熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質、糖鎖などに対して特異的に結合することができる宿主由来の抗体により引き起こされるものが知られている。本発明により製造される抗原ペプチドを含む微粒子から体液性免疫学的応答として抗体を誘導させることが望ましい。また、細胞性免疫学的応答を誘導することも望ましい。   In the present invention, “immunological response” is a concept including both a cellular immunological response and a humoral immunological response. Among these, cellular immunological response refers to immunity caused by macrophages, natural killer cells (NK cells), eosinophils, T cells, etc., and is a cellular immunological response to Plasmodium falciparum. As such, those involving killer T cells are known. Further, humoral immunological responses are known that are caused by host-derived antibodies that can specifically bind to P. falciparum-derived proteins, sugar chains, and the like. It is desirable to induce antibodies as a humoral immunological response from microparticles containing an antigenic peptide produced according to the present invention. It is also desirable to induce a cellular immunological response.

本発明によれば、難溶性の生理活性物質を用いたときも効率よく微粒子を作製することができる。
生理活性物質をマラリア原虫エノラーゼの部分配列および類似配列体とすることで、ヒトおよび他の動物での免疫反応を利用したマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発することのできる、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の増殖を抑える免疫用抗原やマラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物、さらにはマラリア感染への免疫状態の診断材料として使用することができる。 According to the present invention, fine particles can be efficiently produced even when a hardly soluble physiologically active substance is used.
Plasmodium falciparum (P. falciparum) that can induce an immunological response against Plasmodium using the immune response in humans and other animals by making the physiologically active substance a partial sequence and an analogous sequence of Plasmodium enolase It can be used as an antigen for immunity that suppresses the growth of Plasmodium falciparum), a pharmaceutical composition for the prevention of Plasmodium falciparum infection, and a diagnostic material for an immune state against malaria infection.

ヒト体内に於けるマラリア原虫の生活環を示す図。(a) 蚊の吸血による感染と寄生原虫の肝臓内への移行。肝細胞内で***・増殖してから血中に放出される。(b) 赤血球内に寄生原虫が侵入して***増殖を繰り返す赤血球内サイクル。(c) 増殖した原虫は他の蚊による吸血で伝搬されてゆく。The figure which shows the life cycle of the malaria parasite in a human body. (a) Infection by mosquito blood sucking and transfer of parasitic protozoa into the liver. It is released into the blood after dividing and proliferating in hepatocytes. (b) Intra-erythrocyte cycle in which protozoan parasites enter erythrocytes and repeat division and growth. (c) Proliferated protozoa are transmitted by blood sucking by other mosquitoes. 熱帯熱マラリア原虫由来エノラーゼの発見、部分アミノ酸配列（AD22, 配列番号6）を有する人工抗原ペプチドの分子設計、ヨザルを用いたワクチンの動物実験、について模式的に示した図。The figure which showed typically about the discovery of the Enolase derived from a Plasmodium falciparum, the molecular design of the artificial antigen peptide which has a partial amino acid sequence (AD22, sequence number 6), and the animal experiment of the vaccine using a monkey. 実施例で用いた人工抗原ペプチドの分子構造を示す図。AD22は配列番号2に記載のアミノ酸配列である。The figure which shows the molecular structure of the artificial antigen peptide used in the Example. AD22 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. ダブルエマルジョン法による人工抗原微粒子の作製法を示す図。図中、MAPsは人工抗原ペプチドを、PLGAはポリ乳酸グリコール酸共重合体を、DCMはジクロロメタンを、PVAはポリビニルアルコールを示す。なお、シングルエマルジョン法では水相W₁の代わりに有機酸溶液を用いるため、人工抗原ペプチドは生分解性高分子溶液Oと均一に溶解している。The figure which shows the preparation methods of the artificial antigen fine particle by the double emulsion method. In the figure, MAPs represents an artificial antigen peptide, PLGA represents a polylactic acid glycolic acid copolymer, DCM represents dichloromethane, and PVA represents polyvinyl alcohol. In the single emulsion method, since an organic acid solution is used instead of the aqueous phase W ₁ , the artificial antigen peptide is uniformly dissolved in the biodegradable polymer solution O. 酢酸溶液を用いた、シングルエマルジョン法による人工抗原ペプチドを含む微粒子のSEM写真 (倍率3000倍、平均粒径 = 0.7 mm)。SEM photograph of microparticles containing artificial antigen peptide by single emulsion method using acetic acid solution (magnification 3000 times, average particle size = 0.7 mm). ギ酸溶液を用いた、シングルエマルジョン法による人工抗原ペプチドを含む微粒子のSEM写真 (倍率3000倍、平均粒径 = 0.8 mm)。SEM photograph of fine particles containing artificial antigenic peptide by formic acid solution using single emulsion method (magnification 3000 times, average particle size = 0.8 mm). ギ酸水溶液を用いた、ダブルエマルジョン法による人工抗原ペプチドを含む微粒子のSEM写真 (倍率3000倍、平均粒径 = 5 mm)。エマルジョンの形成時に内水相の液滴が残るため二重構造の微粒子（W/O/Wダブルエマルジョン）となっている。平均粒径が大きいため、皮下に於いて長期間の残存が期待される。SEM photograph of fine particles containing artificial antigenic peptide by double emulsion method using formic acid aqueous solution (magnification 3000 times, average particle size = 5 mm). Since the inner aqueous phase droplets remain during the formation of the emulsion, it has double-structured fine particles (W / O / W double emulsion). Since the average particle size is large, long-term survival is expected under the skin. ３７℃の0.2%SDS-リン酸緩衝生理食塩水40 mLの入った容器底に静置した微粒子1.0 mgからの蛍光標識人工抗原ペプチドの放出挙動（○）と、同様に静置した蛍光標識人工抗原ペプチド4.0μgが分散溶解する過程（×）を示す図。Release behavior of fluorescently labeled artificial antigenic peptide from 1.0 mg of fine particles placed on the bottom of a container containing 40 mL of 0.2% SDS-phosphate buffered saline at 37 ° C. The figure which shows the process (x) which antigen peptide 4.0microgram disperse-dissolves. 熱帯熱マラリア原虫エノラーゼ（P. falciparum enolase、GenBank登録番号AB026051）とヒト由来αエノラーゼ（Human alpha enolase 、GenBank登録番号M14328）のアミノ酸配列の比較を示す図。明細書中に示した部分アミノ酸配列４種（GG14、AA13、GL16、AD22）は下線で標記。The figure which shows the comparison of the amino acid sequences of P. falciparum enolase (P. falciparum enolase, GenBank accession number AB026051) and human alpha-enolase (Human alpha enolase, GenBank accession number M14328). The four partial amino acid sequences shown in the specification (GG14, AA13, GL16, AD22) are underlined. マウス皮下に投与された微粒子中の人工抗原ペプチドからの蛍光画像。実施例１と同様な方法で作製された微粒子中に封入された人工抗原ペプチドの分布を生体イメージング観察している。The fluorescence image from the artificial antigen peptide in the microparticles | fine-particles administered to the mouse | mouth subcutaneously. The distribution of the artificial antigen peptide encapsulated in the microparticles produced by the same method as in Example 1 is observed by in vivo imaging. マウス皮下に投与された微粒子による免疫実験と抗体価の推移１。実験区１は抗原量1.6μｇ／匹（0.4ｍｇ微粒子／匹）、実験区２は抗原量16μｇ／匹（4.0ｍｇ微粒子／匹）、実験区３は抗原量16μｇ／匹（抗原のみで微粒子なし）、実験区４は抗原量0.0μｇ／匹（抗原なしで4.0ｍｇ微粒子のみ／匹）となっている。Immunization experiment with microparticles administered subcutaneously in mice and transition of antibody titer1. Experimental group 1 has an antigen amount of 1.6 μg / animal (0.4 mg microparticles / animal), experimental group 2 has an antigen amount of 16 μg / animal (4.0 mg microparticles / animal), and experimental group 3 has an antigen amount of 16 μg / animal (antigen alone and no microparticles) ), Experimental group 4 has an antigen amount of 0.0 μg / animal (without antigen, 4.0 mg microparticles only / animal). マウス皮下に投与された微粒子による免疫実験と抗体価の推移２。ここでは図１１に記載の実験区２のマウス４匹について、２１週目に２匹（マウス３，５）は微粒子を再投与（抗原量16μｇ／匹、4.0ｍｇ微粒子／匹）、残り２匹（マウス１，４）は何も投与せずに抗体価を２７週まで観察した。1. Immunization experiment with microparticles administered subcutaneously in mice and transition of antibody titer Here, 4 mice in experimental group 2 described in FIG. 11 were re-administered with fine particles (antigen amount 16 μg / animal, 4.0 mg fine particle / animal) at 2 weeks (mouse 3 and 5), and the remaining 2 mice. (Mouse 1, 4) was observed for up to 27 weeks without administering anything.

以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の微粒子は、生理活性物質と生分解性高分子を含む微粒子であって、揮発性有機酸水溶液または揮発性有機酸溶液を用いたダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法によって作製された微粒子である。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The fine particles of the present invention are fine particles containing a physiologically active substance and a biodegradable polymer, and are produced by a double emulsion method or a single emulsion method using a volatile organic acid aqueous solution or a volatile organic acid solution. .

生理活性物質としては特に制限されないが、タンパク質またはペプチド、DNAやRNAなどの核酸、医薬化合物またはこれらの組合せが例示される。この中ではタンパク質またはペプチドが好ましい。タンパク質またはペプチドの種類は特に制限されないが、酵素、サイトカイン、抗体、異種タンパク質の免疫用フラグメントなどが例示される。   The physiologically active substance is not particularly limited, and examples thereof include proteins or peptides, nucleic acids such as DNA and RNA, pharmaceutical compounds, or combinations thereof. Of these, proteins or peptides are preferred. The type of protein or peptide is not particularly limited, and examples thereof include enzymes, cytokines, antibodies, and heterologous protein immunization fragments.

本発明の微粒子をマラリア感染への免疫状態の診断材料、熱帯熱マラリア原虫の増殖を抑える免疫用抗原やマラリア原虫感染症の予防のための医薬として使用する場合、生理活性物質を熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはその部分ペプチドとすることができる。
熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはその部分ペプチドとしては、熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼまたはその部分ペプチドが例示される。熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に例示する。
本発明の微粒子を熱帯熱マラリア原虫感染に対するワクチンとして使用する場合は、配列番号１と配列番号２（ヒト エノラーゼのアミノ酸配列）との構造的差違部分（図９）を含み、熱帯熱マラリア原虫に対する細胞性または体液性の免疫学的応答を誘発しうるペプチドを生理活性物質として微粒子に含有させることが好ましい。
配列番号１と配列番号２との構造的差違部分のペプチドとしては特に制限されるものではないが、以下の4種類のペプチドが例示される。
GG14：Gly Ser Lys Asn Glu Trp Gly Trp Ser Lys Ser Lys Leu Gly（配列番号3）
AA13：Ala Ala Pro Asn Lys Val Ser Leu Tyr Lys Tyr Leu Ala（配列番号4）
GL16：Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Asn Ala Asn Glu Ala Leu Asp Leu Leu（配列番号5）
AD22：Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp PheLys Thr Pro
Asn Asn Asp（配列番号6） When the microparticles of the present invention are used as a diagnostic material for an immune state against malaria infection, an immunizing antigen that suppresses the growth of Plasmodium falciparum and a medicament for the prevention of Plasmodium falciparum infection, the physiologically active substance is a Plasmodium falciparum It can be a derived protein or a partial peptide thereof.
Examples of the protein derived from Plasmodium falciparum or a partial peptide thereof include enolase derived from Plasmodium falciparum or a partial peptide thereof. The amino acid sequence of enolase derived from Plasmodium falciparum is exemplified in SEQ ID NO: 1.
When the microparticle of the present invention is used as a vaccine against Plasmodium falciparum infection, it contains a structural difference between SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence of human enolase) (FIG. 9), Peptides that can induce cellular or humoral immunological responses are preferably contained in the microparticles as physiologically active substances.
There are no particular restrictions on the structural differences between SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, but the following four types of peptides are exemplified.
GG14: Gly Ser Lys Asn Glu Trp Gly Trp Ser Lys Ser Lys Leu Gly (SEQ ID NO: 3)
AA13: Ala Ala Pro Asn Lys Val Ser Leu Tyr Lys Tyr Leu Ala (SEQ ID NO: 4)
GL16: Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Asn Ala Asn Glu Ala Leu Asp Leu Leu (SEQ ID NO: 5)
AD22: Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp PheLys Thr Pro
Asn Asn Asp (SEQ ID NO: 6)

一方、微粒子に生理活性物質として医薬化合物を含有させる場合、細胞壁合成阻害作用型抗生物質（ペニシリン系、セフェム・オキサセフェム系、ペネム・カルバペネム系、モノバクタム系、ペプチド系、ホスホマイシン系）、細胞膜阻害作用型抗生物質（ポリペプチド系、ポリエン系）、核酸合成阻害作用型抗生物質（キノロン系、リファンピシン系、インターフェロン系）、蛋白合成阻害作用型抗生物質（アミノグリコシド系、マクロライド・ケトリド系、テトラサイクリン系、クロラムフェニコール系、リンコマイシン系）、葉酸代謝経路阻害型抗生物質（トリメトプリム系）、βラクタマーゼ阻害薬、サルファ薬、抗感染症薬（抗細菌薬、抗結核薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、寄生虫用薬、原虫用薬）、アジュバント（水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、鉱物塩、フロイント非完全アジュバント、ISCOM類、PRR/TLRリガンド、サポニン類）および防腐剤などの医薬化合物が例示される。   On the other hand, when a fine particle contains a pharmaceutical compound as a physiologically active substance, an antibiotic that inhibits cell wall synthesis (penicillin, cephem / oxacephem, penem / carbapenem, monobactam, peptide, fosfomycin), cell membrane inhibitory action Type antibiotics (polypeptides, polyenes), nucleic acid synthesis inhibitory antibiotics (quinolone, rifampicin, interferon), protein synthesis inhibitory antibiotics (aminoglycoside, macrolide ketolide, tetracycline, Chloramphenicol, lincomycin), folate metabolic pathway inhibitor antibiotics (trimethoprim), β-lactamase inhibitors, sulfa drugs, anti-infectives (antibacterial, antitubercular, antifungal, antiviral) Medicine, parasite medicine, protozoan medicine), adjuvant (aluminum hydroxide) Um and aluminum salts such as aluminum phosphate, mineral salts, Freund's incomplete adjuvant, ISCOMs such, PRR / TLR ligands, pharmaceutical compounds such as saponins) and preservatives are exemplified.

次に、微粒子に含まれる生分解性高分子について説明する。
微粒子に含まれる生分解性高分子としては、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ乳酸、ポリデプシペプチドなどが挙げられる。 Next, the biodegradable polymer contained in the fine particles will be described.
Examples of the biodegradable polymer contained in the fine particles include polylactic acid-glycolic acid copolymer, polylactic acid, and polydepsipeptide.

ここで、ポリデプシペプチドとしては、次の（I）〜（V）が挙げられる。
（F₁−F₂）_n (I)
（F₁−F₂−F₃）_n (II)
（F₁−F₂−F₃−F₄）_n (III)
（F₁−F₂−F₃−F₄−F₅）_n (IV)
（F₁−F₂−F₃−F₄−F₅−F₆）_n (V) Here, examples of the polydepsipeptide include the following (I) to (V).
(F ₁ −F ₂ ) _n (I)
(F ₁ −F ₂ −F ₃ ) _n (II)
(F ₁ −F ₂ −F ₃ −F ₄ ) _n (III)
(F ₁ −F ₂ −F ₃ −F ₄ −F ₅ ) _n (IV)
(F ₁ −F ₂ −F ₃ −F ₄ −F ₅ −F ₆ ) _n (V)

式（I）〜(V)において、デプシペプチド構造部分を構成するF₁、F₂、F₃、F₄、F₅およびF₆はアミノ酸またはヒドロキシカルボン酸の残基を表し、式 (I)ではF₁およびF₂の少なくとも１つ、式 (II)ではF₁、F₂およびF₃の少なくとも１つ、式 (II)ではF₁、F₂およびF₃の少なくとも１つ、式 (III)ではF₁、F₂、F₃およびF₄の少なくとも１つ、式 (IV)ではF₁、F₂、F₃、F₄およびF₅の少なくとも１つ、式 (V)ではF₁、F₂、F₃、F₄、F₅およびF₆の少なくとも１つがヒドロキシカルボン酸残基である。なお、デプシペプチド構造部分を構成するアミノ酸は微粒子の用途や生理活性物質の種類に応じて適宜選択されるが、L体のアミノ酸であることが好ましい。
上記ヒドロキシカルボン酸はバリン酸（(S)-2-hydroxy-3-methylbutanoic acid）または乳酸またはグリコール酸が好ましい。 In formulas (I) to (V), F ₁ , F ₂ , F ₃ , F ₄ , F ₅ and F ₆ constituting the depsipeptide structure part represent amino acid or hydroxycarboxylic acid residues, and in formula (I) At least one of F ₁ and F _2, at least one of the formulas (II) in F _1, F ₂ and F _3, at least one of formula (II) in F _1, F ₂ and F _3, the formula (III) Is at least one of F ₁ , F ₂ , F ₃ and F ₄ , Formula (IV) is at least one of F ₁ , F ₂ , F ₃ , F ₄ and F ₅ , Formula (V) is F ₁ , F _At least one of ₂ , F ₃ , F ₄ , F ₅ and F ₆ is a hydroxycarboxylic acid residue. The amino acid constituting the depsipeptide structure portion is appropriately selected according to the use of the fine particles and the type of physiologically active substance, but is preferably an L-form amino acid.
The hydroxycarboxylic acid is preferably valic acid ((S) -2-hydroxy-3-methylbutanoic acid), lactic acid or glycolic acid.

式（I）〜(V)において、デプシペプチドの繰り返しを表すｎは２〜１００の整数が好ましく、５〜５０の整数がより好ましい。
そして、繰り返し単位であるF₁−F₂またはF₁−F₂−F₃またはF₁−F₂−F₃−F₄またはF₁−
F₂−F₃−F₄−F₅またはF₁−F₂−F₃−F₄−F₅−F₆は2種類以上の配列であってもよい。また、残基数の異なる繰り返し配列が任意の順序で並んだものでもよい。例えば５残基の配列と６残基の配列が任意の順序で並んだ下記のようなものが考えられる。
（F₁−F₂−F₃−F₄−F₅）_o−（F₁−F₂−F₃−F₄−F₅−F₆）_p −（F₁−F₂−F₃−F₄−F₅）_q−（F₁−F₂−F₃−F₄−F₅−F₆）_r
ｏは１〜１９の整数、ｐは１９〜１、ｑは１９〜０、ｒは１９〜０の整数を表す。 In the formulas (I) to (V), n representing the repeat of depsipeptide is preferably an integer of 2 to 100, more preferably an integer of 5 to 50.
The repeating unit F ₁ -F ₂ or F ₁ -F ₂ -F ₃ or F ₁ -F ₂ -F ₃ -F ₄ or F _1-
F ₂ -F ₃ -F ₄ -F ₅ or F ₁ -F ₂ -F ₃ -F ₄ -F ₅ -F ₆ may be two or more types of sequences. In addition, repeating sequences having different numbers of residues may be arranged in an arbitrary order. For example, the following can be considered in which a sequence of 5 residues and a sequence of 6 residues are arranged in an arbitrary order.
(F ₁ −F ₂ −F ₃ −F ₄ −F ₅ ) _o − (F ₁ −F ₂ −F ₃ −F ₄ −F ₅ −F ₆ ) _p − (F ₁ −F ₂ −F ₃ −F ₄ −F ₅ ) _q − (F ₁ −F ₂ −F ₃ −F ₄ −F ₅ −F ₆ ) _r
o represents an integer of 1 to 19, p represents 19 to 1, q represents 19 to 0, and r represents an integer of 19 to 0.

繰り返し単位であるデプシペプチドの配列は、以下のようなものが例示される。
式（IV）におけるF₁−F₂−F₃−F₄−F₅としては、-Xaa¹-Xaa²-Gly-Lac-Pro- または -Xaa¹-Xaa²-Gly-Hmb-Pro- が挙げられ、式（V）におけるF₁−F₂−F₃−F₄−F₅−F₆としては-Xaa¹-Xaa²-Gly-Hmb-Ala-Pro-が挙げられる（WO2006/43644）。
ここで、Xaa¹、Xaa²は任意のアミノ酸残基を示し、Hmbは式（VI）で示されるバリン酸残基を表し、Lacは式（VII）で示される乳酸残基を表す。
Examples of the sequence of the depsipeptide which is a repeating unit are as follows.
As F ₁ -F ₂ -F ₃ -F ₄ -F ₅ in the formula (IV), -Xaa ¹ -Xaa ² -Gly-Lac-Pro- or -Xaa ¹ -Xaa ² -Gly-Hmb-Pro- Examples of F ₁ -F ₂ -F ₃ -F ₄ -F ₅ -F ₆ in the formula (V) include -Xaa ¹ -Xaa ² -Gly-Hmb-Ala-Pro- (WO2006 / 43644) .
Here, Xaa ¹ and Xaa ² represent arbitrary amino acid residues, Hmb represents a valic acid residue represented by the formula (VI), and Lac represents a lactic acid residue represented by the formula (VII).

さらに好ましくは、式（IV）におけるF₁−F₂−F₃−F₄−F₅が-Ala-Ile-Gly-Lac-Pro-、-Gly-Ile-Gly-Hmb-Pro- または -Gly-Val-Gly-Hmb-Pro-であり、式（V）におけるF₁−F₂−F₃−F₄−F₅−F₆が -Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro-である。 More preferably, F ₁ -F ₂ -F ₃ -F ₄ -F ₅ in formula (IV) is -Ala-Ile-Gly-Lac-Pro-, -Gly-Ile-Gly-Hmb-Pro- or -Gly -Val-Gly-Hmb-Pro- and F ₁ -F ₂ -F ₃ -F ₄ -F ₅ -F ₆ in formula (V) is -Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro- .

デプシペプチドは、重合反応によるポリマーまたはオリゴマーの合成、またはセグメント縮合と呼ばれる一単位ずつの伸長反応による適当な鎖長を持つ化合物の合成、の二種類の方法を用いて得ることができる（WO2006/43644）。   Depsipeptides can be obtained using two methods: synthesis of a polymer or oligomer by a polymerization reaction, or synthesis of a compound having an appropriate chain length by a unit-by-unit extension reaction called segment condensation (WO2006 / 43644). ).

本発明の微粒子の粒径は特に制限されず、用途に応じて適宜調整されるが、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましい。   The particle size of the fine particles of the present invention is not particularly limited and is appropriately adjusted according to the application, but is preferably 100 nm to 50 μm.

本発明の微粒子は、ダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法によって得ることができる。
具体的には、生理活性物質を含む揮発性有機酸水溶液または生理活性物質の揮発性有機酸溶液を、生分解性高分子を含む揮発性有機溶媒と混合してエマルジョンを作製する工程、および得られたエマルジョンを負電荷を有するポリマーの水溶液と混合する工程によって得ることができる。 The fine particles of the present invention can be obtained by a double emulsion method or a single emulsion method.
Specifically, a step of preparing an emulsion by mixing a volatile organic acid solution containing a physiologically active substance or a volatile organic acid solution of a physiologically active substance with a volatile organic solvent containing a biodegradable polymer, and The obtained emulsion can be obtained by mixing with an aqueous solution of a negatively charged polymer.

揮発性有機溶媒としては、生分解性高分子を溶解することのできる、揮発性で水と混ざりにくい有機溶媒が用いられるが、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテルなどが好ましく用いられる。
負電荷を有するポリマーとしては、酸素原子を含むポリマーが挙げられ、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールが好ましく用いられる
。 As the volatile organic solvent, an organic solvent that can dissolve the biodegradable polymer and is volatile and hardly mixed with water is used, and dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether, and the like are preferably used.
Examples of the negatively charged polymer include a polymer containing an oxygen atom, and polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, and polyethylene glycol are preferably used.

ダブルエマルジョン法は、例えば、Rosasら、Vaccine 2001年、19巻、4445-4451ページに記載されたようにして行うことができる。具体的な製法の一例を以下に示す。
生理活性物質（25 mg）の酢酸水溶液（250μL）を生分解性高分子（ポリ乳酸-グリコール酸共重合体など、250 mg）の揮発性有機溶媒溶液（ジクロロメタンなど、5 mL）と撹拌乳化させる。ここでは生理活性物質を含む内水相が、はげしい攪拌によって微小滴に分散される。このようなW/Oエマルジョンに、大量の負電荷ポリマー（ポリビニルアルコールなど）の水溶液（8〜12％）を注入（25 mL）して撹拌をつづける。それにより、生分解性高分子を溶かしていた揮発性有機溶媒が蒸発して、溶解度が低下するために、生分解性高分子が内水相をとり囲むように析出して微粒子が形成される。 The double emulsion method can be performed, for example, as described in Rosas et al., Vaccine 2001, Vol. 19, pages 4445-4451. An example of a specific production method is shown below.
Stir emulsify bioactive substance (25 mg) in acetic acid solution (250 μL) with biodegradable polymer (polylactic acid-glycolic acid copolymer, 250 mg) volatile organic solvent solution (dichloromethane, 5 mL). . Here, the inner aqueous phase containing the physiologically active substance is dispersed into the microdroplets by vigorous stirring. A large amount of an aqueous solution (8-12%) of a negatively charged polymer (such as polyvinyl alcohol) is poured into such a W / O emulsion (25 mL) and stirring is continued. As a result, the volatile organic solvent in which the biodegradable polymer was dissolved evaporates and the solubility is lowered, so that the biodegradable polymer is deposited so as to surround the inner aqueous phase, thereby forming fine particles. .

シングルエマルジョン法による具体的な製法の一例を以下に示す。
まず、少量の生理活性物質（25 mg）を酢酸に溶解し、この酢酸溶液を生分解性高分子（ポリ乳酸-グリコール酸共重合体など、250 mg）の揮発性有機溶媒溶液（ジクロロメタン、5 mL）と撹拌溶解させる。生理活性物質が均一な揮発性有機溶媒溶液になる点がダブルエマルジョン法と異なる。このようにして得られる有機相に、大量の負電荷ポリマー（ポリビニルアルコールなど）の水溶液（1〜12％）を注入（25 mL）して撹拌をつづける。それにより、生理活性物質と生分解性高分子を含む有機相が、はげしい攪拌によって微小滴に分散される。このようなO/Wエマルジョンにおいて、生分解性高分子を溶かしていた揮発性有機溶媒が蒸発して溶解度が低下するために、生分解性高分子が生理活性物質を含んだまま析出して微粒子が形成される。 An example of a specific production method by the single emulsion method is shown below.
First, a small amount of physiologically active substance (25 mg) is dissolved in acetic acid, and this acetic acid solution is dissolved in a volatile organic solvent solution (dichloromethane, 5 mg of a biodegradable polymer (such as polylactic acid-glycolic acid copolymer). and dissolve with stirring. It differs from the double emulsion method in that the physiologically active substance becomes a uniform volatile organic solvent solution. A large amount of an aqueous solution (1 to 12%) of a negatively charged polymer (such as polyvinyl alcohol) is injected into the organic phase thus obtained (25 mL) and stirring is continued. Thereby, the organic phase containing the physiologically active substance and the biodegradable polymer is dispersed in the microdroplets by vigorous stirring. In such an O / W emulsion, since the volatile organic solvent in which the biodegradable polymer was dissolved evaporates and the solubility is lowered, the biodegradable polymer is precipitated while containing the bioactive substance, and the fine particles Is formed.

なお、本発明の微粒子はアルミニウムイオンを含むものであってもよい。アルミニウムイオンを含む塩類は酢酸やギ酸などの揮発性有機酸に溶けやすいため、生理活性物質とともにアルミニウムイオンを含む塩類を揮発性有機酸水溶液または揮発性有機酸溶液にしてダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法を行うことにより、生理活性物質とアルミニウムを含む微粒子を得ることができる。
アルミニウムイオンが含まれることにより、抗原ペプチドの抗原性がより促進される。これは例えば、Lindblad、Vaccine 2004年、22巻、3658-3668ページおよび引用文献を参考にして、最適なアルミニウム塩の選択や微粒子の設計をすることができる。 The fine particles of the present invention may contain aluminum ions. Since salts containing aluminum ions are easily soluble in volatile organic acids such as acetic acid and formic acid, double emulsion method or single emulsion method using salts containing aluminum ions together with physiologically active substances as volatile organic acid aqueous solution or volatile organic acid solution By performing the above, fine particles containing a physiologically active substance and aluminum can be obtained.
By containing aluminum ions, the antigenicity of the antigenic peptide is further promoted. For example, by referring to Lindblad, Vaccine 2004, Vol. 22, pages 3658-3668 and cited references, it is possible to select an optimal aluminum salt and design fine particles.

なお、本発明の微粒子はアルミニウムイオン以外のアジュバントを含むものであってもよい。アジュバントは酢酸やギ酸などの揮発性有機酸もしくは揮発性有機酸水溶液もしくは有機溶媒に溶けやすいため、生理活性物質とともにそれらのアジュバントを含む揮発性有機酸溶液もしくは揮発性有機酸水溶液もしくは有機溶液にしてダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法を行うことにより、生理活性物質とアジュバントを含む微粒子を得ることができる。
アジュバントが含まれることにより、抗原ペプチドの抗原性がより促進される。これは例えば、Guy、Nature Reviews Microbiology 2007年、5巻、505-517ページおよび引用文献を参考にして、最適なアジュバントの選択や微粒子の設計をすることができる。 The fine particles of the present invention may contain an adjuvant other than aluminum ions. Adjuvants are easily soluble in volatile organic acids such as acetic acid and formic acid or volatile organic acid aqueous solutions or organic solvents. Therefore, volatile organic acid solutions or volatile organic acid aqueous solutions or organic solutions containing these adjuvants together with physiologically active substances are used. By performing the double emulsion method or the single emulsion method, fine particles containing a physiologically active substance and an adjuvant can be obtained.
By including an adjuvant, the antigenicity of the antigen peptide is further promoted. For example, referring to Guy, Nature Reviews Microbiology 2007, Vol. 5, pp. 505-517 and cited references, it is possible to select an optimal adjuvant and design microparticles.

本発明の微粒子は、医薬的に許容可能な担体を配合することにより、医薬組成物とすることができる。本発明の微粒子を含むことで、生理活性物質の放出を制御できる徐放性の医薬組成物とすることができる。
ここで、医薬的に許容可能な担体としては、緩衝剤、凍結乾燥補助剤、安定化補助剤、可溶化補助剤、抗菌剤など製剤過程で許容される成分が挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、スルホサリチル酸塩、および酢酸塩などが挙げられる。
凍結乾燥補助剤としては、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、デキストラン、
フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、およびポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）などが挙げられる。
安定化補助剤としては、アスコルビン酸、システイン、モノチオグリセロール、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、ゲンチシン酸、イノシトールなどが挙げられる。
可溶化補助剤としては、エタノール、グリセリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノオレアート、ポリソルベート類、ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）およびレシチンなどが挙げられる。
抗菌剤としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、クロルブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなどが挙げられる。
医薬組成物の剤型は特に制限されず、注射剤、経口剤、塗布剤などが挙げられるが、注射剤が好ましい。注射剤は、微粒子を希釈剤などに溶解し、必要に応じて安定剤、保存剤、緩衝剤等を添加することによって製造することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などが挙げられる。
生理活性物質を熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはペプチドとすることで、マラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物を得ることができる。
本発明の医薬組成物のヒトへの投与量は、対象者の年齢、性別、体重、免疫状態、投与方法、あるいは該医薬組成物に含有される生理活性物質の割合などにより異なるが、１回の投与において１μg〜100 mgが好ましく、100μg〜10 mgがより好ましい。
投与回数は特に制限されず、一定期間をおいての複数回の投与はブースト効果による抗体価の上昇と維持が期待できる。一定期間とは２週間から６ヶ月が好ましく、３週間から３ヶ月がより好ましい。複数回とは２回から２０回が好ましく、２回から４回がより好ましい。 The microparticles of the present invention can be made into a pharmaceutical composition by blending a pharmaceutically acceptable carrier. By including the fine particles of the present invention, a sustained-release pharmaceutical composition capable of controlling the release of a physiologically active substance can be obtained.
Here, examples of the pharmaceutically acceptable carrier include components that are acceptable in the preparation process such as a buffer, a lyophilization aid, a stabilization aid, a solubilization aid, and an antibacterial agent.
Examples of the buffer include phosphate, citrate, sulfosalicylate, acetate, and the like.
Lyophilization aids include mannitol, lactose, sorbitol, dextran,
Examples include Ficoll and polyvinyl pyrrolidine (PVP).
Examples of stabilizing aids include ascorbic acid, cysteine, monothioglycerol, sodium bisulfite, sodium metabisulfite, gentisic acid, inositol and the like.
Examples of solubilizers include ethanol, glycerin, polyoxyethylene sorbitan monooleate, sorbitan monooleate, polysorbates, poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) poly (oxyethylene) block copolymers (Pluronics), and lecithin. Is mentioned.
Antibacterial agents include benzyl alcohol, benzalkonium chloride, chlorobutanol, methyl paraben, propyl paraben, butyl paraben and the like.
The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited and includes injections, oral preparations, coating agents and the like, and injections are preferred. An injection can be produced by dissolving fine particles in a diluent or the like and adding a stabilizer, a preservative, a buffering agent or the like as necessary. Examples of the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection and the like.
By using a physiologically active substance as a protein or peptide derived from Plasmodium falciparum, a pharmaceutical composition for preventing malaria parasite infection can be obtained.
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention to humans varies depending on the age, sex, body weight, immune status, administration method, ratio of physiologically active substance contained in the pharmaceutical composition, etc. Is preferably 1 μg to 100 mg, more preferably 100 μg to 10 mg.
The frequency of administration is not particularly limited, and multiple administrations over a certain period can be expected to increase and maintain the antibody titer due to the boost effect. The fixed period is preferably 2 weeks to 6 months, more preferably 3 weeks to 3 months. The number of times is preferably 2 to 20 times, more preferably 2 to 4 times.

また、生理活性物質として熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはペプチドを含有する本発明の微粒子は、マラリア原虫の増殖を抑える免疫用抗原（ワクチン）の有効成分として使用することもできる。上記のような医薬的に許容可能な担体やアジュバントと配合して使用することができる。   The fine particles of the present invention containing a protein or peptide derived from Plasmodium falciparum as a physiologically active substance can also be used as an active ingredient of an antigen for immunization (vaccine) that suppresses the growth of malaria parasites. It can be used in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or adjuvant as described above.

なお、本発明の微粒子は、高分子担体、フィルム、ラテックス粒子、金属超微粒子又はプラスチックプレートなどの固相表面に結合させることもできる。
例えば、生理活性物質として熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはペプチドを含有する本発明の微粒子を上記の固相表面に結合させることで、マラリア感染への免疫状態の診断材料や研究試薬とすることもできる。 The fine particles of the present invention can also be bound to a solid surface such as a polymer carrier, film, latex particle, ultrafine metal particle, or plastic plate.
For example, by linking the microparticles of the present invention containing a protein or peptide derived from Plasmodium falciparum as a physiologically active substance to the solid phase surface, it can be used as a diagnostic material or research reagent for an immune state against malaria infection. it can.

以下本発明の実施態様である、ダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法によって作製された微粒子について詳細を実施例１〜３に、内水相にアルカリ性のグリシン緩衝液（150 mM, pH 8.5）を用いた詳細を比較例１に、内水相に蒸留水を用いた詳細を比較例２に示した。さらに、微粒子からの人工抗原ペプチドの放出挙動についての詳細を実施例４に示す。さらに微粒子のin vivoでの挙動を実施例５に示す。しかし以下の具体例は本発明を限定するものではなく、例えば高分子について他の既知の生分解性高分子への置換や溶液量や濃度の調整など、適宜変更できることは勿論である。   Hereinafter, the fine particles produced by the double emulsion method or the single emulsion method, which is an embodiment of the present invention, are described in detail in Examples 1 to 3, and an alkaline glycine buffer (150 mM, pH 8.5) is used for the inner aqueous phase. Details are shown in Comparative Example 1, and details using distilled water for the inner aqueous phase are shown in Comparative Example 2. Further, details on the release behavior of the artificial antigen peptide from the microparticles are shown in Example 4. Further, the in vivo behavior of the fine particles is shown in Example 5. However, the following specific examples do not limit the present invention, and it is needless to say that the polymer can be appropriately changed, for example, by replacing the polymer with another known biodegradable polymer or adjusting the amount or concentration of the solution.

（実施例１）酢酸溶液を用いて作製された微粒子
微粒子はシングルエマルジョン法（O/W）によって作製した。人工抗原ペプチド（図３）は蒸留水に難溶であるが、酢酸には少量で溶解させることができた。シングルエマルジョン法では、図４のダブルエマルジョン法に示す水相W₁の代わりに有機酸溶液を用いるため、人工抗原ペプチドは生分解性高分子溶液Oと均一に溶解している。得られるO/Wエマル
ジョンを氷冷することでより均一な微粒子が形成された。これはエマルジョンの粘性が高くなったためと考えられる。また窒素ガスの吹きつけによって有機溶媒の除去を迅速に行った。その結果、平均粒径が0.6μmの比較的均一な人工抗原ペプチドを含有した微粒子作製に成功した。下記に実験操作の詳細と図５に走査電子顕微鏡写真を示す。 Example 1 Fine particles prepared using an acetic acid solution were prepared by a single emulsion method (O / W). The artificial antigen peptide (FIG. 3) is hardly soluble in distilled water, but could be dissolved in a small amount in acetic acid. In the single emulsion method, since an organic acid solution is used instead of the aqueous phase W ₁ shown in the double emulsion method of FIG. 4, the artificial antigen peptide is uniformly dissolved in the biodegradable polymer solution O. The obtained O / W emulsion was ice-cooled to form more uniform fine particles. This is probably because the viscosity of the emulsion has increased. Also, the organic solvent was quickly removed by blowing nitrogen gas. As a result, the microparticles containing a relatively uniform artificial antigen peptide having an average particle diameter of 0.6 μm were successfully produced. Details of the experimental operation are shown below, and a scanning electron micrograph is shown in FIG.

200 mLナスフラスコに抗原ペプチド１mg、酢酸１mLを加えて溶解させた。氷冷下でPoly(lactic acid-co-glycolic acid) （和光純薬、PLGA7520、分子量20,000）240 mgを蒸留ジクロロメタン 6 mLに溶解させた有機相(O)を加えたのち、ウルトラソニックホモジナイザー（SNTカンパニー、UH-50型、4 mmプローブを使用）によって15分間混合撹拌し、有機相Oとした。   To a 200 mL eggplant flask, 1 mg of the antigen peptide and 1 mL of acetic acid were added and dissolved. After adding an organic phase (O) in which 240 mg of Poly (lactic acid-co-glycolic acid) (Wako Pure Chemicals, PLGA7520, molecular weight 20,000) was dissolved in 6 mL of distilled dichloromethane under ice cooling, Ultrasonic Homogenizer (SNT Company, UH-50 model, 4 mm probe was used) and mixed and stirred for 15 minutes to obtain organic phase O.

氷冷した0.5％PVA水溶液180 mL（W）をウルトラソニックホモジナイザーで超音波撹拌している有機相Oに加えた。さらに氷冷下で超音波撹拌を15分間続けてO/Wエマルジョンを作製した。その後ジクロロメタンを揮発させるために、マグネテックスターラーによる撹拌と窒素ガスの吹きつけを5時間行った。   180 mL (W) of an ice-cooled 0.5% PVA aqueous solution was added to the organic phase O which was ultrasonically stirred with an ultrasonic homogenizer. Furthermore, ultrasonic stirring was continued for 15 minutes under ice cooling to prepare an O / W emulsion. Thereafter, in order to volatilize dichloromethane, stirring by a magnetic stirrer and blowing of nitrogen gas were performed for 5 hours.

O/Wエマルジョンを粗いガラスフィルター(G1)に通して大きな浮遊物を取り除いた後、50 mL遠心管４本に移し遠心分離 (130 G、３０分、４℃)を行い大きな沈殿物をはじめに除去した。再び遠心分離(2000 G、１００分、４℃)を行い微粒子を沈殿させた。40 mL蒸留水への再懸濁を３回繰り返すことで洗浄を行った。蒸留水を5 mLを加えて冷凍庫で凍結した後に凍結乾燥を行い、微粒子を得た。   Pass the O / W emulsion through a coarse glass filter (G1) to remove large suspended solids, transfer to four 50 mL centrifuge tubes, and centrifuge (130 G, 30 minutes, 4 ° C) to remove large precipitates first. did. Centrifugation (2000 G, 100 minutes, 4 ° C.) was performed again to precipitate fine particles. Washing was performed by repeating resuspension in 40 mL distilled water three times. After adding 5 mL of distilled water and freezing in a freezer, freeze drying was performed to obtain fine particles.

（実施例２）ギ酸溶液を用いて作製された微粒子
微粒子はシングルエマルジョン法（O/W）によって作製した。実施例１と同様な方法でギ酸を用いて溶液を作成できた。その結果、平均粒径が0.8μmの比較的均一な人工抗原ペプチドを含有した微粒子作製に成功した。下記に実験操作の詳細と図６に走査電子顕微鏡写真を示す。 Example 2 Fine particles prepared using a formic acid solution were prepared by a single emulsion method (O / W). A solution could be prepared using formic acid in the same manner as in Example 1. As a result, they succeeded in producing fine particles containing a relatively uniform artificial antigenic peptide having an average particle diameter of 0.8 μm. Details of the experimental operation are shown below, and a scanning electron micrograph is shown in FIG.

200 mLナスフラスコに抗原ペプチド12 mg、ギ酸0.6 mLを加えて溶解させた。氷冷下でPoly(lactic acid-co-glycolic acid) （和光純薬、PLGA7520、分子量20,000）240 mgを蒸留ジクロロメタン 6 mLに溶解させた有機相(O)を加えたのち、ウルトラソニックホモジナイザー（SNTカンパニー、UH-50型、4 mmプローブを使用）によって15分間混合撹拌し、有機相Oとした。   To a 200 mL eggplant flask, 12 mg of antigen peptide and 0.6 mL of formic acid were added and dissolved. After adding an organic phase (O) in which 240 mg of Poly (lactic acid-co-glycolic acid) (Wako Pure Chemicals, PLGA7520, molecular weight 20,000) was dissolved in 6 mL of distilled dichloromethane under ice cooling, Ultrasonic Homogenizer (SNT Company, UH-50 model, 4 mm probe was used) and mixed and stirred for 15 minutes to obtain organic phase O.

氷冷した0.5％PVA水溶液180 mL（W）をウルトラソニックホモジナイザーで超音波撹拌している有機相Oに加えた。さらに氷冷下で超音波撹拌を15分間続けてO/Wエマルジョンを作製した。その後ジクロロメタンを揮発させるために、マグネテックスターラーによる撹拌と窒素ガスの吹きつけを5時間行った。   180 mL (W) of an ice-cooled 0.5% PVA aqueous solution was added to the organic phase O which was ultrasonically stirred with an ultrasonic homogenizer. Furthermore, ultrasonic stirring was continued for 15 minutes under ice cooling to prepare an O / W emulsion. Thereafter, in order to volatilize dichloromethane, stirring by a magnetic stirrer and blowing of nitrogen gas were performed for 5 hours.

O/Wエマルジョンを粗いガラスフィルター(G1)に通して大きな浮遊物を取り除いた後、50 mL遠心管４本に移し遠心分離 (130 G、３０分、４℃)を行い大きな沈殿物をはじめに除去した。再び遠心分離(2000 G、１００分、４℃)を行い微粒子を沈殿させた。40 mL蒸留水への再懸濁を３回繰り返すことで洗浄を行った。蒸留水を5 mLを加えて冷凍庫で凍結した後に凍結乾燥を行い、微粒子を得た。   Pass the O / W emulsion through a coarse glass filter (G1) to remove large suspended solids, transfer to four 50 mL centrifuge tubes, and centrifuge (130 G, 30 minutes, 4 ° C) to remove large precipitates first. did. Centrifugation (2000 G, 100 minutes, 4 ° C.) was performed again to precipitate fine particles. Washing was performed by repeating resuspension in 40 mL distilled water three times. After adding 5 mL of distilled water and freezing in a freezer, freeze drying was performed to obtain fine particles.

（実施例３）ギ酸水溶液を用いて作製された微粒子
微粒子はダブルエマルジョン法（W₁/O/ W₂）によって作製した。人工抗原ペプチド（図３）ギ酸と蒸留水を用いて水相W₁を作成した。図４のダブルエマルジョン法に従って混合を行い、それぞれのエマルジョンを氷冷しながら作成することでより均一な微粒子が形成された。これはエマルジョンの粘性が高くなったためと考えられる。また窒素ガスの吹き
つけによって有機溶媒の除去を迅速に行った。その結果、平均粒径が約３〜１０μmの人工抗原ペプチドを含有した微粒子作製に成功した。下記に実験操作の詳細と図７に走査電子顕微鏡写真を示す。 Example 3 Fine particles prepared using an aqueous formic acid solution were prepared by the double emulsion method (W ₁ / O / W ₂ ). Artificial antigen peptide (FIG. 3) Aqueous phase W ₁ was prepared using formic acid and distilled water. Mixing was carried out according to the double emulsion method of FIG. 4, and more uniform fine particles were formed by making each emulsion while cooling with ice. This is probably because the viscosity of the emulsion has increased. Also, the organic solvent was quickly removed by blowing nitrogen gas. As a result, fine particles containing an artificial antigen peptide having an average particle diameter of about 3 to 10 μm were successfully produced. Details of the experimental operation are shown below, and a scanning electron micrograph is shown in FIG.

200 mLナスフラスコに抗原ペプチド3.2 mg、ギ酸0.32 mL、ゼラチン水溶液3.2 mg/0.32mL、水0.64 mLの順に加えて溶解させた（水相W₁）。氷冷下でPoly(lactic acid-co-glycolic acid) （和光純薬、PLGA7520、分子量20,000）240 mgを蒸留ジクロロメタン 6 mLに溶解させた有機相(O)を加えたのち、ウルトラソニックホモジナイザー（SNTカンパニー、UH-50型、4 mmプローブを使用）によって15分間混合撹拌し、W₁/Oエマルジョンとした。 Antigen peptide 3.2 mg, formic acid 0.32 mL, gelatin aqueous solution 3.2 mg / 0.32 mL, and water 0.64 mL were added and dissolved in this order in a 200 mL eggplant flask (aqueous phase W ₁ ). After adding an organic phase (O) in which 240 mg of Poly (lactic acid-co-glycolic acid) (Wako Pure Chemicals, PLGA7520, molecular weight 20,000) was dissolved in 6 mL of distilled dichloromethane under ice cooling, Ultrasonic Homogenizer (SNT Company, UH-50 model, using 4 mm probe) and mixed and stirred for 15 minutes to obtain a W ₁ / O emulsion.

氷冷した0.5％PVA水溶液180 mL（W₂）を氷冷したW₁/Oエマルジョンに加えた。メカニカルホモジェナイザー（本体IKA-T25 Ultra Turrax、プローブS25N-18G）を用い、3200rpm１０分間の撹拌を行った。メカニカルプローブを用いてエマルジョンを穏和に撹拌することで内水相の液滴が残るため二重構造の微粒子（W₁/O/W₂エマルジョン）が生成した。二重構造は共焦点レーザー顕微鏡や走査型電子顕微鏡で確認することができた。その後ジクロロメタンを揮発させるために、マグネテックスターラーによる撹拌と窒素ガスの吹きつけを5時間行った。 180 mL (W ₂ ) of an ice-cooled 0.5% aqueous PVA solution was added to the ice-cooled W ₁ / O emulsion. Using a mechanical homogenizer (main body IKA-T25 Ultra Turrax, probe S25N-18G), stirring was performed at 3200 rpm for 10 minutes. By gently stirring the emulsion using a mechanical probe, droplets in the inner aqueous phase remained, resulting in the formation of double-structured fine particles (W ₁ / O / W ₂ emulsion). The double structure could be confirmed with a confocal laser microscope or a scanning electron microscope. Thereafter, in order to volatilize dichloromethane, stirring by a magnetic stirrer and blowing of nitrogen gas were performed for 5 hours.

作成したW₁/O/W₂エマルジョンを粗いガラスフィルター(G1)に通して大きな浮遊物を取り除いた後、50 mL遠心管４本に移し静置して沈殿する物質をはじめに除去した。再び遠心分離 (130 G、３０分、４℃)を行い微粒子を沈殿させた。40 mL蒸留水への再懸濁を３回繰り返すことで洗浄を行った。蒸留水を5 mLを加えて冷凍庫で凍結した後に凍結乾燥を行い、微粒子を得た。 The prepared W ₁ / O / W ₂ emulsion was passed through a coarse glass filter (G1) to remove large suspended solids, and then transferred to four 50 mL centrifuge tubes and allowed to stand to remove precipitated substances. Centrifugation (130 G, 30 minutes, 4 ° C.) was performed again to precipitate the fine particles. Washing was performed by repeating resuspension in 40 mL distilled water three times. After adding 5 mL of distilled water and freezing in a freezer, freeze drying was performed to obtain fine particles.

（比較例１）内水相にアルカリ性のグリシン緩衝液（150 mM, pH 8.5）を用いて作製された微粒子
ギ酸水溶液や酢酸水溶液の代わりにグリシン緩衝液（150 mM, pH 8.5）を用いたが、まったく微粒子の形成がみられなかった。pHを9.2にしても同様であった。但し人工抗原の溶解性は酢酸水溶液やギ酸水溶液と同様に良好であった。以下に操作方法を示す。 (Comparative Example 1) A glycine buffer solution (150 mM, pH 8.5) was used in place of a fine particle formic acid aqueous solution and an acetic acid aqueous solution prepared using an alkaline glycine buffer solution (150 mM, pH 8.5) for the inner aqueous phase. The formation of fine particles was not observed at all. It was the same even when the pH was 9.2. However, the solubility of the artificial antigen was as good as that of the acetic acid aqueous solution and the formic acid aqueous solution. The operation method is shown below.

200mLナスフラスコに抗原ペプチド10 mg、ゼラチン4 mg（米国PolyScience社）、グリシン緩衝液100 mLを加えて、ウルトラソニックホモジナイザー（SNTカンパニー、UH-50型、4 mmプローブを使用）で超音波撹拌を30分間行った（W₁）。Poly(lactic acid-co-glycolic acid) 375 mgをジクロロメタン2 mLに溶解させた有機相（O）をW₁に加えた。ウルトラソニックホモジナイザーにより超音波撹拌を3分間行いW₁/Oエマルジョンを作製した。 Add 10 mg of antigenic peptide, 4 mg of gelatin (PolyScience, USA) and 100 mL of glycine buffer to a 200 mL eggplant flask, and ultrasonically stir with an Ultrasonic homogenizer (SNT Company, UH-50, 4 mm probe) Performed for 30 minutes (W ₁ ). Poly (lactic acid-co-glycolic acid) and 375 mg was dissolved in 2 mL of dichloromethane the organic phase (O) was added to the W _1. Ultrasonic stirring was performed for 3 minutes with an ultrasonic homogenizer to prepare a W ₁ / O emulsion.

W₁/O/W₂エマルジョンを粗いガラスフィルター(G1)に通して大きな浮遊物を取り除いた後、さらにデカンテーションにて大きな沈殿を取り除き、50 mL遠心管に移し遠心分離 (3000 rpm、１０〜２０分)行い沈殿させた。すべてのW₁/O/W₂エマルジョンを沈殿させた後50 mL蒸留水で洗浄を行った。蒸留水を5 mLを加えて冷凍庫で凍結した後に凍結乾燥を行った。 Pass the W ₁ / O / W ₂ emulsion through a coarse glass filter (G1) to remove large suspended solids, then remove the large precipitate by decantation, transfer to a 50 mL centrifuge tube, and centrifuge (3000 rpm, 10-10 20 minutes) and allowed to settle. All W ₁ / O / W ₂ emulsions were precipitated and washed with 50 mL distilled water. After adding 5 mL of distilled water and freezing in a freezer, lyophilization was performed.

氷冷した0.5％PVA水溶液25 mL（W₂）をウルトラソニックホモジナイザーで超音波撹拌しているW₁/Oエマルジョン中に加えた。さらに氷冷下で超音波撹拌を3分間続けてW₁/O/W₂エマルジョンを作製した。その後ジクロロメタンを揮発させるために、マグネテックスターラーによる撹拌と窒素ガスの吹きつけを6時間行った。 25 mL (W ₂ ) of an ice-cooled 0.5% PVA aqueous solution was added to the W ₁ / O emulsion that was ultrasonically stirred with an ultrasonic homogenizer. Further, ultrasonic stirring was continued for 3 minutes under ice cooling to prepare a W ₁ / O / W ₂ emulsion. Thereafter, in order to volatilize dichloromethane, stirring by a magnetic stirrer and blowing of nitrogen gas were performed for 6 hours.

（比較例２）内水相に蒸留水を用いて作製された高分子微粒子
人工抗原ペプチドは蒸留水に溶解しないため（10 mg/100 mL）微粒子の作製は行うことができない。また、内水相に蒸留水のみを用いて行った場合は、直径が大きく、粒径分布
の広い（5〜30μｍ）マイクロメートルサイズの高分子微粒子が形成された。以下に操作方法を示す。 (Comparative example 2) Since the polymer fine particle artificial antigen peptide produced using distilled water for the inner aqueous phase does not dissolve in distilled water (10 mg / 100 mL), the fine particles cannot be produced. In addition, when only the distilled water was used for the inner aqueous phase, polymer fine particles having a large diameter and a wide particle size distribution (5 to 30 μm) and micrometer size were formed. The operation method is shown below.

200mLナスフラスコにゼラチン4 mg（米国PolyScience社）、蒸留水100 mLを加えて、ウルトラソニックホモジナイザー（SNTカンパニー、UH-50型、4 mmプローブを使用）で超音波撹拌を30分間行った（W₁）。Poly(lactic acid-co-glycolic acid) 375 mgをジクロロメタン2 mLに溶解させた有機相（O）をW₁に加えた。ウルトラソニックホモジナイザーにより超音波撹拌を3分間行いW₁/Oエマルジョンを作製した。 Gelatin 4 mg (PolyScience, USA) and distilled water 100 mL were added to a 200 mL eggplant flask, and ultrasonic agitation was performed for 30 minutes with an Ultrasonic homogenizer (SNT company, UH-50 type, using a 4 mm probe) (W ₁ ). Poly (lactic acid-co-glycolic acid) and 375 mg was dissolved in 2 mL of dichloromethane the organic phase (O) was added to the W _1. Ultrasonic stirring was performed for 3 minutes with an ultrasonic homogenizer to prepare a W ₁ / O emulsion.

W₁/O/W₂エマルジョンを粗いガラスフィルター(G1)に通して大きな浮遊物を取り除いた後、さらにデカンテーションにて大きな沈殿を取り除き、50 mL遠心管に移し遠心分離 (3000 rpm、１０〜２０分)行い沈殿させた。すべてのW₁/O/W₂エマルジョンを沈殿させた後50 mL蒸留水で洗浄を行った。蒸留水を5 mLを加えて冷凍庫で凍結した後に凍結乾燥を行った。 Pass the W ₁ / O / W ₂ emulsion through a coarse glass filter (G1) to remove large suspended solids, then remove the large precipitate by decantation, transfer to a 50 mL centrifuge tube, and centrifuge (3000 rpm, 10-10 20 minutes) and allowed to settle. All W ₁ / O / W ₂ emulsions were precipitated and washed with 50 mL distilled water. After adding 5 mL of distilled water and freezing in a freezer, lyophilization was performed.

氷冷した0.5％PVA水溶液25 mL（W₂）をウルトラソニックホモジナイザーで超音波撹拌しているW₁/Oエマルジョン中に加えた。さらに氷冷下で超音波撹拌を3分間続けてW₁/O/W₂エマルジョンを作製した。その後ジクロロメタンを揮発させるために、マグネテックスターラーによる撹拌と窒素ガスの吹きつけを6時間行った。 An ice-cooled 0.5% aqueous PVA solution (25 mL, W ₂ ) was added to the W ₁ / O emulsion that was ultrasonically stirred with an Ultrasonic homogenizer. Further, ultrasonic stirring was continued for 3 minutes under ice cooling to prepare a W ₁ / O / W ₂ emulsion. Thereafter, in order to volatilize dichloromethane, stirring by a magnetic stirrer and blowing of nitrogen gas were performed for 6 hours.

（実施例４）蛍光標識を用いた微粒子からの人工抗原ペプチドの放出挙動
実施例１と同様な方法で作製された微粒子からの人工抗原ペプチドの放出を観察した。このとき抗原ペプチドはカルボキシフルオレッセインを用いて標識したものを用いた。３７℃の0.2%SDS-リン酸緩衝生理食塩水40 mLの入った容器底（医薬品用プラスチック容器、株式会社大協精工製CZバイアルおよびフッ素樹脂ラミネートゴム栓）に静置した微粒子1.0 mgからの蛍光標識人工抗原ペプチドの放出挙動（○）を蛍光強度によって追跡した（図８）。比較として同様に静置した蛍光標識人工抗原ペプチド4.0μgが分散溶解する過程（×）も追跡した。 Example 4 Release Behavior of Artificial Antigen Peptide from Fine Particles Using Fluorescent Labels The release of artificial antigen peptide from fine particles produced in the same manner as in Example 1 was observed. At this time, the antigen peptide labeled with carboxyfluorescein was used. From 1.0 mg of fine particles placed on the bottom of a container containing 40 mL of 0.2% SDS-phosphate buffered saline at 37 ° C (plastic container for pharmaceuticals, CZ vial and fluororesin laminated rubber stopper made by Daikyo Seiko Co., Ltd.) The release behavior (◯) of the fluorescence-labeled artificial antigen peptide was followed by the fluorescence intensity (FIG. 8). As a comparison, the process (x) in which 4.0 μg of the fluorescence-labeled artificial antigen peptide that was allowed to stand in the same manner was dispersed and dissolved was also followed.

蛍光分光測定には、装置（日本分光製FP-6200）とマイクロセルを用いてバイアル容器内から50μＬの溶液を採取して、フルオレッセインの蛍光を観察した。採取した溶液は再びバイアル容器内に戻すことができる。この方法によれば、微粒子は懸濁させないために容器中に分散することなく、数週間から数ヶ月の長期間にわたって微粒子からの人工抗原ペプチドの放出の様子を観察することが可能である。微粒子が溶液中に懸濁させた場合でも遠心分離法によって溶液と微粒子成分を分離したのちに蛍光測定を行い、同様な抗原ペプチドの微粒子からの放出を観測することができる。   For fluorescence spectroscopic measurement, 50 μL of solution was collected from the vial container using an apparatus (FP-6200 manufactured by JASCO Corporation) and a microcell, and the fluorescence of fluorescein was observed. The collected solution can be returned to the vial container again. According to this method, since the fine particles are not suspended, it is possible to observe the state of release of the artificial antigenic peptide from the fine particles over a long period of several weeks to several months without being dispersed in the container. Even when the microparticles are suspended in the solution, the fluorescence is measured after separating the solution and the microparticle components by the centrifugal separation method, and the release of the same antigen peptide from the microparticles can be observed.

（実施例５）マウス皮下に於ける微粒子からの人工抗原ペプチドの放出挙動
実施例１と同様な方法で作製された微粒子からの人工抗原ペプチドの放出をマウス皮下に於いて観察した。このとき抗原ペプチドはカルボキシフルオレッセインを用いて標識したものをシングルエマルジョン法によって微粒子化した後に皮下からの消失を蛍光イメージング法によって観察した。 Example 5 Release Behavior of Artificial Antigen Peptide from Fine Particles in Mouse Subcutaneous Release of the artificial antigen peptide from fine particles prepared in the same manner as in Example 1 was observed in the mouse subcutaneous. At this time, the antigen peptide labeled with carboxyfluorescein was microparticulated by the single emulsion method, and disappearance from the subcutaneous layer was observed by the fluorescence imaging method.

0.20 mLの生理食塩水に2.0 mgの微粒子を分散させて２匹のヌードマウス皮下（１匹は背中側２ヶ所0.5 mLづつ、もう１匹は背中側１ヶ所0.08 mL）に接種した。蛍光イメージャー（米国CRi製マエストロFL500）によってフルオレッセインの蛍光を数日おきに観察することで皮下に於ける人工抗原ペプチドの消失過程を実際に追跡することができた（図１０）。   2.0 mg of fine particles were dispersed in 0.20 mL of physiological saline and inoculated subcutaneously into two nude mice (one for each 0.5 mL on the back side and the other one on the back side 0.08 mL). By observing fluorescence of fluorescein every few days with a fluorescence imager (Maestro FL500 manufactured by CRi, USA), it was possible to actually follow the disappearance process of the artificial antigenic peptide under the skin (FIG. 10).

０，２，５日目の蛍光画像を励起波長445-490 nm、検出波長500-720 nmの波長域で5 nm
毎に観測した。得られた蛍光画像をスペクトル分解による画像処理を行った。その結果、０日目に皮下へ投与された蛍光微粒子は２日後に強度が24〜48％に、５日後に17〜49％になった。これは投与された微粒子の一部は皮下で拡散して蛍光強度が２日目にかけて急激に減衰し（０〜２日目）、残った微粒子はあまり拡散することなくゆっくり分解されていった（２〜１０日目）。また、１０日目以降の観察ではカルボキシフルオレッセインが皮下の脂肪組織へ蓄積するために、微粒子の分解挙動を蛍光強度から解析することはあまり適していない。 Fluorescence images on days 0, 2 and 5 are 5 nm in the excitation wavelength range 445-490 nm and detection wavelength range 500-720 nm.
Observed every time. The obtained fluorescence image was subjected to image processing by spectral decomposition. As a result, the intensity of fluorescent fine particles administered subcutaneously on the 0th day became 24 to 48% after 2 days and 17 to 49% after 5 days. This was because some of the administered microparticles diffused subcutaneously, and the fluorescence intensity rapidly decreased over the second day (0 to 2 days), and the remaining microparticles were slowly decomposed without much diffusion ( 2-10 days). Further, in the observation after the 10th day, carboxyfluorescein accumulates in subcutaneous adipose tissue, so it is not very suitable to analyze the decomposition behavior of the fine particles from the fluorescence intensity.

上記の蛍光イメージング法ではおよその体内分布で人工抗原ペプチドの消失量をみつもることが限界である。より厳密な定量データを得るには放射性同位元素を人工抗原ペプチドに標識して（例えば放射性ヨウ素によるチロシン残基への標識）体内分布や代謝過程を厳密に定量して追跡することがよい。これは実際に一般的に用いられている方法であり、本実施例に於いても容易に実施が可能である。   The above-mentioned fluorescence imaging method is limited in finding the disappearance amount of the artificial antigenic peptide with an approximate distribution in the body. In order to obtain more precise quantitative data, it is preferable to label a radioisotope with an artificial antigen peptide (for example, label to a tyrosine residue with radioiodine), and to strictly quantify and track the biodistribution and metabolic processes. This is a method that is generally used in practice, and can be easily implemented in this embodiment.

（実施例６）微粒子によるマウスへの免疫実験１
実施例１と同様な方法で作製された微粒子によるマウス皮下への免疫実験と抗体価の推移を検討した。図１１に示すように、人工抗原ペプチドに対する抗体価を０〜１５週までプロットした。抗体価は血清の希釈倍率によって表されるものであり、「ELISA法で測定した検体血清の405nmの吸光度」が「免疫前血清での吸光度＋標準偏差の２倍」を超える時点での希釈率を抗体価として定義される。各実験区はBalb/cマウス（７週齢♀）５匹ずつを用いた。実験区１は抗原量1.6μｇ／匹（0.4ｍｇ微粒子／匹）、実験区２は抗原量16μｇ／匹（4.0ｍｇ微粒子／匹）、実験区３は抗原量16μｇ／匹（抗原のみで微粒子なし）、実験区４は抗原量0.0μｇ／匹（抗原なしで4.0ｍｇ微粒子のみ／匹）の投与となっている。実験区２における抗体価の推移から、本実験での投与量に於いて、本発明の微粒子はマウスへの免疫により抗体を産生できることがわかった。また抗体価は持続的に上昇することも明らかとなった。 (Example 6) Immunization experiment 1 to mice with microparticles
Immunization experiments on mice subcutaneously with microparticles prepared by the same method as in Example 1 and changes in antibody titer were examined. As shown in FIG. 11, antibody titers against artificial antigenic peptides were plotted from 0 to 15 weeks. The antibody titer is expressed by the dilution ratio of the serum, and the dilution rate when the "absorbance at 405 nm of the sample serum measured by ELISA method" exceeds "absorbance in pre-immune serum + twice the standard deviation" Is defined as the antibody titer. Each experimental group used 5 Balb / c mice (7-week old mice). Experimental group 1 has an antigen amount of 1.6 μg / animal (0.4 mg microparticles / animal), experimental group 2 has an antigen amount of 16 μg / animal (4.0 mg microparticles / animal), and experimental group 3 has an antigen amount of 16 μg / animal (antigen alone and no microparticles) ), Experimental group 4 is administered with an antigen amount of 0.0 μg / animal (without antigen, only 4.0 mg microparticles / animal). From the transition of the antibody titer in Experimental Group 2, it was found that the microparticles of the present invention can produce antibodies by immunization of mice at the dose in this experiment. It was also revealed that the antibody titer increased continuously.

（実施例７）微粒子によるマウスへの免疫実験２
ここでは実施例６と図１１に記載の実験区２のマウス４匹について、２１週目に２匹（マウス３，５）は微粒子を再投与（抗原量16μｇ／匹、4.0ｍｇ微粒子／匹）し、残り２匹（マウス１，４）は何も再投与せずに抗体価を２７週まで観察した。図１２に示すように再投与した２匹（マウス３，５）の抗体価が投与前に比較して有意に上昇したことから、本発明の微粒子はマウスへの免疫においてブースター効果を示すことが明らかになった。 (Example 7) Immunization experiment 2 to mice with microparticles
Here, 4 mice in experimental group 2 described in Example 6 and FIG. 11 were re-administered with fine particles (antigen amount 16 μg / animal, 4.0 mg microparticle / animal) at 2 weeks (mouse 3 and 5). The remaining 2 animals (mouse 1 and 4) were observed again for up to 27 weeks without re-administering anything. As shown in FIG. 12, since the antibody titers of two re-administered mice (mouses 3 and 5) were significantly increased compared to those before administration, the microparticles of the present invention may exhibit a booster effect in immunizing mice. It was revealed.

上記の実施例６，７で得られるマウスの抗血清は、例えば熱帯熱マラリア原虫の培養系に10倍、20倍、200倍希釈で添加してゆくことで増殖抑制効果を調べることができる。このとき血清の希釈率を上げることで増殖率が抑えられると予想される。これは実際に一般的に用いられている方法であり、本実施例に於いても容易に実施が可能である。   For example, the anti-serum of mice obtained in Examples 6 and 7 can be examined for the growth inhibitory effect by adding 10-fold, 20-fold, and 200-fold dilutions to the culture system of Plasmodium falciparum. At this time, it is expected that the growth rate can be suppressed by increasing the dilution rate of serum. This is a method that is generally used in practice, and can be easily implemented in this embodiment.

このとき、例えば特許出願2001-176044（特許公開2002-371098）の実施例に記載のように、培養系中の原虫の形態をギムザ染色で顕微鏡観察すると、抗血清を添加したものではシゾントに成熟できず、赤血球中で死んで行く様子が予想される。シゾントは***体と呼ばれ、血流中の増殖サイクルの１形態である。赤血球中のトロフォゾイト（栄養体、輪状体）がシゾント（***体）へ成熟し、感染者の発熱と新たな赤血球への感染を引き起こすメロゾイトとなる。すなわち本発明の微粒子をヒトに投与した場合には、シゾントへの成熟を止めることにより、熱帯熱マラリア感染時の発熱と重症化（新たな赤血球への感染）を直接抑えることができると考えられる。   At this time, for example, as described in the Examples of Patent Application 2001-176044 (Patent Publication 2002-371098), when the morphology of the protozoa in the culture system is observed with Giemsa staining under a microscope, matured schizonts with antiserum added It is not possible to expect to die in red blood cells. Schizonts are called mitotic bodies and are a form of growth cycle in the bloodstream. Trophozoites (nutrients, rings) in erythrocytes mature into schizonts (mitotics), becoming merozoites that cause fever and infection of new erythrocytes. That is, when the microparticles of the present invention are administered to humans, it is considered that fever and seriousness (infection with new erythrocytes) during P. falciparum infection can be directly suppressed by stopping maturation into schizonts. .

Claims (15)

生理活性物質と生分解性高分子を含む微粒子であって、該生理活性物質を含む揮発性有機酸水溶液または生理活性物質の揮発性有機酸溶液を用いたダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法によって作製された微粒子。 Fine particles containing a bioactive substance and a biodegradable polymer, and are prepared by a double emulsion method or a single emulsion method using a volatile organic acid aqueous solution containing the bioactive substance or a volatile organic acid solution of the bioactive substance. Fine particles. 前記揮発性有機酸が酢酸または酢酸を含む混合物である、請求項１に記載の微粒子。 The microparticle according to claim 1, wherein the volatile organic acid is acetic acid or a mixture containing acetic acid. 前記揮発性有機酸がギ酸またはギ酸を含む混合物である、請求項１に記載の微粒子。 The fine particle according to claim 1, wherein the volatile organic acid is formic acid or a mixture containing formic acid. 前記生分解性高分子がポリ乳酸−グリコール酸共重合体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微粒子。 The fine particles according to any one of claims 1 to 3, wherein the biodegradable polymer is a polylactic acid-glycolic acid copolymer. 前記生分解性高分子がポリ乳酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微粒子。 The microparticle according to claim 1, wherein the biodegradable polymer is polylactic acid. 前記生分解性高分子がポリデプシペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微粒子。 The microparticle according to any one of claims 1 to 3, wherein the biodegradable polymer is a polydepsipeptide. 前記生理活性物質がタンパク質またはペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微粒子。 The microparticle according to any one of claims 1 to 6, wherein the physiologically active substance is a protein or a peptide. 前記タンパク質またはペプチドが熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはペプチドである、請求項７に記載の微粒子。 The microparticle according to claim 7, wherein the protein or peptide is a protein or peptide derived from Plasmodium falciparum. 前記熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質またはペプチドが熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼまたはその部分ペプチドである、請求項８に記載の微粒子。 The microparticle according to claim 8, wherein the protein or peptide derived from P. falciparum is an enolase derived from P. falciparum or a partial peptide thereof. 前記部分ペプチドが配列番号１と配列番号２との構造的差違部分を含み、熱帯熱マラリア原虫に対する細胞性または体液性の免疫学的応答を誘発しうるペプチドである、請求項９に記載の微粒子。 The microparticle according to claim 9, wherein the partial peptide comprises a structural difference between SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and is a peptide capable of inducing a cellular or humoral immunological response against Plasmodium falciparum. . 前記部分ペプチドが、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項９に記載の微粒子。 The microparticle according to claim 9, wherein the partial peptide is a peptide consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 6. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微粒子と、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the microparticles according to any one of claims 1 to 11 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微粒子と、医薬的に許容可能な担体を含む、マラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物。 A pharmaceutical composition for preventing malaria parasite infection, comprising the microparticles according to any one of claims 8 to 11 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項８〜１１のいずれか１項に記載の微粒子を有効成分として含有する、マラリア原虫の増殖を抑えるための免疫用抗原。 The antigen for immunity for suppressing the proliferation of the malaria parasite which contains the microparticles | fine-particles of any one of Claims 8-11 as an active ingredient. 生理活性物質を含む揮発性有機酸水溶液または生理活性物質の揮発性有機酸溶液を、生分解性高分子を含む揮発性有機溶媒と混合してエマルジョンを作製する工程、及び得られたエマルジョンを負電荷を有するポリマーの水溶液と混合する工程を含む、生理活性物質含有微粒子の製造方法。 A step of preparing an emulsion by mixing an aqueous volatile organic acid solution containing a physiologically active substance or a volatile organic acid solution of a biologically active substance with a volatile organic solvent containing a biodegradable polymer; and A method for producing fine particles containing physiologically active substances, comprising a step of mixing with an aqueous solution of a polymer having a charge.