JP2009250652A - Screening method for functional material by measuring cell migration speed - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening a material interacting with a protein existing on a cell membrane, by measuring the migration speed from the cell membrane to the inside of a cell. <P>SOLUTION: This screening method for the material interacting with a protein existing on a cell membrane includes processes for: bringing a test material labeled by a detectable labeling material into contact with a cell, having the protein on the cell membrane; and measuring it with the passage of time, the test material in cytoplasm by measuring with passage of time, the labeling material in the cytoplasm of the cell. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、細胞表面上の蛋白質に対して結合する分子種の細胞内移行を速度論的に分析することによって、有効な分子をスクリーニングする方法に関するものである。本発明の方法により選択された分子は、細胞膜上の蛋白質に結合する本来の生体成分の効果を阻害又は促進する効果が期待され、疾患の治療用の候補分子として選別することができる。   The present invention relates to a method for screening effective molecules by kinetically analyzing intracellular migration of molecular species that bind to proteins on the cell surface. The molecule selected by the method of the present invention is expected to have an effect of inhibiting or promoting the effect of the original biological component that binds to the protein on the cell membrane, and can be selected as a candidate molecule for treatment of a disease.

創薬の過程では種々の生物学的標的、例えば、受容体、酵素、シグナル伝達蛋白質などに対する作用について化合物のテストを日常的に行っている。こうした化合物は、化合物の種類が数十万から百万程度の大きなライブラリとして収集されている。   In the process of drug discovery, compounds are routinely tested for effects on various biological targets, such as receptors, enzymes, signaling proteins and the like. Such compounds are collected as a large library having hundreds of thousands to millions of compound types.

低分子化合物がこれまで治療用薬物の主役であったが、現在多くの蛋白質薬剤が登場し、その生理活性の特異性から有用な新薬創生に結びついている。現在、薬の発見と共に、生物学的に適切な細胞アッセイを高い処理能力で実施することができる迅速で強力な方法の開発が望まれている。特に、創薬の種となる蛋白質や化合物の生物活性および新規な生物学的標的に対する作用メカニズムの推定には、細胞を利用したアッセイが不可欠である。   Low molecular weight compounds have been the main role of therapeutic drugs so far, but many protein drugs are now appearing and are linked to the creation of useful new drugs due to the specificity of their physiological activities. Currently, with the discovery of drugs, it is desirable to develop rapid and powerful methods that can perform biologically relevant cell assays with high throughput. In particular, cell-based assays are indispensable for estimating the biological activity of proteins and compounds used as drug discovery seeds and the mechanism of action on novel biological targets.

細胞は多くの受容体分子をその表面膜状に発現し、受容体特異的に反応する分子であるリガンドが結合することによりその受容体の機能に応じたシグナルを細胞内に伝える。受容体分子は蛋白質でありそれ自身を精製または、遺伝子組み換え技術により作製することで純品を得ることができる。精製品を用いてリガンド−受容体反応を試験管内（インビトロ）で再現することによりその結合反応を生体分子さながら再現することが可能である。   A cell expresses many receptor molecules in the form of a surface membrane, and a signal corresponding to the function of the receptor is transmitted into the cell by binding to a ligand which is a molecule that reacts specifically to the receptor. The receptor molecule is a protein, and a pure product can be obtained by purifying itself or producing it by a gene recombination technique. By reproducing the ligand-receptor reaction in vitro (in vitro) using the purified product, it is possible to reproduce the binding reaction as if it were a biomolecule.

多くの場合、上記の生体を模した系を用いて大量の医薬品候補をスクリーニングすることが広く製薬企業にて行われている。得られた候補医薬品はその後実際に生きた細胞にて受容体の効果を促進する、または阻害する効果を有しているかどうかを検証する過程を経てその効果が確かめられる。近年、この生体内を模倣したステップを経ずに直接生細胞を用いて大量の医薬品候補をスクリーニングする試みが始まっている。実際には、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートに生きた細胞を撒き、その中にリガンドに相当する分子に蛍光標識したものを加え、同時に医薬品候補を存在させることにより生細胞の形態変化や蛍光標識したリガンド分子が細胞に結合することを阻害するかまたは促進するかどうかを反応時間の終点を決めたアッセイにて評価している。   In many cases, a large number of drug candidates are screened by pharmaceutical companies using the above-described system imitating a living body. The obtained candidate drug is then confirmed through a process of verifying whether it actually has an effect of promoting or inhibiting the effect of the receptor in living cells. In recent years, an attempt to screen a large number of drug candidates using living cells directly without going through the step of imitating the living body has begun. Actually, living cells are seeded in a 96-well or 384-well plate, and a molecule corresponding to the ligand is added with a fluorescent label, and at the same time, a drug candidate is present, and the morphological change or fluorescent labeling of the living cell is performed. Whether the ligand molecule inhibits or promotes binding to cells is evaluated in an assay that determines the end point of the reaction time.

細胞表面に存在する蛋白質のうち、その蛋白質に物質が結合するにより細胞表面から細胞内部へ移行するものが知られている。その多くは受容体であるがリガンド物質が結合することにより細胞表面から細胞内部への移行が促進されるもの、リガンド物質の結合に依存せず定常的に細胞表面から細胞内部への移行が起こるものが存在する。前者の代表例として、トランスフェリン、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、上皮細胞増殖因子の各受容体が良く知られているが、本来の受容体に対する結合分子ではないものが受容体に結合した場合、その細胞内移行は本来の受容体に対する結合分子が結合した場合に比べ挙動がどうなるかは全くわかっていない。   Among proteins existing on the cell surface, those that move from the cell surface to the inside of the cell when a substance binds to the protein are known. Most of them are receptors, but the transition from the cell surface to the inside of the cell is promoted by the binding of the ligand substance, and the transition from the cell surface to the inside of the cell occurs constantly regardless of the binding of the ligand substance. Things exist. As a typical example of the former, transferrin, low density lipoprotein (LDL), and epidermal growth factor receptors are well known, but when a receptor that is not a binding molecule to the original receptor binds to the receptor, It is not known at all how the intracellular translocation behaves compared to the case where a binding molecule for the original receptor binds.

化学物ライブラリのスクリーニングの多くは、インビトロ（試験管内で）のアッセイ法により行われている。このようなアッセイ法は、ひとたび構築されれば、高感度で再現性よく実施できる。シンチレーション近接法、蛍光偏光法と時間分解蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴分光法などの技術により、リガンド−受容体結合、プロテインキナーゼ活性などの種々の生化学的過程のスクリーニングを大規模に行うことが可能になっている。インビトロ・アッセイ法は薬理および構造活性相関の研究における最も基準になる方法であるが、インビトロ・アッセイ法では、ヒットした化合物の生物学的な利用能もしくは活性についての情報は得られないという欠点があった。   Many screenings of chemical libraries are performed in vitro (in vitro) assays. Such an assay, once constructed, can be performed with high sensitivity and reproducibility. Screening of various biochemical processes such as ligand-receptor binding and protein kinase activity using technologies such as scintillation proximity, fluorescence polarization and time-resolved fluorescence resonance energy transfer (FRET), and surface plasmon resonance spectroscopy It can be done on a scale. In vitro assays are the most standard method in pharmacological and structure-activity relationship studies, but in vitro assays do not provide information on the bioavailability or activity of hit compounds. there were.

ＨＣＳ（ハイコンテント・スクリーニング）は、細胞の画像に基づく解析を利用して、細胞過程の刺激もしくは阻害剤への反応による蛋白質の細胞内配置および再分布を検出する生細胞使用のアッセイ法である（特許文献１）。しかしながら、その検出子の測定には量的な測定のみを終点として測定するだけであり、速度論的概念は乏しいものである。   HCS (High Content Screening) is a live cell-based assay that uses cellular image-based analysis to detect intracellular cellular localization and redistribution by stimulating cellular processes or responding to inhibitors. (Patent Document 1). However, the measurement of the detector only measures the quantitative measurement as an end point, and the kinetic concept is poor.

米国特許第５，９８９，８３５号US Pat. No. 5,989,835

上記したHCSに時間概念を加味し、終点を設定せずその経過を速度論的にモニターすることによって、生細胞の動的パラメータを測定することができれば、創薬候補の発見に応用できることが期待されていた。本発明は、細胞膜から細胞内への移動速度を測定することによって細胞膜上に存在する蛋白質に対して相互作用する物質をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。   If the dynamic parameters of living cells can be measured by adding the time concept to the above HCS and monitoring the progress kinetically without setting the end point, it is expected to be applicable to the discovery of drug candidates. It had been. An object of the present invention is to provide a method for screening a substance that interacts with a protein present on a cell membrane by measuring a moving speed from the cell membrane into the cell.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、検出可能な標識物質で標識された被検物質を細胞に接触させ、細胞質内における標識物質を経時的に測定することによって、細胞膜上に存在する蛋白質に対して相互作用する物質をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of diligent investigations to solve the above problems, the present inventors contacted a test substance labeled with a detectable labeling substance with cells, and measured the labeling substance in the cytoplasm over time, whereby the cell membrane The inventors have found that a substance that interacts with the protein present above can be screened, and have completed the present invention.

即ち、本発明によれば、検出可能な標識物質で標識された被検物質を、細胞膜上に蛋白質を有する細胞に接触させる工程、及び該細胞の細胞質内における標識物質を経時的に測定することによって細胞質内における被検物質を経時的に測定する工程を含む、細胞膜上に存在する蛋白質に対して相互作用する物質のスクリーニング方法が提供される。   That is, according to the present invention, the step of contacting a test substance labeled with a detectable labeling substance with a cell having a protein on the cell membrane, and measuring the labeling substance in the cytoplasm of the cell over time. Provides a method for screening a substance that interacts with a protein present on a cell membrane, comprising the step of measuring a test substance in the cytoplasm over time.

好ましくは、細胞質内における被検物質を経時的に測定することによって、被検物質が細胞膜から細胞質に移行する速度を測定する。
好ましくは、上記細胞膜上の蛋白質は、細胞−細胞間の結合に関与する蛋白質、受容体、受容体の一部であって細胞外部分の切断後細胞表面に残存する蛋白質、細胞間の蛋白−蛋白相互作用による細胞間シグナル伝達を担う蛋白質、細胞膜上の酵素、細胞表面チャネル、細胞表面トランスポーター、細胞膜結合抗体、及び上記と複合体を形成する蛋白質からなる群から選ばれる蛋白質である。 Preferably, the rate at which the test substance moves from the cell membrane to the cytoplasm is measured by measuring the test substance in the cytoplasm over time.
Preferably, the protein on the cell membrane is a protein involved in cell-cell binding, a receptor, a protein that is part of the receptor and remains on the cell surface after cleavage of the extracellular portion, and a protein between cells It is a protein selected from the group consisting of a protein responsible for cell-cell signal transduction by protein interaction, an enzyme on the cell membrane, a cell surface channel, a cell surface transporter, a cell membrane-bound antibody, and a protein that forms a complex with the above.

好ましくは、上記被検物質は、細胞−細胞間の結合に関与する蛋白質ペア、受容体に相互作用するリガンド分子、受容体に相互作用する薬物、細胞膜上に存在する蛋白質に対し相互作用するランダムな配列から選択された蛋白質又はペプチド、細胞間の蛋白−蛋白によるシグナル伝達蛋白質、核酸、細胞膜酵素基質、抗体、抗原、及び細胞膜上に存在する蛋白質と相互作用する機能未知の化合物からなる群から選ばれる物質である。
好ましくは、上記検出可能な標識物質は、（i）蛍光化合物、(ii)蛍光蛋白質、(iii) 蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法のための標識物質、(iv)ラジオアイソトープ標識物質、又は(v)バイオルミネセンス、化学発光、リン光、又は酵素発色による検出が可能な標識物質である。 Preferably, the test substance is a protein pair involved in cell-cell binding, a ligand molecule that interacts with a receptor, a drug that interacts with the receptor, or a random that interacts with a protein present on the cell membrane. A protein or peptide selected from various sequences, an intercellular protein-protein signaling protein, a nucleic acid, a cell membrane enzyme substrate, an antibody, an antigen, and a compound of unknown function that interacts with a protein present on the cell membrane It is a substance to be selected.
Preferably, the detectable labeling substance is (i) a fluorescent compound, (ii) a fluorescent protein, (iii) a labeling substance for the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method, (iv) a radioisotope labeling substance, or ( v) A labeling substance that can be detected by bioluminescence, chemiluminescence, phosphorescence, or enzyme coloration.

本発明によれば、細胞膜に存在する蛋白質と相互作用する被検物質（薬物を含む化合物や蛋白質、ペプチド等）に検出可能な標識物質を付加することによって、当該被検物質の細胞膜から細胞内への移動速度を測定することが可能になり、これにより、細胞膜に存在する蛋白質と相互作用する物質に比べて細胞内移動速度の異なる物質をスクリーニングすることが可能になった。   According to the present invention, by adding a detectable labeling substance to a test substance (compound containing a drug, protein, peptide, etc.) that interacts with a protein present in the cell membrane, It has become possible to measure the rate of movement to the cell, thereby screening for substances with different intracellular movement rates compared to substances that interact with proteins present in the cell membrane.

本発明の方法は、米国特許第６，５１１，９６７号に開示されているような受容体−リガンドのイメージング技術をさらに応用したものであり、米国特許第６，５１１，９６７号に記載された内容は全て引用により本明細書中に含まれるものとする。また、米国特許第５，９８９，８３５号に開示されているような既存のハイコンテント計測器およびソフトウェアを含む生理活性物質の発見のための種々の既存の自動化システムと併せて用いることができる。   The method of the present invention is a further application of a receptor-ligand imaging technique as disclosed in US Pat. No. 6,511,967, and is described in US Pat. No. 6,511,967. The entire contents are hereby incorporated by reference. It can also be used in conjunction with a variety of existing automated systems for the discovery of bioactive substances including existing high content instruments and software as disclosed in US Pat. No. 5,989,835.

［細胞膜上に存在する蛋白質］
本発明では、検出可能な標識物質で標識された被検物質を、細胞膜上に蛋白質を有する細胞に接触させる。ここで、細胞膜上の蛋白質としては、細胞−細胞間の結合に関与する蛋白質、受容体、受容体の一部であって細胞外部分の切断後細胞表面に残存する蛋白質、細胞間の蛋白−蛋白相互作用による細胞間シグナル伝達を担う蛋白質、細胞膜上の酵素、細胞表面チャネル、細胞表面トランスポーター、細胞膜結合抗体、及び上記と複合体を形成する蛋白質などを挙げることができる。これらのうち好ましくは、ジフテリア毒素、緑膿菌毒素、コレラ毒素、リシン、コンカナバリンＡ、トランスフェリン、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、卵黄蛋白、イムノグロブリンＥ、イムノグロブリンＡ重合体、イムノグロブリンＧ、インスリン、上皮細胞増殖因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、神経成長因子、カルシトニン、グルカゴン、プロラクチン、黄体ホルモン、血小板由来増殖因子、インターフェロン、カテコールアミン、ならびに、これらのドメイン、断片もしくは相同物からなる群から選ばれるものが好ましく、最も好ましくはトランスフェリン、上皮細胞増殖因子である。 [Proteins present on cell membranes]
In the present invention, a test substance labeled with a detectable labeling substance is brought into contact with a cell having a protein on the cell membrane. Here, the protein on the cell membrane includes a protein involved in cell-cell binding, a receptor, a part of the receptor, a protein remaining on the cell surface after cleavage of the extracellular part, and a protein between cells Examples include proteins responsible for intercellular signal transduction through protein interaction, enzymes on cell membranes, cell surface channels, cell surface transporters, cell membrane-bound antibodies, and proteins that form complexes with the above. Of these, diphtheria toxin, Pseudomonas aeruginosa toxin, cholera toxin, ricin, concanavalin A, transferrin, low density lipoprotein (LDL), egg yolk protein, immunoglobulin E, immunoglobulin A polymer, immunoglobulin G, insulin , Epidermal growth factor, growth hormone, thyroid stimulating hormone, nerve growth factor, calcitonin, glucagon, prolactin, luteinizing hormone, platelet-derived growth factor, interferon, catecholamine, and domains, fragments or homologues thereof. Most preferred are transferrin and epidermal growth factor.

［被検物質］
スクリーニングすべき被検物質としては、細胞−細胞間の結合に関与する蛋白質ペア、受容体に相互作用するリガンド分子、受容体に相互作用する薬物、細胞膜上に存在する蛋白質に対し相互作用するランダムな配列から選択された蛋白質又はペプチド、細胞間の蛋白−蛋白によるシグナル伝達蛋白質、核酸、細胞膜酵素基質、抗体、抗原、及び細胞膜上に存在する蛋白質と相互作用する機能未知の化合物などを挙げることができる。蛋白質やペプチドであればその断片や誘導体、アミノ配列乃至修飾の異なる蛋白質やペプチド、合成ペプチド、合成オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ増幅物、小型干渉性ＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）、細胞膜上に存在する蛋白質に対し相互作用することが既知または未知の合成または天然の既知または未知の機能を有する化合物などを用いることができる。化合物という用語は、広義に解釈して使用するよう意図されており、このため、例えば、単純な有機および無機分子、蛋白質、ペプチド、抗体、核酸とオリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、もしくは生物学的に重要な任意の化学物が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、化学物ライブラリという用語も、広義に解釈して使用するよう意図されており、例えば、分子のコレクションが含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の方法に用いられる被検物質としては、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、受容体分解阻害剤が好ましい。 [Test substance]
Test substances to be screened include protein pairs involved in cell-cell binding, ligand molecules that interact with receptors, drugs that interact with receptors, and random that interact with proteins present on cell membranes. Proteins or peptides selected from various sequences, intercellular protein-protein signaling proteins, nucleic acids, cell membrane enzyme substrates, antibodies, antigens, compounds with unknown functions that interact with proteins present on cell membranes, etc. Can do. For proteins and peptides, fragments and derivatives thereof, proteins and peptides with different amino sequences or modifications, synthetic peptides, synthetic oligonucleotides, DNA amplification products, small interfering RNA, and proteins present on cell membranes Synthetic compounds that are known or unknown to interact, natural compounds having known or unknown functions, and the like can be used. The term compound is intended to be broadly interpreted and used, for example, for simple organic and inorganic molecules, proteins, peptides, antibodies, nucleic acids and oligonucleotides, carbohydrates, lipids, or biologically. It includes any important chemicals, but is not limited to these. The term chemical library is also intended to be interpreted and used in a broad sense, including, but not limited to, a collection of molecules. The test substance used in the method of the present invention is preferably a receptor agonist, a receptor antagonist, or a receptor degradation inhibitor.

［検出可能な標識物質］
本発明で用いる被検物質は、検出可能な標識物質で標識されている。検出可能な標識物質とは、（i）蛍光化合物、(ii)蛍光蛋白質、(iii) 蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法のための標識物質、(iv)ラジオアイソトープ標識物質、又は(v)バイオルミネセンス、化学発光、リン光、又は酵素発色による検出が可能な標識物質などを挙げることができる。好ましくは、蛍光化合物、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、リン光性蛋白質などを用いることができ、さらに好ましくは、蛍光、バイオルミネセンス、化学発光、又はリン光により検出可能な物質である。 [Detectable labeling substance]
The test substance used in the present invention is labeled with a detectable labeling substance. The detectable labeling substance is (i) a fluorescent compound, (ii) a fluorescent protein, (iii) a labeling substance for the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method, (iv) a radioisotope labeling substance, or (v) a bio Examples thereof include a labeling substance that can be detected by luminescence, chemiluminescence, phosphorescence, or enzyme color development. Preferably, a fluorescent compound, an enzyme, a fluorescent protein, a luminescent protein, a phosphorescent protein, or the like can be used, and more preferably a substance that can be detected by fluorescence, bioluminescence, chemiluminescence, or phosphorescence.

細胞スクリーニング法は、細胞可溶化物を分析する準生化学的な方法、もしくは生細胞アッセイ法の２群に大別することができる。本発明では、主として細胞全体を用いるアッセイに焦点を当てている。細胞全体を用いるアッセイ方法は、アッセイの原理によって異なるが、大部分は共通して発光もしくは蛍光の検出様式を採るため発光または蛍光が好ましい。発光とは、エネルギーが特異的に分子に誘導されて励起状態を生じる現象である。発光には、蛍光、リン光、化学発光および生物発光が含まれる。但し、本発明による検出子は上記発光以外にもイメージ取得が可能な検出子であれば利用可能であるため発光に限定するものではない。   Cell screening methods can be broadly divided into two groups: quasi-biochemical methods for analyzing cell lysates, or live cell assays. The present invention focuses primarily on whole cell assays. The assay method using whole cells varies depending on the principle of the assay, but since most of them commonly adopt a detection mode of luminescence or fluorescence, luminescence or fluorescence is preferred. Luminescence is a phenomenon in which energy is specifically induced in molecules to produce an excited state. Luminescence includes fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence and bioluminescence. However, the detector according to the present invention is not limited to light emission because it can be used as long as it is a detector capable of acquiring an image in addition to the light emission.

化合物に対する蛍光標識を行うための物質は数多く知られているが、特に蛋白質に対する蛍光標識試薬は蛍光化合物がフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ＢＯＤＩＰＹR、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）系化合物、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒRが広く使用され、ＧＥヘルスケア社、ピアース（ＰＩＥＲＣＥ）社、インビトロゲン・モレキュラー・プローブズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社などの販売元から広く入手することができる。また、蛍光蛋白質も増加の一途をたどっているが、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のＧＦＰおよびそのスペクトル変異体が代表として挙げられ、広く用いられている。これらの蛍光蛋白質は、シグナルの発生に外来性の基質もしくは補因子を何ら必要としないという利点を有するが、内在性蛍光体の励起のために外部の放射線源を必要とする。さらに、広範囲の蛍光レポータ蛋白質をコードする遺伝子が入手しやすくなって、特定の用途、細胞種および検出系のためにカスタマイズされたアッセイ法の構築が可能になっている。 Many substances for performing fluorescent labeling on compounds are known, and in particular, fluorescent labeling reagents for proteins are fluorescent compounds such as fluorescein, rhodamine, Texas Red, BODIPYR, cyanine compounds, Alexa. Fluor® is widely used and can be widely obtained from vendors such as GE Healthcare, PIERCE, and Invitrogen Molecular Probes. In addition, fluorescent proteins are steadily increasing, but GFP derived from Aequorea Victoria and its spectral variants are representatively used and widely used. These fluorescent proteins have the advantage of not requiring any exogenous substrates or cofactors for signal generation, but require an external radiation source for excitation of the endogenous fluorophore. In addition, genes encoding a wide range of fluorescent reporter proteins are readily available, allowing the construction of assays customized for specific applications, cell types, and detection systems.

［標識物質（被検物質）を経時的に測定］
標識物質（被検物質）を経時的に測定とは細胞質内に取り込まれた標識物質（被検物質）を単位時間ごとに検出することをいう。具体的な測定方法は下述する。 [Measurement of labeling substance (test substance) over time]
Measuring the labeling substance (test substance) over time means detecting the labeling substance (test substance) taken into the cytoplasm every unit time. The specific measurement method is described below.

［測定方法］
上述のように、本発明の方法は、米国特許第６，５１１，９６７号に開示されているような受容体−リガンドのイメージング技術をさらに応用したものである。本発明は、細胞の複数の情報をイメージデータを採取することで同時に解析する、いわゆるハイコンテント・スクリーニング（ＨＣＳ）のための細胞表面蛋白質−化合物の結合後の細胞内部への移動速度を測定することによりモニターするアッセイ法である。 [Measuring method]
As described above, the method of the present invention is a further application of the receptor-ligand imaging technique as disclosed in US Pat. No. 6,511,967. The present invention measures the rate of movement of a cell surface protein-compound after cell binding for so-called high content screening (HCS), in which a plurality of information of cells is analyzed simultaneously by collecting image data. It is an assay method to monitor by.

本発明のスクリーニング方法は、生細胞、固定細胞、もしくは、細胞溶解液を用いて実施されることが好ましく、スクリーニングのシグナルの細胞内分布、および前記スクリーニングのシグナルの強度を物質の被検物質の標識によって発生する検出可能なシグナルを光学的かつ定量的、経時的に測定されることを特徴とする。このシグナルは自動化された計測により検出されることが好ましい。   The screening method of the present invention is preferably carried out using living cells, fixed cells, or cell lysates, and the intracellular distribution of the screening signal and the intensity of the screening signal are determined based on the substance to be tested. The detectable signal generated by the label is measured optically, quantitatively and over time. This signal is preferably detected by automated measurement.

本発明者らは、これまでにイメージング法を用いて終点を定めた細胞表面上の蛋白質に対し結合する分子種の細胞内移行を確認してきた。一方、その過程で細胞表面上の蛋白質に対し結合する分子種のうち、細胞内への移行速度を経時的な観察により測定できることを見出した。   The present inventors have so far confirmed intracellular migration of molecular species that bind to a protein on the cell surface whose end point has been determined using an imaging method. On the other hand, it was found that, among the molecular species that bind to proteins on the cell surface in the process, the migration rate into the cell can be measured by observation over time.

本発明者においては、上述の既存スクリーニング法に速度論の概念と細胞内移行する事象を入れることにより、より複雑な反応系をスクリーニング可能な方法を提供することが可能になった。受容体のリガンドには蛋白質であるものも知られている。またその結合物が細胞表面から細胞内部へ移行する例も知られている。例えば、トランスフェリンという蛋白質は血液中の鉄イオンを運搬する役目を担う糖蛋白質として知られ、三価鉄イオン（Ｆｅ(ＩＩＩ)）を2つ結合する構造を有する。鉄イオンで飽和されたトランスフェリン（ホロトランスフェリン）が細胞表面のトランスフェリン受容体に出会うと、まず受容体との結合が生じ続いて細胞内部に小胞体として取り込まれる。細胞内部は酸性であるので、トランスフェリンは鉄イオンを遊離させ細胞に鉄イオンを供給している。その後、役目を終えたトランスフェリン受容体は再び細胞表面に戻り、新たなトランスフェリンを取り込む役目を果たすため再利用されることが知られている。一般に癌細胞は多くの新生血管を作り出すが、そのために細胞表面にはトランスフェリン受容体が数多く存在することが知られている。トランスフェリンをリガンドとして用いたスクリーニング系を組むことにより癌細胞に鉄を運ばせないための物質をスクリーニングすることができる。その際トランスフェリンが細胞膜上の受容体に結合させない物質をスクリーニングする系が考えられる。   The present inventor has been able to provide a method capable of screening a more complex reaction system by incorporating the concept of kinetics and an event of intracellular migration into the above existing screening method. Some receptor ligands are also known as proteins. In addition, an example in which the conjugate is transferred from the cell surface to the inside of the cell is also known. For example, a protein called transferrin is known as a glycoprotein responsible for transporting iron ions in blood, and has a structure that binds two trivalent iron ions (Fe (III)). When transferrin (holotransferrin) saturated with iron ions encounters a transferrin receptor on the cell surface, it first binds to the receptor and then is taken up into the cell as an endoplasmic reticulum. Since the cell interior is acidic, transferrin releases iron ions and supplies them to the cells. Thereafter, it is known that the transferrin receptor that has finished its role returns to the cell surface again and is reused to take up the role of taking up new transferrin. In general, cancer cells create many new blood vessels, and it is known that there are many transferrin receptors on the cell surface. By constructing a screening system using transferrin as a ligand, a substance for preventing cancer cells from carrying iron can be screened. In this case, a system for screening a substance that does not allow transferrin to bind to a receptor on the cell membrane is conceivable.

上記以外にも、一旦細胞内に入ったトランスフェリン−トランスフェリン受容体が細胞内に移行することを阻害する物質をスクリーニングする系、更には再利用され細胞表面に戻るための移動を疎外する物質をスクリーニングする系もその測定する経時反応をどこに設定するかを変えることで測定可能となる。   In addition to the above, screening system for substances that inhibit transferrin-transferrin receptor from entering the cell once inside the cell, and screening for substances that alienate the movement for reuse and return to the cell surface This system can also be measured by changing where the time-dependent reaction to be measured is set.

免疫組織化学および免疫細胞化学のこうした広範囲の技術は、まるごとの細胞（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）に対して適用することができる。発光、蛍光もしくは生物発光シグナルは、蛍光マルチウェルプレート・リーダ、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）、およびシグナルの空間分解能を有する細胞利用の自動イメージングシステムを含む種々の自動および／または高性能計測システムのうちの任意のシステムを用いて容易に検出および定量することができる。セロミクス社（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、ＧＥヘルスケア社、ＴＴＰ社、Ｑ３ＤＭ社、エボテック社（Ｅｖｏｔｅｃ）、ユニバーサル・イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）およびツァイス社（Ｚｅｉｓｓ）により開発された自動蛍光イメージングおよび自動顕微鏡システムなど、ＨＣＳを自動化するための種々の計測システムが開発されている。また、生細胞内の蛋白質の移動を検討するのに、光退色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）および経時的蛍光顕微鏡法（ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が用いられている。光退色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）および経時的蛍光顕微鏡法（ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）は処理能力が低いため多検体のスクリーニングには向かないため、このうち好ましくは、蛍光分光法、発光分光法、蛍光励起細胞分析法、螢光励起細胞分離法、自動化された顕微鏡法、もしくは、自動化されたイメージング法（automated imaging）である。   These extensive techniques of immunohistochemistry and immunocytochemistry can be applied to whole cells. Various automatic and / or high performance measurement systems including luminescent, fluorescent or bioluminescent signals, including fluorescent multi-well plate readers, fluorescent cell analyzers (FACS), and cell-based automated imaging systems with signal spatial resolution Can be easily detected and quantified using any of these systems. Automated fluorescence imaging and microscope systems developed by Cellomics, GE Healthcare, TTP, Q3DM, Evotech, Universal Imaging, and Zeiss, etc. Various measurement systems for automating HCS have been developed. In addition, fluorescence studies after photobleaching (FRAP) and temporal fluorescence microscopy (time lapse fluorescence microscopy) have been used to study the movement of proteins in living cells. Since fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and time-lapse fluorescence microscopy are not suitable for screening of multiple specimens because of their low processing capabilities, among these, fluorescence spectroscopy, emission spectroscopy, Fluorescence-excited cell analysis, fluorescence-excited cell separation, automated microscopy, or automated imaging.

光学的計測法およびハードウェアはあらゆる生物発光シグナルを高感度、高性能で検出することができるまで進歩した。これを利用して、例えば、リガンドその他の検出子は、フルオレセインもしくは別の蛍光体で直接標識することにより細胞表面の蛋白質への結合を検出することができ、シグナルを直接的に検出しその細胞内での位置までも確認することができる。   Optical metrology and hardware have advanced to the point where any bioluminescent signal can be detected with high sensitivity and high performance. Using this, for example, ligands and other detectors can detect binding to proteins on the cell surface by directly labeling with fluorescein or another fluorophore, and the signal can be detected directly. You can also check the position within.

本発明の方法においては、細胞の形態を認識させた上で細胞内の領域がどこであるかの位置決めが正確に行われている必要があるが、これらの位置決めにおいてもセロミクス社（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、ＧＥヘルスケア社、ＴＴＰ社、Ｑ３ＤＭ社、エボテック社（Ｅｖｏｔｅｃ）、ユニバーサル・イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）およびツァイス社（Ｚｅｉｓｓ）により開発された自動蛍光イメージングおよび自動顕微鏡システムなど、ＨＣＳとしての自動化計測システムが利用可能である。   In the method of the present invention, it is necessary to accurately determine the location of the intracellular region after recognizing the morphology of the cell. In this positioning as well, Cellomics, GE Automated measurement systems as HCS, including automated fluorescence imaging and automated microscope systems developed by Healthcare, TTP, Q3DM, Evotech, Universal Imaging, and Zeiss Is available.

本発明の方法においては、ＨＣＳを用い細胞の形態を認識させた上で細胞膜から細胞内移行する受容体−受容体結合分子の速度をモニターすることにより細胞内への取り込みを経時的に測定する。   In the method of the present invention, the uptake into cells is measured over time by monitoring the rate of receptor-receptor binding molecules that migrate into the cell from the cell membrane after recognizing the cell morphology using HCS. .

本発明のスクリーニングは、マルチウェルフォーマット、マイクロタイター・プレート、マルチスポットフォーマットもしくはアレイを用いて実施されることが好ましい。また、ベータカウンター、ガンマカウンターによるカウント測定により実施されることが好ましい。   The screening of the present invention is preferably carried out using a multiwell format, a microtiter plate, a multispot format or an array. Moreover, it is preferable to implement by the count measurement by a beta counter and a gamma counter.

本発明は、機能性物質の発見のための、特に細胞膜から細胞内への移行速度に特徴を有する物質を同定するための機能性物質のスクリーニング法である。適切な細胞膜蛋白質と相互作用する薬物を含む化合物や蛋白質またはその改変蛋白質、ランダムな配列から選択され細胞膜蛋白質と相互作用する蛋白質やペプチド、ランダムな化合物から選択された細胞膜蛋白質と相互作用するものについて、細胞膜から細胞内への移動速度を測定することによって、相互作用する物質に比べ細胞内移動速度の異なる物質をスクリーニングすることができる。この相互作用するペアは、細胞−細胞間の結合に関与する蛋白質ペア、受容体とリガンドまたは受容体に相互作用する薬物、もしくは適切な細胞膜蛋白質に対し相互作用するランダムな配列から選択された蛋白質およびペプチド、適切な細胞膜蛋白質と相互作用する機能未知の化合物より選択することができる。本明細書に記載した方法は蛍光標識蛋白質スクリーニング法であるが、その応用として発光やラジオアイソトープ標識などによる検出子によるスクリーニング法も構築することができる。   The present invention is a screening method of a functional substance for discovery of a functional substance, in particular, for identifying a substance having a characteristic in the rate of transition from a cell membrane into a cell. About compounds and proteins containing drugs that interact with appropriate cell membrane proteins or modified proteins thereof, proteins and peptides that are selected from random sequences and interact with cell membrane proteins, and those that interact with cell membrane proteins selected from random compounds By measuring the moving speed from the cell membrane into the cell, it is possible to screen substances having different intracellular moving speeds compared to the interacting substances. This interacting pair is a protein selected from a protein pair involved in cell-cell binding, a receptor and ligand or a drug that interacts with the receptor, or a random sequence that interacts with an appropriate cell membrane protein And a peptide or a compound of unknown function that interacts with an appropriate cell membrane protein. Although the method described in this specification is a fluorescently labeled protein screening method, a screening method using a detector such as luminescence or radioisotope labeling can be constructed as an application thereof.

スクリーニングにより得られた蛋白質または化合物のうち、例えば完全な抗体のような適切に細胞膜蛋白質と相互作用する標準物質に比べ細胞内移動速度がより遅い物質は細胞膜に局在し続け細胞内での分解から逃れられるため細胞膜上での効果が期待できる。例えばスクリーニングにより得られた蛋白質または化合物に抗原性を有する蛋白質や抗原性を有する化合物を付加することで生体内の免疫機構に認識されやすくなり、結合した細胞を選択的に識別し生体が除去するマーカーとして利用できる。また、相互作用する標準となる物質に比べ細胞内移動速度がより速い蛋白質は効果的に細胞内に入るため、蛋白質や化合物を付加することで細胞内への効率の良いキャリアーとして利用可能となる。例えば、相互作用する標準となる物質に比べ細胞内移動速度がより速い物質に細胞膜から細胞内に入って初めて活性化する抗癌剤を付加することで標準となる物質より高い細胞殺傷効果を得ること、細胞膜より更に核に近い位置にまで高効率で到達することを利用してラジオアイソトープで標識することによりDNA切断を効率よく起こすことを利用して細胞殺傷効果を増強することが可能となる。このように細胞膜から細胞内への移行速度に特徴を有する物質のスクリーニング法を構築する方法について説明する。これにより機能物質の発見に対する生物学的に新しい知見、基盤が得られる。   Of the proteins or compounds obtained by screening, substances with a slower intracellular movement rate than the standard substances that interact with cell membrane proteins appropriately, such as complete antibodies, continue to localize on the cell membrane and degrade in the cells The effect on the cell membrane can be expected because it escapes from the cell. For example, by adding an antigenic protein or an antigenic compound to a protein or compound obtained by screening, it becomes easy to be recognized by the immune system in the living body, and the living cells are selectively identified and removed by the living body. Can be used as a marker. In addition, proteins that move faster in the cell than interfering standard substances effectively enter the cell, so by adding proteins and compounds, it can be used as an efficient carrier into the cell. . For example, to obtain a higher cell killing effect than a standard substance by adding an anticancer agent that is activated only after entering the cell from the cell membrane to a substance that has a faster intracellular movement rate than the standard substance that interacts, It is possible to enhance the cell killing effect by utilizing the fact that DNA cleavage is efficiently performed by labeling with a radioisotope by using the fact that it reaches the position closer to the nucleus further than the cell membrane. A method for constructing a screening method for substances having characteristics of the migration rate from the cell membrane into the cell will be described. This provides a new biological knowledge and basis for the discovery of functional substances.

以下の実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

実施例１：
上皮細胞増殖因子受容体を多数細胞表面に発現していることで知られるヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１細胞を１５，０００個／ウェルにて９６ウェルプレートに播種し３７℃、５％炭酸ガスを供給したインキュベーター内で、ＭＥＭ・Ｅ培地に非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）溶液１％およびウシ胎児血清１０％（いずれもインビトロゲン・ギブコ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ）社）を添加した培地２００μＬの存在下で一晩培養した。翌日細胞をリン酸緩衝液（ダルベッコ、以下、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と記載）にて２回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ^TM３３３４２（(株)同仁化学研究所）２μＭとＬａｖａＣｅｌｌ^TM（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）２μＭにて５％炭酸ガスを供給したインキュベーター内で３７℃、３０分染色した。 Example 1:
A squamous cell carcinoma cell line A431 cell known to express a large number of epidermal growth factor receptors on the cell surface is seeded in a 96-well plate at 15,000 cells / well and incubated at 37 ° C. with 5% carbon dioxide. Overnight in the presence of 200 μL of medium supplemented with 1% non-essential amino acid (NEAA) solution and 10% fetal bovine serum (both from Invitrogen GIBCO) in MEM • E medium in the supplied incubator Cultured. The next day, the cells were washed twice with a phosphate buffer (Dulbecco, hereinafter referred to as D-PBS (pH 7.4)), Hoechst ^™ 33342 (Dojindo Laboratories) 2 μM and LavaCell ^™ (Active Motif) ) It dye | stained for 30 minutes at 37 degreeC in the incubator which supplied 5% carbon dioxide gas at 2 micromol.

Ｈｏｅｃｈｓｔ^TM３３３４２は生細胞にて核を染色し細胞の数を測定するためのものである。ＬａｖａＣｅｌｌ^TMは細胞膜および細胞質中に存在する小胞体やゴルジ体、核膜等を染め細胞全体を認識するために用いた。 Hoechst ^™ 33342 is for staining nuclei in living cells and measuring the number of cells. LavaCell ^™ was used to recognize the entire cell by staining the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, nuclear membrane, etc. present in the cell membrane and cytoplasm.

上記細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ）培養液にて２回洗浄後、同メディウム中に４０ｎMの上皮細胞成長因子受容体に対する蛍光標識したモノクローナル抗体Ｃ５２８（ＬａｂＶｉｓｉｏｎより購入）、ならびにＣ５２８より蛋白分解酵素ペプシンにより切断し精製したＦ（ａｂ’）₂を加え、３０、６０、１８０、３００分間５％炭酸ガスを供給したインキュベーター内で３７℃保温後ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培養液にて２回洗浄後新しいＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培養液を加え蛍光強度を測定した。 The cells were washed twice with FreeStyle293 (Invitrogen GIBCO) culture solution, and then the monoclonal antibody C528 (purchased from LabVision) labeled with 40 nM epidermal growth factor receptor in the same medium, and the protease pepsin from C528 F (ab ′) ₂ cleaved and purified by the method described above was added, kept at 37 ° C. in an incubator supplied with 5% carbon dioxide for 30, 60, 180, 300 minutes, washed twice with FreeStyle293 culture solution, and then a new FreeStyle293 culture solution was added. In addition, the fluorescence intensity was measured.

上記で用いたモノクローナル抗体Ｃ５２８ならびにＣ５２８より蛋白分解酵素ペプシンにより切断し精製したＦ（ａｂ’）₂は、ＡＬＥＸＡ ＦＵＬＯＲ^TMマイクロスケールプロテイン標識キットを用いＡＬＥＸＡ−４８８にて標識した。１分子当たりのＡＬＥＸＡ−４８８標識分子数はそれぞれ、７．２１、７．９５、５．１１であった。 The monoclonal antibodies C528 and C528 used above and F (ab ′) ₂ cleaved and purified from the protease by pepsin were labeled with ALEXA-488 using an ALEXA FULL ^™ microscale protein labeling kit. The numbers of ALEXA-488 labeled molecules per molecule were 7.21, 7.95, and 5.11, respectively.

ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥヘルスケア社）を用い、上記経過時間による各蛍光色素をイメージングデータとして取得した。Ｈｏｅｃｈｓｔ^TM３３４２の蛍光測定は、励起波長３６０±４０ｎｍ−測定波長４６０±４０ｎｍ、ＡＬＥＸＡ−４８８の蛍光測定は、励起波長４８０±４０ｎｍ−測定波長５３５±５０ｎｍ、ＬａｖａＣｅｌｌ^TMの蛍光測定は、励起波長４８０±４０ｎｍ−測定波長６２０で行った。蛍光標識による細胞染色結果の一部でＨｏｅｃｈｓｔ^TM３３４２、Ｃ５２８−ＡＬＥＸＡ−４８８標識物、ＬａｖａＣｅｌｌ^TMでの染色像、その透過光イメージの微分干渉像およびそれらの重ね合わせ画像（全て４０Ｘ）の経時的なイメージを代表例として図１に示す。 Using IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), each fluorescent dye according to the elapsed time was obtained as imaging data. The fluorescence measurement of Hoechst ^™ 3342 is excitation wavelength 360 ± 40 nm—measurement wavelength 460 ± 40 nm, the fluorescence measurement of ALEXA-488 is excitation wavelength 480 ± 40 nm—measurement wavelength 535 ± 50 nm, and the fluorescence measurement of LavaCell ^™ is excitation wavelength 480 ± 40 nm-performed at a measurement wavelength of 620. Part of the results of cell staining with fluorescent labeling, Hoechst ^™ 3342, C528-ALEXA-488 labeled product, LavaCell ^™ stained image, differential interference image of the transmitted light image and their superimposed images (all 40X) over time A typical image is shown in FIG. 1 as a representative example.

数値化定量は、細胞形態をＬａｖａＣｅｌｌ^TM染色像にて機械認識させ、その領域内部を細胞質と考え、その領域内に存在するＡＬＥＸＡ−４８８由来の顆粒（Ｇｒａｎｕｌｅ）蛍光を機械認識させ染色強度を数値化後Ｈｏｅｃｈｓｔ^TM３３４２染色による球形の染色像を1個の細胞と数えその細胞数で除した。一連の計算は機器添付のＤｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｓソフトウェアにより自動化した計算を行うためのバッチ処理により行なった。 In numerical quantification, cell morphology is machine-recognized with a LavaCell ^TM stained image, the inside of the region is considered as cytoplasm, and ALEXA-488-derived granule fluorescence present in the region is machine-recognized, and the staining intensity is numerically determined. Spherical stained images by Hoechst ^™ 3342 staining were counted as one cell and divided by the number of cells. A series of calculations was performed by batch processing for performing automated calculations using the Developer Tools software attached to the device.

３０、６０、１８０、３００分後の蛍光染色抗体による細胞内顆粒蛍光強度シグナルを数値化し、Ｃ５２８−ＡＬＥＸＡ−４８８標識の１分子当たりのＡＬＥＸＡ−４８８標識分子数７．９５を基準としてＣ５２８より蛋白分解酵素ペプシンにより切断し精製したＦ（ａｂ’）₂の蛍光強度をその比蛍光分子数で補正したグラフおよびその一次回帰直線を図２に示した。 Intracellular granule fluorescence intensity signal by fluorescent staining antibody after 30, 60, 180, 300 minutes was digitized, and protein from C528 based on the number of ALEXA-488 labeled molecules 7.95 per molecule of C528-ALEXA-488 label FIG. 2 shows a graph in which the fluorescence intensity of F (ab ′) ₂ cleaved and purified by the degrading enzyme pepsin is corrected by the number of specific fluorescent molecules and its linear regression line.

Ｃ５２８ならびにＣ５２８由来Ｆ（ａｂ’）₂が細胞表面上の上皮細胞増殖因子受容体に結合後、細胞内移行した顆粒の形成速度は図２よりＣ５２８由来Ｆ（ａｂ’）₂＞Ｃ５２８の順に速いことが測定された。蛍光強度値（ＲＬＵ）は機器に依存するため、絶対比較可能な値ではないが細胞内移行した顆粒の形成速度は図２の傾きからＣ５２８が１２２．３ＲＬＵ／分、Ｃ５２８由来Ｆ（ａｂ‘）２が１８３．２ＲＬＵ／分となった。これにより細胞内への効率の良い抗体送達のためには、Ｃ５２８は優れており、その切断物であるＣ５２８由来Ｆ（ａｂ’）₂が更に優れていることがスクリーニングにより選別された。 After C528 and C528-derived F (ab ′) ₂ bind to the epidermal growth factor receptor on the cell surface, the rate of formation of granules that migrated into the cell is faster from FIG. 2 in the order of C528-derived F (ab ′) ₂ > C528. It was measured. Since the fluorescence intensity value (RLU) depends on the instrument, it is not a value that can be compared absolutely, but the rate of formation of granules migrated into the cell is 122.3 RLU / min for C528 and C528-derived F (ab ′) from the slope of FIG. 2 was 183.2 RLU / min. As a result, C528 was excellent for efficient antibody delivery into the cell, and C528-derived F (ab ′) _{2, which} was a cleavage product, was further selected by screening.

図１および図２の結果から、細胞内移行する細胞表面の蛋白質に結合し、細胞内移行する可能性のある分子群を検出子により標識し、生細胞を用いた細胞内移行速度をイメージングにより測定し移行速度を算出することができた。すなわち移行速度はＣ５２８＜Ｃ５２８由来Ｆ（ａｂ‘）２の順に早くなる。得られた細胞表面の蛋白質に結合し、細胞内移行する分子のうち移行速度が速いもの、遅いものを選別しその移動速度の差から生理活性を有する候補分子を得ることが可能となる。   From the results of FIG. 1 and FIG. 2, a group of molecules that bind to a cell surface protein that migrates into the cell and possibly migrate into the cell is labeled with a detector, and the intracellular migration rate using live cells is imaged. Measurement and migration speed could be calculated. That is, the transition speed increases in the order of C528 <C528-derived F (ab ′) 2. Among the molecules that bind to the obtained cell surface proteins and migrate into the cell, those having a fast transition speed and those having a slow transition speed are selected, and candidate molecules having physiological activity can be obtained from the difference in the migration speed.

図１は、Ａ４３１細胞を用いたＨｏｅｃｈｓｔ^TM３３４２による核染色イメージ、ＡＬＥＸＡ−４８８標識Ｃ５２８による細胞内染色イメージ、ＬａｖａＣｅｌｌ^TMによる細胞全体にわたる染色イメージ、透過光イメージの微分干渉像を４０ｎＭのＡＬＥＸＡ−４８８標識Ｃ５２８の存在下３０、６０、１８０、３００分間それぞれで４０倍画像イメージを採取した結果を示す。FIG. 1 shows a nuclear staining image using Hoechst ^™ 3342 using A431 cells, an intracellular staining image using ALEXA-488-labeled C528, a staining image over the whole cell using LavaCell ^™ , and a differential interference image of 40 nM ALEXA-488. The results of taking 40 times image images for 30, 60, 180, and 300 minutes in the presence of the label C528 are shown. 図２は、Ａ４３１細胞を用いたＣ５２８、Ｃ５２８由来Ｆ（ａｂ’）₂の細胞内顆粒として存在するＡＬＥＸＡ−４８８標識シグナルの数値化データを、それぞれ４０ｎＭのＡＬＥＸＡ−４８８標識Ｃ５２８の存在時間の違いにより３０、６０、１８０、３００分間測定し、縦軸に細胞１個当たりの蛍光強度数値、横軸に処理時間をプロットしたグラフを示す。Ｃ５２８由来Ｆ（ａｂ’）₂の蛍光強度はＣ５２８の１分子当たりの蛍光分子標識数に合わせるためＣ５２８の標識比を乗じた。FIG. 2 shows the digitized data of ALEXA-488-labeled signals existing as intracellular granules of C528 and C528-derived F (ab ′) ₂ using A431 cells, and the difference in the duration of 40 nM ALEXA-488-labeled C528, respectively. Measured for 30, 60, 180, and 300 minutes, the vertical axis represents the fluorescence intensity value per cell, and the horizontal axis represents the processing time. The fluorescence intensity of C528-derived F (ab ′) ₂ was multiplied by the C528 labeling ratio in order to match the number of fluorescent molecule labels per molecule of C528.

Claims (5)

検出可能な標識物質で標識された被検物質を、細胞膜上に蛋白質を有する細胞に接触させる工程、及び該細胞の細胞質内における標識物質を経時的に測定することによって細胞質内における被検物質を経時的に測定する工程を含む、細胞膜上に存在する蛋白質に対して相互作用する物質のスクリーニング方法。 A test substance labeled with a detectable labeling substance is brought into contact with a cell having a protein on the cell membrane, and the test substance in the cytoplasm is measured by measuring the labeling substance in the cytoplasm of the cell over time. A screening method for a substance that interacts with a protein present on a cell membrane, comprising a step of measuring over time. 細胞質内における被検物質を経時的に測定することによって、被検物質が細胞膜から細胞質に移行する速度を測定する、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the rate at which the test substance moves from the cell membrane to the cytoplasm is measured by measuring the test substance in the cytoplasm over time. 上記細胞膜上の蛋白質が、細胞−細胞間の結合に関与する蛋白質、受容体、受容体の一部であって細胞外部分の切断後細胞表面に残存する蛋白質、細胞間の蛋白−蛋白相互作用による細胞間シグナル伝達を担う蛋白質、細胞膜上の酵素、細胞表面チャネル、細胞表面トランスポーター、細胞膜結合抗体、及び上記と複合体を形成する蛋白質からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項１又は２に記載の方法。 The protein on the cell membrane is a protein involved in cell-cell binding, a receptor, a part of the receptor, a protein remaining on the cell surface after cleavage of the extracellular part, and a protein-protein interaction between cells 2. A protein selected from the group consisting of a protein responsible for intercellular signal transduction, an enzyme on a cell membrane, a cell surface channel, a cell surface transporter, a cell membrane-bound antibody, and a protein that forms a complex with the above. 2. The method according to 2. 上記被検物質が、細胞−細胞間の結合に関与する蛋白質ペア、受容体に相互作用するリガンド分子、受容体に相互作用する薬物、細胞膜上に存在する蛋白質に対し相互作用するランダムな配列から選択された蛋白質又はペプチド、細胞間の蛋白−蛋白によるシグナル伝達蛋白質、核酸、細胞膜酵素基質、抗体、抗原、及び細胞膜上に存在する蛋白質と相互作用する機能未知の化合物からなる群から選ばれる物質である、請求項１から３の何れかに記載の方法。 From the protein pair involved in cell-cell binding, ligand molecules that interact with receptors, drugs that interact with receptors, and random sequences that interact with proteins present on the cell membrane. Substance selected from the group consisting of selected protein or peptide, intercellular protein-protein signaling protein, nucleic acid, cell membrane enzyme substrate, antibody, antigen, and compound with unknown function that interacts with protein present on cell membrane The method according to claim 1, wherein: 上記検出可能な標識物質が、（i）蛍光化合物、(ii)蛍光蛋白質、(iii) 蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法のための標識物質、(iv)ラジオアイソトープ標識物質、又は(v)バイオルミネセンス、化学発光、リン光、又は酵素発色による検出が可能な標識物質である、請求項１から４の何れかに記載の方法。 The detectable labeling substance is (i) a fluorescent compound, (ii) a fluorescent protein, (iii) a labeling substance for the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method, (iv) a radioisotope labeling substance, or (v) a bio The method according to any one of claims 1 to 4, which is a labeling substance that can be detected by luminescence, chemiluminescence, phosphorescence, or enzyme color development.