JP2009247256A - Method for stabilizing tyramine oxidase and composition thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、チラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法および該方法により安定化された組成物に関するものである。 The present invention relates to a method for stabilizing tyramine oxidase in a solution and a composition stabilized by the method.
チラミンオキシダーゼは、これまで生体アミンの測定や、食品分野におけるチラミン測定、およびＢＴＲ（Ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｔｙｒｏｓｉｎ Ｒａｔｉｏ）測定におけるチロシン測定試薬に使用されてきている。
例えば、特許文献１にはチラミンオキシダーゼを用いた生体アミンの測定方法が開示されている。また、特許文献２においては、チラミンオキシダーゼを用いたチラミンの測定方法が開示されており、食品の品質管理用途としての利用が記載されている。特許文献３には電気化学的手法を用いたチラミンとヒスタミンの分別定量方法が開示されている。
For example,
また、特許文献４および５には、電極を用いない酵素法を用いたチロシン測定法が開示されており、臨床診断用途としての利用が記載されている。
特許文献４には、チロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンにチラミンオキシダーゼを作用させることにより過酸化水素を発生させ、この過酸化水素を利用し、ペルオキシダーゼの存在下、ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン。別名Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン）と４−アミノアンチピリンを反応させ、発色に導く過酸化水素検出系にてチロシンを測定する方法が開示されている。
特許文献５には、上記のチロシン測定方法において、チロシンデカルボキシラーゼ（ビタミンＢ６酵素）の活性発現を安定化させることにより、チロシン測定試薬の安定性を向上させる方法が開示されている。
In Patent Document 4, tyrosine decarboxylase is allowed to act on tyrosine, and tyramine oxidase is allowed to act on the generated tyramine to generate hydrogen peroxide. Using this hydrogen peroxide, TOOS (N- Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine, also known as N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline) and 4-aminoantipyrine. A method for measuring tyrosine in a hydrogen peroxide detection system that leads to color development is disclosed.
Patent Document 5 discloses a method for improving the stability of a tyrosine measurement reagent by stabilizing the activity expression of tyrosine decarboxylase (vitamin B6 enzyme) in the above tyrosine measurement method.
これまで、病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化のため凍結乾燥品の形態で流通し、使用時に溶解液で溶解して使用するのが主流となっている。慢性肝炎から肝硬変への移行診断に用いられる、ＢＴＲ測定用試薬（総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定試薬）は、ＢＣＡＡ（総分岐鎖アミノ酸）測定試薬とＴＹＲ（チロシン）測定試薬がセットになっており、ＢＴＲ測定用試薬も各々酵素、色素などが不安定であり凍結乾燥品の形態で流通している。なお、総分岐鎖アミノ酸とはＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンのことを指す。
一方、臨床検査施設では、多項目を測定し検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になることが多く、使用時に試薬の調製が不要な溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。ＢＴＲ測定用試薬に関しても同様であり溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。
Until now, among the clinical laboratory drugs used in hospital laboratories and laboratories, reagents that use unstable enzymes have been distributed in the form of lyophilized products for stabilization and dissolved at the time of use. It is mainly used by dissolving in a liquid. The BTR measurement reagent (total branched chain amino acid / tyrosine molar ratio measurement reagent) used for diagnosis of transition from chronic hepatitis to cirrhosis is a set of BCAA (total branched chain amino acid) measurement reagent and TYR (tyrosine) measurement reagent. In addition, BTR measurement reagents are also unstable in enzymes, dyes, etc., and are distributed in the form of freeze-dried products. The total branched chain amino acid refers to L-leucine, L-isoleucine, and L-valine.
On the other hand, in clinical laboratories, because many items are measured and the number of specimens is large, it is often a burden to dissolve freeze-dried products. Development is desired. The same applies to the BTR measurement reagent, and the development of a measurement reagent that is stable for a long time in a solution state is desired.
また、上記以外の新たな問題点として、本発明者らは、試薬中のチラミンオキシダーゼが光照射の影響により失活することを見出した。特に、ＪＩＳ照度基準が定める一般的な生活環境下における照度範囲である７５〜７５０ルクスにおいても、光照射の影響により失活が見られた。特に、３００ルクス以上の光照射条件下においては、失活がより顕著であった。すなわち、製造中、輸送中、使用先での保存中など日常考えうる範囲内での光照射条件下において、チラミンオキシダーゼが光により失活することを見出した。 Further, as a new problem other than the above, the present inventors have found that tyramine oxidase in the reagent is inactivated by the influence of light irradiation. In particular, deactivation was observed due to the effect of light irradiation even in the illuminance range of 75 to 750 lux, which is a general illuminance range defined by the JIS illuminance standards. In particular, deactivation was more remarkable under light irradiation conditions of 300 lux or more. That is, the present inventors have found that tyramine oxidase is inactivated by light under light irradiation conditions within a daily conceivable range such as during production, transportation, and storage at the place of use.
上記の様に、チラミンオキシダーゼを用いる試薬においては、液状化および自動化のニーズに合致した形態をとることが課題である。すなわち、本発明が解決しようとする課題は、自動分析機での測定において、他の測定項目に影響を及ぼさない形態であり、かつ（試薬中で長期に渡って冷蔵条件、加温条件、光照射条件において安定であるチラミンオキシダーゼ組成物を提供することにある。 As described above, the reagent using tyramine oxidase has a problem of taking a form that meets the needs of liquefaction and automation. That is, the problem to be solved by the present invention is a form that does not affect other measurement items in measurement with an automatic analyzer, and (refrigeration conditions, heating conditions, light, It is to provide a tyramine oxidase composition that is stable under irradiation conditions.
上記特許文献１ないし５には、チラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法に関して特に記載はなく、また、そのような方法を示唆するような記載もない。
In
上記課題に鑑み、本発明者らは、鋭意検討した結果、チラミンオキシダーゼを含む溶液に、キレート剤を共存させることにより、長期（冷蔵）保存安定性、熱安定性、および光に対する安定性を向上させることに成功し本発明の完成に至った。すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］
チラミンオキシダーゼを含む溶液に、金属と陰性の酸基からなる化合物を共存させることを特徴とする、チラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項２］
一般式（１）または、一般式（２）で表されるアニリン系水素供与体を共存させる、項１に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
（式中、Ｒ１はＣ２Ｈ５またはＨのいずれか、Ｒ２はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれか、Ｒ３はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれかである。）
［項３］
金属がナトリウム、カリウム、リチウムまたはマグネシウムよりなる群から選択される少なくとも一つの物質であり、陰性の酸基が塩素、臭素、ヨウ素、硫酸、酢酸または、リン酸よりなる群より選択される少なくとも一つの物質である、項１または２に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項４］
チラミンオキシダーゼを含む溶液が、チロシン測定試薬に含まれるものである、項１〜３のいずれかに記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項５］
チロシン測定試薬が、チラミンオキシダーゼ、アニリン系水素供与体、金属と陰性の酸基からなる化合物を第一試液に含み、チロシンデカルボキシラーゼおよびカップラーを第二試液に含む構成を有する、項１〜４のいずれかに記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項６］
カップラーが４−アミノアンチピリンである、項５に記載のチラミンオキシダーゼの溶液中での安定化方法。
［項７］
項１〜６のいずれかに記載の方法により安定化された、チラミンオキシダーゼを含有する溶液。
［項８］
項７に記載の溶液を含む、チロシン測定試薬。
In view of the above problems, as a result of intensive studies, the present inventors have improved the long-term (refrigerated) storage stability, thermal stability, and light stability by allowing a chelating agent to coexist in a solution containing tyramine oxidase. The present invention was completed successfully. That is, the present invention has the following configuration.
[Claim 1]
A method for stabilizing tyramine oxidase in a solution, wherein a compound comprising a metal and a negative acid group is allowed to coexist in a solution containing tyramine oxidase.
[Section 2]
(In the formula,
[Section 3]
The metal is at least one substance selected from the group consisting of sodium, potassium, lithium or magnesium, and the negative acid group is at least one selected from the group consisting of chlorine, bromine, iodine, sulfuric acid, acetic acid or phosphoric acid Item 3. A method for stabilizing tyramine oxidase according to
[Claim 4]
Item 4. The method for stabilizing tyramine oxidase in a solution according to any one of
[Section 5]
[Claim 6]
[Claim 7]
[Section 8]
本発明によれば、チラミンオキシダーゼを含む溶液において、チラミンオキシダーゼの冷蔵安定性、熱安定性、および光に対する安定性を著しく向上させることができる。 According to the present invention, in a solution containing tyramine oxidase, the refrigeration stability, thermal stability, and light stability of tyramine oxidase can be significantly improved.
本発明において「安定」とは以下の３種の保存状態において、未処理の試薬と比較した場合のチラミンオキシダーゼの残存活性が、以下（１）〜（３）の条件をすべて満たすことを指す。
（１）冷蔵安定性；１０℃保存における安定性。具体的には、１０℃で１４日間保存後の安定性が未処理の試薬と比較し８５％以上であること。
（２）熱安定性；加温処理後の安定性。具体的には、３７℃で１４日間加温処理後の安定性が未処理の試薬と比較し６０％以上であること。
（３）光安定性；光照射後の安定性。具体的には、１０℃の保存条件で、褐色容器内に試薬を保管し、試薬を含有する該容器を５００ルクスで１４日間処理した後の安定性が、未処理の試薬と比較し６０％以上であること。容器の材質としては、臨床化学分野で診断薬に用いられものであれば特に限定されないが、ポリエチレンやポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
In the present invention, “stable” means that the remaining activity of tyramine oxidase when compared with an untreated reagent satisfies all of the following conditions (1) to (3) in the following three storage states.
(1) Refrigerated stability; stability at 10 ° C storage. Specifically, the stability after storage at 10 ° C. for 14 days is 85% or more compared to untreated reagents.
(2) Thermal stability; stability after heating treatment. Specifically, the stability after heating for 14 days at 37 ° C. is 60% or more compared to untreated reagents.
(3) Light stability; stability after light irradiation. Specifically, the stability after storing the reagent in a brown container under a storage condition of 10 ° C. and treating the container containing the reagent with 500 lux for 14 days is 60% compared to the untreated reagent. That's it. The material of the container is not particularly limited as long as it is used as a diagnostic agent in the clinical chemistry field, and examples thereof include polyethylene and polyethylene terephthalate.
本発明の安定化方法の対象は、チラミンオキシダーゼを含む溶液である。
そのような溶液の一形態としては、下記の［１］に例示するチロシン測定方法を実施するためのチロシン測定試薬に含まれるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
The object of the stabilization method of the present invention is a solution containing tyramine oxidase.
As one form of such a solution, although what is contained in the tyrosine measuring reagent for enforcing the tyrosine measuring method illustrated to following [1] is mentioned, it is not limited to this.
［１］チロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンにチラミンオキシダーゼを作用させることにより過酸化水素を発生させる。この発生した過酸化水素を利用し、ペルオキシダーゼの存在下、水素供与体とカップラーを反応させ、発色に導く過酸化水素検出系にて測定する、チロシン測定方法。 [1] Tyrosine decarboxylase is allowed to act on tyrosine, and tyramine oxidase is allowed to act on the produced tyramine to generate hydrogen peroxide. A tyrosine measurement method in which the generated hydrogen peroxide is used to react with a hydrogen donor and a coupler in the presence of peroxidase, and measurement is performed with a hydrogen peroxide detection system that leads to color development.
特に、下記の式（１）で表される反応を用いることが好ましい。
また、そのようにして安定化された、チラミンオキシダーゼを含む溶液、または、該溶液を含むチロシン測定試薬も、本発明に包含される。 Moreover, the solution containing tyramine oxidase stabilized as described above, or a tyrosine measurement reagent containing the solution is also encompassed in the present invention.
本発明のチロシン測定試薬における試薬構成としては、チラミンオキシダーゼ、アニリン系水素供与体、キレート剤を第一試液に含み、チロシンデカルボキシラーゼおよびカップラーを第二試液に含むことを特徴とするチロシン測定液状試薬が考えられる。なお、ペルオキシダーゼは第一試薬、および第二試薬のどちらに配置されても良いが、第一試薬に配置されることがチラミンオキシダーゼの安定性向上の観点からより好ましい。 The reagent composition in the tyrosine measuring reagent of the present invention includes a tyramine oxidase, an aniline hydrogen donor, a chelating agent in the first reagent, and a tyrosine decarboxylase and a coupler in the second reagent. Can be considered. In addition, although peroxidase may be arrange | positioned in any of a 1st reagent and a 2nd reagent, it is more preferable from a viewpoint of stability improvement of a tyramine oxidase to arrange | position to a 1st reagent.
本発明のチロシン測定試薬に含まれるチラミンオキシダーゼを含む溶液は、凍結乾燥試薬（液状で不安定な酵素などを凍結乾燥しておき、使用時に溶解液と混合し、液状にして用いる試薬）、ドライケミストリー試薬（分析に必要な全ての試薬が乾燥状態で用意されており、使用時に試料から持ち込まれる水分を利用して反応させる試薬）、液状試薬、のいずれの形態であってもよいが、特に液状試薬であることが好ましい。
本発明のチロシン測定試薬は、汎用自動分析装置で取り扱える試薬構成であれば、特に限定されないが、２ないし４のパーツで構成されることが望ましい。（好ましくは２つのパーツで構成される２試薬系がよい。）
すなわち、２ないし４のパーツで構成される液状試薬であることが好ましい。（好ましくは２つのパーツで構成される液状試薬がよい。）
The solution containing tyramine oxidase contained in the tyrosine assay reagent of the present invention is a freeze-dried reagent (a reagent that is lyophilized from a liquid and unstable enzyme and mixed with a lysate at the time of use and used in a liquid state), dry Chemistry reagents (all reagents necessary for analysis are prepared in a dry state and are made to react using moisture brought in from the sample at the time of use) and liquid reagents may be used. A liquid reagent is preferred.
The tyrosine measurement reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is a reagent configuration that can be handled by a general-purpose automatic analyzer, but it is preferably composed of 2 to 4 parts. (Preferably, a two-reagent system composed of two parts is good.)
That is, the liquid reagent is preferably composed of 2 to 4 parts. (A liquid reagent composed of two parts is preferable.)
本発明のチロシン測定試薬の測定対象物である生体試料としては、特に限定されないが、血清あるいは血漿もしくは、全血あるいは、尿であることが好ましい。 The biological sample that is the measurement target of the tyrosine measurement reagent of the present invention is not particularly limited, but is preferably serum, plasma, whole blood, or urine.
本発明に用いるチラミンオキシダーゼは、ＥＣ１．４．３．４に分類されるアミンオキシダーゼであり、例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ由来のものが、東洋紡社、旭化成ファーマ社から入手できるが、起源および入手先は特に限定されない。
本発明試薬における、チラミンオキシダーゼの添加配置としては、第一試液および第二試液のどちらでも良いが、第一試液に添加することがより好ましい。
本発明で用いられるチラミンオキシダーゼ濃度の好ましい下限としては、試薬中に０．０１Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５Ｕ／Ｌである。好ましい上限としては、試薬中に２０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは１０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは５Ｕ／Ｌである。
また、チラミンオキシダーゼを含有する試薬のｐＨの好ましい下限としては、ｐＨ５．５、さらに好ましくは、ｐＨ６．０である。好ましい上限としては、ｐＨ９．０、さらに好ましくはｐＨ８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５である。
The tyramine oxidase used in the present invention is an amine oxidase classified as EC 1.4.3.4. For example, those derived from Arthrobacter sp can be obtained from Toyobo and Asahi Kasei Pharma. It is not limited.
The tyramine oxidase may be added to the reagent of the present invention either in the first reagent solution or the second reagent solution, but more preferably in the first reagent solution.
The preferable lower limit of the tyramine oxidase concentration used in the present invention is 0.01 U / L, more preferably 0.05 U / L in the reagent. As a preferable upper limit, it is 20 U / L in a reagent, More preferably, it is 10 U / L, More preferably, it is 5 U / L.
Moreover, as a preferable minimum of pH of the reagent containing tyramine oxidase, it is pH 5.5, More preferably, it is pH 6.0. The upper limit is preferably pH 9.0, more preferably pH 8.0, and still more preferably pH 7.5.
本発明に用いることができる金属化合物としては、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオンと硫酸、硝酸、炭酸などの無機酸との塩、ヨウ素、臭素、塩素等のハロゲン原子との塩、または酢酸、グルコン酸、プロピオン酸、パンテント酸、エチレンジアミン四酢酸などの有機酸との塩、が挙げられる。特に、チラミンオキシダーゼの安定化に顕著な効果が見られるものとして、塩素原子の金属塩が挙げられ、中でも塩化ナトリウムを用いることが好ましく、チラミンオキシダーゼ、アニリン系水素供与体、およびキレート剤が含まれる試薬に配置することでチラミンオキシダーゼの安定性がさらに向上する。濃度としては、好ましい下限として試薬中０．００１重量％、より好ましくは０．０１重量％、さらに好ましくは０．１％重量％である。好ましい上限は、試薬中１０重量％、より好ましくは５．０重量％、さらに好ましくは２．０％重量％である。
また、生体試料中の還元物質の影響回避剤としては、上記金属化合物のうち、鉄イオンが好ましく、エチレンジアミン四酢酸鉄（III）、塩化第一鉄（III）、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等が挙げられる。金属化合物の濃度としては、好ましい下限として試薬中に０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は、試薬中に５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
またこれらの金属化合物は複数組み合わせて用いることができる。
Examples of metal compounds that can be used in the present invention include alkali metal ions, alkaline earth metal ions, manganese ions, iron ions, cobalt ions, nickel ions and salts with inorganic acids such as sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid, iodine, bromine And salts with halogen atoms such as chlorine, or salts with organic acids such as acetic acid, gluconic acid, propionic acid, pantentic acid and ethylenediaminetetraacetic acid. In particular, a metal salt of a chlorine atom can be mentioned as a remarkable effect in stabilizing tyramine oxidase. Among them, sodium chloride is preferably used, and includes tyramine oxidase, aniline hydrogen donor, and chelating agent. By placing it in the reagent, the stability of tyramine oxidase is further improved. The concentration is preferably 0.001% by weight, more preferably 0.01% by weight, and still more preferably 0.1% by weight in the reagent as a preferred lower limit. A preferable upper limit is 10% by weight in the reagent, more preferably 5.0% by weight, and still more preferably 2.0% by weight.
Moreover, as an agent for avoiding the influence of a reducing substance in a biological sample, iron ions are preferable among the above metal compounds, such as iron (III) ethylenediaminetetraacetate, ferrous chloride (III), potassium ferrocyanide, sodium ferrocyanide, and the like. Is mentioned. The concentration of the metal compound is preferably 0.05 mmol / L, more preferably 0.1 mmol / L in the reagent as a preferable lower limit. A preferable upper limit is 5 mmol / L in a reagent, More preferably, it is 0.5 mmol / L.
A plurality of these metal compounds can be used in combination.
本発明で用いられるキレート剤としては、グルコン酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸、クエン酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、ピルビン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロトリスメチレンホスホン酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、または、それらの塩が挙げられる。
本発明の構成は、これらの群より選ばれる少なくとも１種以上のキレート剤をチラミンオキシダーゼとアニリン系水素供与体を含む試薬に含むことからなる。
チラミンオキシダーゼとアニリン系水素供与体を含む試薬中への、キレート剤の添加濃度の好ましい下限としては、０．０１ｍＭ、さらに好ましくは０．０５ｍＭ、さらに好ましくは０．０７５ｍＭである。好ましい上限としては、２００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭ、さらに好ましくは１０ｍＭである。
Examples of the chelating agent used in the present invention include gluconic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, ethylenediaminedipropionic acid, bis (aminophenyl) ethyleneglycoltetraacetic acid, citric acid, tartaric acid, N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, N , N-bis (2-hydroxyethyl) glycine, N- (2-acetamido) iminodiacetic acid, pyruvic acid, glycol ether diamine tetraacetic acid, hydroxyethylenediamine triacetic acid, hydroxyethyliminodiacetic acid, nitrilotriacetic acid, nitrilotrismethylene A phosphonic acid, a triethylenetetramine hexaacetic acid, or those salts are mentioned.
The constitution of the present invention comprises at least one chelating agent selected from these groups in a reagent containing tyramine oxidase and an aniline hydrogen donor.
The preferable lower limit of the addition concentration of the chelating agent in the reagent containing tyramine oxidase and the aniline-based hydrogen donor is 0.01 mM, more preferably 0.05 mM, and further preferably 0.075 mM. A preferred upper limit is 200 mM, more preferably 50 mM, and even more preferably 10 mM.
本発明に用いる、一般式（１）で表されるアニリン系水素供与体としては、例えば表１のものが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。
本発明で用いられるアニリン系水素供与体の濃度の好ましい下限としては、試薬中に０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限としては、試薬中に５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
また、アニリン系水素供与体は、チラミンオキシダーゼを含む試薬に添加されることが好ましい。本発明におけるアニリン系水素供与体の本来の使用用途は、カップラーと組み合わせて発色定量させることであるが、チラミンオキシダーゼをさらに安定化させる効果も有している点で好ましい。特に、発色定量用途にロイコ色素を用いる場合、好ましい安定化効果を有する。
As the aniline-based hydrogen donor represented by the general formula (1) used in the present invention, for example, those shown in Table 1 are preferable, and N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline, N-ethyl-N- Sulfopropylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline, N- Ethyl-N-sulfopropyl-3-methylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) Aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- (2-hydroxy-3-sulfop Pill) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-Methoxyaniline, N-sulfopropylaniline, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -2,5-dimethylaniline and the like.
A preferable lower limit of the concentration of the aniline-based hydrogen donor used in the present invention is 0.01 mmol / L, more preferably 0.05 mmol / L in the reagent. As a preferable upper limit, it is 50 mmol / L in a reagent, Preferably it is 10 mmol / L.
The aniline-based hydrogen donor is preferably added to a reagent containing tyramine oxidase. The original use of the aniline-based hydrogen donor in the present invention is to quantify coloration in combination with a coupler, which is preferable in that it also has an effect of further stabilizing tyramine oxidase. In particular, when a leuco dye is used for color determination, it has a preferable stabilizing effect.
本発明で用いられる、チロシンデカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．２５に分類され、Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｃｈａｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｒｕｇｏｓｕｍ由来のものが挙げられるが、特に起源は特に限定されない。
添加配置としては、チラミンオキシダーゼとアニリン系水素供与体およびキレート剤を含む試薬と別配置であることが好ましい。
濃度としては、好ましい下限としては試薬中０．０１Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．１Ｕ／Ｌである。好ましい上限としては試薬中１００Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは５０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは１０Ｕ／Ｌである。
また、チロシンデカルボキシラーゼを含有する試薬のｐＨとしては、チロシンデカルボキシラーゼの長期冷蔵安定性を鑑み、好ましい下限はｐＨ５．５、さらに好ましくはｐＨ６．０である。好ましい上限はｐＨ９．０、さらに好ましくはｐＨ８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５である。
The tyrosine decarboxylase used in the present invention is classified into EC 4.1. Not.
The addition arrangement is preferably different from the reagent containing tyramine oxidase, aniline hydrogen donor and chelating agent.
As a concentration, a preferable lower limit is 0.01 U / L in the reagent, more preferably 0.05 U / L, and further preferably 0.1 U / L. As a preferable upper limit, it is 100 U / L in a reagent, More preferably, it is 50 U / L, More preferably, it is 10 U / L.
Moreover, as for the pH of the reagent containing tyrosine decarboxylase, in view of the long-term refrigeration stability of tyrosine decarboxylase, the preferable lower limit is pH 5.5, more preferably pH 6.0. A preferable upper limit is pH 9.0, more preferably pH 8.0, and further preferably pH 7.5.
本発明で用いるチロシンデカルボキシラーゼの補酵素としては、ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）、ピリドキサミン５’−リン酸（ＰＭＰ）が挙げられる。添加配置は、チロシンデカルボキシラーゼを含有しない試薬、すなわちチロシンデカルボキシラーゼと別配置にすることがチロシンデカルボキシラーゼの安定性を向上させるうえで好ましい。濃度としては、好ましい下限は試薬中で０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は試薬中で１０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、である。 Examples of coenzymes for tyrosine decarboxylase used in the present invention include pyridoxal 5'-phosphate (PLP) and pyridoxamine 5'-phosphate (PMP). In order to improve the stability of the tyrosine decarboxylase, it is preferable that the addition arrangement be a reagent that does not contain the tyrosine decarboxylase, that is, a tyrosine decarboxylase. As a concentration, a preferable lower limit is 0.001 mmol / L, more preferably 0.01 mmol / L in the reagent. A preferred upper limit is 10 mmol / L, more preferably 5.0 mmol / L, and still more preferably 2.0 mmol / L in the reagent.
本発明で用いられるカップラーとしては、４-アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられるが、４-アミノアンチピリンを用いることがより好適である。カップラーの濃度としては、好ましい下限は試薬中に０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は試薬中に５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
添加配置は、チラミンオキシダーゼを含まない試薬に処方することが好ましい。すなわち、チロシンデカルボキシラーゼを含有する試薬に配置することが好ましい。
Examples of the coupler used in the present invention include 4-aminoantipyrine, MBTH, NCP and the like, but it is more preferable to use 4-aminoantipyrine. The preferred lower limit of the coupler concentration is 0.01 mmol / L, more preferably 0.05 mmol / L in the reagent. A preferable upper limit is 50 mmol / L in a reagent, More preferably, it is 10 mmol / L.
The addition arrangement is preferably formulated in a reagent that does not contain tyramine oxidase. That is, it is preferable to arrange in a reagent containing tyrosine decarboxylase.
本発明で用いられるペルオキシダーゼは、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、細菌若しくは、カビなどの微生物由来のものが挙げられる。なお、微生物等のペルオキシダーゼの遺伝子を大腸菌等の微生物に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は、遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したペルオキシダーゼ等も含まれる。
添加配置としては、二試薬系で構成される試薬の場合、第一試薬または第二試薬のいずれでも良いが、チラミンオキシダーゼを含有する試薬に添加することがチラミンオキシダーゼの安定性をより向上させるため好ましい。
濃度としては、好ましい下限は試薬中０．０１Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．０５Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは０．１Ｕ／Ｌである。好ましい上限は試薬中１００Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは５０Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは３０Ｕ／Ｌである。
The peroxidase used in the present invention can be of any origin, such as those derived from animals such as humans or cows, those derived from plants such as horseradish, and those derived from microorganisms such as bacteria or fungi. It is done. In addition, those prepared by a gene recombination technique in which a peroxidase gene such as a microorganism is incorporated into a microorganism such as Escherichia coli, or a peroxidase prepared from a microorganism whose properties have been improved by gene modification or the like are included.
As the addition arrangement, in the case of a reagent composed of two reagents, either the first reagent or the second reagent may be used, but adding to a reagent containing tyramine oxidase further improves the stability of tyramine oxidase. preferable.
As a concentration, a preferable lower limit is 0.01 U / L in the reagent, more preferably 0.05 U / L, and further preferably 0.1 U / L. A preferable upper limit is 100 U / L in the reagent, more preferably 50 U / L, and further preferably 30 U / L.
本発明に用いられる緩衝剤としては、（アニリン系水素供与体の非特異発色の要因となりうるアミン類などが不純物として含まないものであれば）特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。また、自動分析機への適応を考慮した場合は、トリス緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤が好適であり、さらに好ましくは、緩衝能力に優れることから、グッド緩衝剤を用いることがより好ましい。
グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。中でもＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が挙げられる。
ｐＨはｐＨ５〜１０の範囲で調整されるが、チラミンオキシダーゼおよびチロシンデカルボキシラーゼを含有する試薬のｐＨの、該酵素の安定化のため好ましい下限はｐＨ５．５、さらに好ましくは、ｐＨ６．０である。好ましい上限はｐＨ９．０、より好ましくはｐＨ８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５である。
The buffer used in the present invention is not particularly limited (provided that it does not contain, as impurities, amines that can cause non-specific color development of aniline-based hydrogen donors). Tris buffer, phosphate buffer Citrate buffer, phthalate buffer, maleate buffer, glycine buffer, borate buffer, carbonate buffer, dimethylglycine buffer, Good buffer, and the like. In consideration of adaptation to an automatic analyzer, Tris buffer, citrate buffer, phthalate buffer, maleate buffer, glycine buffer, borate buffer, carbonate buffer, dimethylglycine buffer Good buffer is preferable, and more preferably, Good buffer is more preferably used because of its excellent buffer capacity.
Good buffering agents include N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), N-cyclohexyl-2 -Aminoethanesulfonic acid (CHES), N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 2-morpholinoethane Sulfonic acid (MES), piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminomethanesulfonic acid (TES), N-cyclohexyl-3-amino Propanesulfonic acid (CAPS), N-cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropa Sulfonic acid (CAPSO), 3- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (DIPSO), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propane Sulfonic acid (EPPS), 2-hydroxy-3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (HEPPSO), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), 2-hydroxy-3-morpholino Propanesulfonic acid (MOPSO), piperazine-1,4-bis (2-hydroxy-3-propanesulfonic acid) (POPSO), N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPSO), N- Tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TA S), N- (2-acetamido) iminoniacetic acid (ADA), N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (Tricine), etc. Is done. Among them, N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (Tricine), N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES), N-cyclohexyl- Examples include 3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), N-cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid (CAPSO), and N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPS).
The pH is adjusted in the range of pH 5 to 10, but the lower limit of the pH of the reagent containing tyramine oxidase and tyrosine decarboxylase is preferably 5.5, more preferably 6.0 for stabilization of the enzyme. . A preferable upper limit is pH 9.0, more preferably pH 8.0, and still more preferably pH 7.5.
また、チラミンオキシダーゼを用いた、上記特許文献４および５においては、液状試薬の緩衝液としてマックルバイン緩衝液を用いることが開示されている。このマックルバイン緩衝液は、クエン酸とリン酸を含む緩衝液であるが、近年の測定自動化においては、自動分析機でリン酸を含むバッファーの使用は好ましくない。これは、測定対象となる無機リン酸等にバッファー中のリン酸が影響を及ぼすからである。 Further, in Patent Documents 4 and 5 using tyramine oxidase, it is disclosed that a McLuvine buffer is used as a liquid reagent buffer. This McClubine buffer is a buffer containing citric acid and phosphoric acid, but in recent measurement automation, it is not preferable to use a buffer containing phosphoric acid in an automatic analyzer. This is because the phosphoric acid in the buffer affects the inorganic phosphoric acid to be measured.
本発明で用いられる界面活性剤としては、脂肪酸塩、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸トリエタノールアミン、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルベタインであることが好適である。 Examples of the surfactant used in the present invention include fatty acid salts, alpha sulfo fatty acid ester salts, alkylbenzene sulfonates, alkyl sulfates, alkyl ether sulfate esters, alkyl sulfate triethanolamines, fatty acid diethanolamides, polyoxyethylene alkyl ethers. Polyoxyethylene alkylphenyl ether and alkylbetaine are preferable.
ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン（登録商標）１０４Ｐ、エマルゲン（登録商標）１０５、エマルゲン（登録商標）１０６、エマルゲン（登録商標）１０８、エマルゲン（登録商標）１０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）１２０、エマルゲン（登録商標）１２３Ｐ、エマルゲン（登録商標）１４７、エマルゲン（登録商標）１３０Ｋ、ノニオン（登録商標）Ｋ−２０４、ノニオン（登録商標）Ｋ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｋ−２２０、ノニオン（登録商標）Ｋ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）２１０、エマルゲン（登録商標）２２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオン（登録商標）Ｐ−２０８、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１０、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）３０６Ｐ、エマルゲン（登録商標）３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２０、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０７、ノニオン（登録商標）Ｓ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｓ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）４０４、エマルゲン（登録商標）４０８、エマルゲン（登録商標）４０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）４２０、エマルゲン（登録商標）４３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−５０、ノニオン（登録商標）Ｅ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｅ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｅ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−３０等が挙げられる。 Examples of polyoxyethylene lauryl ethers include Emulgen (registered trademark) 104P, Emulgen (registered trademark) 105, Emulgen (registered trademark) 106, Emulgen (registered trademark) 108, Emulgen (registered trademark) 109P, Emulgen (registered trademark) 120, Emulgen (registered trademark) 123P, Emulgen (registered trademark) 147, Emargen (registered trademark) 130K, Nonion (registered trademark) K-204, Nonion (registered trademark) K-215, Nonion (registered trademark) K-220, Nonion ( Registered trademark) K-230, NIKKOL (registered trademark) BL-2, NIKKOL (registered trademark) BL-4.2, NIKKOL (registered trademark) BL-9EX, NIKKOL (registered trademark) BL-21, NIKKOL (registered trademark) BL-25, polyoxyethylene cetyl As ethers, Emulgen (registered trademark) 210, Emulgen (registered trademark) 220, NIKKOL (registered trademark) BC-2, NIKKOL (registered trademark) BC-5.5, NIKKOL (registered trademark) BC-7, NIKKOL (registered) Trademarks) BC-10TX, NIKKOL (registered trademark) BC-15TX, NIKKOL (registered trademark) BC-20TX, NIKKOL (registered trademark) BC-23, NIKKOL (registered trademark) BC-25TX, NIKOL (registered trademark) BC-30X NIKKOL (registered trademark) BC-40TX, nonion (registered trademark) P-208, nonion (registered trademark) P-210, nonion (registered trademark) P-213, and polyoxyethylene stearyl ethers as Emulgen (registered trademark) 306P, Emargen (registered merchant ) 320P, NIKKOL (registered trademark) BS-2, NIKKOL (registered trademark) BS-4, NIKKOL (registered trademark) BS-20, nonion (registered trademark) S-206, nonion (registered trademark) S-207, nonion ( (Registered Trademark) S-215, Nonion (Registered Trademark) S-220, Polyoxyethylene Oleyl Ethers include Emulgen (Registered Trademark) 404, Emulgen (Registered Trademark) 408, Emulgen (Registered Trademark) 409P, and Emulgen (Registered Trademark) ) 420, Emulgen (registered trademark) 430, NIKKOL (registered trademark) BO-2, NIKKOL (registered trademark) BO-7, NIKKOL (registered trademark) BO-10TX, NIKKOL (registered trademark) BO-20, NIKKOL (registered trademark) ) BO-50, Nonion (registered trademark) E-206, NION (registered trademark) E-215, NONION (registered trademark) E-230, and polyoxyethylene behenyl ethers include NIKKOL (registered trademark) BB-5, NIKKOL (registered trademark) BB-10, NIKKOL (registered trademark). BB-20, NIKKOL (registered trademark) BB-30, and the like.
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）７０７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−９、アデカトール（登録商標）ＳＯ−８０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１０５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１２０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１３５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１４５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１６０、エマルゲン（登録商標）７０５、エマルゲン（登録商標）７０７、エマルゲン（登録商標）７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）８１０、エマルゲン（登録商標）８４０Ｓ、エマルゲン（登録商標）９０９、エマルゲン（登録商標）９１０、エマルゲン（登録商標）９３０、エマルゲン（登録商標）９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲン（登録商標）Ａ６０、エマルゲン（登録商標）Ａ９０、エマルゲン（登録商標）Ｂ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−１５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２３０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２０７、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１２、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１５、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドール（登録商標）（登録商標）ＴＷ−Ｌ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｌ１０６、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｐ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｓ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｏ１２０、レオドール（登録商標）４６０、エマノーン（登録商標）１１１２、エマノーン（登録商標）３１１５、エマノーン（登録商標）３１７０、エマノーン（登録商標）３２９９、エマノーン（登録商標）３１３０ In addition, as polyoxyethylene secondary alkyl ethers, Emulgen (registered trademark) 707, NIKKOL (registered trademark) BT-5, NIKKOL (registered trademark) BT-7, NIKKOL (registered trademark) BT-9, Adecatol (registered) Trademark) SO-80, Adecatol (registered trademark) SO-105, Adecatol (registered trademark) SO-120, Adecatol (registered trademark) SO-135, Adecatol (registered trademark) SO-145, Adecatol (registered trademark) SO-160 , Emulgen (registered trademark) 705, Emulgen (registered trademark) 707, Emargen (registered trademark) 709, and the like. Examples of polyoxyethylene alkylphenyl ethers include Emulgen (registered trademark) 810, Emulgen (registered trademark) 840S, Emulgen (registered trademark) 909, Emulgen (registered trademark) 910, Emulgen (registered trademark) 930, and Emulgen (registered trademark). 950, Triton X-100, Triton X-114, NIKKOL (registered trademark) NP-5, NIKKOL (registered trademark) NP-7.5, NIKKOL (registered trademark) NP-10, NIKKOL (registered trademark) NP-15, NIKKOL (registered trademark) NP-20, NIKKOL (registered trademark) OP-10, NIKKOL (registered trademark) OP-30, and the like. Examples of polyoxyethylene styryl phenyl ethers include Emulgen (registered trademark) A60, Emulgen (registered trademark) A90, and Emulgen (registered trademark) B66. As oxyethylene / oxypropylene block copolymers, Emulgen (registered trademark) PP-150, Emulgen (registered trademark) PP-230, Emargen (registered trademark) PP-250, Emargen (registered trademark) PP-290, NIKKOL (registered) Trademark) PBC-34, NIKKOL (registered trademark) PBC-44, and the like. Examples of polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ethers include EMALEX (registered trademark) DAPE0207, EMALEX (registered trademark) DAPE0210, EMALEX (registered trademark) DAPE0212, EMALEX (registered trademark) DAPE0215, Emalex ( (Registered trademark) DAPE0220, Emarex (registered trademark) DAPE0220, and the like. Examples of fatty acid esters include Rheodor (registered trademark) TW-L120, Rhedol (registered trademark) TW-L106, Rhedol (registered trademark) TW-P120, Rheodor (registered trademark) TW-S120, Rhedol (registered trademark). ) TW-O120, Rheodor (registered trademark) 460, Emanon (registered trademark) 1112, Emanon (registered trademark) 3115, Emanon (registered trademark) 3170, Emanon (registered trademark) 3299, Emanon (registered trademark) 3130
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。 Examples of the polyoxyethylene sterols include NIKKOL (registered trademark) BPS-10, NIKKOL (registered trademark) BPS-20, NIKKOL (registered trademark) BPS-30, NIKKOL (registered trademark) PSH-25, NIKKOL (registered trademark) DHC. -30 etc. are mentioned. Others include n-octyl-β-D-glucoside, n-dodecyl-β-D-maltoside, N, N-bis (3-D-gluconoamidopropyl) colamide, N, N-bis (3-D -Gluconoamidopropyl) deoxycolamide, n-octanoyl-N-methylglucoamide, n-nonanoyl-N-methylglucoamide, n-decanoyl-N-methylglucoamide, sucrose monocaprate, sucrose monolaurate , Sucrose monocholate, digitonin and the like.
さらにアルキルベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール（登録商標）（登録商標）２０ＢＳ、アンヒトール（登録商標）２４Ｂ、アンヒトール（登録商標）８６Ｂ、アンヒトール（登録商標）２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。 Furthermore, alkylbetaines, alkylimidazolium betaines, alkylamidobetaines, alkylalanines, alkylamine oxides, derivatives thereof and the like can be mentioned. These Amphitol (registered trademark) 20BS, Amphitol (registered trademark) 24B, Amphitol (registered trademark) 86B, Amphitol (registered trademark) 20Z, 3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfone Acid, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid, and the like.
界面活性剤の濃度としては、特に規定はしないが、好ましい下限は０．０１重量％、より好ましくは０．０５重量％、さらに好ましくは０．１重量％添加することが好ましい。好ましい上限は１０重量％、さらに好ましくは５．０重量％添加することが好ましい。 The concentration of the surfactant is not particularly specified, but a preferable lower limit is 0.01% by weight, more preferably 0.05% by weight, and still more preferably 0.1% by weight. The upper limit is preferably 10% by weight, more preferably 5.0% by weight.
また、界面活性剤のＨＬＢ値は、好ましい下限として８．８、さらに好ましくは１１．０である。好ましい上限は１９．１である。 Moreover, the HLB value of surfactant is 8.8 as a preferable minimum, More preferably, it is 11.0. A preferred upper limit is 19.1.
本発明に用いられる防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤、プロクリン（登録商標）各種などが挙げられる。濃度としては、好ましい下限として試薬中０．００１重量％、より好ましくは０．０１重量％である。好ましい上限は試薬中１．０重量％、より好ましくは０．１重量％である。 Examples of the preservative used in the present invention include azides, chelating agents, antibiotics, antibacterial agents, and various types of Procrine (registered trademark). The concentration is preferably 0.001% by weight, more preferably 0.01% by weight in the reagent as a preferred lower limit. A preferred upper limit is 1.0% by weight in the reagent, more preferably 0.1% by weight.
本発明に用いられる安定化剤としては、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼなどがある。濃度としては、好ましい下限として試薬中で０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましい上限は、試薬中で１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌである。 Examples of the stabilizer used in the present invention include cyclodextrin and modified products thereof, cluster dextrin, calixarene derivatives, aminosulfonic acid compounds, swellable layered clay minerals such as smectite, borate, and catalase. The concentration is preferably 0.01 mmol / L, more preferably 0.05 mmol / L in the reagent as a preferred lower limit. A preferable upper limit is 10 mmol / L in a reagent, More preferably, it is 2 mmol / L.
また、生体試料中のアスコルビン酸の影響回避のために、アスコルビン酸オキシダーゼを使用することができ、本発明で使用するアスコルビン酸オキシダーゼの起源としては、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐ．やＣｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐ．およびＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．が挙げられる。濃度としては、好ましい下限として試薬中０．０１Ｕ／Ｌ、より好ましくは０．０５Ｕ／Ｌである。好ましい上限は、試薬中１００Ｕ／Ｌ、より好ましくは５０Ｕ／Ｌである。
また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む試薬のｐＨとしては、酵素の安定性、活性を考慮し、好ましい下限はｐＨ６．０、好ましい上限はｐＨ８．０である。また、添加配置としては、第一試薬に含有させることが好ましい。
Moreover, in order to avoid the influence of ascorbic acid in a biological sample, ascorbate oxidase can be used. As the source of ascorbate oxidase used in the present invention, Cucumis sp. And Cucurbita sp. And Acremonium sp. Is mentioned. The concentration is preferably 0.01 U / L, more preferably 0.05 U / L in the reagent as a preferred lower limit. A preferable upper limit is 100 U / L, more preferably 50 U / L in the reagent.
The pH of the reagent containing ascorbate oxidase is preferably 6.0 and the preferable upper limit is 8.0 in consideration of the stability and activity of the enzyme. Moreover, as addition arrangement | positioning, it is preferable to make it contain in a 1st reagent.
本発明において、液状試薬の形態で提供する場合、試薬は、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の形態で提供することができるが、これらの容器を遮光することがより望ましい。 In the present invention, when the reagent is provided in the form of a liquid reagent, the reagent can be provided in the form of filling into a glass bottle, a plastic container or the like, but it is more desirable to shield these containers from light.
本発明におけるチロシン測定試薬において、検量線での校正方法（キャリブレーション方法）は特に限定されないが、
［１］精製水あるいは、生理食塩水と、
［２］１水準以上の濃度の標準物質または、標準溶液により行うのが好ましい。
In the tyrosine measurement reagent of the present invention, the calibration method with the calibration curve (calibration method) is not particularly limited,
[1] Purified water or physiological saline,
[2] It is preferable to use a standard substance or standard solution having a concentration of one level or more.
キャリブレーション方法としては、直線法、スプライン法などいずにも限定されないが、特に直線法が好ましい。 The calibration method is not limited to a straight line method or a spline method, but the straight line method is particularly preferable.
また、分析方法としては、以下の方法に限定されるものではないが、以下の［１］、［２］、［３］、のいずれかであることが好ましい。
［１］１ポイント法；試薬を添加し、一定時間後の吸光度を測定するエンドポイント法
［２］２ポイント法；測光ポイントを変えて２回測定し、差の吸光度を求めるエンドポイント法
［３］レート法；指定された測光ポイント間の単位時間あたりの吸光度変化を求める方法
The analysis method is not limited to the following method, but is preferably any of the following [1], [2], and [3].
[1] One-point method; end-point method in which a reagent is added and the absorbance is measured after a certain time [2] two-point method; end-point method in which the difference is measured twice and the difference absorbance is obtained [3 ] Rate method; a method for determining the change in absorbance per unit time between specified photometric points
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. In addition, this invention is not specifically limited by an Example.
［実施例１〜８、および、比較例１〜８］チラミンオキシダーゼと各色素、またはカップラー、共存条件におけるチラミンオキシダーゼの安定性（表２（実施例）、表３（比較例））
本発明の実施形態の１つとしてチロシン測定用試薬が考えられる。特に、自動分析機への適応などを考えた場合、過酸化水素の発生量に基づく発色量を検出できる測定系が望ましい。よってまず、チラミンオキシダーゼと各色素、カップラーとの共存条件におけるチラミンオキシダーゼの安定性について検討した。
[Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 8] Tyramine oxidase and each dye or coupler, stability of tyramine oxidase in coexistence conditions (Table 2 (Example), Table 3 (Comparative Example))
One embodiment of the present invention is a reagent for tyrosine measurement. In particular, when considering application to an automatic analyzer, a measurement system that can detect the amount of color development based on the amount of hydrogen peroxide generated is desirable. Therefore, first, the stability of tyramine oxidase under the coexistence conditions of tyramine oxidase, each dye, and the coupler was examined.
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製） １５．１ｇ／Ｌ ｐＨ６．５
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製） ０．４ＫＵ／Ｌ ｐＨ７．０
各発色体または、カップラー ０．５ｇ／Ｌ
(Preparation of reagents)
A reagent having the following composition was prepared.
PIPES (manufactured by Dojin Chemical) 15.1 g / L pH 6.5
Tyramine oxidase (Toyobo Co., Ltd.) 0.4 KU / L pH 7.0
Each color former or coupler 0.5g / L
（保存条件）
（１）冷蔵安定性；試薬を１℃〜１０℃に保存。
（２）熱安定性；試薬を３７℃に保存。
（３）光安定性；１０℃以下の保存条件で、褐色容器内に試薬を保管し、試薬を含有する該容器を５００ルクスで照射し保存。容器の材質としては、ポリエチレンテレフタレートのものを使用した。
(Storage conditions)
(1) Refrigerated stability; Reagent stored at 1 ° C to 10 ° C.
(2) Thermal stability: Reagent stored at 37 ° C.
(3) Light stability: Store the reagent in a brown container under storage conditions of 10 ° C. or lower, and store the container containing the reagent by irradiation with 500 lux. As the material of the container, polyethylene terephthalate was used.
（チラミンオキシダーゼ活性測定法）
チラミンオキシダーゼの活性測定は以下の測定条件で行った。以下、残存活性の測定には、本方法を用いた。
（１）基質液
１０ｍＭ チラミン水溶液
（２）発色液
７０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．０７１ｇ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
１．１６ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製）
２．３ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
（３）測定条件
日立７０７０形自動分析機を用いた。
基質液：発色液＝１：９で混合し測定試薬とした。試料１５μＬに測定試薬２８５μＬを添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。第一反応の単位時間あたりの５７０ｎｍにおける吸高度変化をレート法にて測定し活性を求めた。
（４）キャリブレーション法
精製水、０．２U／mＬチラミンオキシダーゼ溶液を２重測定し、０．２U／mＬチラミンオキシダーゼ溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
(Method for measuring tyramine oxidase activity)
The tyramine oxidase activity was measured under the following measurement conditions. Hereinafter, this method was used for measurement of residual activity.
(1)
0.071 g / L 4-aminoantipyrine 1.16 mM TOOS (manufactured by Dojin Chemical)
2.3 u / mL peroxidase (3) Measurement conditions Hitachi 7070 automatic analyzer was used.
Substrate solution: Color developing solution = 1: 9 was used as a measurement reagent. A sample reagent (285 μL) was added to a sample (15 μL) and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to form a first reaction. The activity was determined by measuring the change in absorbance at 570 nm per unit time of the first reaction by the rate method.
(4) Calibration method Double measurement of purified water and 0.2 U / mL tyramine oxidase solution, and calculate and correct the absorbance (sensitivity) obtained by subtracting the purified water measurement absorbance from the 0.2 U / mL tyramine oxidase solution measurement absorbance Went.
チラミンオキシダーゼと各色素、またはカップラー共存条件におけるチラミンオキシダーゼの各保存条件での安定性を表２（実施例）、表３（比較例）に示す。
実施例では、未処理の試料と比較し、いずれも冷蔵安定性≧８５％、熱安定性≧６０％、光安定性≧６０％であるのに対し、比較例１〜８では、著しい残存活性の低下が見られた。
よって、本発明の実施形態として考えられるチロシン測定試薬においては、以下の反応系がより好ましいが、チラミンオキシダーゼとカップラーを別配置にし、水素供与体を同配置にすることが好ましい。特に水素供与体としては、一般式（１）または（２）および表１で表される化合物が良い。
［反応系］
チロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンにチラミンオキシダーゼを作用させることにより過酸化水素を発生させる。この発生した過酸化水素を利用し、ペルオキシダーゼの存在下、水素供与体とカップラーを反応させ、発色に導く過酸化水素検出系にて測定する方法。
Table 2 (Examples) and Table 3 (Comparative Examples) show the stability of tyramine oxidase and each dye, or tyramine oxidase under the coexistence conditions of each coupler under each storage condition.
In the examples, the refrigeration stability ≧ 85%, the thermal stability ≧ 60%, and the light stability ≧ 60% compared to the untreated samples, whereas in Comparative Examples 1-8, the remarkable residual activity Decrease was observed.
Therefore, in the tyrosine measurement reagent considered as an embodiment of the present invention, the following reaction system is more preferable, but it is preferable to arrange the tyramine oxidase and the coupler separately and the hydrogen donor to the same arrangement. In particular, the hydrogen donor is preferably a compound represented by the general formula (1) or (2) and Table 1.
[Reaction system]
Tyrosine decarboxylase is allowed to act on tyrosine, and tyramine oxidase is allowed to act on the produced tyramine to generate hydrogen peroxide. A method in which the generated hydrogen peroxide is used to react with a hydrogen donor and a coupler in the presence of peroxidase, and measurement is performed with a hydrogen peroxide detection system that leads to color development.
［実施例９〜１１］チラミンオキシダーゼを含む試薬に水素供与体および/または金属と陰性の酸基からなる化合物を添加することによるチラミンオキシダーゼの安定化（表４）
実施例３の試薬に、さらに金属と陰性の酸基からなる化合物であるＮａＣｌを添加しチラミンオキシダーゼの残存活性を検討した（実施例９、１０）。また、実施例３の組成からＴＯＯＳ ０．５ｇ/Ｌを除いた試薬に、ＮａＣｌを添加し、チラミンオキシダーゼの残存活性を検討した（実施例１１）。実施例においては、金属と陰性の酸基からなる化合物としてＮａＣｌを用いているが、これに限定されるものではない。
[Examples 9 to 11] Stabilization of tyramine oxidase by adding a compound comprising a hydrogen donor and / or a metal and a negative acid group to a reagent containing tyramine oxidase (Table 4)
NaCl, which is a compound composed of a metal and a negative acid group, was further added to the reagent of Example 3 to examine the residual activity of tyramine oxidase (Examples 9 and 10). Moreover, NaCl was added to the reagent which remove | excluded TOOS 0.5g / L from the composition of Example 3, and the residual activity of tyramine oxidase was examined (Example 11). In the examples, NaCl is used as a compound composed of a metal and a negative acid group, but is not limited thereto.
結果を表４に示す。また、表４の実施例１１より水素供与体を含まず、金属と陰性の酸基からなる化合物（ＮａＣｌ）を単独で添加した場合においてチラミンオキシダーゼの安定化効果が確認された。また表４の実施例９、１０より水素供与体とチラミンオキシダーゼを含む試薬に少なくとも０．１％以上の金属と陰性の酸基からなる化合物（ＮａＣｌ）を添加することで、いずれの保存条件においてもチラミンオキシダーゼの安定化効果が確認された。
金属と陰性の酸基からなる化合物を０．１重量％〜１０重量％の範囲で添加することで同様のチラミンオキシダーゼの安定化効果を確認している。
The results are shown in Table 4. In addition, from Example 11 in Table 4, the effect of stabilizing tyramine oxidase was confirmed when a compound containing no hydrogen donor and containing a metal and a negative acid group (NaCl) alone was added. Further, from Examples 9 and 10 in Table 4, by adding a compound (NaCl) comprising at least 0.1% of a metal and a negative acid group to a reagent containing a hydrogen donor and tyramine oxidase, under any storage condition Moreover, the stabilizing effect of tyramine oxidase was confirmed.
The same effect of stabilizing tyramine oxidase has been confirmed by adding a compound comprising a metal and a negative acid group in the range of 0.1 to 10% by weight.
［実施例１２〜１４、比較例９］水素供与体とチラミンオキシダーゼおよび金属と陰性の酸基からなる化合物を含む試薬に、添加剤を加えることによるチラミンンオキシダーゼの安定化検討（表５）
実施例１０の試薬に、測定上添加の可能性のあるＥＤＴＡ・２Ｎａ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ＰＬＰ（ピリドキサール５リン酸）、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）を添加し残存活性を検討した。ＰＬＰはチロシン測定試薬に用いるチロシンデカルボキシラーゼの補酵素として、ＦＡＤはチラミンオキシダーゼや、その他アミンオキシダーゼの安定化剤としての利用が考えられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を用いているが、これに限定されるものではない。また、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＰＯＤ、ＰＬＰ、ＦＡＤの添加量については、以下の実施例に限定されるものではない。
[Examples 12-14, Comparative Example 9] Stabilization of tyramine oxidase by adding an additive to a reagent containing a compound comprising a hydrogen donor, tyramine oxidase, and a metal and a negative acid group (Table 5)
To the reagent of Example 10, EDTA · 2Na, peroxidase (POD), PLP (pyridoxal pentaphosphate), and FAD (flavin adenine dinucleotide), which may be added for measurement, were added to examine the residual activity. PLP can be used as a coenzyme for tyrosine decarboxylase used as a tyrosine assay reagent, and FAD can be used as a stabilizer for tyramine oxidase and other amine oxidases.
As a chelating agent, ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA · 2Na) is used, but is not limited thereto. Further, the addition amount of EDTA · 2Na, POD, PLP, and FAD is not limited to the following examples.
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製） １５．１ｇ／Ｌ ｐＨ６．５
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製） ０．４ＫＵ／Ｌ ｐＨ７．０
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．４ｇ／Ｌ
ＮａＣｌまたは、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）または、ＰＬＰまたは、ＦＡＤ
（ＥＤＴＡ・２Ｎａ・・・０．０４％、ＰＯＤ（東洋紡社製）・・・５ＫＵ／Ｌ、ＰＬＰ（東京化成社製）・・・１０ｍｇ／Ｌ、ＦＡＤ（ナカライテスク社製）・・・７．５ｍｇ／Ｌ）
(Preparation of reagents)
A reagent having the following composition was prepared.
PIPES (manufactured by Dojin Chemical) 15.1 g / L pH 6.5
Tyramine oxidase (Toyobo Co., Ltd.) 0.4 KU / L pH 7.0
TOOS (Dojin Chemical Co., Ltd.) 0.5g / L
EDTA · 2Na 0.4g / L
NaCl, peroxidase (POD), PLP, or FAD
(EDTA · 2Na: 0.04%, POD (manufactured by Toyobo Co., Ltd.): 5 KU / L, PLP (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.): 10 mg / L, FAD (manufactured by Nacalai Tesque): 7 .5 mg / L)
結果を表５に示す。表５より水素供与体とチラミンオキシダーゼ、金属と陰性の酸基からなる化合物を含む試薬にＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＰＯＤ、ＰＬＰを添加することで、いずれの保存条件においても安定化効果が見られた。一方、ＦＡＤ添加試薬についてはチラミンオキシダーゼの安定性不良が見られ、特に光照射による影響を受け易いことが明らかになった。 The results are shown in Table 5. From Table 5, the stabilization effect was observed under any storage conditions by adding EDTA · 2Na, POD, and PLP to a reagent containing a compound comprising a hydrogen donor, tyramine oxidase, and a metal and a negative acid group. On the other hand, the stability of tyramine oxidase was found to be poor with the FAD-added reagent, and it was revealed that it was particularly susceptible to light irradiation.
［実施例１５、比較例１０］本発明におけるチロシン測定用試薬中のチラミンオキシダーゼの長期冷蔵安定性（表６、７、図１）
本発明における実施形態の一つであるチロシン測定用試薬を調製し、チロシン測定試薬中のチラミンオキシダーゼの長期冷蔵安定性について確認を行った。
[Example 15, Comparative Example 10] Long-term refrigeration stability of tyramine oxidase in the reagent for tyrosine measurement in the present invention (Tables 6, 7, FIG. 1)
A reagent for tyrosine measurement, which is one embodiment of the present invention, was prepared, and the long-term refrigeration stability of tyramine oxidase in the tyrosine measurement reagent was confirmed.
（試薬の調製）
以下の組成からなるチロシン測定試薬を調製した（実施例１５）。なお、比較例１０は実施例１５の第一試薬よりＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＮａＣｌを除いた試薬である。第二試薬は実施例１５、比較例１０とも共通である。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製） ５０ｍＭ ｐＨ６．５
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン
（ＴＯＯＳ） （同仁化学社製） １ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．４ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ０．９ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ５Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．４Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５−リン酸エステル １０ｍｇ／Ｌ
第ニ試薬
ＰＩＰＥＳ（同仁化学社製） ５０ｍＭ ｐＨ６．５
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．４ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ ５Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ
(Preparation of reagents)
A tyrosine measuring reagent having the following composition was prepared (Example 15). Comparative Example 10 is a reagent obtained by removing EDTA · 2Na and NaCl from the first reagent of Example 15. The second reagent is common to Example 15 and Comparative Example 10.
First reagent PIPES (manufactured by Dojindo) 50 mM pH 6.5
N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (TOOS) (manufactured by Dojindo) 1 g / L
EDTA · 2Na 0.4g / L
NaCl 0.9g / L
Triton X-100 1g / L
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 5 U / mL
Ascorbate oxidase (Toyobo ASO-311) 3 / mL
Tyramine oxidase (Toyobo TYO-301) 0.4 U / mL
Pyridoxal 5-phosphate ester 10mg / L
Second reagent PIPES (manufactured by Dojindo) 50 mM pH 6.5
EDTA · 2Na 0.4g / L
Triton X-100 1g / L
4-Aminoantipyrine 0.3g / L
Tyrosine decarboxylase 5U / mL
Potassium ferrocyanide 0.15mmol / L
結果を表６、表７および図１に示す。結果より実施例１５においては、７ヶ月間の長期冷蔵保存においてもチラミンオキシダーゼが高い安定性を保持していることが確認された。 The results are shown in Table 6, Table 7 and FIG. From the results, in Example 15, it was confirmed that tyramine oxidase retained high stability even in long-term refrigerated storage for 7 months.
［実施例１５、比較例１０］本発明におけるチロシン測定用試薬を用いた生体試料の測定（図２、３）
上記検討に用いた７ヶ月保存後の実施例１５試薬および実施例１０試薬を用いて生体試料中のチロシンを測定した。
[Example 15, Comparative Example 10] Measurement of a biological sample using the reagent for tyrosine measurement in the present invention (FIGS. 2 and 3)
Tyrosine in a biological sample was measured using the reagent of Example 15 and Example 10 after storage for 7 months used in the above examination.
生体試料には以下を用いた。
・血清Ａ・・・液状ネスコールＮ（アルフレッサファーマ社）に３０ｕｍｏｌ／ＬのＬチロシンを追添した血清。
・血清Ｂ・・・液状ネスコールＮ（アルフレッサファーマ社）に１５０ｕｍｏｌ／ＬのＬチロシンを追添した血清。
The following was used for the biological sample.
Serum A: Serum obtained by adding 30 umol / L L tyrosine to liquid Nescoll N (Alfresa Pharma).
Serum B: Serum obtained by adding 150 umol / L L tyrosine to liquid Nescoll N (Alfresa Pharma).
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料７．５μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
(Measurement method)
A Hitachi 7170 automatic analyzer was used. 120 μL of the first reagent was added to 7.5 μL of the sample and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to form the first reaction. Thereafter, 40 μL of the second reagent was added and incubated for 5 minutes to form a second reaction. Absorbance at 600 nm was measured by a two-point end method in which the absorbances of the first reaction and the second reaction were corrected for the liquid volume and the difference between the absorbances was taken.
結果を図２および図３に血清Ａ、Ｂ測定のタイムコースデータを示す。結果より、比較例１０においては、タイムコースがエンドポイントになっていないのに対し、実施例１５は、タイムコースがエンドポイントになっていることが確認され、冷蔵７ヶ月保存後においても安定に測定できることが確認された。 The results are shown in FIGS. 2 and 3 for time course data of serum A and B measurements. From the results, it was confirmed that in Comparative Example 10, the time course was not the end point, whereas in Example 15, it was confirmed that the time course was the end point, and it was stable even after refrigerated storage for 7 months. It was confirmed that measurement was possible.
本発明は、チラミンオキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関するものである。
特に臨床診断に用いられる生体成分中のチロシン測定試薬、およびチロシン測定試薬を含むＢＴＲ測定試薬（の総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用試薬）に用いられるチラミンオキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関するものである。本発明は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
The present invention relates to a method for stabilizing tyramine oxidase and a composition thereof.
In particular, it relates to a tyramine oxidase stabilization method and a composition thereof used in a tyrosine measuring reagent in a biological component used for clinical diagnosis, and a BTR measuring reagent containing the tyrosine measuring reagent (total branched chain amino acid / tyrosine molar ratio measuring reagent). Is. The present invention can be used in application fields such as in-vitro diagnostic drugs, and greatly contributes to the industrial world.
Claims (8)
（式中、Ｒ１はＣ２Ｈ５またはＨのいずれか、Ｒ２はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれか、Ｒ３はＯＣＨ３、ＣＨ３、またはＨのいずれかである。） The method for stabilizing tyramine oxidase in a solution according to claim 1, wherein an aniline-based hydrogen donor represented by the general formula (1) or the general formula (2) is allowed to coexist.
(In the formula, R 1 is either C 2 H 5 or H, R 2 is either OCH 3, CH 3, or H, and R 3 is either OCH 3, CH 3, or H.)
A reagent for measuring tyrosine, comprising the solution according to claim 7.
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