JP2009244101A - Method for detecting test material - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a high-sensitivity test material by stably labelling a fluorescent aggregate on a solid-phase carrier. <P>SOLUTION: The method for detecting the test material comprises the steps of modifying the surface of liposome, which is an endoplasmic reticulum consisting of a lipid bilayer membrane, with a fluorescent material and using the liposome as a labelled substance consisting of the fluorescent aggregate. The method allows the stable presence of the liposome on the solid-phase carrier by modification of the surface of the solid-phase carrier and constitutional components of the liposome. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、固相担体上において脂質二分子膜から成る小胞体であるリポソームを標識物質として用いた、被検物質の検出法に関する。   The present invention relates to a method for detecting a test substance using, as a labeling substance, a liposome that is an endoplasmic reticulum composed of a lipid bilayer on a solid phase carrier.

基板上に被検物質となる被検物質を固定化することにより、免疫反応またはハイブリダイゼーション反応を利用して目的物質を検出する方法は、広く利用されている。従来、これらの検出方法は、放射性物質を標識物質として用いることにより行われてきた。しかしながら、放射性物質を用いた検出方法は、放射性物質が健康に有害な影響をおよぼす危険性があり、また測定が特殊な施設に限られてしまう。   A method of detecting a target substance using an immune reaction or a hybridization reaction by immobilizing a test substance to be a test substance on a substrate is widely used. Conventionally, these detection methods have been performed by using a radioactive substance as a labeling substance. However, the detection method using a radioactive substance has a risk that the radioactive substance has a harmful effect on health, and the measurement is limited to a special facility.

これに対し、蛍光色素や酵素などの非放射性物質を標識物質として用いた検出方法の開発が行われている。しかしながら、非放射性物質を標識物質として用いた検出方法の検出感度は、放射性物質を標識物質として用いた検出方法に比べ不十分である。このため、非放射性物質の標識物質を集合体として用いることにより、検出方法の高感度化が行われている。そして、標識物質の集合体として、脂質二分子膜から成る小胞体であるリポソームが用いられている。   On the other hand, detection methods using non-radioactive substances such as fluorescent dyes and enzymes as labeling substances have been developed. However, the detection sensitivity of the detection method using a non-radioactive substance as a labeling substance is insufficient compared to the detection method using a radioactive substance as a labeling substance. For this reason, the sensitivity of detection methods has been increased by using non-radioactive labeling substances as aggregates. As an assembly of labeling substances, liposomes that are vesicles composed of lipid bilayer membranes are used.

例えば、特許文献１では、被検物質に対する抗体を表面に修飾したリポソームの内水相に、多量の蛍光物質を封入することにより、抗原抗体反応の標識物質として用いる方法が開示されている。この方法は、補体を用いてリポソームを破壊した後、リポソーム内部から放出した蛍光物質を検出することにより、抗原を定量する方法である。この方法はマイクロウェルプレートのような液相における検出方法としては有用な方法である。しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイのように表面が平坦な固相上に固定化した被検物質を検出する方法においては、リポソーム内部から放出した標識物質が拡散するため、被検物質の検出が正確に行われない。   For example, Patent Document 1 discloses a method in which a large amount of a fluorescent substance is encapsulated in an inner aqueous phase of a liposome whose surface is modified with an antibody against a test substance, and used as a labeling substance for antigen-antibody reaction. This method is a method of quantifying an antigen by detecting a fluorescent substance released from the inside of a liposome after destroying the liposome using complement. This method is useful as a detection method in a liquid phase such as a microwell plate. However, in the method of detecting a test substance immobilized on a solid surface with a flat surface, such as a DNA microarray, the labeled substance released from the inside of the liposome diffuses, so that the test substance is accurately detected. Absent.

一方、特許文献２においては、表面に抗体および蛍光物質を修飾したリポソームを第二の抗原抗体反応を用いたリンカーを介して抗原に標識する方法が開示されている。本法はリポソームを破壊せずに直接検出することが可能なため、スポット状に固定化した被検物質の検出が可能である。しかしながら、本法を用いた場合、固相担体においてリポソームが標識物質として安定に存在することが困難である。
特開昭６１−２５０５５８号公報 特開平８−２９４２２号公報 On the other hand, Patent Document 2 discloses a method of labeling an antigen with a liposome whose surface is modified with an antibody and a fluorescent substance via a linker using a second antigen-antibody reaction. Since this method can directly detect liposomes without destroying them, it can detect a test substance immobilized in a spot shape. However, when this method is used, it is difficult for liposomes to stably exist as a labeling substance in the solid phase carrier.
JP-A 61-250558 JP-A-8-29422

本発明は、固相担体表面を親水性にすることにより、固相表面にリポソームを標識物質として安定に存在させることを可能とする被検物質の検出方法である。また、リポソーム表面の極性付与および糖質修飾により、固相担体上におけるリポソームの破壊を防ぐことを特徴とする被検物質の検出方法である。   The present invention is a method for detecting a test substance that makes it possible for liposomes to be stably present as a labeling substance on the solid phase surface by making the surface of the solid phase carrier hydrophilic. In addition, the present invention provides a method for detecting a test substance characterized in that the liposome surface is prevented from being destroyed by imparting polarity to the liposome surface and modifying the carbohydrate.

本発明の方法によれば、リポソームのような流動性を持つ小胞体が固相担体上に安定に標識されるため、蛍光集合体を標識物質とする検出反応の高感度化が可能となる。   According to the method of the present invention, since fluid vesicles such as liposomes are stably labeled on a solid phase carrier, it is possible to increase the sensitivity of a detection reaction using a fluorescent aggregate as a labeling substance.

本発明によれば、平坦な基板から成るプローブ担体において、リポソームを用いた蛍光集合体を安定に標識することが可能となり、検出の高感度化が可能となる。   According to the present invention, it is possible to stably label fluorescent aggregates using liposomes in a probe carrier composed of a flat substrate, and to increase the sensitivity of detection.

本発明におけるリポソームを用いた蛍光集合体は、リン脂質、表面に蛍光物質および被検物質に特異的に結合する化合物を修飾したリン脂質、極性を有する脂質、糖質およびコレステロールを構成成分とすることにより、リポソームの安定性を高めるものである。また、固相担体表面を親水性にすることにより、リポソームを固相においても安定に存在することを可能にするものである。   The fluorescent aggregate using liposomes in the present invention comprises phospholipids, phospholipids modified with a compound that specifically binds to fluorescent substances and test substances on the surface, polar lipids, carbohydrates, and cholesterol as constituent components. This increases the stability of the liposome. In addition, by making the surface of the solid phase carrier hydrophilic, the liposome can be stably present even in the solid phase.

リポソームの構成成分となる脂質の総濃度は脂質安定性の点から１０〜１００μｍｏｌ／ｍｌであることが望ましい。また、結果の再現性を高めるため、リポソームの平均粒子径は５０〜５００ｎｍの一枚膜構造であるであることが望ましい。蛍光物質および被検物質に特異的に結合する化合物を修飾したリン脂質の濃度は、結合効率およびリポソーム安定性の点から脂質の総濃度に対して０．１〜０．５％であることが望ましい。極性を有する脂質の濃度はリポソームの安定性の点から脂質の総濃度に対して５〜１０％であることが望ましい。コレステロールの濃度はリポソーム安定性向上の点から脂質の総濃度に対して３０〜５０％であることが望ましい。糖質の濃度はリポソーム安定性向上の点から脂質の総濃度に対して、１〜１０倍程度であることが望ましい。リポソーム表面に結合する蛍光物質の数はリポソーム安定性の点から１００〜１００００であることが望ましい。   The total concentration of lipids constituting the liposomes is preferably 10 to 100 μmol / ml from the viewpoint of lipid stability. Moreover, in order to improve the reproducibility of the results, it is desirable that the average particle size of the liposome is a single membrane structure of 50 to 500 nm. The concentration of the phospholipid modified with the fluorescent substance and the compound that specifically binds to the test substance should be 0.1 to 0.5% with respect to the total lipid concentration in terms of binding efficiency and liposome stability. desirable. The concentration of the lipid having polarity is preferably 5 to 10% with respect to the total concentration of the lipid from the viewpoint of the stability of the liposome. The cholesterol concentration is preferably 30 to 50% of the total lipid concentration from the viewpoint of improving liposome stability. The sugar concentration is preferably about 1 to 10 times the total lipid concentration from the viewpoint of improving liposome stability. The number of fluorescent substances bound to the liposome surface is preferably 100 to 10,000 from the viewpoint of liposome stability.

基板上に固定する化合物の官能基は水酸基であることが望ましい。ただし、親水性を有する化合物であれば、この限りではない。   The functional group of the compound immobilized on the substrate is preferably a hydroxyl group. However, this is not limited as long as the compound has hydrophilicity.

本発明の一形態につき、図１を用いて説明する。   One mode of the present invention will be described with reference to FIG.

基板１には、被検物質および被検物質に対して特異的に結合し得る物質との複合体が固定されている。この複合体は、基板１の固定された被検物質に特異的に結合し得る物質を反応させることにより得ることができる。被検物質としては、例えば核酸、ウイルスまたはタンパク質を用いることができる。被検物質が核酸の場合、複合体は相補配列間のハイブリダイゼーションである。被検物質が抗原の場合、複合体は免疫反応による抗原抗体複合体である。被検物質に特異的に結合し得る物質の末端にはリポソーム標識体と結合可能な架橋物質が標識されている。架橋物質標識後、蛍光修飾リポソーム標識体を添加することにより、複合体にリポソームから成る蛍光集合体を標識する。架橋物質はビオチンおよびアビジンが一般的であるが、本発明はこれによって限定されるものではない。蛍光物質は蛍光修飾リン脂質として市販されているダンシルアミノ酸、ピレン、フルオレセイン、ローダミンまたはそれらの誘導体を用いることができる。   On the substrate 1, a test substance and a complex with a substance that can specifically bind to the test substance are fixed. This complex can be obtained by reacting a substance that can specifically bind to the test substance immobilized on the substrate 1. As the test substance, for example, nucleic acid, virus or protein can be used. When the test substance is a nucleic acid, the complex is hybridization between complementary sequences. When the test substance is an antigen, the complex is an antigen-antibody complex due to an immune reaction. The end of the substance that can specifically bind to the test substance is labeled with a cross-linking substance that can bind to the liposome label. After the cross-linking substance is labeled, a fluorescent aggregate comprising liposomes is labeled on the complex by adding a fluorescent modified liposome label. The cross-linking substances are generally biotin and avidin, but the present invention is not limited thereto. As the fluorescent substance, commercially available dansyl amino acids, pyrene, fluorescein, rhodamine or derivatives thereof as fluorescently modified phospholipids can be used.

リポソームの構成成分としては、リン脂質としてホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、などを挙げることができる。また、極性を与える脂質として、カチオン性を付与する場合はステアリルアミンを、アニオン性を付与する場合はホスファチジルグリセロールを用いることができる。抗体をリポソーム表面に修飾する場合は、リン脂質にホスファチジルエタノールアミンを用いて公知の方法で修飾することができる（文献Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ,１９９３,９，２４２−２５８）。糖質はグルコース、スクロースまたはトレハロースの一種または複数種を用いることができる。   Examples of the constituent components of the liposome include phosphatidylcholine and sphingomyelin as phospholipids. In addition, as the lipid imparting polarity, stearylamine can be used when imparting cationicity, and phosphatidylglycerol can be employed when imparting anionicity. When an antibody is modified on the liposome surface, it can be modified by a known method using phosphatidylethanolamine as a phospholipid (Literature Biotechnology Progress, 1993, 9, 242-258). As the saccharide, one or more of glucose, sucrose or trehalose can be used.

基板表面を親水性にするためには、マレイミド基を修飾した基板上にヒドロキシアルカンチオールを反応させることにより、基板表面に親水基を有する化合物が固定され、可能となる。基板の基材としては、ガラスプレートを用いることができる。   In order to make the substrate surface hydrophilic, a compound having a hydrophilic group is immobilized on the substrate surface by reacting the hydroxyalkanethiol on the substrate modified with the maleimide group. A glass plate can be used as the substrate of the substrate.

図１に示す構成を有する蛍光標識法を用いて被検物質の検出を行った。   A test substance was detected using a fluorescent labeling method having the configuration shown in FIG.

［実施例１］
（１）基板作成
プローブ担持担体の基材として、１インチ×３インチの合成石英ガラス基板を用いた。セミクリーンＫＧ（横浜油脂工業株式会社製）の１ｗｔ％水溶液に浸漬し、超音波を２分間照射した。さらに純水に浸漬して同様に超音波を２分間照射し、エアナイフで乾燥させた。さらにエキシマランプにてＵＶを２分間照射し、清浄面を有する基板を用意した。 [Example 1]
(1) Substrate preparation A 1-inch x 3-inch synthetic quartz glass substrate was used as a base material for the probe carrier. It was immersed in a 1 wt% aqueous solution of semi-clean KG (manufactured by Yokohama Oil & Fat Co., Ltd.) and irradiated with ultrasonic waves for 2 minutes. Furthermore, it was immersed in pure water, was similarly irradiated with ultrasonic waves for 2 minutes, and was dried with an air knife. Further, UV was irradiated for 2 minutes with an excimer lamp to prepare a substrate having a clean surface.

次にポリプロピレン製容器に入れたアミノシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ−９０３；信越化学工業（株）社製）と洗浄済みのガラス基板をポリカーボネート製チャンバに密閉封入し、１０分間ダイアフラムポンプでチャンバ内の空気をシランカップリング剤蒸気と置換した後、常温で３０分間シランカップリング剤蒸気に該ガラス基板を暴露した。次に、常圧クリーンオーブン内で１２０℃、１時間ベーキングを行い、純水で未反応のシランカップリング剤を洗浄除去して、アミノシランカップリング剤処理された基板を得た。   Next, the aminosilane coupling agent (trade name: KBM-903; manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) and a cleaned glass substrate in a polypropylene container and hermetically sealed glass substrate are hermetically sealed in a polycarbonate chamber, and the chamber is used with a diaphragm pump for 10 minutes. After the inside air was replaced with silane coupling agent vapor, the glass substrate was exposed to silane coupling agent vapor at room temperature for 30 minutes. Next, baking was performed at 120 ° C. for 1 hour in a normal pressure clean oven, and the unreacted silane coupling agent was washed away with pure water to obtain a substrate treated with an aminosilane coupling agent.

次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｄｏｊｉｎ社製；以後、ＥＭＣＳと略す）を０．０１ｗｔ％になるように１,４−ジオキサンに溶解させた。次にそのＥＭＣＳジオキサン溶液に上記アミノシランカップリング剤処理された基板を３０分間浸漬して、基板表面のアミノ基とＥＭＣＳを反応させた。続いて、ジオキサンで未反応のＥＭＣＳを除去洗浄し、ドラフト内でジオキサンをエアー除去して、表面にマレイミド基を導入した基板を得た。   Next, N-maleimidocaproyloxysuccinimide (manufactured by Dojin; hereinafter abbreviated as EMCS) was dissolved in 1,4-dioxane so as to be 0.01 wt%. Next, the substrate treated with the aminosilane coupling agent was immersed in the EMCS dioxane solution for 30 minutes to react the amino group on the substrate surface with EMCS. Subsequently, unreacted EMCS was removed and washed with dioxane, and the dioxane was removed by air in a draft to obtain a substrate having maleimide groups introduced on the surface.

（２）プローブＤＮＡの合成
本実施例においてプローブは、検出しようとする標的核酸の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有し、該標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ（交雑反応）することで標的核酸を検出する１本鎖核酸を用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１および、配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってメルカプト基を導入した。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた
５’ＨＳ−ＣＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣ ３’（配列番号：１）。 (2) Synthesis of probe DNA In this example, the probe has a base sequence complementary to all or part of the target nucleic acid to be detected, and specifically hybridizes with the base sequence of the target nucleic acid ( A single-stranded nucleic acid that detects a target nucleic acid by a cross reaction) was used. SEQ ID NO: 1 and a single-stranded nucleic acid of SEQ ID NO: 1 were synthesized using an automatic DNA synthesizer. A mercapto group was introduced into the single-stranded DNA end of SEQ ID NO: 1 by using a thiol modifier (manufactured by Glen Research) during synthesis with an automatic DNA synthesizer. Subsequently, normal deprotection was performed, the DNA was collected, purified by high performance liquid chromatography, and 5′HS-CGTACGATCGATGTAGTAGTAGCATGC 3 ′ (SEQ ID NO: 1) used in the following experiment.

（３）蛍光修飾リポソームの調製
ジパルミトイルホスファチジルコリン(１５．７６μｍｏｌ)、ステアリルアミン(４μｍｏｌ)、コレステロール(２０μｍｏｌ)、ビオチン修飾ホスファチジルエタノールアミン(０．０４μｍｏｌ)、ローダミン修飾ホスファチジルエタノールアミン(０．２μｍｏｌ)を溶解したクロロホルム溶液を１００ｍｌのナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて窒素雰囲気および４０℃の条件下において２時間減圧乾燥することにより、ナス型フラスコの内壁面に脂質薄膜を形成した。次に、スクロースを５０ｍＭ溶解したＭＯＰＳ緩衝塩溶液(１０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２)１ｍｌをナス型フラスコに添加した後、ボルテックスミキサーを用いて、１０分間振とうすることにより、多重層リポソームを形成した。この溶液を、ＡＶＥＳＴＩＮ社製リポソーム調整器ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−Ｂａｓｉｃを用いて、ポアサイズ５０ｎｍのポリカーボネートフィルターに通過させることにより、１枚膜リポソームを調製した。調製後、４℃、１５０００ｇの条件で１０分間遠心分離を行うことにより、リポソームとリポソーム未形成の脂質を分離した。 (3) Preparation of fluorescently modified liposomes Dipalmitoylphosphatidylcholine (15.76 μmol), stearylamine (4 μmol), cholesterol (20 μmol), biotin-modified phosphatidylethanolamine (0.04 μmol), rhodamine-modified phosphatidylethanolamine (0.2 μmol) The dissolved chloroform solution was put into a 100 ml eggplant type flask and dried under reduced pressure for 2 hours under a nitrogen atmosphere and at 40 ° C. using a rotary evaporator to form a lipid thin film on the inner wall surface of the eggplant type flask. Next, 1 ml of a MOPS buffered salt solution (10 mM MOPS, 50 mM NaCl, pH 7.2) in which 50 mM sucrose is dissolved is added to the eggplant-shaped flask, and then shaken for 10 minutes using a vortex mixer to obtain multilamellar liposomes. Formed. This solution was passed through a polycarbonate filter having a pore size of 50 nm using a liposome regulator LiposoFast-Basic manufactured by AVESTIN, to prepare a single membrane liposome. After the preparation, the liposome and the liposome-free lipid were separated by centrifuging at 4 ° C. and 15000 g for 10 minutes.

リポソームの粒子径は光散乱法を用いて測定した。測定装置はＺｅｔａｓｉｚｅｒ３０００（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ.製）を用いた。調製直後におけるリポソームの平均粒子径は、糖の有無に関わらず約８０ｎｍであった。また、４℃で保存した場合、リポソームの平均粒子径は調製１週間後においてもほとんど変化しなかった。粒子径と既報（文献Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ, ９, １９９３，２４２−２５８)による脂質の表面積より、本実施例で調製したリポソームは、表面に約２０００分子の蛍光物質が結合していることが明らかとなった。   The particle size of the liposome was measured using a light scattering method. A Zetasizer 3000 (manufactured by Malvern Instruments Ltd.) was used as a measuring apparatus. The average particle size of the liposomes immediately after preparation was about 80 nm regardless of the presence or absence of sugar. When stored at 4 ° C., the average particle size of the liposomes hardly changed even after 1 week of preparation. From the particle size and the surface area of the lipid according to the previous report (Literature Biotechnology Progress, 9, 1993, 242-258), it was revealed that the liposome prepared in this example had about 2000 molecules of fluorescent substance bound to the surface. It was.

（４）プローブの固定および基板表面修飾
上記(２)で合成したＤＮＡ断片（配列番号：１）をグリセリン１５重量％、尿素１５重量％、ジエチレングリコール９重量％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥ１００;川研ファインケミカル（株）社製）０．０１重量％を含む水溶液に溶解した。ＤＮＡ断片の濃度は０．１ｎＭ〜１０μＭとなるように調製した。 (4) Probe immobilization and substrate surface modification The DNA fragment (SEQ ID NO: 1) synthesized in (2) above was prepared by using glycerin 15% by weight, urea 15% by weight, diethylene glycol 9% by weight, acetylene alcohol (trade name: acetylenol E100; It was dissolved in an aqueous solution containing 0.01% by weight (manufactured by Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.). The concentration of the DNA fragment was adjusted to be 0.1 nM to 10 μM.

これらのＤＮＡ断片を含む水溶液それぞれを市販のインクジェットプリンター（キヤノン（株）製、型番ＢＪＦ−８５０）を改造した装置で、上記(１)の方法によって作製したスライドガラスに別々にスポッティングした。この際、１５倍のルーペによる観測ではサテライトスポット（液体が固相表面に着弾したときの飛沫に由来するスポット）は観測されなかった。   Each of the aqueous solutions containing these DNA fragments was spotted separately on a slide glass produced by the method (1) above using a device obtained by remodeling a commercially available inkjet printer (manufactured by Canon Inc., model number BJF-850). At this time, satellite spots (spots derived from droplets when the liquid landed on the solid phase surface) were not observed by observation with a 15-fold magnifier.

プローブを含む溶液をインクジェット法にてスポッティングしたスライドガラスを室温で３０分間放置した後、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．０)で洗浄した。さらに純水で洗浄後、スピンドライを行うことにより、スライドガラスを乾燥した。   The glass slide spotted with the solution containing the probe was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then washed with a 1M NaCl / 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0). Further, after washing with pure water, the slide glass was dried by spin drying.

次に、スライドガラスを１０μＭの６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール溶液に室温で３０分間浸漬し、スライドガラス表面に６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオールを固定化した。   Next, the slide glass was immersed in a 10 μM 6-hydroxy-1-hexanethiol solution at room temperature for 30 minutes to immobilize 6-hydroxy-1-hexanethiol on the slide glass surface.

（５）ハイブリダイゼーション
基板に結合させたＤＮＡと相補的な配列を持つ、２５ｍｅｒのビオチン標識ＤＮＡをシグマアルドリッチジャパン株式会社に依頼して合成した。ビオチン標識ＤＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解し、得られた溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、ハイブリダイゼーション反応を４５℃で２時間行った。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液を用いて、未反応物質を洗い流した。 (5) Hybridization A 25-mer biotin-labeled DNA having a sequence complementary to the DNA bound to the substrate was synthesized by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd. Biotin-labeled DNA was dissolved in 1 M NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to a final concentration of 1 μM, 2 ml of the resulting solution was enclosed in a hybrid pack together with the substrate, and the hybridization reaction was performed at 45 ° C. for 2 Went for hours. Thereafter, unreacted substances were washed away using a 1 M NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution on the substrate.

（６）リポソーム標識
ハイブリダイゼーション後、１μＭのストレプトアビジン溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、室温で３０分反応させることにより、ハイブリッド形成したビオチン修飾ＤＮＡにストレプトアビジンを結合した。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合のストレプトアビジンを洗い流した。 (6) Liposome labeling After hybridization, 2 ml of a 1 μM streptavidin solution was enclosed in a hybrid pack together with a substrate and reacted at room temperature for 30 minutes to bind streptavidin to the hybridized biotin-modified DNA. Thereafter, unbound streptavidin was washed away from the substrate with a 1 M NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution.

次に、１μＭに希釈した上記(３)で調製した蛍光修飾リポソーム溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、室温で３０分反応させることにより、プローブ担体にリポソーム蛍光集合体を標識した。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合の蛍光修飾リポソームを洗い流した。   Next, 2 ml of the fluorescence-modified liposome solution prepared in (3) diluted to 1 μM was enclosed in a hybrid pack together with the substrate, and reacted at room temperature for 30 minutes, thereby labeling the liposome fluorescent aggregate on the probe carrier. Thereafter, unbound fluorescently modified liposomes were washed off with a 1M NaCl / 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0).

リポソーム標識体との輝度比較のため、１μＭのローダミン修飾ストレプトアビジン溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、室温で３０分反応させることにより、ハイブリッド形成したビオチン修飾ＤＮＡにローダミン修飾ストレプトアビジンを結合した。   In order to compare the brightness with the liposome label, 2 ml of 1 μM rhodamine-modified streptavidin solution was enclosed in a hybrid pack together with the substrate, and reacted at room temperature for 30 minutes to bind rhodamine-modified streptavidin to the hybridized biotin-modified DNA. .

（７）蛍光測定
リポソーム標識後のプローブ担体を蛍光検出装置(Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ)を用いて蛍光測定を行った（蛍光測定波長５３２ｎｍ）。 (7) Fluorescence measurement Fluorescence measurement was performed on the probe carrier after liposome labeling using a fluorescence detector (Axon, GenePix 4000B) (fluorescence measurement wavelength 532 nm).

標識体結合時における蛍光強度をシグナル強度、標識体未結合時における蛍光強度をブランク強度と定義した。リポソームを標識体として用いた場合は、リポソーム標識後に非イオン性の界面活性剤（本実施例では０．０１重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用）を用いてリポソームを崩壊した後の蛍光強度をブランク強度とした。そして、ブランク強度に対して３倍のシグナル強度が得られるプローブ担体濃度を検出下限とした。   The fluorescence intensity when the label was bound was defined as the signal intensity, and the fluorescence intensity when the label was not bound was defined as the blank intensity. When liposomes are used as the label, the fluorescence intensity after disintegrating the liposomes using a nonionic surfactant (in this example, 0.01% by weight Triton X-100) is used after liposome labeling. The blank strength was used. The probe carrier concentration at which a signal intensity three times that of the blank intensity was obtained was taken as the lower limit of detection.

ローダミン修飾ストレプトアビジンを標識した場合におけるプローブＤＮＡの検出下限は２５ｎＭであった。これに対し、ローダミン修飾リポソームを標識した場合におけるプローブＤＮＡの検出下限は５ｎＭとなり、リポソームを標識体として用いることにより、検出感度が５倍向上したことが明らかとなった。   The lower limit of detection of probe DNA when rhodamine-modified streptavidin was labeled was 25 nM. On the other hand, when the rhodamine-modified liposome was labeled, the lower limit of detection of the probe DNA was 5 nM, and it was revealed that the detection sensitivity was improved 5 times by using the liposome as a label.

次に、ブランク強度の比較を行った。リポソーム未標識のブランク強度を１とした場合、糖修飾リポソームおよび基板表面に親水性化合物を結合した場合のブランク強度は１．８、糖未修飾のリポソームを用いた場合のブランク強度は３．８、基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は８．５、糖未修飾および基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は１１．７となり、糖修飾および基板表面への親水性化合物結合により、リポソームが基板上に安定に存在することが明らかとなった。   Next, the blank strength was compared. When the blank strength of liposome-unlabeled is 1, the blank strength when the hydrophilic compound is bound to the sugar-modified liposome and the substrate surface is 1.8, and the blank strength when the sugar-unmodified liposome is used is 3.8. When the hydrophilic compound is not bonded to the substrate surface, the blank strength is 8.5, and when the sugar is not modified and the hydrophilic compound is not bonded to the substrate surface, the blank strength is 11.7. It was revealed that liposomes exist stably on the substrate due to the hydrophilic compound binding to the surface.

［実施例２］
（１）抗原抗体複合体の形成
ウサギＩｇＧ試料溶液(分子量約１５０．０００) １μｌを実施例１(１)で作成した合成石英ガラス基板上に滴下した。滴下した抗原の濃度は０．１ｎＭ〜１０μＭとなるように調製した。室温で基板を乾燥後、１０μＭの６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール溶液に室温で３０分間浸漬することにより、基板表面に６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオールを固定化した。 [Example 2]
(1) Formation of antigen-antibody complex 1 μl of rabbit IgG sample solution (molecular weight about 150.000) was dropped on the synthetic quartz glass substrate prepared in Example 1 (1). The concentration of the dropped antigen was adjusted to 0.1 nM to 10 μM. After drying the substrate at room temperature, 6-hydroxy-1-hexanethiol was immobilized on the surface of the substrate by immersing in a 10 μM 6-hydroxy-1-hexanethiol solution at room temperature for 30 minutes.

次に１０μＭのビオチン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液１μｌをウサギＩｇＧのスポット上に滴下し、３７℃で１時間インキュベートを行った。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合の抗体を洗い流した。   Next, 1 μl of 10 μM biotin-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody solution was dropped onto the spot of rabbit IgG and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the unbound antibody was washed away with a 1 M NaCl / 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0).

（２）リポソーム標識
抗原抗体反応後、１０μＭのストレプトアビジン溶液１μｌを抗原抗体複合体のスポット上に滴下し、室温で３０分反応させることにより、抗原抗体複合体にストレプトアビジンを結合した。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合のストレプトアビジンを洗い流した。 (2) Liposome labeling After the antigen-antibody reaction, 1 μl of 10 μM streptavidin solution was dropped on the spot of the antigen-antibody complex and reacted at room temperature for 30 minutes to bind the streptavidin to the antigen-antibody complex. Thereafter, unbound streptavidin was washed away from the substrate with a 1M NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution.

次に、１０μＭに希釈した実施例１(３)で調製した蛍光修飾リポソーム溶液１μｌを抗原抗体複合体のスポット上に滴下し、室温で３０分反応させることにより、抗原抗体複合体にリポソーム蛍光集合体を標識した。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて未結合の蛍光修飾リポソームを洗い流した。   Next, 1 μl of the fluorescence-modified liposome solution prepared in Example 1 (3) diluted to 10 μM is dropped on the spot of the antigen-antibody complex and reacted at room temperature for 30 minutes, whereby the liposome-antibody complex is assembled to the antigen-antibody complex. The body was labeled. Thereafter, the unbound fluorescently modified liposomes were washed away with a 1M NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution.

リポソーム標識体との輝度比較のため、１０μＭのローダミン修飾ストレプトアビジン溶液１μｌを抗原抗体複合体のスポット上に滴下し、室温で３０分反応させることにより、抗原抗体複合体にローダミン修飾ストレプトアビジンを結合した。   To compare the brightness with the liposome-labeled substance, 1 μl of 10 μM rhodamine-modified streptavidin solution is dropped on the spot of the antigen-antibody complex and reacted at room temperature for 30 minutes to bind rhodamine-modified streptavidin to the antigen-antibody complex. did.

（３）蛍光測定
リポソーム標識後の抗原抗体複合体を蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った（蛍光測定波長５３２ｎｍ）。 (3) Fluorescence measurement The antigen-antibody complex after liposome labeling was subjected to fluorescence measurement using a fluorescence detector (Axon, GenePix 4000B) (fluorescence measurement wavelength 532 nm).

実施例１と同様に、標識体結合時における蛍光強度をシグナル強度、標識体未結合時における蛍光強度をブランク強度と定義した。リポソームを標識体として用いた場合は、リポソーム標識後に非イオン性の界面活性剤(本実施例では０．０１重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用)を用いてリポソームを崩壊した後の蛍光強度をブランク強度とした。そして、ブランク強度に対して３倍のシグナル強度が得られるプローブ担体濃度を検出下限とした。   As in Example 1, the fluorescence intensity when the label was bound was defined as the signal intensity, and the fluorescence intensity when the label was not bound was defined as the blank intensity. When liposomes are used as the label, the fluorescence intensity after disintegrating the liposomes using a nonionic surfactant (in this example, 0.01% by weight Triton X-100) is used after labeling the liposomes. The blank strength was used. The probe carrier concentration at which a signal intensity three times that of the blank intensity was obtained was taken as the lower limit of detection.

ローダミン修飾ストレプトアビジンを標識した場合における抗原の検出下限は５０ｎＭであった。これに対し、ローダミン修飾リポソームを標識した場合における抗原の検出下限は２５ｎＭとなり、リポソームを標識体として用いることにより、検出感度が２倍向上したことが明らかとなった。   The lower limit of detection of the antigen when rhodamine-modified streptavidin was labeled was 50 nM. In contrast, when the rhodamine-modified liposome was labeled, the lower limit of detection of the antigen was 25 nM, and it was revealed that the detection sensitivity was improved by a factor of 2 by using the liposome as a label.

次に、ブランク強度の比較を行った。リポソーム未標識のブランク強度を１とした場合、糖修飾リポソームおよび基板表面に親水性化合物を結合した場合のブランク強度は１．４、糖未修飾のリポソームを用いた場合のブランク強度は３．２、基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は６．７、糖未修飾および基板表面に親水性化合物を結合しなかった場合のブランク強度は１０．８となり、糖修飾および基板表面への親水性化合物結合により、リポソームが基板上に安定に存在することが明らかとなった。   Next, the blank strength was compared. When the non-liposome blank strength is 1, the blank strength when a hydrophilic compound is bound to the sugar-modified liposome and the substrate surface is 1.4, and the blank strength when a sugar-unmodified liposome is used is 3.2. The blank strength when the hydrophilic compound is not bonded to the substrate surface is 6.7, and the blank strength when the hydrophilic compound is not bonded to the substrate surface is 10.8. It was revealed that liposomes exist stably on the substrate due to the hydrophilic compound binding to the surface.

本発明のリポソームを蛍光標識体として用いた、遺伝子検出法の概略図である。It is the schematic of the gene detection method using the liposome of this invention as a fluorescent label.

符号の説明Explanation of symbols

１ 基板
２ プローブ物質
３ ターゲット物質
４ ビオチン
５ ストレプトアビジン
６ リポソーム
７ 糖質
８ 蛍光物質
９ 親水性化合物 1 Substrate 2 Probe material 3 Target material 4 Biotin 5 Streptavidin 6 Liposomes 7 Carbohydrate 8 Fluorescent material 9 Hydrophilic compound

Claims (7)

基板表面に固定化した被検物質を、標識物質を用いて検出する方法であって、
該標識物質はリン脂質、極性を有する脂質、該被検物質に特異的に結合する化合物を修飾したリン脂質、コレステロールおよび糖質から構成される脂質二分子膜から成る小胞体であることを特徴とする被検物質の検出方法。 A method of detecting a test substance immobilized on a substrate surface using a labeling substance,
The labeling substance is a vesicle composed of a phospholipid, a lipid having polarity, a phospholipid modified with a compound that specifically binds to the test substance, a lipid bilayer composed of cholesterol and a carbohydrate. A method for detecting a test substance. 前記被検物質が核酸、ウイルスまたはタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。   The method for detecting a test substance according to claim 1, wherein the test substance is a nucleic acid, a virus, or a protein. 前記蛍光物質がダンシルアミノ酸、ピレン、フルオレセイン、ローダミンまたはそれらの誘導体の一種であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。   The method for detecting a test substance according to claim 1, wherein the fluorescent substance is one of dansyl amino acid, pyrene, fluorescein, rhodamine or derivatives thereof. 前記被検物質に特異的に結合する化合物がビオチンであることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。   The method for detecting a test substance according to claim 1, wherein the compound that specifically binds to the test substance is biotin. 前記被検物質に特異的に結合する化合物が抗体であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。   The method for detecting a test substance according to claim 1, wherein the compound that specifically binds to the test substance is an antibody. 前記糖質がグルコース、スクロースおよびトレハロースのいずれか一種または複数種であることを特徴とする請求項１に記載の被検物質の検出方法。   The method for detecting a test substance according to claim 1, wherein the sugar is one or more of glucose, sucrose, and trehalose. 基板表面に固定化した被検物質を、標識物質として脂質二分子膜を用いて検出する方法であって、該基板表面に親水基を有する化合物が固定され、該脂質二分子膜の構成成分が極性を有する脂質を有し、該脂質二分子膜の平均粒子径が５０〜５００ｎｍの一枚膜構造であることを特徴とする被検物質の検出方法。   A method for detecting a test substance immobilized on a substrate surface using a lipid bilayer membrane as a labeling substance, wherein a compound having a hydrophilic group is immobilized on the substrate surface, and the components of the lipid bilayer membrane are A method for detecting a test substance, comprising a lipid having polarity, wherein the lipid bilayer membrane has a single membrane structure with an average particle diameter of 50 to 500 nm.

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