JP2009235064A - Processes for producing blood glucose level elevation suppressor and starfish collagen peptide using starfish collagen peptide as effective ingredient - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤およびヒトデコラーゲンペプチドの製造方法に関する。 The present invention relates to a blood sugar level increase inhibitor comprising a human decollagen peptide as an active ingredient and a method for producing a human decollagen peptide.
ヒトデの多くは貝や魚を食べる肉食性で、養殖の篭に入り込んで養殖生物を食べてしまうため、北海道の主要な養殖であるホタテの養殖のほか、エビ、ツブ、カニ、アサリ、ホッキ等の養殖に被害を与え、漁業に深刻な影響を及ぼしている。現在、ヒトデを捕獲し陸揚げすることによる懸命な駆除が行われているが、その数は一向に減少していない。 Most starfish are carnivorous that eat shellfish and fish, and enter the aquaculture cages and eat the aquatic organisms, so in addition to scallop aquaculture, which is the main culture in Hokkaido, shrimp, tsubu, crab, clams, hocchi, etc. Damaging aquaculture and seriously affecting the fishery. At present, hard extermination is being carried out by capturing and landing starfish, but the number has not decreased.
また、棘皮動物であるヒトデは、多くの塩分やサポニンを含んでいる。サポニンはコレステロールの吸収を抑制する等健康上有用な物質にも挙げられるが、作用の強いものには経口毒性があるため、ヒトデそのものは食用に適さない。そのため、捕獲・陸揚げされたヒトデは、水産廃棄物として焼却処理または埋め立て処理がされているほか、肥料として加工されている。 Starfish, which is an echinoderm, contains a lot of salt and saponins. Although saponins are listed as health-useful substances, such as inhibiting cholesterol absorption, starfish itself is not edible because it has oral toxicity for those with strong action. Therefore, the captured and unloaded starfish are incinerated or landfilled as marine waste, and processed as fertilizer.
従来、水産廃棄物を有効利用する試みがいくつかなされている。例えば、特開平９−１０２４６号公報では、水産廃棄物である魚皮コラーゲンの活用を可能にした代用皮膚（特許文献１）が開示されており、また、特開２００６−１２４２５８号公報では、醸造酢を用いて水産廃棄物である魚の頭や内臓等の腐敗を防ぎ、同時にアミノ酸を生成させた液体肥料が開示されている（特許文献２）。 Some attempts have been made to effectively use marine waste. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-10246 discloses a skin substitute (Patent Document 1) that enables the use of fish skin collagen, which is a marine waste, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-124258 discloses brewing. A liquid fertilizer is disclosed in which vinegar is used to prevent spoilage of fish heads and internal organs, which are marine wastes, and at the same time, amino acids are produced (Patent Document 2).
また、特開２００６−２７１３３２号公報には、本発明者等により水産廃棄物であるイトマキヒトデの幽門盲のうから見出されたトリプシン活性を有するポリペプチドが開示されている（特許文献３）。 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-271332 discloses a polypeptide having trypsin activity, which was found by the present inventors from the pyloric blindness of a seafood waste, Itokimaki starfish (Patent Document 3).
しかしながら、ヒトデの焼却処理についてはヒトデが高水分かつ高塩分であることから焼却施設を傷めてしまうこと、埋め立て処理については埋め立て施設の処理能力に限界を来して新たな受け入れが困難となっていること、さらに、肥料への加工については一定の施肥効果が認められるものの、コストがかさんでしまうこと等、様々な問題が生じている。 However, for starfish incineration, the starfish is high in moisture and salt, which damages the incineration facility. For landfill processing, the capacity of the landfill facility is limited, making new acceptance difficult. In addition, although a certain fertilization effect is recognized for processing to fertilizer, various problems such as cost increase have occurred.
また、トリプシン活性を有するポリペプチドすなわち酵素は、ヒトデの分泌物であり、ヒトデそのものを有効利用するものではない。ヒトデそのものは、これまで肥料へ加工する以外、有効利用形態がほとんどないため、さらなるヒトデそのものの有効利用形態が求められている。 In addition, a polypeptide having trypsin activity, that is, an enzyme, is a secreted product of starfish, and does not effectively use starfish itself. Since the starfish itself has almost no effective utilization form other than processing to a fertilizer until now, the further effective utilization form of the starfish itself is calculated | required.
他方、昨今において、生活習慣の変化から糖尿病患者は増加傾向にあり、そのうちの９５％以上が２型糖尿病患者である。２型糖尿病患者の多くはインスリン抵抗性を誘発しており、このような病態にも対応可能な血糖値上昇抑制作用を奏する薬剤の開発が望まれている。 On the other hand, in recent years, diabetic patients are increasing due to changes in lifestyle habits, and more than 95% of them are type 2 diabetic patients. Many patients with type 2 diabetes induce insulin resistance, and the development of a drug capable of suppressing the increase in blood glucose level that can cope with such pathological conditions is desired.
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、水産廃棄物であるヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤およびヒトデコラーゲンペプチドの製造方法を提供することを目的としている。 The present invention has been made to solve such problems, and provides a method for producing a human decollagen peptide and a blood sugar level increase inhibitor comprising human decollagen peptide, which is a marine waste, as an active ingredient. It is an object.
本発明者等は、ヒトデをプロテアーゼ処理して得られる加水分解物にコラーゲンペプチドが多く含まれること、さらにはそのコラーゲンペプチドが血糖値上昇抑制効果を有することを見出し、本発明に至った。 The present inventors have found that a hydrolyzate obtained by subjecting starfish to protease treatment contains a large amount of collagen peptide, and further, that the collagen peptide has an effect of suppressing an increase in blood glucose level, and has led to the present invention.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ ヒトデをプロテアーゼ処理して得られるヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤。
［２］ 前記ヒトデコラーゲンペプチドが２０〜５０μｍの粒子径分布を有する担体を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供して得られる低分子の主要画分のヒトデコラーゲンペプチドである、［１］に記載の血糖値上昇抑制剤。
［３］ 前記プロテアーゼが弱酸性ないし中性プロテアーゼである、［１］または［２］に記載の血糖値上昇抑制剤。
［４］ グルコース吸収阻害剤である、［１］から［３］のいずれかに記載の血糖値上昇抑制剤。
［５］ 前記ヒトデがアルカリ処理、酸処理および水浸処理されたヒトデである、［１］から［４］のいずれかに記載の血糖値上昇抑制剤。
［６］ 前記ヒトデが水浸処理されたヒトデであって、かつ前記ヒトデコラーゲンペプチドが前記加水分解物から得られる加水分解液を珪藻土濾過、限外濾過および逆浸透膜濾過のうちのいずれか１または２以上の濾過処理をして得られるヒトデコラーゲンペプチドである、［１］から［４］のいずれかに記載の血糖値上昇抑制剤。
［７］ ヒトデをアルカリ処理、酸処理および水浸処理するヒトデ処理工程と、前記ヒトデ処理後に弱酸性ないし中性プロテアーゼで処理をしてヒトデ加水分解物を生成するヒトデ加水分解物生成工程と、前記ヒトデ加水分解物からヒトデコラーゲンペプチドを回収するヒトデコラーゲンペプチド回収工程とを有するヒトデコラーゲンペプチドの製造方法。
［８］ ヒトデを水浸処理する水浸処理工程と、前記水浸処理後に弱酸性ないし中性プロテアーゼで処理をしてヒトデ加水分解物を生成するヒトデ加水分解物生成工程と、前記ヒトデ加水分解物からヒトデ加水分解液を回収するヒトデ加水分解液回収工程と、前記ヒトデ加水分解液から珪藻土濾過、限外濾過および逆浸透膜濾過のうちのいずれか１または２以上の濾過処理をしてヒトデコラーゲンペプチドを回収するヒトデコラーゲンペプチド回収工程とを有するヒトデコラーゲンペプチドの製造方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A blood sugar level increase inhibitor comprising a starfish collagen peptide obtained by treating a starfish with a protease as an active ingredient.
[2] The blood glucose according to [1], wherein the human decollagen peptide is a human decollagen peptide of a low molecular main fraction obtained by gel filtration chromatography using a carrier having a particle size distribution of 20 to 50 μm. Value increase inhibitor.
[3] The blood glucose level elevation inhibitor according to [1] or [2], wherein the protease is a weakly acidic or neutral protease.
[4] The blood glucose level elevation inhibitor according to any one of [1] to [3], which is a glucose absorption inhibitor.
[5] The blood sugar level increase inhibitor according to any one of [1] to [4], wherein the starfish is a starfish that has been subjected to alkali treatment, acid treatment, and water immersion treatment.
[6] The starfish is a starfish that has been subjected to water immersion treatment, and a hydrolyzate obtained from the hydrolyzate of the starfish collagen peptide is any one of diatomaceous earth filtration, ultrafiltration, and reverse osmosis membrane filtration. Alternatively, the blood sugar level increase inhibitor according to any one of [1] to [4], which is a human decollagen peptide obtained by two or more filtration treatments.
[7] A starfish treatment step in which starfish is subjected to alkali treatment, acid treatment and water immersion treatment, and a starfish hydrolyzate production step in which a starfish hydrolyzate is produced by treatment with the weakly acidic or neutral protease after the starfish treatment, A method for producing a human decollagen peptide, comprising a step of recovering a human decollagen peptide from the hydrolyzate of starfish.
[8] A water immersion treatment step for water-treating starfish, a starfish hydrolyzate production step for producing a starfish hydrolyzate by treatment with a weakly acidic or neutral protease after the water immersion treatment, and the starfish hydrolysis A starfish hydrolyzate recovering step for recovering a starfish hydrolyzate from the product, and subjecting the starfish hydrolyzate to one or more filtration processes of diatomaceous earth filtration, ultrafiltration and reverse osmosis membrane filtration. A method for producing a human decollagen peptide comprising a human decollagen peptide recovery step of recovering a collagen peptide.
本発明によれば、処分することが困難な水産廃棄物であるヒトデそのものをヒトデコラーゲンペプチドとして有効利用するとともに、インスリン抵抗性を有する２型糖尿病患者にも有効な血糖値上昇抑制剤およびヒトデコラーゲンペプチドの製造方法を提供することができる。 According to the present invention, a starfish itself, which is a marine waste that is difficult to dispose of, is effectively used as a human decollagen peptide, and an inhibitor of blood sugar level increase and a human decollagen that are also effective for type 2 diabetic patients with insulin resistance A method for producing a peptide can be provided.
以下、本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤およびヒトデコラーゲンペプチドの製造方法について詳細に説明する。本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤は、ヒトデをプロテアーゼ処理することにより加水分解して得られるヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする。 Hereinafter, the method for producing a blood glucose level increase inhibitor and a human decollagen peptide comprising the human decollagen peptide according to the present invention as an active ingredient will be described in detail. The blood glucose level increase inhibitor comprising the star decollagen peptide according to the present invention as an active ingredient comprises a human decollagen peptide obtained by hydrolyzing starfish by protease treatment.
本発明におけるヒトデコラーゲンペプチドの「ペプチド」は、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチドフラグメント」または「ペプチド部分断片」と交換可能に用いられる。一方、「コラーゲン」とは、型を含め特に限定されないが、主たる抗原部位であるテロペプチドをペプシン処理により消化して得られるアテロコラーゲンのほか、コレクチン、フィコリン、アディポネクチン、マクロファージスカベンジャー受容体等のコラーゲン様領域を有するタンパク質も含む趣旨である。 The “peptide” of the human decollagen peptide in the present invention is used interchangeably with “polypeptide”, “protein”, “peptide fragment” or “peptide partial fragment”. On the other hand, “collagen” is not particularly limited including type, but in addition to atelocollagen obtained by digesting the main antigenic site of telopeptide by pepsin treatment, collagen-like such as collectin, ficolin, adiponectin, macrophage scavenger receptor, etc. This also includes a protein having a region.
本発明におけるヒトデの種類は特に限定されず、例えば、棘皮動物門のヒトデ綱、ムカシヒトデ綱、クモヒトデ綱、シャリンヒトデ綱、座ヒトデ綱等に属するものが挙げられ、具体的には、漁業被害の主な対象であるマヒトデ（Ａｓｔｅｒｉａｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）やニッポンヒトデ（Ｄｉｓｔｏｌａｓｔｅｒｉａｓ ｎｉｐｏｎ）、イトマキヒトデ（Ａｓｔｅｒｉａ ｐｅｃｔｉｎｆｅｒａ）のほか、アカヒトデ（Ｃｅｒｔｏｎａｒｄｏａ ｓｅｍｉｒｅｇｕｌａｒｉｓ）、オニヒトデ（Ａｃａｎｔｈａｓｔｅｒ ｐｌａｎｃｉ）、トゲモミジガイ（Ａｓｔｒｏｐｅｃｐｔｅｎ ｐｏｌｙａｃａｎｔｈｕｓ）、スナヒトデ（Ｌｕｉｄｉａ ｑｕｉｎａｒｉａ）、ヤツデスナヒトデ（Ｌｕｉｄｉａ ｍａｃｕｌａｔａ）、タコヒトデ（Ｐｌａｚａｓｔｅｒ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、ヤツデヒトデ（Ｃｏｓｃｉｎａｓｔｅｒｉａｓ ａｃｕｔｉｓｐｉｎａ）、ニホンクモヒトデ（Ｏｐｈｉｏｐｌｏｃｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シャリンヒトデ（Ｘｙｌｏｐｌａｘ ｓｐｐ．）等を挙げることができる。また、ヒトデは生のままのほか、冷凍したものや乾燥後粉末化したものを用いてもよく、その態様も限定されない。 The type of starfish in the present invention is not particularly limited, and examples include those belonging to the class Echinodermata, Starfish class, Spider starfish class, Sharin starfish class, Zodiac starfish class, and the like. is the main target Mahitode (Asterias amurensis) and Japan starfish (Distolasterias nipon), starfish (Asteria pectinfera) in addition, Akahitode (Certonardoa semiregularis), crown-of-thorns starfish (Acanthaster planci), astropecten polyacanthus (Astropecpten polyacanthus), Sunahitode (Luidia quinaria) , Luidia maculata, Octopus starfish (Plazas) er borealis), Yatsudehitode (Coscinasterias acutispina), Nihon spider starfish (Ophioplocus japonicus), sea daisy (Xyloplax spp.), and the like can be given. In addition to raw starfish, frozen starfish or powdered powder after drying may be used, and the mode is not limited.
本発明におけるゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＦＣ）は、２０〜５０μｍの粒子径分布を有する担体を用いたものであれば、膨張時間や温度、カラムサイズ等の諸条件は特に限定されず、２０〜５０μｍの粒子径分布を有する担体は適宜選択することができる。本実施例においては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を担体として用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行っている。 In the present invention, gel filtration chromatography (GFC) is not particularly limited in terms of conditions such as expansion time, temperature, and column size, as long as it uses a carrier having a particle size distribution of 20 to 50 μm. A carrier having a particle size distribution of 20 to 50 μm can be appropriately selected. In this example, gel filtration chromatography is performed using Sephadex G-50 Superfine (GE Healthcare Bioscience) as a carrier.
本発明にいう「低分子の主要画分」とは、ヒトデをプロテアーゼ処理して得られるコラーゲンペプチドを、２０〜５０μｍの粒子径分布を有する担体を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供した結果、得られる複数の画分（縦軸を２３０ｎｍ吸光度、横軸を時間すなわち分子量とした場合に現れる複数のピーク）のうち、低分子を示す主要な画分（時間の遅いことを示す高いピークすなわち分子量の小さいことを示す高いピーク）をいう。 The “low molecular weight main fraction” referred to in the present invention is obtained as a result of subjecting a collagen peptide obtained by subjecting starfish to a protease to gel filtration chromatography using a carrier having a particle size distribution of 20 to 50 μm. Out of a plurality of fractions (a plurality of peaks appearing when the vertical axis is absorbance at 230 nm and the horizontal axis is time, ie, molecular weight), the main fraction showing low molecules (high peak showing late time, ie, molecular weight High peak indicating smallness).
本発明におけるプロテアーゼは、ヒトデが有するペプチドやタンパク質のペプチド結合を加水分解することができるものであれば特に限定されず、例えば、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、またはアルカリプロテアーゼのいずれであるか、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼのいずれであるか、エキソペプチダーゼ、エンドペプチダーゼのいずれであるか等は問われない。なお、本実施例においては、食品添加物用のプロテアーゼである「スミチーム（登録商標）」Ｐ（新日本化学工業社）、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（天野エンザイム社）、「アルカラーゼ（登録商標）」（ノボザイムズジャパン社）を用いている。また、より多くのヒトデコラーゲンペプチドを抽出したい場合には弱酸性ないし中性プロテアーゼを用いることが好ましい。なお、本実施例においては食品添加物用の弱酸性ないし中性プロテアーゼであるスミチームＰ（新日本化学工業社）を好適な酵素として用いている。 The protease in the present invention is not particularly limited as long as it can hydrolyze the peptide bond of starfish and the peptide bond of the protein. For example, it is any of acidic protease, neutral protease, alkaline protease, amino acid, It does not matter whether it is a peptidase or a carboxypeptidase, an exopeptidase, or an endopeptidase. In this example, "Sumiteam (registered trademark)" P (Shin Nihon Chemical Industry Co., Ltd.), protease P "Amano" 3G (Amano Enzyme), which is a protease for food additives, "Alcalase (registered trademark)" (Novozymes Japan). In order to extract more human decollagen peptide, it is preferable to use weakly acidic or neutral protease. In this example, Sumiteam P (Shin Nihon Chemical Industry Co., Ltd.), which is a weakly acidic or neutral protease for food additives, is used as a suitable enzyme.
なお、本発明において、「弱酸性ないし中性」とは、ｐＨが３〜９であることをいい、ｐＨが４〜８であることが好ましい。 In the present invention, “weakly acidic or neutral” means that the pH is 3 to 9, and preferably 4 to 8.
本発明におけるプロテアーセ処理は、プロテアーゼが働いてヒトデが有するペプチドやタンパク質のペプチド結合を加水分解できる条件下での処理であれば特に限定されないが、プロテアーゼが好適に働いてヒトデの分解度を高める条件として、例えば、加水量についてはヒトデ重量に対して等倍量から数倍量、プロテアーゼ添加量についてはヒトデに対して０．１％（ｗ／ｗ）以上、反応時間については攪拌下にて５時間以上、反応温度については常温から６０℃の間等の条件を好適な条件として挙げることができる。 The protease treatment in the present invention is not particularly limited as long as it is a treatment under the condition that protease can work to hydrolyze the peptide bond of starfish and the peptide bond of the protein, but the protease works suitably to increase the degree of starfish degradation. For example, the amount of water added is about 1 to several times the amount of starfish, the amount of protease added is 0.1% (w / w) or more with respect to starfish, and the reaction time is 5 with stirring. As for the reaction temperature for a period of time or longer, a condition such as between room temperature and 60 ° C. can be mentioned as a suitable condition.
本発明に係る血糖値上昇抑制剤の効果には、食餌や糖等を摂取した際の血糖値の上昇を抑制する効果のみならず、食餌や糖等の摂取に影響を受けることなく元来高い血糖値を正常に近い値に低下させる効果が含まれる。そのため、糖尿病を発症している患者のみならず、糖尿病を発症していないものの発症するリスクを有している、いわゆる糖尿病リスク者にも好適な効果を有する。 The effect of the blood sugar level elevation inhibitor according to the present invention is not only an effect of suppressing an increase in blood sugar level when ingesting food, sugar, etc., but is inherently high without being affected by the intake of food, sugar, etc. The effect of lowering the blood glucose level to a value close to normal is included. Therefore, it has a suitable effect not only for patients who have diabetes, but also for those who are at risk of developing those who have not developed diabetes but have a risk of developing it.
本発明に係る血糖値上昇抑制剤は、グルコース吸収阻害活性を有している。すなわち、本発明に係る血糖値上昇抑制剤は、インスリンの分泌を促進させず、そのため、インスリンの分泌量に影響を与えずに血糖値の上昇を抑制する作用を奏することができる。また、２型糖尿病の患者の多くはインスリン抵抗性を有しており、骨格筋、脂肪組織、肝臓等のインスリンの標的臓器において、その作用効率が低下している状態である。そのため、本発明のようにインスリンの分泌量に影響を与えない他の作用機序を有する血糖値上昇抑制であれば、インスリン抵抗性を有する２型糖尿病患者にも非常に有用であるといえる。 The blood glucose level elevation inhibitor according to the present invention has glucose absorption inhibitory activity. That is, the blood sugar level increase inhibitor according to the present invention does not promote insulin secretion, and therefore can exert an action of suppressing an increase in blood sugar level without affecting the amount of insulin secretion. In addition, many patients with type 2 diabetes have insulin resistance, and the action efficiency is low in target organs of insulin such as skeletal muscle, adipose tissue, and liver. Therefore, it can be said that it is very useful for a type 2 diabetic patient having insulin resistance if the blood glucose level increase suppression has another action mechanism that does not affect the amount of insulin secreted as in the present invention.
また、本発明に係る血糖値上昇抑制剤は、α−グルコシダーゼ阻害活性がなく、そのため、α−グルコシダーゼ阻害により小腸で分解されなかった糖質が大腸に運ばれた後、大腸内の細菌によってこの糖質が分解されてガスが発生することによる腹部膨満感を生じないという効果がある。 In addition, the blood sugar level increase inhibitor according to the present invention has no α-glucosidase inhibitory activity, and therefore, carbohydrates that have not been degraded in the small intestine due to α-glucosidase inhibition are transported to the large intestine, and then the bacteria in the large intestine There is an effect that abdominal fullness due to the generation of gas by decomposition of carbohydrates does not occur.
グルコース吸収阻害効果の確認は、例えば、糖の胃内滞留時間を測定することにより、腸管におけるグルコース吸収率を測定することにより、あるいは排便中のグルコース濃度を測定することにより行うことができる。また、併せて、血中インスリン濃度を測定することにより、あるいはα−グルコシダーゼ阻害活性を測定することにより、より正確にグルコース吸収阻害効果の確認を行うことができる。なお、これらを測定する方法や用いる試薬等は、当業者によって適宜選択可能な方法や試薬等を用いることができる。 The glucose absorption inhibitory effect can be confirmed, for example, by measuring the sugar residence time in the stomach, by measuring the glucose absorption rate in the intestine, or by measuring the glucose concentration in the stool. In addition, the glucose absorption inhibitory effect can be confirmed more accurately by measuring the blood insulin concentration or by measuring the α-glucosidase inhibitory activity. In addition, the method, reagent, etc. which can be suitably selected by those skilled in the art can be used for the method of measuring these, the reagent to be used, etc.
本発明に係る血糖値上昇抑制剤は、本発明におけるヒトデコラーゲンペプチドの他、この作用を損なわない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分、例えば従来用いられてきたグルコース吸収阻害剤やインスリン分泌促進剤等を含んでいてもよい。特に、本発明に係る血糖値上昇抑制剤は、本発明におけるヒトデコラーゲンペプチドを安定に保持できる緩衝剤を含む剤型、例えば、注射剤ないしシロップ等の液剤または錠剤等の固形剤として利用されることが好ましい。緩衝剤を含む液剤の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水等を挙げることができる。また、前記剤型は、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤その他、薬学的に許容可能な種々の成分を含んでいてもよい。 In addition to the human decollagen peptide in the present invention, the blood sugar level increase inhibitor according to the present invention is not limited to the effects of this, and various excipients and other pharmaceuticals that are generally used for pharmaceutical preparations. An active ingredient, for example, a conventionally used glucose absorption inhibitor or insulin secretion promoter may be contained. In particular, the blood sugar level elevation inhibitor according to the present invention is used as a dosage form containing a buffer capable of stably retaining the human decollagen peptide in the present invention, for example, as a liquid agent such as an injection or syrup, or a solid agent such as a tablet. It is preferable. Non-limiting examples of the liquid agent containing a buffer include neutral buffered saline or phosphate buffered saline. The dosage form includes, for example, carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose, dextran, mannitol, proteins, amino acids, antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents (for example, EDTA or glutathione), osmotic pressure regulators, suspensions. It may contain suspending agents, thickeners and / or preservatives and various other pharmaceutically acceptable ingredients.
また本発明におけるヒトデコラーゲンペプチドが血糖値上昇抑制効果を失わない範囲で、ヒトデコラーゲンペプチドを得る過程やこれを得た後に、他の処理を追加することもできる。例えば、原料処理、水等による洗浄や希釈、自然濾過、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過、珪藻土濾過（セライト濾過）、砂濾過、限外濾過、逆浸透膜濾過（ルーズＲＯ濾過）、熱時濾過、電気透析等の濾過処理、ｐＨ調節、エバポレーター等による濃縮、蒸留、乾燥等の各処理を挙げることができる。 Further, as long as the human decollagen peptide in the present invention does not lose the blood glucose level increase inhibitory effect, other processes can be added after obtaining the process of obtaining the human decollagen peptide. For example, raw material treatment, washing and dilution with water, natural filtration, vacuum filtration, pressure filtration, centrifugal filtration, diatomaceous earth filtration (celite filtration), sand filtration, ultrafiltration, reverse osmosis membrane filtration (loose RO filtration), heat Examples thereof include hourly filtration, filtration treatment such as electrodialysis, pH adjustment, concentration using an evaporator, distillation, drying and the like.
次に、本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドの製造方法について説明する。本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドの製造方法は、
(i)ヒトデに対してアルカリ処理、酸処理および水浸処理をするヒトデ処理工程
(ii)ヒトデ処理後に弱酸性ないし中性プロテアーゼで処理をしてヒトデ加水分解物を生成するヒトデ加水分解物生成工程
(iii)ヒトデ加水分解物からヒトデコラーゲンペプチドを回収するヒトデコラーゲンペプチド回収工程
以上(i)〜(iii) の工程を有している。
Next, the manufacturing method of the star decollagen peptide which concerns on this invention is demonstrated. The method for producing a starfish collagen peptide according to the present invention comprises:
(i) A starfish treatment process for subjecting starfish to alkali treatment, acid treatment and water immersion treatment
(ii) A starfish hydrolyzate production step in which a starfish hydrolyzate is produced by treatment with a weakly acidic or neutral protease after starfish treatment.
(iii) Human decollagen peptide recovery step for recovering human decollagen peptide from starfish hydrolyzate The steps (i) to (iii) are included.
本実施例における「ヒトデ処理工程」は、０．２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に一晩浸漬させた後、０．２Ｍの塩酸に一晩浸漬させ、さらに一晩水浸させる工程である。また、本実施例における「ヒトデ加水分解物生成工程」は、水浸処理後、水画分を除いた固体画分にプロテアーゼを加えてヒトデを加水分解することによりヒトデ加水分解物を得る工程である。さらに、本実施例における「ヒトデコラーゲンペプチド回収工程」は、生成したヒトデ加水分解物から撹拌、遠心分離あるいは凍結乾燥を経てヒトデコラーゲンペプチドを回収する工程である。 The “starfish treatment step” in this example is a step of immersing in a 0.2 M aqueous sodium hydroxide solution overnight, then immersing in 0.2 M hydrochloric acid overnight, and further immersing in water overnight. The “starfish hydrolyzate production step” in this example is a step of obtaining a starfish hydrolyzate by hydrolyzing starfish by adding protease to the solid fraction excluding the water fraction after the water immersion treatment. is there. Furthermore, the “human decollagen peptide recovery step” in the present example is a step of recovering the human decollagen peptide from the produced starfish hydrolyzate through stirring, centrifugation or lyophilization.
また、本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドの、他の態様の製造方法は、
(i)ヒトデを水浸処理する水浸処理工程
(ii)水浸処理後に弱酸性ないし中性プロテアーゼで処理をしてヒトデ加水分解物を生成するヒトデ加水分解物生成工程
(iii)ヒトデ加水分解物からヒトデ加水分解液を回収するヒトデ加水分解液回収工程
(iv)ヒトデ加水分解液から珪藻土濾過、限外濾過および逆浸透膜濾過のうちのいずれか１または２以上の濾過処理をしてヒトデコラーゲンペプチドを回収するヒトデコラーゲンペプチド回収工程
以上(i)〜(iv)の工程を有している。
In addition, the method for producing another embodiment of the star decollagen peptide according to the present invention includes:
(i) Water immersion treatment process for water treatment of starfish
(ii) Starfish hydrolyzate production step of producing a starfish hydrolyzate by treatment with a weakly acidic or neutral protease after water immersion treatment
(iii) Starfish hydrolyzate recovery step for recovering starfish hydrolyzate from starfish hydrolyzate
(iv) A human decollagen peptide recovery step of recovering a human decollagen peptide by performing any one or more of diatomaceous earth filtration, ultrafiltration and reverse osmosis membrane filtration from the starfish hydrolyzate. (iv) is included.
本実施例における「水浸処理工程」は、ヒトデ重量に対して２倍となる水をヒトデに加えて水浸させ、一晩ほど静置する工程である。また、本実施例における「ヒトデ加水分解物生成工程」は、水浸処理後に弱酸性ないし中性プロテアーゼを加えて加水分解させる工程である。また、本実施例における「ヒトデ加水分解液回収工程」は、プロテアーゼ処理工程後、濾過により沈殿物と濾液とを分離して、濾液を回収することによりヒトデ加水分解液を得る工程である。さらに、本実施例における「ヒトデコラーゲンペプチド回収工程」は、珪藻土濾過をした後、限外濾過または逆浸透膜濾過をし、さらに珪藻土濾過をしてヒトデコラーゲンペプチドを回収する工程である。 The “water immersion treatment step” in the present example is a step of adding water twice as much as the starfish weight to the starfish and immersing it, and allowing it to stand overnight. In addition, the “starfish hydrolyzate production step” in the present example is a step of hydrolyzing by adding a weakly acidic or neutral protease after the water immersion treatment. The “starfish hydrolyzate recovery step” in this example is a step of obtaining a starfish hydrolyzate by separating the precipitate and the filtrate by filtration after the protease treatment step and recovering the filtrate. Furthermore, the “human decollagen peptide recovery step” in this example is a step of recovering the human decollagen peptide by performing diatomaceous earth filtration, followed by ultrafiltration or reverse osmosis membrane filtration, and further diatomaceous earth filtration.
本発明における濾過は、カドミウム等の重金属を除去が可能であれば特に限定されず、例えば、自然濾過、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過、珪藻土濾過、砂濾過、限外濾過、逆浸透膜濾過、熱時濾過、電気透析等や、これらの組み合わせを挙げることができる。なお、本発明において、酸性度はｐＨ３以下を好適なｐＨとしている。また、水相を濾過処理前または処理後にアルカリ溶液で中性にしても良く、しなくてもよいが、濾過処理前および処理後にアルカリ溶液を用いて中性にするのが好ましい。さらに、得られた固相は、肥料の原料として利用することもできる。 Filtration in the present invention is not particularly limited as long as heavy metals such as cadmium can be removed. For example, natural filtration, vacuum filtration, pressure filtration, centrifugal filtration, diatomaceous earth filtration, sand filtration, ultrafiltration, reverse osmosis membrane Examples thereof include filtration, hot filtration, electrodialysis, and combinations thereof. In the present invention, the acidity is preferably a pH of 3 or less. Further, the aqueous phase may or may not be neutralized with an alkaline solution before or after the filtration treatment, but is preferably neutralized with an alkaline solution before and after the filtration treatment. Furthermore, the obtained solid phase can also be used as a raw material for fertilizer.
本発明における濃縮および乾燥は、乾燥したＣＰを得ることができれば特に限定されないが、製造コストが安く、大量調製に好適な凍結乾燥やスプレードライ（噴霧乾燥）が好ましい。 Concentration and drying in the present invention are not particularly limited as long as a dried CP can be obtained, but freeze-drying and spray-drying (spray-drying) suitable for mass production are preferable because of low production costs.
また、本発明においては、例えば、原料処理、水等による洗浄や希釈、自然濾過、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過、珪藻土濾過（セライト濾過）、砂濾過、限外濾過、逆浸透膜濾過（ルーズＲＯ濾過）、熱時濾過、電気透析等の濾過処理、ｐＨ調節、エバポレーター等による濃縮、蒸留、乾燥等の任意の処理工程を追加することにより、さらに精度の高いＣＰを得ることもできる。 In the present invention, for example, raw material treatment, washing and dilution with water, natural filtration, vacuum filtration, pressure filtration, centrifugal filtration, diatomaceous earth filtration (celite filtration), sand filtration, ultrafiltration, reverse osmosis membrane filtration (Loose RO filtration), filtration during heating, filtration treatment such as electrodialysis, pH adjustment, concentration with an evaporator, distillation, drying, etc. can be added to obtain a more accurate CP. .
以上のようにして得られるコラーゲンペプチドは、本発明に係る血糖値上昇抑制剤のみならず、健康食品素材、ペットフード、化粧品等への応用が期待できる。 The collagen peptide obtained as described above is expected to be applied not only to the blood sugar level increase inhibitor according to the present invention but also to health food materials, pet foods, cosmetics and the like.
以下、本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤およびヒトデコラーゲンペプチドの製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。 Hereinafter, the blood sugar level increase inhibitor and the method for producing a human decollagen peptide comprising the human decollagen peptide according to the present invention as an active ingredient will be described based on examples. Note that the technical scope of the present invention is not limited to the features shown by these examples.
＜実施例１＞ヒトデ水抽出液および加水分解液の調製
凍結マヒトデ１０ｋｇを未処理のまま、これの２倍量（ｗ／ｗ）の水を加え、１５℃以下にて１６時間放置した。その後、０．５ｍｍ目合のザルにて粗濾過を行うことによって目視できる夾雑物を除去し、濾液（１）と残渣（１）とに分けた。マヒトデに対して０．２倍量の水（ｗ／ｗ）を溜水とし、これを用いてヒトデを洗浄後、濾液（１）に洗浄後の溜水を加えたものと残渣（１）とに分けた（図１）。
<Example 1> Preparation of starfish water extract and hydrolyzate 10 kg of frozen starfish was left untreated, twice as much water (w / w) was added, and the mixture was allowed to stand at 15 ° C or lower for 16 hours. Thereafter, visible impurities were removed by rough filtration with a 0.5 mm mesh, and the filtrate (1) and residue (1) were separated. The water (w / w) of 0.2 times the amount of the starfish is used as the stored water, and the starfish is washed using this, and then the filtrate (1) is added with the washed water and the residue (1). (Fig. 1).
濾液（１）について、さらに珪藻土を原料とした濾過助剤であるラヂオライト＃１００（昭和化学工業社）を用いて珪藻土濾過して濾液（２）を得た後、分画分子量６０００の限外濾過膜ＡＩＰ２０１３（旭化成社）を用いて限外濾過することによって高分子画分を除去し、これを透過液とした（図１）。この透過液を塩分阻止率９０％の逆浸透膜ＮＴＲ７２９ＨＧ（日東電工社）を用いて逆浸透膜濾過（ルーズＲ０濾過）して濃縮し、水抽出液を得た（図１）。 The filtrate (1) was further filtered through diatomaceous earth using Radiolite # 100 (Showa Chemical Industry Co., Ltd.), a filter aid made from diatomaceous earth, and then the filtrate (2) was obtained. The polymer fraction was removed by ultrafiltration using a filtration membrane AIP2013 (Asahi Kasei Co., Ltd.), and this was used as a permeate (FIG. 1). This permeate was concentrated by reverse osmosis membrane filtration (loose R0 filtration) using a reverse osmosis membrane NTR729HG (Nitto Denko Corporation) having a salt rejection of 90% to obtain a water extract (FIG. 1).
一方、残渣（１）については、マヒトデに対して２倍量（ｗ／ｗ）の水とプロテアーゼであるスミチームＰ（新日本化学工業社，以下、「ＳＰ」という。）０．２％（ｗ／ｗ）とを加えて、カジワラレオニーダーＫＨ０５型にて攪拌しながら５０℃で８時間プロテアーゼ処理を行い、加水分解物を得た。続いて、０．５ｍｍ目合のザルを用いて加水分解物の粗濾過を行うことにより、目視できる夾雑物を除去し、マヒトデに対して０．２倍量の水（ｗ／ｗ）を溜水とし、これを用いて残渣を洗浄した。洗浄後、濾液（３）に洗浄後の溜水を加えたものと残渣（２）とに分けた。得られた濾液（３）を「加水分解液」とした（図１）。 On the other hand, with respect to residue (1), Sumiteam P (Shin Nihon Chemical Industry Co., Ltd., hereinafter referred to as “SP”), which is twice the amount (w / w) of water and protease, is 0.2% (w / W) was added, and protease treatment was carried out at 50 ° C. for 8 hours with stirring with Kajiwara Leonida KH05 type to obtain a hydrolyzate. Subsequently, by performing rough filtration of the hydrolyzate using a 0.5 mm-sized colander, visible impurities are removed, and 0.2 times the amount of water (w / w) is accumulated with respect to the starfish. The residue was washed with water. After washing, the filtrate (3) was divided into a residue (2) added with the washed water after washing. The obtained filtrate (3) was designated as “hydrolyzed liquid” (FIG. 1).
＜実施例２＞ＳＤラットを用いた血糖値上昇抑制効果の検討
健常ラットであるＳＤラットを用いて、ヒトデの水抽出液および加水分解液の糖負荷試験を行い、血糖値を測定した。
<Example 2> Examination of blood glucose level increase inhibitory effect using SD rat Using an SD rat which is a healthy rat, a glucose tolerance test was performed on a water extract of a starfish and a hydrolyzed solution, and the blood glucose level was measured.
被検物質として、実施例１において得られた「水抽出液」および「加水分解液」を−３０℃にて凍結保存したものを５℃で解凍し、攪拌して均質化したものを各々使用した。試験動物は、９週齢オスのＳＤラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が２５４〜２８６ｇのものを使用した。試験構成群は、コントロール群、対照群、水抽出群、加水分解群の４群を、各々６匹として行った。糖負荷はグルコースを用いて行った。コントロール群については、グルコースの代わりに蒸留水を投与し、被検物質として加水分解液を投与した。対照群、水抽出群、加水分解群の各々については、グルコースを投与し、被検物質として蒸留水、水抽出液、加水分解液を各々投与した。 As the test substances, the “water extract” and “hydrolyzate” obtained in Example 1 were stored frozen at −30 ° C., thawed at 5 ° C., and stirred to be homogenized. did. The test animals used were 9-week-old male SD rats (Nippon Charles River) having a body weight of 254 to 286 g at the start of the test. As the test composition group, four groups of a control group, a control group, a water extraction group, and a hydrolysis group were used as 6 animals each. Glucose loading was performed using glucose. For the control group, distilled water was administered instead of glucose, and a hydrolyzate was administered as a test substance. For each of the control group, the water extraction group, and the hydrolysis group, glucose was administered, and distilled water, a water extract, and a hydrolysis solution were respectively administered as test substances.
試験方法は以下のとおりである。まず、ＳＤラットを１８時間絶食させて血糖値を測定し、これを初期血糖値とした。続いて、コントロール群については、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて、蒸留水５ｍＬ／ｋｇと、加水分解液１０ｍＬ／ｋｇとを混合した溶液１５ｍＬ／ｋｇを、対照群、水抽出群、加水分解群については、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて、４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと、被検物質１０ｍＬ／ｋｇとを混合した溶液１５ｍＬ／ｋｇを、各々強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血糖値の測定を行った。血糖値の測定は、無麻酔下、尾静脈において小型血糖値測定機グルコカードダイアメーター｛以下グルコカード（登録商標）；ＡＲＫＲＡＹ社｝を用いて行った。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 The test method is as follows. First, the SD rat was fasted for 18 hours to measure the blood glucose level, and this was used as the initial blood glucose level. Subsequently, for the control group, using an orally administered sonde (FUCHIGAMI), 15 mL / kg of a mixture of 5 mL / kg of distilled water and 10 mL / kg of the hydrolyzed solution was added to the control group, water extraction group, water For the decomposition group, an oral administration sonde (FUCHIGAMI) was used to forcibly orally administer a solution of 5% / kg of a 41% (w / v) glucose aqueous solution and 15 mL / kg of a test substance 10 mL / kg. Administered. The administration time was 0 minute, and the blood glucose level was measured after 15, 30, 60 and 120 minutes. The blood glucose level was measured in a tail vein using a small blood glucose level measuring machine, Glucocard Diameter (hereinafter referred to as Glucocard (registered trademark); ARKRAY) under no anesthesia. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
［データ解析］
得られた数値に基づいて、各群における平均値および標準誤差を算出した。正規性については、カイ二乗（χ２）適合度検定を用いることにより行った。各群間の統計解析はＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社；登録商標）のマクロを用いて行った。まず、Ｂａｒｔｌｅｔｔ検定による等分散性検定を行い、有意水準５％にて等分散性が認められた場合には更に一元配置分散分析を行い、有意な場合にはＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法を用いた多重比較検定をすることにより行った。また、対照群との平均値を比較することにより被検物質の効果を評価した。その結果を図２に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical values, an average value and a standard error in each group were calculated. Normality was determined by using a chi-square (χ2) goodness-of-fit test. Statistical analysis between each group was performed using an Excel (Microsoft; registered trademark) macro. First, an equal variance test by Bartlett test is performed. If equal variance is recognized at a significance level of 5%, a one-way analysis of variance is further performed. If significant, multiple comparison using the Tukey-Kramer method is performed. This was done by testing. Moreover, the effect of the test substance was evaluated by comparing the average value with the control group. The result is shown in FIG. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図２に示すように、対照群では糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、６０分経過後に最高血糖値に達した。その後、血糖値は１２０分を経過するまで徐々に低下し、９週齢のＳＤラットの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、水抽出群および加水分解群では、対照群に比べて３０，６０分経過後の血糖値が低値を示した。特に、加水分解群では６０分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 2, in the control group, the blood glucose level immediately increased after sugar loading, and reached the maximum blood glucose level after 60 minutes. Thereafter, the blood glucose level gradually decreased until 120 minutes passed, and showed a normal blood glucose level in a glucose tolerance test of 9-week-old SD rats. On the other hand, in the water extraction group and the hydrolysis group, the blood glucose level after 30 or 60 minutes passed was lower than that in the control group. In particular, the hydrolysis group showed significance at a 5% significance level with respect to the control group after 60 minutes.
本実施例２により、ヒトデの加水分解液投与による有意な血糖値上昇抑制効果が示された。 The present Example 2 showed a significant blood glucose level inhibitory effect by administration of a starfish hydrolyzate.
＜実施例３＞Ｗｉｓｔａｒラットを用いた血糖値上昇抑制効果の検討
健常ラットであるＷｉｓｔａｒラットを用いて、ヒトデの水抽出液および加水分解液の糖負荷試験を行い、血糖値および血中インスリン濃度を測定した。
<Example 3> Examination of inhibitory effect on increase in blood glucose level using Wistar rats Using Wistar rats, which are healthy rats, a glucose tolerance test was performed on a water extract of a starfish and a hydrolyzed solution to determine blood glucose levels and blood insulin concentrations. Was measured.
被検物質は、実施例２で調製したものと同じものを用いた。試験動物は、１０週齢オスのＷｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が３３４〜３８８ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群、水抽出群、加水分解群の３群を、各々６匹として行った。対照群、水抽出群、加水分解群の各々については、グルコースを投与し、被検物質として蒸留水、水抽出液、加水分解液を各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 The same substance as that prepared in Example 2 was used as the test substance. The test animals used were 10-week-old male Wistar rats (Charles River Japan, Inc.) having a body weight of 334 to 388 g at the start of the test. The test group consisted of 3 groups of 6 groups, a control group, a water extraction group, and a hydrolysis group. For each of the control group, the water extraction group, and the hydrolysis group, glucose was administered, and distilled water, a water extract, and a hydrolysis solution were respectively administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、Ｗｉｓｔａｒラットを１８時間絶食させて血糖値を測定し、これを初期血糖値とした。血中インスリン濃度測定用の血液を採取後、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと、被検物質１０ｍＬ／ｋｇとを混合した溶液１５ｍＬ／ｋｇを各々強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血糖値測定および血中インスリン濃度測定用の血液採取を行った。 The test method is as follows. First, Wistar rats were fasted for 18 hours to measure blood glucose levels, which were used as initial blood glucose levels. After collecting blood for measuring insulin concentration in blood, an oral administration sonde (FUCHIGAMI) was used to mix 5 mL / kg of a 41% (w / v) glucose aqueous solution with 10 mL / kg of a test substance, 15 mL / kg. Each kg was administered by oral gavage. The administration time was 0 minute, and blood was collected for blood glucose level measurement and blood insulin concentration measurement after 15, 30, 60, 120 minutes.
血糖値の測定は実施例２と同様にして行った。血中インスリン濃度の測定は以下のとおりである。まず、無麻酔下、尾静脈における血液１００μＬをインスリン分泌測定用のエッペンドルフチューブに採取し、２００００×ｇ，４℃にて１０分間遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３６３０）を行い、血清を得た。続いて、この血清中のインスリン濃度を、森永インスリン測定キット（森永生化学研究所）を用いて測定した。各群における血糖値は初期血糖値を１００％とした相対血糖値（％）として示した。 The blood glucose level was measured in the same manner as in Example 2. The measurement of blood insulin concentration is as follows. First, under anesthesia, 100 μL of blood in the tail vein was collected in an Eppendorf tube for insulin secretion measurement, and centrifuged at 20000 × g and 4 ° C. for 10 minutes (KUBOTA3630) to obtain serum. Subsequently, the insulin concentration in the serum was measured using a Morinaga insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Research Institute). The blood glucose level in each group was shown as a relative blood glucose level (%) with the initial blood glucose level being 100%.
［データ解析］
得られた数値に基づいて、各群における平均値および標準誤差を算出した。各群間の統計解析は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社；登録商標）のマクロを用い、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定をすることにより行った。また、対照群との平均値を比較することにより被検物質の効果を評価した。その結果を図３および図４に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical values, an average value and a standard error in each group were calculated. Statistical analysis between each group was performed by using Dunnett's multiple comparison test using Excel (Microsoft; registered trademark) macro. Moreover, the effect of the test substance was evaluated by comparing the average value with the control group. The results are shown in FIGS. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図３に示すように、対照群では糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、６０分経過後に最高値に達した。その後、血糖値は１２０分を経過するまで徐々に低下し、１０週齢のＷｉｓｔａｒラットの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、水抽出群および加水分解群では、対照群に比べて３０分経過後の血糖値が低値を示した。特に、加水分解群では１５，３０，６０，１２０分経過後のすべての測定点において、対照群に比べて低い血糖値を示し、１５，３０，６０分経過後において対照群に比べて有意に低い血糖値が認められた。詳細には、３０，６０分経過後には対照群に対して１％有意水準にて有意性を示し、６０分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 3, in the control group, the blood glucose level immediately increased after the glucose load, and reached the maximum value after 60 minutes. Thereafter, the blood glucose level gradually decreased until 120 minutes passed, and showed a normal blood glucose level in a glucose tolerance test of 10-week-old Wistar rats. On the other hand, in the water extraction group and the hydrolysis group, the blood glucose level after 30 minutes was lower than that in the control group. In particular, in the hydrolysis group, blood glucose levels were lower than those in the control group at all measurement points after 15, 30, 60, 120 minutes, and were significantly higher than those in the control group after 15, 30, 60 minutes. A low blood glucose level was observed. Specifically, after 30 and 60 minutes, the control group showed significance at the 1% significance level, and after 60 minutes, the control group showed significance at the 5% significance level.
一方、血中インスリン濃度については図４に示すように、対照群では３０分経過後に最高値を示し、その後、徐々に低下し、１０週齢のＷｉｓｔａｒラットの糖負荷試験における通常の血中インスリン濃度を示した。一方、水抽出群および加水分解群においても、対照群と同様に３０分経過後に最高値を示し、その後、徐々に低下した。その結果、各群間には有意差は認められなかった。 On the other hand, as shown in FIG. 4, the blood insulin concentration showed the highest value after 30 minutes in the control group, and then gradually decreased, followed by normal blood insulin in the glucose tolerance test of 10-week-old Wistar rats. Concentration was indicated. On the other hand, also in the water extraction group and the hydrolysis group, the maximum value was exhibited after 30 minutes as in the control group, and then gradually decreased. As a result, there was no significant difference between the groups.
本実施例３により、ヒトデの水抽出液および加水分解液は、血糖値上昇抑制効果を示すとともに、血中インスリン濃度に対して影響を与えないということが示された。特に加水分解液において血糖値上昇抑制効果が顕著に示された。このことから、ヒトデの水抽出液および加水分解液はインスリン分泌を促進せず、糖の吸収を抑制することによる血糖値上昇抑制効果を呈することが示され、インスリン抵抗性を誘発する２型糖尿病患者に非常に有益であることが示された。 According to Example 3, it was shown that the starfish water extract and the hydrolyzate showed an inhibitory effect on the increase in blood glucose level and did not affect the blood insulin concentration. In particular, the effect of suppressing the increase in blood glucose level was remarkably shown in the hydrolyzed solution. From this, it is shown that the water extract and hydrolyzate of starfish do not promote insulin secretion, and exhibit an inhibitory effect on the increase in blood glucose level by inhibiting sugar absorption, and type 2 diabetes that induces insulin resistance It has been shown to be very beneficial to the patient.
＜実施例４＞糖尿病モデルラットを用いた血糖値調節機能の検討
２型糖尿病モデルラットを用いて、ヒトデの水抽出液および加水分解液の糖負荷試験を行い、血糖値を測定した。
Example 4 Examination of Blood Glucose Level Control Function Using Diabetes Model Rat Using a type 2 diabetes model rat, a glucose tolerance test was performed on a water extract of a starfish and a hydrolyzate, and the blood glucose level was measured.
被検物質は、実施例２で調製したものと同じものを用いた。試験動物は、１２週齢オスのＧＫラット（日本エスエルシー社）のうち、試験開始時の体重が２５２〜２８３ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群、水抽出群、加水分解群の３群を、各々８匹として行い、被検物質として蒸留水、水抽出液、加水分解液を各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。試験方法は、実施例２と同様にして血糖値を測定し、データ解析を行う方法であった。各群における血糖値は初期血糖値を１００％とした相対血糖値（％）として示した。その結果を図５に示す。 The same substance as that prepared in Example 2 was used as the test substance. The test animal used was a 12-week-old male GK rat (Japan SLC) with a body weight of 252 to 283 g at the start of the test. The test group consisted of three groups, a control group, a water extraction group and a hydrolysis group, each with 8 animals, and distilled water, a water extract and a hydrolysis solution were administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”. The test method was a method of measuring the blood glucose level and analyzing the data in the same manner as in Example 2. The blood glucose level in each group was shown as a relative blood glucose level (%) with the initial blood glucose level being 100%. The result is shown in FIG.
図５に示すように、対照群では糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、６０分経過後に最高血糖値に達した。その後、血糖値は１２０分を経過するまで徐々に低下し、１２週齢オスのＧＫラットの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、水抽出群および加水分解群では、１５，３０，６０，１２０分経過後のすべての測定点において、対照群に比べて低い血糖値を示した。特に、加水分解群では３０，６０分経過後において対照群に比べて顕著に低い血糖値が認められ、３０分経過後には対照群に対して１％有意水準にて有意性を示し、６０分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 5, in the control group, the blood glucose level immediately increased after sugar loading, and reached the maximum blood glucose level after 60 minutes. Thereafter, the blood glucose level gradually decreased until 120 minutes passed, and showed a normal blood glucose level in a glucose tolerance test of 12-week-old male GK rats. On the other hand, the water extraction group and the hydrolysis group showed lower blood glucose levels than the control group at all measurement points after 15, 30, 60 and 120 minutes. In particular, the hydrolysis group showed a significantly lower blood glucose level than the control group after 30 and 60 minutes, and showed a significance level of 1% relative to the control group after 30 minutes. After the lapse of time, significance was shown at 5% significance level with respect to the control group.
本実施例４により、健常モデルラットのみならず、２型糖尿病モデルラットにおいても、ヒトデの水抽出液および加水分解液は血糖値上昇抑制効果を示した。特に加水分解液は、顕著な血糖値上昇抑制効果を示した。 According to Example 4, not only the healthy model rat but also the type 2 diabetes model rat, the starfish water extract and the hydrolyzate showed an effect of suppressing the increase in blood glucose level. In particular, the hydrolyzed solution showed a remarkable effect of suppressing the increase in blood glucose level.
＜実施例５＞ヒトデの加水分解液の血糖値上昇抑制効果の検討
実施例３および４において、ヒトデの加水分解液が顕著な血糖値上昇抑制効果を示したことから、加水分解液の上澄み液のみを投与する糖負荷試験を行い、血糖値を測定した。
<Example 5> Examination of blood glucose level increase inhibitory effect of starfish hydrolyzate In Examples 3 and 4, the starfish hydrolyzate showed a remarkable blood glucose level increase inhibitory effect. Glucose tolerance test was conducted to administer only glucose, and blood glucose level was measured.
実施例２で調製したものと同じものを被検物質として、各々２０，０００×ｇ，４℃にて１０分間遠心分離（コクサンＨ−２０００Ｂ）を行い、その上澄み液を採取し用いた。試験動物は、１４週齢オスのＷｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が４００．２０〜４８６．２３ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群、上澄群の２群を、各々６匹として行い、被検物質として蒸留水、加水分解液の上澄み液を各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。試験方法は、実施例２と同様にして血糖値を測定し、データ解析を行う方法であった。各群における血糖値は初期血糖値を１００％とした相対血糖値（％）として示した。その結果を図６に示す。 Centrifugation (Kokusan H-2000B) was carried out at 20,000 × g and 4 ° C. for 10 minutes using the same one prepared in Example 2 as the test substance, and the supernatant was collected and used. The test animal used was a 14-week-old male Wistar rat (Charles River Japan) with a body weight of 400.20 to 486.23 g at the start of the test. The test group consisted of 2 groups, a control group and a supernatant group, each with 6 animals, and distilled water and a supernatant of the hydrolyzed solution were administered as test substances, respectively. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”. The test method was a method of measuring the blood glucose level and analyzing the data in the same manner as in Example 2. The blood glucose level in each group was shown as a relative blood glucose level (%) with the initial blood glucose level being 100%. The result is shown in FIG.
図６に示すように、対照群では糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、１５分経過後に最高血糖値に達した。その後、血糖値は６０分を経過するまでほぼ平衡を保ち、その後緩やかに低下し、１２０分後に初期血糖値とほぼ同じ値になり、１４週齢のＷｉｓｔａｒラットの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、上澄群では、対照群に比べて１５，３０，６０分経過後において血糖値が低値を示し、特に３０分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 6, in the control group, the blood glucose level immediately increased after the sugar load, and reached the maximum blood glucose level after 15 minutes. Thereafter, the blood glucose level was almost balanced until 60 minutes passed, and then gradually decreased. After 120 minutes, the blood glucose level became almost the same as the initial blood glucose level, and the normal blood glucose level in the glucose tolerance test of a 14-week-old Wistar rat was observed. showed that. On the other hand, in the supernatant group, the blood glucose level was low after 15, 30 and 60 minutes compared to the control group, and in particular, after 30 minutes, it showed significance at a 5% significance level relative to the control group. It was.
本実施例５おいて、「加水分解液の上澄み液」を投与することにより３０分経過後にのみ有意な血糖値低下が示された。一方、上記実施例３における「加水分解液」の投与では、３０分経過後のみならず、１５，６０分経過後でも有意な血糖値低下が示された。つまり、「加水分解液の上澄み液」は「加水分解液」よりも、やや血糖値上昇抑制効果が低いことが示された。このことから、加水分解液の遠心後の沈殿物に血糖値上昇抑制効果を示す物質が主要に含まれており、当該物質としてコラーゲンペプチドである可能性が示唆された。 In Example 5, administration of the “hydrolyzate supernatant” showed a significant decrease in blood glucose level only after 30 minutes. On the other hand, administration of the “hydrolysis solution” in Example 3 showed a significant decrease in blood glucose level not only after 30 minutes but also after 15,60 minutes. That is, it was shown that “the supernatant of the hydrolyzed solution” has a slightly lower blood glucose level suppressing effect than the “hydrolyzed solution”. From this, the substance which shows a blood glucose level raise inhibitory effect was mainly contained in the precipitate after centrifugation of a hydrolyzate, and the possibility that it was a collagen peptide as the said substance was suggested.
＜実施例６＞ヒトデコラーゲンペプチドの調製
ヒトデからコラーゲンペプチドを調製した。具体的には、実施例１で得られた濾液（３）すなわち加水分解液を塩酸や硫酸等の酸でｐＨ３にし、これを三相分離器（アルファラバルＣＨＰＸ４０７）または遠心分離器（コクサンＨ６００Ｓ）にて４０００×ｇ，室温にて３０分間遠心することにより水相、油相、固相の三相に分離した（図１）。得られた水相を、珪藻土を原料とした濾過助剤であるラヂオライト＃１００（昭和化学工業社）を用いて珪藻土濾過した後、攪拌しながら１０Ｎの水酸化ナトリウム溶液を加えることにより中和した。つづいて、分画分子量６０００の限外濾過膜ＡＩＰ２０１３（旭化成社）を用いた限外濾過、活性炭ＦＣ（二村化学工業社）による処理、珪藻土を原料とした濾過助剤であるラヂオライト＃１００（昭和化学工業社）を用いて珪藻土濾過を順次行った（図１）。
<Example 6> Preparation of starfish collagen peptide A collagen peptide was prepared from starfish. Specifically, the filtrate (3) obtained in Example 1, that is, the hydrolyzate, is adjusted to pH 3 with an acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and this is converted into a three-phase separator (Alfa Laval CHPX407) or a centrifuge (Kokusan H600S). The mixture was separated into three phases of an aqueous phase, an oil phase and a solid phase by centrifugation at 4000 × g for 30 minutes at room temperature (FIG. 1). The obtained aqueous phase was filtered through diatomaceous earth using Radiolite # 100 (Showa Chemical Industry Co., Ltd.), a filter aid made from diatomaceous earth, and then neutralized by adding a 10N sodium hydroxide solution while stirring. did. Subsequently, ultrafiltration using an ultrafiltration membrane AIP2013 (Asahi Kasei Co., Ltd.) with a molecular weight cut off of 6000, treatment with activated carbon FC (Nikamura Chemical Co., Ltd.), Radiolite # 100 (filter aid using diatomaceous earth as a raw material) Diatomaceous earth filtration was sequentially performed using Showa Chemical Industry Co., Ltd. (FIG. 1).
最後に、得られた溶液をエバポール（大川原製作所社）にて減圧濃縮し、噴霧乾燥機ＤＣＴＲ−３型（阪本技研社）にてスプレードライ（噴霧乾燥）して粉末状のヒトデコラーゲンペプチド含有物５０ｇを得た（図１）。得られたヒトデコラーゲンペプチド含有物中のコラーゲンを定量し、このヒトデコラーゲンペプチド含有物がコラーゲンを主要に含んでいることを確認した。なお、コラーゲンの定量は、日本食品アミノ酸組成表（科学技術庁資源調査会・資源調査所編）に準じたアミノ酸分析方法により行った。すなわち、６Ｎの塩酸で加水分解後、Ｌ８５００アミノ酸自動分析計（ＨＩＴＡＣＨＩ社）でヒドロキシプロリン量を検出し、検出されたヒドロキシプロリン量に係数１１．１を乗じた値をコラーゲン量として算出した。 Finally, the obtained solution was concentrated under reduced pressure with Evapor (Okawara Seisakusho), and spray-dried (spray-dried) with a spray dryer DCTR-3 type (Sakamoto Giken) 50 g was obtained (FIG. 1). Collagen in the obtained human decollagen peptide-containing product was quantified, and it was confirmed that this human decollagen peptide-containing product mainly contains collagen. The amount of collagen was quantified by an amino acid analysis method according to the Japanese Food Amino Acid Composition Table (Science and Technology Agency Resource Research Committee, Resource Research Institute). That is, after hydrolysis with 6N hydrochloric acid, the amount of hydroxyproline was detected with an L8500 amino acid automatic analyzer (HITACHI), and a value obtained by multiplying the detected amount of hydroxyproline by a coefficient of 11.1 was calculated as the amount of collagen.
＜実施例７＞ヒトデコラーゲンペプチドの抽出条件の検討
（１）加水分解条件の検討
ヒトデコラーゲンペプチド調製過程における限外濾過の限外濾過膜の検討を行った。具体的には、実施例６において、プロテアーゼをＳＰから「アルカラーゼ（登録商標）」（ノボザイムズジャパン社，以下、「Ａｌｃ．」という。）に代えて加水分解処理したものを、分画分子量６０００の限外濾過膜であるＡＩＰ２０１３（旭化成社）から、各々５Ｋ，１０Ｋ，３０Ｋ，５０Ｋの限外濾過膜であるペリコン２（ミリポア社）に代えて限外濾過を行い、低分子画分を除去して保持液を得た。この保持液に含まれるコラーゲンタンパク質量を定量し、ヒトデ重量に対するコラーゲン重量｛コラーゲン歩留り（％）｝と、タンパク量に対するコラーゲン量｛Ｃ／Ｐ（％）｝とを算出した。なお、コラーゲンの定量は、日本食品アミノ酸組成表（科学技術庁資源調査会・資源調査所編）に準じたアミノ酸分析方法により行った。一方、タンパク質の定量は、上述のアミノ酸分析方法を用いて得られた個々のアミノ酸の、Ｎ量の総計に係数６．２５を乗じることにより算出した。その結果を図７に示す。
<Example 7> Examination of extraction conditions for human decollagen peptides (1) Examination of hydrolysis conditions Ultrafiltration membranes for ultrafiltration in the process of preparing human decollagen peptides were examined. Specifically, in Example 6, the protease was changed from SP to “Alcalase (registered trademark)” (Novozymes Japan Ltd., hereinafter referred to as “Alc.”) And subjected to hydrolysis treatment, AIP2013 (Asahi Kasei Co., Ltd.), which is an ultrafiltration membrane of 6000, was subjected to ultrafiltration in place of Pellicon 2 (Millipore), which is an ultrafiltration membrane of 5K, 10K, 30K, and 50K, respectively. Removal of the retentate was obtained. The amount of collagen protein contained in the retentate was quantified, and the collagen weight {collagen yield (%)} relative to the starfish weight and the collagen amount {C / P (%)} relative to the protein amount were calculated. The amount of collagen was quantified by an amino acid analysis method according to the Japanese Food Amino Acid Composition Table (Science and Technology Agency Resource Research Committee, Resource Research Institute). On the other hand, protein quantification was calculated by multiplying the total amount of N of individual amino acids obtained using the above-described amino acid analysis method by a coefficient of 6.25. The result is shown in FIG.
図７に示すように、コラーゲン歩留りとＣ／Ｐの値は、限外濾過膜の分画分子量が５Ｋにおいて最も高く、３０Ｋにおいて最も低くなった。これは、既にコラーゲンはコラーゲンペプチドに分解されており、限外濾過膜の分画分子量が小さいとコラーゲンペプチドが膜通過できず、コラーゲン歩留りの値が高くなり、逆に分画分子量が大きいとコラーゲンペプチドが膜通過するため、コラーゲン歩留りの値が低くなることを示している。 As shown in FIG. 7, the values of collagen yield and C / P were highest when the ultrafiltration membrane molecular weight cut off was 5K and lowest at 30K. This is because collagen has already been decomposed into collagen peptides, and if the molecular weight of the ultrafiltration membrane is small, the collagen peptide cannot pass through the membrane, resulting in a high collagen yield. Conversely, if the molecular weight is large, collagen It shows that the value of collagen yield decreases because the peptide passes through the membrane.
（２）プロテアーゼ種類の検討
食品添加物用のプロテアーゼであるＡｌｃ．、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（天野エンザイム社，以下、「ＡＰ」という。）、ＳＰを用いて、ヒトデから抽出されるコラーゲンペプチドの量について検討を行った。
(2) Examination of protease types Alc., A protease for food additives. The amount of collagen peptide extracted from starfish was examined using protease P “Amano” 3G (Amano Enzyme, Inc., hereinafter referred to as “AP”) and SP.
具体的には、実施例６のＳＰの代わりにＡｌｃ．，ＡＰ，ＳＰを用い、各々を加えてプロテアーゼ処理して得た加水分解物を遠心分離器（コクサンＨ６００Ｓ）にて４０００×ｇ，室温にて３０分間遠心分離し、上澄み液を得た。得られた上澄み液を、珪藻土を原料とした濾過助剤であるラヂオライト＃１００（昭和化学工業社）を用いて珪藻土濾過した後、分画分子量を６Ｋから５Ｋの限外濾過膜（旭化成）に代えて限外濾過を行い、保持液を得た。この保持液のコラーゲン歩留り（％）とＣ／Ｐ（％）とを算出した。その結果を図８に示す。 Specifically, Alc. , AP and SP were added, and the hydrolyzate obtained by protease treatment was centrifuged at 4000 × g for 30 minutes at room temperature in a centrifuge (Kokusan H600S) to obtain a supernatant. The resulting supernatant is filtered through diatomaceous earth using Radiolite # 100 (Showa Chemical Industry Co., Ltd.), a filter aid made from diatomaceous earth, and then an ultrafiltration membrane with a molecular weight cutoff of 6K to 5K (Asahi Kasei). Instead of ultrafiltration, a retentate was obtained. The collagen yield (%) and C / P (%) of this retentate were calculated. The result is shown in FIG.
図８に示すように、３種のプロテアーゼを用いた場合すべてにおいてコラーゲンが検出され、これらプロテアーゼにより加水分解されていることが示された。特に、弱酸性ないし中性プロテアーゼであるＳＰを用いた場合に最も高いコラーゲン歩留り値を示したことから、コラーゲンを効率よく得るためには弱酸性ないし中性プロテアーゼを用いて加水分解するのが好適であることが示された。 As shown in FIG. 8, collagen was detected in all cases where three types of proteases were used, indicating that they were hydrolyzed by these proteases. In particular, when SP, which is a weakly acidic or neutral protease, was used, the highest collagen yield value was exhibited. Therefore, in order to obtain collagen efficiently, hydrolysis using a weakly acidic or neutral protease is preferable. It was shown that.
（３）プロテアーゼ濃度の検討
次に、弱酸性ないし中性プロテアーゼであるＳＰの添加濃度の検討を行った。具体的には、実施例６のＳＰの濃度を、ヒトデに対して０．１，０．２，０．４，０．８％（ｗ／ｗ）とし、各々を加えてプロテアーゼ処理して得た加水分解物を遠心分離器（コクサンＨ６００Ｓ）にて４０００×ｇ，室温にて３０分間遠心分離し、上澄み液を得た。得られた上澄み液を、珪藻土を原料とした濾過助剤であるラヂオライト＃１００（昭和化学工業社）を用いて珪藻土濾過した後、分画分子量を６Ｋから５Ｋの限外濾過膜（旭化成社）に代えて限外濾過を行い、保持液を得た。この保持液のコラーゲン歩留り（％）とＣ／Ｐ（％）とを算出した。その結果を図９に示す。
(3) Examination of protease concentration Next, the addition concentration of SP, which is a weakly acidic or neutral protease, was examined. Specifically, the concentration of SP in Example 6 was 0.1, 0.2, 0.4, 0.8% (w / w) with respect to starfish, and each was added and treated with protease. The hydrolyzate was centrifuged at 4000 × g for 30 minutes at room temperature in a centrifuge (Kokusan H600S) to obtain a supernatant. The obtained supernatant is filtered through diatomaceous earth using Radiolite # 100 (Showa Chemical Industry Co., Ltd.), a filter aid made from diatomaceous earth, and then an ultrafiltration membrane (Asahi Kasei Co., Ltd.) having a molecular weight cut off of 6K to 5K. ) And ultrafiltration was performed to obtain a retentate. The collagen yield (%) and C / P (%) of this retentate were calculated. The result is shown in FIG.
図９に示すように、すべての酵素濃度において、コラーゲンが検出され、これら濃度のプロテアーゼにより加水分解されていることが示された。特に、プロテアーゼ濃度が０．２％の場合に、最も高いコラーゲン歩留り値を示したことから、コラーゲンを効率よく得るためにはプロテアーゼ濃度を０．２％として加水分解するのが好適であることが示された。 As shown in FIG. 9, collagen was detected at all enzyme concentrations, indicating that it was hydrolyzed by these concentrations of protease. In particular, when the protease concentration was 0.2%, the highest collagen yield value was exhibited. Therefore, in order to obtain collagen efficiently, it is preferable to perform hydrolysis with a protease concentration of 0.2%. Indicated.
（４）プロテアーゼ処理時間の検討
続いて、ＳＰの処理時間の検討を行った。具体的には、実施例６のＳＰの処理時間を２，４，６，８時間にとして、各々プロテアーゼ処理して得た加水分解物を遠心分離器（コクサンＨ６００Ｓ）にて４０００×ｇ，室温にて３０分間遠心分離し、上澄み液を得た。そして、実施例６と同様に、ヒトデ重量に対する上澄み液のタンパク量（％）とヒトデ重量に対する上澄み液のコラーゲン重量（％）を算出した。その結果を図１０に示す。
(4) Examination of protease treatment time Subsequently, the treatment time of SP was examined. Specifically, the processing time of SP in Example 6 was set to 2, 4, 6 and 8 hours, and the hydrolyzate obtained by protease treatment was 4000 × g, room temperature in a centrifuge (Kokusan H600S). And centrifuged for 30 minutes to obtain a supernatant. Then, in the same manner as in Example 6, the amount of protein (%) in the supernatant liquid relative to the weight of the starfish and the collagen weight (%) of the supernatant liquid relative to the weight of the starfish were calculated. The result is shown in FIG.
図１０に示すように、すべてのプロテアーゼ処理時間において、コラーゲンが検出され、プロテアーゼにより加水分解されていることが示された。また、処理時間の変化によるコラーゲン歩留り値およびＣ／Ｐ値に大きな差はみられなかったが、処理時間が長くなるにつれてコラーゲン歩留り値およびＣ／Ｐ値が上昇する傾向を示した。 As shown in FIG. 10, collagen was detected and hydrolyzed by the protease at all protease treatment times. Further, although there was no significant difference in the collagen yield value and the C / P value due to changes in the treatment time, the collagen yield value and the C / P value tended to increase as the treatment time increased.
（５）中和後の濾過処理の検討
実施例６における中和した中和後の、限外濾過膜により濾過および濃縮した場合のコラーゲン歩留り値の減少が大きいことから、逆浸透膜により濾過および濃縮した場合との比較を行った。具体的には、分画分子量６０００の限外濾過膜ＡＩＰ２０１３（旭化成）と塩分阻止率１０％の逆浸透膜ＮＴＲ７４１０ＨＧ（日東電工社）とを用いて濾過して濃縮し、保持液を得た。この保持液のコラーゲン歩留り（％）とＣ／Ｐ（％）とを算出した。その結果を図１１に示す。
(5) Examination of filtration treatment after neutralization After the neutralization neutralization in Example 6, since the decrease in collagen yield when filtering and concentrating with an ultrafiltration membrane is large, filtration with a reverse osmosis membrane is performed. Comparison was made with the concentrated case. Specifically, filtration and concentration were performed using an ultrafiltration membrane AIP2013 (Asahi Kasei) with a molecular weight cut off of 6000 and a reverse osmosis membrane NTR7410HG (Nitto Denko) with a salt rejection of 10% to obtain a retentate. The collagen yield (%) and C / P (%) of this retentate were calculated. The result is shown in FIG.
図１１に示すように、塩分阻止率１０％の逆浸透膜を用いて濾過した場合、分画分子量６０００の限外濾過膜を用いて濾過した場合の２倍以上の歩留りを示した。 As shown in FIG. 11, when filtration was performed using a reverse osmosis membrane having a salt rejection of 10%, the yield was twice or more that of filtration using an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 6000.
（６）ヒトデ原料処理の検討
以上（１）〜（５）の結果を踏まえたうえで、ヒトデ原料の処理についての検討を行った。具体的には、実施例６で得られた未処理ヒトデ原料から調製したヒトデコラーゲンペプチド（以下、「従来ＣＰ」という。）の他、ヒトデ原料を３〜５ｃｍのブロック状にカットしたもの、およびカットする代わりにミートチョッパーで処理して直径９．６ｍｍの目皿を通したものを、各々、デカンテーションにてその約２倍量の水で約１０回洗浄し、内臓等を除去して調製したヒトデコラーゲンペプチド（以下、それぞれを「ブロックＣＰ」および「ミンチＣＰ」という。）のＣ／Ｐ値を、実施例７と同様の手法により算出した。その結果を図１２に示す。
(6) Examination of starfish raw material treatment Based on the results of (1) to (5) above, the treatment of starfish raw material was examined. Specifically, in addition to the starfish collagen peptide prepared from the untreated starfish raw material obtained in Example 6 (hereinafter referred to as “conventional CP”), the starfish raw material cut into blocks of 3 to 5 cm, and Instead of cutting, processed with a meat chopper and passed through a 9.6 mm diameter plate, each was washed about 10 times with about twice the amount of water by decantation, and the internal organs were removed. C / P values of the obtained star decollagen peptides (hereinafter referred to as “block CP” and “mince CP”) were calculated in the same manner as in Example 7. The result is shown in FIG.
図１２に示すように、ブロックＣＰとミンチＣＰとのヒトデコラーゲンペプチドのＣ／Ｐ値は、いずれも、従来ＣＰのＣ／Ｐ値よりも高いことが示された。また、ミンチＣＰのＣ／Ｐ値と比較して、ブロックＣＰのＣ／Ｐ値の方が高いことが示された。 As shown in FIG. 12, it was shown that the C / P values of the human decollagen peptides of block CP and mince CP are both higher than the C / P value of the conventional CP. Further, it was shown that the C / P value of the block CP was higher than the C / P value of the mince CP.
＜実施例８＞カドミウム含有量の検討
（１）ヒトデコラーゲンペプチド調製工程におけるカドミウム含有量の検討
ヒトデコラーゲンペプチド調製工程におけるカドミウム含有量の検討を行った。すなわち、図１３に示すように、コラーゲンペプチド調製工程における酸性処理の段階を様々に変え、各々のコラーゲン歩留り（％）と含有カドミウム（Ｃｄ）量（ｐｐｍ）とを比較定量した。
<Example 8> Examination of cadmium content (1) Examination of cadmium content in the human decollagen peptide preparation step The cadmium content in the human decollagen peptide preparation step was examined. That is, as shown in FIG. 13, the acidic treatment stage in the collagen peptide preparation process was changed in various ways, and each collagen yield (%) and the amount of cadmium (Cd) contained (ppm) were comparatively quantified.
図１３に示すように、具体的には、酸性処理を行わないコントロール、加水分解液を直接酸性処理する工程（Ａ）、プロテアーゼ処理直後に酸性処理する工程（Ｂ）、プロテアーゼ処理直前に酸性処理する工程（Ｃ）、ヒトデに加水した直後とプロテアーゼ処理直前とにおいて２度酸性処理する工程（Ｄ）の５つの工程を設定し、得られる加水分解液と、コラーゲンプチドの各々のコラーゲン歩留り（％）と、含有カドミウム（Ｃｄ）量（ｐｐｍ）とを各々測定し算出した。 As shown in FIG. 13, specifically, a control in which acid treatment is not performed, a step (A) in which the hydrolyzed liquid is directly acid-treated, a step (B) in which acid treatment is performed immediately after protease treatment, and an acid treatment just before protease treatment. Step (C), the step (D) in which acid treatment is performed twice immediately after water addition to starfish and just before protease treatment, and the resulting hydrolyzate and collagen yield of each collagen peptide (% ) And the amount of cadmium (Cd) contained (ppm).
なお、コラーゲン歩留り（％）の測定および算出は、実施例７と同様の方法で行った。一方、カドミウムの検出は、ＭＬＳ−１２００ＭＥＧとＥＭ−４５マイクロウェーブ乾燥装置（ともに日本ゼネラル社）とを使用して、硝酸にて湿式分解後、Ｚ−６０００原子吸光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ社）で分析することにより行った。その結果を図１４に示す。 The collagen yield (%) was measured and calculated in the same manner as in Example 7. On the other hand, the detection of cadmium was analyzed by Z-6000 atomic absorption photometer (HITACHI) after wet decomposition with nitric acid using MLS-1200 MEG and EM-45 microwave dryer (both from Nippon General). It was done by doing. The result is shown in FIG.
図１４に示すように、工程（Ａ）について、目的産物であるヒトデコラーゲンペプチドには、カドミウムがほとんど検出されなかった。また、加水分解液のカドミウム含有量については、コントロールおよび工程（Ａ）で最も低い値を示した。このことから、酸性処理は、加水分解液を得る前段階で行っても含有カドミウムを除去できないが、加水分解液を得た後に行うことにより、含有カドミウムを除去できることが示された。 As shown in FIG. 14, cadmium was hardly detected in the human decollagen peptide, which is the target product, in the step (A). Moreover, about the cadmium content of the hydrolyzate, the lowest value was shown by control and the process (A). From this fact, it was shown that the cadmium contained can be removed by carrying out the acid treatment after obtaining the hydrolyzate, although the cadmium contained cannot be removed even if it is carried out in the previous stage of obtaining the hydrolyzate.
（２）中和後に逆浸透膜を用いて濾過した場合のカドミウム除去の検討
実施例６における中和後の、逆浸透膜により濾過および濃縮して得られる保持液に含まれるカドミウムを除去するために、電気透析によるカドミウム除去の検討を行った。具体的には、電気透析装置マイクロアシライザーＳ３型（アストム社）を用い、逆浸透膜により濾過および濃縮して得られる保持液について電気透析処理を行ってカドミウムを除去した後、活性炭ＦＣ（二村化学工業社）による処理および珪藻土を原料とした濾過助剤であるラヂオライト＃１００（昭和化学工業社）を用いて珪藻土濾過を行った。その結果を図１５に示す。
(2) Examination of cadmium removal in the case of filtration using a reverse osmosis membrane after neutralization To remove cadmium contained in the retentate obtained by filtration and concentration using a reverse osmosis membrane after neutralization in Example 6. In addition, cadmium removal by electrodialysis was examined. Specifically, electrodialysis was performed on the retentate obtained by filtering and concentrating with a reverse osmosis membrane using an electrodialyzer microacylator S3 type (Astom), and then cadmium was removed, and then activated carbon FC (Nimura) Diatomite filtration was performed using Radiolite # 100 (Showa Kagaku Kogyo Co., Ltd.) which is a filter aid made from diatomaceous earth as a raw material. The result is shown in FIG.
図１５に示すように、逆浸透膜により濾過および濃縮して得られる保持液に含まれる０．３０８ｐｐｍのカドミウム量が、６時間の電気透析処理後には検出限界である０．００２ｐｐｍ以下になっていた。 As shown in FIG. 15, the amount of cadmium of 0.308 ppm contained in the retentate obtained by filtration and concentration through a reverse osmosis membrane is 0.002 ppm or less, which is the detection limit after 6 hours of electrodialysis. It was.
以上、実施例６、実施例７および本実施例８より、本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドの製造方法としては、図１６に示す各工程が好適であることが示された。 As described above, Example 6, Example 7, and Example 8 show that the steps shown in FIG. 16 are preferable as the method for producing a human decollagen peptide according to the present invention.
＜実施例９＞より純度（Ｃ／Ｐ）の高いヒトデコラーゲンペプチドの調製
図１６に示すヒトデコラーゲンペプチドの製造方法とは異なる、より純度（Ｃ／Ｐ）の高いヒトデコラーゲンの製造方法を検討した。
<Example 9> Preparation of human decollagen peptide with higher purity (C / P) A method for producing human decollagen with higher purity (C / P), which is different from the method for producing human decollagen peptide shown in FIG. .
凍結マヒトデから内臓を除去して得られた体壁約１．１ｋｇを原料として、０．２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液４Ｌに一晩浸漬してアルカリ処理し、続いて０．２Ｍの塩酸４Ｌに一晩浸漬して酸処理した。さらに蒸留水に一晩浸漬して水浸処理して得られた原料に２倍量（ｗ／ｗ）の水とＳＰ０．２％（ｗ／ｗ）とを加えて、攪拌しながら５０℃で８時間プロテアーゼ処理を行い、加水分解物を得た。この加水分解物を遠心分離器（コクサンＨ−２０００Ｂ）にて、１００００×ｇ，４℃で１０分間遠心分離を行い、その上澄み液を採取して凍結乾燥することによりヒトデコラーゲンペプチド（以下、「ＨｉＣＰ」という。）を得た。得られたＨｉＣＰのＣ／Ｐ値を実施例７と同様の手法により算出した。その結果を図１７に示す。 About 1.1 kg of the body wall obtained by removing the viscera from the frozen starfish was used as a raw material and immersed in 4 L of a 0.2 M aqueous sodium hydroxide solution overnight, followed by alkali treatment, followed by 4 L of 0.2 M hydrochloric acid. It was soaked overnight and acid-treated. Furthermore, twice the amount (w / w) of water and SP 0.2% (w / w) were added to the raw material obtained by soaking in distilled water overnight and soaking at 50 ° C. with stirring. Protease treatment was performed for 8 hours to obtain a hydrolyzate. This hydrolyzate was centrifuged at 10,000 × g and 4 ° C. for 10 minutes in a centrifuge (Kokusan H-2000B), and the supernatant was collected and freeze-dried to obtain a human decollagen peptide (hereinafter “ HiCP "). The C / P value of the obtained HiCP was calculated by the same method as in Example 7. The result is shown in FIG.
図１７に示すように、ＨｉＣＰのＣ／Ｐ値は、従来ＣＰ、ブロックＣＰおよびミンチＣＰのいずれのＣ／Ｐ値よりも高いことが示され、その値は８７．８％であった。 As shown in FIG. 17, it was shown that the C / P value of HiCP was higher than the C / P values of the conventional CP, block CP, and mince CP, and the value was 87.8%.
以上、本実施例９より、本発明に係るヒトデコラーゲンペプチドの製造方法としては、図１８に示す工程も好適であることが示された。 As described above, from Example 9, it was shown that the process shown in FIG. 18 is also suitable as a method for producing a human decollagen peptide according to the present invention.
＜実施例１０＞Ｗｉｓｔａｒラットへのヒトデコラーゲンペプチドの投与による血糖値上昇抑制効果の検討
健常ラットであるＷｉｓｔａｒラットを用いて、ヒトデコラーゲンペプチドの糖負荷試験を行い、血糖値を測定した。
<Example 10> Examination of inhibitory effect on increase in blood glucose level by administration of human decollagen peptide to Wistar rat Using a Wistar rat, which is a healthy rat, a glucose tolerance test of human decollagen peptide was performed to measure the blood glucose level.
（１）逆浸透膜濾過を行って調製した従来ＣＰの投与による血糖値上昇抑制効果の検討
被検物質は、実施例７（５）で逆浸透膜濾過を行って調製した従来ＣＰを用いた。試験動物は、９〜１０週齢オスのＷｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３９０ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群とヒトデコラーゲンペプチド群の２群を、各々５匹として行った。グルコースを投与した後、被検物質として蒸留水とヒトデコラーゲンペプチドとを各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。
(1) Examination of blood glucose level increase inhibitory effect by administration of conventional CP prepared by reverse osmosis membrane filtration The test substance used was conventional CP prepared by performing reverse osmosis membrane filtration in Example 7 (5). . The test animals used were 9 to 10-week-old male Wistar rats (Charles River Japan) having an average weight of about 390 g at the start of the test. The test group consisted of 2 groups, a control group and a human decollagen peptide group, each with 5 animals. After administration of glucose, distilled water and human decollagen peptide were respectively administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、Ｗｉｓｔａｒラットを１６時間絶食させて血糖値を測定し、これを初期血糖値とした。対照群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、ヒトデコラーゲンペプチド群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％ヒトデコラーゲンペプチド水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合し、各々、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血糖値の測定を行った。血糖値の測定は実施例２と同様にして行った。 The test method is as follows. First, the Wistar rat was fasted for 16 hours to measure the blood glucose level, which was used as the initial blood glucose level. For the control group, 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and distilled water 10 mL / kg, and for the human decollagen peptide group 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and 15% human decollagen. The peptide aqueous solution was mixed with 10 mL / kg, and each was forcibly administered orally using an oral administration sonde (FUCHIGAMI). The administration time was 0 minute, and the blood glucose level was measured after 15, 30, 60 and 120 minutes. The blood glucose level was measured in the same manner as in Example 2.
［データ解析］
得られた数値に基づいて、実施例３と同様にして、各群における平均値および標準誤差を算出した。その結果を図１９に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical values, the average value and the standard error in each group were calculated in the same manner as in Example 3. The result is shown in FIG. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図１９に示すように、対照群は糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、１５分経過後に最高値に達した後、血糖値は１２０分を経過するまで徐々に低下し、９〜１０週齢のＷｉｓｔａｒラットの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、ヒトデコラーゲンペプチド群では、糖負荷後１５分までゆるやかに血糖値が上昇して最高値に達した後、その後ゆるやかに低下した。また、１５，３０，６０分経過後の測定点において、対照群に比べて低い血糖値を示し、１５，３０分経過後において対照群に比べて有意に低い血糖値が認められた。詳細には、３０分経過後には対照群に対して１％有意水準にて有意性を示し、１５分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 19, in the control group, the blood glucose level immediately increased after glucose load, reached the maximum value after 15 minutes, and then gradually decreased until 120 minutes passed. Normal blood glucose levels in the glucose tolerance test of aged Wistar rats were shown. On the other hand, in the star decollagen peptide group, the blood glucose level gradually increased to 15 minutes after sugar loading and reached the maximum value, and then gradually decreased. Moreover, the blood glucose level was lower than that of the control group at the measurement points after 15, 30, and 60 minutes, and the blood glucose level was significantly lower than that of the control group after the passage of 15, 30 minutes. Specifically, after 30 minutes, the control group showed significance at the 1% significance level, and after 15 minutes, the control group showed significance at the 5% significance level.
（２）ＨｉＣＰの投与による血糖値上昇抑制効果の検討
被検物質は、実施例９で調製したＨｉＣＰを用いた。試験動物は、１１〜１２週齢オスのＷｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３９０ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群とヒトデコラーゲンペプチド群の２群を、各々５匹として行った。グルコースを投与した後、被検物質として蒸留水とヒトデコラーゲンペプチドとを各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。
(2) Examination of blood glucose level increase inhibitory effect by administration of HiCP HiCP prepared in Example 9 was used as a test substance. The test animals used were 11 to 12-week-old male Wistar rats (Charles River Japan, Inc.) having an average weight of about 390 g at the start of the test. The test group consisted of 2 groups, a control group and a human decollagen peptide group, each with 5 animals. After administration of glucose, distilled water and human decollagen peptide were respectively administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、Ｗｉｓｔａｒラットを１６時間絶食させて血糖値を測定し、これを初期血糖値とした。対照群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、ヒトデコラーゲンペプチド群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％ヒトデコラーゲンペプチド水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合し、各々、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血糖値の測定を行った。血糖値の測定は実施例２と同様にして行った。 The test method is as follows. First, the Wistar rat was fasted for 16 hours to measure the blood glucose level, which was used as the initial blood glucose level. For the control group, 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and distilled water 10 mL / kg, and for the human decollagen peptide group 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and 15% human decollagen. The peptide aqueous solution was mixed with 10 mL / kg, and each was forcibly administered orally using an oral administration sonde (FUCHIGAMI). The administration time was 0 minute, and the blood glucose level was measured after 15, 30, 60 and 120 minutes. The blood glucose level was measured in the same manner as in Example 2.
［データ解析］
得られた数値に基づいて、実施例３と同様にして、各群における平均値および標準誤差を算出した。その結果を図２０に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical values, the average value and the standard error in each group were calculated in the same manner as in Example 3. The result is shown in FIG. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図２０に示すように、いずれの群も糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、１５分経過後に最高値に達した。その後、対照群では、血糖値は１２０分を経過するまで徐々に低下し、１１〜１２週齢のＷｉｓｔａｒラットの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、ヒトデコラーゲンペプチド群では、１５，３０，６０分経過後の測定点において、対照群に比べて低い血糖値を示し、１５，３０分経過後において対照群に比べて有意に低い血糖値が認められた。詳細には、３０分経過後には対照群に対して１％有意水準にて有意性を示し、１５分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 20, in all groups, the blood glucose level immediately increased after glucose loading, and reached the maximum value after 15 minutes. Thereafter, in the control group, the blood glucose level gradually decreased until 120 minutes passed, and showed a normal blood glucose level in a glucose tolerance test of 11-12 week old Wistar rats. On the other hand, in the star decollagen peptide group, the blood glucose level is lower than that of the control group at the measurement points after 15, 30 and 60 minutes, and the blood glucose level is significantly lower than that of the control group after 15 and 30 minutes. Admitted. Specifically, after 30 minutes, the control group showed significance at the 1% significance level, and after 15 minutes, the control group showed significance at the 5% significance level.
＜実施例１１＞ＣＤ１マウスへのヒトデコラーゲンペプチドの投与による血糖値上昇抑制効果の検討
健常マウスであるＣＤ１マウスを用いて、ヒトデコラーゲンペプチドの糖負荷試験を行い、血糖値を測定した。
<Example 11> Examination of inhibitory effect on increase in blood glucose level by administration of human decollagen peptide to CD1 mice Using a CD1 mouse, which is a healthy mouse, a glucose tolerance test of human decollagen peptide was performed to measure the blood glucose level.
被検物質は、実施例９で調製したＨｉＣＰを用いた。試験動物は、８週齢のＣＤ１マウス（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３０ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群とヒトデコラーゲンペプチド群の２群を、各々６匹として行った。グルコースを投与した後、被検物質として蒸留水とヒトデコラーゲンペプチドとを各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 As the test substance, HiCP prepared in Example 9 was used. The test animals used were 8 weeks old CD1 mice (Charles River Japan, Inc.) having an average body weight of about 30 g at the start of the test. The test group consisted of 2 groups, a control group and a human decollagen peptide group, each with 6 animals. After administration of glucose, distilled water and human decollagen peptide were respectively administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、ＣＤ１マウスを１６時間絶食させて血糖値を測定し、これを初期血糖値とした。対照群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、ヒトデコラーゲンペプチド群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％ヒトデコラーゲンペプチド水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合し、各々、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血糖値の測定を行った。血糖値の測定は実施例２と同様にして行った。 The test method is as follows. First, CD1 mice were fasted for 16 hours to measure blood glucose levels, which were used as initial blood glucose levels. For the control group, 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and distilled water 10 mL / kg, and for the human decollagen peptide group 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and 15% human decollagen. The peptide aqueous solution was mixed with 10 mL / kg, and each was forcibly administered orally using an oral administration sonde (FUCHIGAMI). The administration time was 0 minute, and the blood glucose level was measured after 15, 30, 60 and 120 minutes. The blood glucose level was measured in the same manner as in Example 2.
［データ解析］
得られた数値に基づいて、実施例３と同様にして、各群における平均値および標準誤差を算出した。その結果を図２１に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical values, the average value and standard error in each group were calculated in the same manner as in Example 3. The result is shown in FIG. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図２１に示すように、いずれの群も糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、３０分経過後に最高値に達した。その後、対照群では、血糖値は１２０分を経過するまで徐々に低下し、８週齢のＣＤ１マウスの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、ヒトデコラーゲンペプチド群では、１５，３０，６０，１２０分経過後のすべての測定点において、対照群に比べて低い血糖値を示し、３０，６０，１２０分経過後において対照群に比べて有意に低い血糖値が認められた。詳細には、６０分経過後には対照群に対して１％有意水準にて有意性を示し、３０，１２０分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 21, in all groups, the blood glucose level immediately increased after glucose loading, and reached the maximum value after 30 minutes. Thereafter, in the control group, the blood glucose level gradually decreased until 120 minutes passed, and showed a normal blood glucose level in the glucose tolerance test of 8-week-old CD1 mice. On the other hand, the human decollagen peptide group showed a lower blood glucose level than the control group at all measurement points after 15, 30, 60, 120 minutes, and compared with the control group after 30, 60, 120 minutes. Significantly lower blood glucose levels were observed. Specifically, after 60 minutes, the control group showed significance at the 1% significance level, and after 30,120 minutes, the control group showed significance at the 5% significance level.
＜実施例１２＞ＣＤ１マウスを用いたヒトデコラーゲンペプチドの投与量の検討
健常マウスであるＣＤ１マウスを用いて、ヒトデコラーゲンペプチドの投与量を変えて糖負荷試験を行い、血糖値を測定することにより、ヒトデコラーゲンペプチドの投与量を検討した。
<Example 12> Examination of dose of human decollagen peptide using CD1 mouse Using a CD1 mouse which is a healthy mouse, a glucose tolerance test is performed by changing the dose of human decollagen peptide, and a blood glucose level is measured. The dosage of star decollagen peptide was examined.
被検物質は、実施例９で調製したヒトデコラーゲンペプチドを用いた。試験動物は、９週齢のＣＤ１マウス（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３０ｇのものを使用した。試験構成群は、ヒトデコラーゲンペプチドの投与量別に、対照群、５００ｍｇ／ｋｇ・ｗ群、７５０ｍｇ／ｋｇ・ｗ群、１．０ｇ／ｋｇ・ｗ群、１．５ｇ／ｋｇ・ｗおよび２．０ｇ／ｋｇ・ｗ群の６群を、各々７匹として行った。グルコースを投与した後、被検物質として蒸留水とヒトデコラーゲンペプチドとを各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 As a test substance, the human decollagen peptide prepared in Example 9 was used. The test animals used were 9-week-old CD1 mice (Charles River Japan, Inc.) having an average weight of about 30 g at the start of the test. The test group consists of a control group, a 500 mg / kg · w group, a 750 mg / kg · w group, a 1.0 g / kg · w group, 1.5 g / kg · w, and 2.0 g according to the dose of human decollagen peptide. 6 groups of / kg · w group were performed as 7 animals each. After administration of glucose, distilled water and human decollagen peptide were respectively administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、ＣＤ１マウスを１６時間絶食させて血糖値を測定し、これを初期血糖値とした。対照群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、５００ｍｇ／ｋｇ・ｗ群、７５０ｍｇ／ｋｇ・ｗ群、１．０ｇ／ｋｇ・ｗ群、１．５ｇ／ｋｇ・ｗおよび２．０ｇ／ｋｇ・ｗ群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇとヒトデコラーゲンペプチド５００ｍｇ／ｋｇ・ｗ、７５０ｍｇ／ｋｇ・ｗ、１．０ｇ／ｋｇ・ｗ、１．５ｇ／ｋｇ・ｗまたは２．０ｇ／ｋｇ・ｗとを各々混合して、各々蒸留水により１５ｍＬ／ｋｇとなるよう調製し、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血糖値の測定を行った。血糖値の測定は実施例２と同様にして行った。 The test method is as follows. First, CD1 mice were fasted for 16 hours to measure blood glucose levels, which were used as initial blood glucose levels. In the control group, a 41% (w / v) glucose aqueous solution (5 mL / kg) and distilled water (10 mL / kg), 500 mg / kg · w group, 750 mg / kg · w group, 1.0 g / kg · w group, In the 5 g / kg · w and 2.0 g / kg · w groups, 41 mL (w / v) glucose aqueous solution 5 mL / kg, human decollagen peptide 500 mg / kg · w, 750 mg / kg · w, 1.0 g / kg kg · w, 1.5 g / kg · w or 2.0 g / kg · w are mixed to prepare 15 mL / kg with distilled water and forced using an oral administration sonde (FUCHIGAMI) Orally administered. The administration time was 0 minute, and the blood glucose level was measured after 15, 30, 60 and 120 minutes. The blood glucose level was measured in the same manner as in Example 2.
［データ解析］
得られた数値に基づいて血糖値の総和を算出し、これと時間経過とを表したグラフで描かれる曲線（血糖値総和−時間曲線）と横軸（時間軸）によって囲まれた部分の面積を算出し、血糖値総和曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｃｕｒｖｅ；ＡＵＣ）を求めた。その結果を図２２に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical value, the sum of blood glucose levels is calculated, and the area surrounded by the curve (blood glucose level sum-time curve) and the horizontal axis (time axis) drawn in a graph showing this and the passage of time Was calculated, and the area under the blood glucose sum curve (AUC) was determined. The result is shown in FIG. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図２２に示すように、ヒトデコラーゲンペプチドの投与量が１．５ｇ／ｋｇ・ｗの場合で有意に低い血糖値総和値が認められ、５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 22, a significantly low blood sugar level total value was observed when the dose of human decollagen peptide was 1.5 g / kg · w, indicating significance at a 5% significance level.
＜実施例１３＞ヒトデコラーゲンペプチドに含まれるペプチドの分子量の検討
分子篩クロマトグラフィーの一種であるゲル濾過クロマトグラフィーにより、ヒトデコラーゲンペプチドに含まれるペプチドの分子量を検討した。
<Example 13> Examination of molecular weight of peptide contained in human decollagen peptide The molecular weight of the peptide contained in human decollagen peptide was examined by gel filtration chromatography which is a kind of molecular sieve chromatography.
蒸留水で十分に膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）をカラムに充填し、蒸留水で平衡化した。これに、実施例１２で示したヒトデコラーゲンペプチド１．５ｇ／ｋｇ・ｗを供し、蒸留水で溶出しながらフラクションを５ｍＬずつ回収した。回収したフラクション（ゲル濾過分画物）をＦ１、Ｆ２およびＦ３とした。これらは、蒸留水で十分に洗浄した充填カラムにそれぞれ供して蒸留水で溶出し、２３０ｎｍの吸光度から溶出ピーク位置を決定した。その結果を図２３に示す。 Sephadex G-50 (GE Healthcare Bioscience) fully swollen with distilled water was packed in a column and equilibrated with distilled water. This was supplied with 1.5 g / kg · w of the human decollagen peptide shown in Example 12, and 5 mL fractions were collected while eluting with distilled water. The collected fractions (gel filtration fractions) were designated as F1, F2 and F3. These were each supplied to packed columns thoroughly washed with distilled water and eluted with distilled water, and the elution peak position was determined from the absorbance at 230 nm. The result is shown in FIG.
図２３に示すように、ヒトデコラーゲンペプチドはＦ３で示される分子量が約３００〜５０００の低分子のゲル濾過分画物を多く含むことが示された。 As shown in FIG. 23, it was shown that the human decollagen peptide contains many low molecular weight gel filtration fractions having a molecular weight of about 300 to 5000 represented by F3.
＜実施例１４＞ＣＤ１マウスへのＦ３ゲル濾過分画物の投与による血糖値上昇抑制効果の検討
健常マウスであるＣＤ１マウスを用いて、実施例１３で得られたＦ３ゲル濾過分画物の糖負荷試験を行い、血糖値を測定した。
<Example 14> Examination of inhibitory effect on increase in blood glucose level by administration of F3 gel filtration fraction to CD1 mouse Sugar of F3 gel filtration fraction obtained in Example 13 using CD1 mouse which is a healthy mouse A stress test was performed and blood glucose levels were measured.
被検物質は、実施例１３で得られたＦ３ゲル濾過分画物を用いた。試験動物は、９週齢のＣＤ１マウス（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３０ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群とＦ３ゲル濾過分画物群の２群を、各々６匹として行った。グルコースを投与した後、被検物質として蒸留水とＦ３ゲル濾過分画物とを各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 The F3 gel filtration fraction obtained in Example 13 was used as the test substance. The test animals used were 9-week-old CD1 mice (Charles River Japan, Inc.) having an average weight of about 30 g at the start of the test. The test group consisted of 2 groups, a control group and an F3 gel filtration fraction group, each with 6 animals. After administration of glucose, distilled water and F3 gel filtration fraction were respectively administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、ＣＤ１マウスを１６時間絶食させて血糖値を測定し、これを初期血糖値とした。対照群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、Ｆ３ゲル濾過分画物群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％Ｆ３ゲル濾過分画物水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合し、各々、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血糖値の測定を行った。血糖値の測定は実施例２と同様にして行った。 The test method is as follows. First, CD1 mice were fasted for 16 hours to measure blood glucose levels, which were used as initial blood glucose levels. In the control group, 41 mL (w / v) of glucose aqueous solution 5 mL / kg and distilled water 10 mL / kg, and in the F3 gel filtration fraction group, 41% (w / v) glucose aqueous solution 5 mL / kg and 15 mL. % F3 gel filtration fraction aqueous solution (10 mL / kg) was mixed, and each was forcibly orally administered using an orally administered sonde (FUCHIGAMI). The administration time was 0 minute, and the blood glucose level was measured after 15, 30, 60 and 120 minutes. The blood glucose level was measured in the same manner as in Example 2.
［データ解析］
得られた数値に基づいて、実施例３と同様にして、各群における平均値および標準誤差を算出した。その結果を図２４に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical values, the average value and standard error in each group were calculated in the same manner as in Example 3. The result is shown in FIG. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図２４に示すように、いずれの群も糖負荷後すみやかに血糖値が上昇し、３０分経過後に最高値に達した。その後、対照群では、血糖値は１２０分を経過するまで徐々に低下し、９週齢のＣＤ１マウスの糖負荷試験における通常の血糖値を示した。一方、Ｆ３ゲル濾過分画物群では、１５，３０，６０，１２０分経過後のすべての測定点において、対照群に比べて低い血糖値を示し、かつ有意に低い血糖値が認められた。詳細には、３０分経過後には対照群に対して１％有意水準にて有意性を示し、１５，６０，１２０分経過後には対照群に対して５％有意水準にて有意性を示した。 As shown in FIG. 24, in all groups, the blood glucose level immediately increased after the sugar load, and reached the maximum value after 30 minutes. Thereafter, in the control group, the blood glucose level gradually decreased until 120 minutes passed, and showed a normal blood glucose level in a glucose tolerance test of 9-week-old CD1 mice. On the other hand, in the F3 gel filtration fraction group, the blood glucose level was lower than that of the control group at all measurement points after 15, 30, 60 and 120 minutes, and a significantly lower blood glucose level was observed. Specifically, after 30 minutes, the control group showed significance at the 1% significance level, and after 15, 60, 120 minutes, the control group showed significance at the 5% significance level. .
＜実施例１５＞ヒトデコラーゲンペプチドの血糖値上昇抑制機構の検討
ヒトデコラーゲンペプチドの血糖値上昇抑制機構を検討するため、グルコースの胃内滞留時間の検討、インスリン分泌の検討、α−グルコシダーゼ阻害の検討および小腸グルコース吸収阻害の検討を行った。
<Example 15> Examination of mechanism for suppressing increase in blood glucose level of human decollagen peptide In order to investigate the mechanism for suppressing increase in blood sugar level of human decollagen peptide, examination of gastric residence time in gastrics, examination of insulin secretion, examination of α-glucosidase inhibition In addition, we examined the inhibition of glucose absorption in the small intestine.
（１）ヒトデコラーゲンペプチド投与によるグルコース胃内滞留時間の検討
実施例９で調製したヒトデコラーゲンペプチドを糖負荷したＣＤ１マウスに投与することにより、グルコースの胃内滞留時間と胃内グルコース量とを測定し、その遅延効果から血糖値上昇抑制効果を検討した。まず、１１週齢のＣＤ１マウス（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３０ｇのものを選択し、各々４１匹として対照群とヒトデコラーゲンペプチド群の２群を試験構成群とした。グルコースを投与した後、被検物質として蒸留水とヒトデコラーゲンペプチドとを各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。
(1) Examination of glucose gastric residence time by administration of human decollagen peptide Administration of human decollagen peptide prepared in Example 9 to glucose-loaded CD1 mice to measure glucose gastric residence time and gastric glucose level Then, the effect of suppressing the increase in blood glucose level was examined from the delayed effect. First, among the 11-week-old CD1 mice (Nippon Charles River), those having an average body weight of about 30 g at the start of the test were selected, and each group consisted of 41 control animals and a human decollagen peptide group. Grouped. After administration of glucose, distilled water and human decollagen peptide were respectively administered as test substances. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、ＣＤ１マウスを１６時間絶食させた後、対照群には被検サンプルとして４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、ヒトデコラーゲンペプチド群には被検サンプルとして４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％ヒトデコラーゲンペプチド水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合し、各々、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。投与時間を０分として１５，３０，６０，１２０分経過後、これら糖負荷試験をしたＣＤ１マウスを、炭酸ガスを用いて経時的に屠殺した。 The test method is as follows. First, after fasting CD1 mice for 16 hours, the control group was tested with 41% (w / v) glucose aqueous solution (5 mL / kg) and distilled water (10 mL / kg), and the human decollagen peptide group was tested. As a sample, 5% / kg of a 41% (w / v) aqueous glucose solution and 10 mL / kg of a 15% human decollagen peptide aqueous solution were mixed, and each was forcibly orally administered using an orally administered sonde (FUCHIGAMI). After the lapse of 15, 30, 60, 120 minutes with the administration time being 0 minutes, the CD1 mice subjected to these glucose tolerance tests were sacrificed with carbon dioxide over time.
屠殺した各々のマウスの胃の両端をピンセットではさみ、胃を摘出した後、１ｍＬ生理食塩水に浸漬し、胃内容物を生理食塩水に溶解させ、共洗いをした。これを２回繰り返した後、その溶解物を遠沈管に移し遠心分離器（コクサンＨ６００Ｓ）にて２０００×ｇ，４℃にて１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清の量を、１０ｍＬメスシリンダーを用いて測定し、次いで、グルコース定量発色試薬３．０ｍＬを加えて３７℃、３０分間発色反応を行った後、発色反応で生成した赤色物質を５０５ｎｍで吸光値を測定し、投与した被検サンプルのグルコース定量発色の吸光値とからグルコース量を測定した。なお、投与時間１５分後の検体のみ、１／１０倍に希釈して測定した。また、グルコース定量試薬は、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５００ｍＬに、終濃度５．３ｍＭのフェノールと、０．２５５ｍＭの４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社）と、２９００ｕｎｉｔｓのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来グルコースオキシダーゼ（和光純薬工業社）と、３５５ｕｎｉｔｓの西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）とを溶解して調製した。その結果を図２５に、摘出した胃の状態を図２６（写真）に示す。なお、図２５において、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。 Both ends of the stomach of each slaughtered mouse were sandwiched with tweezers and the stomach was excised, then immersed in 1 mL of physiological saline, the stomach contents were dissolved in physiological saline, and washed together. After repeating this twice, the lysate was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 2000 × g and 4 ° C. for 10 minutes in a centrifuge (Kokusan H600S), and the supernatant was collected. The amount of the obtained supernatant was measured using a 10 mL graduated cylinder, then 3.0 mL of glucose quantitative coloring reagent was added, and the color reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes. The absorbance value was measured at 505 nm, and the glucose amount was measured from the absorbance value of glucose quantitative color development of the administered test sample. In addition, only the sample 15 minutes after the administration time was diluted to 1/10 and measured. The glucose quantification reagent was prepared by adding 500 mL of 30 mM phosphate buffer (pH 7.4), phenol having a final concentration of 5.3 mM, 0.255 mM 4-aminoantipyrine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 2900 units Aspergillus niger. It was prepared by dissolving glucose oxidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 355 units of horseradish peroxidase (HRP). The result is shown in FIG. 25, and the extracted stomach is shown in FIG. 26 (photograph). In FIG. 25, the significance level is assumed to be 5% and 1%, and is indicated by “*” and “**”, respectively.
図２５に示すように、対象群は糖負荷後すみやかに胃内グルコース量が減少し、６０分経過後までにすべての胃内グルコースが消化された。一方、ヒトデコラーゲンペプチド群では、胃内グルコース量は１２０分を経過するまで徐々に減少した。また、ヒトデコラーゲンペプチド群では、１５，３０，６０，１２０分経過後のすべての測定点において、対照群に比べて高い胃内グルコース量の値を示し、かつ有意に高い値が認められた。詳細には、１５，３０分経過後には対照群に対して１％有意水準にて有意性を示した。また、図２６に示すように、ヒトデコラーゲンペプチド群では、１５，３０分経過後において、対照群に比べて胃のふくらみが大きいことが確認された。 As shown in FIG. 25, in the subject group, the amount of glucose in the stomach immediately decreased after the glucose load, and all the gastric glucose was digested by 60 minutes. On the other hand, in the starfish collagen peptide group, the amount of gastric glucose gradually decreased until 120 minutes passed. In the star decollagen peptide group, the gastric glucose level was higher than that of the control group at all measurement points after 15, 30, 60 and 120 minutes, and a significantly higher value was observed. Specifically, after 15 and 30 minutes, the control group showed significance at a 1% significance level. Further, as shown in FIG. 26, it was confirmed that in the human decollagen peptide group, stomach swelling was larger than that in the control group after 15, 30 minutes.
以上より、ヒトデコラーゲンペプチドの投与により胃内のグルコースの滞留時間を遅延させることができることが確認され、血糖値の上昇を穏やかにする効果を有することが確認された。 From the above, it was confirmed that the residence time of glucose in the stomach can be delayed by administration of the human decollagen peptide, and it was confirmed that it has an effect of moderately increasing the blood glucose level.
（２）ヒトデコラーゲンペプチド投与によるインスリン分泌の検討
健常ラットであるＷｉｓｔａｒラットを用いて、実施例９で調製したヒトデコラーゲンペプチドの糖負荷試験を行い、血中インスリン濃度を測定した。
(2) Examination of insulin secretion by administration of human decollagen peptide Using the Wistar rat, which is a healthy rat, the glucose tolerance test of the human decollagen peptide prepared in Example 9 was performed, and the blood insulin concentration was measured.
被検物質は、実施例９で調製したものと同じものを用いた。試験動物は、１１週齢オスのＷｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３９０ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群、ヒトデコラーゲンペプチド群の２群を、各々５匹として行った。対照群、ヒトデコラーゲンペプチド群の各々については、グルコースを投与し、被検物質として蒸留水、ヒトデコラーゲンペプチドを各々投与した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 The same substance as that prepared in Example 9 was used as the test substance. The test animals used were 11-week-old male Wistar rats (Charles River Japan, Inc.) having an average weight of about 390 g at the start of the test. The test group consisted of 2 groups, a control group and a human decollagen peptide group, each with 5 animals. For each of the control group and the human decollagen peptide group, glucose was administered, and distilled water and human decollagen peptide were administered as test substances, respectively. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、Ｗｉｓｔａｒラットを１６時間絶食させた後、血液採取して血中インスリン濃度を測定し、これを初期血中インスリン濃度とした。対照群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、ヒトデコラーゲンペプチド群には４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％ヒトデコラーゲンペプチド水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合し、各々、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。投与時間を０分とし、１５，３０，６０，１２０分経過後に血液採取を行い、血中インスリン濃度を測定した。なお、血中インスリン濃度の測定は実施例３と同様にして行った。 The test method is as follows. First, after Wistar rats were fasted for 16 hours, blood was collected and the blood insulin concentration was measured, and this was used as the initial blood insulin concentration. For the control group, 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and distilled water 10 mL / kg, and for the human decollagen peptide group 41% (w / v) aqueous glucose solution 5 mL / kg and 15% human decollagen. The peptide aqueous solution was mixed with 10 mL / kg, and each was forcibly administered orally using an oral administration sonde (FUCHIGAMI). The administration time was 0 minute, blood was collected after 15, 30, 60 and 120 minutes, and the blood insulin concentration was measured. The blood insulin concentration was measured in the same manner as in Example 3.
［データ解析］
得られた数値に基づいて、実施例３と同様にして、各群における平均値および標準誤差を算出した。その結果を図２７に示す。なお、有意水準は危険率５％および１％とし、各々「＊」および「＊＊」で示す。
[Data analysis]
Based on the obtained numerical values, the average value and standard error in each group were calculated in the same manner as in Example 3. The result is shown in FIG. Significance levels are 5% and 1%, respectively, and are indicated by “*” and “**”, respectively.
図２７に示すように、対照群では１５分経過後に最高値を示し、その後、徐々に低下し、１１週齢のＷｉｓｔａｒラットの糖負荷試験における通常の血中インスリン濃度を示した。一方、ヒトデコラーゲンペプチド群においても、対照群と同様に１５分経過後に最高値を示し、その後、徐々に低下した。なお、各群間には有意差は認められなかった。 As shown in FIG. 27, the control group showed the maximum value after 15 minutes, and then gradually decreased to show the normal blood insulin concentration in the glucose tolerance test of 11-week-old Wistar rats. On the other hand, the starfish collagen peptide group also showed the maximum value after 15 minutes as in the control group, and then gradually decreased. There were no significant differences between the groups.
本実施例１５（２）により、ヒトデコラーゲンペプチドは、血中インスリン濃度に対して影響を与えないということが示された。このことから、ヒトデコラーゲンペプチドはインスリン分泌を促進しないことが示され、ヒトデの水抽出液および加水分解液と同様に、インスリン抵抗性を誘発する２型糖尿病患者に非常に有益であることが示された。 This Example 15 (2) showed that the human decollagen peptide has no effect on the blood insulin concentration. This shows that starfish collagen peptide does not promote insulin secretion and, like starfish water extract and hydrolyzate, is very beneficial to type 2 diabetic patients who induce insulin resistance. It was done.
（３）ヒトデコラーゲンペプチド投与によるα−グルコシダーゼ阻害の検討
α-グルコシダーゼ阻害の検討は栗原等の方法（Ｔ．ＯＨＴＡ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６（７），１５５２−１５５４（２００２））に従った。すなわち、試料である１５％ヒトデコラーゲンペプチド０．１ｍＬと、基質溶液としてマルトース水溶液またはスクロース水溶液０．１ｍＬと、０．１Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．７ｍＬとを試験管に加えて混合した後、α−グルコシダーゼ粗酵素液０．１ｍＬを加えて３７℃、１時間酵素反応を行った。反応後、２．０Ｍマレイン酸−トリス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１．０ｍＬを加えて酵素反応を停止させた。この反応停止溶液０．０２ｍＬを試験管に取り、本実施例１５（１）で調製したグルコース定量発色試薬３．０ｍＬを加えて３７℃、３０分間発色反応を行った後、発色反応で生成した赤色物質を５０５ｎｍで吸光値を測定した。
(3) Examination of α-glucosidase inhibition by administration of human decollagen peptide α-glucosidase inhibition was examined by the method of Kurihara et al. (T. OHTA et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66 (7), 1552-1554 (2002)). Followed. That is, 0.1 mL of 15% human decollagen peptide as a sample, 0.1 mL of an aqueous solution of maltose or sucrose as a substrate solution, and 0.7 mL of 0.1 M maleic acid buffer (pH 6.0) were added to a test tube. After mixing, 0.1 mL of α-glucosidase crude enzyme solution was added, and an enzyme reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, 1.0 mL of 2.0 M maleic acid-Tris-sodium hydroxide buffer (pH 7.4) was added to stop the enzyme reaction. 0.02 mL of this reaction stop solution was taken in a test tube, added with 3.0 mL of the glucose quantitative color-developing reagent prepared in Example 15 (1) and subjected to a color reaction at 37 ° C. for 30 minutes, and then produced by a color reaction. The absorbance of the red material was measured at 505 nm.
［データ解析］
阻害活性（阻害率）は、次式により算出した。
阻害率（％）＝１００×｛１−（Ａ−Ａ‘）／（Ｂ−Ｂ’）｝
Ａ ：糖を加え、試料を加えていないときの吸光値
Ａ’：糖を加え、試料を加えたときの吸光値
Ｂ ：糖を加えず、試料を加えていないときの吸光値
Ｂ’：糖を加えず、試料を加えたときの吸光値
なお、すべての試験は一定量および一定時間で行っているため、吸光値の変化量はそのまま酵素反応速度に相当するとみなし、阻害率を算出した。また、ポジティブコントロールとしてデオキシノジリマイシンを用いた。その結果を図２８に示す。
[Data analysis]
Inhibitory activity (inhibition rate) was calculated by the following equation.
Inhibition rate (%) = 100 × {1− (AA ′) / (BB ′)}
A: Absorbance value when sugar is added but no sample is added A ': Absorbance value when sugar is added and sample is added B: Absorbance value when sample is not added without sugar B': Sugar Absorption value when the sample was added without any addition Since all the tests were carried out at a constant amount and for a certain time, the amount of change in the absorption value was considered to correspond to the enzyme reaction rate as it was, and the inhibition rate was calculated. Deoxynojirimycin was used as a positive control. The result is shown in FIG.
図２８に示すように、ヒトデコラーゲンペプチドには、α−グルコシダーゼ活性は確認されなかった。 As shown in FIG. 28, α-glucosidase activity was not confirmed in the human decollagen peptide.
（４）ヒトデコラーゲンペプチド投与によるグルコース吸収阻害の検討
［４−１：Ｗｉｓｔａｒラットの小腸におけるグルコース吸収率の測定］
健常ラットであるＷｉｓｔａｒラットの小腸を用いて、ヒトデコラーゲンペプチド投与によるグルコース吸収阻害を検討した。
(4) Examination of glucose absorption inhibition by administration of human decollagen peptide [4-1: Measurement of glucose absorption rate in small intestine of Wistar rat]
Using the small intestine of Wistar rats, which are healthy rats, inhibition of glucose absorption by administration of human decollagen peptide was examined.
被検物質は、実施例９で調製したヒトデコラーゲンペプチドを用いた。試験動物は、１０週齢オスのＷｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３９０ｇのものを使用した。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 As a test substance, the human decollagen peptide prepared in Example 9 was used. The test animals used were 10-week-old male Wistar rats (Charles River Japan, Inc.) having an average weight of about 390 g at the start of the test. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、Ｗｉｓｔａｒラットを１６時間絶食させた後、炭酸ガスを用いて屠殺し、約２０ｃｍとなるように小腸を切除して回収した。回収した小腸を生理食塩水で洗浄し、下端をヒモで縛ったものを１２本準備した。次に、このうちの６本の小腸には、４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを混合した溶液（以下、「溶液Ａ」という。）を各々１ｍＬずつ流入し、上端をヒモで縛った。残りの６本の小腸には、４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％ヒトデコラーゲンペプチド水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合した溶液（以下、「溶液Ｂ」という。）を流入し、上端をヒモで縛ることにより計１２本の検体を作製した。生理食塩水の入った５０ｍＬのメスシリンダーを１２本用意し、これらに各々の検体を吊して入れ、３０分（溶液Ａが２本と溶液Ｂが２本）、６０分（同左）、１２０分（同左）間浸漬した。各々の外液の一部を回収し、本実施例１５（３）と同様の手法により、溶液中のグルコース量を測定した。その結果を図２９に示す。 The test method is as follows. First, Wistar rats were fasted for 16 hours, then sacrificed using carbon dioxide gas, and the small intestine was excised and collected so as to be about 20 cm. The collected small intestine was washed with physiological saline, and twelve were prepared with the lower ends tied with string. Next, in each of the six small intestines, 1 mL each of a solution prepared by mixing 5 mL / kg of a 41% (w / v) glucose aqueous solution and 10 mL / kg distilled water (hereinafter referred to as “solution A”). It flowed in one by one and tied the upper end with a string. A solution (hereinafter referred to as “solution B”) in which a 41% (w / v) aqueous glucose solution (5 mL / kg) and a 15% human decollagen peptide aqueous solution (10 mL / kg) are mixed flows into the remaining six small intestines. A total of 12 specimens were prepared by tying the upper ends with straps. Twelve 50 mL graduated cylinders containing physiological saline are prepared, and each specimen is suspended and placed in them for 30 minutes (two solutions A and two solutions B), 60 minutes (same as left), 120 Soaked for minutes (same as left). A part of each external liquid was collected, and the amount of glucose in the solution was measured by the same method as in Example 15 (3). The result is shown in FIG.
図２９に示すように、いずれの群もすみやかに糖の吸収が始まるが、対照群とヒトデコラーゲンペプチド群とでは、６０，１２０分経過後の測定点において、ヒトデコラーゲンペプチド群の方が対照群と比べて低い糖吸収率を示した。 As shown in FIG. 29, the absorption of sugar begins immediately in any group, but in the control group and the human decollagen peptide group, the human decollagen peptide group is more control group at the measurement points after 60, 120 minutes. The sugar absorption rate was low.
［４−２：ＣＤ１マウスの糞中グルコース濃度の測定］
健常マウスであるＣＤ１マウスにヒトデコラーゲンペプチドを投与し、糞中のグルコース濃度を測定した。
[4-2: Measurement of fecal glucose concentration in CD1 mice]
Human decollagen peptide was administered to CD1 mice, which are healthy mice, and the glucose concentration in feces was measured.
被検物質は、実施例９で調製したヒトデコラーゲンペプチドを用いた。試験動物は、１０週齢のＣＤ１ラット（日本チャールス・リバー社）のうち、試験開始時の体重が平均約３０ｇのものを使用した。試験構成群は、対照群とヒトデコラーゲンペプチド群の計６群を、各々７匹として行った。なお、動物実験は、「動物に関する指針（国立大学法人北海道大学大学院水産科学研究院）」に準じて実施した。 As a test substance, the human decollagen peptide prepared in Example 9 was used. The test animals used were 10-week-old CD1 rats (Nippon Charles River) having an average body weight of about 30 g at the start of the test. The test group consisted of a total of 6 groups, 7 for each of the control group and the human decollagen peptide group. Animal experiments were conducted according to the “Guidelines for Animals (National Hokkaido University Graduate School of Fisheries Sciences)”.
試験方法は以下のとおりである。まず、自由摂水かつ自由摂餌下のＣＤ１マウスについて、対照群には被検サンプルとして４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと蒸留水１０ｍＬ／ｋｇとを、ヒトデコラーゲンペプチド群には被検サンプルとして４１％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液５ｍＬ／ｋｇと１５％ヒトデコラーゲンペプチド水溶液１０ｍＬ／ｋｇとを混合し、各々、経口投与ゾンデ（ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ社）を用いて強制経口投与した。自由摂水かつ自由摂餌下で１２時間経過後、各々の糞を回収し、湿重量を測定した。回収した糞を凍結乾燥した後、乾燥重量を測定した。乾燥した糞を蒸留水に懸濁し、遠心分離器（コクサンＨ−２０００Ｂ）にて１００００×ｇ，４℃にて１０分間遠心分離して上清を回収し、本実施例１５（４）［４−１］と同様の手法により回収した上清のグルコース含量を測定した。その結果を図３０に示す。 The test method is as follows. First, for CD1 mice under free feeding and free feeding, the control group contained 41 mL (w / v) glucose aqueous solution 5 mL / kg and distilled water 10 mL / kg as the test sample. As a test sample, 5% / kg of a 41% (w / v) aqueous glucose solution and 10 mL / kg of a 15% human decollagen peptide aqueous solution were mixed, and each was orally administered by gavage using an orally administered sonde (FUCHIGAMI). After 12 hours passed under free water and free food, each feces was collected and the wet weight was measured. The collected feces were freeze-dried and then the dry weight was measured. The dried feces is suspended in distilled water, centrifuged at 10,000 × g and 4 ° C. for 10 minutes with a centrifuge (Kokusan H-2000B), and the supernatant is collected. This Example 15 (4) [4 The glucose content of the supernatant collected by the same method as in [-1] was measured. The result is shown in FIG.
図３０に示すように、ヒトデコラーゲンペプチドを投与した場合はグルコースが吸収されずに糞中に***されていることが確認された。 As shown in FIG. 30, it was confirmed that when human decollagen peptide was administered, glucose was not absorbed but excreted in feces.
以上（１）〜（４）より、本発明におけるヒトデコラーゲンペプチドの血糖値上昇抑制の機構は、グルコース吸収阻害であることが確認された。 From the above (1) to (4), it was confirmed that the mechanism for suppressing the increase in blood glucose level of the human decollagen peptide in the present invention is glucose absorption inhibition.
以上のような本実施例によれば、ヒトデコラーゲンペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制剤およびヒトデコラーゲンペプチドを提供することが可能である。 According to the present Example as described above, it is possible to provide a blood sugar level increase inhibitor and a human decollagen peptide comprising human decollagen peptide as an active ingredient.
一般に、単一の有用物質を分離精製するためには、抽出する試薬や煩雑な工程が必要とであり、目的成分以外の有用成分が変性を受けることや、目的成分以外の成分が大量に廃棄物として排出されることが多い。本発明は、このような問題点を解決するものでもあり、処分することが困難な水産廃棄物であるヒトデから有用物質を抽出することにより、ヒトデ全体を有効利用することができ、漁業におけるヒトデの問題の解決に資することが期待できる。 In general, in order to separate and purify a single useful substance, a reagent to be extracted and a complicated process are required. The useful ingredient other than the target ingredient is denatured, or the non-target ingredient is discarded in large quantities. It is often discharged as a thing. The present invention solves these problems, and by extracting useful substances from starfish, which is a marine waste that is difficult to dispose of, the entire starfish can be used effectively, and the starfish in the fishery industry can be used. It can be expected to contribute to the solution of this problem.
Claims (8)
前記ヒトデ処理後に弱酸性ないし中性プロテアーゼで処理をしてヒトデ加水分解物を生成するヒトデ加水分解物生成工程と、
前記ヒトデ加水分解物からヒトデコラーゲンペプチドを回収するヒトデコラーゲンペプチド回収工程と
を有するヒトデコラーゲンペプチドの製造方法。 A starfish treatment step for alkali treatment, acid treatment and water immersion treatment of the starfish;
A starfish hydrolyzate production step of producing a starfish hydrolyzate by treating with a weakly acidic or neutral protease after the starfish treatment;
A method for producing a human decollagen peptide, comprising: recovering a human decollagen peptide from the starfish hydrolyzate.
前記水浸処理後に弱酸性ないし中性プロテアーゼで処理をしてヒトデ加水分解物を生成するヒトデ加水分解物生成工程と、
前記ヒトデ加水分解物からヒトデ加水分解液を回収するヒトデ加水分解液回収工程と、
前記ヒトデ加水分解液から珪藻土濾過、限外濾過および逆浸透膜濾過のうちのいずれか１または２以上の濾過処理をしてヒトデコラーゲンペプチドを回収するヒトデコラーゲンペプチド回収工程と
を有するヒトデコラーゲンペプチドの製造方法。 A water immersion process for water-treating starfish;
A starfish hydrolyzate production step of producing a starfish hydrolyzate by treatment with a weakly acidic or neutral protease after the water immersion treatment;
A starfish hydrolyzate recovery step for recovering a starfish hydrolyzate from the starfish hydrolyzate;
A human decollagen peptide recovery step of recovering human decollagen peptide by subjecting the starfish hydrolyzate to one or more of diatomaceous earth filtration, ultrafiltration and reverse osmosis membrane filtration to recover human decollagen peptide. Production method.
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