JP2009219417A - Method for producing fatty acid alkyl ester - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for easily producing a fatty acid alkyl ester in high yield with the need of, separately, neither glycerol-removing step nor wastewater treatment step. <P>SOLUTION: The method for producing the fatty acid alkyl ester includes conducting a reaction between triglyceride-containing fat-and-oil and an alkyl carbonate in the presence of a lipase. In this method, the lipase is an immobilized one subjected to immobilization treatment in the presence of an organic solvent, wherein the lipase is preferably of Alcaligenes sp. origin. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、石鹸の製造原料や高級アルコールなどの合成原料などとして有用な脂肪酸アルキルエステルの製造方法に関するものである。   The present invention relates to a method for producing a fatty acid alkyl ester useful as a raw material for producing soap or a synthetic raw material such as higher alcohol.

脂肪酸アルキルエステルは、石鹸の製造原料、また高級アルコール若しくは界面活性剤などの合成原料などとして広く工業的に利用されており、例えば脂肪酸グリセリドとメタノールをアルカリ触媒存在下でエステル交換反応を行うことによって製造することができる（特許文献１）。
特開昭５６−１２０７９９号公報 Fatty acid alkyl esters are widely used industrially as soap raw materials and synthetic raw materials such as higher alcohols or surfactants. For example, fatty acid glycerides and methanol are transesterified in the presence of an alkali catalyst. It can be manufactured (Patent Document 1).
JP-A 56-120799

しかしながら、トリグリセリドとメタノールのエステル交換反応よって、脂肪酸アルキルエステルを製造する方法は、大量の副生グリセリンの除去や処理する工程、使用した触媒を水洗除去した廃水処理などを別途必要とし、製造コストが高くなるという問題がある。   However, the method of producing a fatty acid alkyl ester by transesterification of triglyceride and methanol requires a process for removing and treating a large amount of by-product glycerin, a waste water treatment by removing the used catalyst with water, and the production cost is high. There is a problem of becoming higher.

そこで、本発明は、グリセリン除去や廃水処理の工程を別途必要とせずに、高収率でかつ簡便に脂肪酸アルキルエステルを製造することができる脂肪酸アルキルエステルの製造方法を提供することを目的とする。   Then, this invention aims at providing the manufacturing method of the fatty-acid alkylester which can manufacture a fatty-acid alkylester simply by a high yield, without requiring the process of a glycerol removal or a wastewater treatment separately. .

以上の目的を達成するため、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、アルキル化剤としてアルキルカーボネートを使用し、有機溶媒中で固定化されたリパーゼを触媒として用いることにより前記課題を解決した。すなわち、本発明は、トリグリセリドを含む油脂とアルキルカーボネートをリパーゼ存在下において反応させて脂肪酸アルキルエステルを製造する方法であって、前記リパーゼは、有機溶媒存在下で固定化処理された固定化リパーゼであることを特徴とする脂肪酸アルキルエステルの製造方法である。   In order to achieve the above object, as a result of intensive research, the present inventors have solved the above problems by using alkyl carbonate as an alkylating agent and using lipase immobilized in an organic solvent as a catalyst. did. That is, the present invention is a method for producing a fatty acid alkyl ester by reacting an oil and fat containing triglyceride with an alkyl carbonate in the presence of lipase, wherein the lipase is an immobilized lipase that has been immobilized in the presence of an organic solvent. It is a method for producing a fatty acid alkyl ester.

本発明によれば、グリセリン除去や廃水処理の工程を別途必要とせずに、高収率でかつ簡便に脂肪酸アルキルエステルを製造することができる脂肪酸アルキルエステルの製造方法を提供することができる。   ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the manufacturing method of the fatty-acid alkylester which can manufacture a fatty-acid alkylester simply in a high yield can be provided, without requiring the process of a glycerol removal or wastewater treatment separately.

本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法において用いられるトリグリセリドを含む油脂としては、植物油や動物油等の天然油脂に含まれるものや化学的に合成されたものなど様々のものを用いることができる。主にステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸の４種類からなる。特にバイオマスであることが好ましい。また、このトリグリセリドは、精製されたものであっても良く、未精製のものを直接使用しても良い。植物油および動物油としては、魚油、牛脂や豚脂等の獣油、サフラワー油、ひまわり油、アマニ油、大豆油、ナタネ油、綿実油、オリーブ油、パーム油、コーン油、ゴマ油、ヒマシ油、米油等の植物油等がある。これらの油脂は１種のみを使用しても良く、２種以上を混合して使用しても良い。さらに、これらの油脂は天ぷら油等の廃食油であっても良い。この中で、分析や入手の容易さや価格等からナタネ油、パーム油、大豆油、米油が好適に用いられる。   As fats and oils containing triglycerides used in the method for producing fatty acid alkyl esters according to the present invention, various oils such as those contained in natural fats and oils such as vegetable oils and animal oils and chemically synthesized oils can be used. It consists mainly of four types: stearic acid, palmitic acid, oleic acid, and linoleic acid. In particular, biomass is preferable. The triglyceride may be purified, or unpurified one may be used directly. Vegetable oils and animal oils include fish oil, animal oil such as beef tallow and lard, safflower oil, sunflower oil, linseed oil, soybean oil, rapeseed oil, cottonseed oil, olive oil, palm oil, corn oil, sesame oil, castor oil, rice oil There are vegetable oils. These fats and oils may use only 1 type, and may mix and use 2 or more types. Furthermore, these fats and oils may be waste cooking oil such as tempura oil. Among these, rapeseed oil, palm oil, soybean oil, and rice oil are preferably used because of their ease of analysis, availability, price, and the like.

本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法において用いられるアルキルカーボネートとしては、ジメチルカーボネート（炭酸ジメチル）、ジエチルカーボネート(炭酸ジエチル)、ジプロピルカーボネートなどの対称カーボネートやメチルエチルカーボネート、メチルプロピルカーボネート、エチルプロピルカーボネートのような非対称カーボネートなどを用いることが好ましい。この中で、入手の容易さの観点から、ジメチルカーボネートが特に好ましい。使用するアルキルカーボネートの使用量は、トリグリセリドを含む油脂１モルに対して１〜５０モル、好ましくは、１．５〜１０モルである。   Examples of the alkyl carbonate used in the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention include symmetric carbonates such as dimethyl carbonate (dimethyl carbonate), diethyl carbonate (diethyl carbonate), and dipropyl carbonate, methyl ethyl carbonate, methyl propyl carbonate, and ethyl propyl. It is preferable to use an asymmetric carbonate such as carbonate. Among these, dimethyl carbonate is particularly preferable from the viewpoint of availability. The usage-amount of the alkyl carbonate to be used is 1-50 mol with respect to 1 mol of fats and oils containing a triglyceride, Preferably, it is 1.5-10 mol.

本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法において、固定化とは、リパーゼを凝集剤とグルタルアルデヒドなどの架橋剤で架橋する架橋凝集体を形成することや、多孔性ポリプロピレン担体などの固定化坦体にリパーゼを物理吸着させることをいう。リパーゼ触媒の固定化処理には、有機溶媒を沈殿剤として用いる。これにより、水溶液中で調製した固定化酵素に比べて、脂肪酸アルキルエステルの反応速度を向上させることができ、生産面で有利である。有機溶媒としては、アセトン、１，２−ジメトキシエタン、エタノールなどが挙げられる。また、固定化には、必要に応じてｐＨ緩衝液を使用しても良い。ｐＨ緩衝液としては、りん酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム水溶液などが挙げられる。   In the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention, immobilization means forming a cross-linked aggregate obtained by cross-linking lipase with a flocculant and a cross-linking agent such as glutaraldehyde, or an immobilized carrier such as a porous polypropylene carrier. This refers to the physical adsorption of lipase. An organic solvent is used as a precipitating agent for the immobilization treatment of the lipase catalyst. Thereby, compared with the immobilized enzyme prepared in the aqueous solution, the reaction rate of the fatty acid alkyl ester can be improved, which is advantageous in production. Examples of the organic solvent include acetone, 1,2-dimethoxyethane, ethanol and the like. Moreover, you may use a pH buffer solution for fixation as needed. Examples of the pH buffer include potassium dihydrogen phosphate / sodium hydroxide aqueous solution.

固定化処理において、架橋凝集体を形成する場合、添加剤としては、ジベンゾ−１８−クラウン−６（ＣＲ）などの大環状エーテル類， polyoxyethylene-p-isooctylphenol （Ｔｏｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などの非イオン系界面活性剤，ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン系界面活性剤などが用いられる。固定化処理において、物理吸着する場合、固定化坦体として多孔性ポリプロピレン担体Ａｃｃｕｒｅｌ ＭＰ１０００（ＭＥＭＢＲＡＮＡ製）が好適に用いられる。   In the case of forming a crosslinked aggregate in the immobilization treatment, additives include macrocyclic ethers such as dibenzo-18-crown-6 (CR), and non-ions such as polyoxyethylene-p-isooctylphenol (Toriton X-100). Anionic surfactants such as a surfactant and sodium dodecyl sulfate (SDS) are used. In the immobilization treatment, in the case of physical adsorption, a porous polypropylene carrier Accurel MP1000 (manufactured by MEMBRANA) is preferably used as the immobilization carrier.

本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法において、リパーゼとしては、アルカリジェネス種（Alcaligenes sp）起源のリパーゼを用いることが好ましい。アルカリジェネス種起源のリパーゼを固定化処理された固定化リパーゼを用いることにより、粉末のアルカリジェネス種起源のリパーゼに比べてエステル交換反応速度を向上させることができる。固定化されたアルカリジェネス種起源のリパーゼの使用量は、トリグリセリドを含む油脂１ミリモルに対して２５〜１００ｍｇ、好ましくは５０〜１００ｍｇである。   In the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention, it is preferable to use a lipase derived from Alcaligenes sp as the lipase. By using the immobilized lipase obtained by immobilizing the lipase derived from the alkaline gene species, the transesterification rate can be improved as compared with the lipase derived from the alkaline gene species. The amount of immobilized lipase derived from Alkali Genes species is 25 to 100 mg, preferably 50 to 100 mg, per 1 mmol of fats and oils containing triglycerides.

エステル交換反応の反応温度は、５〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは４０〜５０℃である。このように反応温度を低温で処理できるので、熱エネルギーコストを低減することができる。反応時間は、通常３〜１２０好ましくは２４〜７２時間である。反応は、無溶媒で行うことができるが、ノルマルヘキサンなどエステル交換反応を阻害しない有機溶媒中でも行うことができる。   The reaction temperature of the transesterification reaction is 5 to 60 ° C, preferably 25 to 50 ° C, particularly preferably 40 to 50 ° C. Thus, since the reaction temperature can be processed at a low temperature, the thermal energy cost can be reduced. The reaction time is usually 3 to 120, preferably 24 to 72 hours. The reaction can be performed without a solvent, but can also be performed in an organic solvent that does not inhibit the transesterification reaction, such as normal hexane.

本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法は、有機溶媒存在下で固定化処理されたリパーゼを用いることによって反応速度を向上させることができるので、製造コストを抑えることができる。また、本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法は、アルカリ触媒を使用していないため、使用した触媒の水洗い除去などを必要とせず、後処理が簡易である。   In the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention, the reaction rate can be improved by using a lipase immobilized in the presence of an organic solvent, so that the production cost can be suppressed. Further, since the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention does not use an alkali catalyst, it does not require removal of the used catalyst by washing with water, and post-treatment is simple.

本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法において製造される脂肪酸アルキルエステルは、脂肪酸アルキルエステルの他に、モノグリセリドやジグリセリド等のグリセリン誘導体（ＧＤｓ）を含む。これらの混合物は、高品質の石鹸や高級アルコールの原料など様々な用途として使用することができる。   The fatty acid alkyl ester produced in the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention contains glycerin derivatives (GDs) such as monoglyceride and diglyceride in addition to the fatty acid alkyl ester. These mixtures can be used for various purposes such as high-quality soaps and raw materials for higher alcohols.

なお、本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法において、原料であるトリグリセリドを含む油脂として、廃油等を用いる場合には、予めフィルタープレス等の既知の濾過機を用いて不純物を除去することが好ましい。この際、活性白土、珪藻土、ゼオライト、活性炭、酸性白土、ベントナイト、シリカ系吸着剤、シリカ−アルミナ化合物、炭酸カルシウム、骨灰、パーライト、セルロース、マグネシア、アルミナ、石膏等の既知の濾材を用いることもできる。この濾材の量は、廃油の種類や廃油中に含有される不純物の量等に応じて適宜設定することができる。   In addition, in the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention, when waste oil or the like is used as an oil containing a triglyceride as a raw material, it is preferable to remove impurities using a known filter such as a filter press in advance. . At this time, it is also possible to use known filter media such as activated clay, diatomaceous earth, zeolite, activated carbon, acidic clay, bentonite, silica-based adsorbent, silica-alumina compound, calcium carbonate, bone ash, perlite, cellulose, magnesia, alumina, gypsum and the like. it can. The amount of the filter medium can be appropriately set according to the type of waste oil, the amount of impurities contained in the waste oil, and the like.

本発明で使用される固定化リパーゼは、反応終了後に脂肪酸アルキルエステルから分離され、繰り返し使用することができる。   The immobilized lipase used in the present invention is separated from the fatty acid alkyl ester after completion of the reaction and can be used repeatedly.

［トリグリセリドを含む油脂］
次に、本発明に係る脂肪酸アルキルエステルの製造方法の実施例について説明する。本実施例に係る脂肪酸アルキルエステルにおいて、原料のトリグリセリド（ＴＧ）を含む油脂としては、米油（築野食品工業（株）製、比重：０．９１７ｍｌ／ｇ、ケン化価（分子量）：８９８）を用いた。米油の構成脂肪酸含有率を表１に示す。 [Oil containing triglyceride]
Next, examples of the method for producing a fatty acid alkyl ester according to the present invention will be described. In the fatty acid alkyl ester according to the present example, as fats and oils containing triglyceride (TG) as a raw material, rice oil (manufactured by Tsukino Food Industry Co., Ltd., specific gravity: 0.917 ml / g, saponification value (molecular weight): 898 ) Was used. Table 1 shows the constituent fatty acid content of rice oil.

［固定化リパーゼの調製］
［固定化リパーゼ１］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株））粉末を２５０ｍｇを２５ｍＬ遠心分離管に入れ、（ｐＨ ７、１００ ｍＭ）ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬを加え溶解させた。沈殿剤としてアセトン１５ｍＬを入れて、２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド水溶液（（株）関東化学）４００μＬを加えた。その混合物を４℃、１７ｈ、攪拌した。アセトン５ｍＬ加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。次いでデカントし、残査をアセトン２５ｍＬで洗浄して、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。この操作をあと２回繰り返して、乾燥させた。 [Preparation of immobilized lipase]
[Immobilized lipase 1]
250 mg of lipase (QLM lipase, Meika Sangyo Co., Ltd.) powder derived from an alkali genese species was placed in a 25 mL centrifuge tube, and 5 mL (pH 7, 100 mM) KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer was added and dissolved. As a precipitating agent, 15 mL of acetone was added, and 400 μL of 25% (W / V) glutaraldehyde aqueous solution (Kanto Chemical Co., Ltd.) was added. The mixture was stirred at 4 ° C. for 17 h. 5 mL of acetone was added and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. Then, it was decanted, and the residue was washed with 25 mL of acetone and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes. This operation was repeated twice more and dried.

［固定化リパーゼ２］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株））粉末を２５０ｍｇを２５ｍＬ遠心分離管に入れ、（ｐＨ ７、１００ ｍＭ）ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬを加え溶解させた。沈殿剤として１，２−ジメトキシエタン１５ｍＬを入れて、２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド水溶液（（株）関東化学）４００μＬを加えた。その混合物を４℃、１７ｈ、攪拌した。１，２−ジメトキシエタン５ｍＬ加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。次いでデカントし、残査を１，２−ジメトキシエタン２５ｍＬで洗浄して、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。この操作をあと２回繰り返して、アセトンで乾燥させた。 [Immobilized lipase 2]
250 mg of lipase (QLM lipase, Meika Sangyo Co., Ltd.) powder derived from an alkali genese species was placed in a 25 mL centrifuge tube, and 5 mL (pH 7, 100 mM) KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer was added and dissolved. As a precipitating agent, 15 mL of 1,2-dimethoxyethane was added, and 400 μL of 25% (W / V) glutaraldehyde aqueous solution (Kanto Chemical Co., Ltd.) was added. The mixture was stirred at 4 ° C. for 17 h. 1,5-Dimethoxyethane (5 mL) was added, and the mixture was centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. Then, it was decanted, and the residue was washed with 25 mL of 1,2-dimethoxyethane and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. This operation was repeated twice more and dried with acetone.

［固定化リパーゼ３］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株））粉末を２５０ｍｇを２５ｍＬ遠心分離管に入れ、（ｐＨ ７、１００ ｍＭ）ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬを加え溶解させた。添加剤としてジベンゾ−１８−クラウン−６（ＣＲ）（日本曹達（株））１１．５ｍｇを加え、さらに沈殿剤として１，２−ジメトキシエタン１５ｍＬを入れて、２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド水溶液（（株）関東化学）４００μＬを加えた。その混合物を４℃、１７ｈ、攪拌した。１，２−ジメトキシエタン５ｍＬ加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。次いでデカントし、残査を１，２−ジメトキシエタン２５ｍＬで洗浄して、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。この操作をあと２回繰り返して、アセトンで乾燥させた。 [Immobilized lipase 3]
250 mg of lipase (QLM lipase, Meika Sangyo Co., Ltd.) powder derived from an alkali genese species was placed in a 25 mL centrifuge tube, and 5 mL (pH 7, 100 mM) KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer was added and dissolved. Add 11.5 mg of dibenzo-18-crown-6 (CR) (Nippon Soda Co., Ltd.) as an additive, add 15 mL of 1,2-dimethoxyethane as a precipitating agent, and add 25% (W / V) glutaraldehyde 400 μL of an aqueous solution (Kanto Chemical Co., Inc.) was added. The mixture was stirred at 4 ° C. for 17 h. 1,5-Dimethoxyethane (5 mL) was added, and the mixture was centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. Then, it was decanted, and the residue was washed with 25 mL of 1,2-dimethoxyethane and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. This operation was repeated twice more and dried with acetone.

［固定化リパーゼ４］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株））粉末を２５０ｍｇを２５ｍＬ遠心分離管に入れ、（ｐＨ ７、１００ ｍＭ）ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬを加え溶解させた。沈殿剤として固体の硫酸アンモニウム２．７５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒの５５％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム溶液５ｍＬ、２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド水溶液（（株）関東化学）４００μＬを加えた。その混合物を４℃、１７ｈ、攪拌した。水１５ｍＬ加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。次いでデカントし、残査を水２５ｍＬで洗浄して、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。この操作をあと２回繰り返して、アセトンで乾燥させた。 [Immobilized lipase 4]
250 mg of lipase (QLM lipase, Meika Sangyo Co., Ltd.) powder derived from an alkali genese species was placed in a 25 mL centrifuge tube, and 5 mL (pH 7, 100 mM) KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer was added and dissolved. As a precipitating agent, 2.75 g of solid ammonium sulfate, 5 mL of 55% (W / V) ammonium sulfate solution of KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer, and 400 μL of 25% (W / V) aqueous glutaraldehyde solution (Kanto Chemical Co., Ltd.) were added. . The mixture was stirred at 4 ° C. for 17 h. 15 mL of water was added and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. Then, it was decanted, and the residue was washed with 25 mL of water and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. This operation was repeated twice more and dried with acetone.

［固定化リパーゼ５］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株））粉末を２５０ｍｇを２５ｍＬ遠心分離管に入れ、添加剤としてＳＤＳ（東京化成工業（株））１２５ｍｇ 溶かした（ｐＨ ７、１００ ｍＭ）ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬを加え溶解させた。ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒの５５％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム溶液５ｍＬ、２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド水溶液（（株）関東化学）４００μＬを加えた。その混合物を４℃、１７ｈ、攪拌した。水１５ｍＬ加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。次いでデカントし、残査を水２５ｍＬで洗浄して１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。この操作をあと２回繰り返して、アセトンで乾燥させた。 [Immobilized lipase 5]
250 mg of lipase derived from Alkali Genes species (QLM lipase, Meika Sangyo Co., Ltd.) powder was placed in a 25 mL centrifuge tube, and 125 mg of SDS (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was dissolved as an additive (pH 7, 100 mM). 5 mL of KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer was added and dissolved. 5 mL of a 55% (W / V) ammonium sulfate solution of KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer and 400 μL of a 25% (W / V) aqueous glutaraldehyde solution (Kanto Chemical Co., Ltd.) were added. The mixture was stirred at 4 ° C. for 17 h. 15 mL of water was added and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. Subsequently, it was decanted and the residue was washed with 25 mL of water and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. This operation was repeated twice more and dried with acetone.

［固定化リパーゼ６］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株））粉末を２５０ｍｇを２５ｍＬ遠心分離管に入れ、添加剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ， Ｉｎｃ．）１１７μＬ溶かした（ｐＨ ７、１００ ｍＭ）ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬを加え溶解させた。ＫＨ_２ＰＯ_４／ＮａＯＨ Ｂｕｆｆｅｒの５５％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム溶液５ｍＬ、２５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド水溶液（（株）関東化学）４００μＬを加えた。その混合物を４℃、１７ｈ、攪拌した。水１５ｍＬ加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。次いでデカントし、残査を水２５ｍＬで洗浄して１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ遠心分離した。この操作をあと２回繰り返して、アセトンで乾燥させた。 [Immobilized lipase 6]
250 mg of lipase (QLM lipase, Meito Sangyo Co., Ltd.) powder derived from an alkali genese species was placed in a 25 mL centrifuge tube, and 117 μL of Triton X-100 (SIGMA ALDRICH, Inc.) was dissolved as an additive (pH 7, 100). (mM) 5 mL of KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer was added and dissolved. 5 mL of a 55% (W / V) ammonium sulfate solution of KH ₂ PO ₄ / NaOH Buffer and 400 μL of a 25% (W / V) aqueous glutaraldehyde solution (Kanto Chemical Co., Ltd.) were added. The mixture was stirred at 4 ° C. for 17 h. 15 mL of water was added and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. Subsequently, it was decanted and the residue was washed with 25 mL of water and centrifuged at 12,000 rpm, 4 ° C., 5 min. This operation was repeated twice more and dried with acetone.

［固定化リパーゼ７］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株）製）粉末を１ｇ、２０ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファーに溶解させた。Ａｃｃｕｒｅｌ（ＭＥＭＢＲＡＮＡ製）１ｇを３ｍＬ脱水エタノールで湿らした。リパーゼ溶液をＡｃｃｕｒｅｌに加え、室温で一晩中振とうさせた。水で数回洗浄しろ過した。次いで、アセトンで洗浄した。脱水エタノールの調製方法は次のとおりである。５００ｍＬ丸底フラスコに５ｇのマグネシウムを入れ、脱水エタノールを６０ｍＬ加えた。マントルヒーターで加熱すると反応が進みケークが出来た。ケークが出来たら、市販のエタノール４００ｍＬを加え還流する。２４ｈ後、蒸留した。 [Immobilized lipase 7]
Lipase (QLM lipase, manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) powder derived from Alkali Genes species was dissolved in 1 g, 20 mL of 0.1 M phosphate buffer. 1 g of Accurel (manufactured by MEMBRANA) was moistened with 3 mL of dehydrated ethanol. The lipase solution was added to Accurel and shaken overnight at room temperature. Washed several times with water and filtered. It was then washed with acetone. The method for preparing dehydrated ethanol is as follows. 5 g of magnesium was placed in a 500 mL round bottom flask, and 60 mL of dehydrated ethanol was added. When heated with a mantle heater, the reaction progressed and a cake was made. When cake is made, add 400 mL of commercially available ethanol and reflux. After 24 hours, it was distilled.

［脂肪酸アルキルエステルの測定法］
反応後の脂肪酸アルキルエステルの含有率は、イアトロスキャン（ＴＬＣ−ＦＩＤ）（（株）三菱化学ヤトロンＭＫ−５型）によるシンクロマトグラフィーにより測定した。測定条件を表２に示す。尚、クロマロッドはＳIIIシリカゲル焼結薄層棒、細孔径は６０オングストローム、粒度は５μｍである。 [Measurement method of fatty acid alkyl ester]
The content of the fatty acid alkyl ester after the reaction was measured by synchromatography using Iatroscan (TLC-FID) (Mitsubishi Chemical Yatron MK-5). Table 2 shows the measurement conditions. The chroma rod is an SIII silica gel sintered thin layer rod, the pore diameter is 60 Å, and the particle size is 5 μm.

脂肪酸メチルエステルの収率は、ステアリン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノレン酸メチルおよびリノール酸メチルの合計量とした。ステアリン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノレン酸メチルおよびリノール酸メチルのピークの保持時間は、標準品で決定した（ステアリン酸メチル，パルミチン酸メチル：０．０７〜０．１３０ｍｉｎ、オレイン酸メチル，リノレン酸メチル，リノール酸メチル：０．１５０〜０．２５０ｍｉｎ）。   The yield of fatty acid methyl ester was the total amount of methyl stearate, methyl palmitate, methyl oleate, methyl linolenate and methyl linoleate. Retention times of peaks of methyl stearate, methyl palmitate, methyl oleate, methyl linolenate, and methyl linoleate were determined by standard products (methyl stearate, methyl palmitate: 0.07 to 0.130 min, oleic acid Methyl, methyl linolenate, methyl linoleate: 0.150 to 0.250 min).

［参考例１］リパーゼの供給量の検討
リパーゼの供給量を変えてエステル交換反応を実施した。ねじ蓋付き試験管（１５ｍＬ）に、アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株））粉末を５０、１００，１５０、２００ｍｇ、米油２ｍＬ（２．０ｍｍｏｌ）、ジメチルカーボネート（宇部興産（株）製、以下「ＤＭＣ」と略す）３ｍＬ（３５．７ｍｍｏｌ）を加え、よく攪拌した。５０℃の恒温振とう器（アズワン（株）ＳＩ−３００型）に設置し、反応を開始させた。１２０時間後に、反応液を３０μＬサンプリングし、遠心分離機（久保田製作所（株）、ＫＵＢＯＴＡ１１３０）で遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）、上澄み液をデカンテーションして反応液を得た。その後、ヘキサン４ｍＬ、水５ｍＬを加え、良く振り混ぜて抽出洗浄した。有機相に無水硫酸ナトリウムを加え、混入した水分を取り除いた。空焼きが終わったクロマロッドにマイクロシリンジを用いて試料をスポッティングした（８〜１０滴）。展開槽に展開溶媒（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝９７：３：０．５）７０ｍＬを注ぎ、蒸気を展開槽に充満させた後に、スポッティングしたクロマロッドを漬けた（２０〜２５ｍｉｎ）。クロマロッドを展開溶媒から引き上げ、ロッドドライヤー（ダイアヤトロン（株）、ＴＫ−８）を使って１２０℃、５ｍｉｎで溶媒を除去した。イアトロスキャンによるシンクロマトグラフィーにより脂肪酸メチルエステル（以下「ＦＡＭＥ」と略す）の転化率と収率を求めた。アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株）製）粉末が５０、１００、１５０、２００ｍｇにおけるＦＡＭＥの収率は、それぞれ３７．２、８３．３、８４．５、８８．８％であった。尚、ＤＭＣに基質阻害は認められなかった。 [Reference Example 1] Examination of supply amount of lipase The transesterification reaction was carried out by changing the supply amount of lipase. In a test tube with a screw cap (15 mL), 50, 100, 150, 200 mg of lipase (QLM lipase, Meito Sangyo Co., Ltd.) powder derived from Alkali Genes species, 2 mL (2.0 mmol) of rice oil, dimethyl carbonate (Ube) 3 mL (35.7 mmol) manufactured by Kosan Co., Ltd. (hereinafter abbreviated as “DMC”) was added and stirred well. The reaction was started by installing in a 50 ° C. constant temperature shaker (AS-One SI-300 type). 120 hours later, 30 μL of the reaction solution was sampled, centrifuged with a centrifuge (Kubota Manufacturing Co., Ltd., KUBOTA 1130) (12000 rpm, 5 min), and the supernatant was decanted to obtain a reaction solution. Thereafter, 4 mL of hexane and 5 mL of water were added, and the mixture was well shaken and extracted and washed. Anhydrous sodium sulfate was added to the organic phase to remove mixed water. A sample was spotted (8 to 10 drops) using a microsyringe on the chroma rod after baking. 70 mL of developing solvent (hexane: diethyl ether: acetic acid = 97: 3: 0.5) was poured into the developing tank to fill the developing tank with steam, and then spotted chroma rods were immersed (20-25 min). The chroma rod was lifted from the developing solvent, and the solvent was removed at 120 ° C. for 5 min using a rod dryer (Diatron, TK-8). The conversion rate and yield of fatty acid methyl ester (hereinafter abbreviated as “FAME”) were determined by thin chromatography using Iatroscan. The yields of FAME in 50, 100, 150, and 200 mg of lipase (QLM lipase, manufactured by Meisei Sangyo Co., Ltd.) derived from Alkali Genes species are 37.2, 83.3, 84.5, and 88.8, respectively. %Met. In addition, substrate inhibition was not recognized by DMC.

［参考例２］アルキルカーボネートの供給量の検討
参考例１において、アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株）製）粉末を２００ｍｇし、米油２mLに対するＤＭＣの供給量を，溶媒あり（ＤＭＣ／ヘキサン）の場合０．１２５ｍＬ／２．８７５ｍＬ、０．２５ｍＬ／２．７５ｍＬ、０．５ｍＬ／２．５ｍＬ、１ｍＬ／２ｍＬ、２ｍＬ／１ｍＬ、あるいは溶媒なし（ＤＭＣのみ）の場合１，２，３ｍＬのように変化させた以外は、参考例１と同様な条件でエステル交換反応を行った。その結果、ＤＭＣの供給量を溶媒あり（ＤＭＣ／ヘキサン）の場合０．１２５ｍＬ／２．８７５ｍＬ、０．２５ｍＬ／２．７５ｍＬ、０．５ｍＬ／２．５ｍＬ、１ｍＬ／２ｍＬ、２ｍＬ／１ｍＬ、あるいは溶媒なし（ＤＭＣのみ）の場合１，２、３ｍＬにおけるＦＡＭＥの収率は、それぞれ２７．２、４５．９、７０．４、８１．１、８７．１、８６．０、８６．３、８８．８％であった。 [Reference Example 2] Examination of Alkyl Carbonate Supply Amount In Reference Example 1, 200 mg of Alkali Genes species-derived lipase (QLM lipase, manufactured by Meisei Sangyo Co., Ltd.) powder, and the amount of DMC supplied to 2 mL of rice oil, With solvent (DMC / hexane) 0.125mL / 2.875mL, 0.25mL / 2.75mL, 0.5mL / 2.5mL, 1mL / 2mL, 2mL / 1mL, or without solvent (DMC only) The transesterification reaction was carried out under the same conditions as in Reference Example 1 except that the amount was changed to 1, 2, 3 mL. As a result, when the amount of DMC supplied is with solvent (DMC / hexane), 0.125 mL / 2.875 mL, 0.25 mL / 2.75 mL, 0.5 mL / 2.5 mL, 1 mL / 2 mL, 2 mL / 1 mL, or In the case of no solvent (DMC only), the yields of FAME in 1, 2, 3 mL were 27.2, 45.9, 70.4, 81.1, 87.1, 86.0, 86.3, 88, respectively. 8%.

［実施例１］
ねじ蓋付き試験管（１５ｍＬ）に、上記で得た固定化リパーゼ１を２００ｍｇ、米油２ｍＬ（２．0ｍｍｏｌ）、ＤＭＣ３ｍＬ（３５．７ｍｍｏｌ）を加え、よく攪拌した。５０℃の恒温振とう器（アズワン（株）ＳＩ−３００型）に設置し、反応を開始させた。２４、４８、７２、９６、１２０時間後に、反応液を３０μＬサンプリングし、遠心分離機（久保田製作所（株）、ＫＵＢＯＴＡ１１３０）で遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）、上澄み液をデカンテーションして反応液を得た。その後、ヘキサン４ｍＬ、水５ｍＬを加え、良く振り混ぜて抽出洗浄した。有機相に無水硫酸ナトリウムを加え、混入した水分を取り除いた。空焼きが終わったクロマロッドにマイクロシリンジを用いて試料をスポッティングした（８〜１０滴）。展開槽に展開溶媒（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝９７：３：０．５）７０ｍＬを注ぎ、蒸気を展開槽に充満させた後に、スポッティングしたクロマロッドを漬けた（２０〜２５ｍｉｎ）。クロマロッドを展開溶媒から引き上げ、ロッドドライヤー（ダイアヤトロン(株)、TK−８）を使って１２０℃、５ｍｉｎで溶媒を除去した。イアトロスキャンによるシンクロマトグラフィーによりＦＡＭＥの転化率と収率を求めた。その結果を表３に示す。ここで、表３中、ＧＤｓはモノグリセリド、ジグリセリド、グリセリンカーボネートなどのグリセリン誘導体を示す。ここで、図１として反応途中のイアトロスキャンによるシンクロマトグラフィーのチャートを示す。ここでは、保持時間が０．０２〜０．３０分をＦＡＭＥ、０．３１〜０．３６分をトリグリセリド、０．３７〜０．５ｍｉｎ程度のピークをＧＤｓとしている。 [Example 1]
To a test tube with a screw cap (15 mL), 200 mg of the immobilized lipase 1 obtained above, 2 mL of rice oil (2.0 mmol), and 3 mL of DMC (35.7 mmol) were added and stirred well. The reaction was started by installing in a 50 ° C. constant temperature shaker (AS-One SI-300 type). After 24, 48, 72, 96, and 120 hours, 30 μL of the reaction solution was sampled, centrifuged with a centrifuge (Kubota Manufacturing Co., Ltd., KUBOTA 1130) (12000 rpm, 5 min), the supernatant was decanted and the reaction solution was decanted Got. Thereafter, 4 mL of hexane and 5 mL of water were added, and the mixture was well shaken and extracted and washed. Anhydrous sodium sulfate was added to the organic phase to remove mixed water. A sample was spotted (8 to 10 drops) using a microsyringe on the chroma rod after baking. 70 mL of developing solvent (hexane: diethyl ether: acetic acid = 97: 3: 0.5) was poured into the developing tank to fill the developing tank with steam, and then spotted chroma rods were immersed (20-25 min). The chroma rod was pulled up from the developing solvent, and the solvent was removed at 120 ° C. for 5 min using a rod dryer (Diatron, TK-8). The conversion rate and yield of FAME were determined by thin chromatography using Iatroscan. The results are shown in Table 3. Here, in Table 3, GDs represents glycerin derivatives such as monoglyceride, diglyceride, and glycerin carbonate. Here, FIG. 1 shows a chart of thin chromatography by iatroscan during the reaction. Here, a retention time of 0.02 to 0.30 minutes is FAME, 0.31 to 0.36 minutes is triglyceride, and a peak of about 0.37 to 0.5 min is GDs.

［実施例２および実施例３］
固定化リパーゼ１を固定化リパーゼ２および３に変更した以外は、実施例１と同様な条件でエステル交換反応を行った。その結果を表３に示す。 [Example 2 and Example 3]
A transesterification reaction was carried out under the same conditions as in Example 1 except that the immobilized lipase 1 was changed to the immobilized lipases 2 and 3. The results are shown in Table 3.

［比較例１乃至３］
固定化リパーゼ１を固定化リパーゼ４乃至６に変更した以外は、実施例１と同様な条件でエステル交換反応を行った。その結果を表３に示す。この結果、有機溶媒存在下で固定化処理されたリパーゼのほうが水溶液中で固定化処理されたものに比べてエステル交換反応の速度が向上することが明らかとなった。 [Comparative Examples 1 to 3]
A transesterification reaction was carried out under the same conditions as in Example 1 except that the immobilized lipase 1 was changed to the immobilized lipases 4 to 6. The results are shown in Table 3. As a result, it has been clarified that the lipase immobilized in the presence of an organic solvent has a higher transesterification rate than the lipase immobilized in an aqueous solution.

［実施例４］
固定化リパーゼ１を固定化リパーゼ７に、固定化リパーゼ７の供給量を５００ｍｇに変更した以外は実施例１と同様な条件でエステル交換反応を行った。その結果を表３に示す。実施例４においては、実施例１乃至３と比較して格段にエステル交換反応の速度が向上することが明らかとなった。 [Example 4]
Transesterification was performed under the same conditions as in Example 1 except that the immobilized lipase 1 was changed to the immobilized lipase 7 and the supply amount of the immobilized lipase 7 was changed to 500 mg. The results are shown in Table 3. In Example 4, it was revealed that the transesterification rate was significantly improved as compared with Examples 1 to 3.

［参考例３］
アルカリジェネス種起源のリパーゼ（ＱＬＭリパーゼ，名糖産業（株）製）粉末を固定化処理することなく、そのままエステル交換反応に用いた以外は、実施例１と同様な条件でエステル交換反応を行った。その結果を表３に示す。この結果、リパーゼを固定化処理した実施例１乃至４のほうが反応速度が向上することが明らかとなった。 [Reference Example 3]
The transesterification reaction was carried out under the same conditions as in Example 1 except that the lipase derived from Alkali Genes species (QLM lipase, manufactured by Meisei Sangyo Co., Ltd.) was used for the transesterification reaction as it was without immobilization. It was. The results are shown in Table 3. As a result, it became clear that the reaction rates of Examples 1 to 4 in which lipase was immobilized were improved.

本発明における反応途中のイアトロスキャンによるシンクロマトグラフィーのチャートである。It is a chart of the thin chromatography by the iatroscan in the middle of reaction in this invention.

Claims (2)

トリグリセリドを含む油脂とアルキルカーボネートをリパーゼ存在下において反応させて脂肪酸アルキルエステルを製造する方法であって、前記リパーゼは、有機溶媒存在下で固定化処理された固定化リパーゼであることを特徴とする脂肪酸アルキルエステルの製造方法。   A method for producing a fatty acid alkyl ester by reacting an oil and fat containing triglyceride with an alkyl carbonate in the presence of a lipase, wherein the lipase is an immobilized lipase that has been immobilized in the presence of an organic solvent. A method for producing a fatty acid alkyl ester. 前記リパーゼは、アルカリジェネス種起源のリパーゼである請求項１記載の脂肪酸アルキルエステルの製造方法。   The method for producing a fatty acid alkyl ester according to claim 1, wherein the lipase is a lipase derived from an alkali genese species.

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