JP2009210392A - Chip - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、チップに関し、特に、微生物を検出するチップに関する。 The present invention relates to a chip, and more particularly to a chip for detecting microorganisms.
マイクロ流体チップに関する技術として、特許文献１に記載のものがある。同文献に記載のマイクロ流体チップにおいては、マイクロチャンネル底面に１０種類の生体分子（抗体）がチャンネル延在方向に沿って固定化された構成が示されている。
ところが、上記特許文献１に記載のチップを用いて試料中の成分を検出しようとすると、以下の点で改善の余地があった。
まず、特許文献１のチップにおいては、基板面に水平な一方向に延在する流路中を試料が流れ、試料中の成分を流路の底部に固定化されている抗体により捕捉する構造となっている。このため、試料中の成分の抗体への衝突確率が低いことがあった。これにより、検出対象の成分が抗体に接触せずおよび捕捉されずに検出部を素通りしてしまい、捕捉効率が充分でない場合があった。
However, when trying to detect a component in a sample using the chip described in Patent Document 1, there is room for improvement in the following points.
First, the chip of Patent Document 1 has a structure in which a sample flows in a flow channel extending in one direction horizontal to the substrate surface, and components in the sample are captured by an antibody immobilized on the bottom of the flow channel. It has become. For this reason, the collision probability of the components in the sample to the antibody may be low. Thereby, the component to be detected does not come into contact with the antibody and is not captured, but passes through the detection unit, and the capture efficiency may not be sufficient.
また、上記捕捉効率を高めるために、試料の流速を低下させると、時間あたりの流量が低下することになるため、試料の処理速度が遅くなってしまう。 Further, if the flow rate of the sample is reduced in order to increase the capture efficiency, the flow rate per hour will be reduced, and the sample processing speed will be reduced.
本発明によれば、
基板に、試料中の成分を検出する検出部が設けられたチップであって、
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記成分を捕捉する捕捉部と、
前記捕捉部から上方に向かって設けられ、前記試料が導入される流入路と、
前記捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに前記流入路より幅狭に設けられ、前記試料が排出される複数の排出路と、
を含み、
前記捕捉部に前記成分を捕捉する捕捉物質が設けられた、チップが提供される。
According to the present invention,
A chip provided with a detection unit for detecting a component in a sample on a substrate,
The detection unit is
A capturing unit provided on the substrate for capturing the component;
An inflow path that is provided upward from the capture unit and into which the sample is introduced;
A plurality of discharge passages extending from the capturing portion in different directions within the substrate surface and narrower than the inflow passage, and for discharging the sample;
Including
A chip is provided in which a capturing substance that captures the component is provided in the capturing part.
本発明においては、試料が導入される流入路が捕捉部から上方に向かって配置されている。このため、検出対象の成分を含んだ試料が抗体等の固定化物質に対して検出部の上方から下向きに流れ込むことにより、捕捉部への成分の衝突確率を高めることができる。
また、流入路を捕捉部から上方に向かって配置するとともに、排出路を基板面方向に延在させた構成となっているため、試料が捕捉部の上方からチップに流入した試料が、捕捉部にて試料の流向を基板面方向に変更することになる。このため、試料中の成分と捕捉物質の接触率を高めることができるため、捕捉物質による成分の捕捉率を向上することができる。
In the present invention, the inflow path through which the sample is introduced is arranged upward from the capturing part. For this reason, the sample containing the component to be detected flows downward from above the detection unit into the immobilized substance such as an antibody, whereby the collision probability of the component to the capture unit can be increased.
In addition, since the inflow path is arranged upward from the capture unit and the discharge path extends in the substrate surface direction, the sample that has flowed into the chip from above the capture unit is captured by the capture unit. Thus, the flow direction of the sample is changed to the substrate surface direction. For this reason, since the contact rate of the component in a sample and a capture substance can be raised, the capture rate of the component by a capture substance can be improved.
また、試料が捕捉部の上方から捕捉部に向かって流れ込む構成においては、捕捉部に導入された試料を効率よく捕捉部外に排出することが、試料の処理速度の向上の観点で重要となる。そこで、本発明においては、導入より幅狭の複数の排水路を基板面の異なる方向に配置している。これにより、流出路の抵抗を相対的に高め、捕捉部付近での試料の流速を相対的に遅くすることができる。よって、検体の捕捉率を向上することができる。また、複数の排出路により試料の排出流量を大きくすることができるため、処理速度を高めることができる。 Moreover, in the configuration in which the sample flows from the upper side of the capturing unit toward the capturing unit, it is important from the viewpoint of improving the processing speed of the sample that the sample introduced into the capturing unit is efficiently discharged out of the capturing unit. . Therefore, in the present invention, a plurality of drainage channels narrower than the introduction are arranged in different directions on the substrate surface. Thereby, the resistance of the outflow path can be relatively increased, and the flow rate of the sample in the vicinity of the capturing part can be relatively slowed. Therefore, the capture rate of the specimen can be improved. Further, since the discharge flow rate of the sample can be increased by the plurality of discharge paths, the processing speed can be increased.
なお、これらの各構成の任意の組み合わせや、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた本発明の態様として有効である。 It should be noted that any combination of these components, or a conversion of the expression of the present invention between methods, apparatuses, and the like is also effective as an aspect of the present invention.
たとえば、本発明によれば、前記本発明におけるチップを用いた検出方法が提供される。 For example, according to the present invention, a detection method using the chip according to the present invention is provided.
以上説明したように本発明によれば、試料中の成分を簡便で迅速に検出することができる。 As described above, according to the present invention, components in a sample can be detected simply and quickly.
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には共通の符号を付し、適宜説明を省略する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. In all the drawings, similar constituent elements are denoted by common reference numerals, and description thereof is omitted as appropriate.
（第一の実施形態）
図１は、本実施形態のチップの構成を示す平面図である。図２は、図１のチップ１００の検出部１１０を拡大して示す平面図である。図３（ａ）は、図１のチップ１００の検出部１１０の捕捉部周辺の構成を示す平面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ'断面図である。
(First embodiment)
FIG. 1 is a plan view showing the configuration of the chip of this embodiment. FIG. 2 is an enlarged plan view showing the detection unit 110 of the chip 100 of FIG. 3A is a plan view showing a configuration around the capturing unit of the detection unit 110 of the chip 100 of FIG. 1, and FIG. 3B is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG.
図１〜３に示したチップ１００は、基板（接合基板１０１の基板１４１）に、試料中の成分を検出する検出部１１０が設けられたチップである。
本実施形態において、接合基板１０１は、基板１４１（図３（ｂ））上に上板１３５（図７）を接合したものである。また、図１においては、１つの接合基板１０１に複数の検出部１１０が一列に配置されている。
検出部１１０は、捕捉部１０５、流入路１０３、および複数の排出路１０７を含む。
The chip 100 illustrated in FIGS. 1 to 3 is a chip in which a detection unit 110 that detects a component in a sample is provided on a substrate (the substrate 141 of the bonding substrate 101).
In the present embodiment, the bonded substrate 101 is obtained by bonding the upper plate 135 (FIG. 7) to the substrate 141 (FIG. 3B). In FIG. 1, a plurality of detection units 110 are arranged in a row on one bonded substrate 101.
The detection unit 110 includes a capturing unit 105, an inflow path 103, and a plurality of discharge paths 107.
捕捉部１０５は、接合基板１０１中の基板１４１に設けられ、検出対象の成分（検体）を捕捉する。捕捉部１０５は液溜状に形成されており、液溜の底部に、検出対象の成分を捕捉する捕捉物質が固定化されている。検出対象成分はたとえば微生物であり、このとき捕捉物質としてたとえば当該微生物に対する親和性を有する抗体が用いられる。
図１に示したチップ１００においては、捕捉部１０５の平面形状が矩形である。捕捉部１０５の大きさは、たとえば矩形の縦、横を１０〜５０００μｍ、高さを１０〜１０００μｍとする。
The capturing unit 105 is provided on the substrate 141 in the bonded substrate 101 and captures a component (specimen) to be detected. The capturing unit 105 is formed in a liquid reservoir shape, and a capturing substance that captures a component to be detected is fixed to the bottom of the liquid reservoir. The component to be detected is, for example, a microorganism. At this time, for example, an antibody having affinity for the microorganism is used as a capture substance.
In the chip 100 illustrated in FIG. 1, the planar shape of the capturing unit 105 is a rectangle. The size of the capturing unit 105 is, for example, 10 to 5000 μm in the vertical and horizontal directions and 10 to 1000 μm in height.
流入路１０３は、捕捉部１０５から上方（鉛直上方）に向かって設けられている。流入路１０３から検出部１１０に試料が導入される。図３において、流入路１０３の直径は、たとえば１０〜３０００μｍとする。 The inflow path 103 is provided upward (vertically upward) from the capturing unit 105. A sample is introduced from the inflow path 103 into the detection unit 110. In FIG. 3, the diameter of the inflow channel 103 is, for example, 10 to 3000 μm.
複数の排出路１０７は、捕捉部１０５から基板面内の異なる方向に互いに延在している。複数の排出路１０７は、捕捉部１０５から基板面内に放射状に延びている。図１に示したチップ１００では、捕捉部１０５の矩形の各辺に複数の排出路１０７が設けられている。同じ辺に設けられた排出路１０７は、当該辺に直交して互いに平行に延びている。また、同じ辺に設けられた排出路１０７は等間隔で設けられている。 The plurality of discharge paths 107 extend from the capturing unit 105 in different directions within the substrate surface. The plurality of discharge paths 107 extend radially from the capturing unit 105 into the substrate surface. In the chip 100 shown in FIG. 1, a plurality of discharge paths 107 are provided on each rectangular side of the capturing unit 105. The discharge passages 107 provided on the same side extend in parallel to each other perpendicular to the side. Further, the discharge passages 107 provided on the same side are provided at equal intervals.
また、排出路１０７は流入路１０３より幅狭に設けられている。排出路１０７は、たとえば流路幅１〜５００μｍ程度、流路高（深さ）１〜５００μｍ程度に形成される。捕捉部１０５に導入された試料は排出路１０７から捕捉部外部に排出される。排出路１０７は、基板１４１と上板１３５との間に形成されている。 Further, the discharge passage 107 is provided narrower than the inflow passage 103. The discharge path 107 is formed, for example, with a channel width of about 1 to 500 μm and a channel height (depth) of about 1 to 500 μm. The sample introduced into the capture unit 105 is discharged from the discharge path 107 to the outside of the capture unit. The discharge path 107 is formed between the substrate 141 and the upper plate 135.
また、検出部１１０は、接続流路１０９、環状流路１１１および廃液溜１１３をさらに含む。
環状流路１１１は、捕捉部１０５の外側に捕捉部１０５の周囲を取り囲んで設けられた環状の流路である。図１に示したチップ１００においては、捕捉部１０５の平面形状に対応して、環状流路１１１も矩形の環状となっている。環状流路１１１は、たとえば基板１４１と上板１３５との間隙として形成される。
排出路１０７は、一端で捕捉部１０５に連通し、他端で環状流路１１１に連通している。
The detection unit 110 further includes a connection channel 109, an annular channel 111 and a waste liquid reservoir 113.
The annular channel 111 is an annular channel provided outside the capturing unit 105 so as to surround the capturing unit 105. In the chip 100 shown in FIG. 1, the annular flow path 111 has a rectangular annular shape corresponding to the planar shape of the capturing unit 105. The annular channel 111 is formed as a gap between the substrate 141 and the upper plate 135, for example.
The discharge path 107 communicates with the capturing part 105 at one end and communicates with the annular flow path 111 at the other end.
また、環状流路１１１は、接続流路１０９を介して廃液溜１１３に連通している。流入路１０３から検出部１１０に導入された液体は、捕捉部１０５、排出路１０７、環状流路１１１および接続流路１０９をこの順に経由して廃液溜１１３に排出される。 The annular flow path 111 communicates with the waste liquid reservoir 113 through the connection flow path 109. The liquid introduced into the detection unit 110 from the inflow path 103 is discharged to the waste liquid reservoir 113 through the capturing section 105, the discharge path 107, the annular flow path 111, and the connection flow path 109 in this order.
次に、図４〜図７を参照して、図１に示したチップの製造方法を説明する。本実施形態では、上板１３５としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコンエラストマーを用い、ＰＤＭＳ加工用のモールド材料として、シリコンモールドを用いる方法を例示する。 Next, a manufacturing method of the chip shown in FIG. 1 will be described with reference to FIGS. In the present embodiment, a method is exemplified in which a silicon elastomer such as polydimethylsiloxane (PDMS) is used as the upper plate 135 and a silicon mold is used as a mold material for PDMS processing.
この方法は、以下の工程を含む。
第一工程：マイクロ流路チップ用シリコンモールドの作成
第二工程：ＰＤＭＳ製マイクロ流路チップ（接合基板１０１）の作成
第三工程：抗体の固相化
以下、各工程を順に説明する。
This method includes the following steps.
First step: preparation of silicon mold for microchannel chip Second process: preparation of PDMS microchannel chip (bonding substrate 101) Third process: antibody solid phase Hereinafter, each step will be described in order.
（第一工程）
第一工程では、光リソグラフィー技術を用いて、上板１３５を形成するためのモールドを準備する。モールドは、シリコンウェーハ上にフォトレジストをパターニングすることにより形成される。また、レジスト材をそのまま流路用モールドとして使用する場合と、耐久性を向上させるため、その後エッチングの工程を行いシリコンそのものに加工を施しモールドとする場合がある。
(First step)
In the first step, a mold for forming the upper plate 135 is prepared using an optical lithography technique. The mold is formed by patterning a photoresist on a silicon wafer. Further, there are a case where the resist material is used as it is as a mold for a flow path, and a case where an etching process is subsequently performed to form silicon by processing the silicon itself in order to improve durability.
図４（ａ）〜図４（ｄ）は、シリコンモールドの製造工程を示す断面図である。
まず、図４（ａ）に示したように、シリコンウェーハ１１５上に、スピンコート法によりフォトレジスト１１７を塗布する。フォトレジスト１１７の材料は上板１３５の材料等に応じて選択されるが、たとえばＳＵ−８（SU-8 2000 MicroChem社製）等を用いる。
FIG. 4A to FIG. 4D are cross-sectional views showing the manufacturing process of the silicon mold.
First, as shown in FIG. 4A, a photoresist 117 is applied on the silicon wafer 115 by spin coating. The material of the photoresist 117 is selected according to the material of the upper plate 135 and the like. For example, SU-8 (manufactured by SU-8 2000 MicroChem) is used.
次に、コンタクトリソグラフィーを用いて、フォトレジスト１１７上にマイクロ流路のパターンを描画したフォトマスク１１９を配置し、チップ１００のマイクロ流路デザインをフォトレジスト１１７に露光・転写する（図４（ｂ））。そして、現像により、シリコンウェーハ１１５上の所定の位置に選択的にフォトレジスト１１７を残す（図４（ｃ））。そして、フォトレジストが残ったままのシリコン基板をモールドとして用いる。ただし、フォトレジストは強度的に脆弱な場合があるため、強度が必用な場合は、その後、フォトレジスト１１７をマスクとしてシリコンウェーハ１１５をエッチングし、シリコンモールド１２１を得てもよい（図４（ｄ））。 Next, by using contact lithography, a photomask 119 on which a microchannel pattern is drawn is placed on the photoresist 117, and the microchannel design of the chip 100 is exposed and transferred to the photoresist 117 (FIG. 4B). )). Then, the photoresist 117 is selectively left at a predetermined position on the silicon wafer 115 by development (FIG. 4C). Then, the silicon substrate with the photoresist remaining is used as a mold. However, since the photoresist may be weak in strength, when the strength is necessary, the silicon wafer 115 may be etched using the photoresist 117 as a mask to obtain the silicon mold 121 (FIG. 4D). )).
（第二工程）
第二工程では、第一工程で得られたシリコンモールド１２１を用いて上板１３５を作製し、ＰＤＭＳ製マイクロ流路チップ（接合基板１０１）を作製する。
(Second step)
In the second step, the upper plate 135 is produced using the silicon mold 121 obtained in the first step, and a PDMS micro-channel chip (bonding substrate 101) is produced.
図５（ａ）〜図５（ｄ）および図６（ａ）〜図６（ｅ）は、接合基板１０１の作成手順を示す断面図である。
まず、第一工程で準備したシリコンモールド１２１を、シャーレ１２３等の所定の容器内に接着し、固定する（図５（ａ））。そして、クロスリンカー（化学架橋剤）および高分子（ＰＤＭＳ）を含む溶液をシャーレ１２３に注入する（図５（ｂ））。シャーレ１２３に注入する溶液として、たとえばシリコンエラストマー作製キット等を用いることができ、具体的には、シルガード１８４（東レ・ダウコーニング社製）が用いられる。
FIG. 5A to FIG. 5D and FIG. 6A to FIG. 6E are cross-sectional views showing a procedure for creating the bonded substrate 101.
First, the silicon mold 121 prepared in the first step is bonded and fixed in a predetermined container such as a petri dish 123 (FIG. 5A). Then, a solution containing a crosslinker (chemical crosslinking agent) and a polymer (PDMS) is injected into the petri dish 123 (FIG. 5B). As a solution to be injected into the petri dish 123, for example, a silicon elastomer production kit or the like can be used. Specifically, Sylgard 184 (manufactured by Dow Corning Toray) is used.
そして、シャーレ１２３を６０〜７０℃程度のオーブン内で約２〜３時間加熱する。この間、ＰＤＭＳは架橋し、固形状の下層ＰＤＭＳ１２５となる。その後、シリコンモールド１２１の凸部の排出路１０７の端部に対応する位置つまりリザーバ部分に、針１２９が挿入されたチューブ１２７を垂直に挿入する（図５（ｃ））。 Then, the petri dish 123 is heated in an oven at about 60 to 70 ° C. for about 2 to 3 hours. During this time, PDMS is crosslinked to form a solid lower layer PDMS 125. Thereafter, the tube 127 in which the needle 129 is inserted is vertically inserted into the position corresponding to the end of the discharge path 107 of the convex portion of the silicon mold 121, that is, the reservoir portion (FIG. 5C).
続いて、下層ＰＤＭＳ１２５上に上層ＰＤＭＳ１３１を形成する。図５（ｂ）と同様にして、クロスリンカー（化学架橋剤）および高分子（ＰＤＭＳ）を含む溶液をシャーレ１２３に注入し（図５（ｄ））、オーブン加熱することにより、下層ＰＤＭＳ１２５と上層ＰＤＭＳ１３１とが一体化し、流入路としてのチューブ１２７が固定されたＰＤＭＳ層１３３を得る（図６（ａ））。 Subsequently, an upper layer PDMS 131 is formed on the lower layer PDMS 125. In the same manner as in FIG. 5B, a solution containing a crosslinker (chemical crosslinking agent) and a polymer (PDMS) is injected into the petri dish 123 (FIG. 5D), and heated in an oven, whereby the lower PDMS 125 and the upper layer are heated. The PDMS 131 is integrated with the PDMS 131 to obtain the PDMS layer 133 to which the tube 127 as the inflow channel is fixed (FIG. 6A).
次いで、チューブ１２７内の針１２９を除去し（図６（ｂ））、ＰＤＭＳ層１３３をシャーレ１２３およびシリコンモールド１２１から取り出して、上板１３５を得る（図６（ｃ））。得られた上板１３５と基板１４１とを接着することにより、マイクロ流路を有する接合基板１０１を得る（図６（ｅ））。なお、基板１４１の材料は上板１３５の材料と同じでも異なってもよい。基板１４１の材料の具体例として、シリコン、ガラス、ＰＤＭＳやポリスチレン等の樹脂が挙げられる。 Next, the needle 129 in the tube 127 is removed (FIG. 6B), the PDMS layer 133 is taken out of the petri dish 123 and the silicon mold 121, and the upper plate 135 is obtained (FIG. 6C). By bonding the obtained upper plate 135 and the substrate 141, a bonded substrate 101 having a microchannel is obtained (FIG. 6E). Note that the material of the substrate 141 may be the same as or different from the material of the upper plate 135. Specific examples of the material of the substrate 141 include resins such as silicon, glass, PDMS, and polystyrene.
（第三工程）
第三工程では、第二工程で得られた接合基板１０１に、捕捉物質として機能する抗体を固定化する。図７（ａ）〜図７（ｃ）は、抗体の固定化手順を示す図である。図７（ａ）〜図７（ｃ）の各図において、右図は検出部１１０近傍の構成を示す平面図であり、左図は右図の排出路１０７に沿った断面を示す図である。
(Third process)
In the third step, an antibody that functions as a capture substance is immobilized on the bonding substrate 101 obtained in the second step. Fig.7 (a)-FIG.7 (c) are figures which show the fixation procedure of an antibody. 7A to 7C, the right figure is a plan view showing the configuration in the vicinity of the detection unit 110, and the left figure is a diagram showing a cross section along the discharge path 107 in the right figure. .
まず、図７（ａ）に示したように、抗体を含んだリン緩衝溶液（たとえばＰＢＳ（Phosphate buffered saline）を接合基板１０１の捕捉部１０５に注入する。抗体を含んだＰＢＳを検出部に充填した状態で、接合基板１０１を１０分〜数時間程度放置し、抗体を固相化する（図７（ｂ））。さらに、抗体を含んだＰＢＳを排水しＰＢＳのみを用いて数回洗浄を行う（図７（ｃ））。こうして、基板１４１上に抗体層１３９が形成される。 First, as shown in FIG. 7 (a), a phosphorus buffer solution containing an antibody (for example, PBS (Phosphate buffered saline) is injected into the capture unit 105 of the bonded substrate 101. The detection unit is filled with PBS containing the antibody. In this state, the bonding substrate 101 is allowed to stand for about 10 minutes to several hours to solidify the antibody (FIG. 7B), and the PBS containing the antibody is drained and washed several times using only PBS. (FIG. 7C) Thus, the antibody layer 139 is formed on the substrate 141.
なお、図７（ｃ）では、抗体が基板１４１上に層状に固定化された構成を例示したが、捕捉部１０５において検出対象物質を実用上支障ない程度に検知できる程度の抗体が捕捉部１０５に固定されていればよく、層をなしていなくてもよい。 7C illustrates the configuration in which the antibody is fixed in a layered manner on the substrate 141. However, the capturing unit 105 has an antibody that can detect the detection target substance to a practically satisfactory level. As long as it is fixed to, it does not have to be layered.
以上の手順により、図１に示したチップ１００が得られる。なお、以上の方法では、抗体が捕捉部１０５から排出路１０７にわたって固定化されるが、抗体は捕捉部１０５の少なくとも一部の領域に設けられていればよい。また、抗体は捕捉部１０５の底面に物理的吸着により固定化していてもよいし、化学結合により固定化されていてもよい。 The chip 100 shown in FIG. 1 is obtained by the above procedure. In the above method, the antibody is immobilized from the capture unit 105 to the discharge path 107, but the antibody may be provided in at least a part of the region of the capture unit 105. In addition, the antibody may be immobilized on the bottom surface of the capturing unit 105 by physical adsorption or may be immobilized by chemical bonding.
得られたチップ１００は、液体試料中の検出対象成分の有無または量を検出するセンサーとして用いることができる。
チップ１００の捕捉部１０５に捕捉された成分を検知する装置の構成に特に制限はなく、たとえば汎用の蛍光顕微鏡を用いることができる。
The obtained chip 100 can be used as a sensor for detecting the presence or absence or amount of a detection target component in a liquid sample.
There is no particular limitation on the configuration of the device that detects the component captured by the capturing unit 105 of the chip 100, and for example, a general-purpose fluorescence microscope can be used.
また、たとえば細菌数の計測にのみ用いる場合においては、蛍光検出装置を図８に示す構成としてもよい。図８においては、励起用光源からの出射光が、ダイクロイックミラー、鏡および対物レンズを経由してセンサーチップ（チップ１００）の捕捉部１０５に照射される。捕捉部１０５からの出射光は、対物レンズを経由して鏡で反射し、ダイクロイックミラーを通過し、光学フィルターにより不要な光を排除し、結像レンズにより結像され、電荷結合素子（Charge Coupled Device：ＣＣＤ）により検知される。
また、他の例として、表面プラズモン共鳴センサーを検出装置として用いることも可能である。
For example, when used only for the measurement of the number of bacteria, the fluorescence detection device may be configured as shown in FIG. In FIG. 8, the light emitted from the excitation light source is applied to the capturing unit 105 of the sensor chip (chip 100) via the dichroic mirror, mirror, and objective lens. Light emitted from the capturing unit 105 is reflected by a mirror via an objective lens, passes through a dichroic mirror, eliminates unnecessary light by an optical filter, is imaged by an imaging lens, and is charged coupled element (Charge Coupled). Device: CCD).
As another example, a surface plasmon resonance sensor can be used as a detection device.
次に、本実施形態の作用効果を説明する。
本実施形態においては、流入路１０３が基板の法線方向に延在して捕捉部１０５の上部から捕捉部１０５に液体試料が導入されるとともに、捕捉部１０５に導入された試料が、流入路１０３より細い複数の排出路１０７から基板面内方向に排出される構成となっている。このため、以下の作用効果が得られる。
Next, the effect of this embodiment is demonstrated.
In the present embodiment, the inflow path 103 extends in the normal direction of the substrate, and a liquid sample is introduced from the upper part of the capture unit 105 into the capture unit 105, and the sample introduced into the capture unit 105 is A plurality of discharge paths 107 that are thinner than 103 are discharged in the in-plane direction of the substrate. For this reason, the following effects are obtained.
まず、流入路１０３を垂直方向に配置し、検体を含んだ試料が抗体等の固定化物質に対して鉛直方向から流入することで、基板１４１上に固定化された捕捉物質に、試料中の成分を効率よく接触させることができる。このため、捕捉部１０５における捕捉効率を高め、検出効率を向上させることができる。
さらに、捕捉部１０５において、試料の流れの主方向を基板に鉛直な方向から水平な方向へと直角に変える構成となっている。このため、捕捉部１０５における検出対象成分と固定化物質との接触効率が高まり、捕捉率が向上する。
First, the inflow path 103 is arranged in the vertical direction, and the sample containing the specimen flows into the immobilized substance such as the antibody from the vertical direction, so that the capture substance immobilized on the substrate 141 has the The components can be contacted efficiently. For this reason, the capture efficiency in the capture unit 105 can be increased and the detection efficiency can be improved.
Further, the capturing unit 105 is configured to change the main direction of the sample flow from a direction perpendicular to the substrate to a direction perpendicular to the substrate. For this reason, the contact efficiency between the detection target component and the immobilized substance in the capture unit 105 is increased, and the capture rate is improved.
また、流入路１０３を捕捉部１０５の上部に配置した構造とすることにより、基板１４１と上板１３５との圧着後、捕捉物質を流入路１０３より検出部１１０に導入して捕捉部１０５に配置する加工法を容易に行うことが可能となる。また、基板１４１と上板１３５との接着部において、これらの間に捕捉物質の層が介在しないため、接着強度を高めることができる。 In addition, by adopting a structure in which the inflow path 103 is arranged on the upper part of the capturing unit 105, after the substrate 141 and the upper plate 135 are pressure-bonded, the capturing substance is introduced into the detection unit 110 through the inflow path 103 and disposed in the capturing unit 105. It is possible to easily perform the processing method. In addition, in the bonding portion between the substrate 141 and the upper plate 135, no trapping substance layer is interposed between them, so that the bonding strength can be increased.
また、本実施形態では、流入路１０３より細い複数の排出路１０７が設けられ、これらの排出路１０７が捕捉部１０５の端部から互いに異なる基板面内の複数方向に延びた構成となっている。このため、捕捉部１０５の内部から外部に排出される試料の流量を効果的に増し、処理速度を高めることができる。また、試料を捕捉部１０５の上部から導入する場合にも、排出路１０７の入口付近等に気泡や不純物が付着して排出路１０７が詰まるのを抑制し、捕捉部１０５からの試料の排液を確実に行うことができる。
また、排出路１０７を流入路１０３より細くすることにより、排出路１０７の抵抗をあげ、捕捉部１０５に固定化された抗体付近での試料の流速を遅くして、検出対象成分の捕捉率を向上させることができる。
Further, in the present embodiment, a plurality of discharge paths 107 that are narrower than the inflow path 103 are provided, and these discharge paths 107 extend from the end of the capturing unit 105 in a plurality of directions in different substrate planes. . For this reason, the flow rate of the sample discharged | emitted from the inside of the capture | acquisition part 105 to the outside can be increased effectively, and processing speed can be raised. In addition, even when the sample is introduced from the upper part of the capture unit 105, it is possible to suppress clogging of the discharge path 107 due to bubbles and impurities adhering to the vicinity of the inlet of the discharge path 107, and the sample drainage from the capture unit 105. Can be performed reliably.
Further, by making the discharge path 107 narrower than the inflow path 103, the resistance of the discharge path 107 is increased, the flow rate of the sample in the vicinity of the antibody immobilized on the capture unit 105 is decreased, and the capture rate of the detection target component is increased. Can be improved.
こうした作用効果は、複数の排出路１０７が放射状に設けられた構成において顕著に発揮される。
ここで、複数の排出路１０７が放射状に設けられているとは、複数の排出路１０７が捕捉部１０５から面内の異なる方向に広がっていることをいう。排出路１０７の平面配置は捕捉部１０５の形状等により決めてよく、たとえば図９（ａ）に示すように基板面内で捕捉部１０５の中心に対して線対称な配置であってもよいし、図９（ｂ）に示すように基板面内で捕捉部１０５の中心に対して点対称な配置であってもよい。
Such an effect is remarkably exhibited in a configuration in which a plurality of discharge paths 107 are provided radially.
Here, the plurality of discharge paths 107 being provided in a radial manner means that the plurality of discharge paths 107 spread from the capturing unit 105 in different directions in the plane. The planar arrangement of the discharge path 107 may be determined depending on the shape of the capturing unit 105 and the like. For example, as shown in FIG. 9A, the plane may be symmetrical with respect to the center of the capturing unit 105 in the substrate surface. As shown in FIG. 9 (b), it may be arranged point-symmetrically with respect to the center of the capturing part 105 in the substrate plane.
上記図９（ａ）および図９（ｂ）は、捕捉部１０５および排出路１０７の構成例を示す平面図である。このうち、図９（ａ）は、図１〜図３に示したチップ１００の構成に対応している。図９（ａ）のように、捕捉部１０５の矩形の各辺に複数の排出路１０７が連通する構成とすることにより、液体を各辺からより一層効率よく排出することができる。 FIG. 9A and FIG. 9B are plan views showing a configuration example of the capturing unit 105 and the discharge path 107. Among these, FIG. 9A corresponds to the configuration of the chip 100 shown in FIGS. As shown in FIG. 9A, by adopting a configuration in which a plurality of discharge paths 107 communicate with each rectangular side of the capturing unit 105, it is possible to discharge liquid more efficiently from each side.
また、捕捉部１０５の平面形状は、矩形には限られず、たとえば正多角形としてもよい。また、図９（ｂ）に示したように、円形としてもよい。図９（ｂ）では、円形の流入路１０３の外周に排出路１０７が等間隔で配置され、各排出路１０７は捕捉部１０５との接続部において接線に垂直な方向に延びている。 Further, the planar shape of the capturing unit 105 is not limited to a rectangle, and may be, for example, a regular polygon. Moreover, as shown in FIG.9 (b), it is good also as a circle. In FIG. 9B, the discharge passages 107 are arranged at equal intervals on the outer periphery of the circular inflow passage 103, and each discharge passage 107 extends in a direction perpendicular to the tangent at the connection portion with the capturing portion 105.
また、背景技術の項で前述した特許文献１に記載のチップでは、複数の流路が基板面に平行に配置されており、各流路の延在方向に対して直交して、生体分子が帯状に固定化されている。このようなチップは、構造上、２枚の基板を貼り合わせて製造することになる。具体的には、下の基板に生体分子を固定化した後、流路が加工された上の基板を接着することになる。このため、プラズマクリーナー等を用いた表面処理を施すことが困難であり、上下基板の接着性が低い場合があった。また、加熱等により接着強度を高めようとすると、固定化された生体分子が変性する懸念があった。また、基板の貼り合わせ以外の方法でチップを製造しようとすると、製造工程が煩雑であった。 Further, in the chip described in Patent Document 1 described above in the section of the background art, a plurality of flow paths are arranged in parallel to the substrate surface, and the biomolecules are perpendicular to the extending direction of each flow path. It is fixed in a band shape. Such a chip is structurally manufactured by bonding two substrates. Specifically, after the biomolecule is immobilized on the lower substrate, the upper substrate on which the flow path is processed is bonded. For this reason, it is difficult to perform a surface treatment using a plasma cleaner or the like, and the adhesion between the upper and lower substrates may be low. Further, when the adhesive strength is increased by heating or the like, there is a concern that the immobilized biomolecule is denatured. Further, when trying to manufacture a chip by a method other than the bonding of the substrates, the manufacturing process is complicated.
これに対し、本実施形態においては、捕捉部から鉛直方向に延びる流入路が設けられたチップ構成のため、接合基板１０１を形成した後、捕捉物質を捕捉部に固定化することが容易な構成となっている。このため、製造安定性に優れたチップを安定的に得ることができる。 On the other hand, in the present embodiment, since the chip configuration is provided with an inflow passage extending in the vertical direction from the capturing portion, it is easy to immobilize the capturing substance on the capturing portion after forming the bonded substrate 101. It has become. For this reason, the chip | tip excellent in manufacture stability can be obtained stably.
本実施形態は、たとえばバクテリア（細菌）、菌類等の微生物の検出に好適に用いられる。微生物の検出に用いたときの利点として、たとえば以下のことが挙げられる。以下においては、バクテリアを検出する場合を例に説明する。
（ｉ）検出感度の向上
イムノクロマト法、酵素固定化免疫測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法等に比べて、バクテリアを微小な領域で捕捉することで、捕捉部におけるバクテリアの密度を高め、検出感度を向上させることができる。
（ｉｉ）全量検査が可能
イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法といった他方法では、全試料のうち抽出した試料についてしか検査することができないが、本実施形態のチップ１０１は試料を継続的に流入して検出対象の成分を捕捉する構造のため、試料の全量を用いた検査が可能である。このことにより検査の統計学的信頼性が向上する。
（ｉｉｉ）検出速度の高速化
バクテリアを流路中で捕捉し、直接検出することで、培養法、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）法のような時間を要する工程が不要となり、測定全体に要する時間が高速化される。
（ｉｖ）標識試薬および捕捉物質（たとえば、抗体）の消費量の減少
抗体を固定化する領域が微小であるので、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＤＮＡプローブ法等の方法に比べて、抗体の使用量が少なくてすむ。
さらに、検出対象の成分が微小領域に集中しているので、標識試薬として用いる蛍光試薬も少なくてすむ。
（ｖ）生死菌の判別が可能
捕捉した成分を検知する際に、たとえば市販の蛍光染色試薬を用いて、生死菌の判別が可能となる。生死菌の判別が可能となることにより、たとえば食品衛生検査や抗菌剤の感受性試験等への応用が可能となる。
This embodiment is suitably used for detecting microorganisms such as bacteria (bacteria) and fungi. For example, the following can be mentioned as advantages when used for detection of microorganisms. In the following, a case where bacteria are detected will be described as an example.
(I) Improvement of detection sensitivity Compared with immunochromatography, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, latex agglutination method, DNA probe method, etc. It is possible to increase the density of bacteria in the capturing part and improve the detection sensitivity.
(Ii) Total quantity inspection is possible In other methods such as immunochromatography, ELISA, latex agglutination, and DNA probe method, only the extracted sample can be inspected, but the chip 101 of this embodiment uses a sample. The structure that continuously flows in and captures the component to be detected allows inspection using the entire amount of the sample. This improves the statistical reliability of the examination.
(Iii) Acceleration of detection speed By capturing bacteria directly in the flow path and detecting them directly, time-consuming steps such as culture methods and polymerase chain reaction (PCR) methods are not required, and the entire measurement is performed. The time required for is increased.
(Iv) Reduction in consumption of labeling reagent and capture substance (for example, antibody) Since the region where the antibody is immobilized is very small, compared to methods such as immunochromatography, ELISA, latex agglutination, DNA probe, etc. Use less antibody.
Furthermore, since the components to be detected are concentrated in a minute region, less fluorescent reagent is used as the labeling reagent.
(V) Viable and dead bacteria can be discriminated When a captured component is detected, viable and dead bacteria can be discriminated using, for example, a commercially available fluorescent staining reagent. By making it possible to discriminate between live and dead bacteria, it becomes possible to apply to, for example, food hygiene inspections and antimicrobial susceptibility tests.
以下の実施形態においては、第一の実施形態と異なる点を中心に説明する。 In the following embodiment, it demonstrates centering on a different point from 1st embodiment.
（第二の実施形態）
第一の実施形態においては、ＰＤＭＳをシリコンモールドにより加工して、チップ１００の接合基板１０１を製造する方法を例示したが、樹脂の射出成型による接合基板１０１を製造してもよい。
(Second embodiment)
In the first embodiment, the method of manufacturing the bonding substrate 101 of the chip 100 by processing PDMS with a silicon mold is exemplified. However, the bonding substrate 101 may be manufactured by resin injection molding.
図１０（ａ）、図１０（ｂ）、図１１（ａ）および図１１（ｂ）は、本実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。 FIG. 10A, FIG. 10B, FIG. 11A, and FIG. 11B are cross-sectional views illustrating the manufacturing process of the bonded substrate in the present embodiment.
まず、マイクロ流路を配置した金型１５１に樹脂を射出し、基板１５３（図１０（ａ））および上板１５５（図１０（ｂ））を成型する。その後、得られた両板（図１１（ａ））を圧着または接着して、マイクロ流路チップ（接合基板１５７、図１１（ｂ））を得る。
その後の工程は、第一の実施形態で前述した第三工程に準じて行い、捕捉部１０５に抗体を固相化する。
First, a resin is injected into a mold 151 in which a microchannel is arranged, and a substrate 153 (FIG. 10A) and an upper plate 155 (FIG. 10B) are molded. Thereafter, the obtained both plates (FIG. 11A) are pressure-bonded or bonded to obtain a microchannel chip (bonding substrate 157, FIG. 11B).
Subsequent steps are performed according to the third step described above in the first embodiment, and the antibody is immobilized on the capture unit 105.
本実施形態における樹脂の射出成型による加工法は、第一の実施形態に記載の方法に比べて、たとえば量産する際の製造コストを低減する点でさらに効果的である。 The processing method by injection molding of the resin in the present embodiment is more effective in reducing the manufacturing cost in mass production, for example, compared to the method described in the first embodiment.
（第三の実施形態）
本実施形態は、接合基板１０１のさらに別の製造方法に関する。本実施形態では、フォトリソグラフィー技術を用いて接合基板を得る。
(Third embodiment)
The present embodiment relates to still another method for manufacturing the bonded substrate 101. In this embodiment, a bonded substrate is obtained using a photolithography technique.
図１２（ａ）〜図１２（ｄ）、図１３（ａ）および図１３（ｂ）は、本実施形態における接合基板の製造工程を示す断面図である。 12 (a) to 12 (d), FIG. 13 (a), and FIG. 13 (b) are cross-sectional views illustrating the manufacturing process of the bonded substrate in the present embodiment.
まず、図１２（ａ）に示したように、基板１６１上にレジスト１６３を成膜し（図１２（ａ））、フォトマスク１６５を用いて（図１２（ｂ））レジスト１６３を選択的に除去する（図１２（ｃ））。こうして所定の形状に加工されたレジスト１６３をマスクとして、基板１６１をエッチング等により加工する（図１２（ｄ））。 First, as shown in FIG. 12A, a resist 163 is formed on a substrate 161 (FIG. 12A), and the resist 163 is selectively formed using a photomask 165 (FIG. 12B). It is removed (FIG. 12C). Using the resist 163 thus processed into a predetermined shape as a mask, the substrate 161 is processed by etching or the like (FIG. 12D).
また、要求される加工精度や加工形状により、リソグラフィー、切削または射出成型等の加工法を選択し、上板１６９の成型を行う。 Further, depending on the required processing accuracy and processing shape, a processing method such as lithography, cutting, or injection molding is selected, and the upper plate 169 is molded.
そして、基板１６１上の所定の位置に上板１６９を配置して（図１３（ａ））、圧着することにより、接合基板１７１を得る（図１３（ｂ））。
その後の工程は、第一の実施形態で前述した第三工程に準じて行い、捕捉部１０５に抗体を固相化する。
And the upper board 169 is arrange | positioned in the predetermined position on the board | substrate 161 (FIG. 13 (a)), and the joining board | substrate 171 is obtained by crimping | bonding (FIG.13 (b)).
Subsequent steps are performed according to the third step described above in the first embodiment, and the antibody is immobilized on the capture unit 105.
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described with reference to drawings, these are the illustrations of this invention, Various structures other than the above are also employable.
たとえば、基板を含むチップの素材として使用可能な材料の例としては、ガラス、石英ガラス、シリコンおよび樹脂が挙げられる。 For example, examples of a material that can be used as a raw material for a chip including a substrate include glass, quartz glass, silicon, and resin.
また、以上の実施形態においては、バクテリアを検出する場合を主に例示したが、検出対象はバクテリアには限られず、ウイルス等の他の微生物としてもよい。また、タンパク質、核酸等の生体高分子や他の生体分子、生体分子に対する親和性を有する化合物等も対象となる。 Moreover, although the case where bacteria were mainly detected was illustrated in the above embodiment, the detection target is not limited to bacteria, and may be other microorganisms such as viruses. In addition, biopolymers such as proteins and nucleic acids, other biomolecules, compounds having affinity for biomolecules, and the like are also targeted.
また、以上の実施形態においては、検出対象を捕捉して基板上に固定化する捕捉物質として、微生物に対する抗体を代表例に挙げたが、検出対象の成分に対して相互作用するものであればこれには限られず、たとえば検出対象の成分に対する特異的相互作用を有する物質が挙げられる。このような物質は、検出対象の成分に応じて適宜選択されるが、たとえば人工抗体（Molecular imprint）が挙げられる。 Moreover, in the above embodiment, as an example of the capture substance that captures the detection target and immobilizes it on the substrate, an antibody against a microorganism is given as a representative example, but any substance that interacts with a component to be detected can be used. For example, a substance having a specific interaction with a component to be detected can be used. Such a substance is appropriately selected according to the component to be detected, and examples thereof include an artificial antibody (Molecular imprint).
また、以上の実施形態においては、マイクロ流路チップの加工法として、上記のＰＤＭＳ法、射出成型法およびフォトリソグラフィー法を代表例に挙げたが、これらの加工法には限られず、加工精度や製造コストに応じて適宜選択されるが、たとえばホットエンボス法が挙げられる。 In the above embodiment, the PDMS method, the injection molding method, and the photolithography method are given as representative examples of the processing method of the microchannel chip. However, the processing method is not limited to these processing methods. Although it selects suitably according to manufacturing cost, the hot embossing method is mentioned, for example.
（実施例１）
本実施例では、２つの方法で大腸菌の検出実験を行った。
図１４（ａ）および図１４（ｂ）は、本実施例における検出方法を説明する斜視図である。
Example 1
In this example, E. coli detection experiments were conducted by two methods.
FIG. 14A and FIG. 14B are perspective views for explaining a detection method in the present embodiment.
図１４（ｂ）では、第一の実施形態に記載の方法に準じて、マイクロ流路チップを作製した。チップの構成を以下に示す。
基板１４１の材料：ガラス
上板１３５の材料：ＰＤＭＳ
流入路１０３の直径：３００μｍ
捕捉部１０５の大きさ：２ｍｍ
排出路１０７：幅２０μｍ、深さ１０μｍ
捕捉物質：抗体（抗大腸菌抗体；Goat IgG; GeneTex社）
検出対象成分：大腸菌
検出方法：蛍光顕微鏡観察
In FIG. 14B, a microchannel chip was fabricated according to the method described in the first embodiment. The configuration of the chip is shown below.
Substrate 141 material: Glass top plate 135 material: PDMS
Diameter of inflow channel 103: 300 μm
Capturing part 105 size: 2 mm
Discharge path 107: width 20 μm, depth 10 μm
Capture material: Antibody (Anti-E. Coli antibody; Goat IgG; GeneTex)
Detection target component: E. coli Detection method: Fluorescence microscope observation
このマイクロ流路チップの捕捉部に大腸菌を含んだリン酸緩衝液の試料（１０6個／ｍＬ）を注入し、抗原抗体反応による大腸菌の捕捉を行った後、リン酸緩衝液により捕捉部を洗浄した。 A phosphate buffer solution sample containing E. coli (10 6 cells / mL) is injected into the capture part of this microchannel chip, and after capture of E. coli by antigen-antibody reaction, the capture part is placed in the phosphate buffer solution. Washed.
また、比較のため、捕捉部を流路の一部に配置したチップを用いて、上記方法に準じて大腸菌の検出を行った。図１４（ａ）は、捕捉部を流路の一部に配置した場合の検出方法を説明する図である。 For comparison, Escherichia coli was detected in accordance with the above method using a chip in which the capture part was arranged in a part of the flow path. FIG. 14A is a diagram illustrating a detection method when the capturing unit is arranged in a part of the flow path.
図１５（ａ）は、図１４（ａ）に示したチップの捕捉部の蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。図１５（ａ）より、図１４（ａ）に示したチップを用いた場合、捕捉部に捕捉された大腸菌が少ないことがわかる。 Fig.15 (a) is a figure which shows the fluorescence microscope observation result of the capture part of the chip | tip shown to Fig.14 (a). From FIG. 15 (a), it can be seen that when the chip shown in FIG. 14 (a) is used, the number of E. coli captured by the capture unit is small.
一方、図１５（ｂ）は、図１４（ｂ）に示したチップの捕捉部の蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。図１４（ｂ）に示したチップを用いた場合、図１５（ａ）に比べて非常に多くの大腸菌が捕捉されていることが図１５（ｂ）よりわかる。また、図１５（ｂ）より計数された捕捉された大腸菌数は約１５０個であった。
図１４（ｂ）に示したチップを用いることにより、一方向に延在する流路の一部に捕捉部を設けて流路に試料を流す図１４（ａ）の方法に比べて、捕集効率が著しく高まることがわかる。
On the other hand, FIG.15 (b) is a figure which shows the fluorescence microscope observation result of the capture part of the chip | tip shown in FIG.14 (b). When the chip shown in FIG. 14 (b) is used, it can be seen from FIG. 15 (b) that an extremely large amount of E. coli is captured compared to FIG. 15 (a). The number of captured E. coli counted from FIG. 15 (b) was about 150.
Compared with the method shown in FIG. 14 (a), by using the chip shown in FIG. 14 (b), a capturing portion is provided in a part of the flow path extending in one direction and the sample is flowed into the flow path. It can be seen that the efficiency is significantly increased.
（実施例２）
本実施例では、図１４（ｂ）に示したチップを用いて、複合蛍光染色法と蛍光観察による大腸菌検出と生死判定を行った。
チップによるバクテリアの捕捉は、実施例１に記載の方法に準じて行った。試料として、大腸菌を含んだリン酸緩衝液（１０7個／ｍＬ）を用いた。また、バクテリアに対する抗体として抗大腸菌抗体、Goat IgGを用いた。本実施例においても、試料を注入し、抗原抗体反応による大腸菌の捕捉を行った後、リン酸緩衝液により捕捉部を洗浄した。
(Example 2)
In this example, using the chip shown in FIG. 14 (b), Escherichia coli detection and viability determination were performed by the combined fluorescent staining method and fluorescence observation.
Bacteria capture by the chip was performed according to the method described in Example 1. As a sample, a phosphate buffer solution (10 7 cells / mL) containing E. coli was used. In addition, anti-E. Coli antibodies and Goat IgG were used as antibodies against bacteria. Also in this example, after injecting a sample and capturing E. coli by antigen-antibody reaction, the capturing part was washed with a phosphate buffer.
その後、複合蛍光染色法を用いて、特異的に捕捉された大腸菌の生死と個体数を判別した。複合蛍光染色試薬として、LIVE/DEAD BacLight（商標） Bacterial Viability Kits（Invitrogen社製）を用いた。 Thereafter, the life and death of the specifically captured E. coli and the number of individuals were discriminated using a complex fluorescent staining method. LIVE / DEAD BacLight (trademark) Bacterial Viability Kits (manufactured by Invitrogen) was used as a composite fluorescent staining reagent.
複合蛍光染色試薬を含む緩衝溶液をチップの捕捉部に導入した。複合蛍光染色試薬は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のよう化プロビジウム色素を含んでおり、これらは膜透過性に違いがある。ＳＹＴＯ９は生死菌両方の膜を透過し緑色に染色する。一方、よう化プロビジウムは死菌のダメージを受けた膜のみを透過し赤色に染色する。また、両方の色素がバクテリア中に存在すると、ＳＹＴＯ９の蛍光は減衰する。従って、細菌が生存していれば、複合蛍光試薬は緑色に蛍光し、細菌が死亡しているなら、複合蛍光試薬は、赤色に蛍光する。分子化学反応に、１０分要した後、バクテリア抗体グレーティング部の蛍光顕微鏡観察を行った。 A buffer solution containing a complex fluorescent staining reagent was introduced into the capture part of the chip. The composite fluorescent staining reagent contains a green fluorescent SYTO9 dye and a red fluorescent propidium iodide dye, which are different in membrane permeability. SYTO9 permeates the membranes of both live and dead bacteria and stains green. On the other hand, propidium iodide permeates only the membrane damaged by dead bacteria and stains red. Also, if both dyes are present in the bacteria, the fluorescence of SYTO9 is attenuated. Therefore, if the bacteria are alive, the composite fluorescent reagent fluoresces green, and if the bacteria are dead, the composite fluorescent reagent fluoresces red. After 10 minutes were required for the molecular chemical reaction, the bacterial antibody grating was observed with a fluorescence microscope.
図１６（ａ）〜図１６（ｃ）は、観察結果を示す図である。図１６（ａ）は、すべての菌の観察結果を示し、図１６（ｂ）および図１６（ｃ）は、それぞれ、図１６（ａ）の画像解析により生菌および死菌を抽出した結果を示す。 Fig.16 (a)-FIG.16 (c) are figures which show an observation result. FIG. 16 (a) shows the observation results of all the bacteria, and FIGS. 16 (b) and 16 (c) show the results of extracting live and dead bacteria by the image analysis of FIG. 16 (a), respectively. Show.
図１６（ａ）〜図１６（ｃ）より、本実施形態においても、大腸菌を短時間で感度よく検出することができた。また、蛍光固体の色、個数、場所を検出することで、抗体により特異的に捕捉された細菌の個体数、生死を一度に検出することができる。 From FIG. 16 (a) to FIG. 16 (c), E. coli could be detected with high sensitivity in a short time also in this embodiment. In addition, by detecting the color, number, and location of the fluorescent solid, it is possible to detect the number of individuals and life / death of the bacteria specifically captured by the antibody.
（実施例３）
本実施例では、大腸菌の抗菌剤感受性試験を行った。具体的には、実施例２で大腸菌を捕捉したチップの捕捉部に、抗菌剤（セファム系抗生物質製剤「パンスポリン」武田薬品工業社製、濃度：１０ｇ／Ｌ）を投与し、捕捉部に捕捉されている大腸菌の生死の経過観察を行った。観察は実施例２に記載の方法に準じて行った。
(Example 3)
In this example, an antimicrobial susceptibility test for Escherichia coli was performed. Specifically, an antibacterial agent (cephalum antibiotic preparation “pansporin” manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., concentration: 10 g / L) is administered to the capture part of the chip that captured E. coli in Example 2, and captured in the capture part. The progress of E. coli life and death was observed. The observation was performed according to the method described in Example 2.
図１７（ａ）〜図１７（ｃ）は、順に、抗菌剤投与直後、２時間後および４時間後の観察結果を示す図である。図１７（ａ）〜図１７（ｃ）より、抗菌剤を投与してから時間が経過するにつれ、死菌が増加し生菌が減少する過程を直接把握できることがわかる。 FIG. 17 (a) to FIG. 17 (c) are diagrams showing observation results immediately after administration of the antibacterial agent, 2 hours later, and 4 hours later. From FIG. 17 (a) to FIG. 17 (c), it can be seen that the process of increasing the number of dead bacteria and decreasing the number of viable bacteria can be directly grasped as time passes after the administration of the antibacterial agent.
１００ チップ
１０１ 接合基板
１０３ 流入路
１０５ 捕捉部
１０７ 排出路
１０９ 接続流路
１１０ 検出部
１１１ 環状流路
１１３ 廃液溜
１１５ シリコンウェーハ
１１７ フォトレジスト
１１９ フォトマスク
１２０ 試料
１２１ シリコンモールド
１２３ シャーレ
１２５ 下層ＰＤＭＳ
１２７ チューブ
１２９ 針
１３１ 上層ＰＤＭＳ
１３３ ＰＤＭＳ層
１３５ 上板
１３７ 抗体液
１３９ 抗体層
１４１ 基板
１５１ 金型
１５３ 基板
１５５ 上板
１５７ 接合基板
１６１ 基板
１６３ レジスト
１６５ フォトマスク
１６９ 上板
１７１ 接合基板
100 Chip 101 Bonded substrate 103 Inflow path 105 Capture section 107 Discharge path 109 Connection flow path 110 Detection section 111 Annular flow path 113 Waste liquid reservoir 115 Silicon wafer 117 Photoresist 119 Photomask 120 Sample 121 Silicon mold 123 Petri dish 125 Lower layer PDMS
127 Tube 129 Needle 131 Upper layer PDMS
133 PDMS layer 135 Upper plate 137 Antibody solution 139 Antibody layer 141 Substrate 151 Mold 153 Substrate 155 Upper plate 157 Bonding substrate 161 Substrate 163 Resist 165 Photomask 169 Upper plate 171 Bonding substrate
Claims (6)
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記成分を捕捉する捕捉部と、
前記捕捉部から上方に向かって設けられ、前記試料が導入される流入路と、
前記捕捉部から基板面内の異なる方向に延在するとともに前記流入路より幅狭に設けられ、前記試料が排出される複数の排出路と、
を含み、
前記捕捉部に前記成分を捕捉する捕捉物質が設けられた、チップ。 A chip provided with a detection unit for detecting a component in a sample on a substrate,
The detection unit is
A capturing unit provided on the substrate for capturing the component;
An inflow path that is provided upward from the capture unit and into which the sample is introduced;
A plurality of discharge passages extending from the capturing portion in different directions within the substrate surface and narrower than the inflow passage, and for discharging the sample;
Including
The chip | tip in which the capture | acquisition substance which capture | acquires the said component was provided in the said capture | acquisition part.
前記複数の排出路が、前記捕捉部から前記基板面内に放射線状に延びている、チップ。 The chip according to claim 1,
The chip, wherein the plurality of discharge paths extend radially from the capturing part into the substrate surface.
前記捕捉部の平面形状が矩形であって、
前記矩形の各辺から、複数の前記排出路が辺に直行して延びる、チップ。 The chip according to claim 1 or 2,
The planar shape of the capturing part is rectangular,
A chip in which a plurality of the discharge paths extend perpendicularly to the sides from each side of the rectangle.
前記検出部が、
前記基板に設けられ、前記捕捉部の外周を取り囲む環状流路と、
前記環状流路に連通する廃液溜と、
をさらに含み、
前記複数の排出路が、前記環状流路に連通する、チップ。 The chip according to any one of claims 1 to 3,
The detection unit is
An annular flow path provided on the substrate and surrounding an outer periphery of the capturing part;
A waste liquid reservoir communicating with the annular channel;
Further including
The chip, wherein the plurality of discharge paths communicate with the annular flow path.
Priority Applications (1)
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2008
- 2008-03-04 JP JP2008053209A patent/JP2009210392A/en active Pending
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