JP2009207463A - Method for measuring hdl3-c, and reagent for measuring hdl3-c - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離する方法、検体中のHDL3-C中のコレステロール含有量（HDL3-C）の測定方法及びHDL3-C測定用試薬に関する。 The present invention relates to a method for separating HDL3 in a sample from other lipoproteins, a method for measuring a cholesterol content (HDL3-C) in HDL3-C in a sample, and a reagent for measuring HDL3-C.
高密度リポ蛋白質（HDL）中のコレステロール（Ｃ）値であるHDL-Cは冠動脈疾患（CHD）の負の危険因子として知られており、HDL-Cの低値はLDL-C高値と同様CHDの強力なリスクである。HDLはHDL2：比重ｄ＝1.063-1.125g/mL、及びHDL3：比重ｄ＝1.125-1.210g/mLの２つの主要なサブフラクションを含有する。いくつかのエビデンスは、HDLの抗動脈硬化作用がTotal HDL-CやHDL3-CではなくHDL2-Cに良く相関することを示唆している。また幾つかの疫学研究は、低HDL2-CがCHDイベントと密接に関係していることを報告している。一方、他の試験では反対意見が報告されている。このように、HDL-Cと抗動脈硬化作用の因果関係は医学界では重要視されている。この因果関係を解明するためには、HDLのサブフラクションを、多くの検体でより簡便に測定することが必要とされてきた。 HDL-C, which is a cholesterol (C) level in high-density lipoprotein (HDL), is known as a negative risk factor for coronary artery disease (CHD), and low HDL-C levels are similar to high LDL-C levels. Is a powerful risk. HDL contains two major subfractions: HDL2: specific gravity d = 1.063-1125 g / mL and HDL3: specific gravity d = 1.125-1.210 g / mL. Some evidence suggests that the anti-atherogenic effects of HDL correlate well with HDL2-C rather than Total HDL-C or HDL3-C. Several epidemiological studies have also reported that low HDL2-C is closely associated with CHD events. On the other hand, disagreements have been reported in other trials. Thus, the causal relationship between HDL-C and anti-arteriosclerosis is regarded as important in the medical community. In order to elucidate this causal relationship, it has been necessary to more easily measure HDL subfractions in many specimens.
研究レベルでは血漿中のHDL2-C及びHDL3-Cを決定するため超遠心法が用いられてきた。超遠心法により密度の差を利用してHDLサブフラクションを分離し、そのコレステロール量や蛋白量を定量する方法が知られている（非特許文献１及び２を参照）。この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要する。また一度に大量の検体を処理することが出来なかった。 At the research level, ultracentrifugation has been used to determine HDL2-C and HDL3-C in plasma. A method of separating the HDL subfraction using the difference in density by ultracentrifugation and quantifying the amount of cholesterol or protein is known (see Non-Patent Documents 1 and 2). This method requires expensive equipment and takes a very long time for measurement. Moreover, a large amount of samples could not be processed at a time.
また、HPLCを用いてリポ蛋白を分離し、その成分を定量する方法、NMRを用いてHDLサブクラスのリポ蛋白粒子数を計測する方法が知られている（非特許文献３及び４を参照）。この方法は、測定に特殊な装置を必要とするので、汎用性に乏しかった。 Also known are a method of separating lipoproteins using HPLC and quantifying the components, and a method of measuring the number of lipoprotein particles of the HDL subclass using NMR (see Non-Patent Documents 3 and 4). Since this method requires a special device for measurement, it was poor in versatility.
さらに、汎用の自動分析装置を用いたHDLサブクラス測定法として、沈殿法を用いたHDLサブフラクション測定法が開発されている（非特許文献５〜９を参照）。この方法は２段階の沈殿処理操作を用いる方法である。この方法は、第一段階でヘパリン-Mn試薬によってカイロミクロン（CM）、VLDL、IDL、LDL、Lp(a)等ApoB含有リポ蛋白を凝集させて、これらのリポ蛋白を遠心分離で沈殿させ上清部分のHDLを回収する。その後デキストラン硫酸を用いてHDL2部分を凝集させ、遠心分離法で沈殿させ上清分画のHDL3を回収するという沈殿処理操作を行う。この上清分画の総コレステロールを測定することによりHDL3-Cが測定できる。HDL2-Cは、同一検体で測定したTotal HDL-CからHDL3-Cを差し引くことにより得られる。この方法は２回の遠心分離を必要とするため、測定に時間がかかり簡便性に劣るという問題がある。 Furthermore, an HDL subfraction measurement method using a precipitation method has been developed as an HDL subclass measurement method using a general-purpose automatic analyzer (see Non-Patent Documents 5 to 9). This method uses a two-stage precipitation process operation. In this method, in the first stage, ApoB-containing lipoproteins such as chylomicron (CM), VLDL, IDL, LDL, Lp (a) are aggregated with heparin-Mn reagent, and these lipoproteins are precipitated by centrifugation. Collect the HDL of the clear part. Thereafter, the HDL2 portion is aggregated using dextran sulfate, precipitated by centrifugation, and the supernatant fraction HDL3 is collected. HDL3-C can be measured by measuring the total cholesterol in the supernatant fraction. HDL2-C is obtained by subtracting HDL3-C from Total HDL-C measured on the same sample. Since this method requires two times of centrifugation, there is a problem that measurement takes time and is inferior in convenience.
ヘパリン-Mn試薬を用いず、遠心分離法のみでリポ蛋白を分画する沈殿法では、HDL測定ではCMを大量に含む乳び検体で、CM分画がうまく沈殿せず、遠心分離後最上部にHDL分画とCM分画が混ざった層が膜状に存在する場合があった（非特許文献１０を参照）。上層部分のHDL分画を回収する際どうしてもCMが混入してしまい、この上清分画の総コレステロールを測定する場合CM中コレステロールの一部も併せて測定されるため正誤差となり特異性に劣る。 In the precipitation method in which lipoproteins are fractionated only by centrifugation without using heparin-Mn reagent, the HDL measurement is a chyle sample containing a large amount of CM, and the CM fraction does not precipitate well. In some cases, a layer in which the HDL fraction and the CM fraction are mixed is present in the form of a film (see Non-Patent Document 10). When collecting the HDL fraction in the upper layer, CM is inevitably mixed, and when measuring the total cholesterol in this supernatant fraction, a portion of the cholesterol in the CM is also measured, resulting in a positive error and poor specificity. .
そこで、迅速かつ簡便で、特異性に優れたHDL3の測定方法が求められていた。 Therefore, there has been a demand for a method for measuring HDL3 that is quick, simple and excellent in specificity.
本発明は検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離する方法、HDL3-Cの定量法及びHDL3-C測定用試薬の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for separating HDL3 in a sample from other lipoproteins, a method for quantifying HDL3-C, and a reagent for measuring HDL3-C.
本発明者は、迅速かつ簡便にHDL3中のコレステロール（HDL3-C）及びHDL2中のコレステロール（HDL2-C）並びにHDL3中のアポA-1及びA-2を正確に測定する方法について鋭意検討を行った。本発明者は、HDL3を含む種々のリポ蛋白が含まれる血清又は血漿検体に少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を添加することにより、HDL3以外のリポ蛋白が凝集し、遠心分離又はろ過により、LDL3以外のリポ蛋白を分離除去できることを見出した。除去した後のHDL3中のコレステロールをコレステロール測定法で測定することによりHDL3-C及びHDL2-C並びにHDL3中のアポA-1及びA-2蛋白質を正確に特異的に測定することができた。 The present inventor has intensively studied a method for accurately measuring cholesterol in HDL3 (HDL3-C) and cholesterol in HDL2 (HDL2-C) and apo A-1 and A-2 in HDL3 quickly and easily. went. The present inventor adds at least heparin, divalent metal ions and dextran sulfate to a serum or plasma sample containing various lipoproteins including HDL3, so that lipoproteins other than HDL3 aggregate and are centrifuged or filtered. The present inventors have found that lipoproteins other than LDL3 can be separated and removed. HDL3-C and HDL2-C and apoA-1 and A-2 proteins in HDL3 could be accurately and specifically measured by measuring cholesterol in HDL3 after removal by cholesterol measurement.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] ヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬を検体に添加し、HDL3以外のリポ蛋白を凝集させる工程、並びに
１回の遠心分離又はろ過により検体からHDL3以外のリポ蛋白を分離除去する工程
とを含む検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離する方法。
[２] ２価金属イオンがMn2+イオンである、[１]の方法。
[３] HDL3以外のリポ蛋白を凝集させるのに、さらに１価金属イオンを添加する、[１]又は[２]の方法。
[４] [１]〜[３]のいずれかの方法により、検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離し、分離したHDL3中のコレステロール含有量（HDL3-C）を測定することを含む検体中のHDL3-Cを測定する方法。
[５] HDL3以外のリポ蛋白を分離除去する工程の後、HDLコレステロール直接測定用試薬を用いてHDL3中のコレステロールを測定することを含む、[４]の検体中のHDL3-Cを測定する方法。
[６] HDL3以外のリポ蛋白を分離除去する工程の後、総コレステロール測定用試薬を用いてHDL3中のコレステロールを測定することを含む、[４]の検体中のHDL3-Cを測定する方法。
[７] HDL3以外のリポ蛋白を凝集させる工程で反応系に添加されるヘパリン最終濃度が100〜250U/mL、２価金属イオン最終濃度が２〜100mg/mL、及びデキストラン硫酸最終濃度が１〜４mg/mLである、[４]〜[６]のいずれかの検体中のHDL3-Cを測定する方法。
[８] HDL中のコレステロール含有量（HDL-C）直接測定法により求めた検体中のHDL-C値から、[４]〜[７]のいずれかのHDL3-Cを測定する方法により求めた検体中のHDL3-Cの測定値を差し引くことにより検体中のHDL2中のコレステロール含有量（HDL2-C）を求めることを含む、検体中のHDL2-Cを測定する方法。
[９] [１]〜[３]のいずれかの方法により、検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離し、分離したHDL3中のアポA-1量をアポA-1測定用試薬を用いて測定することを含む、検体中のHDL3中のアポA-1量を測定する方法。
[１０] [１]〜[３]のいずれかの方法により、検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離し、分離したHDL3中のアポA-2量をアポA-2測定用試薬を用いて測定することを含む、検体中のHDL3中のアポA-2量を測定する方法。
[１１] [１]〜[３]のいずれかの検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離する方法に用いるHDL3分離用試薬組成物であって、ヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含むHDL3分離用試薬組成物。
[１２] ２価金属イオンがMn2+イオンである[１１]のHDL3分離用試薬組成物。
[１３] さらに、１価金属イオンを含む[１１]又は[１２]のHDL3分離用試薬組成物。
[１４] ヘパリン濃度が600〜1500U/mL、２価金属イオン濃度が12〜600mg/mL、及びデキストラン硫酸濃度が６〜24mg/mLである[１１]〜[１３]のいずれかのHDL3分離用試薬組成物。
[１５] [４]〜[７]のいずれかの検体中のHDL3-Cを測定する方法に用いるHDL3-C測定用キットであって、[１１]〜[１３]のいずれかの試薬組成物並びに総コレステロール測定用試薬若しくはHDL-C測定用試薬を含むHDL3-C測定用キット。
である。
That is, the present invention is as follows.
[1] A reagent containing heparin, divalent metal ions and dextran sulfate is added to the sample to agglutinate lipoproteins other than HDL3, and lipoproteins other than HDL3 are separated and removed from the sample by one centrifugation or filtration. A method for separating HDL3 in a specimen from other lipoproteins.
[2] The method of [1], wherein the divalent metal ion is Mn 2+ ion.
[3] The method according to [1] or [2], wherein monovalent metal ions are further added to aggregate lipoproteins other than HDL3.
[4] The method includes separating HDL3 in a sample from other lipoproteins and measuring the cholesterol content (HDL3-C) in the separated HDL3 by any one of methods [1] to [3]. A method for measuring HDL3-C in a specimen.
[5] The method for measuring HDL3-C in a specimen according to [4], comprising measuring cholesterol in HDL3 using a reagent for direct measurement of HDL cholesterol after the step of separating and removing lipoproteins other than HDL3 .
[6] The method for measuring HDL3-C in a specimen according to [4], comprising measuring cholesterol in HDL3 using a reagent for measuring total cholesterol after the step of separating and removing lipoproteins other than HDL3.
[7] The final concentration of heparin added to the reaction system in the step of aggregating lipoproteins other than HDL3 is 100 to 250 U / mL, the final concentration of divalent metal ions is 2 to 100 mg / mL, and the final concentration of dextran sulfate is 1 to A method for measuring HDL3-C in a sample according to any one of [4] to [6], which is 4 mg / mL.
[8] Cholesterol content in HDL (HDL-C) Determined by a method for measuring HDL3-C in any one of [4] to [7] from the HDL-C value in a sample determined by a direct measurement method A method for measuring HDL2-C in a sample, comprising determining a cholesterol content (HDL2-C) in HDL2 in a sample by subtracting a measured value of HDL3-C in the sample.
[9] According to any one of the methods [1] to [3], HDL3 in the specimen is separated from other lipoproteins, and the amount of apoA-1 in the separated HDL3 is determined using a reagent for measuring apoA-1. A method for measuring the amount of apo A-1 in HDL3 in a sample, which comprises measuring by using.
[10] According to any of the methods [1] to [3], HDL3 in the sample is separated from other lipoproteins, and the amount of apoA-2 in the separated HDL3 is determined using a reagent for measuring apoA-2. A method for measuring the amount of apo A-2 in HDL3 in a sample, which comprises measuring by using.
[11] A reagent composition for separating HDL3 used in a method for separating HDL3 in a specimen from any one of [1] to [3] from other lipoproteins, comprising heparin, divalent metal ions and dextran sulfate. A reagent composition for separating HDL3.
[12] The reagent composition for HDL3 separation according to [11], wherein the divalent metal ion is Mn 2+ ion.
[13] The reagent composition for HDL3 separation according to [11] or [12], further comprising a monovalent metal ion.
[14] For HDL3 separation according to any of [11] to [13], wherein the heparin concentration is 600 to 1500 U / mL, the divalent metal ion concentration is 12 to 600 mg / mL, and the dextran sulfate concentration is 6 to 24 mg / mL Reagent composition.
[15] An HDL3-C measurement kit for use in a method for measuring HDL3-C in a specimen according to any one of [4] to [7], wherein the reagent composition is any one of [11] to [13] And a kit for measuring HDL3-C containing a reagent for measuring total cholesterol or a reagent for measuring HDL-C.
It is.
本発明の検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離する方法により、１回の遠心分離又はろ過という簡便な操作で検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白と分離することができる。該方法により検体中のHDL3を分離し、分離したHDL3中のコレステロール含有量（HDL3-C）、アポA-1量、アポA-2量を容易に分別測定することができるため臨床上極めて有用である。 By the method of separating HDL3 in a sample from other lipoproteins of the present invention, HDL3 in the sample can be separated from other lipoproteins by a simple operation such as one centrifugation or filtration. HDL3 in a sample is separated by this method, and cholesterol content (HDL3-C), apo A-1 amount, and apo A-2 amount in the separated HDL3 can be easily and separately measured, which is extremely useful clinically. It is.
本発明は検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白、特に高比重リポ蛋白と分離する方法である。本発明の方法によりHDL3を分離し、分離したHDL3中のコレステロール含有量（HDL3-C）、アポA-1量、アポA-2量を測定することができる。本発明の分離方法においては、検体に、少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を添加する。本発明において、少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬をHDL3-C分離用試薬又はHDL3-C測定用試薬と呼ぶことがある。検体に該試薬を添加した後、１回の遠心分離又はろ過によりHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離することができる。 The present invention is a method for separating HDL3 in a specimen from other lipoproteins, particularly high-density lipoproteins. HDL3 can be separated by the method of the present invention, and the cholesterol content (HDL3-C), apo A-1 amount, and apo A-2 amount in the separated HDL 3 can be measured. In the separation method of the present invention, at least heparin, divalent metal ions and dextran sulfate are added to the specimen. In the present invention, a reagent containing at least heparin, a divalent metal ion and dextran sulfate may be referred to as an HDL3-C separation reagent or an HDL3-C measurement reagent. After the reagent is added to the specimen, HDL3 can be separated from other lipoproteins by one centrifugation or filtration.
リポ蛋白は大きくCM、VLDL、LDL及びHDLの分画に分けられ、HDLはさらに密度によりHDL2とHDL3に分けられる。HDL3を小粒子HDL、small HDL、Small dense HDL、dense HDLと呼ぶこともあり、HDL2を大粒子HDL、large HDL、Light HDL等と呼ぶこともある。これらの分画及び亜分画は、粒子サイズ又は比重により区別できる。その粒子サイズの直径はVLDLが30nm〜80nm（30nm〜75nm）で、LDLが22nm〜28nm（19nm〜30nm）、HDLが直径７nm〜10nmである。比重は、VLDLが1.006以下、LDLが1.019〜1.063、HDLが1.063〜1.21である。 Lipoprotein is roughly divided into CM, VLDL, LDL and HDL fractions, and HDL is further divided into HDL2 and HDL3 according to density. HDL3 is sometimes referred to as small particle HDL, small HDL, small dense HDL, dense HDL, and HDL2 is sometimes referred to as large particle HDL, large HDL, light HDL, or the like. These fractions and subfractions can be distinguished by particle size or specific gravity. The diameter of the particle size is 30 nm to 80 nm (30 nm to 75 nm) for VLDL, 22 nm to 28 nm (19 nm to 30 nm) for LDL, and 7 nm to 10 nm for HDL. Specific gravity is 1.006 or less for VLDL, 1.019 to 1.063 for LDL, and 1.063 to 1.21 for HDL.
HDL3は、一般的には直径が8.5nm〜10nmのHDL亜分画、比重1.125〜1.210のHDL亜分画を指す。これに対しHDL2は直径が7.0nm〜8.5nmのHDL亜分画、比重1.063〜1.125のHDL亜分画を指す。 HDL3 generally refers to an HDL subfraction having a diameter of 8.5 nm to 10 nm and an HDL subfraction having a specific gravity of 1.125 to 1.210. In contrast, HDL2 refers to an HDL subfraction having a diameter of 7.0 nm to 8.5 nm and an HDL subfraction having a specific gravity of 1.063 to 1.125.
リポ蛋白中には、コレステロール、アポA-1蛋白質、アポA-2蛋白質等が含まれている。HDL2及びHDL3を含むHDL中のコレステロール含有量をHDL-C、HDL2中のコレステロール含有量をHDL2-C、HDL3中のコレステロール含有量をHDL3-Cと呼び、mg/mLで表される。 Lipoprotein contains cholesterol, apo A-1 protein, apo A-2 protein and the like. The cholesterol content in HDL including HDL2 and HDL3 is called HDL-C, the cholesterol content in HDL2 is called HDL2-C, and the cholesterol content in HDL3 is called HDL3-C, and expressed in mg / mL.
本発明の方法で用いる検体としては、血清又は血漿が使用可能であり、好ましくは血清を使用する。 As the specimen used in the method of the present invention, serum or plasma can be used, and preferably serum is used.
HDL3を他のリポ蛋白と分離するには、少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を検体に添加し、一定時間反応させることによりCM、IDL、VLDL、LDLのアポＢ含有リポ蛋白及びHDL2を凝集させ、遠心分離により凝集したHDL3以外のリポ蛋白を沈殿させるか、あるいはろ過により除去する。遠心分離後の上清中又はろ液中にHDL3が含まれる。HDL3を分離する工程に続いて、分離したHDL3中のコレステロールやアポ蛋白質を定量する。 In order to separate HDL3 from other lipoproteins, at least heparin, divalent metal ions and dextran sulfate are added to the sample and reacted for a certain period of time to obtain CM, IDL, VLDL, LDL apo B-containing lipoproteins and HDL2. Aggregate and precipitate lipoproteins other than HDL3 aggregated by centrifugation, or remove by filtration. HDL3 is contained in the supernatant or filtrate after centrifugation. Following the step of separating HDL3, cholesterol and apoprotein in the separated HDL3 are quantified.
本発明において、ヘパリンとは、水中でヘパリン由来のポリアニオンとして作用し得る化合物であればよい。ヘパリンはヘパリンそのものであってもよく、ヘパリンの金属塩、たとえばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等であってもよい。デキストラン硫酸はデキストラン硫酸そのものであってもよく、デキストラン硫酸の金属塩、たとえばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等であってもよい。 In the present invention, heparin may be a compound that can act as a polyanion derived from heparin in water. The heparin may be heparin itself or a metal salt of heparin, such as an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt. The dextran sulfate may be dextran sulfate itself, or a metal salt of dextran sulfate, such as an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt.
２価金属イオンはMn2+イオン、Mg2+イオン及び／又はCa2+イオンを用いることができる。 As the divalent metal ion, Mn 2+ ion, Mg 2+ ion and / or Ca 2+ ion can be used.
検体に試薬を添加した後の反応混液中のヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸の濃度（以下、「最終濃度」という）は、ヘパリンが100〜250U/mL、好ましくは150〜200U/mLであり、デキストラン硫酸は、１〜４mg/mL、好ましくは1.5〜３mg/mL、より好ましくは1.8〜2.5mg/mLであり、２価金属イオンは、２〜100mg/mL、好ましくは５〜200mg/mL、さらに好ましくは10〜100mg/mLであり、例えばMn2+イオンの場合はイオン濃度が２〜100mg/mL、好ましくは５〜50mg/mL、より好ましくは10〜25mg/mLである。Ca2+イオンの場合はイオン濃度が５〜200mg/mL、好ましくは20〜100mg/mLである。Mg2+イオンの場合はイオン濃度が10〜300mg/mL、好ましくは30〜150mg/mLである。 The concentration of heparin, divalent metal ions and dextran sulfate (hereinafter referred to as “final concentration”) in the reaction mixture after adding the reagent to the sample is 100 to 250 U / mL, preferably 150 to 200 U / mL for heparin. Dextran sulfate is 1 to 4 mg / mL, preferably 1.5 to 3 mg / mL, more preferably 1.8 to 2.5 mg / mL, and divalent metal ions are 2 to 100 mg / mL, preferably 5 to 200 mg / mL. For example, in the case of Mn 2+ ions, the ion concentration is 2 to 100 mg / mL, preferably 5 to 50 mg / mL, more preferably 10 to 25 mg / mL. In the case of Ca 2+ ions, the ion concentration is 5 to 200 mg / mL, preferably 20 to 100 mg / mL. In the case of Mg 2+ ions, the ion concentration is 10 to 300 mg / mL, preferably 30 to 150 mg / mL.
検体と試薬の混合比は限定されないが、例えば検体100〜500μLにヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬を10〜100μＬ添加する。好ましくは、検体300μLに試薬60μLを添加する。この場合、試薬中のヘパリン濃度は、600〜1500U/mL、デキストラン硫酸濃度は、６〜24mg/mLが好ましい。また２価金属イオン濃度は12〜600mg/mLが好ましい。 The mixing ratio of the sample and the reagent is not limited. For example, 10 to 100 μL of a reagent containing heparin, a divalent metal ion and dextran sulfate is added to 100 to 500 μL of the sample. Preferably, 60 μL of reagent is added to 300 μL of specimen. In this case, the heparin concentration in the reagent is preferably 600 to 1500 U / mL, and the dextran sulfate concentration is preferably 6 to 24 mg / mL. The divalent metal ion concentration is preferably 12 to 600 mg / mL.
HDL3を分離する工程で用いるヘパリン、デキストラン硫酸及び２価金属イオンの最終濃度が上記濃度範囲内であればHDL2やLDL、VLDL等の他のリポ蛋白が凝集し易く、HDL3が凝集しにくい。従って、HDL3のみを遠心分離やろ過により容易に分離・回収することができる。この結果、次の工程でHDL3中のコレステロールやアポ蛋白を定量する際に、他のリポ蛋白中のコレステロールやアポ蛋白が混入することがなく、HDL3中のコレステロールやアポ蛋白の正確な定量値が得られる。 If the final concentrations of heparin, dextran sulfate and divalent metal ions used in the step of separating HDL3 are within the above concentration range, other lipoproteins such as HDL2, LDL, and VLDL are likely to aggregate, and HDL3 is difficult to aggregate. Therefore, only HDL3 can be easily separated and recovered by centrifugation or filtration. As a result, when quantifying cholesterol and apoprotein in HDL3 in the next step, cholesterol and apoprotein in other lipoproteins are not mixed, and accurate quantification values of cholesterol and apoprotein in HDL3 are obtained. can get.
少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を検体に添加する方法は特に限定されず、例えば各成分をあらかじめ混合した測定試薬を検体に添加してもよく、各成分を１種類ごとあるいは数種類まとめて別々に調製しておき、使用時に検体にこれらの調製品を全部添加してもよい。この際の添加の順序は限定されない。 The method for adding at least heparin, divalent metal ions, and dextran sulfate to the specimen is not particularly limited. For example, a measurement reagent in which each component is mixed in advance may be added to the specimen. They may be prepared separately and all of these preparations may be added to the specimen at the time of use. The order of addition at this time is not limited.
少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬には溶媒として、精製水、生理食塩水及び各種緩衝液を用いることができる。測定試薬のpHは３〜８に調整することが好ましい。 For a reagent containing at least heparin, a divalent metal ion, and dextran sulfate, purified water, physiological saline, and various buffers can be used as a solvent. The pH of the measurement reagent is preferably adjusted to 3-8.
検体に少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬を添加した後、反応混液を攪拌し、分離反応を行わせる。分離工程での反応は２℃〜45℃、好ましくは20℃〜37℃で行えばよい。また分離工程での反応は３分〜30分間、好ましくは５分〜15分間行なえばよい。 After adding a reagent containing at least heparin, divalent metal ions, and dextran sulfate to the specimen, the reaction mixture is stirred to cause a separation reaction. The reaction in the separation step may be performed at 2 ° C to 45 ° C, preferably 20 ° C to 37 ° C. The reaction in the separation step may be performed for 3 minutes to 30 minutes, preferably 5 minutes to 15 minutes.
分離工程において、ヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸に加えて、さらに１価金属イオンを添加してもよい。反応に１価金属イオンを添加することにより、１価金属イオンがイオン強度調整剤として作用し、遠心分離によるHDL３と他のリポ蛋白との分離をより確実かつ容易に達成することができる。１価金属イオンの種類は限定されず、例えばNa+やK+等のアルカリ金属を用いることができる。反応混液中の１価金属イオンの最終濃度は、0.4mol/L以下、好ましくは0.01〜0.3mol/Lである。１価金属イオンは、少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬と別々に検体に添加してもよく、また上記試薬に１価金属イオンをあらかじめ混合しておいて検体に添加してもよい。さらに、ヘパリン、２価金属イオン、デキストラン硫酸及び１価金属イオンを適宜組合せて複数の試薬を調製し、該複数の試薬を検体に添加してもよい。ヘパリン、２価金属イオン、デキストラン硫酸及び１価金属イオンあるいはこれらを適宜組合せて含む試薬の添加の順序は限定されない。従って、本発明は、検体にヘパリン、２価金属イオン、デキストラン硫酸及び１価金属イオンを添加し、HDL3以外のリポ蛋白を凝集させることを含む、検体からHDL3分離する方法をも包含する。 In the separation step, monovalent metal ions may be further added in addition to heparin, divalent metal ions and dextran sulfate. By adding a monovalent metal ion to the reaction, the monovalent metal ion acts as an ionic strength adjusting agent, and separation of HDL3 and other lipoproteins by centrifugation can be achieved more reliably and easily. The kind of monovalent metal ion is not limited, and for example, an alkali metal such as Na + or K + can be used. The final concentration of monovalent metal ions in the reaction mixture is 0.4 mol / L or less, preferably 0.01 to 0.3 mol / L. The monovalent metal ion may be added to the specimen separately from the reagent containing at least heparin, divalent metal ion and dextran sulfate, or the monovalent metal ion is previously mixed with the reagent and added to the specimen. Also good. Furthermore, a plurality of reagents may be prepared by appropriately combining heparin, divalent metal ions, dextran sulfate and monovalent metal ions, and the plurality of reagents may be added to the specimen. The order of addition of the reagent containing heparin, divalent metal ion, dextran sulfate and monovalent metal ion, or an appropriate combination thereof is not limited. Therefore, the present invention also includes a method for separating HDL3 from a sample, which comprises adding heparin, divalent metal ion, dextran sulfate and monovalent metal ion to the sample and aggregating lipoproteins other than HDL3.
検体と少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬との反応が終了した後、遠心分離を行い上清を得ることにより、HDL3を主に含む画分を採取することができる。この際の遠心分離条件は、9,000g〜36,000gで５〜30分である。 After the reaction between the specimen and the reagent containing at least heparin, divalent metal ions, and dextran sulfate is completed, a fraction containing mainly HDL3 can be collected by centrifuging and obtaining a supernatant. The centrifugation conditions at this time are 9,000 g to 36,000 g and 5 to 30 minutes.
また、遠心分離ではなく、検体と少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む試薬との反応が終了した後、反応混液をフィルターにかけてろ過し、パススルーとしてHDL3を主に含む画分を採取することができる。この際用いるフィルターの分画サイズは、0.10〜0.80μｍであり、例えば、市販のウルトラフリー（MILLIPORE社製）、ミニザルト（Sartorius社製）、DISMIC（ADVANTEC社製）、HTタフリン・アクロディスク・シリンジフィルター（PALL Gelman Laboratory社製）等を用いることができる。 Also, instead of centrifugation, after the reaction between the specimen and the reagent containing at least heparin, divalent metal ions, and dextran sulfate is completed, the reaction mixture is filtered and a fraction mainly containing HDL3 is collected as a pass-through. be able to. The fraction size of the filter used at this time is 0.10 to 0.80 μm. For example, commercially available Ultra Free (manufactured by MILLIPORE), Minisart (manufactured by Sartorius), DISMIC (manufactured by ADVANTEC), HT Tafrin / Acrodisc / Syringe A filter (manufactured by PALL Gelman Laboratory) or the like can be used.
ここで、「HDL3を主に含む」とは、好ましくはHDL3以外のリポ蛋白を実質的に含まないことをいう。ただし、HDL3以外のリポ蛋白を全く含まれないことまでは必要なく、主にHDL3を含み、HDL3以外の他のリポ蛋白の含有量がHDL3に比べ小さい場合も含む。例えば、すべてのリポ蛋白中のHDL3の比率（重量比又は濃度比）が80％以上の場合、90％以上の場合、好ましくは95％以上の場合、さらに好ましくは97％以上の場合、特に好ましくは99％以上の場合、「HDL3を主に含む」という。但し、検体がカイロミクロンを多く含む高CM検体の場合、遠心分離によってもCMが除去できず、遠心分離後上清部分の最上部にCMが膜状に存在することがある。本発明においては、高CM検体を用いて遠心分離後に上清の最上部にCMが存在する場合もCMの量にかかわらず、「HDL3が主に含まれる」という。 Here, “mainly containing HDL3” preferably means substantially free of lipoproteins other than HDL3. However, it is not necessary that lipoproteins other than HDL3 are contained at all, and includes cases where the content of lipoproteins other than HDL3 is mainly smaller than HDL3. For example, when the ratio (weight ratio or concentration ratio) of HDL3 in all lipoproteins is 80% or more, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably If it is 99% or more, it is said to “mainly contain HDL3”. However, when the specimen is a high CM specimen containing a large amount of chylomicrons, the CM cannot be removed even by centrifugation, and the CM may be present in the uppermost part of the supernatant after centrifugation. In the present invention, even when CM is present at the top of the supernatant after centrifugation using a high CM specimen, it is said that “HDL3 is mainly contained” regardless of the amount of CM.
HDL3の分離工程で得られたHDL3を含む画分中のコレステロールのみを定量する工程により、検体中のHDL3-Cを測定することができる。この際、分離したHDL3中のコレステロール含有量（HDL3-C）の測定は、分離した画分中の総コレステロール量を測定するか、HDL-Cを測定することにより行える。 HDL3-C in the sample can be measured by the step of quantifying only cholesterol in the fraction containing HDL3 obtained in the HDL3 separation step. At this time, the cholesterol content (HDL3-C) in the separated HDL3 can be measured by measuring the total cholesterol amount in the separated fraction or by measuring HDL-C.
分離したHDL3中のコレステロールを測定する工程では、公知のHDL-C（HDL中のコレステロール含有量）を測定する方法を用いればよい。このような測定方法としては、分画操作を要しない測定方法、すなわち直接測定法（homogeneous法）を選択することが好ましい。例えば第WO03/064684号国際公開パンフレットの記載に従って、以下のようにしてHDL3の分離工程で得られたHDL3を含む画分中のコレステロールを定量することができる。すなわち、HDL3の分離工程で得られたHDL3を含む分画を試料とし、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、HDL3の分離工程で完全に分離できず試料中に混入している可能性のあるCM等のHDL以外のリポ蛋白を消去する（ステップＡ）。該ステップＡにおいては、HDLに実質的に作用しない界面活性剤が含まれていてもよい。次いで試料中の残存HDLのHDL-Cを測定する（ステップＢ）。このコレステロールの測定の際、ステップＡはHDLに作用する界面活性剤の非存在下において行われる。ステップＡにより、試料中にはリポ蛋白として実質的にHDL3のみ含まれるようになるので、ステップＢの残存HDLのコレステロール含有量の測定においては、HDL3中のコレステロール含有量（HDL3-C）を測定することになる。ここで、「実質的にHDL3のみ含まれる」とは、試料中の全HDLに対してHDL3が90％以上（重量％）、好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上含まれることを意味する。この結果、ステップＡにおいて、混在するHDL以外のリポ蛋白が除去される。 In the step of measuring cholesterol in the separated HDL3, a known method of measuring HDL-C (cholesterol content in HDL) may be used. As such a measurement method, it is preferable to select a measurement method that does not require a fractionation operation, that is, a direct measurement method (homogeneous method). For example, according to the description in WO03 / 064684 International Publication Pamphlet, cholesterol in the fraction containing HDL3 obtained in the HDL3 separation step can be quantified as follows. In other words, using the fraction containing HDL3 obtained in the HDL3 separation step as a sample, allowing cholesterol esterase and cholesterol oxidase to act and eliminating the generated hydrogen peroxide, the sample cannot be completely separated in the HDL3 separation step Eliminate lipoproteins other than HDL such as CM that may be mixed in (step A). In Step A, a surfactant that does not substantially act on HDL may be included. Next, HDL-C of residual HDL in the sample is measured (step B). In the measurement of cholesterol, step A is performed in the absence of a surfactant that acts on HDL. By step A, since the sample substantially contains only HDL3 as lipoprotein, in the measurement of the residual HDL cholesterol content in step B, the cholesterol content in HDL3 (HDL3-C) is measured. Will do. Here, “substantially only HDL3 is contained” means that HDL3 is 90% or more (% by weight), preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% of all HDL in the sample. % Or more is included. As a result, in step A, lipoproteins other than the mixed HDL are removed.
ステップＢでは、HDLに特異的に作用する界面活性剤が用いられる。HDLに特異的に作用する界面活性剤としては親水性疎水性バランス（HLB）が13〜14の界面活性剤を挙げることができ、中でも、HLBが13〜14の非イオン界面活性剤、特にポリアルキレンオキサイド誘導体を用いることができる。ポリアルキレンオキサイド誘導体としては、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が13以上14以下の化合物が挙げられる。 In Step B, a surfactant that specifically acts on HDL is used. Surfactants that specifically act on HDL include surfactants with a hydrophilic-hydrophobic balance (HLB) of 13-14, and among them, nonionic surfactants with an HLB of 13-14, especially polysiloxanes. An alkylene oxide derivative can be used. Examples of the polyalkylene oxide derivative include polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene higher alcohol ether, polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene nonyl phenyl ether, and HLB value. Is a compound of 13 or more and 14 or less.
ステップＢにおいては、HDL3中のコレステロールを酵素的に定量する。コレステロールの酵素的な定量方法自体は、周知である。例えば、ステップＢにおいて、上記の界面活性剤の他、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させることにより、遊離型コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素を定量すればよい。過酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等により測定すればよい。キノン色素は、例えば過酸化水素と4-アミノアンチピリン及びDAOS若しくはHDAOS（N-(2-ヒドロキシスルホプロピル）-3,5-ジメチオキシアニリン）を反応させることにより形成される。 In Step B, cholesterol in HDL3 is quantified enzymatically. The enzymatic determination method of cholesterol itself is well known. For example, in Step B, in addition to the above surfactant, cholesterol esterase and cholesterol oxidase are allowed to act to generate hydrogen peroxide from free cholesterol, and the generated hydrogen peroxide may be quantified. The hydrogen peroxide may be quantified, for example, by reacting with a compound that reacts with hydrogen peroxide to form a quinone dye in the presence of peroxidase, and the amount of the generated quinone dye may be measured by absorbance measurement or the like. The quinone dye is formed, for example, by reacting hydrogen peroxide with 4-aminoantipyrine and DAOS or HDAOS (N- (2-hydroxysulfopropyl) -3,5-dimethyloxyaniline).
コレステロールを測定する際のステップＡ及びステップＢの条件は、第WO03/064684号国際公開パンフレットに記載されたとおりである。 The conditions of Step A and Step B when measuring cholesterol are as described in WO03 / 064684 International Publication Pamphlet.
CMを含まない検体では、HDL3の分離工程で得られるリポ蛋白はHDL3のみであるため、続く測定工程で総コレステロール測定用試薬を用いてもHDL-C測定用試薬を用いてもよい。これらの測定用試薬を用いることにより、分離した画分中のHDL3中に含まれるコレステロールを測定することができる。一方、高トリグリセリド（TG）でカイロミクロン（CM）を多く含む検体、例えばTGが500mg/dLを越える濃度で含まれる高CM検体では、HDL3の分離工程における反応液の遠心後、上清部分の最上部にCMが膜状に存在する。これを総コレステロール測定キットで定量した場合には、CMに存在するコレステロールをも測定することになる。この場合、測定値にCM中のコレステロールも含まれることになり、HDL3-Cを正確に測定することができない。このためCMを多く含む検体を用いた場合、HDL-C測定キットを用いて検体中のHDL-Cを測定することが好ましい。 In a sample that does not contain CM, since HDL3 is the only lipoprotein obtained in the HDL3 separation step, the total cholesterol measurement reagent or the HDL-C measurement reagent may be used in the subsequent measurement process. By using these measuring reagents, cholesterol contained in HDL3 in the separated fraction can be measured. On the other hand, in samples containing high triglycerides (TG) and many chylomicrons (CM), for example, high CM samples containing TG in a concentration exceeding 500 mg / dL, after centrifugation of the reaction solution in the HDL3 separation step, CM exists in the form of a film at the top. When this is quantified with a total cholesterol measurement kit, the cholesterol present in the CM is also measured. In this case, cholesterol in CM is included in the measured value, and HDL3-C cannot be measured accurately. For this reason, when a specimen containing a large amount of CM is used, it is preferable to measure HDL-C in the specimen using an HDL-C measurement kit.
また、CMを大量に含む高CM検体でHDL3の分離工程後にHDL3に加えCMが存在していた場合には、上記のコレステロールの測定工程のステップＢにおいてHDLに特異的に作用する界面活性剤がCMに作用しにくいため、CM中のコレステロールが消去され得る。従って、高CM検体を用いた場合、コレステロールの測定工程において、HDLに特異的に作用する界面活性剤を用いること及びHDL-C測定用試薬を用いることという２つの処理により、最終的な測定値にCMの混入の影響が及ぶことを避けることができる。 In addition, when CM is present in addition to HDL3 after the HDL3 separation step in a high CM sample containing a large amount of CM, a surfactant that specifically acts on HDL in Step B of the cholesterol measurement step described above is used. Since it is difficult to act on CM, cholesterol in CM can be eliminated. Therefore, when a high CM sample is used, the final measurement value is obtained by two processes of using a surfactant specifically acting on HDL and using a reagent for HDL-C measurement in the cholesterol measurement step. It is possible to avoid the influence of CM mixture.
総コレステロール及びHDL-Cの測定は、市販の試薬キットを用いて行うことができる。HDL-C測定用の市販の試薬キットとしては、例えばHDL-EX（デンカ生研）がある。 Measurement of total cholesterol and HDL-C can be performed using a commercially available reagent kit. An example of a commercially available reagent kit for HDL-C measurement is HDL-EX (Denka Seikan).
別途検体を分離せずに検体中のトータルHDL-CをHDL-C測定用試薬を用いて求め、トータルHDL-Cから上記の方法で求めたHDL3-Cを差し引くことにより、HDL2-C（HDL2中のコレステロール含有量）を求めることができる。 HDL2-C (HDL2) is obtained by subtracting HDL3-C obtained by the above method from total HDL-C by obtaining total HDL-C in the specimen using a reagent for HDL-C measurement without separating the specimen separately. Cholesterol content) can be determined.
本発明は、この方法によりHDL2-Cを測定する方法をも包含する。 The present invention also includes a method for measuring HDL2-C by this method.
さらに、単離したHDL3にアポA-1抗体を作用させて、HDL3中のアポA-1分画の含有量を測定することができる。同様に、アポA-2抗体を用いて、HDL3中のアポA-2分画の含有量を測定することができる。抗ヒトアポA-1抗体によりアポA-1を測定する方法としていくつかの方法、例えば（Clin Chem. 1990;36:591-7）等があるが、これらを好適に用いることができる。また、同様に抗ヒトアポA-2抗体によりアポA-2を測定する方法としていくつかの方法、例えば（Clin Chem. 1990;36:591-7）等があるが、これらを好適に用いることができる。 Furthermore, the apo A-1 antibody can be allowed to act on the isolated HDL3 to measure the content of the apo A-1 fraction in HDL3. Similarly, the content of the apo A-2 fraction in HDL3 can be measured using an apo A-2 antibody. There are several methods for measuring apoA-1 using an anti-human apoA-1 antibody, such as (Clin Chem. 1990; 36: 591-7), and these can be used preferably. Similarly, there are several methods for measuring apo A-2 with an anti-human apo A-2 antibody, such as (Clin Chem. 1990; 36: 591-7). it can.
本発明は、HDL3中のアポA-1を測定する方法及びHDL3中のアポA-2を測定する方法も包含する。 The present invention also includes a method for measuring apo A-1 in HDL3 and a method for measuring apo A-2 in HDL3.
本発明は、HDL3を分離するための試薬組成物、該組成物及び分離したHDL3を測定するためのキットも包含する。HDL3を分離するための試薬組成物は、少なくともヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を含む。該試薬組成物は、さらに１価金属イオンを含んでいてもよい。該試薬組成物中のヘパリン、２価金属イオン、デキストラン硫酸及び１価金属イオンの濃度は、検体と試薬組成物の混合比（体積比）にもよるが、例えば検体300μLに試薬組成物60μLを添加する場合、試薬組成物中のヘパリン濃度は、600〜1500U/mL、デキストラン硫酸濃度は、６〜24mg/mLが好ましい。また２価金属イオン濃度は12〜600mg/mLが好ましい。さらに１価金属イオン濃度は、0.06〜1.8mol/Lが好ましい。 The present invention also includes a reagent composition for separating HDL3, the composition, and a kit for measuring separated HDL3. The reagent composition for separating HDL3 contains at least heparin, a divalent metal ion, and dextran sulfate. The reagent composition may further contain a monovalent metal ion. The concentration of heparin, divalent metal ion, dextran sulfate and monovalent metal ion in the reagent composition depends on the mixing ratio (volume ratio) of the specimen and the reagent composition. For example, 60 μL of the reagent composition is added to 300 μL of the specimen. When added, the heparin concentration in the reagent composition is preferably 600 to 1500 U / mL, and the dextran sulfate concentration is preferably 6 to 24 mg / mL. The divalent metal ion concentration is preferably 12 to 600 mg / mL. Furthermore, the monovalent metal ion concentration is preferably 0.06 to 1.8 mol / L.
分離したHDL3を測定するためのキットは、上記の試薬組成物及び総コレステロール測定用試薬又はHDL-C測定用試薬を含む。該キットはさらに遠心分離用チューブ、HDL3分離用フィルター等を含んでいてもよい。 A kit for measuring the separated HDL3 includes the reagent composition described above and a reagent for measuring total cholesterol or a reagent for measuring HDL-C. The kit may further contain a centrifuge tube, an HDL3 separation filter, and the like.
脂質正常及び脂質異常血清検体（TG：500mg/dL以下）のHDL3-Cの測定
（使用材料）
検体：脂質正常及び脂質異常血清検体（TG：500mg/dL以下） 98例
ヘパリン：ヘパリンナトリウム塩、市販品
２価金属イオン：Mn2+イオン、MnCl2、和光純薬社製特級、市販品
HDL-C測定用試薬：HDL-C測定キットHDL-EX（デンカ生研社製）
総コレステロール測定試薬：総コレステロール測定キットT-CHO(S)（デンカ生研社製）
デキストラン硫酸：デキストラン硫酸ナトリウム、市販品
界面活性剤：ポリオキシエチレンラウリルエーテル系、HLB値13.5、市販品。
Measurement of HDL3-C in normal and abnormal lipid samples (TG: 500 mg / dL or less) (material used)
Specimen: Normal lipid and abnormal serum specimen (TG: 500 mg / dL or less) 98 cases Heparin: Heparin sodium salt, commercial divalent metal ions: Mn 2+ ion, MnCl 2 , Wako Pure Chemicals special grade, commercial product
Reagent for HDL-C measurement: HDL-C measurement kit HDL-EX (manufactured by Denka Seken)
Total cholesterol measurement reagent: Total cholesterol measurement kit T-CHO (S) (manufactured by Denka Seken)
Dextran sulfate: Dextran sulfate sodium, commercially available surfactant: Polyoxyethylene lauryl ether, HLB value 13.5, commercially available.
HDL3以外のリポ蛋白を分離除去する第１工程として検体300μＬにヘパリンナトリウム1000U/mL及びMnCl2 100mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウム12mg/mL、界面活性剤100mgからなる測定試薬60μＬを添加し、37℃で30分間反応させた。その後18,500gで10分間遠心分離を行い、上清を回収した。HDL3中のコレステロールを測定する第２工程としてHDL-C測定キットHDL-EX（デンカ生研社製）、又は総コレステロール測定キットT-CHO(S)N（デンカ生研社製）を使用して日立7180型自動分析装置によってHDL3中のコレステロールを測定した。比較法として超遠心法により測定した。超遠心法においては血清と比重液を混合後、超遠心分離を行い比重1.125〜1.210の分画を回収し、コレステロールを測定してHDL3中コレステロール値とした。 As a first step of separating and removing lipoproteins other than HDL3, add 60 μL of a measuring reagent consisting of 1000 U / mL heparin sodium and 100 mg / mL MnCl 2 , 12 mg / mL dextran sulfate sodium and 100 mg surfactant to 300 μL of the sample, and 37 ° C. For 30 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 18,500 g for 10 minutes, and the supernatant was collected. Hitachi 7180 using HDL-C measurement kit HDL-EX (manufactured by Denka Seiken Co., Ltd.) or total cholesterol measurement kit T-CHO (S) N (manufactured by Denka Seiken Co., Ltd.) as the second step of measuring cholesterol in HDL3 Cholesterol in HDL3 was measured by a type automatic analyzer. As a comparative method, measurement was performed by an ultracentrifugation method. In the ultracentrifugation method, serum and specific gravity solution were mixed, ultracentrifugation was performed to collect fractions having a specific gravity of 1.125 to 1.210, and cholesterol was measured to obtain a cholesterol level in HDL3.
TG500mg/dLより小さい血清を試料とし、本発明法によりHDL3-Cを測定し、その測定値を超遠心法によって得られる値と比較した。この結果を図１に示す。図１中、コレステロールの単位は、mg/dLである。図１に示すように、脂質正常及びTGが500mg/dLより小さい高TG（TG>500mg/dL）ではない検体では、本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。 Serum smaller than TG 500 mg / dL was used as a sample, HDL3-C was measured by the method of the present invention, and the measured value was compared with the value obtained by ultracentrifugation. The result is shown in FIG. In FIG. 1, the unit of cholesterol is mg / dL. As shown in FIG. 1, the results of the method of the present invention showed a good correlation with the results of the ultracentrifugation method in normal lipids and samples having a high TG of less than 500 mg / dL (TG> 500 mg / dL). .
脂質異常血清検体（TG：500mg/dL以下）のHDL3-Cの測定
TG含有量が０〜500mg/dLの低TG血清を含む血清82検体と、TG含有量が500〜1700mg/dLの高TG血清を含む血清８検体を試料とし、本発明の方法によりHDL3を分離した後、HDL-C試薬及び総コレステロール試薬を用いて測定を行い、その測定値を超遠心法によって得られる値と比較した。本発明による分離工程、測定工程で用いた測定試薬及び超遠心法は実施例１と同様のものを使用した。本発明法の測定値と超遠心法の測定値の％差を図２に示す。図２中、黒のシンボルがHDL-Cを用いて測定した結果であり、白のシンボルが総コレステロール試薬を用いて測定した結果である。
Measurement of HDL3-C in dyslipidemic serum specimen (TG: 500mg / dL or less)
HDL3 was separated by the method of the present invention using 82 samples of serum containing low TG serum with 0 to 500 mg / dL of TG and 8 samples of serum containing high TG serum with 500 to 1700 mg / dL of TG. After that, measurement was performed using HDL-C reagent and total cholesterol reagent, and the measured value was compared with the value obtained by ultracentrifugation. The measurement reagent and ultracentrifugation method used in the separation step and measurement step according to the present invention were the same as those in Example 1. The% difference between the measured value of the method of the present invention and the measured value of the ultracentrifugation method is shown in FIG. In FIG. 2, the black symbols are the results measured using HDL-C, and the white symbols are the results measured using the total cholesterol reagent.
図２に示すように、測定工程において総コレステロール測定用試薬を用いた場合には高TG検体で超遠心法と乖離が生ずる。これに対し、測定工程でHDL-C測定用試薬を用いた場合では超遠心法と乖離が生じず、正確に測定を行うことができる。 As shown in FIG. 2, when a reagent for measuring total cholesterol is used in the measurement process, the high TG sample is different from the ultracentrifugation method. On the other hand, when the reagent for HDL-C measurement is used in the measurement process, the measurement can be performed accurately without any deviation from the ultracentrifugation method.
HDL3中のアポA-1の測定
血清を試料とし、本発明法によりHDL3中のアポA-1を測定し、その測定値を超遠心法によって得られるHDL3中のアポA-1値と比較した。
すなわち、検体300μLにヘパリンナトリウム1000U/mL及びMnCl2 100mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウム12mg/mLからなる測定試薬60μＬを添加し、37℃で30分間反応させた。その後18,500gで10分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販されているキットアポA-1オートＮ第一（第一化学薬品社製）を使用して日立7180型自動分析装置によってHDL3中のアポA-1を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重1.125〜1.210の分画を回収し、アポA-1を測定してHDL3中アポA-1値とした。この結果を図３に示す。図３中、アポA-1の単位は、mg/dLである。図３に示すように本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
Measurement of ApoA-1 in HDL3 Using serum as a sample, ApoA-1 in HDL3 was measured by the method of the present invention, and the measured value was compared with the value of ApoA-1 in HDL3 obtained by ultracentrifugation .
Specifically, heparin sodium 1000 U / mL,
HDL3中のアポA-2の測定
血清を試料とし、本発明法によりHDL3中のアポA-2を測定し、その測定値を超遠心法によって得られるHDL3中のアポA-2値と比較した。
すなわち、血清試料300μＬにヘパリンナトリウム1000U/mL及びMnCl2 100mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウム12mg/mLからなる測定試薬60μＬを添加し、37℃で30分間反応させた。その後18,500gで10分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販されているキットアポA-2オートＮ第一（第一化学薬品社製）を使用して日立7180型自動分析装置によってHDL3中のアポA-2を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心分離を行い比重1.125〜1.210の分画を回収し、アポA-2を測定してHDL３中アポA-2値とした。この結果を図４に示す。図４中、アポA-1の単位は、mg/dLである。図４に示すように本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
Measurement of ApoA-2 in HDL3 Using serum as a sample, ApoA-2 in HDL3 was measured by the method of the present invention, and the measured value was compared with the value of ApoA-2 in HDL3 obtained by ultracentrifugation. .
That is, 60 μL of a measuring reagent comprising heparin sodium 1000 U / mL,
HDL2-Cの測定
血清を試料とし、本発明法により計算によって得られるHDL2中のコレステロールを測定し、その測定値を超遠心法によって得られるHDL2中のコレステロール値と比較した。
実施例１で使用した試薬及びHDL-C測定用試薬を用いて、血清中のHDL3-C及びHDL-Cを求め、HDL-CよりHDL3-Cを差し引くことによりHDL2-Cを求めた。また、超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重1.063〜1.125の分画を回収し、総コレステロールを測定してHDL2中コレステロール値とした。この結果を図５に示す。図５中、コレステロールの単位は、mg/dLである。
図５に示すように本発明法によって求められる結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
Measurement of HDL2-C Using serum as a sample, cholesterol in HDL2 obtained by calculation according to the method of the present invention was measured, and the measured value was compared with the cholesterol value in HDL2 obtained by ultracentrifugation.
HDL3-C and HDL-C in the serum were determined using the reagents used in Example 1 and the reagent for HDL-C measurement, and HDL2-C was determined by subtracting HDL3-C from HDL-C. In the ultracentrifugation method, serum and a specific gravity solution were mixed and then centrifuged to collect a fraction having a specific gravity of 1.063 to 1.125, and total cholesterol was measured to obtain a cholesterol level in HDL2. The result is shown in FIG. In FIG. 5, the unit of cholesterol is mg / dL.
As shown in FIG. 5, the results obtained by the method of the present invention showed a good correlation with the results obtained by the ultracentrifugation method.
本発明のHDL3の定量法及びHDL3-C測定試薬は、簡便な操作でHDL3をそれ以外のリポ蛋白と分離することができ、HDL3中のコレステロールを分別測定することができるため臨床上極めて有用である。 The HDL3 quantification method and HDL3-C measurement reagent of the present invention are extremely useful clinically because HDL3 can be separated from other lipoproteins by simple operation and cholesterol in HDL3 can be separately measured. is there.
Claims (15)
１回の遠心分離又はろ過により検体からHDL3以外のリポ蛋白を分離除去する工程
とを含む検体中のHDL3をそれ以外のリポ蛋白から分離する方法。 Adding a reagent containing heparin, divalent metal ion and dextran sulfate to the sample to aggregate lipoproteins other than HDL3, and separating and removing lipoproteins other than HDL3 from the sample by one centrifugation or filtration; For separating HDL3 in a sample containing lysine from other lipoproteins.
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012011556A1 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| WO2012011554A1 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| WO2012011563A1 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| WO2012118017A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and reagent kit for the method |
| WO2012124340A1 (en) | 2011-03-16 | 2012-09-20 | 協和メデックス株式会社 | Method for measuring cholesterol in hdl subfraction, and reagents and kit therefor |
| WO2013111820A1 (en) | 2012-01-25 | 2013-08-01 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 3 |
| WO2015012334A1 (en) | 2013-07-24 | 2015-01-29 | デンカ生研株式会社 | Method and reagent for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 3 |
| CN109813921A (en) * | 2019-02-25 | 2019-05-28 | 安徽大千生物工程有限公司 | HDL3 immunoturbidimetry detection kit and its preparation application method based on polyclonal antibody preparation |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000239300A (en) * | 1998-12-22 | 2000-09-05 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Monoclonal antibody against apolipoprotein a-i |
| WO2004053500A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method of quantifying small-sized low density lipoprotein |
| WO2007026829A1 (en) * | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantification of small-sized low density lipoprotein and kit for use in the quantification |
| WO2007037419A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for selective, simultaneous quantification of two substances in biological sample |
| JP2007325587A (en) * | 2006-05-10 | 2007-12-20 | Fujifilm Corp | Method for measuring high-density lipoprotein cholesterol |
-
2008
- 2008-03-06 JP JP2008056836A patent/JP5500777B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000239300A (en) * | 1998-12-22 | 2000-09-05 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Monoclonal antibody against apolipoprotein a-i |
| WO2004053500A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method of quantifying small-sized low density lipoprotein |
| WO2007026829A1 (en) * | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantification of small-sized low density lipoprotein and kit for use in the quantification |
| WO2007037419A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for selective, simultaneous quantification of two substances in biological sample |
| JP2007325587A (en) * | 2006-05-10 | 2007-12-20 | Fujifilm Corp | Method for measuring high-density lipoprotein cholesterol |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CLINICAL CHEMISTRY 1990; V. 36, P.591-7., JPN6013031495, ISSN: 0002571630 * |
| J LIPID RES. 1982 NOV;23(8):1206-23., JPN6013031489, ISSN: 0002571627 * |
| 動脈硬化 VOL.12 NO.4 PAGE.887-894 (1984.10), JPN6013031492, ISSN: 0002571628 * |
| 臨床病理 VOL.32 NO.11 PAGE.1235-1241 (1984.11), JPN6013031493, ISSN: 0002571629 * |
Cited By (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8932865B2 (en) | 2010-07-23 | 2015-01-13 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| CN103080748B (en) * | 2010-07-23 | 2015-05-27 | 电化生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| WO2012011563A1 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| WO2012011554A1 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| JP5671029B2 (en) * | 2010-07-23 | 2015-02-18 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 3 |
| KR20130043185A (en) | 2010-07-23 | 2013-04-29 | 덴카 세이켄 가부시키가이샤 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| CN103080748A (en) * | 2010-07-23 | 2013-05-01 | 电化生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| CN103080332A (en) * | 2010-07-23 | 2013-05-01 | 电化生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| WO2012011556A1 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| EP2607901A1 (en) * | 2010-07-23 | 2013-06-26 | DENKA SEIKEN Co., Ltd. | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| AU2011280496B2 (en) * | 2010-07-23 | 2015-08-20 | Denka Company Limited | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| KR101891984B1 (en) | 2010-07-23 | 2018-08-27 | 덴카 세이켄 가부시키가이샤 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| JP5706418B2 (en) * | 2010-07-23 | 2015-04-22 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 3 |
| EP2607901A4 (en) * | 2010-07-23 | 2014-01-15 | Denka Seiken Kk | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| US9151768B2 (en) | 2010-07-23 | 2015-10-06 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| CN103124906A (en) * | 2010-07-23 | 2013-05-29 | 电化生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| CN103080332B (en) * | 2010-07-23 | 2014-11-12 | 电化生研株式会社 | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
| JP5956420B2 (en) * | 2011-02-28 | 2016-07-27 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 2 and reagent kit therefor |
| KR20140027108A (en) | 2011-02-28 | 2014-03-06 | 덴카 세이켄 가부시키가이샤 | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and reagent kit for the method |
| US20180306823A1 (en) * | 2011-02-28 | 2018-10-25 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and reagent kit for the method |
| US20140045201A1 (en) * | 2011-02-28 | 2014-02-13 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and reagent kit for the method |
| US10955426B2 (en) | 2011-02-28 | 2021-03-23 | Denka Company Limited | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and reagent kit for the method |
| WO2012118017A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | デンカ生研株式会社 | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and reagent kit for the method |
| US10031145B2 (en) * | 2011-02-28 | 2018-07-24 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and reagent kit for the method |
| US20130344518A1 (en) * | 2011-03-16 | 2013-12-26 | Kumamoto Health Science University | Method for measuring cholesterol in hdl subfraction, and reagents and kit therefor |
| CN103415623A (en) * | 2011-03-16 | 2013-11-27 | 协和梅迪克斯株式会社 | Method for measuring cholesterol in hdl subfraction, and reagents and kit therefor |
| US9080201B2 (en) * | 2011-03-16 | 2015-07-14 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for measuring cholesterol in HDL subfraction, and reagents and kit therefor |
| WO2012124340A1 (en) | 2011-03-16 | 2012-09-20 | 協和メデックス株式会社 | Method for measuring cholesterol in hdl subfraction, and reagents and kit therefor |
| KR101924663B1 (en) * | 2011-03-16 | 2018-12-03 | 교와 메덱스 가부시키가이샤 | Method for measuring cholesterol in hdl subfraction, and reagents and kit therefor |
| JP5969978B2 (en) * | 2011-03-16 | 2016-08-17 | 協和メデックス株式会社 | Method for measuring cholesterol in HDL subfraction, measuring reagent and measuring kit |
| US10018641B2 (en) | 2012-01-25 | 2018-07-10 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 3 |
| KR20140131519A (en) | 2012-01-25 | 2014-11-13 | 덴카 세이켄 가부시키가이샤 | Method for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 3 |
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| US11041869B2 (en) | 2013-07-24 | 2021-06-22 | Denka Company Limited | Method and reagent for quantifying cholesterol in high density lipoprotein 3 |
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