JP2009198356A - 核磁気共鳴測定装置および核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＮＭＲ測定装置の制御性を向上させる技術を提供する。
【解決手段】測定対象となる高分子化合物を含む試料溶液と、リカンドとなる低分子化合物を含む低分子化合物溶液を用いた循環フロー方式を採用する。試料溶液と低分子化合物溶液とが混合される混合フィルタ３２、および分離される分離フィルタ３４と、分離フィルタ３４から排出された試料溶液が混合フィルタ３２に注入される経路１と、分離フィルタ３４から排出された低分子化合物溶液が混合フィルタ３２に注入される経路２と、混合フィルタ３２から排出された混合溶液が容器１０を通じて分離フィルタ３４に注入される経路３と、を備えている。
【選択図】図１

Description

本発明は、核磁気共鳴測定装置およびそれを用いた測定技術に関し、特に、タンパク質などの高分子化合物の核磁気共鳴測定に適用して有効な技術に関する。

タンパク質など生体内で機能を有する分子の分子量は薬などに用いられる低分子化合物に比べて大きく高分子化合物としての特性を有している。タンパク質に代表される高分子化合物は溶液中で分子機能を有しており、この機能は特定の低分子化合物と結合することで阻害されたり促進されたりする。特定の低分子化合物と高分子化合物の結合あるいは相互作用は、多くの方法で検出されている。

特に、高分子化合物あるいは低分子化合物の分子構造の情報を直接観測できる核磁気共鳴測定（以下、ＮＭＲ測定という。）では、化合物濃度に対する測定スペクトルの変化から高分子化合物と低分子化合物の解離定数、反応速度の評価だけでなく化合物の構造に基づいた相互作用解析が可能である。特表２００３−５１０６０８号公報（特許文献１）には、ＮＭＲ測定によるタンパク質と低分子化合物の相互作用を測定する方法について記載されている。

ＮＭＲ測定に用いる高分子化合物のうちタンパク質は、自然界に存在する生命体から抽出する方法、目的タンパク質の生成に関連する遺伝子を組み込んだ大腸菌等を利用した大量発現系から抽出する方法、生きた細胞を用いずにタンパク質を大量発現させる無細胞発現系を利用する方法などによって生成される。また、タンパク質を構成する主な元素である水素、炭素、窒素に対して同位体放射元素による標識（以下、ラベル化という。）を行う場合がある。このラベル化には、タンパク質を構成する水素、炭素、窒素の３元素を組み合わせてラベル化する方法、すべてをラベル化する全標識方法、特定のアミノ酸残基に属する原子のみをラベル化する選択的標識などの方法がある。どの方法においてもラベル化の処理コストは高額である。

核磁気共鳴測定装置（以下、ＮＭＲ測定装置という。）は、典型的には静磁場（Ｂ_０）を生じさせる磁石と、この磁石の内側の空間に配置された核磁気共鳴プローブとを含む。この核磁気共鳴プローブには、目的とする試料にＲＦ磁場（Ｂ_１）を加え、そして加えられた磁場に対する試料の反応（応答）を検出するための１つ以上のコイルが含まれる。

従来の核磁気共鳴プローブには、静置試料プローブおよびフロースループローブが含まれる。静置試料プローブではガラス管またはアンプル（以下、試料管という）の中に試料を加え、この試料管をＮＭＲ測定装置の所定の位置にセットしてから測定を開始する方法が行われている。

従来の静置試料プローブを用いた滴定測定では、開口部を持つ試料管で低分子化合物の滴定を行いながらＮＭＲ測定を行うことで、濃度増加に対するＮＭＲスペクトル変化の観測が可能である。しかしながら、試料溶液は高分子化合物、薬効評価対象の低分子化合物、その他の試薬が混合した溶液であるため、一旦、ある濃度の低分子化合物を含んだ条件に達した試料溶液を用いて、その濃度以下の条件でＮＭＲ測定を行うことは困難である。

また、試料管の体積が少量であるため、低分子化合物の滴定は試料溶液全体の体積増大を生じさせ、高分子化合物試料濃度の変化および試料溶液の液面位置の変化を生じる。これらの変化を抑制するためには、試料溶液の体積に対して滴下する体積を出来るだけ少なくする必要がある。しかし、滴下する体積を小さくするためには、低分子化合物濃度を上げる必要があるが、滴下溶液の濃度は低分子化合物の溶解度によってその上限が決まり、一般に物質の溶解度は溶媒の種類や温度などによって大きく異なる。

このように滴下による低分子化合物濃度調整では試料体積の変動が生じる。またこの変動の大きさは低分子化合物と高分子化合物の組合せ、溶媒、温度によって変化する。そして濃度変化方向も１方向である。

一方、従来のフロースループローブは、試料入口、試料出口、および入口と出口との間に延びる内部の管部を含む。この内部の管部には、試料を保持するためのセルが含まれる。試料は試料入口から内部の管部を流れてセルに入る。測定後には管部を流れてプローブ外へと取り除かれる。

従来のフロースループローブとロボット式の試料移送システムの組み合わせが使用されている。そのようなシステムでは、複数の測定条件に調整した試料を、複数の容器にあらかじめ準備する必要がある。試料は容器から試料を取り出せる装置を経由してあらかじめセットされたフロースループローブへ試料を送り込まれる。１つの試料に対してＮＭＲ測定が終了すると、試料はプローブ外に排出される。特表２００４−５３４９５８号公報（特許文献２）には、試料を送りこむシステムについて記載されている。

従来のフロースループローブと試料移送システムの組み合わせでは、複数の濃度条件に調整した試料をあらかじめ準備することが求められる。したがって、測定条件数の一定濃度の高分子化合物溶液が必要となり、試料に要する費用が高価となる。

また、測定条件範囲が未知の高分子化合物や低分子化合物では、好適な測定条件範囲や条件変化の度合いが確定するまで機能評価の測定全体を繰り返し行う問題で悩まされ得る。特開２００７−３１５８２６号公報（特許文献３）には、単純な循環路を利用してＮＭＲ測定の繰返しを行うシステムが記載されている。
特表２００３−５１０６０８号公報 特表２００４−５３４９５８号公報 特開２００７−３１５８２６号公報

本発明者らが検討したＮＭＲ測定装置について図７を用いて説明する。本発明者らが検討したＮＭＲ測定装置は、測定対象となるタンパク質などの高分子化合物およびリカンドとなる低分子化合物を含む混合溶液が保持される容器１０と、容器１０で保持されている混合溶液に磁場を加えるためのスプリット型の磁石２０と、容器１０に取り付けられた核磁気共鳴プローブ２４と、核磁気共鳴プローブ２４からのＮＭＲ信号を記憶する送受信システムとを備え、ＮＭＲ測定を行う装置である。

容器１０は混合溶液の排出口１２と注入口１４を有しており、閉じられた経路５を構成する試料移送管１６１６と接続されている。この試料移送管１６１６には、高分子化合物を含む試料溶液を注入するためのシリンジ９０、および低分子化合物を含む低分子化合物溶液を注入するためのシリンジ８０が設けられている。例えば、まず低分子化合物溶液がシリンジ８０から試料移送管１６１６に注入され、次いで、試料溶液がシリンジ９０から試料移送管１６１６に注入されて、循環ポンプ（図示しない）によって混合溶液として経路５を循環する。

循環されて均一化された混合溶液は、その循環を停止することにより容器１０内に止まりＮＭＲ測定が行われる。

しかしながら、このような本発明者らが検討したＮＭＲ測定装置では、低分子化合物濃度を変化させながらＮＭＲ測定を行う場合、あらかじめ高分子化合物を注入しない条件下でのＮＭＲ信号を取得し、低分子化合物濃度を調べた後、同条件下で高分子化合物を注入して容器１０内の混合溶液のＮＭＲ測定を繰り返して行うため、その都度、低分子化合物濃度のＮＭＲ測定を行う必要があった。

本発明の目的は、ＮＭＲ測定装置の制御性を向上させる技術を提供することにある。

本発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。

本願において開示される発明のうち、代表的なものの概要を簡単に説明すれば、次のとおりである。

本発明の一実施の形態におけるＮＭＲ測定装置は、第１化合物（高分子化合物）および第２化合物（低分子化合物）を含む混合溶液が保持される容器と、前記容器で保持されている前記混合溶液に磁場を加えるための磁石と、前記容器に取り付けられた核磁気共鳴プローブと、を備え、測定対象となる前記第１化合物を含む第１溶液（試料溶液）と、リカンドとなる前記第２化合物を含む第２溶液（低分子化合物溶液）を用いた循環フロー方式を採用するものである。

このＮＭＲ測定装置は、更に前記第１溶液と前記第２溶液とが混合される混合フィルタ、および分離される分離フィルタと、前記分離フィルタから排出された前記第１溶液が前記混合フィルタに注入される第１経路、前記分離フィルタから排出された前記第２溶液が前記混合フィルタに注入される第２経路、および前記混合フィルタから排出された前記混合溶液が前記容器を通じて前記分離フィルタに注入される第３経路を構成する管と、を備えている。

以下、本願において開示される発明におけるＮＭＲ測定装置の構成、動作方法、およびＮＭＲ測定方法について説明する。

（ＮＭＲ測定装置の構成）
ＮＭＲ測定装置は、静磁場を発生する磁石（マグネット）、試料へ電磁波を照射し試料由来のＦＩＤ信号を検出するアンテナ、照射電磁波を生成する送信ユニット、検出したＦＩＤ信号を処理する受信ユニット、そして試料をＮＭＲ測定に適した位置に固定する容器を有する。この容器へ試料を注入する管と容器から試料を排出する管を設置する。

試料を注入する管（第１試料移送管）には、低分子化合物溶液と高分子化合物溶液（試料溶液）を混合するフィルタ（混合フィルタ）を接続する。混合フィルタには、低分子化合物溶液注入口、試料溶液注入口、低分子化合物溶液と試料溶液が混合された混合溶液の混合溶液排出口の３つの口があり、第１試料移送管はその排出口に接続されている。試料溶液注入口には流路切り替えバルブ（第１バルブ）が取り付けられている。

また、容器から混合溶液を排出する管（第２試料移送管）には、低分子化合物溶液と試料溶液を分離するフィルタ(分離フィルタ）を接続する。分離フィルタには、試料溶液排出口、低分子化合物溶液排出口、混合溶液注入口の３つの口があり、第２試料移送管は混合溶液注入口に接続されている。試料溶液排出口には流路切り替えバルブ（第２バルブ）が取り付けられている。

また、第１バルブと第２バルブを管（第３試料移送管）にて接続し、試料溶液の循環が可能な流路を形成する。

また、分離フィルタの低分子化合物溶液排出口と低分子化合物溶液制御部の注入口を管（第４試料移送管）で接続する。また、低分子化合物溶液制御部の排出口と混合フィルタの低分子化合物溶液注入口を管（第８試料移送管）で接続する。以上の配置により、低分子化合物溶液が、低分子化合物溶液制御部、混合フィルタ、分離フィルタ、そして再び低分子化合物溶液制御部へと循環する流路が形成される。

低分子化合物溶液制御部は、排出用バルブ、低分子化合物溶液注入部、注水用バルブ、循環ポンプからなる。排出バルブと低分子化合物注入部は第５試料移送管で接続される。低分子化合物注入部と注水用バルブは第６試料移送管で接続される。注水バルブと循環ポンプは第７試料移送管で接続される。

以上の構成および流路により、高分子化合物と低分子化合物の混合溶液が通過する部分のループ状流路と、低分子化合物溶液の循環的な流れを実現する流路の２つの循環流路が可能となる。この構成により、低分子化合物溶液の注入、高分子化合物溶液の注入、低分子化合物溶液の循環、低分子化合物溶液の調整と独立した混合溶液の均一化制御が可能となる。

さらに、混合溶液の通過部分である第１試料移送管あるいは第２試料移送管に円二色性スペクトル計やラマン分光計を設置する。濃度測定に適した吸光度計（濃度計）、水素イオン濃度計（ｐＨ計）を第１試料移送管と第２試料移送管それぞれに設置する。そして、低分子化合物溶液のみの通過部分である、第４、第５、第６、第７、第８試料移送管のどれか１つに濃度計、ｐＨ計を設置する。設置した円二色性スペクトル計、ラマン分光計、吸光度計（濃度計）、水素イオン濃度計（ｐＨ計）は各測定時刻とデータを組として表示あるいは記録あるいはデータ転送する機能を有する。各測定装置に付属あるいは内蔵した時計は、同一の時刻になるように調整可能である。

（低分子化合物濃度の測定方法）
次に前記構成における低分子化合物濃度の測定について説明する。

少なくとも第４、第５、第６、第７、または第８試料移送管のいずれか１つに設置した濃度計を用いて低分子化合物濃度を測定する。吸光度計（濃度計）を利用した濃度測定方法は、広く知られている方法である。設置した濃度計では、測定時刻と濃度データの組が表示あるいは記録されている。この測定時刻と濃度データの組を、記録媒体付きコンピュータあるいは紙などへ記録する。濃度測定と測定時刻と濃度データの組の記録は、測定者の開始指示から終了指示までの間、連続的に行われる。

（混合溶液の操作）
次に前記構成における高分子化合物と低分子化合物の溶液状態の操作について説明する。

第１、第２試料移送管に設置した吸光度計（濃度計）を用いて混合溶液の吸光度を測定する。測定する波長は注入する高分子化合物や低分子化合物の特性に合わせて選択する。分光機能が付いている吸光度計の場合には、測定波長の選択は観測帯域の選択として行う。溶液の吸光度は溶質の変化に応じて変化するので、低分子化合物のみが存在する溶液に高分子化合物が混入すると、高分子化合物の量（濃度）に応じて吸光度が変化する。この変化を利用して、注入した高分子化合物の位置判断、混合溶液の濃度均一性評価を行う。

混合溶液の循環を行わない場合には、第１および第２バルブの操作により第３試料移送管を混合溶液が通過しない流路にする。このとき、第１バルブに取り付けた注入用シリンジ等から注入された高分子化合物は、混合フィルタ、第１試料移送管、容器、第２試料移送管、分離フィルタ、第２バルブを経て、第２バルブに取り付けた排出用シリンジへ移動する。

ＮＭＲ測定を行うためには、測定の間、高分子化合物を容器の中に保持する必要がある。高分子化合物の注入用シリンジから容器までの移動のモニタのために、第１試料移送管に設置した吸光度計を利用する。また、容器から排出用シリンジまでの移動のモニタのために、第２試料移送管に設置した吸光度計を利用する。測定者のモニタ開始指示から終了指示の間、連続的に吸光度測定と、測定時刻と吸光度データの組の記録を行う。

高分子化合物の注入後、第１試料移送管に設置した吸光度計の吸光度の変化が生じる。この後、第２試料移送管に設置した吸光度計が変化した時に溶液循環を停止しＮＭＲ測定を行う。このとき、高分子化合物は容器の中に保持されており、高分子化合物を含んだ溶液のＮＭＲ測定に適した状態になっている。ＮＭＲ測定の終了後、溶液循環を開始する。その後、第１試料移送管および第２試料移送管に設置した吸光度計の値が、低分子化合物溶液と同様な値に戻った時には、高分子化合物は容器から排出され、第２試料移送管から分離フィルタへ移動した状態になっている。このように、混合溶液の循環を行わない場合には、循環ポンプによる循環動作のオン・オフのみで、高分子化合物の移動・保持を行う。この後、排出用シリンジを用いて高分子化合物を回収する。

一方、混合溶液の循環を行う場合には、第１および第２バルブの操作により第３試料移送管を混合溶液が通過できる流路にする。この場合、バルブ操作を伴う高分子化合物の注入過程と排出過程の２過程が必要である。注入過程では、まず、第１バルブに取り付けた注入用シリンジから高分子化合物を注入する。そして、第１バルブを切替え、注入用シリンジから第３試料移送管へと流路を切替る。高分子化合物を含む溶液は混合フィルタ、第１試料移送管、容器、第２試料移送管、分離フィルタ、第２バルブを経て、第３試料移送管、第１バルブへ至る。高分子化合物に関する流路は閉じているので、高分子化合物は前記ルートを循環する。なお、循環効率を高めるため、第３試料移送管に循環用第２ポンプを設置してもよい。

この循環中の溶液状態の変化は、前記第１試料移送管および第２試料移送管に設置した吸光度計で連続的にモニタされている。次に、第１試料移送管および第２試料移送管に設置した吸光度計の値の時間に対するばらつきが同程度になったとき、混合溶液での高分子化合物の濃度が均一になったと判断する。この状態では、高分子化合物は容器の中にも均一濃度で満たされているので、循環を停止し、ＮＭＲ測定を行う。

ＮＭＲ測定の終了後の排出過程では、まず第１バルブおよび第２バルブにおいて、第３試料移送管との流路を閉ざす。この後、低分子化合物溶液の循環を開始すると、高分子化合物は徐々に分離フィルタと第２バルブ間の接続部分に集まる。そして、前記第１試料移送管および第２試料移送管に設置した吸光度計の値が、低分子化合物のみの値に近づいたら、第２バルブの流路を排出用シリンジへ切替えて、高分子化合物を含む溶液を回収する。

再び、第１バルブおよび第２バルブを第３試料移送管へと切替えて、混合溶液の閉ループを作り、混合溶液を循環させる。また、前記第１試料移送管および第２試料移送管に設置した吸光度計の値が、再び、混合溶液の値に近づいたら、第１バルブおよび第２バルブを操作し、第３試料移送管との流路を閉ざし、低分子化合物溶液の循環により高分子化合物を排出用シリンジで回収する。前記手順を数回繰り返すことで、高分子化合物を回収することができる。

（滴定測定方法）
循環フロー方式の試料溶液調整において、高分子化合物濃度一定のもと、低分子化合物濃度を変化させる場合の測定方法を説明する。

（注水）
まず、注水バルブ、排水バルブを開き、第１バルブと第２バルブをともに第３試料移送管側へ流路を切替える。次に、循環ポンプを駆動させ、注水バルブから純水を注入する。純水は第８試料移送管を通り、混合フィルタを満たし、排出口と試料溶液注入口の両方に達する。混合フィルタの排出口に到達した純水は、第１試料移送管、容器、第２試料移送管を通り、分離フィルタに達する。同様に、混合フィルタの試料溶液注入口に到達した純水は、第１バルブ、第３試料移送管、第２バルブを通り、分離フィルタに達する。分離フィルタに達した純水は、第４試料移送管を通り、排水バルブから排出される。

（バッファ液へ交換）
一旦、循環ポンプを停止させ、注水バルブの口をバッファ液の容器へ取り替える。その後、循環ポンプを駆動させ、バッファ液を循環路全体へ送り込む。送り込みが終了したら注水バルブを閉じる。

（高分子化合物の注入および均一化）
循環ポンプによる循環を行い、第１バルブの流路を注入用シリンジ側とする。次に第１バルブに取り付けた注入用シリンジから高分子化合物を注入する。そして、第１バルブを切替え、注入用シリンジから第３試料移送管へと流路を切替える。高分子化合物を含む溶液は混合フィルタ、第１試料移送管、容器、第２試料移送管、分離フィルタ、第２バルブを経て、第３試料移送管、第１バルブへ至る。高分子化合物に関する流路は閉じているので、高分子化合物は前記ルートを循環する。この循環中の溶液状態の変化は、前記第１試料移送管および第２試料移送管に設置した吸光度計で連続的にモニタされている。次に、第１試料移送管および第２試料移送管に設置した吸光度計の値の時間に対するばらつきが同程度になったとき、混合溶液での高分子化合物の濃度が均一になったと判断する。

（滴定測定）
以下に低分子化合物溶液を注入して循環路内の低分子化合物濃度を増加させる過程について説明する。特定の低分子化合物を含まない溶液を用いて、同じ手順を実施することで、特定の低分子化合物濃度のみを減少させる滴定測定が実施できる。最初に、第４試料移送管あるいは第５試料移送管あるいは第６試料移送管あるいは第７試料移送管あるいは第８試料移送管に設置した濃度計を用いて低分子化合物濃度測定を開始する。次に、循環ポンプを駆動させて、溶液循環を開始する。そして、低分子化合物溶液注入用シリンジポンプを用いて、低分子化合物溶液を循環路内に注入する。低分子化合物用の濃度計の値が、一定値あるいは一定のばらつき範囲内に収束したら、循環路内部の低分子化合物濃度は均一化されたと判断する。低分子化合物濃度が目的の濃度に達したならば、循環を停止し、測定を行う。

低分子化合物濃度が目的の濃度より低いならば、前記低分子化合物溶液の注入過程を行い、濃度を増加させる。低分子化合物濃度が目的の濃度より高い場合には、低分子化合物を含まない溶液で、前記注入過程を行い、濃度を減少させる。測定者が設定していたすべての低分子化合物濃度条件に対して、前記低分子化合物濃度を増加あるいは減少させる過程と、測定を行う。

（測定）
ここで測定とは、ＮＭＲ測定だけでなく、第１および第２試料移送管に設置した他測定装置（吸光度計、円二色性スペクトル計、ラマン分光計、電気伝導度計）による測定を含む。

本願において開示される発明のうち、代表的なものによって得られる効果を簡単に説明すれば以下のとおりである。

本発明の一実施の形態によれば、測定対象となる第１化合物に対する第２化合物の量を、第２化合物溶液の濃度によって変化させる循環フロー方式によって、ＮＭＲ測定装置の制御性を向上させることができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、実施の形態を説明するための全図において、同一の機能を有する部材には同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、以下の実施の形態を説明する図面においては、構成を分かり易くするためにハッチングを付す場合がある。

（実施の形態１）
本発明に係るＮＭＲ測定装置は、タンパク質などの高分子化合物および高分子化合物より分子量の低い低分子化合物を含む混合溶液に対してＮＭＲ測定を行う装置であり、例えば、一定の高分子化合物の量の下で低分子化合物と高分子化合物の濃度比を自由に制御してＮＭＲスペクトルの変化を測定できる装置である。

本発明の循環フロー方式の試料溶液調整を利用した滴定測定における、ＮＭＲ測定と他の測定の同時測定や濃度制御を向上させる装置構成および方法の好適な実施の形態について図を参照して、以下に説明する。

（ＮＭＲ測定装置の構成）
まず、試料溶液の流れる流路の配置について説明する。図１に示したように、試料に磁場を加えるためのスプリット型磁石２０の内部に配置された空間（ボア）２２に核磁気共鳴プローブ２４を置く。核磁気共鳴プローブ２４に、試料の注入口１４と排出口１２を有する試料を保持する容器１０を置く。容器１０の注入口１４に第１試料移送管１６０２を接続する。そして、第１試料移送管１６０２に低分子化合物溶液と試料溶液（高分子化合物溶液）を混合する混合フィルタ３２を接続する。混合フィルタ３２に低分子化合物溶液注入口５１と試料溶液注入口５２と混合溶液排出口５０が設けられている。混合溶液排出口５０には第１試料移送管１６０２が接続されている。容器１０の排出口１２に第２試料移送管１６００を接続する。

第２試料移送管１６００に低分子化合物溶液と試料溶液を分離する分離フィルタ３４を接続する。分離フィルタ３４には試料溶液排出口６２と低分子化合物溶液排出口６１と混合溶液注入口６０が設けられている。混合溶液注入口６０には第２試料移送管１６００が接続されている。混合フィルタ３２の試料溶液注入口５２に第１バルブ７２を接続する。同様に、分離フィルタ３４の試料溶液排出口６２にも第２バルブ７０を接続する。

第１バルブ７２の１つの口と第２バルブ７０の１つの口を第３試料移送管１６０４で接続する。分離フィルタ３４の低分子化合物排出口６１に第４試料移送管１６０６を接続する。第４試料移送管１６０６には排出用バルブ７４を接続する。排出用バルブ７４に第５試料移送管１６０８を接続する。第５試料移送管１６０８に低分子化合物溶液注入部３０を接続する。低分子化合物溶液注入部３０に第６試料移送管１６１０を接続する。第６試料移送管１６１０に注水用バルブ７６を接続する。注水用バルブ７６に第７試料移送管１６１２を接続する。第７試料移送管１６１２に循環ポンプ１００を接続する。循環ポンプ１００と混合フィルタ３２の低分子化合物溶液注入口５１を第８試料移送管１６１４で接続する。

以上の構成および流路により、高分子化合物と低分子化合物の混合溶液が通過する部分のループ状流路と、低分子化合物溶液の循環的な流れを実現する流路の２つの循環流路が可能となる。

ここで、本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置の構成について概略すると、本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置は、高分子化合物およびそれより分子量の低い低分子化合物を含む混合溶液が保持される容器１０と、容器１０で保持されている混合溶液に磁場を加えるための磁石２０と、容器１０に取り付けられた核磁気共鳴プローブ２４と、を備えている。容器１０は、例えば石英ガラスから構成されている。磁石２０は、例えば超伝導磁石から構成され、例えば３００ＭＨｚ〜１ＧＨｚに対応した磁場を発生することができるものである。核磁気共鳴プローブ２４は、例えば、容器１０の周囲にコイル２８が巻かれ、そのコイル２８から測定対象の混合溶液に対し、電磁波パルスを照射し、ＮＭＲ信号の検出を行うことができる。

更に、本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置は、高分子化合物を含む試料溶液と低分子化合物を含む低分子化合物溶液とを混合し、混合溶液として排出する混合フィルタ３２と、注入された混合溶液から試料溶液と低分子化合物溶液とに分離する分離フィルタ３４と、を備えている。混合フィルタ３２および分離フィルタ３４は、タンパク質などの高分子化合物と他の成分を分離できるものである限り、特に限定はされないが、好ましくは、高分子化合物は通過できない程度であって低分子化合物を含む他の成分が通過できる程度の径の細孔を持った中空糸膜から構成される。すなわち、混合溶液内の高分子化合物の分子量に合わせて中空糸膜の細孔サイズを選択して使用できるので、高分子化合物以外の成分（例えば、低分子化合物）の限外濾過操作を好適に行うことができる。

更に、本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置は、分離フィルタ３４から排出された試料溶液が混合フィルタ３２に注入される経路１、分離フィルタ３４から排出された低分子化合物溶液が混合フィルタ３２に注入される経路２、および混合フィルタ３２から排出された混合溶液が容器１０を通じて分離フィルタ３４に注入される経路３を構成する管を備えている。図１に示したＮＭＲ測定装置では、経路１を構成する管は、第３試料移送管１６０４から構成されている。また、経路２を構成する管は、第４、第５、第６、第７、第８試料移送管１６０６、１６０８、１６１０、１６１２、１６１４から構成されている。また、経路３を構成する管は、第１試料移送管１６０２と第２試料移送管１６００から構成されている。これら経路１〜３を構成する管の材質は、例えばＮＭＲ測定対象の性質によって選択すべきであり、例えば、タンパク質などの生体関連の高分子化合物に対する測定では、ポリエチレンエチレンケトン（ＰＥＥＫ）などを用いることができる。また、管の内径は、例えば０．５〜０．０６５ｍｍの範囲とすることができる。

更に、本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置は、経路２に設けられ、低分子化合物が所定の濃度で調整された低分子化合物溶液を注入する注入部３０と、経路２に設けられ、経路２および経路３に低分子化合物溶液を循環させる循環ポンプ１００と、を備えている。注入部３０は、例えば加圧式のシリンジポンプを電子制御することができ、低分子化合物を含む溶液を入れた低分子化合物溶液注入用シリンジ８０を制御しながら加圧送液を行い、低分子化合物溶液を経路２に注入する作業を好適に行うことができる。同様に、注入部３０は、バッファ液注入用シリンジ８２を制御しながら加圧送液を行うことで経路２にバッファ液を注入できる。循環ポンプ１００は、例えば、高速液体クロマトグラフィで用いられるものが好適である。電子制御可能なステッピングモータなどを用いてプランジャーを駆動し、溶液１０と経路２に定圧送液が可能なものが望ましい。

このような構成の本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置では、測定対象となる高分子化合物（第１化合物）に対する低分子化合物（第２化合物）の量を、低分子化合物溶液の濃度によって変化させる循環フロー方式によって、濃度制御性を向上させることができる。

次に、測定機器の配置について説明する。図１に示すように、第１試料移送管１６０２または第２試料移送管１６００に測定機器３１０として例えば円二色性スペクトル計（ＣＤ計）を設置する。図２に第２試料移送管１６００への設置例を示す。第２移送管１６００を２つに分け、その間にＣＤ計としての測定機器３１０を設置する。ＣＤ計としての測定機器３１０の溶液入口３１２と溶液出口３１４で第２試料移送管１６００と接続する。接続方法は、ＨＰＬＣなどの溶液を取り扱う作業者なら既知のオシネ等を利用した方法を用いるのが好適である。ＣＤ計としての測定機器３１０は測定時刻と測定値をセットで記録あるいは表示あるいはデータ転送する機能を有する。

第１試料移送管１６０２に第１濃度計３００を設置し、第２試料移送管１６００に第２濃度計３０２を設置する。第１濃度計３００および第２濃度計３０２の設置は図２に示したＣＤ計としての測定機器３１０の設置例と同様な方法で行う。これら第１濃度計３００、第２濃度計３０２は、溶液の吸光度を測定するものである。溶液濃度と吸光度の間に比例関係が成立する原理を利用して、測定した吸光度から濃度を計算することができる。第１濃度計３００、第２濃度計３０２は、吸光度を測定し、測定した時刻と測定値をセットで記録あるいは表示あるいはデータ転送する機能を有する。また、計算した濃度も併せて、記録あるいは表示あるいはデータ転送してもよい。

また、第４、第５、第６、第７、第８試料移送管１６０６、１６０８、１６１０、１６１２、１６１４で接続された、混合フィルタ３２の低分子化合物溶液注入口５１と分離フィルタ３４の低分子化合物溶液排出口６１の間に第３濃度計３０４を設置する。第３濃度計３０４の設置は図２に示した測定機器３１０の設置例と同様な方法で行う。この第３濃度計３０４も吸光度を測定し、測定した時刻と測定値をセットで記録あるいは表示あるいはデータ転送する機能を有する。また、計算した濃度も併せて、記録あるいは表示あるいはデータ転送してもよい。

設置した測定機器３１０、第１濃度計３００、第２濃度計３０２、第３濃度計３０４は、それぞれ、測定時刻と測定値をセットで表示あるいはデータ転送が可能なので、観測者がこれらのデータをリアルタイムに比較することが可能である。

図１にはＮＭＲ信号を記録する送受信システム２６、第１濃度計３００、第２濃度計３０２、第３濃度計３０４、およびＣＤ計としての測定機器３１０とこれらからのデータを収集および表示するコンピュータ４００の間の接続関係を示す。このように各測定部のデータ転送機能を用いることで、各測定時刻と測定値の組を記録し、時刻をもとにして各測定値を比較することができる。

更に、図１に示すように、循環路内部の溶存空気を取り除くために循環ポンプ１００の第７試料移送管１６１２側にデガッサー（脱気装置）２００を取り付けてもよい。また、循環効率を高めるため、第３試料移送管１６０４に循環用第２ポンプ１０２を設置してもよい。なお、測定機器３１０として、ＣＤ計の代わりにラマン分光計やｐＨ計、電気伝導度計を設置し、ＮＭＲとの同時的測定を行ってもよい。

（滴定測定手順）
本実施の形態における核磁気共鳴測定装置を用いた滴定測定では、高分子化合物の濃度を一定に保ち、低分子化合物の濃度を自由に変化することができる。高分子化合物と低分子化合物の濃度比を変える滴定測定の手順について説明する。

高分子化合物として広範囲の種類のタンパク質を、低分子化合物として薬候補化合物（リガンド）を用いることが出来る。バッファ液は各タンパク質の性質にあわせて選択する。ここで、好適な一例として、高分子化合物としてウシ血清タンパク質、低分子化合物としてＬ−トリプトファン、バッファ液としてリン酸バッファの組合せを挙げる。

図３に示すように、滴定測定全体の概要は以下の手順からなる。まず、循環路への注水２０１０、バッファ液への交換２０２０を行い、循環路全体を溶液で満たす。次に、低分子化合物濃度の連続測定の開始２０３０、混合溶液の連続測定の開始２０４０を行う。そして、高分子化合物溶液の注入と高分子化合物溶液の均一化２０５０を行い、容器１０を含む循環経路内の濃度均一化を行う。そして、低分子化合物溶液の注入２０６０、低分子化合物濃度の均一化２０７０、測定２０８０を、濃度調整を行いながら繰り返し実施する。測定終了後には、高分子化合物の回収を行い、純水での洗浄を行う。

前記手順において、低分子化合物溶液の注入と濃度均一化を繰返し行うと、低分子化合物溶液を含む余剰体積を排出用バルブ７４から排出しながら循環路内部の低分子化合物濃度は増大する。一方、高分子化合物は混合フィルタ３２と分離フィルタ３４によって容器１０を含む循環路の中に閉じ込められる形になるので、どんなに低分子化合物溶液を注入しても排出用バルブ７４から排出されない。従って、高分子化合物の濃度は一定である。この低分子化合物溶液の注入の代わりに、対象とする低分子化合物を含まない溶液の注入を行っていくと、循環路内部の低分子化合物濃度は低下し、高分子化合物濃度は一定に保たれることになる。

（循環路への注水２０１０）
まず、注水用バルブ７６、排水用バルブ７４を開け、第１バルブ７２と第２バルブ７０をともに第３試料移送管１６０４側へ流路を切替える。次に、循環ポンプ１００を駆動させ、注水用バルブ７６から純水を注入する。純水は第８試料移送管１６１４を通り、混合フィルタ３２を満たし、混合溶液排出口５０と試料溶液注入口５２の両方に達する。その後、混合フィルタ３２の混合溶液排出口５０に到達した純水は、第１試料移送管１６０２、容器１０、第２試料移送管１６００を通り、分離フィルタ３４に達する。同様に、混合フィルタ３２の試料溶液注入口５２に到達した純水は、第１バルブ７２、第３試料移送管１６０４、第２バルブ７０を通り、分離フィルタ３４に達する。分離フィルタ３４に達した純水は、第４試料移送管１６０６を通り、排水用バルブ７４へ達する。

（バッファ液への交換２０２０）
一旦、循環ポンプ１００を停止させ、注水用バルブ７６の口をバッファ液の容器へ取り替える。その後、循環ポンプ１００を駆動させ、バッファ液を循環路全体へ送り込む。送り込みが終了したら注水用バルブ７６を閉じる。

（低分子化合物濃度の連続測定の開始２０３０）
第３濃度計３０４を用いて低分子化合物濃度の連続的な測定を開始する。測定する波長は注入する高分子化合物や低分子化合物の特性に合わせて選択する。分光機能が付いている吸光度計の場合には、測定波長の選択は観測帯域の選択として行う。測定間隔は１秒から１０分の範囲が好適である。

（混合溶液の連続測定の開始２０４０）
第１濃度計３００と第２濃度計３０２を用いて、混合溶液の吸光度の連続的な測定を開始する。測定する波長は注入する高分子化合物や低分子化合物の特性に合わせて選択する。分光機能が付いている吸光度計の場合には、測定波長の選択は観測帯域の選択として行う。測定間隔は１秒から１０分の範囲が好適である。測定開始後の暫くの状態では、第１〜第３濃度計が観測した吸光度はほぼ等しい値または同等のばらつき度合いを示している。

この状態で、著しく異なる値を観測する場合には、循環路構成部品の汚染や破損が考えられるので、測定を中止し、点検を行うほうが良い。

（高分子化合物溶液の注入・均一化２０５０）
循環ポンプ１００による循環を行い、第１バルブ７２の流路を試料溶液注入用シリンジ９０側とする。注入過程では、まず、第１バルブ７２に取り付けた試料溶液注入用シリンジ９０から高分子化合物を注入する。そして、第１バルブ７２を切替え、試料溶液注入用シリンジ９０から第３試料移送管１６０４へと流路を切替る。高分子化合物を含む溶液は混合フィルタ３２、第１試料移送管１６０２、容器１０、第２試料移送管１６００、分離フィルタ３４、第２バルブ７０を経て、第３試料移送管１６０４、第１バルブ７２へ至る。高分子化合物に関する流路は閉じているので、高分子化合物は前記ルートを循環する。この循環中の溶液状態の変化は、前記第１および第２濃度計で連続的にモニタされている。次に、第１および第２濃度計の値が等しく、時間に対するばらつきが同程度になったとき、混合溶液での高分子化合物の濃度が均一になったと判断する。

図１に示すように、循環効率を高めるため、第３試料移送管１６０４に循環用第２ポンプ１０２を設置してもよい。

（滴定測定）
ここでは、低分子化合物溶液を注入して循環路での低分子化合物濃度を増加させる過程について説明する。特定の低分子化合物を含まない溶液を用いて、同じ手順を実施することで、特定の低分子化合物濃度のみを減少させた過程での滴定測定が実施できる。

（低分子化合物溶液の注入・均一化２０６０、２０７０）
最初に、循環ポンプ１００を駆動させて、溶液循環を開始する。そして、低分子化合物溶液注入部３０の低分子化合物溶液注入用シリンジ８０を用いて、低分子化合物溶液を循環路内に注入する。低分子化合物用の第３濃度計３０４の値が、一定値あるいは一定のばらつき範囲内に収束したら、循環路内部の低分子化合物濃度は均一化されたと判断する。

低分子化合物濃度が目的の濃度より低いならば、前記低分子化合物溶液の注入過程を行い、濃度を増加させる。低分子化合物濃度が目的の濃度より高い場合には、低分子化合物を含まない溶液をバッファ液注入用シリンジ８２から注入し、循環による濃度均一化で調整を行う。

（測定２０８０、反復測定２０９０）
低分子化合物濃度が目的の濃度に達したならば、循環を停止し、ＮＭＲ測定を行う。測定者が設定していたすべての低分子化合物濃度条件に対して、前記低分子化合物濃度を増加あるいは減少させる過程と、測定を行う。

ここで測定とは、ＮＭＲ測定だけでなく、第１試料移送管１６０２および第２試料移送管１６００に設置した他の測定機器３１０（吸光度計、ＣＤ計、ラマン分光計、電気伝導度計）による測定を含む。

本発明では、低分子化合物濃度や水素イオン濃度などの溶液環境の変化の下で、ＮＭＲプローブと他測定装置による測定が可能である。ＮＭＲ測定では試料分子の核スピンの応答から、分子運動性や分子構造の変化を観測する。一方、吸光度計やＣＤ計では試料溶液中を通過する偏光の吸収/反射係数から試料分子の２次構造の変化を観測する。また、ラマン分光では、試料分子の分子振動から構造変化を観測する。

このように本発明では、溶液内での試料分子に対して、異なる物理過程をプローブとした様々な観測が可能である。得られたデータは、同溶液条件、同時刻のデータなので、個別に試料を用意しそれぞれ単独に行われた測定データに比べ、より相補的な実験データの組を提供でき、構造変化と化学機能の関係を明らかにすることができる。

（高分子化合物の排出２１００）
一方、ＮＭＲ測定の終了後の排出過程では、第１バルブ７２および第２バルブ７０において、第３試料移送管１６０４との流路を閉ざす。この後、低分子化合物溶液の循環を開始すると、高分子化合物は徐々に第２バルブ７０の分離フィルタ３４との接続部分に集まる。そして、前記第１試料移送管１６０２および第２試料移送管１６００に設置した吸光度計の値が、低分子化合物のみの値に近づいたら、第２バルブ７０の流路を試料溶液回収用シリンジ９２へ切替えて、高分子化合物を含む溶液を回収する。

再び、第１バルブ７２および第２バルブ７０を第３試料移送管１６０４へと切替えて、混合溶液の閉ループを作り、混合溶液を循環させる。また、前記第１試料移送管１６０２および第２試料移送管１６００に設置した吸光度計の値が、再び、混合溶液の値に近づいたら、第１バルブ７２および第２バルブ７０を操作し、第３試料移送管１６０４との流路を閉ざし、低分子化合物溶液の循環により高分子化合物を試料溶液回収用シリンジ９２で回収する。前記手順を数回繰り返すことで、高分子化合物を回収することができる。

本発明の実施の形態によれば、高分子化合物と低分子化合物の滴定測定において、円二色性スペクトル測定、ラマン測定、電気伝導度測定、ｐＨ測定や吸光度測定とＮＭＲ測定の同時的測定が可能となる。分子運動、分子構造の直接的な反映である円二色性スペクトルおよびラマンスペクトルと、原子核スピンの磁気共鳴の反映であるＮＭＲスペクトルの同時的な測定により、高分子化合物の構造変化と化学的機能の関係を直接測定することが可能となる。また、低分子化合物溶液の定常的なモニタによる濃度制御性向上、測定手順短縮化を図ることができる。

（実施の形態２）
前記実施の形態では、高分子化合物の濃度を一定に保ち、低分子化合物の濃度を自由に変化する測定手順について説明した。本実施の形態では、前記実施の形態１で示した核磁気共鳴測定装置を用いて、一定条件の低分子化合物溶液の下での高分子化合物の測定手順について図を参照して、以下に説明する。

図４に示すように、滴定測定全体の概要は以下の手順からなる。まず、循環路への注水２２１０、バッファ液への交換２２２０を行い、循環路全体を溶液で満たす。次に、低分子化合物濃度の連続測定の開始２２３０、混合溶液の連続測定の開始２２４０を行う。そして、低分子化合物溶液の注入・均一化２２５０を行い、容器を含む循環経路内の濃度均一化を行う。そして、高分子化合物の注入２２６０、移動２２７０、測定２２８０、高分子化合物の回収２２９０を繰り返し実施する。なお、測定終了後には純水での洗浄を行う。

注水２２１０、バッファ液への交換２２２０、低分子化合物濃度の連続測定の開始２２３０、混合溶液の連続測定の開始２２４０までは前記実施の形態１で説明した手順２０１０、２０２０、２０３０、２０４０と同様であるので説明は省略し、低分子化合物溶液の注入・均一化２２５０以降の手順について説明する。

（低分子化合物溶液の注入・均一化２２５０）
まず、循環ポンプ１００を駆動させて、溶液循環を開始する。そして、低分子化合物溶液注入部３０に設置した低分子化合物注入用シリンジ８０を用いて、低分子化合物溶液を循環路内に注入する。低分子化合物用の第３濃度計３０４の値が、一定値あるいは一定のばらつき範囲内に収束したら、循環路内部の低分子化合物濃度は均一化されたと判断する。低分子化合物濃度が目的の濃度に達したならば、循環を停止する。

低分子化合物濃度が目的の濃度より低いならば、前記低分子化合物溶液の注入過程を行い、濃度を増加させる。低分子化合物濃度が目的の濃度より高い場合には、低分子化合物溶液注入部３０に設置した低分子化合物を含まないバッファ液注入用シリンジ８２から溶液注入を行い、循環による濃度均一化を行い、低分子化合物濃度を調整する。

水素イオン濃度の調整を行う場合には、第３濃度計３０４の代わりにｐＨ計を設置し、酸性の溶媒とアルカリ性の溶媒をそれぞれ低分子化合物溶液注入用シリンジ８０、バッファ液注入用シリンジ８２にセットし、前記溶液注入と循環による均一化手順によりｐＨ値を調整する。

（高分子化合物溶液の注入２２６０）
循環ポンプ１００による循環を行い、第１バルブ７２の流路を試料溶液注入用シリンジ９０側とする。そして第１バルブ７２に取り付けた注入用シリンジ９０から高分子化合物を注入する。

（高分子化合物の移動２２７０）
高分子化合物溶液は、低分子化合物溶液の流れに沿って、混合フィルタ３２、第１試料移送管１６０２、容器１０へと移動する。この間、第１試料移送管１６０２に設置した第１濃度計３００の吸光度に変化が生じる。この後、第２試料移送管１６００に設置した第２濃度計３０２の吸光度が変化したときに、溶液循環を停止する。このとき、容器１０の中に高分子化合物が存在する。

（測定２２８０）
溶液停止状態で、測定を行う。ここで測定とは、ＮＭＲ測定だけでなく、第１および第２試料移送管に設置した他の測定機器３１０（吸光度計、円二色性スペクトル計、ラマン分光計、電気伝導度計）による測定を含む。

（高分子化合物溶液の回収２２９０）
溶液循環を開始する。第１濃度計３００と第２濃度計３０２の値が低分子化合物溶液のみのときと同様な値に戻ったとき、試料溶液回収用シリンジ９２を動かして、分離フィルタ３４から試料溶液回収用シリンジ９２の中へ高分子化合物を移動させ、回収する。

回収時の高分子化合物溶液には低分子化合物が混入したものになっているが、限外濾過法などの化学や生化学分野での一般的な分離方法を用いて、高分子化合物と低分子化合物を分離することは、この分野の作業者にとって容易なことである。

（反復計測２３００）
前述の高分子化合物溶液の注入２２６０、高分子化合物の移動２２７０、測定２２８０、高分子化合物溶液の回収２２９０の４つの手順を繰り返すことで、一定の低分子化合物溶液条件下での、複数の高分子化合物に対する測定を簡便に行うことができる。

このように本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置では、測定対象となる低分子化合物（第１化合物）に対する高分子化合物（第２化合物）の量を、低分子化合物溶液の濃度によって変化させる循環フロー方式によって、濃度制御性を向上させることができる。

（実施の形態３）
前記実施の形態１では、本発明の循環フロー方式の試料溶液調整を利用した滴定測定での、ＮＭＲ測定との同時測定や濃度制御を向上させるＮＭＲ測定装置において、試料に磁場を加えるためにスプリット型の磁石を適用した場合について説明したが、本実施の形態では、縦型一体型磁石を適用した場合について説明する。なお、前記実施の形態１で示したＮＭＲ測定装置の構成と同様の構成についての説明は省略する。

図５に示したように、縦型一体型の磁石２１の中の空間２３に設置した核磁気共鳴プローブ２４の中を第１試料移送管１６０２と第２試料移送管１６００が縦方向に貫通する配置とする。容器１０はプローブ内部のコイル２９との間で核磁気共鳴信号を観測するのに適した位置に設置する。この適した位置関係はプローブの構成、コイル形状ごとに異なるが、検出した核磁気共鳴信号が最大となる位置とするのが適している。

容器１０の底部に注入口１４を設け、注入口１４と第１試料移送管１６０２を接続する。また、容器１０の上部に排出口１２を設け、排出口１２と第２試料移送管１６００を接続する。こうすることで、前記実施の形態１、２で示した測定方法と同様に、一体型磁石においても一定量の高分子化合物を用いた滴定測定によるＮＭＲ測定と他測定機器との測定との同時的測定が可能となる。

このように本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置では、測定対象となる第１化合物（例えば、高分子化合物）に対する第２化合物（例えば、低分子化合物）の量を、第２化合物溶液の濃度によって変化させる循環フロー方式によって、濃度制御性を向上させることができる。

（実施の形態４）
前記実施の形態３では、本発明の循環フロー方式の試料溶液調整を利用した滴定測定での、ＮＭＲ測定との同時測定や濃度制御を向上させるＮＭＲ測定装置において、フロースルー型または細管貫通型の核磁気共鳴プローブを適用した場合について説明したが、本実施の形態では、それらとは別の型の核磁気共鳴プローブについて適用した場合について説明する。なお、前記実施の形態３で示したＮＭＲ測定装置の構成と同様の構成についての説明は省略する。

図６に示したように、縦型一体型の磁石２１の中の空間２３に設置した核磁気共鳴プローブ２５に、容器１１を設置する。容器１１はプローブ内部のコイル２９との間で核磁気共鳴信号を観測するのに適した位置に設置する。この適した位置関係はプローブの構成、コイル形状ごとに異なるが、検出した核磁気共鳴信号が最大となる位置とするのが適している。

容器１１の上面に注入口１４と排出口１２を設ける。注入口１４と第１試料移送管１６０２を接続する。また、排出口１２と第２試料移送管１６００を接続する。また、第１試料移送管１６０２と第２試料移送管１６００はともに核磁気共鳴プローブ２５の上部から出し、空間２３を通し、磁石２１の上部において、それぞれ、混合フィルタ３２と分離フィルタ３４と接続する。こうすることで、一体型磁石においてフロースルー型でないまたは細管貫通ができない構成の核磁気共鳴プローブを使用した場合でも、前記実施の形態１、２で示した測定方法と同様に、一定量の高分子化合物を用いた滴定測定によるＮＭＲ測定と他測定機器による測定との同時的測定が可能となる。

このように本実施の形態におけるＮＭＲ測定装置では、測定対象となる第１化合物（例えば、高分子化合物）に対する第２化合物（例えば、低分子化合物）の量を、第２化合物溶液の濃度によって変化させる循環フロー方式によって、濃度制御性を向上させることができる。

以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。

例えば、前記実施の形態では、特に、循環フロー方式を用いたＮＭＲ測定装置に適用した場合について説明したが、循環フロー方式を用いた滴定計測装置にも適用することができる。

本発明は、核磁気共鳴測定装置およびそれを用いた測定技術に関し、特に、タンパク質などの高分子化合物の核磁気共鳴測定を行う核磁気共鳴測定装置の製造業に幅広く利用されるものである。

タンパク質をはじめとする生体内で機能を有する高分子化合物に本発明を適用することにより、一定量の高分子化合物の使用のもとで、滴定条件によらず試料体積一定を維持し、溶液条件を変化させたＮＭＲ測定と他測定との同時的測定の反復が可能となるので、ライフサイエンスの分野では生体内で生じている生化学プロセス解析の効率向上となり、医療や創薬分野では疾病関連タンパク質との結合強度測定による疾病メカニズム解析やスクリーニングの高効率化に繋がる。

本発明の一実施の形態におけるＮＭＲ測定装置の構成を模式的に示す説明図である。 図１のＮＭＲ測定装置が備える測定機器の接続を模式的に示す説明図である。 本発明の一実施の形態におけるＮＭＲ測定装置の測定フロー図である。 本発明の他の実施の形態におけるＮＭＲ測定装置の測定フロー図である。 本発明の他の実施の形態におけるＮＭＲ測定装置の構成を模式的に示す説明図である。 本発明の他の実施の形態におけるＮＭＲ測定装置の構成を模式的に示す説明図である。 本発明者らが検討したＮＭＲ測定装置の構成を模式的に示す説明図である。

符号の説明

１ 経路（第１経路）
２ 経路（第２経路）
３ 経路（第３経路）
５ 経路
１０、１１ 容器
１２ 排出口
１４ 注入口
２０、２１ 磁石
２２、２３ 空間
２４、２５ 核磁気共鳴プローブ
２６ 送受信システム
２８、２９ コイル
３０ 低分子化合物溶液注入部
３２ 混合フィルタ
３４ 分離フィルタ
５０ 混合溶液排出口
５１ 低分子化合物溶液注入口
５２ 試料溶液注入口
６０ 混合溶液注入口
６１ 低分子化合物溶液排出口
６２ 試料溶液排出口
７０ 第２バルブ
７２ 第１バルブ
７４ 排出用バルブ
７６ 注水用バルブ
８０ 低分子化合物溶液注入用シリンジ
８２ バッファ液注入用シリンジ
９０ 試料溶液注入用シリンジ
９２ 試料溶液回収用シリンジ
１００ 循環ポンプ（第１ポンプ）
１０２ 第２ポンプ
２００ デガッサー
３００ 第１濃度計
３０２ 第２濃度計
３０４ 第３濃度計
３１０ 測定機器
３１２ 溶液入口
３１４ 溶液出口
４００ コンピュータ
１６００ 第２試料移送管
１６０２ 第１試料移送管
１６０４ 第３試料移送管
１６０６ 第４試料移送管
１６０８ 第５試料移送管
１６１０ 第６試料移送管
１６１２ 第７試料移送管
１６１４ 第８試料移送管
１６１６ 試料移送管

Claims (20)

1. 第１化合物およびそれより分子量の低い第２化合物を含む混合溶液が保持される容器と、
   前記容器で保持されている前記混合溶液に磁場を加えるための磁石と、
   前記容器に取り付けられた核磁気共鳴プローブと、
   前記第１化合物を含む第１溶液と前記第２化合物を含む第２溶液とを混合し、前記混合溶液として排出する混合フィルタと、
   注入された前記混合溶液から前記第１溶液と前記第２溶液とに分離する分離フィルタと、
   前記分離フィルタから排出された前記第１溶液が前記混合フィルタに注入される第１経路、前記分離フィルタから排出された前記第２溶液が前記混合フィルタに注入される第２経路、および前記混合フィルタから排出された前記混合溶液が前記容器を通じて前記分離フィルタに注入される第３経路を構成する管と、
   を備えていることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
2. 請求項１記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記第２経路に設けられ、前記第２化合物が所定の濃度で調整された前記第２溶液を注入する注入部と、
   前記第２経路に設けられ、前記第２経路および前記第３経路に前記第２溶液を循環させる第１ポンプと、
   を備えていることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
3. 請求項１記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記容器の注入口と前記混合フィルタの排出口との間の前記第３経路に設けられた第１濃度計と、
   前記容器の排出口と前記分離フィルタの注入口との間の前記第３経路に設けられた第２濃度計と、
   前記第２経路に設けられた第３濃度計と、
   前記核磁気共鳴プローブ、前記第１〜第３濃度計と接続されたコンピュータと、
   を備え、
   前記コンピュータが、
   （ａ）前記第１〜第３経路でバッファ液を循環させる手順、
   （ｂ）前記手順（ａ）の後、前記第１〜第３濃度計の測定を開始させる手順、
   （ｃ）前記手順（ｂ）の後、前記第１経路に前記第１溶液を注入し、前記第１経路および前記第３経路で前記第１溶液を循環させて、前記第１濃度計および前記第２濃度計により前記第１溶液の濃度が均一の状態を測定する手順、
   （ｄ）前記手順（ｃ）の後、前記第２経路に前記第２溶液を注入し、前記第２経路および前記第３経路で前記第２溶液を循環させて、前記第３濃度計により前記第２溶液の濃度が均一の状態を測定する手順、
   （ｅ）前記手順（ｄ）の後、前記核磁気共鳴プローブで前記混合溶液の核磁気共鳴を測定する手順、
   （ｆ）前記手順（ｅ）の後、前記第２溶液の濃度を変えて、前記手順（ｄ）および前記手順（ｅ）を繰り返して行う手順、
   を制御する機能を有していることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
4. 請求項１記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記容器が、前記混合溶液が注入される注入口と、前記混合溶液が排出される排出口と、を有し、
   前記混合フィルタが、前記第１溶液が注入される第１注入口と、前記第２溶液が注入される第２注入口と、前記混合溶液が排出される排出口と、を有し、
   前記分離フィルタが、前記混合溶液が注入される注入口と、前記第１溶液が排出される第１排出口と、前記第２溶液が排出される第２排出口と、を有し、
   更に、
   前記容器の注入口と前記混合フィルタの排出口とが接続され、前記第３経路を構成する第１試料移送管と、
   前記容器の排出口と前記分離フィルタの注入口とが接続され、前記第３経路を構成する第２試料移送管と、
   前記混合フィルタの第１注入口に接続された第１バルブと、
   前記分離フィルタの第１排出口に接続された第２バルブと、
   前記第１バルブの１つの口と前記第２バルブの１つの口とが接続され、前記第１経路を構成する第３試料移送管と、
   前記分離フィルタの第２排出口に接続され、前記第２経路を構成する第４試料移送管と、
   前記第４試料移送管に接続された排出用バルブと、
   前記排出用バルブに接続され、前記第２経路を構成する第５試料移送管と、
   前記第５試料移送管に接続され、前記第２溶液を注入する注入部と、
   前記注入部に接続され、前記第２経路を構成する第６試料移送管と、
   前記第６試料移送管に接続された注水用バルブと、
   前記注水用バルブに接続され、前記第２経路を構成する第７試料移送管と、
   前記第７試料移送管に接続され、前記第２溶液を循環させる第１ポンプと、
   前記第１ポンプと前記混合フィルタの第２注入口とが接続され、前記第２経路を構成する第８試料移送管と、
   を備えていることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
5. 請求項４記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記第３経路に、少なくともラマン分光計、円二色性スペクトル計、吸光計、または電気伝導度計のいずれか１つが接続されていることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
6. 請求項４記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記第１経路に前記第１溶液を循環させる第２ポンプが設けられていることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
7. 請求項４記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記混合フィルタおよび前記分離フィルタは、前記第２溶液のみ通過する中空状のフィルタ物質を有することを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
8. 請求項４記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記容器の注入口と前記混合フィルタの排出口との間の前記第３経路に第１濃度計あるいは第１水素イオン濃度計が設けられ、
   前記容器の排出口と前記分離フィルタの注入口との間の前記第３経路に第２濃度計あるいは第２水素イオン濃度計が設けられ、
   前記第２経路に第３濃度計あるいは第３水素イオン濃度計が設けられていることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
9. 請求項８記載の核磁気共鳴測定装置において、
   前記第１から第３濃度計あるいは前記第１から第３水素イオン濃度計は、各測定における時刻と測定データの組を表示、記録あるいはデータ転送する機能を有することを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
10. 請求項４記載の核磁気共鳴測定装置において、
    前記注入部は、前記第２化合物を含む溶液が注入される第１シリンジと、前記第２化合物を含まない溶液が注入される第２シリンジと、を有することを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
11. 請求項４記載の核磁気共鳴測定装置において、
    前記第１バルブに前記第１溶液が注入される第３シリンジが取り付けられ、
    前記第２バルブに前記第１溶液が回収される第４シリンジが取り付けられていることを特徴とする核磁気共鳴測定装置。
12. 第１化合物およびそれより分子量の低い第２化合物を含む混合溶液が保持される容器と、
    前記容器で保持されている前記混合溶液に磁場を加えるための磁石と、
    前記容器に取り付けられた核磁気共鳴プローブと、
    前記第１化合物を含む第１溶液と前記第２化合物を含む第２溶液とが混合される混合フィルタと、
    前記第１溶液と前記第２溶液とが分離される分離フィルタと、
    前記分離フィルタから排出された前記第１溶液が前記混合フィルタに注入される第１経路と、
    前記分離フィルタから排出された前記第２溶液が前記混合フィルタに注入される第２経路と、
    前記混合フィルタから排出された前記混合溶液が前記容器を通じて前記分離フィルタに注入される第３経路と、
    を備え、
    前記容器の注入口と前記混合フィルタの排出口との間の前記第３経路に第１濃度計、
    前記容器の排出口と前記分離フィルタの注入口との間の前記第３経路に第２濃度計、および前記第２経路に第３濃度計が設けられている核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    （ａ）前記第１〜第３経路でバッファ液を循環させる手順、
    （ｂ）前記手順（ａ）の後、前記第１〜第３濃度計の測定を開始させる手順、
    （ｃ）前記手順（ｂ）の後、前記第１経路に前記第１溶液を注入し、前記第１経路および前記第３経路で前記第１溶液を循環させて、前記第１濃度計および前記第２濃度計により前記第１溶液の濃度が均一の状態を測定する手順、
    （ｄ）前記手順（ｃ）の後、前記第２経路に前記第２溶液を注入し、前記第２経路および前記第３経路で前記第２溶液を循環させて、前記第３濃度計により前記第２溶液の濃度が均一の状態を測定する手順、
    （ｅ）前記手順（ｄ）の後、前記核磁気共鳴プローブで前記混合溶液の核磁気共鳴を測定する手順、
    （ｆ）前記手順（ｅ）の後、前記第２溶液の濃度を変えて、前記手順（ｄ）および前記手順（ｅ）を繰り返して行う手順、
    を含むことを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
13. 請求項１２記載の核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    前記第３濃度計を用いて前記第２化合物の濃度の連続的な測定を行い、各測定時刻と測定データの組を記録、表示、あるいはデータ転送することを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
14. 請求項１２記載の核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    前記手順（ｅ）では、前記第１濃度計と前記第２濃度計を用いて、前記混合溶液の吸光度の連続的な測定を行い、各測定時刻と測定データの組を記録、表示、あるいはデータ転送すると共に、前記混合溶液の核磁気共鳴を測定することを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
15. 請求項１２記載の核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    前記手順（ｅ）では、循環中の溶液状態の変化を前記第１濃度計および前記第２濃度計で連続的にモニタし、前記第１濃度計および前記第２濃度計の値が等しく、時間に対するばらつきが同程度になったとき、前記混合溶液での前記第１化合物の濃度が均一になったと判断した後に、前記混合溶液の核磁気共鳴を測定することを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
16. 請求項１２記載の核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    前記手順（ｄ）では、前記第３濃度計の値が、一定値あるいは一定のばらつき範囲内に収束したら、前記第２経路および前記第３経路の前記第２化合物の濃度は均一化されたと判断し、
    もし前記第２化合物の濃度が目的濃度より低いならば、前記第２溶液の注入を行い、濃度を増加させ、あるいは、
    もし前記第２化合物の濃度が目的濃度より高いならば、前記第２化合物を含まない溶液の注入を行い、濃度を減少させ、
    前記第２化合物の濃度が目的濃度に達したならば、循環を停止し、
    前記手順（ｅ）では、核磁気共鳴測定を開始し、
    前記手順（ｆ）では、すべての前記第２化合物の濃度条件に対して、前記第２化合物の濃度を調整し、核磁気共鳴測定の繰返しを行うことを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
17. 請求項１２記載の核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    前記手順（ｅ）での核磁気共鳴測定と共に、前記第３経路に設けられた少なくとも吸光度計、円二色性スペクトル計、ラマン分光計、または電気伝導度計のいずれか１つによる測定を行うことを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
18. 請求項１７記載の核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    前記核磁気共鳴プローブによる測定、前記第１〜第３濃度計による測定、前記円二色性スペクトル計による測定、前記ラマン分光計による測定で得られたデータは測定時刻との組として表示、記録、データ転送され、このデータを相互に参照および比較できることを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
19. 請求項１２記載の核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    （ｇ）前記手順（ｆ）の後、前記第１経路を閉ざして前記第２経路および前記第３経路を循環させることによって前記分離フィルタと前記第１経路との間に前記第１化合物を収集し、前記第１濃度計および前記第２濃度計の値が、前記第１化合物の存在しない値に近づいたら、前記分離フィルタと前記第１経路との間から前記第１化合物を含む溶液を回収する手順、
    （ｈ）前記手順（ｇ）の後、前記第１経路を開いて前記第１経路および前記第３経路で前記第１溶液を循環させる手順、
    （ｉ）前記手順（ｈ）の後、前記第１濃度計および前記第２濃度計の値が再度変動した場合、前記手順（ｇ）および前記（ｈ）手順を繰り返して行う手順、
    を含むことを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。
20. 第１化合物およびそれより分子量の低い第２化合物を含む混合溶液が保持される容器と、
    前記容器で保持されている前記混合溶液に磁場を加えるための磁石と、
    前記容器に取り付けられた核磁気共鳴プローブと、
    前記第１化合物を含む第１溶液と前記第２化合物を含む第２溶液とが混合される混合フィルタと、
    前記第１溶液と前記第２溶液とが分離される分離フィルタと、
    前記分離フィルタから排出された前記第１溶液が前記混合フィルタに注入される第１経路と、
    前記分離フィルタから排出された前記第２溶液が前記混合フィルタに注入される第２経路と、
    前記混合フィルタから排出された前記混合溶液が前記容器を通じて前記分離フィルタに注入される第３経路と、
    を備え、
    前記容器の注入口と前記混合フィルタの排出口との間の前記第３経路に第１濃度計、
    前記容器の排出口と前記分離フィルタの注入口との間の前記第３経路に第２濃度計、および前記第２経路に第３濃度計が設けられている核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法であって、
    （ａ）前記第１〜第３経路でバッファ液を循環させる手順、
    （ｂ）前記手順（ａ）の後、前記第１〜第３濃度計の測定を開始させる手順、
    （ｃ）前記手順（ｂ）の後、前記第２経路に前記第２溶液を注入し、前記第２経路および前記第３経路で前記第２溶液を循環させて、前記第３濃度計により前記第２溶液の濃度が均一の状態を測定する手順、
    （ｄ）前記手順（ｃ）の後、前記第１経路に前記第１溶液を注入し、前記第１経路および前記第３経路で前記第１溶液を循環させて、前記第１濃度計および前記第２濃度計により前記第混合溶液の濃度が均一の状態を測定する手順、
    （ｅ）前記手順（ｄ）の後、前記核磁気共鳴プローブで前記混合溶液の核磁気共鳴を測定する手順、
    （ｆ）前記手順（ｅ）の後、前記第２溶液の濃度を変えて、前記手順（ｄ）および前記手順（ｅ）を繰り返して行う手順、
    を含むことを特徴とする核磁気共鳴測定装置を用いた測定方法。

Images