JP2009195228A - Method for producing controllable t cell and apparatus for amplifying controllable t cell - Google Patents
Method for producing controllable t cell and apparatus for amplifying controllable t cell Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009195228A JP2009195228A JP2009010523A JP2009010523A JP2009195228A JP 2009195228 A JP2009195228 A JP 2009195228A JP 2009010523 A JP2009010523 A JP 2009010523A JP 2009010523 A JP2009010523 A JP 2009010523A JP 2009195228 A JP2009195228 A JP 2009195228A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- cell
- regulatory
- bag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 208
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 47
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 28
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 99
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 38
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 38
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 25
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 claims description 17
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 114
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 description 37
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 34
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 25
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 25
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 24
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 24
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 21
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 18
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 14
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 8
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- -1 serum Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 5
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 5
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 4
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 4
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 4
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 3
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 3
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 8-azido-5-ethyl-6-phenylphenanthridin-5-ium-3-amine;bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101500025614 Homo sapiens Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000004699 Ultra-high molecular weight polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004702 low-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229920005672 polyolefin resin Polymers 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229920000785 ultra high molecular weight polyethylene Polymers 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229920001179 medium density polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004701 medium-density polyethylene Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Description
本発明は、制御性Ｔ細胞を効率的に製造する方法、及び制御性Ｔ細胞を効率的に増幅する装置に関する。 The present invention relates to a method for efficiently producing regulatory T cells and an apparatus for efficiently amplifying regulatory T cells.
制御性Ｔ細胞（Treg：Regulatory T cells）は、ＣＤ２５陽性（以下、「ＣＤ２５＋」とも記される。）、ＣＤ４陽性（以下、「ＣＤ４＋」とも記される。）の表面形質を有する特殊なＴ細胞系列に属する細胞であり、その発生及び分化は転写因子であるＦｏｘＰ３（Forkhead box P3）によってプログラムされている。制御性Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞（Effector T cells）と相反する免疫応答を示し、免疫寛容の維持において重要な役割を担っている。ヒトにおける制御性Ｔ細胞の減少乃至機能異常は、自己免疫疾患やアレルギーの発症原因となる。したがって、制御性Ｔ細胞の量的又は質的なコントロールは、自己免疫疾患やアレルギーの治療に有用であり、さらには、難治性移植片対宿主病（GVHD：Graft Versus Host Disease）の治療など、移植免疫や腫瘍免疫の分野における新たな細胞療法となることが期待されている。 Regulatory T cells (Treg) are special CD-positive (hereinafter also referred to as “CD25 + ”) and CD4 positive (hereinafter also referred to as “CD4 + ”) surface traits. These cells belong to the T cell lineage, and their development and differentiation are programmed by the transcription factor FoxP3 (Forkhead box P3). Regulatory T cells exhibit an immune response opposite to activated T cells (Effector T cells) and play an important role in maintaining immune tolerance. The decrease or functional abnormality of regulatory T cells in humans causes autoimmune diseases and allergies. Therefore, quantitative or qualitative control of regulatory T cells is useful for the treatment of autoimmune diseases and allergies, and also for the treatment of refractory graft-versus-host disease (GVHD). It is expected to become a new cell therapy in the fields of transplantation immunity and tumor immunity.
特許文献１には、ヒトの制御性Ｔ細胞を製造する方法が開示されている。この方法では、ヒト末梢血からナイーブ表現型のＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が分離され、この細胞が、ＩＬ２やＩＦＮ−γなどのＴ細胞増殖因子、及び抗ヒトＣＤ３抗体などＴ細胞受容体を介して細胞を刺激する物質の存在下で培養される。その結果、ナイーブ表現型のＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が１００倍以上に増殖され、増殖された細胞が制御性Ｔ細胞としての機能を発揮すると示されている。 Patent Document 1 discloses a method for producing human regulatory T cells. In this method, naive phenotype CD25 + CD4 + T cells are isolated from human peripheral blood, and these cells are mediated by T cell growth factors such as IL2 and IFN-γ, and T cell receptors such as anti-human CD3 antibodies. And cultured in the presence of substances that stimulate the cells. As a result, it has been shown that CD25 + CD4 + T cells with a naive phenotype proliferate 100 times or more, and the proliferated cells exhibit a function as regulatory T cells.
特許文献２には、ヒトの活性化Ｔリンパ球の誘導において、抗ＣＤ３抗体を固定した不溶性担体を用いることが開示されている。また、リンパ球の増殖を促進させるために、ＩＬ２などのサイトカインを培養補助剤として培地中に含有させることが開示されている。これらを用いることにより、少量のリンパ球から５００〜１００００倍の細胞が誘導できるとされている。 Patent Document 2 discloses the use of an insoluble carrier to which an anti-CD3 antibody is immobilized in the induction of human activated T lymphocytes. Moreover, in order to promote the proliferation of lymphocytes, it is disclosed that a cytokine such as IL2 is contained in the medium as a culture auxiliary agent. By using these, it is said that 500 to 10,000 times of cells can be induced from a small amount of lymphocytes.
患者の末梢血から制御性Ｔ細胞を特異的に増幅する手法として、主として次の二つが考えられる。一つは、末梢血から制御性Ｔ細胞を分離してから増幅する手法である。もう一つは、末梢血から制御性Ｔ細胞を含む細胞群を分離して増幅し、その増幅過程において或いは最終的に制御性Ｔ細胞を選択する手法である。しかし、前者において、治療に必要な量の制御性Ｔ細胞を得るには、多量の末梢血を患者から採取するか、増幅効率を極めて高める必要がある。現実には極度に高い増幅効率の培養方法が実現されていないので、患者から多量の末梢血を採る必要があり、患者負担が大きいという問題がある。後者においては、増幅された多種多量の細胞群から制御性Ｔ細胞を選別する作業が難しいという問題がある。例えば、ＣＤ２５は活性化Ｔ細胞でも発現されているので、ＣＤ２５の＋／−をもって制御性Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞とを区別することができない。また、ＦｏｘＰ３は制御性Ｔ細胞に特異的に発現するが細胞内分子であるので、ＦｏｘＰ３の発現の有無により制御性Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞とを区別できるとしても、ＦｏｘＰ３を確認するためには、細胞膜の透過処理を施して染色をする必要があり、その後は、生きた細胞として治療に用いることができない。したがって、制御性Ｔ細胞を前述された様々な細胞療法に用いるために、少ない量の末梢血から制御性Ｔ細胞が特異的かつ効率的に増幅できる手法が望まれる。 There are mainly the following two methods for specifically amplifying regulatory T cells from the peripheral blood of a patient. One is a technique in which regulatory T cells are isolated from peripheral blood and then amplified. The other is a technique of separating and amplifying a cell group containing regulatory T cells from peripheral blood, and selecting regulatory T cells in the amplification process or finally. However, in the former case, in order to obtain the amount of regulatory T cells necessary for treatment, it is necessary to collect a large amount of peripheral blood from the patient or to greatly increase the amplification efficiency. In reality, since a culture method with extremely high amplification efficiency has not been realized, it is necessary to collect a large amount of peripheral blood from the patient, and there is a problem that the burden on the patient is large. In the latter, there is a problem that it is difficult to select regulatory T cells from a large number of amplified cell groups. For example, since CD25 is also expressed in activated T cells, it is not possible to distinguish between regulatory T cells and activated T cells with +/− of CD25. In addition, although FoxP3 is specifically expressed in regulatory T cells, it is an intracellular molecule. Therefore, even if it is possible to distinguish between regulatory T cells and activated T cells based on the presence or absence of FoxP3 expression, FoxP3 is used to confirm FoxP3. Needs to be permeabilized and stained, and thereafter cannot be used as a living cell for treatment. Therefore, in order to use regulatory T cells for the various cell therapies described above, a technique is desired that can specifically and efficiently amplify regulatory T cells from a small amount of peripheral blood.
本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトから採取された血液中から制御性Ｔ細胞を特異的かつ効率的に増幅できる手段を提供することにある。 The present invention has been made in view of these circumstances, and an object thereof is to provide a means capable of specifically and efficiently amplifying regulatory T cells from blood collected from a human.
(1) 本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法は、ヒトから採取された血液中からＣＤ４陽性を示すＴ細胞を分離する第１ステップと、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液中において、上記Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が不溶担体に固定された固相化抗体と反応させる第２ステップと、上記固相化抗体からＴ細胞を分離して、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中において当該Ｔ細胞を増幅させる第３ステップと、を含む。 (1) A regulatory T cell production method according to the present invention comprises a first step of separating T cells showing CD4 positivity from blood collected from a human, and a first solution containing IL2 and TGF-β. A second step of reacting the T cell with an immobilized antibody in which an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody are immobilized on an insoluble carrier; separating the T cell from the immobilized antibody; and IL2 and TGF-β And a third step of amplifying the T cell in the second liquid.
制御性Ｔ細胞とは、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けることによって反応性Ｔ細胞の活性化を阻害しうる免疫応答を示す細胞を言う。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５陽性かつＣＤ４陽性の表面形質を有する。また、制御性Ｔ細胞は、その発生及び分化のマスター制御分子が転写因子ＦｏｘＰ３である。 Regulatory T cells refer to cells that exhibit an immune response that can inhibit the activation of reactive T cells by receiving stimulation through the T cell receptor. Regulatory T cells have CD25 positive and CD4 positive surface traits. In addition, the regulatory T cell is a transcription factor FoxP3 as a master control molecule for its development and differentiation.
ヒトから採取された血液は、増幅された制御性Ｔ細胞を用いて細胞療法を行うべき患者などから得られた末梢血又は臍帯血である。末梢血とは、体の末梢を流れている血液であり、例えば静脈から採血されることによって得られる。臍帯血とは、胎児と母体とを繋ぐ臍帯に含まれる血液である。 The blood collected from a human is peripheral blood or umbilical cord blood obtained from a patient or the like to be subjected to cell therapy using amplified regulatory T cells. Peripheral blood is blood flowing through the periphery of the body, and is obtained, for example, by collecting blood from a vein. Umbilical cord blood is blood contained in the umbilical cord that connects the fetus and the mother.
第１ステップにおいて、ヒトから採取された血液中からＣＤ４陽性を示すＴ細胞（以下、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」とも称される。）を分離する方法は、フィコール比重遠心法や免疫磁気ビーズ法などの公知の方法を採用することができる。例えば免疫磁気ビーズ法であれば、ヒト末梢血若しくは臍帯血、又はバフィーコートに含まれる単核球に対して、抗ＣＤ４抗体を含む液体を加えて反応させ、さらに抗ＣＤ４抗体と特異的に反応する２次抗体が固定された磁気ビーズを加えて反応させる。この反応により、単核球のうちＣＤ４＋Ｔ細胞が磁気ビーズに結合する。その後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が結合した磁気ビーズと残液とを分離して、磁気ビーズからＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する。これにより、ヒトから採取された血液からＣＤ４＋Ｔ細胞が分離される。 In the first step, a method of separating CD4 positive T cells (hereinafter also referred to as “CD4 + T cells”) from blood collected from humans is Ficoll specific gravity centrifugation, immunomagnetic bead method, etc. These known methods can be employed. For example, in the case of the immunomagnetic bead method, human peripheral blood or umbilical cord blood, or mononuclear cells contained in buffy coat are reacted with a liquid containing anti-CD4 antibody, and further reacted specifically with anti-CD4 antibody. The magnetic antibody to which the secondary antibody to be immobilized is added is reacted. By this reaction, CD4 + T cells among the mononuclear cells bind to the magnetic beads. Thereafter, the magnetic beads to which the CD4 + T cells are bound and the residual liquid are separated, and the CD4 + T cells are separated from the magnetic beads. Thereby, CD4 + T cells are separated from blood collected from humans.
第２ステップにおいては、ＣＤ４＋Ｔ細胞を第１液中において固相化抗体と反応させる。 In the second step, CD4 + T cells are reacted with the immobilized antibody in the first solution.
第１液は、少なくともＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む液であるが、一般にはＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む培地である。この培地として、制御性Ｔ細胞に適する公知のものが使用でき、例えば、Ａｌｙｓ培地シリーズ（細胞科学研究所社製）があげられる。この培地は、有機酸、アミノ酸、還元剤、緩衝剤、抗生物質、サイトカイン、血清などの添加物を予め含んで調製されたものや、複数の培地の混合物であってもよい。 The first liquid is a liquid containing at least IL2 and TGF-β, but is generally a medium containing IL2 and TGF-β. As this medium, a known medium suitable for regulatory T cells can be used, and examples thereof include an Alys medium series (manufactured by Cell Science Laboratory). This medium may be prepared in advance containing additives such as organic acids, amino acids, reducing agents, buffers, antibiotics, cytokines, serum, or a mixture of a plurality of media.
第１液に含まれるＩＬ２及びＴＧＦ−βの濃度は特に限定されない。通常、ＩＬ２の濃度は、５０〜２，０００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは１００〜７００Ｕ／ｍＬであり、とくに好ましくは２００〜７００Ｕ／ｍＬである。また、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１が好適であり、その濃度は、１〜５０ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは５〜１０ｎｇ／ｍＬである。 The concentrations of IL2 and TGF-β contained in the first liquid are not particularly limited. Usually, the concentration of IL2 is 50 to 2,000 U / mL, preferably 100 to 700 U / mL, and particularly preferably 200 to 700 U / mL. Further, TGF-β is preferably TGF-β1, and the concentration thereof is 1 to 50 ng / mL, preferably 5 to 10 ng / mL.
固相化抗体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が不溶担体に固定されたものである。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシなどの動物由来、及びヒト由来のものが使用でき、特にヒト由来のものが好適であるが、これに限定されるものではない。不溶担体は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を物理的又は化学的に結合できる部材であって、水溶液に対して不溶なものを用いることができる。例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を物理的に吸着可能な素材として、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂やガラスなどがあげられる。不溶担体の形状は特に限定されず、例えば、プレート形状やビーズ形状、容器形状などが採用できる。 The immobilized antibody is an antibody in which an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody are immobilized on an insoluble carrier. As the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody, for example, those derived from animals such as mice, rabbits, goats and cows, and those derived from humans can be used, and those derived from humans are particularly suitable, but are not limited thereto. Absent. As the insoluble carrier, a member that can physically or chemically bind the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody, and insoluble in an aqueous solution can be used. Examples of materials that can physically adsorb the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody include synthetic resins such as polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, and polypropylene, and glass. The shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and for example, a plate shape, a bead shape, a container shape, or the like can be adopted.
物理的吸着により、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を不溶担体に結合するには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、及びリン酸緩衝液などの溶媒を含む抗体水溶液を不溶担体に接触させた状態で所定時間放置すればよい。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の疎水性により、これら抗体が不溶担体の表面に物理的に吸着する。 In order to bind the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody to an insoluble carrier by physical adsorption, an antibody aqueous solution containing a solvent such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody and a phosphate buffer is in contact with the insoluble carrier. It can be left for a predetermined time. Due to the hydrophobic nature of the anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, these antibodies are physically adsorbed on the surface of the insoluble carrier.
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定された不溶担体は、第１液を保持可能なバッグなどの容器に予め封入されていてもよい。この容器に、ヒトから採取された血液から分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞及び第１液を注入して、ＣＤ４＋Ｔ細胞と固相化抗体とを反応させることができる。 The insoluble carrier to which the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody are immobilized may be sealed in advance in a container such as a bag that can hold the first liquid. CD4 + T cells separated from blood collected from humans and the first liquid can be injected into this container to react the CD4 + T cells with the immobilized antibody.
第１液中においてＣＤ４＋Ｔ細胞を固相化抗体と反応させると、ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原受容体に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体がそれぞれ結合する。これにより、抗原受容体を介してＣＤ４＋Ｔ細胞が刺激を受ける。さらに、第１液に含まれるＩＬ２及びＴＧＦ−βによってもＣＤ４＋Ｔ細胞が刺激を受ける。このＣＤ４＋Ｔ細胞には、ＣＤ２５陰性（−）ＦｏｘＰ３陰性（−）Ｔ細胞も含まれるが、これらの刺激によってＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞に転換されると想定される。つまり、これら刺激によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が選択的に増幅される。 When CD4 + T cells are reacted with the immobilized antibody in the first solution, anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody bind to the antigen receptor of CD4 + T cells, respectively. This stimulates CD4 + T cells via the antigen receptor. Furthermore, CD4 + T cells are also stimulated by IL2 and TGF-β contained in the first fluid. The CD4 + T cells include CD25 negative (−) FoxP3 negative (−) T cells, but these stimuli convert CD4 + CD25 − FoxP3 − T cells into CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells. It is assumed. In other words, these stimulation, CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells from CD4 + T cells are selectively amplified.
第１液中におけるＣＤ４＋Ｔ細胞と固相化抗体との反応は、通常、温度約３０〜４０℃の範囲で、１〜１０％ＣＯ２の存在下で、１〜１０日間行われ、とくに好ましくは、温度３７℃、５％ＣＯ２、７日間である。 The reaction between the CD4 + T cells and the immobilized antibody in the first solution is usually performed at a temperature in the range of about 30 to 40 ° C. in the presence of 1 to 10% CO 2 for 1 to 10 days. Preferably, the temperature is 37 ° C., 5% CO 2 , and 7 days.
第３ステップにおいて、固相化抗体からＣＤ４＋Ｔ細胞が分離されて、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中においてＣＤ４＋Ｔ細胞が増幅される。 In the third step, CD4 + T cells are separated from the immobilized antibody, and CD4 + T cells are amplified in the second solution containing IL2 and TGF-β.
第２液は、少なくともＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む液であるが、一般には培地である。この培地として、第１液で例示されたように、制御性Ｔ細胞に適する公知のものが使用できる。この培地は、有機酸、アミノ酸、還元剤、緩衝剤、抗生物質、サイトカイン、血清などの添加物を予め含んで調製されたものや、複数の培地の混合物であってもよい。 The second liquid is a liquid containing at least IL2 and TGF-β, but is generally a medium. As this medium, as exemplified in the first liquid, a known medium suitable for regulatory T cells can be used. This medium may be prepared in advance containing additives such as organic acids, amino acids, reducing agents, buffers, antibiotics, cytokines, serum, or a mixture of a plurality of media.
第２液に含まれるＩＬ２及びＴＧＦ−βの濃度は特に限定されない。通常、ＩＬ２の濃度は、５０〜２，０００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは１００〜７００Ｕ／ｍＬであり、とくに好ましくは２００〜７００Ｕ／ｍＬである。また、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１が好適であり、その濃度は、１〜５０ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは５〜１０ｎｇ／ｍＬである。 The concentrations of IL2 and TGF-β contained in the second liquid are not particularly limited. Usually, the concentration of IL2 is 50 to 2,000 U / mL, preferably 100 to 700 U / mL, and particularly preferably 200 to 700 U / mL. Further, TGF-β is preferably TGF-β1, and the concentration thereof is 1 to 50 ng / mL, preferably 5 to 10 ng / mL.
固相化抗体からのＣＤ４＋Ｔ細胞の分離は、公知の用具を用いて行うことができる。例えば、セルリフターを用いてバッグ越しに不溶担体に結合されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を掻き取った後に細胞を回収すればよい。また、ビーズ形状の不溶担体がバッグに封入されている場合には、バッグの上からビーズ形状の不溶担体を揉み解すように擦り合わせることによって、不溶担体に結合されたＣＤ４＋Ｔ細胞を剥がし取ることができる。 Separation of CD4 + T cells from the immobilized antibody can be performed using a known tool. For example, the cells may be recovered after scraping off CD4 + CD25 + T cells bound to an insoluble carrier through a bag using a cell lifter. When a bead-shaped insoluble carrier is enclosed in a bag, the CD4 + T cells bound to the insoluble carrier are peeled off by rubbing the bead-shaped insoluble carrier from above the bag. be able to.
ＣＤ４＋Ｔ細胞の増幅は、培養バッグなどの公知の容器を用いて行うことができる。この培養バッグに、固相化抗体から分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞及び第２液を注入して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を増幅させることができる。なお、固相化抗体から分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞以外のＣＤ４＋Ｔ細胞も含まれる場合があるが、ここでは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみを選別する必要はない。 CD4 + T cells can be amplified using a known container such as a culture bag. CD4 + T cells can be amplified by injecting CD4 + T cells separated from the immobilized antibody and the second solution into the culture bag. Note that the CD4 + T cells isolated from the immobilized antibody, but may be included also CD4 + T cells than CD4 + CD25 + T cells, wherein the selecting only CD4 + CD25 + T cells There is no need.
第２液中におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の増幅は、通常、温度約３０〜４０℃の範囲で、１〜１０％ＣＯ２の存在下で、１〜１０日間行われ、とくに好ましくは、温度３７℃、５％ＣＯ２、７日間である。 Amplification of CD4 + T cells in the second solution is usually performed in the presence of 1 to 10% CO 2 in the range of about 30 to 40 ° C. for 1 to 10 days, particularly preferably at a temperature of 37 ° C. 5% CO 2 for 7 days.
これにより、ヒトから採取された血液から制御性Ｔ細胞が特異的かつ効率的に増幅される。 Thereby, regulatory T cells are specifically and efficiently amplified from blood collected from humans.
(2) 上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞に、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、かつＦｏｘＰ３陽性のＴ細胞が含まれることが好適である。 (2) It is preferable that the T cells amplified by the third step include CD4 positive, CD25 positive, and FoxP3 positive T cells.
本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＴ細胞が制御性Ｔ細胞であることを確認する手段として、第３ステップにより増幅されたＴ細胞の抗原受容体及び転写因子を確認する手法があげられる。Ｔ細胞の抗原受容体は、フローサイトメトリー解析などの公知の手法により確認することができる。ＦｏｘＰ３は、Ｔ細胞の細胞膜の透過処理を施してからＦｏｘＰ３抗体を用いて免疫染色を施すなどの公知の手法により確認することができる。 As a means for confirming that the T cell obtained by the method for producing regulatory T cells according to the present invention is a regulatory T cell, a method for confirming the antigen receptor and transcription factor of the T cell amplified by the third step Can be given. The antigen receptor of T cells can be confirmed by a known method such as flow cytometry analysis. FoxP3 can be confirmed by a known technique such as performing permeabilization of the cell membrane of T cells and then immunostaining with FoxP3 antibody.
(3) 上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞に、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、当該ヒトに対して自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応において、当該レスポンダーＴ細胞の増殖を抑制するＴ細胞が含まれることが好適である。 (3) Mixed lymphocytes using human-derived mononuclear cells as responder T cells and stimulating cells of the same or the same type of dendritic cells or lymphocytes as T cells amplified in the third step. In the reaction, T cells that suppress the proliferation of the responder T cells are preferably included.
本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＴ細胞が制御性Ｔ細胞であることを確認する手段として、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、当該ヒトに対して自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応（ＭＬＲ：Mixed Lympfocyte Reaction）を用いることができる。ここで、ヒトとは、例えば、健常人、患者及びドナーなどをいう。ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、当該ヒトに対して自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応の系に、本制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＴ細胞を添加して培養して、レスポンダーＴ細胞の増殖抑制効果を判定する。増殖抑制効果の判定は、主にフローサイトメトリーにより行われる。 As a means for confirming that the T cells obtained by the method for producing regulatory T cells according to the present invention are regulatory T cells, human-derived mononuclear cells are used as responder T cells, and self or allogeneic with respect to the human. A mixed lymphocyte reaction (MLR) using a dendritic cell or a lymphocyte as a stimulating cell can be used. Here, a human means a healthy person, a patient, a donor, etc., for example. It is obtained by this regulatory T cell production method in a mixed lymphocyte reaction system using human-derived mononuclear cells as responder T-cells and autologous or homologous dendritic cells or lymphocytes as stimulating cells. The T cells are added and cultured to determine the suppressive effect of the responder T cells. The determination of the growth inhibitory effect is mainly performed by flow cytometry.
(4) 上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に対して、制御性Ｔ細胞が占める細胞数の割合が４５％以上であることが好適である。これにより、少量のヒトから採取された血液から制御性Ｔ細胞を増幅して細胞療法に用いることができる。 (4) It is preferable that the ratio of the number of cells occupied by regulatory T cells is 45% or more with respect to all T cells amplified by the third step. Thereby, regulatory T cells can be amplified from blood collected from a small amount of human and used for cell therapy.
(5) 上記第１ステップにおいて分離された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞に対する、上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞の増幅率が１０，０００倍以上であることが好適であり、さらに好ましくは２０，０００倍以上である。これにより、少量のヒトから採取された血液から制御性Ｔ細胞を増幅して細胞療法に用いることができる。 (5) The amplification factor of regulatory T cells contained in all T cells amplified in the third step is 10,000 times or more of regulatory T cells contained in all T cells isolated in the first step It is preferable that it is 20,000 times or more. Thereby, regulatory T cells can be amplified from blood collected from a small amount of human and used for cell therapy.
(6) 本発明にかかる制御性Ｔ細胞増幅装置は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定可能な不溶担体と、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定された上記不溶担体に、ヒトから採取された血液から分離されたＣＤ４陽性を示すＴ細胞が付着した状態で、当該固相化抗体をＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液と共に保持する容器と、を具備する。 (6) A regulatory T cell amplification device according to the present invention is collected from a human on an insoluble carrier capable of immobilizing an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody and the insoluble carrier immobilizing the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody. And a container for holding the immobilized antibody together with a first solution containing IL2 and TGF-β in a state where T cells showing CD4 positivity separated from the blood are attached.
本制御性Ｔ細胞増幅装置は、任意のＴ細胞の増幅にも用いることができるが、特に、前述された制御性Ｔ細胞製造方法に好適に用いられる。 The regulatory T cell amplification apparatus can be used for amplification of any T cell, but is particularly suitably used for the regulatory T cell production method described above.
(7) 上記不溶担体が、上記容器が第１液を保持する空間の少なくとも一部を構成し、かつ保持された第１液と接触しうる部材であってもよい。 (7) The insoluble carrier may be a member that constitutes at least a part of a space in which the container holds the first liquid and can come into contact with the held first liquid.
つまり、不溶担体を容器と一体にしてもよい。例えば、ボトル形状やバッグ形状の壁の一部を不溶担体として、その壁の内面（第１液と接触しうる面）に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定してもよい。 That is, the insoluble carrier may be integrated with the container. For example, a part of a bottle-shaped or bag-shaped wall may be used as an insoluble carrier, and an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody may be immobilized on the inner surface of the wall (the surface that can come into contact with the first liquid).
本発明にかかる制御性Ｔ細胞製造方法によれば、ヒトから採取された血液から分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液中において抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体により刺激した後、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体から分離して増幅させるので、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が選択的に増幅されて、制御性Ｔ細胞を特異的かつ効率的に得ることができる。これにより、採血量を少なくして患者への負担を軽減し、かつ細胞療法に必要な量の制御性Ｔ細胞を簡易に得ることができる。 According to the regulatory T cell production method of the present invention, CD4 + T cells isolated from blood collected from a human are treated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody in a first solution containing IL2 and TGF-β. after stimulation, since the amplified separated from the anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, CD4 + T CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells from the cell is selectively amplified, specifically and efficiently regulatory T cells Can get to. As a result, the amount of blood collected can be reduced, the burden on the patient can be reduced, and the amount of regulatory T cells necessary for cell therapy can be easily obtained.
本発明にかかる制御性Ｔ細胞増幅装置によれば、前述された制御性Ｔ細胞製造方法の如く、ＣＤ４＋Ｔ細胞への刺激によるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の選択的増幅を簡便に実施することができる。 According to regulatory T cell expansion device according to the present invention, as described above regulatory T cells production method, conveniently carried out selective amplification of CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells by stimulation of the CD4 + T cells can do.
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. In addition, this embodiment is only one embodiment of this invention, and it cannot be overemphasized that an embodiment can be changed in the range which does not change the summary of this invention.
［制御性Ｔ細胞増幅装置１０］
図１に示されるように、制御性Ｔ細胞増幅装置１０は、バッグ１１とプレート１２とを具備する。バッグ１１が、本発明における容器に相当する。プレート１２が、本発明における不溶担体に相当する。
[Regulatory T cell amplification apparatus 10]
As shown in FIG. 1, the regulatory T cell amplifying apparatus 10 includes a bag 11 and a plate 12. The bag 11 corresponds to the container in the present invention. The plate 12 corresponds to the insoluble carrier in the present invention.
バッグ１１は、平面視において矩形であって、その内部に一定容量の培地を封入可能なものである。なお、バッグ１１の形状は特に限定されるものではなく、培地（第１液体、第２液体）の容量や操作性などを考慮して、形状及び容量が設定される。要するに、バッグ１１は、所望の容量の培地を保持できるものであればよい。本実施形態にように、バッグ１１が培地を保持する密閉空間を形成するものであれば、バッグ１１の内部空間に雑菌などが侵入するおそれが低減される。バッグ１１の容量としては、例えば、２０〜４００ｍＬが採用される。 The bag 11 has a rectangular shape in a plan view and can contain a certain volume of medium inside. The shape of the bag 11 is not particularly limited, and the shape and volume are set in consideration of the volume and operability of the culture medium (first liquid, second liquid). In short, the bag 11 only needs to be capable of holding a desired volume of medium. As in the present embodiment, if the bag 11 forms a sealed space for holding the culture medium, the possibility that germs and the like enter the internal space of the bag 11 is reduced. As a capacity | capacitance of the bag 11, 20-400 mL is employ | adopted, for example.
バッグ１１は、平面視において矩形の樹脂シート２枚が、その周縁領域が熱溶着されてバッグ形状をなしている。そして、２枚の樹脂シートが溶着されていない中央の領域が、バッグ１１において培地が封入される所定容量の内部空間である。バッグ１１を形成する樹脂シートは、公知のものを採用することができ、例えば、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリエチレン−ポリテトラフルオロエチレン共重合体、ポリエチレン−１，２−ジクロロエタン共重合体などのポリオレフィン系樹脂からなるシートがあげられる。 The bag 11 has a bag shape in which two peripheral resin sheets in a plan view are thermally welded at the peripheral region. A central region where the two resin sheets are not welded is an internal space having a predetermined capacity in which the culture medium is sealed in the bag 11. As the resin sheet forming the bag 11, known ones can be employed. For example, low density polyethylene, medium density polyethylene, ultrahigh molecular weight polyethylene, polyethylene-polytetrafluoroethylene copolymer, polyethylene-1,2- The sheet | seat which consists of polyolefin resin, such as a dichloroethane copolymer, is mention | raise | lifted.
バッグ１１には、内部空間に細胞や培地などを流出入するためのポート１３，１４が設けられている。ポート１３，１４は、バッグ１１の周縁領域において、前述された２枚の樹脂シートの間に樹脂チューブが介在されることにより形成されている。なお、本実施形態では、バッグ１１に２つのポート１３，１４が設けられているが、ポートの数は適宜変更されてよい。 The bag 11 is provided with ports 13 and 14 for flowing cells and culture medium into and out of the internal space. The ports 13 and 14 are formed in the peripheral region of the bag 11 by interposing a resin tube between the two resin sheets described above. In the present embodiment, the bag 11 is provided with the two ports 13 and 14, but the number of ports may be changed as appropriate.
バッグ１１の内部空間には、プレート１２が配置されている。本実施形態では、前述されたように２枚の樹脂シートが溶着されてバッグ形状とされる際に、バッグ１１の内部空間となる位置にプレート１２が配置されて、バッグ１１の内部空間に封入されているが、ポート１３，１４以外にプレート１２を内部空間へ挿入可能な開口をバッグ１１に形成して、任意のタイミングでプレート１２をバッグ１１の内部空間へ挿入できるようにしてもよい。その場合には、プレート１２を挿入するための開口は、プレート１２挿入後に封止できることが好ましい。 A plate 12 is disposed in the internal space of the bag 11. In the present embodiment, as described above, when the two resin sheets are welded to form a bag shape, the plate 12 is disposed at a position to be the internal space of the bag 11 and enclosed in the internal space of the bag 11. However, an opening through which the plate 12 can be inserted into the internal space other than the ports 13 and 14 may be formed in the bag 11 so that the plate 12 can be inserted into the internal space of the bag 11 at an arbitrary timing. In that case, it is preferable that the opening for inserting the plate 12 can be sealed after the plate 12 is inserted.
プレート１２は、矩形の平板であるが、バッグ１１の内部空間に封入可能であれば、形状や厚みなどは特に限定されない。プレート１２は、培地や緩衝液などに対して不溶であり、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定可能な素材からなる。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を固定可能な素材は、抗体の固定方法を考慮して選択されるが、例えば物理的吸着により抗体を固定する場合には、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂を用いることができる。なお、プレート１２において抗体が固定される表面が前述された合成樹脂であればよく、例えばプレート１２の内部に磁性体などが用いられてもよい。 The plate 12 is a rectangular flat plate, but the shape and thickness are not particularly limited as long as it can be enclosed in the internal space of the bag 11. The plate 12 is insoluble in a culture medium or a buffer solution, and is made of a material that can fix an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody. The material capable of immobilizing the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody is selected in consideration of the immobilization method of the antibody. For example, when immobilizing the antibody by physical adsorption, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, polypropylene, etc. A synthetic resin can be used. The surface on which the antibody is immobilized on the plate 12 may be any synthetic resin as described above. For example, a magnetic material or the like may be used inside the plate 12.
［制御性Ｔ細胞製造方法］
以下に、制御性Ｔ細胞増幅装置１０を用いた制御性Ｔ細胞製造方法が説明される。本制御性Ｔ細胞製造方法は、以下に示される第１ステップから第３ステップの３つのステップを含む。
（１）ヒトから採取された血液中からＣＤ４陽性を示すＴ細胞（以下、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」とも称される。）を分離する第１ステップ。
（２）ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液中において、ＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート１２に固定された抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と反応させる第２ステップ。
（３）プレート１２からＣＤ４＋Ｔ細胞を分離して、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中においてＣＤ４＋Ｔ細胞を増幅させる第３ステップ。
[Regulatory T cell production method]
Hereinafter, a method for producing regulatory T cells using the regulatory T cell amplification apparatus 10 will be described. This regulatory T cell production method includes the following three steps from the first step to the third step.
(1) A first step of separating T cells showing CD4 positivity (hereinafter also referred to as “CD4 + T cells”) from blood collected from humans.
(2) A second step in which CD4 + T cells are reacted with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody immobilized on plate 12 in a first solution containing IL2 and TGF-β.
(3) A third step of separating CD4 + T cells from plate 12 and amplifying CD4 + T cells in a second solution containing IL2 and TGF-β.
［抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の固定］
プレート１２に抗ＣＤ３抗体（図３における参照符号１５）及び抗ＣＤ２８抗体（図３における参照符号１６）が固定されて、本発明における固相化抗体が作製される（図２：Ｓ１）。この工程は、第１ステップの直前に行われても、制御性Ｔ細胞増幅装置１０が作製される際に予め行われていてもよい。固定すべき抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）は、リン酸緩衝液などを用いて所定の濃度に調製される。抗体の濃度は、抗体の活性などの特性を考慮して適宜設定されるが、通常、１〜１００μｇ／ｍＬ程度に調製される。
[Immobilization of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody]
An anti-CD3 antibody (reference numeral 15 in FIG. 3) and an anti-CD28 antibody (reference numeral 16 in FIG. 3) are immobilized on the plate 12 to produce a solid-phased antibody in the present invention (FIG. 2: S1). This step may be performed immediately before the first step or may be performed in advance when the regulatory T cell amplification device 10 is manufactured. The anti-CD3 antibody (15) and the anti-CD28 antibody (16) to be immobilized are prepared at a predetermined concentration using a phosphate buffer or the like. The concentration of the antibody is appropriately set in consideration of characteristics such as the activity of the antibody, but is usually adjusted to about 1 to 100 μg / mL.
調製された抗体溶液がポート１３，１４を通じてバッグ１１の内部空間へ注入される。注入される抗体溶液の量はバッグ１１の容量やプレート１２の大きさなどを考慮して設定されるが、バッグ１１の内部空間においてプレート１２が抗体溶液で浸される程度の量であることが好ましい。 The prepared antibody solution is injected into the internal space of the bag 11 through the ports 13 and 14. The amount of the antibody solution to be injected is set in consideration of the capacity of the bag 11 and the size of the plate 12. preferable.
抗体溶液を注入した後、プレート１２を内包するバッグ１１を、冷蔵乃至室温で所定時間放置する。これにより、図３に示されるように、プレート１２の表面に抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）が物理的に吸着する。所定時間放置後に抗体溶液をバッグ１１から排出して、バッグ１１の内部空間及びプレート１２をリン酸緩衝液などで洗浄する。 After injecting the antibody solution, the bag 11 containing the plate 12 is allowed to stand for a predetermined period of time between refrigeration and room temperature. Thereby, as shown in FIG. 3, the anti-CD3 antibody (15) and the anti-CD28 antibody (16) are physically adsorbed on the surface of the plate 12. After leaving for a predetermined time, the antibody solution is discharged from the bag 11, and the inner space of the bag 11 and the plate 12 are washed with a phosphate buffer solution or the like.
［第１ステップ］
第１ステップでは、先ず、ヒトの末梢血又は臍帯血を採血する（図２：Ｓ２）。ヒトは患者でも健常人でもよいが、ＧＶＨＤにおける細胞療法などを目的とする場合には、移植を行った患者又はドナーから採血する。採血量は、目的とする制御性Ｔ細胞の量により異なるが、通常、１０〜５０ｍＬ程度である。採血は、採血管や注射器などを用いて公知の手法により行う。また、採血に際して末梢血又は臍帯血にヘパリンなどの凝固防止剤が加えられてもよい。
[First step]
In the first step, first, human peripheral blood or umbilical cord blood is collected (FIG. 2: S2). The human may be a patient or a healthy person, but blood is collected from the transplanted patient or donor for the purpose of cell therapy in GVHD. The amount of blood collected varies depending on the amount of target regulatory T cells, but is usually about 10 to 50 mL. Blood collection is performed by a known technique using a blood collection tube or a syringe. Further, an anticoagulant such as heparin may be added to peripheral blood or umbilical cord blood at the time of blood collection.
得られた末梢血又は臍帯血から、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する（図２：Ｓ３）。具体的には、フィコール比重遠心法を用いて末梢血又は臍帯血から単核球を分離する。次いで、免疫ビーズ法を用いて単核球からＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する。ここで、単核球とは、リンパ球及び単球を含む総称である。まず、採血により得られた末梢血又は臍帯血に対してフィコール比重遠心法における遠心分離を行ってバフィーコートを得る。このバフィーコートに、抗ＣＤ４抗体を含む液体を加えて反応させる。これにより、末梢血若しくは臍帯血、又はバフィーコート中の単核球であって、表面マーカーとしてＣＤ４分子を有する細胞、つまりＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）に抗ＣＤ４抗体が免疫結合する。つづいて、抗ＣＤ４抗体と特異的に反応する２次抗体が固定された磁気ビーズを加えて反応させる。この反応により、抗ＣＤ４抗体が免疫結合したＣＤ４＋Ｔ細胞が磁気ビーズに結合する。したがって、磁気ビーズをマグネットに吸着させることにより、反応残液を除去することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞が結合した磁気ビーズと反応残液とを分離してから、磁気ビーズからＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する。分離したＣＤ４＋Ｔ細胞は液中に浮遊するので、この液と磁気ビーズとを分離することにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞の浮遊液が得られる。なお、本工程（図２：Ｓ３）は、末梢血又は臍帯血にＣＤ４抗体を含む液体を直接加えて反応させ、次いで免疫磁気ビーズ法によりＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する手法であってもよい。また、ＣＤ４−Ｔ細胞を除去してＣＤ４＋Ｔ細胞を得る手法であってもよい。 CD4 + T cells are separated from the obtained peripheral blood or umbilical cord blood (FIG. 2: S3). Specifically, mononuclear cells are separated from peripheral blood or umbilical cord blood using Ficoll specific gravity centrifugation. CD4 + T cells are then separated from mononuclear cells using immunobead methods. Here, the mononuclear cell is a general term including lymphocytes and monocytes. First, peripheral blood or umbilical cord blood obtained by blood collection is subjected to centrifugation by Ficoll density centrifugation to obtain a buffy coat. A liquid containing an anti-CD4 antibody is added to the buffy coat and allowed to react. As a result, the anti-CD4 antibody immunologically binds to peripheral blood or umbilical cord blood, or a mononuclear cell in a buffy coat and having a CD4 molecule as a surface marker, that is, a CD4 + T cell (helper T cell). Subsequently, magnetic beads to which a secondary antibody that specifically reacts with the anti-CD4 antibody is immobilized are added and reacted. By this reaction, CD4 + T cells immunoconjugated with the anti-CD4 antibody bind to the magnetic beads. Therefore, the residual reaction liquid can be removed by adsorbing the magnetic beads to the magnet. After separating the magnetic beads to which the CD4 + T cells are bound and the reaction residual liquid, the CD4 + T cells are separated from the magnetic beads. Since separated CD4 + T cells are suspended in the liquid, by separating the resulting solution and magnetic beads, suspension of CD4 + T cells are obtained. This step (FIG. 2: S3) may be a technique in which a liquid containing CD4 antibody is directly added to and reacted with peripheral blood or umbilical cord blood, and then CD4 + T cells are separated by immunomagnetic bead method. Furthermore, CD4 - T cells may be a technique for obtaining a CD4 + T cells were removed.
［第２ステップ］
第２ステップでは、第１液を充填されたバッグ１１の内部空間において、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート１２に固定された抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）と反応させる（図２：Ｓ４）。
[Second step]
In the second step, CD4 + T cells are reacted with the anti-CD3 antibody (15) and the anti-CD28 antibody (16) immobilized on the plate 12 in the internal space of the bag 11 filled with the first liquid (FIG. 2). : S4).
バッグ１１に充填される第１液は、Ａｌｙｓ培地に、５％ヒトＡＢ型血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ＩＬ２（図４における参照符号１７）、ＴＧＦ−β（図４における参照符号１８）を添加した液である。この第１液をポート１３，１４を通じてバッグ１１の内部空間へ注入する。つづいて、前述されたＣＤ４＋Ｔ細胞の浮遊液を、ポート１３，１４を通じてバッグ１１の内部空間へ注入する。このバッグ１１を、ＣＯ２インキュベータに入れて、３７℃、５％ＣＯ２で７日間放置する。なお、放置期間中においては、適宜、第１液などをバッグ１１へ追加したり、バッグ１１を裏返したりする。この放置期間中に、ＣＤ４＋Ｔ細胞が抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）と反応するとともに、ＩＬ２（１７）、ＴＧＦ−β（１８）により刺激を受ける。 The first liquid to be filled in the bag 11 is Alys medium, 5% human AB serum, penicillin, streptomycin, amphotericin B, IL2 (reference numeral 17 in FIG. 4), TGF-β (reference numeral 18 in FIG. 4). Is a liquid to which is added. The first liquid is injected into the internal space of the bag 11 through the ports 13 and 14. Subsequently, the aforementioned suspension of CD4 + T cells is injected into the internal space of the bag 11 through the ports 13 and 14. The bag 11 is placed in a CO 2 incubator and left at 37 ° C. and 5% CO 2 for 7 days. During the leaving period, the first liquid or the like is appropriately added to the bag 11 or the bag 11 is turned over. During this standing period, CD4 + T cells react with anti-CD3 antibody (15) and anti-CD28 antibody (16) and are stimulated by IL2 (17) and TGF-β (18).
詳細には、第１液中において、ＣＤ４＋Ｔ細胞２０の抗原受容体であるＣＤ３（図４における参照符号２１）及びＣＤ２８（図４における参照符号２２）に抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）がそれぞれ結合する。これにより、ＣＤ３（２１）及びＣＤ２８（２２）を介してＣＤ４＋Ｔ細胞２０が刺激を受ける。 Specifically, in the first fluid, CD3 (reference numeral 21 in FIG. 4) and CD28 (reference numeral 22 in FIG. 4), which are antigen receptors of CD4 + T cells 20, are anti-CD3 antibody (15) and anti-CD28. Each antibody (16) binds. As a result, the CD4 + T cells 20 are stimulated via CD3 (21) and CD28 (22).
さらに、第１液に含まれるＩＬ２（１７）及びＴＧＦ−β（１８）によってもＣＤ４＋Ｔ細胞２０が刺激を受ける。ＣＤ４＋Ｔ細胞２０には、ＣＤ２５陰性（−）ＦｏｘＰ３陰性（−）Ｔ細胞も含まれるが、これらの刺激によってＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞に転換されると想定される。つまり、プレート１２に固定された抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）と結合したＣＤ４＋Ｔ細胞２０がＩＬ２（１７）及びＴＧＦ−β（１８）に刺激されることによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞２０からＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が選択的に増幅される。この選択的な増幅により、バッグ１１におけるＣＤ４＋Ｔ細胞２０の大半がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞となる。 Furthermore, the CD4 + T cell 20 is also stimulated by IL2 (17) and TGF-β (18) contained in the first fluid. CD4 + T cells 20 include CD25 negative (−) FoxP3 negative (−) T cells, but it is assumed that CD4 + CD25 − FoxP3 − T cells are converted to CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells by these stimulations. Is done. That is, CD4 + T cells 20 bound to anti-CD3 antibody (15) and anti-CD28 antibody (16) immobilized on plate 12 are stimulated by IL2 (17) and TGF-β (18), thereby causing CD4 + CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells are selectively amplified from T cells 20. By this selective amplification, most of the CD4 + T cells 20 in the bag 11 become CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells.
［第３ステップ］
第３ステップでは、プレート１２からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が分離されて（図２：Ｓ５）、第２液中においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が増幅される（図２：Ｓ６）。
[Third step]
In the third step, CD4 + CD25 + T cells are separated from the plate 12 (FIG. 2: S5), and CD4 + CD25 + T cells are amplified in the second liquid (FIG. 2: S6).
プレート１２からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の分離は、セルリフターを用いてバッグ１１の壁越しにプレート１２に結合されたＣＤ４＋Ｔ細胞２０を掻き取ることにより行われる。掻き取られたＣＤ４＋Ｔ細胞２０はバッグ１１内において第１液中に浮遊する。そして、バッグ１１の同様のバッグをポート１３又はポート１４に連結して、バッグ１１内の第１液を移し取る。移し取られた第１液にはＣＤ４＋Ｔ細胞２０が浮遊しているので、遠心分離により、このＣＤ４＋Ｔ細胞２０の細胞浮遊液を収集する。 Separation of CD4 + CD25 + T cells from the plate 12 is performed by scraping the CD4 + T cells 20 bound to the plate 12 through the wall of the bag 11 using a cell lifter. The scraped CD4 + T cells 20 float in the first solution in the bag 11. And the same bag of the bag 11 is connected to the port 13 or the port 14, and the 1st liquid in the bag 11 is transferred. Since CD4 + T cells 20 are suspended in the transferred first liquid, the cell suspension of CD4 + T cells 20 is collected by centrifugation.
収集されたＣＤ４＋Ｔ細胞２０の細胞浮遊液を、公知の培養バッグなどに注入して培養する。この培養バッグには第２液を充填する。本実施形態で用いられる第２液は、前述された第１液と同じ組成であり、Ａｌｙｓ培地（細胞科学研究所社製）に、５％ヒトＡＢ型血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ＩＬ２、ＴＧＦ−βを添加した液である。この第２液を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞２０を培養する。この培養は、３７℃、５％ＣＯ２で７日間行う。なお、培養期間中においては、適宜、第２液などを培養バッグへ追加する。培養後に、遠心分離により、培養バッグからＣＤ４＋Ｔ細胞２０を収集する。このＣＤ４＋Ｔ細胞２０の大半がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。得られたＣＤ４＋Ｔ細胞２０の細胞浮遊液は、Ａｌｙｓ培地及びＤＭＳＯを含む液体中で凍結保存することもできる（図２：Ｓ７）。 The collected cell suspension of CD4 + T cells 20 is injected into a known culture bag and cultured. The culture bag is filled with the second liquid. The second liquid used in the present embodiment has the same composition as the first liquid described above, and is added to an Alys medium (manufactured by Cell Science Laboratories) with 5% human AB serum, penicillin, streptomycin, amphotericin B, IL2 , TGF-β added. Using this second solution, CD4 + T cells 20 are cultured. This culture is carried out at 37 ° C. and 5% CO 2 for 7 days. During the culture period, the second solution and the like are added to the culture bag as appropriate. After culture, CD4 + T cells 20 are collected from the culture bag by centrifugation. Most of the CD4 + T cells 20 are CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells. The obtained cell suspension of CD4 + T cells 20 can also be cryopreserved in a liquid containing Alys medium and DMSO (FIG. 2: S7).
［制御性Ｔ細胞の確認］
前述された制御性Ｔ細胞製造方法により得られたＣＤ４＋Ｔ細胞２０に制御性Ｔ細胞が含まれることは、以下の２つの方法により確認される。
[Confirmation of regulatory T cells]
It is confirmed by the following two methods that the regulatory T cells are contained in the CD4 + T cells 20 obtained by the regulatory T cell production method described above.
［確認方法１］
確認方法の１つめとしては、ＣＤ４＋Ｔ細胞２０に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が含まれることを直接フローサイトメトリーを用いて判定する方法があげられる。この方法では、主に、ＣＤ４＋Ｔ細胞２０の細胞膜の透過処理を施してから、ＣＤ２５抗体及びＦｏｘＰ３抗体を用いて免疫染色を施すことにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞を確認することができる。また、この方法によれば、全ＣＤ４＋Ｔ細胞２０におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の存在比率を算出することもできる。
[Confirmation method 1]
As a first confirmation method, there is a method for directly determining by using flow cytometry that CD4 + T cells 20 contain CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells. In this method, CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells can be confirmed mainly by performing permeabilization of the cell membrane of CD4 + T cells 20 and then immunostaining with CD25 antibody and FoxP3 antibody. it can. According to this method, the abundance ratio of CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells in all CD4 + T cells 20 can also be calculated.
［確認方法２］
確認方法の２つめとしては、混合リンパ球反応系に上記第３ステップにより増幅されたＴ細胞を加えることにより、レスポンダーＴ細胞の増殖が抑制されることを確認する方法があげられる。この判定は、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応（ＭＬＲ：Mixed Lympfocyte Reaction）を用いて行うことができる。具体的には、ヒト由来の単核球をレスポンダーＴ細胞とし、自己又は同種の樹状細胞若しくはリンパ球を刺激細胞とする混合リンパ球反応の系に、上記第３ステップにより得られたＣＤ４＋Ｔ細胞２０を添加して培養する。レスポンダーＴ細胞に対する増殖抑制効果の判定は、主にフローサイトメトリーにより、レスポンダーＴ細胞を染色した化合物の輝度の減衰度にて行われる。この確認手法において、レスポンダーＴ細胞が染色される。染色は、例えば、ＣＦＳＥ染色キット（Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit、ダイナール・インビトロゲン社製）を用いて行うことができる。
[Confirmation method 2]
As a second confirmation method, there is a method for confirming that the proliferation of responder T cells is suppressed by adding the T cells amplified in the third step to the mixed lymphocyte reaction system. This determination can be performed using a mixed lymphocyte reaction (MLR) in which a human-derived mononuclear cell is a responder T cell, and self or the same type of dendritic cell or lymphocyte is a stimulating cell. Specifically, the CD4 + obtained by the above-mentioned third step was added to a mixed lymphocyte reaction system using human-derived mononuclear cells as responder T cells and autologous or allogeneic dendritic cells or lymphocytes as stimulating cells. T cells 20 are added and cultured. The growth inhibitory effect on the responder T cells is determined mainly by flow cytometry based on the brightness attenuation of the compound that stained the responder T cells. In this confirmation procedure, responder T cells are stained. Staining can be performed, for example, using a CFSE staining kit (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit, manufactured by Dynal Invitrogen).
［本実施形態の効果］
本制御性Ｔ細胞製造方法によれば、ヒト末梢血又は臍帯血から分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞２０を、ＩＬ２（１７）及びＴＧＦ−β（１８）を含む第１液中において抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）により刺激した後、抗ＣＤ３抗体（１５）及び抗ＣＤ２８抗体（１６）から分離して増幅させるので、ＣＤ４＋Ｔ細胞２０からＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が選択的に増幅されて、制御性Ｔ細胞を特異的かつ効率的に得ることができる。これにより、採血量を少なくしてヒトへの負担を軽減し、かつ細胞療法に必要な量の制御性Ｔ細胞を簡易に得ることができる。特に、制御性Ｔ細胞増幅装置１０を用いることにより、本制御性Ｔ細胞製造方法を簡便に実施できる。
[Effect of this embodiment]
According to this regulatory T cell production method, CD4 + T cells 20 isolated from human peripheral blood or umbilical cord blood are treated with anti-CD3 antibody (in the first solution containing IL2 (17) and TGF-β (18) ( 15) and anti-CD28 antibody (16), and then the CD4 + T cells 20 to CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells are separated from the anti-CD3 antibody (15) and the anti-CD28 antibody (16) and amplified. It can be selectively amplified to obtain regulatory T cells specifically and efficiently. As a result, the amount of blood collected can be reduced to reduce the burden on humans, and the amount of regulatory T cells necessary for cell therapy can be easily obtained. In particular, by using the regulatory T cell amplifying apparatus 10, the present regulatory T cell production method can be easily carried out.
［第１変形例］
前述された実施形態では、バッグ１１の内部空間にプレート１２が封入されているが、本発明における不溶担体は、プレート形状以外の他の形状が採用されてもよい。例えば、図５に示されるように、バッグ１１の内部空間に複数のビーズ３１が封入されてもよい。ビーズ３１の素材として、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂を用いることができる。また、ビーズ３１は、その内部に磁性体が用いられた磁性ビーズであってもよい。このビーズ３１への抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の固定は、プレート１２と同様の手法を用いることができる。
[First Modification]
In the above-described embodiment, the plate 12 is enclosed in the internal space of the bag 11, but the insoluble carrier in the present invention may have a shape other than the plate shape. For example, as shown in FIG. 5, a plurality of beads 31 may be enclosed in the internal space of the bag 11. As a material for the beads 31, a synthetic resin such as polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, or polypropylene can be used. Further, the beads 31 may be magnetic beads in which a magnetic material is used. For immobilization of the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody to the beads 31, the same technique as that for the plate 12 can be used.
［第２変形例］
前述された実施形態では、本発明における不溶担体として、バッグ１１とは別のプレート１２が用いられているが、本発明における不溶担体は、バッグなどの容器と一体に構成されていてもよい。不溶担体を容器と一体に構成する場合には、不溶担体は、容器が第１液を保持する空間の少なくとも一部を構成し、かつ保持された第１液と接触しうる部材である。
[Second Modification]
In the above-described embodiment, the plate 12 different from the bag 11 is used as the insoluble carrier in the present invention, but the insoluble carrier in the present invention may be integrated with a container such as a bag. When the insoluble carrier is configured integrally with the container, the insoluble carrier is a member that constitutes at least a part of the space in which the container holds the first liquid and can be in contact with the held first liquid.
例えば、図６に示されるように、バッグ３２の内壁の一部を不溶担体としてもよい。バッグ３２は、バッグ１１と同様に２枚の樹脂シート３３，３４から構成されているが、これら樹脂シート３３，３４は、第１液を保持した状態で撓むことなく形状を維持する曲げ剛性を有する。この曲げ剛性は、樹脂シート３３，３４の素材、厚み、ラミネート構造などによって達成される。例えば、樹脂シート３３，３４の素材として低密度ポリエチレンを選択した場合には厚みを２００μｍ以上とすることにより適度な曲げ剛性が得られる。また、樹脂シート３３，３４の素材として超高分子量ポリエチレンを選択した場合には厚みを２５μｍ以上とし、環状ポリオレフィン系樹脂を選択した場合には厚みを１００μｍ以上とすることにより適度な曲げ剛性が得られる。 For example, as shown in FIG. 6, a part of the inner wall of the bag 32 may be used as an insoluble carrier. The bag 32 is composed of two resin sheets 33 and 34 as in the case of the bag 11, but the resin sheets 33 and 34 have a bending rigidity that maintains the shape without being bent while holding the first liquid. Have This bending rigidity is achieved by the material, thickness, laminate structure, and the like of the resin sheets 33 and 34. For example, when low density polyethylene is selected as the material for the resin sheets 33 and 34, moderate bending rigidity can be obtained by setting the thickness to 200 μm or more. In addition, when ultra-high molecular weight polyethylene is selected as the material for the resin sheets 33 and 34, a thickness of 25 μm or more is selected. When a cyclic polyolefin resin is selected, a thickness of 100 μm or more is obtained to obtain an appropriate bending rigidity. It is done.
そして、樹脂シート３３，３４の内壁の一部を抗体固定領域３５（図６において２点鎖線で囲まれた領域）とする。この抗体固定領域３５は、抗体を固定可能な樹脂素材を樹脂シート３３，３４の内壁側に積層して形成されている。この抗体固定領域３５に、前述された手法によって抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定される。そして、バッグ３２の内部空間に第１液が充填されることにより、抗体固定領域３５が第１液と接触する。 A part of the inner walls of the resin sheets 33 and 34 is defined as an antibody fixing region 35 (a region surrounded by a two-dot chain line in FIG. 6). The antibody fixing region 35 is formed by laminating a resin material capable of fixing an antibody on the inner wall side of the resin sheets 33 and 34. The anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody are fixed to the antibody fixing region 35 by the method described above. Then, the antibody fixing region 35 comes into contact with the first liquid by filling the internal space of the bag 32 with the first liquid.
以下に、本発明の実施例が説明される。本実施例は、本発明の一実施形態であり、本発明が実施例に記載された態様に限定されないことは言うまでもない。 In the following, examples of the present invention are described. This example is one embodiment of the present invention, and it goes without saying that the present invention is not limited to the mode described in the example.
［実施例１］
制御性Ｔ細胞増幅装置１０のバッグ１１及びプレート１２は、ニプロ社にて製造されたものを用いた。抗ヒトＣＤ３抗体（オルソクローン、ヤンセン協和／協和発酵社製）及び抗ヒトＣＤ２８抗体（eBiosience社製）をリン酸緩衝液で希釈して各々５μg/ｍＬとして抗体溶液を調製した。予め内部をリン酸緩衝液で洗浄したバッグ１１に、この抗体溶液５ｍＬを注入し、室温に３０分間放置した後、４℃で冷蔵保存した。そして、後述される制御性Ｔ細胞製造方法を実施する前に、バッグ１１内から抗体溶液を排出してリン酸緩衝液で洗浄した（Ｓ１）。
[Example 1]
The bag 11 and the plate 12 of the regulatory T cell amplifying apparatus 10 were manufactured by Nipro. Anti-human CD3 antibody (Orthoclone, manufactured by Janssen Kyowa / Kyowa Hakko) and anti-human CD28 antibody (eBiosience) were diluted with a phosphate buffer to prepare an antibody solution of 5 μg / mL each. 5 mL of this antibody solution was poured into a bag 11 whose interior had been previously washed with a phosphate buffer, left at room temperature for 30 minutes, and then refrigerated at 4 ° C. And before implementing the regulatory T cell manufacturing method mentioned later, the antibody solution was discharged | emitted from the bag 11, and it wash | cleaned with the phosphate buffer (S1).
５例の健常人から末梢血２０ｍＬをそれぞれヘパリン加採血し（Ｓ２）、予め３ｍＬフィコール（GE-Amersham Pharmacia社製）を分注したコニカルチューブ（１５ｍＬ、コーニング社製）社に、各末梢血をそれぞれ重層した。そのコニカルチューブを、１８００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、分離されたバフィーコートを採取した。得られたバフィーコートにリン酸緩衝液を加えて２度遠心分離し（１，５００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、Ａｌｙｓ培地（Alys505Nw/oIL2、細胞化学研究所製）を加えて細胞浮遊液を得た。 Peripheral blood 20 mL was collected from 5 healthy individuals with heparin (S2), and each peripheral blood was transferred to a conical tube (15 mL, Corning) with 3 mL Ficoll (GE-Amersham Pharmacia) dispensed in advance. Each was layered. The conical tube was centrifuged at 1800 rpm for 20 minutes, and the separated buffy coat was collected. Phosphate buffer solution is added to the obtained buffy coat and centrifuged twice (1,500 rpm, 10 minutes, 4 ° C.), and Alys medium (Alys505Nw / oIL2, manufactured by Cytochemical Laboratories) is added to the cell suspension. Obtained.
前述された細胞浮遊液に、抗ＣＤ４抗体（Dynabeads FlowComp Human CD4、ダイナール・インビトロゲン社製）を５μＬ／１×１０７ｃｅｌｌの割合で添加して、４℃、１０分間放置して反応させた。１回、分離用の緩衝液（PBS, 0.1% AB serum, 2mM EDTA）にて洗浄後、分離用の緩衝液２００μＬ／１×１０７ｃｅｌｌの割合で細胞を浮遊させ、磁性ビーズ（Dynabeads FlowComp Human CD4、ダイナール・インビトロゲン社製）を１５μＬ／１×１０７ｃｅｌｌの割合でそれぞれ加えて、４℃、１５分間撹拌した。マグネットにより磁性ビーズを固定して上清を廃棄及び洗浄した後、製品添付のリリース緩衝液（Dynabeads FlowComp Human CD4、ダイナール・インビトロゲン社製）を加えて室温で１０分間撹拌して、磁性ビーズからＣＤ４＋Ｔ細胞を遊離させた（Ｓ３）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の浮遊液の一部を試験して、純度が９５％以上であることを確認した。 An anti-CD4 antibody (Dynabeads FlowComp Human CD4, manufactured by Dynal Invitrogen) was added to the cell suspension described above at a rate of 5 μL / 1 × 10 7 cells, and allowed to react at 4 ° C. for 10 minutes. . After washing once with a separation buffer (PBS, 0.1% AB serum, 2 mM EDTA), cells are suspended at a ratio of separation buffer of 200 μL / 1 × 10 7 cells, and magnetic beads (Dynabeads FlowComp Human CD4 (manufactured by Dynal Invitrogen) was added at a ratio of 15 μL / 1 × 10 7 cells, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 15 minutes. After fixing the magnetic beads with a magnet and discarding and washing the supernatant, add the release buffer (Dynabeads FlowComp Human CD4, manufactured by Dynal Invitrogen) attached to the product, and stir at room temperature for 10 minutes. CD4 + T cells were released (S3). A portion of the suspension of CD4 + T cells was tested to confirm that the purity was 95% or higher.
ＣＤ４＋Ｔ細胞の浮遊液を、第１液（Alys 505N, 5% AB serum, Penicilin, Streptomycin, Amphotericin B, recombinat human IL2 200U/ml, recombinant human TGF-β1, 10ng/ml）を用いて５×１０５ｃｅｌｌ／５ｍＬに調製して、１０ｍＬをバッグ１１に注入した。そのバッグ１１をＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて、１日毎にバッグ１１を裏返し、３日目に第１液を適宜追加した（Ｓ４）。 The suspension of CD4 + T cells is 5 × using the first solution (Alys 505N, 5% AB serum, Penicilin, Streptomycin, Amphotericin B, recombinat human IL2 200 U / ml, recombinant human TGF-β1, 10 ng / ml). 10 5 cell / 5 mL was prepared, and 10 mL was injected into the bag 11. The bag 11 was placed in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ), the bag 11 was turned over every day, and the first liquid was added as appropriate on the third day (S4).
７日目に、セルリフターを用いてバッグ１１の壁越しにプレート１２からＣＤ４＋Ｔ細胞を剥がし取り、バッグ１１内の細胞浮遊液５０ｍＬをコニカルチューブへ移した（Ｓ５）。このコニカルチューブ内の細胞浮遊液を遠心分離（４００Ｇ、１０分間、４℃）した後、上清を廃棄した。このコニカルチューブに第２液（Alys 505N, 5% AB serum, Penicilin, Streptomycin, Amphotericin B, recombinat human IL2 200U/ml, recombinant human TGF-β1, 5ng/ml）を１×１０７cellあたり５０ｍＬを加え、これを２次培養バッグ（ニプロ社製）に移した。その２次培養バッグをＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて培養した（Ｓ６）。３日目及び６日目（初期から１０日目及び１３日目）に第２液を適宜追加した。 On the seventh day, CD4 + T cells were peeled from the plate 12 through the wall of the bag 11 using a cell lifter, and 50 mL of the cell suspension in the bag 11 was transferred to a conical tube (S5). The cell suspension in the conical tube was centrifuged (400 G, 10 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was discarded. Second liquid to the conical tube (Alys 505N, 5% AB serum , Penicilin, Streptomycin, Amphotericin B, recombinat human IL2 200U / ml, recombinant human TGF-β1, 5ng / ml) to 1 × 10 7 cell per 50mL added This was transferred to a secondary culture bag (Nipro). The secondary culture bag was placed in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) and cultured (S6). The 2nd liquid was added suitably on the 3rd day and the 6th day (the 10th day and the 13th day from the initial stage).
１４日目に、２次培養バッグから評価試験用サンプルを採取すると共に、前述と同様にコニカルチューブを用いて２次培養バッグの細胞浮遊液を得た。 On the 14th day, a sample for evaluation test was collected from the secondary culture bag, and a cell suspension of the secondary culture bag was obtained using a conical tube as described above.
［実施例２］
５例の健常人の末梢血（サンプルＮｏ．１〜５）に代えて、予めインフォームドコンセントを得た慢性ＧＶＨＤ患者の末梢血（サンプルＮｏ．６）及び臍帯血移植患者の末梢血（サンプルＮｏ．７）を用いたこと以外は、前述された実施例１と同様に行った。
[Example 2]
Instead of the peripheral blood (sample Nos. 1 to 5) of 5 healthy individuals, the peripheral blood (sample No. 6) of a chronic GVHD patient who obtained informed consent in advance and the peripheral blood (sample No. of a umbilical cord blood transplant patient) .7) was performed in the same manner as in Example 1 described above.
［比較例１］
第１液及び第２液においてＴＧＦ−β１を加えなかったこと以外は実施例１と同様に行った。
[Comparative Example 1]
The same procedure as in Example 1 was performed except that TGF-β1 was not added in the first solution and the second solution.
［実験例１］
実施例１、実施例２及び比較例１におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の確認をフローサイトメトリーを用いて行った。
[Experiment 1]
Confirmation of CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells in Example 1, Example 2 and Comparative Example 1 was performed using flow cytometry.
フローサイトメトリー測定用のチューブに、上記で採取した実施例１及び比較例１の評価試験用サンプルを０．５〜１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬチューブ添加し、１００μＬリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に浮遊させた。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２５抗体５μＬ、ＥＣＤ標識抗ＣＤ４（若しくはＣＤ６９）抗体を２μＬ添加し細胞表面を公知の方法でまず標識した。死細胞を区別するためにエチジウムモノアジドブロマイド（ＥＭＡ、Molecular Probe社製）を最終濃度５μｇ／ｍＬとなるように加え、一旦氷上で近距離（蛍光灯下１０〜２０ｃｍ）から蛍光灯の光を１０分間あてた。光を当てた後に、PE antihuman Foxp3 Staining Set（eBioScience社製）の方法に準じて染色した。即ち、Fixation/Permealization buffer（１：３で希釈、PE antihuman Foxp3 Staining Set付属）を加え、３０分間から１時間４℃遮光にて放置した。その後１回ＰＢＳにて洗浄後、０．５ｍＬのPermealization buffer（PE antihuman Foxp3 Staining Set付属）にてさらに２回洗浄後、デカントで上清を廃棄した。残りの細胞浮遊液に２％(０．５μＬ) normal rat serum（PE antihuman Foxp3 Staining Set付属）およびＰＥ標識抗ＦｏｘＰ３抗体（eBioScience社製）を１０μＬ添加し４℃、３０分間静置した。Permealization buffer ０．５ｍＬにて２回洗浄後、適量のＰＢＳに浮遊させた。この細胞浮遊液の入ったフローサイトメトリー測定用のチューブをフローサイトメトリー（EPICS XL、ベックマン・コールター株式会社製）にセットし、測定を行った。その結果を解析し、ＣＤ４＋Ｔ細胞数におけるＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の存在比率を算出した。その結果を表１に示す。 The sample for evaluation test of Example 1 and Comparative Example 1 collected above is added to a tube for flow cytometry measurement in a 0.5 to 1 × 10 6 cell / mL tube and added to 100 μL phosphate buffer (PBS). Floated. First, 5 μL of FITC-labeled anti-CD25 antibody and 2 μL of ECD-labeled anti-CD4 (or CD69) antibody were added, and the cell surface was first labeled by a known method. In order to distinguish dead cells, ethidium monoazide bromide (EMA, manufactured by Molecular Probe) was added to a final concentration of 5 μg / mL, and light from a fluorescent lamp was once irradiated on ice from a short distance (10-20 cm under fluorescent lamp). I hit it for 10 minutes. After light exposure, staining was performed according to the method of PE antihuman Foxp3 Staining Set (manufactured by eBioScience). That is, Fixation / Permealization buffer (diluted 1: 3, attached with PE antihuman Foxp3 Staining Set) was added and left for 30 minutes to 1 hour at 4 ° C. with light shielding. Thereafter, the plate was washed once with PBS, further washed twice with 0.5 mL of Permealization buffer (attached to PE antihuman Foxp3 Staining Set), and the supernatant was discarded by decantation. 10 μL of 2% (0.5 μL) normal rat serum (attached to PE antihuman Foxp3 Staining Set) and PE-labeled anti-FoxP3 antibody (manufactured by eBioScience) were added to the remaining cell suspension and left at 4 ° C. for 30 minutes. After washing twice with 0.5 mL of Permealization buffer, it was suspended in an appropriate amount of PBS. The tube for flow cytometry measurement containing this cell suspension was set in flow cytometry (EPICS XL, manufactured by Beckman Coulter, Inc.) and measured. The results were analyzed, and the abundance ratio of CD25 + FoxP3 + T cells in the number of CD4 + T cells was calculated. The results are shown in Table 1.
表１から明らかなように、実施例により培養された全Ｔ細胞数に対する制御性Ｔ細胞が占める細胞数の割合は、少なくとも４５％以上であった。一方、比較例１では、最も高い割合で４２％であった。このことから、本制御性Ｔ細胞製造方法により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が効率的に増幅されることが明らかとなった。 As apparent from Table 1, the ratio of the number of regulatory T cells to the total number of T cells cultured according to the examples was at least 45% or more. On the other hand, in Comparative Example 1, the highest ratio was 42%. From this, it was revealed that CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells are efficiently amplified by the present regulatory T cell production method.
また、上記第１ステップにおいて分離された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）に対して、上記第３ステップにより増幅された全Ｔ細胞に含まれる制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）の増幅率を、前述されたフローサイトメトリーの測定結果から算出して表２に示した。なお、増幅率は、実施例１及び比較例１については５例（サンプルＮｏ．１〜５）の平均値±ＳＤが示され、実施例２については各例（サンプルＮｏ．６，７）において算出された値が示されている。 Moreover, the regulatory property contained in the whole T cell amplified by the said 3rd step with respect to the regulatory T cell (CD4 + CD25 + FoxP3 + T cell) contained in the whole T cell isolate | separated in the said 1st step. The amplification rate of T cells (CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells) was calculated from the flow cytometry measurement results described above and shown in Table 2. As for the amplification factor, an average value ± SD of 5 examples (sample Nos. 1 to 5) is shown for Example 1 and Comparative Example 1, and each example (sample Nos. 6 and 7) for Example 2 is shown. The calculated value is shown.
実施例１では、培養０日目の細胞数に対して６２，２４９±３３，５９７倍の細胞が得られた。また、実施例２のサンプルＮｏ．６では、培養０日目の細胞数に対して８６，７６７倍の細胞が得られ、サンプルＮｏ．７では、培養０日目の細胞数に対して６０２，７８４倍の細胞が得られた。一方、比較例１では、２６，３４０±２７，７８１倍であった。この結果から、本制御性Ｔ細胞製造方法が、当業者の予測を遙かに超えた倍率でＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増幅を可能とすることが明らかとなった。 In Example 1, 62,249 ± 33,597 times as many cells as the number of cells on day 0 of culture were obtained. In addition, sample No. 6 obtained 86,767 times the number of cells on day 0 of culture. In No. 7, 602,784 times the number of cells on day 0 of culture was obtained. On the other hand, in Comparative Example 1, it was 26,340 ± 27,781 times. From this result, it became clear that this regulatory T cell production method enables the amplification of CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells at a magnification far exceeding the prediction of those skilled in the art.
［実験例２］
実施例１及び比較例１におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増殖抑制効果の確認を、混合リンパ球反応とフローサイトメトリーを組み合わせた方法により評価を行った。
[Experimental example 2]
The confirmation of the growth inhibitory effect of CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells in Example 1 and Comparative Example 1 was evaluated by a method combining a mixed lymphocyte reaction and flow cytometry.
（１）レスポンダーＴ細胞の懸濁液の調製
まず、レスポンダーＴ細胞を調製した。具体的には、サンプルＮｏ．1の提供者の末梢血２０ｍＬをヘパリン加採血し、予め３ｍＬのLymphoprep液（AXIS-SHIELD PoC AS社製）を分注したコニカルチューブに、各個体の末梢血をそれぞれ重層した。そのコニカルチューブを、１，８００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、分離された単核球を採取した。得られた単核球にリン酸緩衝液を加えて２度遠心分離し（１，５００ｒｐｍ、５分間）、リン酸緩衝液を加えて、１〜５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのレスポンダーＴ細胞懸濁液を得た。これに、ＣＦＳＥ最終濃度１μＭ（１ｍＭのストックを１０００倍希釈）となるように添加し、約１５分間、３７℃、遮光環境下で、培養した。培養は、途中で撹拌しながら行った。その後、４℃で、２％ＡＢ型血清のリン酸緩衝溶液を１ｍＬ添加し、さらにリン酸緩衝液を加えて、染色の反応を止めた。遠心分離後、リン酸緩衝液をAssay Medium（Alys 505N, 10% AB serum）に置き換えて、レスポンダーＴ細胞を再度洗浄した。その後、適量のAssay Mediumを添加後、血球計算板（萱垣製作所社製）により、レスポンダーＴ細胞の細胞数をカウントした。そして、Assay Mediumを用いて、細胞濃度が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、レスポンダーＴ細胞の懸濁液を調製した。また、後述の混合リンパ球反応における、コントロールとしてこのレスポンダーＴ細胞の懸濁液を、ポジティブコントロールとしてこのレスポンダーＴ細胞の懸濁液にPHA-L (5μg／ｍＬ添加)をそれぞれ用意した。
(1) Preparation of responder T cell suspension First, responder T cells were prepared. Specifically, sample no. Peripheral blood of each individual was layered on a conical tube in which 20 mL of peripheral blood of donor 1 was heparinized and pre-dispensed with 3 mL of Lymphoprep solution (manufactured by AXIS-SHIELD PoC AS). The conical tube was centrifuged at 1,800 rpm for 20 minutes, and the separated mononuclear cells were collected. Phosphate buffer solution is added to the obtained mononuclear cells and centrifuged twice (1,500 rpm, 5 minutes). Phosphate buffer solution is added, and 1-5 × 10 6 cells / mL responder T cell suspension is added. A turbid liquid was obtained. To this, CFSE was added at a final concentration of 1 μM (1 mM stock diluted 1000-fold), and cultured for about 15 minutes at 37 ° C. in a light-shielded environment. Incubation was performed while stirring. Then, 1 mL of a 2% AB type serum phosphate buffer solution was added at 4 ° C., and a phosphate buffer solution was further added to stop the staining reaction. After centrifugation, the responder T cells were washed again by replacing the phosphate buffer with Assay Medium (Alys 505N, 10% AB serum). Thereafter, after adding an appropriate amount of Assay Medium, the number of responder T cells was counted with a hemocytometer (manufactured by Higaki Co., Ltd.). Then, a suspension of responder T cells was prepared using Assay Medium so that the cell concentration was 2 × 10 6 cells / mL. In the mixed lymphocyte reaction described later, a suspension of the responder T cells was prepared as a control, and PHA-L (added at 5 μg / mL) was prepared as a positive control.
（２）樹状細胞の懸濁液の調製
次に、樹状細胞を調製した。制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞と同一者を自己、他人を同種として上記（１）の採血(混合リンパ球反応試験日)より概ね１週間前に採取し、それぞれの単核球を、リン酸緩衝液を用いて、細胞濃度が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製した。次に、１０ｃｍ Ｄｉｓｈにこの細胞懸濁液１０ｍＬを入れ、３７℃、５％ＣＯ２環境下で、約２時間培養した。浮遊細胞を除去した後、培養液を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地に置換し、サイトカインとして、ＩＬ４を５００Ｕ／ｍＬ、ＧＭ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍＬを加えて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で、約６日間培養した。これにより、未熟樹状細胞が作製される。さらに、浮遊細胞を除去した後、再度１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で、３７℃、５％ＣＯ２環境下で、ＴＮＦ−α ２０ｎｇ／ｍＬを加えて約２日間培養した。これにより、成熟樹状細胞が作製される。スクレーパー又はセルリプターを用いて付着細胞を剥離し、浮遊細胞も含めて細胞を回収した。そして、Assay Mediumを用いて、細胞濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、樹状細胞の懸濁液を調製した。なお、この懸濁液は、５０Ｇｙのγ線を照射して、樹状細胞自体の増殖はできないようにした。また、同種の樹状細胞の懸濁液を調製するために、サンプルＮｏ．３の提供者にも協力いただいた。
(2) Preparation of Dendritic Cell Suspension Next, dendritic cells were prepared. The T cells including regulatory T cells are taken as the same person as the T cell and the other person as the same species, and collected approximately one week before the blood collection (mixed lymphocyte reaction test day) in the above (1). A cell suspension was prepared using a buffer solution so that the cell concentration was 1 × 10 6 cells / mL. Next, 10 mL of this cell suspension was placed in a 10 cm dish and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment for about 2 hours. After removing floating cells, the culture medium was replaced with RPMI medium containing 10% FCS, and 500 U / mL IL4 and 10 ng / mL GM-CSF were added as cytokines at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment. And cultured for about 6 days. Thereby, immature dendritic cells are produced. Furthermore, after removing floating cells, TNF-α 20 ng / mL was added to the RPMI medium containing 10% FCS again in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 for about 2 days. Thereby, mature dendritic cells are produced. Adherent cells were detached using a scraper or a cell lifter, and cells including floating cells were collected. Then, a suspension of dendritic cells was prepared using Assay Medium so that the cell concentration was 2 × 10 5 cells / mL. This suspension was irradiated with 50 Gy of γ rays so that the dendritic cells themselves could not grow. In addition, in order to prepare a suspension of dendritic cells of the same type, sample no. 3 donors also cooperated.
（３）制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の懸濁液の調製
まず、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の懸濁液を調製した。具体的には、上記で採取した実施例１の評価試験用サンプル（サンプルＮｏ．１、１×１０７ｃｅｌｌｓ）を回収した後、無血清・無抗生剤ＲＰＭＩ培地にて２回洗浄し、２５μＬ以下となるように、上清を除去した。次に、ＰＫＨ２６染色キット（Mini26-1KT PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, for General Cell Membrane Labeling, #037K0464, Sigma社製）を用いて、この評価試験用サンプルの制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞を染色した。具体的には、洗浄した実施例１及び比較例１の評価試験用サンプルに、上記キット添付のDiluent Cを０．５ｍＬを加え、次いで、ＰＫＨ２６溶液（４×１０−６M）を０．５ｍＬを加えた。そして、ときどき撹拌しながら室温（２５℃）で、５分間培養した。その後、２％ＡＢ型血清のリン酸緩衝溶液を１ｍＬ添加して反応を止め、１分間室温（２５℃）で放置した。その後、Assay Mediumを加え、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、Assay Mediumで３回洗浄した。血球計算板（萱垣製作所社製）により、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞数をカウントした。最後に、Assay Mediumを用いて、細胞濃度が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の懸濁液を調製した。
(3) Preparation of suspension of T cells containing regulatory T cells First, a suspension of T cells containing regulatory T cells was prepared. Specifically, after collecting the sample for evaluation test (sample No. 1, 1 × 10 7 cells) collected in Example 1 above, the sample was washed twice with a serum-free / antibiotic RPMI medium, and 25 μL. The supernatant was removed so that: Next, using the PKH26 staining kit (Mini26-1KT PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, for General Cell Membrane Labeling, # 037K0464, manufactured by Sigma), T cells containing regulatory T cells of this evaluation test sample were obtained. Stained. Specifically, 0.5 mL of Diluent C attached to the kit was added to the washed samples for evaluation test of Example 1 and Comparative Example 1, and then 0.5 mL of PKH26 solution (4 × 10 −6 M) was added. Was added. And it culture | cultivated for 5 minutes at room temperature (25 degreeC), stirring occasionally. Thereafter, 1 mL of 2% AB type serum phosphate buffer solution was added to stop the reaction, and the mixture was allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 1 minute. Thereafter, Assay Medium was added and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, followed by washing with Assay Medium three times. The number of T cells including regulatory T cells was counted with a hemocytometer (manufactured by Higaki Corporation). Finally, a suspension of T cells containing regulatory T cells was prepared using Assay Medium so that the cell concentration was 1 × 10 6 cells / mL.
（４）混合リンパ球反応
上記（１）〜（３）の各細胞懸濁液を用いて、混合リンパ球反応を行った。詳細には、上記（１）〜（３）の各細胞懸濁液を、下記表３の混合比（細胞数として）に従って、96 well plate U 型に播種した。全容量が２００μＬとなるようにAssay Mediumを加えた後、抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍＬ）のAssay Medium溶液を２μＬずつさらに各Wellに加え、約５日間培養した。下記表３における系（ａ）〜（ｄ）は、樹状細胞若しくはリンパ球が同種の場合と、自己の場合のそれぞれで行った。
(4) Mixed lymphocyte reaction Mixed lymphocyte reaction was performed using each cell suspension of said (1)-(3). Specifically, each cell suspension of the above (1) to (3) was seeded in a 96-well plate U type according to the mixing ratio (as the number of cells) shown in Table 3 below. After adding Assay Medium so that the total volume became 200 μL, 2 μL of Assay Medium solution of anti-CD3 antibody (5 μg / mL) was further added to each Well and cultured for about 5 days. The systems (a) to (d) in Table 3 below were performed in the case where dendritic cells or lymphocytes were allogeneic and in the case of self.
（５）フローサイトメトリーによる評価
上記（４）における混合リンパ球反応の結果を、フローサイトメトリーを用いて、レスポンダーＴ細胞に染色したＣＦＳＥの輝度の減衰により評価した。詳細には、フローサイトメトリー測定用のチューブに、ＥＣＤ抗ＣＤ４抗体を１μＬ添加した。一方で、別途用意したフローサイトメトリー測定用のチューブに、ＥＣＤ抗ＣＤ８抗体を１μＬ添加した。そして、各チューブに、上記（４）における混合リンパ球反応後に採取した細胞懸濁液をそれぞれ９５μＬずつ添加し、４℃、３０分間、遮光環境下で静置した。リン酸緩衝液で洗浄後、ＰＩ（Propidium Iodine）を添加した。この懸濁液を収容したフローサイトメトリー測定用のチューブを、フローサイトメトリー（EPICS XL、ベックマン・コールター株式会社製）にセットし、レスポンダーＴ細胞のうち各ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの輝度の測定を行った。
(5) Evaluation by flow cytometry The result of the mixed lymphocyte reaction in the above (4) was evaluated by attenuation of the brightness of CFSE stained on responder T cells using flow cytometry. Specifically, 1 μL of ECD anti-CD4 antibody was added to a tube for flow cytometry measurement. On the other hand, 1 μL of ECD anti-CD8 antibody was added to a separately prepared tube for flow cytometry measurement. Then, 95 μL each of the cell suspension collected after the mixed lymphocyte reaction in (4) above was added to each tube, and left at 4 ° C. for 30 minutes in a light-shielded environment. After washing with a phosphate buffer, PI (Propidium Iodine) was added. A tube for flow cytometry measurement containing this suspension was set in flow cytometry (EPICS XL, manufactured by Beckman Coulter, Inc.), and each CD4 + T cell or CD8 + T cell among responder T cells. The brightness of CFSE was measured.
得られた結果を図７及び図８に示す。自己又は同種ともに樹状細胞若しくはリンパ球の存在によって、各図（ａ）と比較して、ＣＦＳＥの輝度が減衰していることがわかる（図７（ｂ）及び図８（ｂ））。これは、樹状細胞若しくはリンパ球の存在によりレスポンダーＴ細胞が活性化され、増幅していることを示す結果である。 The obtained results are shown in FIGS. It can be seen that the brightness of CFSE is attenuated by the presence of dendritic cells or lymphocytes in both self and the same species as compared to each figure (a) (FIGS. 7B and 8B). This is a result showing that responder T cells are activated and amplified by the presence of dendritic cells or lymphocytes.
しかしながら、さらに、本制御性Ｔ細胞製造方法により得られた制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞を存在させると、各図（ａ）と比較して、ＣＦＳＥの輝度がほとんど減衰していないことがわかる（図７（ｃ）及び図８（ｃ））。これは、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の存在により、レスポンダーＴ細胞の増幅が抑制されていることを示す結果である。 However, when T cells containing regulatory T cells obtained by this regulatory T cell production method are present, it can be seen that the brightness of CFSE is hardly attenuated as compared with each figure (a). (FIG. 7 (c) and FIG. 8 (c)). This is a result showing that amplification of responder T cells is suppressed by the presence of T cells including regulatory T cells.
そして、各図（ｃ）における制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の存在比よりも、その存在比を低くすると、各図（ａ）と比較して、ＣＦＳＥの輝度が若干ではあるが減衰していることがわかる（図７（ｄ）及び図８（ｄ））。これは、レスポンダーＴ細胞の増幅抑制効果が、制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の存在比に依存していることを示す結果である。 When the abundance ratio is made lower than the abundance ratio of T cells containing regulatory T cells in each figure (c), the brightness of CFSE is slightly attenuated compared to each figure (a). (FIG. 7D and FIG. 8D). This is a result showing that the amplification inhibitory effect of responder T cells depends on the abundance ratio of T cells including regulatory T cells.
［実験例３］
Ｉｎ ｖｉｖｏでの制御性Ｔ細胞の投与効果を確認した。
[Experiment 3]
The effect of regulatory T cell administration in vivo was confirmed.
（１）Xenogenetic-GVHD発症モデルマウス
生後８〜１４日目の４匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（重症免疫力不全マウス）を、日本ＳＬＣ社から得た。これらのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、国立大学法人東京大学医科学研究所のガイドラインに従って取り扱った。Xenogenetic-GVHD（Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ）発症用の細胞として、ある２人のドナー（以下、各々がドナー１、ドナー２と称される。）から得られた末梢血単核細胞（以下、「ＰＢＭＣ」とも称される。）を用いた。このＰＢＭＣを、抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体をコートしたフラスコにて培養することによって、活性化Ｔ細胞とした。この培養は、ＩＬ−２（２００units/mL）を含むＡｌｙｓ５０５Ｎ培地（細胞科学研究所製）を用い、６ウェル−プレートに細胞を播種して行った。培養開始から２日後に、活性化Ｔ細胞に対してルシフェラーゼ発現（HIV-EF1a-Luciferase）第３世代レンチウイルスベクターで遺伝子導入を行った。実際には、細胞ペレットにＭＯＩ（multiplicity of infection）２０のレンチウイルスとともに２時間培養して感染、洗浄した。遺伝子導入後の細胞を、さらに１週間、抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体をコートしたフラスコにて培養し、Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞とした。
(1) Xenogenetic-GVHD onset model mice Four NOD / SCID mice (severe immune dysfunction mice) 8-14 days after birth were obtained from Japan SLC. These NOD / SCID mice were handled according to the guidelines of the University of Tokyo Institute of Medical Science. Peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as “PBMC”) obtained from two donors (hereinafter referred to as donor 1 and donor 2) as cells for developing Xenogenetic-GVHD (Xeno-GVHD). Also called). This PBMC was cultured in a flask coated with anti-CD3CD28 antibody to obtain activated T cells. This culture was performed by seeding cells in a 6-well plate using an Alys505N medium (manufactured by Cell Science Laboratory) containing IL-2 (200 units / mL). Two days after the start of culture, the activated T cells were transfected with a luciferase expression (HIV-EF1a-Luciferase) third generation lentiviral vector. Actually, the cell pellet was incubated with a lentivirus of MOI (multiplicity of infection) 20 for 2 hours, infected and washed. The cells after gene transfer were further cultured in a flask coated with an anti-CD3CD28 antibody for another week to obtain activated T cells for developing Xeno-GVHD.
前述された各ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対して、細胞を投与する前に、３５０cGyのγ線を照射した。そして、２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、形質転換されたドナー１のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞３０×１０６個を腹腔内投与し、別の２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、形質転換されたドナー２のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞３０×１０６個を腹腔内投与することによって、Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスを作成した。 Each NOD / SCID mouse described above was irradiated with 350 cGy of γ-rays prior to cell administration. Then, 2 NOD / SCID mice were intraperitoneally administered with 30 × 10 6 activated T cells for developing Xeno-GVHD of donor 1 and another 2 NOD / SCID mice were Xeno-GVHD-onset model mice were prepared by intraperitoneally administering 30 × 10 6 activated T cells for onset of Xeno-GVHD onset from converted donor 2.
（２）制御性Ｔ細胞の投与
ドナー１のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞投与によるＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症から１３日経過後の１匹のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに、実施例１に従って製造された制御性Ｔ細胞１０×１０６個を投与した（マウス１）。また、ドナー２のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症用活性化Ｔ細胞投与によるＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症から１３日経過後の１匹のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスにも、実施例１に従って製造された制御性Ｔ細胞１０×１０６個を投与した（マウス２）。一方、ドナーがそれぞれ異なる残りの２匹のＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに対しては、制御性Ｔ細胞を投与せずに、それぞれの比較対象とした（マウス３，４）。
(2) Administration of regulatory T cells One Xeno-GVHD development model mouse 13 days after the onset of Xeno-GVHD by administration of activated T cells for development of Xeno-GVHD of donor 1 was produced according to Example 1. 10 × 10 6 regulatory T cells were administered (mouse 1). In addition, the control T cell 10x produced according to Example 1 was also applied to one Xeno-GVHD developing model mouse 13 days after the onset of Xeno-GVHD by administration of activated T cells for developing Xeno-GVHD of donor 2. 10 6 were administered (mouse 2). On the other hand, the remaining two Xeno-GVHD model mice with different donors were not compared with regulatory T cells (mouse 3 and 4).
（３）Ｉｎ ｖｉｖｏでの評価
Ｉｎ ｖｉｖｏでの制御性Ｔ細胞の投与効果を、ＣＣＤカメラシステム（Xenogen社製、IVIS Image System）を用いて行った。具体的には、ＣＣＤカメラシステムにて観察する直前に、各Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに、７５mg/kgのＤ−ルシフェリン（Promega社製）を皮下投与した。そして、Ｘｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスに対してイソフルランで麻酔しながら、ＣＣＤカメラシステムの試料室にＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ発症モデルマウスを置いて、イソフルラン投与１０分後のマウスの腹部を各３回ずつ撮影した。撮影は、制御性Ｔ細胞の投与前と、制御性Ｔ細胞投与後の３〜７６日後の任意の複数の日とにおいてそれぞれ行った。マウス１〜４の撮影結果を図９に示す。
(3) In vivo evaluation The effect of regulatory T cell administration in vivo was performed using a CCD camera system (Xenogen, IVIS Image System). Specifically, immediately before observation with a CCD camera system, 75 mg / kg D-luciferin (Promega) was subcutaneously administered to each Xeno-GVHD developing model mouse. Then, the Xeno-GVHD developing model mouse was anesthetized with isoflurane, the Xeno-GVHD developing model mouse was placed in the sample room of the CCD camera system, and the abdomen of the mouse 10 minutes after isoflurane administration was photographed 3 times each. . Imaging | photography was each performed before the administration of a regulatory T cell, and the arbitrary several days 3 to 76 days after a regulatory T cell administration. The imaging results of the mice 1 to 4 are shown in FIG.
マウス１，２においては、いずれも活性化Ｔ細胞の増加が抑制されることが確認された。マウス３，４においては、いずれも活性化Ｔ細胞の増加が確認され、マウス３では４６日後にマウスが死亡し、マウス４では７６日後にマウスが死亡した。このことから、ＧＶＨＤ患者に対して制御性Ｔ細胞を投与することによって、活性化Ｔ細胞の増加が抑制されることがＩｎ ｖｉｖｏで証明された。 In both mice 1 and 2, it was confirmed that the increase in activated T cells was suppressed. In mice 3 and 4, an increase in activated T cells was confirmed. In mouse 3, the mouse died after 46 days, and in mouse 4 the mouse died after 76 days. From this, it was proved in vivo that administration of regulatory T cells to GVHD patients suppresses the increase of activated T cells.
１０・・・制御性Ｔ細胞増幅装置
１１，３２・・・バッグ（容器）
１２・・・プレート（不溶担体）
３１・・・ビーズ（不溶担体）
３５・・・抗体固定領域（不溶担体）
10 ... Controllable T cell amplification device 11, 32 ... Bag (container)
12 ... Plate (insoluble carrier)
31 ... Beads (insoluble carrier)
35 ... Antibody immobilization region (insoluble carrier)
Claims (7)
ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液中において、上記Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が不溶担体に固定された固相化抗体と反応させる第２ステップと、
上記固相化抗体からＴ細胞を分離して、ＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第２液中において当該Ｔ細胞を増幅させる第３ステップと、を含む制御性Ｔ細胞製造方法。 Separating a T cell showing CD4 positivity from blood collected from a human;
A second step of reacting the T cell with an immobilized antibody in which the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody are immobilized on an insoluble carrier in a first solution containing IL2 and TGF-β;
A third step of separating T cells from the immobilized antibody and amplifying the T cells in a second solution containing IL2 and TGF-β.
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定された上記不溶担体に、ヒトから採取された血液から分離されたＣＤ４陽性を示すＴ細胞が付着した状態で、当該固相化抗体をＩＬ２及びＴＧＦ−βを含む第１液と共に保持する容器と、を具備する制御性Ｔ細胞増幅装置。 An insoluble carrier capable of immobilizing an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody;
With the insoluble carrier to which the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody are immobilized attached with T cells showing CD4 positivity isolated from blood collected from humans, the immobilized antibody is treated with IL2 and TGF-β. A control T cell amplification device comprising: a container that is held together with the first liquid.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009010523A JP5464641B2 (en) | 2008-01-21 | 2009-01-21 | Regulatory T cell production method and regulatory T cell amplification apparatus |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008010645 | 2008-01-21 | ||
| JP2008010645 | 2008-01-21 | ||
| JP2009010523A JP5464641B2 (en) | 2008-01-21 | 2009-01-21 | Regulatory T cell production method and regulatory T cell amplification apparatus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009195228A true JP2009195228A (en) | 2009-09-03 |
| JP5464641B2 JP5464641B2 (en) | 2014-04-09 |
Family
ID=41139489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009010523A Active JP5464641B2 (en) | 2008-01-21 | 2009-01-21 | Regulatory T cell production method and regulatory T cell amplification apparatus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5464641B2 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012096376A1 (en) * | 2011-01-14 | 2012-07-19 | タカラバイオ株式会社 | Method for producing regulatory t cells |
| WO2015093041A1 (en) * | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | Culture container, method for culturing lymphocytes, culture-container production method, and solid-phasing apparatus |
| JP2015116152A (en) * | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | Culture vessel, and culturing method for lymphocyte |
| JP2015122960A (en) * | 2013-12-25 | 2015-07-06 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | Method of producing culture vessel, and solidifying device |
| WO2020040198A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-27 | 国立大学法人大阪大学 | Method for producing regulatory t cells |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018106885A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-14 | East Carolina University | Compositions and methods for in vitro cultivation and/or expansion of regulatory t cells |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02255077A (en) * | 1989-03-28 | 1990-10-15 | Kawasumi Lab Inc | Culture bag |
| JPH03172169A (en) * | 1989-11-30 | 1991-07-25 | Koojin Bio Kk | Vessel for storage and tissue culture |
| WO1994029436A1 (en) * | 1993-06-04 | 1994-12-22 | The United States Of America Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for selectively stimulating proliferation of t cells |
| JP2000212200A (en) * | 1999-01-26 | 2000-08-02 | Hitachi Chem Co Ltd | Carrier for culturing t lymphocyte, production of activated t lymphocyte, kit for production of activated t lymphocyte and immune therapeutic agent |
| JP2005218444A (en) * | 2004-01-09 | 2005-08-18 | Nipro Corp | Cell culture container |
| JP2005287425A (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Koojin Bio Kk | Culture bag with culture medium bag |
| JP2006280307A (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-19 | Kyoto Univ | Method for producing controllable t cell |
-
2009
- 2009-01-21 JP JP2009010523A patent/JP5464641B2/en active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02255077A (en) * | 1989-03-28 | 1990-10-15 | Kawasumi Lab Inc | Culture bag |
| JPH03172169A (en) * | 1989-11-30 | 1991-07-25 | Koojin Bio Kk | Vessel for storage and tissue culture |
| WO1994029436A1 (en) * | 1993-06-04 | 1994-12-22 | The United States Of America Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for selectively stimulating proliferation of t cells |
| JP2000212200A (en) * | 1999-01-26 | 2000-08-02 | Hitachi Chem Co Ltd | Carrier for culturing t lymphocyte, production of activated t lymphocyte, kit for production of activated t lymphocyte and immune therapeutic agent |
| JP2005218444A (en) * | 2004-01-09 | 2005-08-18 | Nipro Corp | Cell culture container |
| JP2005287425A (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Koojin Bio Kk | Culture bag with culture medium bag |
| JP2006280307A (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-19 | Kyoto Univ | Method for producing controllable t cell |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6013048075; ＲＡＯ，Ｐ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ' Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ．１７４， Ｎｏ．３, 20050201, ｐｐ．１４４６-５５ * |
| JPN6013048076; ＧＯＤＦＲＥＹ，Ｗ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｉｎ ｖｉｔｒｏ-ｅｘｐａｎｄｅｄ ｈｕｍａｎ ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋） Ｔ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃ' Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ．１０４， Ｎｏ．２, 20040715, ｐｐ．４５３-６１ * |
| JPN6013048077; ＺＨＥＮＧ，Ｓ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．: 'ＩＬ-２ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ＴＧＦ-ｂｅｔａ ｔｏ ｃｏｎｖｅｒｔ ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５- ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎ' Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏｌ．１７８， Ｎｏ．４, 20070215, ｐｐ．２０１８-２７ * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012096376A1 (en) * | 2011-01-14 | 2012-07-19 | タカラバイオ株式会社 | Method for producing regulatory t cells |
| JPWO2012096376A1 (en) * | 2011-01-14 | 2014-06-09 | タカラバイオ株式会社 | Method for producing regulatory T cells |
| JP5911810B2 (en) * | 2011-01-14 | 2016-04-27 | タカラバイオ株式会社 | Method for producing regulatory T cells |
| WO2015093041A1 (en) * | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | Culture container, method for culturing lymphocytes, culture-container production method, and solid-phasing apparatus |
| JP2015116152A (en) * | 2013-12-18 | 2015-06-25 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | Culture vessel, and culturing method for lymphocyte |
| US11884907B2 (en) | 2013-12-18 | 2024-01-30 | Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. | Culture container, method for culturing lymphocytes, culture-container production method, and solid-phasing apparatus |
| JP2015122960A (en) * | 2013-12-25 | 2015-07-06 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | Method of producing culture vessel, and solidifying device |
| WO2020040198A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-27 | 国立大学法人大阪大学 | Method for producing regulatory t cells |
| JPWO2020040198A1 (en) * | 2018-08-22 | 2021-08-10 | 国立大学法人大阪大学 | Method for producing regulatory T cells |
| JP7083190B2 (en) | 2018-08-22 | 2022-06-10 | 国立大学法人大阪大学 | Method for producing regulatory T cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5464641B2 (en) | 2014-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20190071640A1 (en) | Methods and materials for the generation of regulatory t cells | |
| Shah et al. | An injectable bone marrow–like scaffold enhances T cell immunity after hematopoietic stem cell transplantation | |
| JP7084304B2 (en) | Methods of Selective Proliferation of Different T Cell Subpopulations by Altering Cell Surface Signals and Signal Ratios | |
| JP5464641B2 (en) | Regulatory T cell production method and regulatory T cell amplification apparatus | |
| JP2011036263A (en) | Method for preparing and isolating antigen-specific t cell | |
| AU637702B2 (en) | T-lymphocyte progenitor cell assay | |
| JP2011519271A (en) | Methods and compositions for accelerating the generation of regulatory T cells ex vivo | |
| JP2009060894A (en) | Cd4+cd25+ regulatory t cells from human blood | |
| JP2001520509A (en) | Autoimmune cell therapy: cell compositions, methods and applications in the treatment of human diseases | |
| US11944672B2 (en) | Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying Treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 | |
| JP4275680B2 (en) | Culture methods for lymphocyte activity / proliferation | |
| WO2001038494A1 (en) | Method of proliferating natural killer cells | |
| Kim et al. | Off-the-shelf partial HLA matching SARS-CoV-2 antigen specific T cell therapy: a new possibility for COVID-19 treatment | |
| US20060121027A1 (en) | Method for detecting and isolating t lymphocytes that recognize a defined antigen | |
| WO2011013568A1 (en) | Immunosuppressive γδt cell | |
| JPH11292772A (en) | Preparation containing allogenic activated cd4 positive cell as main ingredient and production of the preparation | |
| JP2020195408A (en) | Methods for producing natural killer t (nkt) cell-stimulating dendritic cells | |
| TW202117008A (en) | Ciml nk cells and methods therefor | |
| CN113195706A (en) | CIML NK cells and methods thereof | |
| JPH11127851A (en) | Induced proliferation of antigen-specific immunosuppressive cell and culture tool used therefor | |
| Papert | New approaches to improve extracorporeal photopheresis for the treatment of graft-versus-host disease | |
| CN113416696B (en) | Immunoregulatory gamma delta T cell and in-vitro amplification method thereof | |
| US20240075063A1 (en) | Use of mait cells for controlling graft versus host disease | |
| TWI669400B (en) | A serum-free cell culture medium for in-vitro expansion of nature killer cells and nature killer t cells | |
| JP6426767B2 (en) | Method for culturing dendritic cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131001 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131127 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140107 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140116 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5464641 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |