JP2009184981A - Anti-d-amino acid monoclonal antibody and method for immunologically analyzing d-amino acid using anti-d-amino acid monoclonal antibody - Google Patents

Anti-d-amino acid monoclonal antibody and method for immunologically analyzing d-amino acid using anti-d-amino acid monoclonal antibody Download PDF

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潔 財津
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豊 芦田
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a method for analyzing a D-amino acid suitable for multiple-sample analysis of clinical specimen etc., which is a method for analyzing a D-amino acid, having high specificity to a specific D-amino acid and high selectivity to other similar structure-containing compounds. <P>SOLUTION: The anti-D-amino acid monoclonal antibody is reacted with a specific one kind of a D-amino acid but not cross-reacted with other compounds similar to the D-amino acid. The method for immunologically analyzing a D-amino acid comprises using the monoclonal antibody. A competitive ELISA method or a surface plasmon resonance method may be used in the method for immunologically analyzing a D-amino acid. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、該抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いるＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法及び分析用キットとに関する。   The present invention relates to an anti-D-amino acid monoclonal antibody, and an immunological analysis method and kit for analysis of D-amino acid using the anti-D-amino acid monoclonal antibody.

アミノ酸の多くは、α位の不斉炭素原子についてＤ体とＬ体という２種類の立体異性体が存在する。通常の化学合成においてはＬ体とＤ体の等量混合物であるラセミ体が得られるが、タンパク質の構成単位をはじめとして自然界に存在するアミノ酸のほとんどが、Ｌ−アミノ酸である（非特許文献１参照）。しかし、近年かつて非天然型アミノ酸と呼ばれていたＤ−アミノ酸が、細菌だけでなく環形動物、昆虫、植物、及び脊椎動物体内に至るまで幅広く存在し、種々の重要な役割を有していることが明らかにされている（非特許文献２参照）。また、クロマトグラフィー法をはじめとする微量分析法及び光学分割法の目覚しい技術革新により、ヒト、ラット、マウス等で遊離アミノ酸として、あるいは、ペプチド中に取り込まれたアミノ酸残基として、哺乳類体内に様々なＤ−アミノ酸が存在することが１９８０年代から明らかにされた。現在までに、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン等が知られている。
Ｊ．Ｊ．Ｃｏｒｒｉｇａｎ，Ｄ−Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６４，１４２−１４９（１９６９） 左右田健次：Ｄ−アミノ酸の生化学(Ｉ)、化学３２，５１７−５２６（１９７７） Many amino acids have two stereoisomers of D-form and L-form with respect to the asymmetric carbon atom at the α-position. In ordinary chemical synthesis, a racemate that is a mixture of equal amounts of L and D isomers is obtained, but most of amino acids existing in nature including protein structural units are L-amino acids (Non-patent Document 1). reference). However, D-amino acids, which have been called unnatural amino acids in recent years, are widely present not only in bacteria but also in ring animals, insects, plants, and vertebrates, and have various important roles. (See Non-Patent Document 2). In addition, due to remarkable technological innovations such as chromatographic methods such as microanalysis and optical resolution, there are various free amino acids in humans, rats, mice, etc., or amino acid residues incorporated into peptides. It has been clarified since the 1980s that there is a new D-amino acid. To date, D-serine, D-aspartic acid, D-alanine, D-proline, D-leucine and the like are known.
J. et al. J. et al. Corrigan, D-Amino acids in animals, Science, 164, 142-149 (1969). Kenji Yokota: Biochemistry of D-amino acids (I), Chemistry 32,517-526 (1977)

Ｄ−セリンやＤ−アスパラギン酸はＤ体の割合が高いことから比較的研究が進んでいるＤ−アミノ酸である。Ｄ−セリンは大脳、海馬に局在し、脳内のＮＭＤＡ受容体の調節因子であることが明らかにされている。Ｄ−アスパラギン酸は精巣や松果体に局在が認められ、ホルモン分泌の制御に関与していることが示されている。その他にも、Ｄ−アラニンが下垂体前葉や膵臓のβ細胞に局在し、概日変動を示すこと、Ｄ−プロリンがＤ−アミノ酸オキシダーゼ欠損マウスの尿中に多量存在すること、Ｄ−ロイシンがマウス脳内の特定部位に局在すること等が報告されている（特許文献１参照）。さらに、一部Ｄ−アミノ酸と疾患との関連も報告されている。例えば、統合失調症やアルツハイマー病等の神経性疾患においてＤ−アミノ酸の血中含量や脳内含量変化が認められる。統合失調症患者にＤ−セリンを投与した結果、症状の改善が見られたとの報告もある。
特開２００５−３５５８号公報 D-serine and D-aspartic acid are D-amino acids that have been relatively studied since the ratio of D-form is high. D-serine is localized in the cerebrum and hippocampus and has been shown to be a regulator of NMDA receptors in the brain. D-aspartic acid is localized in the testis and pineal gland and has been shown to be involved in the regulation of hormone secretion. In addition, D-alanine is localized in the anterior pituitary gland and pancreatic β cells and exhibits circadian variation, D-proline is present in a large amount in the urine of D-amino acid oxidase-deficient mice, D-leucine Has been reported to be localized at a specific site in the mouse brain (see Patent Document 1). Furthermore, some D-amino acids have been reported to be associated with diseases. For example, changes in the blood content and brain content of D-amino acids are observed in neurological diseases such as schizophrenia and Alzheimer's disease. There is also a report that symptom improvement was observed as a result of administering D-serine to schizophrenic patients.
JP 2005-3558 A

このように、Ｄ−アミノ酸は哺乳類体内において生理的役割や臨床診断上の意義を有していると考えられており、新たなＤ−アミノ酸の生理機能の解明が、Ｄ−アミノ酸をリード化合物とする新規薬効分子の探索を可能にし、新たな医薬品創生の基盤になることが期待されている。そこで、Ｄ−アミノ酸の詳細な機能解析のため様々な生理条件下や疾病下における試料分析が望まれている。 Thus, D-amino acids are considered to have physiological roles and clinical diagnostic significance in the mammalian body, and elucidation of the physiological functions of new D-amino acids has led to the use of D-amino acids as lead compounds. It is expected that it will be possible to search for new medicinal molecules and to become the basis for the creation of new drugs. Therefore, sample analysis under various physiological conditions and diseases is desired for detailed functional analysis of D-amino acids.

従来のＤ−アミノ酸の分析法としては、酵素を用いる方法、キラルな試薬を用いるジアステレオマー法、キラル移動相法、ガスクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法（特許文献２参照）、キャピラリー電気泳動法及びカラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法（非特許文献２及び３）等を利用する方法が知られている。特に、カラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法は、高感度かつ選択的で、生体内微量Ｄ−アミノ酸分析法の中で最も優れた分析法のひとつである。カラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法は、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン及びＤ−プロリンがそれぞれ異なった組織分布を示すことを明らかにした。これらの高感度分析法の確立によって、極微量Ｄ−アミノ酸の定量が可能になり、生体内における種々のＤ−アミノ酸の生理機能の発見を始め、臓器局在、体内動態、疾病時の含量変化解析等が行われてきた。しかしこれらの方法は、単一のシステムで一度に１種類のアミノ酸しか分析できないため、１回の分析に長時間を要し、かつ複雑な装置を必要とする。そこで、従来技術では臨床検体等の多試料分析には限界がある。詳細なＤ−アミノ酸の生理機能や疾患との関連解明のために、迅速かつ簡便な分析法の開発が切望されている。
特開２００２−２６７６４９号公報 長田洋子：生体に存在するＤ−アミノ酸―哺乳類を中心として―、札幌医誌、５８，２７１−２７８（１９８９） Conventional methods for analyzing D-amino acids include enzyme-based methods, diastereomeric methods using chiral reagents, chiral mobile phase methods, gas chromatography methods, high-performance liquid chromatography methods (see Patent Document 2), capillary electricity Methods using electrophoresis method and column switching chiral HPLC method (Non-patent Documents 2 and 3) are known. In particular, the column switching chiral HPLC method is highly sensitive and selective, and is one of the most excellent analytical methods among in-vivo trace D-amino acid analysis methods. Column switching chiral HPLC method revealed that D-alanine, D-leucine and D-proline show different tissue distributions. The establishment of these high-sensitivity analysis methods enables the quantification of trace amounts of D-amino acids, as well as the discovery of physiological functions of various D-amino acids in vivo, organ localization, pharmacokinetics, and changes in content during disease. Analysis has been conducted. However, since these methods can analyze only one type of amino acid at a time using a single system, each analysis takes a long time and requires a complicated apparatus. Therefore, the conventional technique has a limit to the analysis of multiple samples such as clinical specimens. In order to elucidate the relationship between detailed physiological functions of D-amino acids and diseases, development of rapid and simple analytical methods is eagerly desired.
JP 2002-267649 A Yoko Nagata: D-amino acids present in living organisms, with a focus on mammals, Sapporo Medical Journal, 58, 271-278 (1989)

現在、迅速性と簡便性を兼ね備えた測定法として、臨床検査の分野では主に免疫学的原理に基づく方法が利用されている。免疫学的測定法は、抗原抗体反応を利用するために特異性に優れ、目的物質の分離、精製、濃縮等の煩雑な操作を伴わず簡便であるという利点を有している。抗Ｄ−アミノ酸抗体を用いる免疫学的測定法の開発は多検体の迅速分析を可能とし、Ｄ−アミノ酸の生理機能解明に大きく貢献できると考えられる。Ｄ−アミノ酸に対する抗体はこれまでに多数報告され、市販もされているがほとんどがポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、複数のＢ細胞に由来する多数のイムノグロブリンを含有するために免疫動物の個体差を大きく反映し、一定品質の抗体を継続的に得ることは困難である。一方、モノクローナル抗体は半永久的に同質の抗体を得ることが可能であり、長期間にわたり同一性が求められる免疫測定法には適していると考えられる。   At present, methods based on immunological principles are mainly used in the field of clinical tests as measuring methods having both speed and convenience. The immunological measurement method has an advantage that it is excellent in specificity because it uses an antigen-antibody reaction and is simple without complicated operations such as separation, purification, and concentration of a target substance. The development of an immunological assay using anti-D-amino acid antibodies enables rapid analysis of many samples and is thought to contribute greatly to elucidation of physiological functions of D-amino acids. Many antibodies against D-amino acids have been reported so far, and most of them are polyclonal antibodies. Since a polyclonal antibody contains a large number of immunoglobulins derived from a plurality of B cells, it greatly reflects individual differences among immunized animals, and it is difficult to continuously obtain antibodies of a certain quality. Monoclonal antibodies, on the other hand, can obtain antibodies of the same quality semipermanently, and are considered suitable for immunoassays that require long-term identity.

しかし、モノクローナル抗体が認識するエピトープ構造は特定の化学構造に必ずしも限定されない。例えば、あるＤ−アミノ酸に対して特異的に結合する抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体であっても、該Ｄ−アミノ酸の立体異性体であるＬ−アミノ酸その他の類似構造を有する他の化合物とも結合する場合がある。そこでＤ−アミノ酸の生理機能解明のためには、特定のＤ−アミノ酸に対する特異性が高く、かつ、類似構造を有する他の化合物に対する選択性も高いモノクローナル抗体を作成する必要がある。   However, the epitope structure recognized by the monoclonal antibody is not necessarily limited to a specific chemical structure. For example, even an anti-D-amino acid monoclonal antibody that specifically binds to a certain D-amino acid also binds to an L-amino acid that is a stereoisomer of the D-amino acid or other compounds having a similar structure. There is a case. Therefore, in order to elucidate the physiological functions of D-amino acids, it is necessary to create monoclonal antibodies having high specificity for specific D-amino acids and high selectivity for other compounds having a similar structure.

本発明は、特定の１種類のＤ−アミノ酸のみを抗原として認識し、他の化合物とは交差反応しない、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を提供する。本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は、Ｄ−アスパラギン酸又はＤ−ロイシンのみと抗原として反応し、他の化合物とは交差反応しないモノクローナル抗体の場合がある。本発明は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を産生する細胞株を提供する。   The present invention provides an anti-D-amino acid monoclonal antibody that recognizes only one specific type of D-amino acid as an antigen and does not cross-react with other compounds. The anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention may be a monoclonal antibody that reacts only with D-aspartic acid or D-leucine as an antigen and does not cross-react with other compounds. The present invention provides a cell line that produces the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention.

本発明は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いてＤ−アミノ酸を検出・定量する、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法を提供する。本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体の抗原であるＤ−アミノ酸が固定された固体支持体との反応を、Ｄ−アミノ酸含量を測定する試料中のＤ−アミノ酸が競合阻害することを利用する場合がある。本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法においては、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と反応するＤ−アミノ酸が、キャリア高分子と結合したＤ−アミノ酸複合体として、固体支持体に固定される場合がある。   The present invention provides a method for immunological analysis of D-amino acids, which detects and quantifies D-amino acids using the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention. The D-amino acid immunological analysis method of the present invention comprises the reaction of the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention with a solid support on which the D-amino acid that is the antigen of the monoclonal antibody is immobilized. In some cases, the D-amino acid in the sample whose content is to be measured is competitively inhibited. In the D-amino acid immunological analysis method of the present invention, the D-amino acid that reacts with the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a solid support as a D-amino acid complex bound to a carrier polymer. May be.

本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、（１）抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体と、試料とを用意するステップと、（２）前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と前記試料との混合溶液を調製するステップと、(３)前記混合溶液を前記固体支持体に接触させるステップと、（４）前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップとを含む場合がある。前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップは、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法等を利用する場合がある。   The D-amino acid immunological analysis method of the present invention comprises (1) a step of preparing an anti-D-amino acid monoclonal antibody, a solid support on which a D-amino acid complex is immobilized, and a sample; Preparing a mixed solution of the anti-D-amino acid monoclonal antibody and the sample; (3) contacting the mixed solution with the solid support; and (4) anti-D- bound to the solid support. Detecting and quantifying the amino acid monoclonal antibody. The step of detecting and quantifying the anti-D-amino acid monoclonal antibody bound to the solid support may utilize an ELISA method, a surface plasmon resonance method, a latex agglutination method, or the like.

本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法において、前記モノクローナル抗体の作成の際の免疫原は、Ｄ−アミノ酸とキャリア高分子とが結合したＤ−アミノ酸複合体である場合がある。その場合には、前記免疫原のＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子とは異なる場合がある。前記モノクローナル抗体の作成に用いた動物の免疫に用いたＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子はウシ血清アルブミンで、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は卵白アルブミンの場合がある。   In the method for immunological analysis of D-amino acids of the present invention, the immunogen for producing the monoclonal antibody may be a D-amino acid complex in which a D-amino acid and a carrier polymer are bound. In that case, the carrier polymer of the D-amino acid complex of the immunogen may be different from the carrier polymer of the D-amino acid complex immobilized on the solid support. The carrier polymer of the D-amino acid complex used for the immunization of the animal used for the production of the monoclonal antibody is bovine serum albumin, and the carrier polymer of the D-amino acid complex immobilized on the solid support is egg white albumin. There is a case.

本発明は、本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法を実行する、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析装置を提供する。   The present invention provides a D-amino acid immunological analyzer for carrying out the D-amino acid immunological analysis method of the present invention.

本発明は、（１）本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、（２）該モノクローナル抗体の抗原のＤ−アミノ酸と、本発明の免疫学的分析方法に用いる固体支持体と、該固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体と、前記固体支持体を含むＥＬＩＳＡ法用マルチウェルプレート、表面プラズモン共鳴法用センサーチップ又は凝集法用微粒子とのうち少なくとも１つとを含む、Ｄ−アミノ酸の分析用試薬キットを提供する。   The present invention includes (1) an anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention, (2) a D-amino acid of the antigen of the monoclonal antibody, a solid support used in the immunological analysis method of the present invention, and the solid support A D-amino acid complex comprising: a D-amino acid complex immobilized on a body; and at least one of an ELISA method multiwell plate, a surface plasmon resonance sensor chip, or an agglomeration microparticle comprising the solid support. An analytical reagent kit is provided.

本発明におけるアミノ酸とは、不斉炭素を含まないグリシンのようなアミノ酸と、α位に不斉炭素を含み、Ｄ−体及びＬ−体の立体異性体を有するアミノ酸と、α位以外に不斉炭素を含むアミノ酸とを含む。本発明のＬ−アミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−チロシンからなる１９種類のＬ−アミノ酸を含むがこれらに限定されない。本発明におけるＤ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファンのＤ−チロシンからなる１９種類のＤ−アミノ酸を含むがこれらに限定されない。本発明のＤ−アミノ酸は、Ｄ−アスパラギン酸又はＤ−ロイシンの場合がある。   An amino acid in the present invention is an amino acid such as glycine that does not contain an asymmetric carbon, an amino acid that contains an asymmetric carbon at the α-position and has stereoisomers of D-form and L-form, and an amino acid other than the alpha-position. And amino acids containing homocarbons. The L-amino acids of the present invention are L-alanine, L-cysteine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-phenylalanine, L-histidine, L-isoleucine, L-lysine, L-leucine, L-methionine, L -Including, but not limited to, 19 kinds of L-amino acids consisting of asparagine, L-proline, L-glutamine, L-arginine, L-serine, L-threonine, L-valine, L-tryptophan and L-tyrosine. The D-amino acids in the present invention are D-alanine, D-cysteine, D-aspartic acid, D-glutamic acid, D-phenylalanine, D-histidine, D-isoleucine, D-lysine, D-leucine, D-methionine, D -Including, but not limited to, 19 kinds of D-amino acids consisting of D-tyrosine of asparagine, D-proline, D-glutamine, D-arginine, D-serine, D-threonine, D-valine and D-tryptophan. The D-amino acid of the present invention may be D-aspartic acid or D-leucine.

本発明のモノクローナル抗体が交差反応しない「他の化合物」とは、本発明のモノクローナル抗体が反応する特定の１種類のＤ−アミノ酸以外の全ての化合物をいう。前記「他の化合物」には、前記特定の１種類のＤ−アミノ酸と類似する化合物が含まれる。ここで前記特定の１種類のＤ−アミノ酸と類似する化合物には、該特定のＤ−アミノ酸以外のＤ−アミノ酸と、生体の主要な構成要素であるグリシン及び前記１９種類のＬ−アミノ酸とを含むが、これらに限られない。例えば、Ｄ−ロイシンと類似する化合物は、イソロイシンのエピマーである、Ｌ−アロイソロイシン（Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）及びＤ−アロイソロイシン（Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）を含む。したがって本発明のモノクローナル抗体がＤ−ロイシンのみと反応する場合には、該モノクローナル抗体は、Ｄ−ロイシン以外のＤ−アミノ酸と、グリシン及び前記１９種類のＬ−アミノ酸と反応しないばかりか、Ｌ−アロイソロイシン及びＤ−アロイソロイシンとも反応しない。   The “other compound” to which the monoclonal antibody of the present invention does not cross-react refers to all compounds other than one specific D-amino acid to which the monoclonal antibody of the present invention reacts. The “other compounds” include compounds similar to the specific one type of D-amino acid. Here, the compound similar to the one specific type of D-amino acid includes a D-amino acid other than the specific D-amino acid, glycine, which is a main component of the living body, and the 19 types of L-amino acids. Including but not limited to. For example, compounds similar to D-leucine include L-alloisoleucine (L-allo-Ile) and D-alloisoleucine (D-allo-Ile), which are epimers of isoleucine. Therefore, when the monoclonal antibody of the present invention reacts only with D-leucine, the monoclonal antibody does not react with D-amino acids other than D-leucine, glycine and the 19 kinds of L-amino acids, but also with L- It does not react with alloisoleucine or D-alloisoleucine.

本発明のＤ−アミノ酸は、キャリア高分子と結合した複合体として、本発明のモノクローナル抗体の作成、及び／又は、本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法の実施に用いられる場合がある。本明細書では、Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を、それぞれ、（Ｄ−ＡＡ）−ＰＯＬ又はＡＡ−ＰＯＬと表す。単にアミノ酸−ＰＯＬと表す場合には、いずれかのアミノ酸とキャリア高分子との複合体を意味する。ここでアミノ酸が特定のアミノ酸の場合には、ＡＡ又はＤ−ＡＡの代わりに慣用の３文字表記で表される。例えば、Ｄ−アスパラギン酸とキャリア高分子とが結合した複合体は、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＰＯＬと表される。また、複数のアミノ酸がハイフンで結ばれている場合には、左側のアミノ酸のカルボキシル基と右側のアミノ酸のアミノ基とがペプチド結合した化合物であることを表す。例えば、Ｇｌｙ−（Ｄ−Ａｓｐ）は、グリシンのカルボキシル基とＤ−アスパラギン酸のアミノ基とがペプチド結合したジペプチドである。ここでキャリア高分子は、ハプテンに免疫原性を付与することのできるいずれかの高分子をいい、タンパク質、多糖類等の生体高分子でも、ポリリジン等の合成高分子でもかまわない。本発明の複合体のキャリア高分子に用いられるタンパク質は、ウシ血清アルブミン、ニワトリオバルブミン及びスカシ貝ヘモシアニンを含むがこれらに限られない。本発明の複合体にウシ血清アルブミン、ニワトリオバルブミン又はスカシ貝ヘモシアニンを用いるときには、本発明の複合体はそれぞれ（Ｄ−ＡＡ）−ＢＳＡ、（Ｄ−ＡＡ）−ＯＶＡ又は（Ｄ−ＡＡ）−ＫＨＬと表される。   The D-amino acid of the present invention may be used as a complex bound to a carrier polymer to produce the monoclonal antibody of the present invention and / or to carry out the immunological analysis method of the D-amino acid of the present invention. . In the present specification, a complex of a D-amino acid or L-amino acid and a carrier polymer is represented as (D-AA) -POL or AA-POL, respectively. When simply expressed as amino acid-POL, it means a complex of any amino acid and a carrier polymer. Here, when the amino acid is a specific amino acid, it is represented by conventional three-letter code instead of AA or D-AA. For example, a complex in which D-aspartic acid and a carrier polymer are bound is represented as (D-Asp) -POL. In addition, when a plurality of amino acids are connected by a hyphen, it represents a compound in which the carboxyl group of the left amino acid and the amino group of the right amino acid are peptide-bonded. For example, Gly- (D-Asp) is a dipeptide in which a carboxyl group of glycine and an amino group of D-aspartic acid are peptide-bonded. Here, the carrier polymer refers to any polymer capable of imparting immunogenicity to the hapten, and may be a biopolymer such as a protein or polysaccharide, or a synthetic polymer such as polylysine. Proteins used in the carrier polymer of the complex of the present invention include, but are not limited to, bovine serum albumin, chicken ovalbumin and mussel hemocyanin. When bovine serum albumin, chicken ovalbumin or mussel hemocyanin is used in the complex of the present invention, the complex of the present invention is (D-AA) -BSA, (D-AA) -OVA or (D-AA)- Expressed as KHL.

本発明の複合体におけるＤ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸とキャリア高分子とは、アミノ酸のいかなる官能基とキャリア高分子との間で結合されてもかまわない。例えば、アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基とキャリア高分子のいずれかの側鎖との間を適当な架橋剤を介して共有結合する場合がある。前記架橋剤は、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含むがこれらに限られない。本発明のＤ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体は、Ｄ−アミノ酸の免疫原性を高めるためにさまざまな保護、修飾等が行われる場合がある。また、前記架橋剤による架橋反応の後で、アミノ酸とキャリア高分子との連結部分の免疫原性を低下させることによりＤ−アミノ酸に対する免疫原性を高める場合もある。例えば、前記Ｄ−アミノ酸とキャリアタンパク質とのグルタルアルデヒドによる架橋反応では、第一級アミンとアルデヒド又はケトンとの縮合反応により生成する窒素と炭素との二重結合を含む化合物であるシッフ塩基を生じることが知られている。前記シッフ塩基の二重結合を還元せずに前記Ｄ−アミノ酸複合体で動物を免疫した場合、二重結合部位に対する非特異的な抗体が多く産生されることが知られている。したがって前記Ｄ−アミノ酸複合体は、前記Ｄ−アミノ酸と前記キャリアタンパク質との結合後に水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）等の還元剤で還元させ前記二重結合を単結合とし、Ｄ−アミノ酸以外の部分の免疫原性を低減させる場合がある。本発明のアミノ酸とキャリアタンパク質とがグルタルアルデヒドによって架橋され、その後架橋部分が水素化ホウ素ナトリウムにより還元された複合体は、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＫＨＬ等と表される場合がある。 The D-amino acid or L-amino acid and the carrier polymer in the complex of the present invention may be bonded between any functional group of the amino acid and the carrier polymer. For example, the amino group or carboxyl group of an amino acid and any side chain of the carrier polymer may be covalently bonded via an appropriate crosslinking agent. Examples of the crosslinking agent include, but are not limited to, glutaraldehyde (GA), N-hydroxysuccinimide (NHS), and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC). The complex of the D-amino acid and carrier polymer of the present invention may be subjected to various protections, modifications and the like in order to enhance the immunogenicity of the D-amino acid. In some cases, after the cross-linking reaction with the cross-linking agent, the immunogenicity of the D-amino acid is increased by reducing the immunogenicity of the linking portion between the amino acid and the carrier polymer. For example, the cross-linking reaction of D-amino acid and carrier protein with glutaraldehyde produces a Schiff base that is a compound containing a double bond of nitrogen and carbon generated by the condensation reaction of a primary amine and an aldehyde or ketone. It is known. It is known that when an animal is immunized with the D-amino acid complex without reducing the double bond of the Schiff base, many non-specific antibodies against the double bond site are produced. Therefore, the D-amino acid complex is reduced with a reducing agent such as sodium borohydride (NaBH 4 ) or sodium cyanoborohydride (NaBH 3 CN) after binding the D-amino acid and the carrier protein. In some cases, the bond is a single bond, and the immunogenicity of a portion other than the D-amino acid is reduced. The complex in which the amino acid of the present invention and the carrier protein are cross-linked with glutaraldehyde and the cross-linked part is reduced with sodium borohydride is (D-AA) -GA-BSA, (D-AA) -GA-OVA. , (D-AA) -GA-KHL or the like.

本発明のモノクローナル抗体とは、動物の単一の抗体産生細胞クローンに由来する抗体をいう。発明のモノクローナル抗体は、Ｄ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を免疫原として免疫された動物の抗体産生細胞に由来する場合がある。前記動物には、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物が含まれるがこれらに限られない。前記抗体産生細胞は脾細胞の場合がある。本発明のモノクローナル抗体は、免疫された動物の抗体産生細胞と、同種又は異種の動物由来のミエローマ細胞との細胞融合の結果得られるハイブリドーマ細胞株から産生される場合がある。また本発明のモノクローナル抗体は、免疫された動物の抗体産生細胞から調製したｃＤＮＡライブラリから単離した抗体遺伝子ｃＤＮＡの抗原結合部分に由来する組換え抗体の場合もある。前記組換え抗体は、Ｄ−アミノ酸とのみ反応するものであれば、軽鎖又は重鎖のいずれかの抗原結合部分のみに由来する組換え抗体であってもよく、他の抗原に対する抗原結合部分との融合抗体であってもよい。したがって、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を産生する細胞株は、前記ハイブリドーマ細胞株と、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の組換え抗体を発現するように該組換え抗体遺伝子の形質転換又はトランスフェクションを施された細菌、酵母、菌類、植物又は動物の細胞とを含む。   The monoclonal antibody of the present invention refers to an antibody derived from a single antibody-producing cell clone of an animal. The monoclonal antibody of the invention may be derived from antibody-producing cells of an animal immunized with a complex of D-amino acid and carrier polymer as an immunogen. Such animals include, but are not limited to, mammals such as mice, rats, goats and sheep. The antibody-producing cell may be a spleen cell. The monoclonal antibody of the present invention may be produced from a hybridoma cell line obtained as a result of cell fusion between antibody-producing cells of an immunized animal and myeloma cells derived from the same or different animals. The monoclonal antibody of the present invention may be a recombinant antibody derived from an antigen-binding portion of an antibody gene cDNA isolated from a cDNA library prepared from antibody-producing cells of an immunized animal. The recombinant antibody may be a recombinant antibody derived only from an antigen-binding portion of either a light chain or a heavy chain, as long as it reacts only with D-amino acids, and an antigen-binding portion against another antigen. And a fusion antibody. Accordingly, a cell line producing the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention includes the above-mentioned hybridoma cell line and transformation or transfection of the recombinant antibody gene so as to express the recombinant antibody of the anti-D-amino acid monoclonal antibody. Bacteria, yeast, fungi, plant or animal cells subjected to the above.

本発明のモノクローナル抗体が特定の１種類のＤ−アミノ酸を抗原として認識するとは、該Ｄ−アミノ酸の試料中の濃度を競合ＥＬＩＳＡ法で定量することができることをいう。すなわち、抗原のＤ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を吸着させた固相に前記モノクローナル抗体を接触させた後、洗浄し、固相の前記Ｄ−アミノ酸と結合したモノクローナル抗体に、該モノクローナル抗体に対する酵素標識２次抗体を接触させ、酵素の発色反応の結果を吸光度で測定する際に、前記Ｄ−アミノ酸が遊離状態で存在する試料を競合に用いると、０．１ｍＭないし１０ｍＭ、好ましくは０．０５ｍＭないし１０ｍＭ、最も好ましくは０．０１６ｍＭないし１６ｍＭの濃度範囲内で濃度依存的な吸光度の減少が認められ、これらの範囲内で試料中での前記Ｄ−アミノ酸の濃度を定量することが可能であることをいう。   The recognition of a specific one type of D-amino acid as an antigen by the monoclonal antibody of the present invention means that the concentration of the D-amino acid in a sample can be quantified by a competitive ELISA method. That is, the monoclonal antibody is brought into contact with a solid phase on which a complex of an antigen D-amino acid and a carrier polymer is adsorbed and then washed, and the monoclonal antibody bound to the D-amino acid on the solid phase is subjected to the monoclonal antibody. When a sample in which the D-amino acid is present in a free state is used for competition when the enzyme-labeled secondary antibody is brought into contact with the antibody, and the result of the color reaction of the enzyme is measured by absorbance, 0.1 mM to 10 mM, preferably A concentration-dependent decrease in absorbance is observed within a concentration range of 0.05 mM to 10 mM, most preferably 0.016 mM to 16 mM, and the concentration of the D-amino acid in the sample can be quantified within these ranges. That is possible.

また、本発明のモノクローナル抗体がある化合物と交差反応しないとは、前記ＥＬＩＳＡ法を行う際に、抗原のＤ−アミノ酸とキャリア高分子との複合体を固相に吸着させた場合の吸光度が、当該化合物とキャリア高分子との複合体を固相に吸着させた場合の吸光度より少なくとも１０倍、好ましくは２０倍以上大きいこという。この交差反応の有無を判断するためのＥＬＩＳＡ法の実験は、前記Ｄ−アミノ酸について０．１ｍＭないし１０ｍＭ、好ましくは０．０５ｍＭないし１０ｍＭ、最も好ましくは０．０１６ｍＭないし１６ｍＭの濃度範囲内で濃度依存的な吸光度の減少が認められる条件で行われるものとする。   Further, the fact that the monoclonal antibody of the present invention does not cross-react with a compound means that when performing the ELISA method, the absorbance when adsorbing a complex of an antigen D-amino acid and a carrier polymer to a solid phase is as follows: That is, it is at least 10 times, preferably 20 times or more larger than the absorbance when the complex of the compound and the carrier polymer is adsorbed to the solid phase. The ELISA method for determining the presence or absence of this cross-reaction is dependent on the concentration of the D-amino acid within a concentration range of 0.1 mM to 10 mM, preferably 0.05 mM to 10 mM, most preferably 0.016 mM to 16 mM. Under conditions where a significant decrease in absorbance is observed.

本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いてＤ−アミノ酸を検出・定量する、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、免疫組織化学的方法、光学顕微鏡又は電子顕微鏡による免疫細胞化学的方法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法の他、微粒子又はナノ微粒子の凝集による比濁度の変化に基づく分析方法が含まれるが、これらに限られない。本発明のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法には、競合的な結合に基づく方法と非競合的な結合に基づく方法とが含まれる。Ｄ−アミノ酸を検出・定量するために、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体が、ビオチンのような低分子リガンド、酵素、放射性同位元素、色素等で標識される場合があり、前記モノクローナル抗体に対する２次抗体か、前記ビオチンのような低分子リガンドと特異的に結合するアビジンのような生体高分子かが、酵素、放射性同位元素、色素等で標識される場合がある。   The D-amino acid immunological analysis method for detecting and quantifying D-amino acid using the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention is an immunohistochemical method, an immunocytochemical method using an optical microscope or an electron microscope, In addition to Western blotting and ELISA, analysis methods based on changes in turbidity due to aggregation of microparticles or nanoparticles are included, but are not limited thereto. The D-amino acid immunological analysis method of the present invention includes a method based on competitive binding and a method based on non-competitive binding. In order to detect and quantify D-amino acids, the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention may be labeled with a low molecular ligand such as biotin, an enzyme, a radioisotope, a dye, or the like. A secondary antibody or a biopolymer such as avidin that specifically binds to a low molecular ligand such as biotin may be labeled with an enzyme, a radioisotope, a dye, or the like.

本発明Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析方法は、前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体を用いる場合がある。前記固体支持体は、前記Ｄ−アミノ酸複合体のＤ−アミノ酸の免疫原性を失わせず固定できるものであればよく、さまざまな材料又は形状の固体を利用することができる。前記固体支持体は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、ゲル、膜、天然繊維、シリコーン、金属およびこれらの複合材料を含むがこれらに限定されない材料から加工される場合がある。前記固体支持体は、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、マルチアレイチップ、センサーチップ、ラテックス凝集法用微粒子又はナノ微粒子のような、自動診断システムによって取り扱うのに適する形状が含まれる。   The D-amino acid immunological analysis method of the present invention may use a solid support on which the D-amino acid complex is immobilized. The solid support is not particularly limited as long as it can be fixed without losing the immunogenicity of the D-amino acid of the D-amino acid complex, and solids of various materials or shapes can be used. The solid support may be fabricated from materials including but not limited to polymeric materials, glass, ceramics, gels, membranes, natural fibers, silicones, metals and composites thereof. The solid support includes shapes suitable for handling by automated diagnostic systems, such as multiwell plates, microtiter plates, multiarray chips, sensor chips, latex agglomeration microparticles or nanoparticles.

本発明のＤ−アミノ酸複合体は、静電気による吸着により前記固体支持体上に固定される場合のほか、前記Ｄ−アミノ酸複合体のアミノ基と前記固体支持体のカルボキシル基とのアミド結合により前記固体支持体上に固定される場合がある。前記Ｄ−アミノ酸複合体の前記固体支持体上への固定を促進するために、前記Ｄ−アミノ酸複合体は、前記固体支持体上への固定の前に予めアミノ基が導入される場合がある。アミノ基の導入のための１つの手法は、Ｄ−アミノ酸とキャリアタンパク質との架橋反応時にヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２）を共存させることによりアミノ基で修飾されたＤ−アミノ酸複合体を作製することである。前記アミノ基で修飾されたＤ−アミノ酸複合体は、アミノ基導入型Ｄ−アミノ酸複合体ともいい、（Ｄ−ＡＡ）−ＰＯＬ複合体（＋ＮＨ２）、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＰＯＬ複合体（＋ＮＨ２）、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）等と表される。 In addition to the case where the D-amino acid complex of the present invention is immobilized on the solid support by electrostatic adsorption, the D-amino acid complex can be obtained by an amide bond between the amino group of the D-amino acid complex and the carboxyl group of the solid support. It may be fixed on a solid support. In order to promote the fixation of the D-amino acid complex on the solid support, the D-amino acid complex may be preliminarily introduced with an amino group before the fixation on the solid support. . One technique for introducing an amino group is to prepare a D-amino acid complex modified with an amino group by allowing hydrazine (NH 2 NH 2 ) to coexist during the crosslinking reaction between the D-amino acid and the carrier protein. It is. The D-amino acid complex modified with the amino group is also referred to as an amino group-introduced D-amino acid complex, which is a (D-AA) -POL complex (+ NH 2 ) or (D-AA) -GA-POL complex. Body (+ NH 2 ), (D-AA) -GA-OVA complex (+ NH 2 ), (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) and the like.

本発明の競合的な結合を利用する方法の（１）前記固体支持体を用意するステップは、前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、前記Ｄ−アミノ酸キャリア高分子複合体が固定された固体支持体と、前記試料とが、手作業により、あるいは、自動的に用意される。   (1) The step of preparing the solid support of the method using competitive binding of the present invention comprises the step of preparing the solid support on which the anti-D-amino acid monoclonal antibody and the D-amino acid carrier polymer complex are immobilized. The sample is prepared manually or automatically.

本発明の競合的な結合を利用する方法の（２）Ｄ−アミノ酸を含む試料と前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体との混合溶液を調製するステップでは、試料中のＤ−アミノ酸と前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体とが抗原抗体反応を行う。したがって、ステップ（２）には、試料中のＤ−アミノ酸と前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体との間の抗原抗体反応が完了するのに十分な条件で前記混合溶液をインキュベーションすることを含む。   In the step (2) of preparing the mixed solution of the sample containing D-amino acid and the anti-D-amino acid monoclonal antibody in the method using competitive binding of the present invention, the D-amino acid in the sample and the anti-D- Antigen-antibody reaction with amino acid monoclonal antibody. Therefore, step (2) includes incubating the mixed solution under conditions sufficient to complete the antigen-antibody reaction between the D-amino acid in the sample and the anti-D-amino acid monoclonal antibody.

本発明の競合的な結合を利用する方法の（３）前記混合溶液を前記固体支持体に接触させるステップでは、前記固体支持体に固定されたＤ−アミノ酸複合体のＤ−アミノ酸と、ステップ（２）で試料中のＤ−アミノ酸と反応しなかった抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体とが抗原抗体反応を行う。したがって、ステップ（３）には、前記固体支持体に固定されたＤ−アミノ酸複合体のＤ−アミノ酸と、試料中のＤ−アミノ酸と反応しなかった抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体との間の抗原抗体反応が完了するのに十分な条件で前記混合溶液をインキュベーションすることを含む。   In the step (3) of bringing the mixed solution into contact with the solid support in the method of using competitive binding of the present invention, the step comprises the steps of: D-amino acid of the D-amino acid complex immobilized on the solid support; The anti-D-amino acid monoclonal antibody that did not react with the D-amino acid in the sample in 2) undergoes an antigen-antibody reaction. Therefore, in step (3), an antigen between the D-amino acid of the D-amino acid complex immobilized on the solid support and the anti-D-amino acid monoclonal antibody that did not react with the D-amino acid in the sample. Incubating the mixed solution under conditions sufficient to complete the antibody reaction.

本発明の競合的な結合を利用する方法の（４）前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップは、前記固体支持体に結合しなかった抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を洗浄により除去するステップを含む場合がある。また、前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体又は２次抗体等の標識により検出・定量される。定量するステップ（４）は、既知の濃度のＤ−アミノ酸を含む試料を用いて固体支持体のＤ−アミノ酸と反応した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量を数値化してプロットした検量線を作成するステップと、未知の濃度のＤ−アミノ酸を含む試料についてステップ（１）ないし（３）を行って、前記固体支持体に結合した前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体量から前記検量線を用いて試料中のＤ−アミノ酸濃度を算出するステップとを含む。   (4) The step of detecting and quantifying the anti-D-amino acid monoclonal antibody bound to the solid support in the method using competitive binding of the present invention comprises the step of detecting and quantifying the anti-D-amino acid monoclonal not bound to the solid support. It may include removing the antibody by washing. The anti-D-amino acid monoclonal antibody is detected and quantified with a label such as the monoclonal antibody or the secondary antibody. Quantifying step (4) creates a calibration curve in which the amount of the anti-D-amino acid monoclonal antibody reacted with the D-amino acid of the solid support is digitized and plotted using a sample containing a known concentration of D-amino acid. Steps (1) to (3) are performed on a sample containing an unknown concentration of D-amino acid, and the amount of the anti-D-amino acid monoclonal antibody bound to the solid support is used in the sample using the calibration curve. Calculating the D-amino acid concentration.

本発明の検量線とは、試料中のＤ−アミノ酸濃度と、固体支持体のＤ−アミノ酸と反応した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量とを対応づけるグラフ又は関係式をいう。検量線の作成に用いる濃度既知のＤ−アミノ酸を含む試料は少なくとも２点あればよいが、定量精度確保の観点から３点又は４点以上であることが望ましい。   The calibration curve of the present invention refers to a graph or a relational expression that correlates the concentration of D-amino acid in a sample with the amount of anti-D-amino acid monoclonal antibody reacted with D-amino acid on a solid support. There should be at least two samples containing D-amino acids with known concentrations used for the preparation of the calibration curve, but it is desirable that the number is 3 or 4 or more from the viewpoint of ensuring quantitative accuracy.

前記固体支持体のＤ−アミノ酸と反応した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量を数値化する手法は特に限定されないが、以下に説明するＥＬＩＳＡ法及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法のほか、ラテックス凝集法が含まれる。   The method for quantifying the amount of the anti-D-amino acid monoclonal antibody reacted with the D-amino acid of the solid support is not particularly limited, but in addition to the ELISA method and surface plasmon resonance (SPR) method described below, latex aggregation method Is included.

ＥＬＩＳＡ法は、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体に対する酵素標識２次抗体を前記モノクローナル抗体に結合させ、前記標識酵素の基質を添加し、酵素反応産物を検出することにより前記目的の抗体を検出・定量する手法である。２次抗体を用いる代わりに、前記モノクローナル抗体にビオチンのような低分子リガンドを結合させておいて、該低分子リガンドと特異的に結合するアビジンのような生体高分子を用いる場合がある。前記標識に用いられる酵素標識には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ベータガラクトシダーゼ（β-ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等があり、適当な基質を用いる発色反応や化学発光反応によって検出される。   In the ELISA method, an enzyme-labeled secondary antibody against an anti-D-amino acid monoclonal antibody is bound to the monoclonal antibody, a substrate for the labeled enzyme is added, and the target antibody is detected and quantified by detecting the enzyme reaction product. It is a technique. Instead of using a secondary antibody, a low molecular ligand such as biotin may be bound to the monoclonal antibody, and a biopolymer such as avidin that specifically binds to the low molecular ligand may be used. Examples of the enzyme label used for the labeling include peroxidase (POD), beta-galactosidase (β-gal), alkaline phosphatase (ALP), and the like, which are detected by a color development reaction or chemiluminescence reaction using an appropriate substrate.

ＳＰＲ法は、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）とよばれる光学現象を利用して、固体支持体上に固定化した分子と相互作用の相手となる分子との、固体支持体上における特異的相互作用を微細な質量変化として測定する手法である。この手法を適用することで、固体支持体に固定化されたＤ−アミノ酸複合体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の量を、固体支持体の質量変化として数値化することができる。ＳＰＲ法を実施するためのシステムとしては、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）が市販されている。   The SPR method utilizes an optical phenomenon called surface plasmon resonance (SPR), and a molecule immobilized on a solid support and a molecule that is a partner of interaction with the molecule on the solid support. It is a technique to measure the dynamic interaction as a minute mass change. By applying this technique, the amount of the anti-D-amino acid monoclonal antibody bound to the D-amino acid complex immobilized on the solid support can be quantified as the mass change of the solid support. As a system for carrying out the SPR method, for example, a BIAcore system (BIAcore, Uppsala, Sweden) is commercially available.

ラテックス凝集法では、固体支持体であるラテックス等の微粒子又はナノ微粒子に結合したモノクローナル抗体の量に応じた微粒子の凝集反応の程度を比濁度の変化として分光光度計で測定する。   In the latex agglutination method, the degree of agglomeration reaction of fine particles according to the amount of monoclonal antibody bound to fine particles or nanoparticles such as latex as a solid support is measured with a spectrophotometer as a change in turbidity.

ハプテン分子をキャリアタンパク質に結合させて免疫した場合、キャリアタンパク質に対する抗体も産生される。したがって本発明の競合的な結合を利用する方法では、キャリアタンパク質に反応する抗体の存在によりＤ−アミノ酸の検出・定量の精度が低下する可能性を排除するために、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質と異なる場合がある。好ましくは、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は卵白アルブミンであり、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質はウシ血清アルブミンである場合がある。   When immunized with a hapten molecule bound to a carrier protein, antibodies against the carrier protein are also produced. Therefore, in the method using competitive binding of the present invention, in order to eliminate the possibility that the accuracy of detection and quantification of D-amino acid is reduced due to the presence of an antibody that reacts with a carrier protein, the method is used. The carrier protein constituting the D-amino acid complex may be different from the carrier protein constituting the D-amino acid complex used for immunization of the mammal. Preferably, the carrier protein constituting the D-amino acid complex immobilized on the solid support is ovalbumin, and the carrier protein constituting the D-amino acid complex used for immunization of the mammal is bovine serum albumin. There is a case.

本発明は、前記のいずれかのＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法を実施できるように構成される、Ｄ−アミノ酸の免疫学的分析装置を提供する。前記装置には、固体支持体に結合したモノクローナル抗体の量を検出・測定するための分光光度計、蛍光分光光度計、表面プラズモン共鳴測定器等の測定ユニット、試薬、洗浄液及び／又は試料の注入及び又は除去のためのディスペンサユニット、ＥＬＩＳＡ用マルチウェルプレートや表面プラズモン共鳴用センサーチップのハンドリングのためのロボットアームユニット、これらの制御のための制御ユニット等が含まれる。   The present invention provides a D-amino acid immunological analyzer configured to be able to carry out any of the aforementioned D-amino acid immunological analysis methods. In the apparatus, a measuring unit such as a spectrophotometer, a fluorescence spectrophotometer, a surface plasmon resonance measuring instrument for detecting and measuring the amount of the monoclonal antibody bound to the solid support, an injection of a reagent, a washing solution and / or a sample And / or a dispenser unit for removal, a robot arm unit for handling a multi-well plate for ELISA and a sensor chip for surface plasmon resonance, a control unit for controlling these, and the like.

本発明は、本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を含むＤ−アミノ酸の分析用試薬キットも提供する。前記キットには、前記モノクローナル抗体のほか、該モノクローナル抗体の抗原Ｄ−アミノ酸と、該Ｄ−アミノ酸とキャリア高分子とが結合したＤ−アミノ酸複合体と、該Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体とのうち少なくとも１つを含む場合がある。前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体は、前記Ｄ−アミノ酸複合体がコーティングされた基質を有するＥＬＩＳＡ法用マルチウェルプレート、前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された表面プラズモン共鳴法用センサーチップ及び／又は前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された凝集法用の微粒子又はナノ微粒子の場合がある。   The present invention also provides a reagent kit for analysis of D-amino acid comprising the anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention. In addition to the monoclonal antibody, an antigen D-amino acid of the monoclonal antibody, a D-amino acid complex in which the D-amino acid and a carrier polymer are bound, and the D-amino acid complex are immobilized in the kit. At least one of the solid support may be included. The solid support on which the D-amino acid complex is immobilized is a multi-well plate for an ELISA method having a substrate coated with the D-amino acid complex, or for a surface plasmon resonance method on which the D-amino acid complex is immobilized In some cases, the sensor chip and / or fine particles or nano-particles for the aggregation method in which the D-amino acid complex is fixed.

キャリアタンパク質に反応する抗体の存在によりＤ−アミノ酸の検出・定量の精度が低下する可能性を排除するために、前記分析用キットでは、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質と異なる場合がある。さらに好ましくは前記分析用キットでは、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質は卵白アルブミンであり、前記哺乳動物の免疫に用いるＤ−アミノ酸複合体を構成するキャリアタンパク質はウシ血清アルブミンである場合がある。   In order to eliminate the possibility that the accuracy of detection and quantification of D-amino acids is reduced due to the presence of an antibody that reacts with a carrier protein, the analytical kit comprises a D-amino acid complex immobilized on the solid support. The carrier protein used may be different from the carrier protein constituting the D-amino acid complex used for immunization of the mammal. More preferably, in the analysis kit, the carrier protein constituting the D-amino acid complex immobilized on the solid support is ovalbumin, and the carrier protein constituting the D-amino acid complex used for immunization of the mammal May be bovine serum albumin.

本発明の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は極めて特異性が高いだけでなく、抗原のＤ−アミノ酸以外の他の化合物との交差反応が非常に低いため、該抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いるＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法によれば、迅速かつ簡便に、また高精度でＤ−アミノ酸を分析することができ、多検体の分析も可能となる。前記免疫学的分析方法はＥＬＩＳＡ法、ＳＰＲ法等さまざまな手法を適用して実施可能であり、完全自動化への応用も可能である。したがって本発明は、Ｄ−アミノ酸の生理的意義及び機能の解明を含むＤ−アミノ酸研究に大きく貢献することができる。   The anti-D-amino acid monoclonal antibody of the present invention is not only highly specific but also has a very low cross-reactivity with other compounds other than the D-amino acid of the antigen. According to the immunological analysis method of amino acids, D-amino acids can be analyzed quickly and easily with high accuracy, and analysis of multiple samples is also possible. The immunological analysis method can be carried out by applying various methods such as ELISA method and SPR method, and can be applied to full automation. Therefore, the present invention can greatly contribute to D-amino acid research including elucidation of physiological significance and function of D-amino acid.

以下に具体的な実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの具体例により何ら制限されるものではない。   The present invention will be described in detail below with reference to specific examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these specific examples.

実施例で使用する実験動物及び動物細胞は以下のように準備した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＰＦ、メス）及びウィスターラット（ＳＰＦ、オス）は、九動株式会社（熊本）より購入し、１週間以上九州大学薬学部内の動物舎において飼育した後で、実験に供した。飼育条件は明期７：００〜１９：００、暗期１９：００〜７：００とし、水及び食餌は自由摂取させた。食餌はＮＭＦダイエット（オリエンタル酵母、東京）を使用した。なお、各動物実験は九州大学大学院薬学研究院等動物実験委員会の承諾を受けて遂行された。ミエローマ細胞は、理研バイオリソースセンター（つくば、日本）より供与されたｓｐ２／０−Ａｇ１４株を使用した。   Experimental animals and animal cells used in the examples were prepared as follows. BALB / c mice (SPF, female) and Wistar rats (SPF, male) were purchased from Kudo Co., Ltd. (Kumamoto) and kept in an animal house in the Faculty of Pharmaceutical Sciences of Kyushu University for more than one week, and then subjected to experiments. . The breeding conditions were light period from 7:00 to 19:00, dark period from 19:00 to 7:00, and water and food were freely ingested. NMF diet (Oriental yeast, Tokyo) was used for the diet. Each animal experiment was carried out with the consent of the Animal Experiment Committee such as Kyushu University Graduate School of Pharmaceutical Sciences. As the myeloma cell, sp2 / 0-Ag14 strain provided by RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan) was used.

本実施例では、Ｄ−アミノ酸複合体、ハイブリドーマ細胞株及び抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の作製について示す。   In this example, preparation of a D-amino acid complex, a hybridoma cell line, and an anti-D-amino acid monoclonal antibody is shown.

材料及び方法
１−１ Ｄ−アミノ酸複合体の作製及びマウスへの免疫
１−１−１ マウスの免疫に使用する（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製
種々のＤ−アミノ酸を用いた（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体を以下のように作製した。２０ｍＬ遮光硝子バイアルにＢＳＡ１２ｍｇを秤量し、６２．５ｍＭ Ｄ−アミノ酸含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１．６ｍＬ加え溶解させた。この溶液に２．５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液０．４ｍＬを加え、室温で２時間振盪撹拌した後、４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）水溶液２．０ｍＬを加え、室温で１時間振盪撹拌した。反応液を透析膜（ＷＭＣＯ ３，５００、スペクトラムメディカルインダストリーズ、インク．、米国 カリフォルニア州 ランチョドミンゲズ）に入れ、ＰＢＳに対して４°Ｃ下一晩透析して（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体溶液を得た。前記複合体溶液は分注して使用時まで−２０°Ｃで保存した。一例として、図１に（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製方法と、作製の際に起こる反応の模式図とを示す。 Materials and Methods 1-1 Preparation of D-amino acid complex and immunization to mouse 1-1-1 Preparation of (D-AA) -GA-BSA complex used for immunization of mouse Various D-amino acids were used. A (D-AA) -GA-BSA complex was prepared as follows. In a 20 mL light-shielding glass vial, 12 mg of BSA was weighed, and 1.6 mL of 62.5 mM D-amino acid-containing 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) was added and dissolved. To this solution, 0.4 mL of 2.5% glutaraldehyde (GA) aqueous solution was added and stirred at room temperature for 2 hours, and then 2.0 mL of 4 mg / mL sodium borohydride (NaBH 4 ) aqueous solution was added. Stir for hours. The reaction solution was placed in a dialysis membrane (WMCO 3,500, Spectrum Medical Industries, Inc., Rancho Dominges, CA, USA) and dialyzed against PBS overnight at 4 ° C (D-AA) -GA- A BSA complex solution was obtained. The complex solution was dispensed and stored at −20 ° C. until use. As an example, FIG. 1 shows a method for producing a (D-Asp) -GA-BSA complex and a schematic diagram of a reaction that occurs during the production.

１−１−２ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の分子量の測定
１−１−１で調製した反応液を透析膜（ＷＭＣＯ ３，５００、スペクトラムメディカルインダストリーズ，インク．）に入れ、ミリＱ水で４°Ｃ下一晩透析した。得られた透析内液１０μＬをマトリックス溶液（飽和量のシナピン酸をＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ＝５０／５０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）に加え、１分間撹拌した後５０００ｇで遠心分離して得られた上清）４０μＬと混合して撹拌した後、１μＬをＭＳプレートに塗布し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。測定はレーザー強度２３００で行った。 1-1-2 Measurement of Molecular Weight of (D-AA) -GA-BSA Complex by MALDI-TOF-MS The reaction solution prepared in 1-1-1 was used as a dialysis membrane (WMCO 3,500, Spectrum Medical Industries, Inc. ) And dialyzed overnight at 4 ° C against milliQ water. 10 μL of the obtained dialysis internal solution was added to a matrix solution (saturated amount of sinapinic acid was added to CH 3 CN / H 2 O / TFA = 50/50 / 0.1 (v / v / v) and stirred for 1 minute, and then 5000 g The supernatant obtained by centrifugation in (1) was mixed with 40 μL and stirred, and 1 μL was applied to an MS plate and analyzed by MALDI-TOF-MS. The measurement was performed at a laser intensity of 2300.

１−１−３ マウスへの免疫
免疫は２週間間隔で計３回行った。１−１−１で調製した（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体溶液０．７ｍＬにＰＢＳ０．７ｍＬ及びフロイント完全アジュバント（ＡＣＦ）１．４ｍＬを加え撹拌し、油中水滴型エマルジョンを得た。このエマルジョン２００μＬを６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＰＦ、メス）にペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）麻酔下で背部皮下に複数箇所に分けて投与した。２回目の免疫は、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いて、初回と同様の方法でエマルジョンを作製し、２００μＬをマウス背部皮下に投与した。抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により確認した後、３回目の免疫を行った。前記（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体溶液５０μＬ（無希釈）を無麻酔下で腹腔内投与した。 1-1-3 Immunization to mice Immunization was performed 3 times at intervals of 2 weeks. 0.7 mL of PBS and 1.4 mL of Freund's complete adjuvant (ACF) were added to 0.7 mL of the (D-AA) -GA-BSA complex solution prepared in 1-1-1, and stirred to obtain a water-in-oil emulsion. . 200 μL of this emulsion was administered to 6-week-old BALB / c mice (SPF, female) under penalbarbital (50 mg / kg intraperitoneal administration) under anesthesia in multiple portions under the dorsal skin. For the second immunization, an emulsion was prepared in the same manner as the first time using Freund's incomplete adjuvant (FIA), and 200 μL was administered subcutaneously to the back of the mouse. After confirming antibody production by ELISA, a third immunization was performed. 50 μL (undiluted) of the (D-AA) -GA-BSA complex solution was intraperitoneally administered without anesthesia.

１−１−４ ＥＬＩＳＡ法用アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の作製
ＥＬＩＳＡ法に供試するための、種々のアミノ酸を用いたアミノ酸−グルタルアルデヒド架橋−卵白アルブミン複合体（以下、「アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体」という。）を以下のように作製した。ＯＶＡ６ｍｇを１０ｍＬの遮光硝子バイアルに秤量し、６２．５ｍＭアミノ酸含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬ及び２．５％ＧＡ水溶液０．２ｍＬを加えて室温で２時間振盪撹拌した後、４ｍｇ／ｍＬ ＮａＢＨ４水溶液１．０ｍＬを加えて１時間振盪撹拌し、アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体溶液とした。なお、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒについては０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用いて３１．２５ｍＭ溶液を調製し、この溶液０．８ｍＬにＯＶＡ３ｍｇ及び１．２５％ＧＡ水溶液０．２ｍＬを加えて２時間振盪撹拌した後、２ｍｇ／ｍＬ ＮａＢＨ４水溶液１．０ｍＬを加えて１時間振盪撹拌することにより作製した。 1-1-4 Preparation of Amino Acid-GA-OVA Complex for ELISA Method Amino acid-glutaraldehyde cross-linked-ovalbumin complex (hereinafter referred to as “amino acid-GA-”) using various amino acids for the ELISA method. OVA complex ") was prepared as follows. Weigh 6 mg of OVA into a 10 mL light-shielding glass vial, add 0.8 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 62.5 mM amino acid and 0.2 mL of 2.5% GA aqueous solution, and shake at room temperature for 2 hours. After stirring, 1.0 mL of 4 mg / mL NaBH 4 aqueous solution was added, and the mixture was shaken and stirred for 1 hour to obtain an amino acid-GA-OVA complex solution. For D-Cys and D-Tyr, a 31.25 mM solution was prepared using 0.1 M sodium borate buffer (pH 10.0), and OVA 3 mg and 1.25% GA aqueous solution 0 were added to 0.8 mL of this solution. 2 mL was added and stirred for 2 hours, and then 1.0 mL of 2 mg / mL NaBH 4 aqueous solution was added and stirred for 1 hour.

１−２ 抗体産生細胞株の樹立と抗体の特異性評価
１−２−１ 細胞融合による抗体産生細胞株の樹立
図４に、抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の作製方法の概略図を示す。免疫後のマウスをエーテル麻酔下で断頭し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に全身を浸して殺菌した後、クリーンベンチ内で脾臓を摘出した。脾臓は３７°Ｃに加温したＤＭＥＭ５ｍＬ（３７°Ｃ）を入れたペトリ皿４枚中で順次脂肪片、組織片等を除去し洗浄した。５枚目のペトリ皿中でスライドガラスを用いて脾臓を磨りつぶし、脾細胞の懸濁液を得た。得られた懸濁液を１５ｍＬの遠沈管に移し５分間静置することで大きな組織片等を沈殿させた後、上清を５０ｍＬ遠沈管に移した。１２００ｒｐｍで５分間遠心後上清を除去し、ＤＭＥＭ（３７°Ｃ）を１０ｍＬ添加して懸濁し、再び５分間遠心（１２００ｒｐｍ）した。この操作を３回繰り返して碑細胞を洗浄した後、上清を除去した。血球計測装置を用いて碑細胞数及び対数増殖期のミエローマ細胞（ｓｐ２／０−Ａｇ１４）数を測定し（各細胞の懸濁液０．１ｍＬをＰＢＳで５０倍して測定した。）、ミエローマ細胞懸濁液を碑細胞：ミエローマ細胞＝４：１になるように加えた。さらにＤＭＥＭ（３７°Ｃ）を加えて全量１０ｍＬとして懸濁し、５分間遠心（１２００ｒｐｍ）後上清を除去した。ペレットを崩して層状にした後、遠沈管の壁を伝わらせながら１ｍＬの５０％ＰＥＧ１５００（７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０、（ｗ／ｖ）、ロシュ）を１分間かけて滴下した。遠沈管を１分間掌の中で静置した後、９ｍＬのＤＭＥＭ（３７°Ｃ）を５分間かけて滴下した。５分間遠心（１２００ｒｐｍ）して上清を除去した後、１５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（ｖ／ｖ、３７°Ｃ）１００ｍＬに懸濁させ、ピペットを用いて９６穴培養プレートに各ウェル１滴（Ｄ−Ｌｅｕ）又は２滴（Ｄ−Ａｓｐ）ずつ分注しＣＯ２インキュベーター（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）で培養した。 1-2 Establishment of Antibody Producing Cell Line and Evaluation of Antibody Specificity 1-2-1 Establishment of Antibody Producing Cell Line by Cell Fusion FIG. 4 shows a schematic diagram of a method for producing an anti-D-amino acid monoclonal antibody. The mouse after immunization was decapitated under ether anesthesia, the whole body was immersed in a 70% (v / v) ethanol aqueous solution and sterilized, and then the spleen was removed in a clean bench. The spleen was washed by removing fat pieces, tissue pieces and the like sequentially in 4 Petri dishes containing 5 mL of DMEM (37 ° C.) heated to 37 ° C. The spleen was ground using a slide glass in a fifth Petri dish to obtain a suspension of splenocytes. The obtained suspension was transferred to a 15 mL centrifuge tube and allowed to stand for 5 minutes to precipitate large tissue pieces and the like, and then the supernatant was transferred to a 50 mL centrifuge tube. After centrifuging at 1200 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, 10 mL of DMEM (37 ° C.) was added and suspended, and centrifuged again (1200 rpm) for 5 minutes. This operation was repeated three times to wash the monkey cells, and then the supernatant was removed. The number of monocyte cells and the number of myeloma cells (sp2 / 0-Ag14) in the logarithmic growth phase were measured using a blood cell counter (measured by multiplying 0.1 mL of each cell suspension with PBS 50 times). The cell suspension was added so that the number of monocyte cells: myeloma cells = 4: 1. Further, DMEM (37 ° C) was added to make a total volume of 10 mL, and the supernatant was removed after centrifugation for 5 minutes (1200 rpm). After breaking the pellets into layers, 1 mL of 50% PEG 1500 (75 mM HEPES (pH 8.0, (w / v), Roche)) was dropped over 1 minute while passing through the wall of the centrifuge tube. After standing in the palm for 5 minutes, 9 mL of DMEM (37 ° C.) was added dropwise over 5 minutes, centrifuged for 5 minutes (1200 rpm), the supernatant was removed, and 15% FCS-containing DMEM (v / v) , 37 ° C), suspended in 100 mL, and dispensed 1 drop (D-Leu) or 2 drops (D-Asp) into each well of a 96-well culture plate using a pipette. CO 2 incubator (37 ° C, 5 ° % CO 2 ).

細胞融合の翌日、各ウェルに３倍濃度のＨＡＴ培地（１０％ＦＣＳ、３００μＭヒポキサンチン、１．２μＭアミノプテリン、４８μＭチミジン含有ＤＭＥＭ）を１滴ずつ（Ｄ−Ａｓｐ）、１．５倍濃度ＨＡＴ培地（１０％ＦＣＳ含有）２滴（Ｄ−Ｌｅｕ）ずつを加え、さらに培養した。融合から約２週間後に各ウェルから培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によりＤ−Ａｓｐ又はＤ−Ｌｅｕに対する抗体を産生する細胞のスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡ法は（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を固定化したプレートを用い、採取した培養上清中の抗体結合を１−２−５と同様の方法で評価した。発色が強いウェルを陽性とし、これら陽性ウェルの細胞培養液を９６穴培養プレートから２４穴培養プレートにスケールアップした（Ｄ−Ａｓｐ：２１ウェル、Ｄ−Ｌｅｕ：２７ウェル）。数日培養した後、プレートに固定化された各種ＡＡ−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する交叉反応性をＥＬＩＳＡ法により検討した。さらに遊離体に対する抗体の反応性を検討するために、競合法による吸光度変化を測定した。測定の結果（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体のみに特異的結合を認め、遊離体を認識すると示唆されたウェルを選択して限界希釈法による細胞のクローニングを行った。限界希釈は２４穴プレートの培養液の５ｎ倍（ｎ＝１−８）希釈系列を作製し、各希釈系列を９６穴培養プレートにピペットを用いて１滴ずつ分注した。２週間培養後、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する結合を指標とするスクリーニングをＥＬＩＳＡ法により行い、前記複合体に対して結合が認められるウェルの中で単コロニーからなるウェルを選択し、再度限外希釈法によりクローニングを行った。２回目のクローニングの際にＨＡＴ培地からＨＴ培地（１０％ＦＣＳ、１００μＭヒポキサンチン、１６μＭチミジン含有ＤＭＥＭ）に変更した。２週間培養した後、単コロニーからなるウェルを２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬの培養プレートに順次スケールアップし、モノクローナル抗体産生株を得た。なお、培地はスケールアップの際にＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ含有）に変更した。   On the next day of cell fusion, each well was added with a drop of 3 times HAT medium (10% FCS, 300 μM hypoxanthine, 1.2 μM aminopterin, 48 μM thymidine-containing DMEM) (D-Asp), 1.5 times concentration HAT. Two drops (D-Leu) of medium (containing 10% FCS) were added and further cultured. About 2 weeks after the fusion, the culture supernatant was collected from each well, and cells producing antibodies against D-Asp or D-Leu were screened by ELISA. The ELISA method uses (D-Asp) -GA-OVA complex or (D-Leu) -GA-OVA complex-immobilized plate, and the antibody binding in the collected culture supernatant is 1-2-5. Evaluation was made in the same manner. Wells with strong color development were regarded as positive, and the cell culture solution of these positive wells was scaled up from a 96-well culture plate to a 24-well culture plate (D-Asp: 21 well, D-Leu: 27 well). After culturing for several days, cross-reactivity with various AA-GA-OVA complexes or (D-AA) -GA-OVA complexes immobilized on the plate was examined by ELISA. Furthermore, in order to examine the reactivity of the antibody with the educt, the change in absorbance by the competition method was measured. As a result of the measurement, specific binding was observed only in the (D-Asp) -GA-OVA complex or (D-Leu) -GA-OVA complex, and the wells suggested to recognize the free form were selected and the limiting dilution method was selected. The cells were cloned by For limiting dilution, 5n-fold (n = 1-8) dilution series of the culture solution in a 24-well plate was prepared, and each dilution series was dispensed drop-wise into a 96-well culture plate using a pipette. After culturing for 2 weeks, screening using the binding to (D-Asp) -GA-OVA complex or (D-Leu) -GA-OVA complex as an index was performed by ELISA, and binding to the complex was recognized. Of the wells, a well consisting of a single colony was selected, and cloning was performed again by the limiting dilution method. During the second cloning, the HAT medium was changed to HT medium (10% FCS, 100 μM hypoxanthine, 16 μM thymidine-containing DMEM). After culturing for 2 weeks, wells consisting of single colonies were sequentially scaled up to 2 mL, 5 mL, and 10 mL culture plates to obtain monoclonal antibody-producing strains. The medium was changed to DMEM (containing 10% FCS) at the time of scale-up.

１−２−２ 抗体精製
１−２−１で得た細胞株を５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（ｖ／ｖ）を用いて継代培養し、培養液量を約３６０ｍＬとした。培地を無血清培地（細胞培養用培地添加剤ＲＤ−１（極東製薬工業、東京）をＤＭＥＭ１Ｌに溶解；１０μｇ／ｍＬインシュリン、３５μｇ／ｍＬ、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭセレン含有ＤＭＥＭ）に置換して７−１０日間無継代培養した。得られた培養上清をフィルター（ＭＦ（商標）−メンブレンフィルター、０．４５μｍ ＨＡ、ミリポア、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）濾過し、プロテインＧカラム（ハイトラッププロテインＧ ＨＰカラム、５ｍＬ、アマシャムバイオサイエンスコーポレーション、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて４°Ｃ下でアフィニティー精製した。プロテインＧカラムは１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で安定化した後、濾過した培養上清を一晩かけて送液した。溶出液の吸光度（２８０ｎｍ）が０．０５以下になるまで１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、その後０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７）を用いて抗体を溶出した。溶出液は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１．４ｍＬを入れた遠沈管に５ｍＬずつ分取し、分取した画分の吸光度（２８０ｎｍ）が、０．０３以上の画分を限外濾過膜（５０，０００ＭＷＣＯ、ザルトリウス（東京））を用いて濃縮後、ミリＱ水３０ｍＬで洗浄し、凍結乾燥させた。 1-2-2 Antibody Purification The cell line obtained in 1-2-1 was subcultured using DMEM (v / v) containing 5% FCS to make the culture volume about 360 mL. The medium was replaced with a serum-free medium (cell culture medium additive RD-1 (Kyokuto Pharmaceutical, Tokyo) dissolved in 1 L of DMEM; 10 μg / mL insulin, 35 μg / mL, 20 μM ethanolamine, 25 nM selenium-containing DMEM). -Subcultured for 10 days. The obtained culture supernatant was filtered (MF (trademark) -membrane filter, 0.45 μm HA, Millipore, Bedford, Mass., USA), and protein G column (high trap protein G HP column, 5 mL, Amersham Bioscience Corporation) , Piscataway, NJ, USA) at 4 ° C. The protein G column was stabilized with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and then the filtered culture supernatant was fed overnight. The column was washed with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) until the absorbance (280 nm) of the eluate was 0.05 or less, and then the antibody was added using 0.1 M sodium citrate buffer (pH 2.7). Was eluted. The eluate was fractionated in 5 mL portions into a centrifuge tube containing 1.4 mL of 1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0), and the fraction with an absorbance (280 nm) of 0.03 or more was limited. After concentration using a filtration membrane (50,000 MWCO, Sartorius (Tokyo)), it was washed with 30 mL of milli-Q water and lyophilized.

１−２−３ 抗体量の定量
精製した抗体のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ試薬（ナカライテスク、京都）を用いて、ＢＳＡを用いて作成した検量線を使用して定量した。抗体溶液又は、ＢＳＡ溶液１０μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加した後、水で５倍希釈したＣＢＢ試薬２００μＬを加え、１０分間撹拌した後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 1-2-3 Quantification of antibody amount The protein concentration of the purified antibody was quantified using a calibration curve prepared with BSA using a protein assay CBB reagent (Nacalai Tesque, Kyoto). After adding 10 μL of the antibody solution or BSA solution to the ELISA plate, 200 μL of CBB reagent diluted 5-fold with water was added, and the absorbance at 595 nm after stirring for 10 minutes was measured with a microplate reader.

１−２−４ 抗体アイソタイピング
抗体のアイソタイプはマウスタイパーサブアイソタイピングキット（バイオラッド、米国 カリフォルニア州 ハーキュルズ）を用いて決定した。１５ｍＬの遠沈管にキット附属のアイソタイピングスティックを１本入れ、作製した抗体溶液（約１μｇ／ｍＬ）とペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体溶液をキットの指示に従い混合し、そのうち３ｍＬを遠沈管に入れ、１５分間室温で撹拌した。５ｍＬのＴ−ＰＢＳで２回撹拌洗浄した後、キット附属の基質溶液（４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素水との混合液）３ｍＬを加え、１５分反応させた。５ｍＬの水で２回撹拌洗浄した後、アイソタイプを判定した。 1-2-4 Antibody Isotyping Antibody isotypes were determined using a mouse typer subisotyping kit (BioRad, Hercules, CA, USA). Place one isotyping stick attached to the kit in a 15 mL centrifuge tube, mix the prepared antibody solution (about 1 μg / mL) and the peroxidase-labeled anti-mouse antibody solution according to the instructions of the kit, 3 mL of which is put in the centrifuge tube, 15 Stir for minutes at room temperature. After stirring and washing twice with 5 mL of T-PBS, 3 mL of the substrate solution (mixed solution of 4-chloro-1-naphthol and hydrogen peroxide solution) attached to the kit was added and reacted for 15 minutes. After stirring and washing twice with 5 mL of water, the isotype was determined.

１−２−５ 抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性評価（アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する認識能評価）
図６に、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の交叉反応性の評価のための直接ＥＬＩＳＡ法の手順を示す。１−１−４で作製したアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）溶液（１．５μｇ／ｍＬ）１００μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間静置することでプレート上に固定化した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、５％スキムミルクＰＢＳ溶液を３００μＬ加え、２５°Ｃで１時間ブロッキングした。洗浄後、精製した抗体（１．０μｇ／ｍＬ）のＴ−ＰＢＳ溶液１００μＬを添加した。１時間後洗浄し、Ｔ−ＰＢＳで１０００倍希釈した、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ山羊抗体溶液を１００μＬを添加し、２５°Ｃで１時間静置した。洗浄後、基質溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）０．３ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳと０．００３％Ｈ２Ｏ２を含有）を添加し、１５分後の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより測定した。 1-2-5 Specificity evaluation of anti-D-amino acid monoclonal antibody (recognition ability evaluation for amino acid-GA-OVA complex)
FIG. 6 shows the procedure of the direct ELISA method for evaluating the cross-reactivity of the anti-D-Asp monoclonal antibody. Add 100 μL of 50 mM sodium carbonate buffer (pH 9.6) solution (1.5 μg / mL) of the amino acid-GA-OVA complex prepared in 1-1-4 to the ELISA plate and leave it for 1 hour to leave the plate. Immobilized on top. After washing 3 times with T-PBS, 300 μL of 5% skim milk PBS solution was added and blocked at 25 ° C. for 1 hour. After washing, 100 μL of a purified antibody (1.0 μg / mL) T-PBS solution was added. After washing for 1 hour, 100 μL of a POD-labeled anti-mouse IgG goat antibody solution diluted 1000 times with T-PBS was added and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. After washing, a substrate solution (containing 0.1 M sodium citrate buffer (pH 4.0) 0.3 mg / mL ABTS and 0.003% H 2 O 2 ) was added, and the absorbance (405 nm) after 15 minutes was measured. Measured with a microplate reader.

１−２−６ 抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性評価（遊離アミノ酸に対する認識能評価）
１−１−４で作製したアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）溶液（１．５μｇ／ｍＬ）１００μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間静置することでプレート上に固定化した。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、５％スキムミルクＰＢＳ溶液を３００μＬ加え、室温で１時間ブロッキングした。洗浄後、アミノ酸のＴ−ＰＢＳ溶液（０．５ｍＭ、２０μＬ）、精製した抗体（１．２５μｇ／ｍＬ）のＴ−ＰＢＳ溶液８０μＬを添加して撹拌した。１時間後洗浄し、Ｔ−ＰＢＳで１０００倍希釈した、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ山羊抗体溶液を１００μＬを添加し、１時間静置した。洗浄後、基質溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）０．３ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳと０．００３％Ｈ２Ｏ２を含有）を添加し、１５分後の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより測定した。 1-2-6 Specificity evaluation of anti-D-amino acid monoclonal antibodies (recognition of free amino acids)
Add 100 μL of 50 mM sodium carbonate buffer (pH 9.6) solution (1.5 μg / mL) of the amino acid-GA-OVA complex prepared in 1-1-4 to the ELISA plate and leave it for 1 hour to leave the plate. Immobilized on top. After washing 3 times with T-PBS, 300 μL of 5% skim milk PBS solution was added and blocked at room temperature for 1 hour. After washing, an amino acid T-PBS solution (0.5 mM, 20 μL) and a purified antibody (1.25 μg / mL) T-PBS solution 80 μL were added and stirred. After washing for 1 hour, 100 μL of a POD-labeled anti-mouse IgG goat antibody solution diluted 1000-fold with T-PBS was added and allowed to stand for 1 hour. After washing, a substrate solution (containing 0.1 M sodium citrate buffer (pH 4.0) 0.3 mg / mL ABTS and 0.003% H 2 O 2 ) was added, and the absorbance (405 nm) after 15 minutes was measured. Measured with a microplate reader.

結果及び考察
１−３ 抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の作製
１−３−１ （Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製
Ｄ−Ａｓｐについての図１に示す方法を各種のアミノ酸に適用して、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体を作製した。Ｄ−アミノ酸のＢＳＡへの結合は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて確認した。図２に示すようにＧＡ−ＢＳＡ複合体は７５ｋＤａ、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は７７ｋＤａであり、約２０個のＤ−Ａｓｐ分子がＢＳＡに結合していると考えられた。また、同様の方法により（Ｄ−Ｓｅｒ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は約６０個、（Ｄ−Ｐｒｏ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は約５０個、（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体は約６０個（図３）のＤ−アミノ酸分子が各々ＢＳＡに結合していると考えられた。 Results and Discussion 1-3 Preparation of Anti-D-Amino Acid Monoclonal Antibody 1-3-1 Preparation of (D-AA) -GA-BSA Complex The method shown in FIG. 1 for D-Asp was applied to various amino acids. , (D-AA) -GA-BSA complex was prepared. The binding of D-amino acid to BSA was confirmed using MALDI-TOF-MS. As shown in FIG. 2, the GA-BSA complex was 75 kDa and the (D-Asp) -GA-BSA complex was 77 kDa, and it was considered that about 20 D-Asp molecules were bound to BSA. Further, by the same method, about 60 (D-Ser) -GA-BSA complexes, about 50 (D-Pro) -GA-BSA complexes, and (D-Leu) -GA-BSA complexes were Approximately 60 (FIG. 3) D-amino acid molecules were each considered to be bound to BSA.

１−３−２ マウスへの免疫
マウスへの２回目の（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体投与後、抗血清の各種アミノ酸に対する結合性を、免疫原とは異なるキャリアタンパク質（ＯＶＡ）と結合させたアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を抗原として用いたＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。その結果、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体を免疫原として投与したマウスでは、Ｄ−ＡｓｐとＬ−Ａｓｐとを明確に識別し、他のアミノ酸に対してほとんど交叉反応性を示さない抗体を産生していると考えられた。Ｄ−ＬｅｕについてはＤ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｉｌｅ等の構造類似アミノ酸と交叉反応性を有していたが、Ｄ−ＬｅｕとＬ−Ｌｅｕとを明確に区別する抗体の産生が強く示唆された。一方Ｄ−Ｓｅｒに関しては、（Ｄ−Ｓｅｒ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体と反応する抗体は認められたが、（Ｄ−Ｓｅｒ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体と反応する抗体はほとんど産生されていなかった。またＤ−Ｐｒｏに関しては反応性が低いことに加え、Ｄ−Ａｌａに対して強い交叉反応性を有していた。以上の結果より、十分な抗体産生が認められ、Ｄ体とＬ体とを明確に区別すると考えられるＤ−Ａｓｐ及びＤ−Ｌｅｕについてモノクローナル抗体の作製を試みた。 1-3-2 Immunization to mice After the second administration of (D-AA) -GA-BSA complex to mice, the binding of antiserum to various amino acids is different from the carrier protein (OVA) different from the immunogen. Evaluation was performed by ELISA using the bound amino acid-GA-OVA complex as an antigen. As a result, in mice administered with (D-Asp) -GA-BSA complex as an immunogen, D-Asp and L-Asp were clearly distinguished and showed little cross-reactivity to other amino acids. It was thought to be producing antibodies. Although D-Leu had cross-reactivity with structurally similar amino acids such as D-Val and D-Ile, production of an antibody that clearly distinguishes D-Leu and L-Leu was strongly suggested. On the other hand, for D-Ser, an antibody that reacts with (D-Ser) -GA-BSA complex was observed, but an antibody that reacts with (D-Ser) -GA-OVA complex was hardly produced. . In addition, D-Pro has low reactivity and has strong cross-reactivity with D-Ala. From the above results, production of monoclonal antibodies was attempted for D-Asp and D-Leu, which are considered to produce sufficient antibodies and are considered to clearly distinguish D-form and L-form.

１−３−３ 抗体産生細胞株の樹立
細胞融合法による抗体産生細胞株の樹立を試みた。最終免疫から３日後にマウスから脾臓を摘出し、脾細胞とミエローマ細胞（ｓｐ２／０−Ａｇ１４）とを融合した。ＨＡＴ選択培地を用いて培養した後、ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングを行い、目的の抗体を産生している細胞を選抜した。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を固定化したプレートに培養上清を加え、各々約９００個又は１４００個のウェルについて抗体のプレートへの結合を評価した結果、Ｄ−Ａｓｐでは２１個、Ｄ−Ｌｅｕでは２７個の陽性ウェルが認められた。さらに陽性ウェルについて、構造の類似するアミノ酸に対する認識能を同様のＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。Ｄ−Ａｓｐについては、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体と（Ｌ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体とを明確に区別している７系統の細胞について評価した結果、１系統でＤ−Ａｓｎとの交叉反応性が認められたものの、６系統についてはほとんど交叉反応性を示さないことが明らかになった。Ｄ−Ｌｅｕについては（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体と（Ｌ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体とを明確に区別する抗体を産生していると考えられた６系統の細胞について、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを含む構造類似アミノ酸を抗原として選択性を評価した。 1-3-3 Establishment of Antibody-Producing Cell Line An attempt was made to establish an antibody-producing cell line by the cell fusion method. Three days after the final immunization, the spleen was removed from the mouse, and the spleen cells and myeloma cells (sp2 / 0-Ag14) were fused. After culturing using a HAT selection medium, screening was performed using the ELISA method, and cells producing the target antibody were selected. The culture supernatant is added to a plate on which (D-Asp) -GA-OVA complex or (D-Leu) -GA-OVA complex is immobilized, and about 900 or 1400 wells are added to the antibody plate. As a result of evaluating the binding, 21 positive wells were observed in D-Asp and 27 positive wells in D-Leu. Furthermore, the positive wells were examined for the ability to recognize amino acids having similar structures using the same ELISA method. As for D-Asp, as a result of evaluation of 7 lines of cells clearly distinguishing (D-Asp) -GA-OVA complex and (L-Asp) -GA-OVA complex, D-Asp was D-Asp in 1 line. Although cross-reactivity with Asn was observed, it was revealed that 6 lines showed almost no cross-reactivity. Regarding D-Leu, about 6 lines of cells thought to be producing antibodies that clearly distinguish (D-Leu) -GA-OVA complex from (L-Leu) -GA-OVA complex, Selectivity was evaluated using structurally similar amino acids including D-allo-Ile as antigens.

これらのアミノ酸について交叉性を検討した結果、図５に示すように５系統ではＤ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅをはじめとする構造類似アミノ酸に対して交叉反応性を有していたが、１系統はほとんど交叉反応を示さなかった。交叉反応性を示さなかった細胞系統について遊離Ｄ−Ａｓｐ又はＤ−Ｌｅｕに対する認識能の評価を行った。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体又は（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を固定化したプレートを用い、競合ＥＬＩＳＡ法により遊離Ｄ−Ａｓｐ及びＤ−Ｌｅｕに対する反応性を検討した。その結果、Ｄ−Ａｓｐ又はＤ−Ｌｅｕの添加により、抗体のプレートへの結合阻害に基づく吸光度減少が観察されたことから、これらの細胞が遊離体を認識する抗体を産生していることが明らかになった。当該細胞について、３９種のアミノ酸に対する交叉反応性を検討した後、２度のクローニングを行い抗遊離Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体産生細胞株を得た。抗体は、樹立した抗体産生細胞培養液からプロテインＧアフィニティーカラムを用いて精製した。   As a result of examining the cross-linking properties of these amino acids, as shown in FIG. 5, 5 strains were cross-reactive with structurally similar amino acids such as D-allo-Ile. There was no reaction. Cell lines that did not show cross-reactivity were evaluated for their ability to recognize free D-Asp or D-Leu. Using a plate on which (D-Asp) -GA-OVA complex or (D-Leu) -GA-OVA complex was immobilized, reactivity to free D-Asp and D-Leu was examined by a competitive ELISA method. As a result, the addition of D-Asp or D-Leu observed a decrease in absorbance based on inhibition of antibody binding to the plate, indicating that these cells are producing antibodies that recognize the free form. Became. The cells were examined for cross-reactivity with 39 amino acids, and then cloned twice to obtain an anti-free D-amino acid monoclonal antibody-producing cell line. The antibody was purified from the established antibody-producing cell culture using a protein G affinity column.

１−３−４ 抗体アイソタイピング
アイソタイプをマウス・タイパー・サブアイソタイピング・キット（バイオ−ラッド、米国 カリフォルニア州 ハークルズ）を用いて決定した。その結果、抗Ｄ−Ａｓｐ抗体、抗Ｄ−Ｌｅｕ抗体共に重鎖がγ１、軽鎖がκであった。 1-3-4 Antibody Isotyping Isotypes were determined using a mouse typer subisotyping kit (Bio-Rad, Harkles, CA, USA). As a result, in both the anti-D-Asp antibody and the anti-D-Leu antibody, the heavy chain was γ1 and the light chain was κ.

１−４ 抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性評価
１−４−１ 抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体
作製した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体の特異性を、種々のアミノ酸を用いて作成したアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を用いて図６に示す直接ＥＬＩＳＡ法により評価した。アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を結合させたＥＬＩＳＡプレートに精製した各抗体を添加し、抗体結合量を吸光度により評価した。その結果、図７に示すように抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体は、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対して高い発色が認められた一方で、Ｌ−Ａｓｐを始めとする他のアミノ酸によるアミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対してはほとんど発色が認められなかった。このことから、本抗体はＤ−Ａｓｐのみを強く認識する特異性の高い抗体であると考えられた。さらに、競合ＥＬＩＳＡ法により３９種の遊離型アミノ酸に対する反応性を検討した結果、本抗体は遊離Ｄ−Ａｓｐのみを特異的に認識することが明らかになった。本抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（マウス-マウス ハイブリドーマ ＤＡＳＰＺＨ−０７０３）は２００７年１２月７日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託された（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１４６０）。 1-4 Specificity Evaluation of Anti-D-Amino Acid Monoclonal Antibody 1-4-1 Anti-D-Asp Monoclonal Antibody Specificity of the prepared anti-D-amino acid monoclonal antibody was determined using amino acids-GA-OVA prepared using various amino acids. The composite was evaluated by the direct ELISA method shown in FIG. Each purified antibody was added to an ELISA plate to which an amino acid-GA-OVA complex was bound, and the amount of antibody binding was evaluated by absorbance. As a result, as shown in FIG. 7, the anti-D-Asp monoclonal antibody showed high color development with respect to the (D-Asp) -GA-OVA complex, while other amino acids including L-Asp. No color development was observed for the amino acid-GA-OVA complex obtained by From this, it was considered that this antibody is a highly specific antibody that strongly recognizes only D-Asp. Furthermore, as a result of examining the reactivity to 39 free amino acids by competitive ELISA, it was revealed that this antibody specifically recognizes only free D-Asp. A hybridoma cell line (mouse-mouse hybridoma DASPZH-0703) producing this antibody was deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of December 7, 2007 (Accession No. FERM P-21460). .

１−４−２ 抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体
抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体についても同様に、アミノ酸−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に対する認識能を検討した。その結果、図８に示すように（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体に高い発色を示した一方で、３９種のアミノ酸にイソロイシンのエピマーであるａｌｌｏ−Ｉｌｅを加えた４１種に対してはほとんど発色が認められなかった。このことから、作製した抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体は構造類似アミノ酸を始めとする他のアミノ酸に対してほとんど交叉反応性を有さない、極めて特異性の高い抗体であると考えられた。さらに遊離アミノ酸に対する認識能を検討した結果、本抗体は遊離Ｄ−Ｌｅｕのみを特異的に認識していることが明らかになった。 1-4-2 Anti-D-Leu monoclonal antibody The anti-D-Leu monoclonal antibody was similarly examined for its ability to recognize an amino acid-GA-OVA complex. As a result, as shown in FIG. 8, while (D-Leu) -GA-OVA complex showed high color development, it was compared with 41 kinds of 39 amino acids plus allo-Ile which is an epimer of isoleucine. Almost no color was observed. From this, it was considered that the prepared anti-D-Leu monoclonal antibody is an antibody having extremely high specificity and almost no cross-reactivity with other amino acids including structurally similar amino acids. Furthermore, as a result of examining the recognition ability for free amino acids, it was revealed that this antibody specifically recognizes only free D-Leu.

以上の様に、今回作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体及び抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体は、他のアミノ酸に対する交叉反応性をほとんど有さず、特異性が高い抗体であることが明らかになった。これらの抗体は遊離体のＤ−アミノ酸も良好に認識することから、作製した抗体を用いるＤ−Ａｓｐ及びＤ−Ｌｅｕの免疫測定が可能であると考えられる。     As described above, it was revealed that the anti-D-Asp monoclonal antibody and the anti-D-Leu monoclonal antibody prepared this time have almost no cross-reactivity with other amino acids and are highly specific antibodies. Since these antibodies also recognize the free D-amino acids well, it is considered that immunoassay of D-Asp and D-Leu using the prepared antibodies is possible.

今回作製した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体は、キャリアタンパク質に結合したＤ−アミノ酸と、遊離のＤ−アミノ酸を極めて特異的に認識する抗体であり、迅速分析法による多検体分析を始め、免疫染色による細胞局在解明へと応用可能であり、Ｄ−アミノ酸の生理機能を解明する上で極めて有用である。   The anti-D-amino acid monoclonal antibody prepared this time is an antibody that recognizes D-amino acid bound to a carrier protein and free D-amino acid very specifically. It can be applied to elucidation of cell localization and is extremely useful for elucidating physiological functions of D-amino acids.

本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を利用するＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法について示す。   In this example, a method for immunological analysis of D-amino acids using the ELISA method is shown.

材料及び方法
２−１ 遊離Ｄ−アミノ酸に対する競合ＥＬＩＳＡ法
図９に、遊離Ｄ−アミノ酸の一例としての遊離Ｄ−Ａｓｐの競合ＥＬＩＳＡ法の手順を示す。ＥＬＩＳＡプレート上に１．５μｇ／ｍＬの（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）溶液１００μＬを添加し１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後に、５％スキムミルク／ＰＢＳ（ｗ／ｖ）３００μＬを添加して１時間静置後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した。ラット血清２０μＬ及び抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体Ｔ−ＰＢＳ溶液（１．０μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し軽く撹拌した後１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後１０００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ山羊抗体のＴ−ＰＢＳ溶液１００μＬを添加し１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、基質溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）と、０．３ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳと、０．００３％Ｈ２Ｏ２とを含有）を添加し、１５分後の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより測定した。 Materials and Methods 2-1 Competitive ELISA Method for Free D-Amino Acid FIG. 9 shows the procedure of a competitive ELISA method for free D-Asp as an example of free D-amino acid. 100 μL of a 50 mM sodium carbonate buffer (pH 9.6) solution of 1.5 μg / mL (D-Asp) -GA-OVA complex was added to the ELISA plate and incubated for 1 hour. After washing 3 times with T-PBS, 300 μL of 5% skim milk / PBS (w / v) was added, allowed to stand for 1 hour, and then washed 3 times with T-PBS. Rat serum (20 μL) and anti-D-Asp monoclonal antibody T-PBS solution (1.0 μg / mL) (100 μL) were added, and the mixture was stirred gently and then incubated for 1 hour. After washing 3 times with T-PBS, 100 μL of a POD-labeled anti-mouse IgG goat antibody 100 μL diluted 1000-fold was added and incubated for 1 hour. After washing 3 times with T-PBS, a substrate solution (containing 0.1 M sodium citrate buffer (pH 4.0), 0.3 mg / mL ABTS, and 0.003% H 2 O 2 ) is added. Then, the absorbance (405 nm) after 15 minutes was measured with a microplate reader.

２−２ ラット血中におけるＤ−アミノ酸動態解析
２−２−１ ラット血中へのＤ−アミノ酸投与
７週齢のウィスターラット（オス、ＳＰＦ）をペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内投与して麻酔した後、咽頭部より切開を行い左右頸動脈を露出させた。１ｍＬのシリンジ（２６Ｇの注射針を使用）を用いて右頸静脈から１ｍｍｏｌ／ｋｇ体重（１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））のＤ−Ａｓｐを添加した。１、３、５、１０、２０、３０分後に左頚静脈から１ｍＬのシリンジ（２６Ｇの注射針を使用）を用いて順次採血した。得られた血液を１時間室温で放置した後、４°Ｃ下で１０分、５０００ｇで遠心分離して血清を得た。血清は使用まで−２０°Ｃで保存した。 2-2 Analysis of D-amino acid kinetics in rat blood 2-2-1 Administration of D-amino acid into rat blood A 7-week-old Wistar rat (male, SPF) was intraperitoneally administered with pentobarbital 50 mg / kg body weight. After anesthesia, an incision was made from the pharynx to expose the left and right carotid arteries. Using a 1 mL syringe (using a 26 G needle), 1 mmol / kg body weight (1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0)) of D-Asp was added from the right jugular vein. After 1, 3, 5, 10, 20, and 30 minutes, blood was sequentially collected from the left jugular vein using a 1 mL syringe (using a 26 G injection needle). The obtained blood was allowed to stand at room temperature for 1 hour and then centrifuged at 5000 g for 10 minutes at 4 ° C. to obtain serum. Serum was stored at −20 ° C. until use.

２−２−２ ＯＰＡ蛍光誘導体化ＨＰＬＣによるＤ−アミノ酸分析
２−２−１で得た血清２０μＬに４００μＬのＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード、和光純薬）を添加し、ボルテックスミキサーを用いて１分間撹拌した後、５０００ｇで５分間遠心分離した。上清１０μＬを４０°Ｃで減圧乾固し、０．４Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を４０μＬ添加して再溶解させた。ここにＯＰＡ試薬（１％ＯＰＡ、１％Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓのメタノール溶液（ｗ／ｗ／ｖ））を１０μＬ添加して撹拌した後、室温で２分間反応させたもの５μＬを次に示すＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ＱＡ（２５０ｍｍ ｘ ４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、４０°Ｃ、東ソー）、移動相：Ａ；９％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ／０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｂ；１６％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ／０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、勾配：時間；０分〜２４．５分、Ａ；１００％〜３０％、Ｂ；０％〜７０％、流速：１．４ｍＬ／分、検出：蛍光検出；励起３４４ｎｍ、発光４４３ｎｍ。 2-2-2 D-amino acid analysis by OPA fluorescence derivatization HPLC 400 μL of MeOH (HPLC grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 20 μL of the serum obtained in 2-2-1 and stirred for 1 minute using a vortex mixer. Thereafter, it was centrifuged at 5000 g for 5 minutes. 10 μL of the supernatant was dried under reduced pressure at 40 ° C., and 40 μL of 0.4 M sodium borate buffer (pH 9.0) was added and redissolved. 10 μL of OPA reagent (1% OPA, 1% Boc-L-Cys in methanol (w / w / v)) was added and stirred, and then reacted at room temperature for 2 minutes. Analyzed with The HPLC conditions are as follows. Column: TSK-gel ODS-80Ts QA (250 mm x 4.6 mm id, 40 ° C, Tosoh), mobile phase: A; 9% (v / v) MeCN / 0.1 M sodium acetate buffer (pH 6) 0.0), B; 16% (v / v) MeCN / 0.1M sodium acetate buffer (pH 6.0), gradient: time; 0 minutes to 24.5 minutes, A; 100% to 30%, B; 0% to 70%, flow rate: 1.4 mL / min, detection: fluorescence detection; excitation 344 nm, emission 443 nm.

結果及び考察
２−３ 遊離Ｄ−アミノ酸に対する競合ＥＬＩＳＡ法
Ｄ−アミノ酸の迅速測定法の一例として、実施例１で作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法について検討を行った。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体を結合させたプレートに試料と抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体とを加え、抗体の競合的なプレートへの結合を指標にＤ−Ａｓｐ定量を試みた。 Results and Discussion 2-3 Competitive ELISA Method for Free D-Amino Acid As an example of a rapid measurement method for D-amino acid, an ELISA method using the anti-D-Asp monoclonal antibody prepared in Example 1 was examined. The sample and the anti-D-Asp monoclonal antibody were added to the plate to which the (D-Asp) -GA-OVA complex was bound, and D-Asp quantification was attempted using the binding of the antibody to the competitive plate as an index.

図９に示した手順に従い測定した結果、Ｄ−Ａｓｐの添加濃度依存的な抗体結合量減少が認められた。一方でＬ−Ａｓｐをはじめとするタンパク構成アミノ酸及びそのＤ−体を用いて同様の検討を行った結果、添加に伴う吸光度変化はほとんど認められなかった。   As a result of measurement according to the procedure shown in FIG. 9, a decrease in the amount of antibody binding dependent on the addition concentration of D-Asp was observed. On the other hand, as a result of conducting the same investigation using protein-constituting amino acids including L-Asp and its D-form, almost no change in absorbance due to addition was observed.

また、Ｄ−Ａｓｐはタンパク質中にアミノ酸残基としても存在するため、生体試料中のＤ−Ａｓｐ分析に際しては抗体のタンパク中Ｄ−Ａｓｐ残基に対する反応性の検討は重要であると考えられた。そこでモデルペプチドとしてＧｌｙ−（Ｄ−Ａｓｐ）を用い、遊離Ｄ−Ａｓｐ測定に与える影響を競合ＥＬＩＳＡ法により検討した。その結果、Ｇｌｙ−（Ｄ−Ａｓｐ）の添加に伴う吸光度変化はほとんど認められなかったことから、Ｇｌｙ−Ｄ−ＡｓｐはＤ−Ａｓｐ測定に影響を与えないことが示された。以上の結果から作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体を用いる競合ＥＬＩＳＡ法により、遊離Ｄ−Ａｓｐの選択的定量が可能であると考えられた。     In addition, since D-Asp is also present as an amino acid residue in a protein, it is considered that examination of the reactivity of the antibody to the D-Asp residue in the protein is important when analyzing D-Asp in a biological sample. . Therefore, Gly- (D-Asp) was used as a model peptide, and the influence on free D-Asp measurement was examined by a competitive ELISA method. As a result, almost no change in absorbance due to the addition of Gly- (D-Asp) was observed, indicating that Gly-D-Asp does not affect D-Asp measurement. From the above results, it was considered that selective quantification of free D-Asp was possible by competitive ELISA using an anti-D-Asp monoclonal antibody prepared.

２−４ ラット血中におけるＤ−アミノ酸動態解析
２−４−１ 血中Ｄ−アミノ酸の定量可能性評価
次に生体試料中における本法の適用性を評価するため、ウィスター系ラット（オス、７週齢、ＳＰＦ）から得た血清に濃度既知のＤ−Ａｓｐを添加し、検量線を作製した。その結果、図１０（ａ）に示すように０．０１６−１６ｍＭの範囲においてＤ−Ａｓｐ濃度依存的な吸光度減少が認められ、本範囲においてラット血中Ｄ−Ａｓｐの定量が可能であることが示された。 2-4 Analysis of D-amino acid kinetics in rat blood 2-4-1 Quantitative evaluation of blood D-amino acid Next, in order to evaluate the applicability of this method in biological samples, Wistar rats (male, 7 A calibration curve was prepared by adding D-Asp of known concentration to the serum obtained from (week-old, SPF). As a result, as shown in FIG. 10 (a), a D-Asp concentration-dependent decrease in absorbance was observed in the range of 0.016 to 16 mM, and in this range, D-Asp in rat blood could be quantified. Indicated.

また本測定法の再現性をＤ−Ａｓｐ含有血清（１ｍｍｏｌ／ｋｇ体重のＤ−Ａｓｐをラット静脈内に投与した後、３０分後に得られた血清）を用いてプレート内、及びプレート間について評価した。その結果、プレート内誤差がＲＳＤにして４．８％（５ウェル）、プレート間誤差が４．５％（４プレート）であり、本測定法はラット血清中Ｄ−Ａｓｐを再現的に測定可能であることが明らかになった（図１０（ｂ））。   In addition, the reproducibility of this measurement method was evaluated within and between plates using D-Asp-containing serum (serum obtained 30 minutes after administration of 1 mmol / kg body weight of D-Asp into a rat vein). did. As a result, the in-plate error was 4.8% (5 wells) in terms of RSD, and the inter-plate error was 4.5% (4 plates). This measurement method can reproducibly measure D-Asp in rat serum. (FIG. 10 (b)).

次に、定量の正確性を当研究室で開発したＯＰＡ誘導体化蛍光ＨＰＬＣ法との比較により評価した。ｘ軸にＥＬＩＳＡ法、ｙ軸にＨＰＬＣ法の定量値をプロットした結果、図１１に示す様に回帰直線はｙ＝１．０９ｘ＋０．４４であり、相関係数ｒ＝０．９６３の良好な相関関係が得られた。以上の結果より今回開発した競合ＥＬＩＳＡ法は、ラット血清中Ｄ−Ａｓｐを正確かつ再現的に定量可能であることが示された。さらに、本法は得られた血清をそのまま用いることで煩雑な前処理を必要とせず、測定時間が約２時間半であることから、簡便性と迅速性を兼ね備えた分析法であると考えられる。   Next, the accuracy of quantification was evaluated by comparison with the OPA derivatized fluorescent HPLC method developed in our laboratory. As a result of plotting the quantitative value of the ELISA method on the x-axis and the HPLC method on the y-axis, the regression line is y = 1.09x + 0.44 as shown in FIG. 11, and a good correlation with a correlation coefficient r = 0.963 is obtained. A relationship was obtained. From the above results, it was shown that the competitive ELISA method developed this time can accurately and reproducibly determine D-Asp in rat serum. Furthermore, since this method uses the obtained serum as it is and does not require complicated pretreatment, and the measurement time is about 2.5 hours, it is considered to be an analytical method having both simplicity and speed. .

２−４−２ ラット血中のＤ−アミノ酸動態解析
開発した競合ＥＬＩＳＡ法を用いてＤ−Ａｓｐ投与ラットにおける血中濃度の経時変化を解析した。ラットの右頸静脈へＤ−Ａｓｐを投与し、１、３、５、１０、２０、３０分後にそれぞれ左頸動脈より血液を採取し、Ｄ−Ａｓｐの濃度を図９に示す競合ＥＬＩＳＡ法により測定した。図１２にＤ−Ａｓｐ血中濃度の経時変化を示す。Ｄ−Ａｓｐ濃度は投与１分後に最高値９．３±２．８μｍｏｌ／ｍＬ（ｎ＝３）に達した後、二相性の減少過程を経て３０分後に１．７±０．２７μｍｏｌ／ｍＬまで減少した。またＨＰＬＣ法を用いて同試料を分析した結果、ほぼ同じ体内動態が得られたことから、開発したＥＬＩＳＡ法はラット血中Ｄ−Ａｓｐ体内動態解析に十分適用可能であると考えられた。 2-4-2 Analysis of D-amino acid dynamics in rat blood Using the developed competitive ELISA method, changes in blood concentration over time in D-Asp-administered rats were analyzed. D-Asp was administered to the right jugular vein of the rat, blood was collected from the left carotid artery after 1, 3, 5, 10, 20, and 30 minutes, respectively, and the concentration of D-Asp was determined by a competitive ELISA method shown in FIG. It was measured. FIG. 12 shows the time course of D-Asp blood concentration. The D-Asp concentration reached a maximum value of 9.3 ± 2.8 μmol / mL (n = 3) 1 minute after administration, and then passed through a biphasic decrease process until 1.7 ± 0.27 μmol / mL 30 minutes later. Diminished. Moreover, as a result of analyzing the same sample using the HPLC method, almost the same pharmacokinetics were obtained. Therefore, the developed ELISA method was considered to be sufficiently applicable to analysis of D-Asp pharmacokinetics in rat blood.

今回開発したＥＬＩＳＡ法は、ラット血清中Ｄ−Ａｓｐを０．０１６−１６ｍＭの範囲において正確かつ再現的に定量可能である。さらに試料の前処理を必要とせず、約２時間半で数百個の検体を処理可能であり、迅速性と簡便性を兼ね備えた方法であると考えられる。これらのことより、本法は様々な疾患や生理条件下における多試料解析に大きく貢献できると考えられる。   The ELISA method developed this time can accurately and reproducibly quantify D-Asp in rat serum in the range of 0.016 to 16 mM. Furthermore, pretreatment of the sample is not required, and several hundred specimens can be processed in about two and a half hours, which is considered to be a method having both speed and simplicity. From these facts, it is considered that this method can greatly contribute to multi-sample analysis under various diseases and physiological conditions.

本実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を利用するＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法について示す。   This example shows an immunological analysis method for D-amino acids using the surface plasmon resonance (SPR) method.

材料及び方法
３−１ 直接法による定量性検討
３−１−１ プレコンセントレーション条件の決定
プレコンセントレーション効果の測定は、未使用のＳｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン、２５°Ｃ）を用いて行った。Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＣＭ５をＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に挿入し、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，５．０，４．０）溶液（２０μｇ／ｍＬ）各５μＬをインジェクトした時のセンサーグラム変化量をモニターした。なお、ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を用い、流速５μＬ／分で行った。 Materials and Methods 3-1 Quantitative Examination by Direct Method 3-1-1 Determination of Preconcentration Conditions Measurement of the preconcentration effect was performed using unused Sensor chip CM5 (BIAcore, Uppsala, Sweden, 25 ° C.). I went. Sensor chip CM5 was inserted into BIAcore X (BIAcore, Uppsala, Sweden), and 5 μL each of 10 mM sodium acetate buffer solution (pH 6.0, 5.0, 4.0) (20 μg / mL) of anti-D-Asp monoclonal antibody. The amount of change in sensorgram when injecting was monitored. The running buffer was HBS-EP (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20), and the flow rate was 5 μL / min.

３−１−２ アミンカップリング法による抗体固定化
Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＣＭ５への抗体の固定化はアミンカップリングキット（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて行った。固定化方法の概略を図１３に示す。０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）水溶液と０．２５Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）水溶液の等量混合物５０μＬを送液し、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化した。次いで１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体（１００μｇ／ｍＬ）５０μＬを送液し、センサーチップ上に固定した。残存活性化エステルは１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）５０μＬを添加することで不活性化した。対照セルにはピュアマウスＩｇＧ（ＩＣＮファーマケミカルズ、米国 オハイオ州 オーロラ）を同様の方法にて固定化した。 3-1-2 Antibody Immobilization by Amine Coupling Method Immobilization of the antibody on Sensor chip CM5 was performed using an amine coupling kit (BIAcore, Uppsala, Sweden). An outline of the immobilization method is shown in FIG. 50 μL of an equal amount mixture of 0.05 M N-hydroxysuccinimide (NHS) aqueous solution and 0.25 M 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) aqueous solution is fed on the sensor chip The carboxyl group of was activated. Next, 50 μL of anti-D-Asp monoclonal antibody (100 μg / mL) dissolved in 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) was fed and immobilized on the sensor chip. The remaining activated ester was inactivated by adding 50 μL of 1M ethanolamine-HCl solution (pH 8.5). In a control cell, pure mouse IgG (ICN Pharma Chemicals, Aurora, Ohio, USA) was immobilized in the same manner.

３−１−３ Ｄ−Ａｓｐの定量
３−１−２で抗体を固定化したセンサーチップを用いてＤ−Ａｓｐの測定を行った。２０×（１／２）ｎｍＭ（ｎ＝０−５）のＤ−Ａｓｐ又はＬ−Ａｓｐ／ＨＥＰＥＳ溶液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）２０μＬを添加した時のセンサーグラムの変化をモニターした。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰを用い、流速２０μＬ／分、２５°Ｃで測定した。なお、抗体の固定化量の差を補正して評価した。（対照セルの共鳴角変化値を固定化量の比（１８：５／１２．４）で除した値で補正した。）
３−２ 間接法による定量性検討
３−２−１ アミノ基導入型Ｄ−アミノ酸複合体の調製
間接法による定量性検討に供試するためのアミノ基導入型（Ｄ−アミノ酸）−グルタルアルデヒド架橋−卵白アルブミン複合体（以下、「（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）」という。）を以下のように作製した。作製方法の概略を図１６に示す。２０ｍＬの遮光硝子バイアルにＯＶＡ１２ｍｇを秤量し、６２．５ｍＭ Ｄ−Ａｓｐ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．６ｍＬに溶解させた。５０ｍＭヒドラジン水溶液０．２ｍＬ及び２．５％グルタルアルデヒド水溶液０．２ｍＬを添加し、１時間撹拌した。次いで１６ｍｇ／ｍＬ ＮａＢＨ４水溶液０．５ｍＬを添加して１時間撹拌した。反応液を透析膜（ＷＭＣＯ３，５００）に入れて４°Ｃで水に対して透析し、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）を得た。アミノ基導入型グルタルアルデヒド卵白アルブミン複合体（以下、「ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）」という。）は、Ｄ−Ａｓｐ非含有緩衝液を用いて同様に調製した。 3-1-3 Quantification of D-Asp D-Asp was measured using a sensor chip to which an antibody was immobilized in 3-1-2. 20 × (1/2) n mM (n = 0-5) D-Asp or L-Asp / HEPES solution (0.1 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% interface) The change in sensorgram when 20 μL of activator P20) was added was monitored. The running buffer was HBS-EP, and measurement was performed at a flow rate of 20 μL / min and 25 ° C. The evaluation was performed by correcting the difference in the amount of antibody immobilized. (It was corrected by the value obtained by dividing the resonance angle change value of the control cell by the ratio of the immobilized amount (18: 5 / 12.4).)
3-2 Quantitative Examination by Indirect Method 3-2-1 Preparation of Amino Group-Introduced D-Amino Acid Complex Amino Group-Introduced Type (D-Amino Acid) -Glutaraldehyde Cross-Link for Testing for Quantitative Examination by Indirect Method - ovalbumin conjugate (. hereinafter, "(D-AA) -GA-OVA conjugate (+ NH 2)" hereinafter) was prepared as follows. An outline of the manufacturing method is shown in FIG. In a 20 mL light-shielding glass vial, 12 mg of OVA was weighed and dissolved in 1.6 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 62.5 mM D-Asp. 0.2 mL of 50 mM hydrazine aqueous solution and 0.2 mL of 2.5% glutaraldehyde aqueous solution were added and stirred for 1 hour. Next, 0.5 mL of 16 mg / mL NaBH 4 aqueous solution was added and stirred for 1 hour. The reaction solution was put in a dialysis membrane (WMCO3,500) and dialyzed against water at 4 ° C. to obtain a (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ). An amino group-introduced glutaraldehyde ovalbumin complex (hereinafter referred to as “GA-OVA complex (+ NH 2 )”) was similarly prepared using a D-Asp-free buffer.

３−２−２ 抗原濃度の測定
作製した（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）、ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ試薬（ナカライテスク）を用いて、ＢＳＡを用いて作成した検量線を使用して定量した。前記複合体溶液又はＢＳＡ溶液１０μＬをＥＬＩＳＡプレートに添加した後、水で５倍希釈したＣＢＢ試薬２００μＬを加え、１０分間撹拌した後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、濃度を求めた。 3-2-2 Measurement of antigen concentration The concentration of the prepared (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) and GA-OVA complex (+ NH 2 ) was determined using protein assay CBB reagent (Nacalai Tesque). Quantification was performed using a calibration curve prepared using BSA. After adding 10 μL of the complex solution or BSA solution to the ELISA plate, 200 μL of CBB reagent diluted 5-fold with water was added, and the absorbance at 595 nm after stirring for 10 minutes was measured with a microplate reader to determine the concentration.

３−２−３ プレコンセントレーション条件の決定
未使用のＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（２５°Ｃ）をＢＩＡｃｏｒｅ Ｘに挿入し、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、５．０、４．５、４．０）溶液（２０μｇ／ｍＬ）各５μＬをインジェクトした時のセンサーグラム変化量をモニターした。なお、ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ、流速５μＬ／分で測定を行った。 3-2-3 Determination of preconcentration conditions Unused Sensor Chip CM5 (25 ° C) was inserted into BIAcore X, and (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) in 10 mM sodium acetate buffer (PH 6.0, 5.0, 4.5, 4.0) Solution (20 μg / mL) The amount of change in sensorgram when 5 μL of each was injected was monitored. The running buffer was HBS-EP, and the flow rate was 5 μL / min.

３−２−４ アミンカップリング法による抗原固定化
アミンカップリングキットを用いて３−２−１で作製した抗原の固定化を行った。０．０５Ｍ ＮＨＳ水溶液と０．２５Ｍ ＥＤＣ水溶液の等量混合物３５μＬを送液し、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化した。次いで１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解したＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）（２０μｇ／ｍＬ）３５μＬを送液し、センサーチップ上に固定した。残存活性化エステルは１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）３５μＬを添加して不活性化した。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）はＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の結合量と同等になるように固定化した。５０μＬのＮＨＳ／ＥＤＣ溶液を送液しセンサーチップを活性化した後、２０μｇ／ｍＬの（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）／１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を、センサーグラムをモニターしながら７０μＬ送液した。次いでエタノールアミン溶液５０μＬを添加して活性化エステルを不活化した。なお、ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰを用い、流速５μＬ／分、２５°Ｃで行った。 3-2-4 Antigen immobilization by amine coupling method The antigen produced in 3-2-1 was immobilized using an amine coupling kit. 35 μL of an equimolar mixture of 0.05 M NHS aqueous solution and 0.25 M EDC aqueous solution was fed to activate the carboxyl groups on the sensor chip. Next, 35 μL of GA-OVA complex (+ NH 2 ) (20 μg / mL) dissolved in 10 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) was fed and immobilized on the sensor chip. The remaining activated ester was inactivated by adding 35 μL of 1M ethanolamine-HCl solution (pH 8.5). The (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) was immobilized so as to be equivalent to the binding amount of the GA-OVA complex (+ NH 2 ). After feeding 50 μL of NHS / EDC solution to activate the sensor chip, 20 μg / mL of (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) / 10 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) was added. While monitoring the sensorgram, 70 μL of the solution was fed. Next, 50 μL of ethanolamine solution was added to inactivate the activated ester. The running buffer was HBS-EP, and the flow rate was 5 μL / min at 25 ° C.

３−２−５ Ｄ−Ａｓｐの競合ＳＰＲ測定
３−２−４で（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）を固定化したセンサーチップを用いて競合法によるＤ−Ａｓｐの測定を行った。２０×（１／２）ｎｍＭ（ｎ＝０−５）のＤ−Ａｓｐ又はＬ−Ａｓｐ／ＨＥＰＥＳ溶液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）と１０μｇ／ｍＬ抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体のＨＥＰＥＳ溶液を１：１の割合で混合し、このうち２０μＬを測定した。測定後、結合した抗体は１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１．５）を１０μＬ添加することにより解離させチップを再生した。なお、測定はランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰを用い、流速２０μＬ／分、２５°Ｃで行った。 3-2-5 Competitive SPR measurement of D-Asp Measurement of D-Asp by the competition method using a sensor chip in which (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) is immobilized in 3-2-4 Went. 20 × (1/2) n mM (n = 0-5) D-Asp or L-Asp / HEPES solution (0.1 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% interface) Activator P20) and a HEPES solution of 10 μg / mL anti-D-Asp monoclonal antibody were mixed at a ratio of 1: 1, and 20 μL of this was measured. After the measurement, the bound antibody was dissociated by adding 10 μL of 10 mM glycine-HCl buffer (pH 1.5) to regenerate the chip. The measurement was performed using a running buffer HBS-EP at a flow rate of 20 μL / min and 25 ° C.

結果及び考察
３−３ 直接法による定量性検討
３−３−１ プレコンセントレーション条件の決定
実施例１で作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体を用いて、直接法による遊離Ｄ−Ａｓｐの濃度測定を試みた。センサーチップへの抗体固定化に先立ち、抗Ｄ−Ａｓｐ抗体のプレコンセントレーション条件として、固定化時に使用する緩衝液のｐＨを決定した。本実験では、ｐＨ６．０、５．０、４．０の１０ｍＭ酢酸塩緩衝液を用いて検討した。その結果、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体はｐＨ５．０と４．０で同様の濃縮効果が認められたことから、よりカップリング反応が進行しやすいｐＨ５．０を採用した。 Results and Discussion 3-3 Quantitative Examination by Direct Method 3-3-1 Determination of Preconcentration Conditions Using the anti-D-Asp monoclonal antibody prepared in Example 1, the concentration of free D-Asp by direct method was measured. Tried. Prior to antibody immobilization on the sensor chip, the pH of the buffer used for immobilization was determined as preconcentration conditions for the anti-D-Asp antibody. In this experiment, a 10 mM acetate buffer solution having pH 6.0, 5.0, and 4.0 was used. As a result, the anti-D-Asp monoclonal antibody was observed to have the same concentration effect at pH 5.0 and 4.0, and thus pH 5.0 that facilitates the coupling reaction was adopted.

３−３−２ アミンカップリング法による抗体固定化
図１４に抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体及びマウスＩｇＧの固定化にかかるセンサーグラムを示す。抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体は１２．４ｎｇ／ｍｍ２の結合が認められ、対照であるマウスＩｇＧは１８．５ｎｇ／ｍｍ２の結合が認められた（１０００ＲＵ＝１ｎｇ／ｍｍ２）。 3-3-2 Antibody Immobilization by Amine Coupling Method FIG. 14 shows a sensorgram for immobilization of anti-D-Asp monoclonal antibody and mouse IgG. Anti D-Asp monoclonal antibodies observed binding of 12.4 ng / mm 2, mouse IgG in contrast was observed binding of 18.5ng / mm 2 (1000RU = 1ng / mm 2).

３−３−３ 直接法による遊離Ｄ−Ａｓｐの測定
抗Ｄ−Ａｓｐ抗体を固定化させたチップを用いて、直接法によるＤ−Ａｓｐの定量性を検討した。ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて作製したＤ−Ａｓｐの希釈系列を順次インジェクトし、センサーグラムのレスポンスを測定した。但し、マウスＩｇＧの固定化量は抗Ｄ−Ａｓｐ抗体の１．５倍であることから（図１４）、得られたレスポンスは固定化量で補正し、Ｄ−Ａｓｐに対する応答を評価した。図１５はＡｓｐ溶液添加時に得られたレスポンス変化を示したものである。その結果、Ｄ−Ａｓｐ、Ｌ−Ａｓｐ共に添加濃度増加に伴うレスポンス上昇が認められた。抗体の固定化量及びＤ−Ａｓｐの分子量から算出した最大応答量は約１１と推測されるが、本検討ではこれを遙かに超えるレスポンス変化が認められたことから、Ａｓｐがセンサーチップに対して非特異的に吸着する、チップ上でクラスター分子を形成している等、他の要因によるレスポンス上昇が生じていると考えられた。以上の結果より、直接法を用いるＤ−Ａｓｐ測定は困難であると考え間接法の適用を試みた。 3-3-3 Measurement of free D-Asp by direct method Using a chip on which an anti-D-Asp antibody was immobilized, the quantitative property of D-Asp by the direct method was examined. A dilution series of D-Asp produced using HEPES buffer was sequentially injected, and the response of the sensorgram was measured. However, since the immobilized amount of mouse IgG was 1.5 times that of the anti-D-Asp antibody (FIG. 14), the obtained response was corrected by the immobilized amount, and the response to D-Asp was evaluated. FIG. 15 shows the response change obtained when the Asp solution was added. As a result, both D-Asp and L-Asp were found to increase in response as the concentration added was increased. Although the maximum response amount calculated from the amount of immobilized antibody and the molecular weight of D-Asp is estimated to be about 11, in this study, a response change far exceeding this was observed. It was thought that the response increased due to other factors such as nonspecific adsorption and formation of cluster molecules on the chip. From the above results, it was considered difficult to measure D-Asp using the direct method, and an indirect method was applied.

３−４ 間接法による定量性検討
３−４−１ アミノ基導入型Ｄ−アミノ酸複合体の調製
図１６に示すようにＧＡ添加時にヒドラジン（ＮＨ２ＮＨ２）を共存させて、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）を作製した。この修飾により抗原のアミンカップリング法によるセンサーチップへの固定が容易になると考えられる。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）と対照として作製したＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）との抗原性はＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。その結果、抗Ｄ−Ａｓｐ抗体が（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）のみに選択的に結合することを確認した。 3-4 Quantitative Examination by Indirect Method 3-4-1 Preparation of Amino Group-Introduced D-Amino Acid Complex As shown in FIG. 16, hydrazine (NH 2 NH 2 ) coexists at the time of GA addition, and (D-Asp ) -GA-OVA conjugate (+ NH 2) was prepared. This modification is considered to facilitate the fixation of the antigen to the sensor chip by the amine coupling method. Antigenicity of (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) and GA-OVA complex (+ NH 2 ) prepared as a control was examined using ELISA. As a result, it was confirmed that the anti-D-Asp antibody selectively binds only to the (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ).

３−４−２ プレコンセントレーション条件の決定
センサーチップへの固定化に先立ち、ｐＨ６．０、５．０、４．５、４．０の１０ｍＭ酢酸塩緩衝液を用いて（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）のプレコンセントレーション条件として、固定時に使用する緩衝液のｐＨを決定した。その結果、ｐＨの減少に伴う（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の濃縮量増加が認められ、最大の濃縮が認められたｐＨ４．０を採用した。 3-4-2 Determination of preconcentration conditions Prior to immobilization on a sensor chip, using a 10 mM acetate buffer solution of pH 6.0, 5.0, 4.5, 4.0 (D-Asp) − As preconcentration conditions for the GA-OVA complex (+ NH 2 ), the pH of the buffer used at the time of fixation was determined. As a result, an increase in the concentrated amount of (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) accompanying a decrease in pH was observed, and pH 4.0 where maximum concentration was observed was adopted.

３−４−３ アミンカップリング法による抗体固定化
図１７に（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）及びＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の固定化にかかるセンサーグラムを示す。（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の固定化量は４．９３ｎｇ／ｍｍ２、対照であるＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の固定化量は４．９８ｎｇ／ｍｍ２となり同程度の結合が認められた。 3-4-3 Antibody Immobilization by Amine Coupling Method FIG. 17 shows sensorgrams for immobilization of (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) and GA-OVA complex (+ NH 2 ). . The immobilization amount of (D-Asp) -GA-OVA complex (+ NH 2 ) was 4.93 ng / mm 2 , and the immobilization amount of GA-OVA complex (+ NH 2 ) as a control was 4.98 ng / mm 2. The same degree of binding was observed.

３−４−４ Ｄ−Ａｓｐの競合ＳＰＲ測定
競合ＳＰＲ測定のセンサーグラムのレスポンス変化を図１８に示す。Ｄ−Ａｓｐの濃度上昇に伴いセンサーグラム上の応答減少が認められた。一方、Ｌ−Ａｓｐを用いて同様に検討した結果、センサーグラムの変化はほとんど認められなかった。試料添加前後のレスポンス変化量を、Ａｓｐ無添加時を０としてグラフ化した結果、図１９に示すようにＤ−Ａｓｐ添加濃度依存的なレスポンス変化が認められ、Ｌ−Ａｓｐを添加した場合においてはほとんど認められなかった。さらにＧｌｙを用いて同様の検討を行った結果、Ｌ−Ａｓｐと同様に変化は認められなかった。レスポンス変化はＤ−Ａｓｐ濃度０．０２−５ｍＭの範囲において認められたことから、本範囲においてＤ−Ａｓｐの定量が可能であると考えられる。さらに今回の測定時間は２分以内であることから、本法は迅速分析法として有用であると考えられる。 3-4-4 Competitive SPR Measurement of D-Asp FIG. 18 shows the response change of the sensorgram of the competitive SPR measurement. A decrease in response on the sensorgram was observed with an increase in the concentration of D-Asp. On the other hand, as a result of examining similarly using L-Asp, the change of the sensorgram was hardly recognized. As a result of graphing the amount of change in response before and after addition of the sample as 0 when Asp was not added, a change in response dependent on D-Asp addition concentration was observed as shown in FIG. 19, and when L-Asp was added, Almost not recognized. Furthermore, as a result of conducting the same examination using Gly, no change was observed as in L-Asp. Since the change in response was observed in the D-Asp concentration range of 0.02 to 5 mM, it is considered that D-Asp can be quantified in this range. Furthermore, since this measurement time is within 2 minutes, this method is considered to be useful as a rapid analysis method.

実施例１における、（Ｄ−ＡＡ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体の作製方法を示すフローチャート。The flowchart which shows the preparation methods of the (D-AA) -GA-BSA complex in Example 1. 実施例１において測定した、ＢＳＡ、ＢＳＡ−ＧＡ、（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体のマス・スペクトルを示すグラフ。The graph which shows the mass spectrum of BSA, BSA-GA, and (D-Asp) -GA-BSA complex measured in Example 1. 実施例１において測定した、ＢＳＡ、ＢＳＡ−ＧＡ、（Ｄ−Ｌｅｕ）−ＧＡ−ＢＳＡ複合体のマス・スペクトルを示すグラフ。The graph which shows the mass spectrum of BSA, BSA-GA, and (D-Leu) -GA-BSA complex measured in Example 1. FIG. 実施例１における、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の作製方法を示す概略図。1 is a schematic diagram showing a method for producing an anti-D-Asp monoclonal antibody in Example 1. FIG. 実施例１における、構造類似アミノ酸に対する抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体産生細胞株（６系統）の選択性の評価を示すグラフ。The graph which shows the evaluation of the selectivity of the anti- D-Leu monoclonal antibody production cell line (six lines) with respect to a structurally similar amino acid in Example 1. FIG. 実施例１において作製した抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の交叉反応性の評価のための直接ＥＬＩＳＡ法の手順を示すフローチャート。The flowchart which shows the procedure of the direct ELISA method for evaluation of the cross-reactivity of the anti- D-Asp monoclonal antibody produced in Example 1. FIG. 実施例１における、ＯＶＡ複合体アミノ酸に対する抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体の免疫反応性の評価を示すグラフ。The graph which shows evaluation of the immunoreactivity of the anti- D-Asp monoclonal antibody with respect to an OVA complex amino acid in Example 1. FIG. 実施例１における、ＯＶＡ複合体アミノ酸に対する抗Ｄ−Ｌｅｕモノクローナル抗体の免疫反応性の評価を示すグラフ。The graph which shows evaluation of the immunoreactivity of the anti- D-Leu monoclonal antibody with respect to an OVA complex amino acid in Example 1. FIG. 実施例２における、遊離Ｄ−Ａｓｐの競合ＥＬＩＳＡ法の手順を示すフローチャート。The flowchart which shows the procedure of the competition ELISA method of free D-Asp in Example 2. FIG. 実施例２において測定した、ラット血清における遊離Ｄ−Ａｓｐの競合ＥＬＩＳＡ法の（ａ）キャリブレーションカーブを示すグラフ、及び（ｂ）プレート間あるいはプレート内精度を表す表。The graph which shows the (a) calibration curve of the competition ELISA method of the free D-Asp in the rat serum measured in Example 2, and (b) The table showing the accuracy between plates or in a plate. 実施例２における、ラット血清における競合ＥＬＩＳＡ法とＯＰＡ誘導体化蛍光ＨＰＬＣ法との相関関係を示すグラフ。The graph which shows the correlation with the competitive ELISA method and OPA derivatization fluorescence HPLC method in rat serum in Example 2. FIG. 実施例２における、Ｄ−Ａｓｐの静脈内投与後のラット血清におけるＤ−Ａｓｐ量の経時変化を示すグラフ。The graph which shows the time-dependent change of the amount of D-Asp in the rat serum after intravenous administration of D-Asp in Example 2. FIG. 実施例３における、抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体のＳＰＲ測定用センサーチップへの固定化方法を示すフローチャート。The flowchart which shows the fixation method to the sensor chip for SPR measurement of the anti- D-Asp monoclonal antibody in Example 3. 実施例３における、（ａ）抗Ｄ−Ａｓｐモノクローナル抗体及び（ｂ）マウス純血ＩｇＧ固定化のセンサーグラム。Sensorgram of Example 3 (a) anti-D-Asp monoclonal antibody and (b) mouse pure blood IgG immobilization. 実施例３における、遊離Ｄ−Ａｓｐ及び遊離Ｌ−Ａｓｐの直接ＳＰＲ測定を示すグラフ。The graph which shows the direct SPR measurement of free D-Asp and free L-Asp in Example 3. 実施例３における、ＳＰＲ測定のための（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）の作製方法を示すフローチャート。In Example 3, a flowchart illustrating a manufacturing method of (D-Asp) -GA-OVA conjugate (+ NH 2) for the SPR measurement. 実施例３における、（ａ）（Ｄ−Ａｓｐ）−ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）及び（ｂ）ＧＡ−ＯＶＡ複合体（＋ＮＨ２）固定化のセンサーグラム。In Example 3, (a) (D- Asp) -GA-OVA conjugate (+ NH 2) and (b) GA-OVA conjugate (+ NH 2) sensorgram immobilization. 実施例３における、競合ＳＰＲ測定のレスポンス変化を示すセンサーグラム。The sensorgram which shows the response change of a competition SPR measurement in Example 3. 実施例３における、遊離Ｄ−Ａｓｐ及び遊離Ｌ−Ａｓｐの競合ＳＰＲ測定を示すグラフ。The graph which shows the competitive SPR measurement of free D-Asp and free L-Asp in Example 3.

Claims (12)

特定の１種類のＤ−アミノ酸のみを抗原として認識し、他の化合物とは交差反応しないことを特徴とする抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体。   An anti-D-amino acid monoclonal antibody characterized by recognizing only one specific type of D-amino acid as an antigen and not cross-reacting with other compounds. 前記特定の１種類のＤ−アミノ酸は、Ｄ−アスパラギン酸又はＤ−ロイシンであることを特徴とする請求項１に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体。   The anti-D-amino acid monoclonal antibody according to claim 1, wherein the specific one type of D-amino acid is D-aspartic acid or D-leucine. 請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を産生することを特徴とする細胞株。   A cell line characterized by producing the anti-D-amino acid monoclonal antibody according to claim 1 or 2. 請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を用いてＤ−アミノ酸を検出・定量することを特徴とするＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。   A method for immunological analysis of D-amino acids, comprising detecting and quantifying D-amino acids using the anti-D-amino acid monoclonal antibody according to claim 1 or 2. 請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体の抗原であるＤ−アミノ酸が固定された固体支持体との反応を、試料中の前記Ｄ−アミノ酸が競合阻害することを利用することを特徴とするＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。   The D-amino acid in the sample competitively inhibits the reaction between the anti-D-amino acid monoclonal antibody according to claim 1 or 2 and the solid support on which the D-amino acid that is the antigen of the monoclonal antibody is immobilized. A method for immunological analysis of D-amino acids, characterized in that 前記抗原であるＤ−アミノ酸はキャリア高分子と結合したＤ−アミノ酸複合体として固体支持体に固定されることを特徴とする請求項５に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。   6. The method for immunological analysis of D-amino acids according to claim 5, wherein the D-amino acid as the antigen is immobilized on a solid support as a D-amino acid complex bound to a carrier polymer. （１）前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、前記Ｄ−アミノ酸複合体が固定された固体支持体と、前記試料とを用意するステップと、（２）前記抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と前記試料との混合溶液を調製するステップと、(３)前記混合溶液を前記固体支持体に接触させるステップと、（４）前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップとを含むことを特徴とする請求項６に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。   (1) providing the anti-D-amino acid monoclonal antibody, a solid support on which the D-amino acid complex is immobilized, and the sample; (2) the anti-D-amino acid monoclonal antibody and the sample; (3) contacting the mixed solution with the solid support, and (4) detecting and quantifying the anti-D-amino acid monoclonal antibody bound to the solid support. The method for immunological analysis of D-amino acids according to claim 6, comprising: 前記固体支持体に結合した抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体を検出・定量するステップは、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法又はラテックス凝集法を利用することを特徴とする請求項７に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。   The step of detecting and quantifying the anti-D-amino acid monoclonal antibody bound to the solid support uses an ELISA method, a surface plasmon resonance method, or a latex agglutination method. Immunological analysis method. 前記モノクローナル抗体の作成の際の免疫原はＤ−アミノ酸とキャリア高分子とが結合したＤ−アミノ酸複合体であり、該免疫原のＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子とは異なることを特徴とする請求項６ないし８のいずれかに記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。   The immunogen for producing the monoclonal antibody is a D-amino acid complex in which a D-amino acid and a carrier polymer are bound, and the carrier polymer of the D-amino acid complex of the immunogen is attached to the solid support. 9. The method for immunological analysis of D-amino acids according to claim 6, wherein the method is different from the carrier polymer of the D-amino acid complex to be immobilized. 前記モノクローナル抗体の作成に用いた動物の免疫に用いたＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子はウシ血清アルブミンであり、前記固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体のキャリア高分子は卵白アルブミンであることを特徴とする請求項９に記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法。   The carrier polymer of the D-amino acid complex used for immunization of the animal used for the production of the monoclonal antibody is bovine serum albumin, and the carrier polymer of the D-amino acid complex immobilized on the solid support is ovalbumin The method for immunological analysis of D-amino acids according to claim 9, wherein: 請求項４ないし１０のいずれかに記載のＤ−アミノ酸の免疫学的分析方法を実行することを特徴とするＤ−アミノ酸の免疫学的分析装置。   11. A D-amino acid immunological analyzer characterized by executing the D-amino acid immunological analysis method according to any one of claims 4 to 10. （１）請求項１又は２に記載の抗Ｄ−アミノ酸モノクローナル抗体と、（２）請求項５ないし１０のいずれかに記載の免疫学的分析方法に用いる固体支持体と、請求項６ないし１０のいずれかに記載の免疫学的分析方法に用いる固体支持体に固定されるＤ−アミノ酸複合体と、請求項８ないし１０のいずれかに記載の免疫学的分析方法に用いる固体支持体を含むＥＬＩＳＡ法用マルチウェルプレート、表面プラズモン共鳴法用センサーチップ又はラテックス凝集法用微粒子とのうち少なくとも１つとを含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の分析用試薬キット。   (1) The anti-D-amino acid monoclonal antibody according to claim 1 or 2, (2) the solid support used in the immunological analysis method according to any of claims 5 to 10, and claims 6 to 10. A D-amino acid complex immobilized on a solid support used in the immunological analysis method according to any one of claims 8 to 10, and a solid support used in the immunological analysis method according to any one of claims 8 to 10. A reagent kit for analyzing D-amino acid, comprising at least one of an ELISA method multiwell plate, a surface plasmon resonance sensor chip, or a latex agglutination method microparticle.
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