JP2009183176A - Il−1タイプiiレセプター遺伝子の欠損変異体マウス - Google Patents
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Abstract
【課題】
IL−1タイプIIレセプターがIL−1リガンドのシグナル伝達に果たす役割を解明するために、IL−1タイプIIレセプター遺伝子が全く発現しない遺伝子欠損変異体動物を作出すること。
【解決手段】
本発明は、マウス染色体上のIL−1タイプIIレセプター遺伝子座に欠失及び/又は挿入変異を有する、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウスを提供する。本発明は、本発明のマウスにマウスIL−1タイプIIレセプタータンパク質を免疫感作して、該レセプタータンパク質に対するモノクローナル抗体を作成するステップ等を含む、アレルギー及び/又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法を提供する。本発明は、試験物質存在下又は非存在下、IL−1タイプIIレセプターか、該レセプターを発現している細胞かにIL−1を作用させるステップ等を含む、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法を提供する。
【選択図】なし
IL−1タイプIIレセプターがIL−1リガンドのシグナル伝達に果たす役割を解明するために、IL−1タイプIIレセプター遺伝子が全く発現しない遺伝子欠損変異体動物を作出すること。
【解決手段】
本発明は、マウス染色体上のIL−1タイプIIレセプター遺伝子座に欠失及び/又は挿入変異を有する、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウスを提供する。本発明は、本発明のマウスにマウスIL−1タイプIIレセプタータンパク質を免疫感作して、該レセプタータンパク質に対するモノクローナル抗体を作成するステップ等を含む、アレルギー及び/又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法を提供する。本発明は、試験物質存在下又は非存在下、IL−1タイプIIレセプターか、該レセプターを発現している細胞かにIL−1を作用させるステップ等を含む、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウスと、該変異体マウスを用いるアレルギー及び/又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法と、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法とに関する。
IL−1は向炎症性のサイトカインで、その産生及び/又は活性を下向き調節する因子は臨床的に重要な創薬ターゲットである。以下の非特許文献1の総説に説明されるとおり、IL−1リガンドのファミリーには、IL−1アルファ、IL−1ベータ及びIL−1レセプターアンタゴニスト(IL−1Ra)という3つのメンバーがあり、IL−1アルファ及びIL−1ベータがアゴニストとして機能し、IL−1Raは特異的なアンタゴニストであることが知られている。一方、IL−1レセプターのファミリーには、IL−1タイプIレセプター(IL−1R I)と、IL−1タイプIIレセプター(IL−1R II)と、IL−1レセプターアクセソリープロテイン(IL−1RAcP)という3つのメンバーがあり、IL−1タイプIレセプターはIL−1リガンドのシグナル伝達に関与するが、IL−1タイプIIレセプターは細胞内ドメインがほとんどなく、IL−1リガンドと結合してもシグナル伝達を行わないと考えられている。IL−1タイプIIレセプターは、タイプIレセプターと複合体を形成することはないが、IL−1レセプターアクセソリープロテインは、IL−1タイプIレセプターともIL−1タイプIIレセプターとも複合体を形成することができる。
Dinarello, C.H., Blood, 87: 2095 - 2147 (1996)
Dinarello, C.H., Blood, 87: 2095 - 2147 (1996)
IL−1タイプIIレセプターは、従来、おとり(decoy)レセプターであって、IL−1タイプIレセプターとIL−lリガンドとの結合を競合的に阻害することによって、IL−1シグナル伝達を調節すると考えられてきた。また、IL−1タイプIIレセプターは、IL−1リガンドと結合すると、IL−1レセプターアクセソリープロテインとも結合して複合体を形成することから、IL−1リガンドだけでなく、IL−1レセプターアクセソリープロテインについても、IL−1タイプIレセプターとの結合を競合的に阻害するものと考えられてきた(非特許文献2)。さらにタイプIIレセプターの細胞外ドメインは、タンパク質分解酵素によって切断されて、可溶性断片として血液循環中に存在する。このタイプIIレセプターの可溶性断片は、レセプターアクセソリープロテインの可溶性断片と会合すると、IL−1アルファ及びベータへの親和性が100倍高くなり、安定な可溶性複合体を形成することも知られている(非特許文献3)。
Lang, D. et al., J. Immunol. 161: 6871 - 6877 (1998) Smith, D. E. et al., Immunity, 18: 87 - 96 (2003)
Lang, D. et al., J. Immunol. 161: 6871 - 6877 (1998) Smith, D. E. et al., Immunity, 18: 87 - 96 (2003)
表1に示すとおり、マウスIL−1リガンド及びレセプターファミリー遺伝子については1984年にIL−1アルファ遺伝子がクローニングされて以来、次々に遺伝子がクローニングされている。そして、クローニングされた遺伝子は、順次、ES細胞への相同遺伝子組換え法により遺伝子欠損マウスが作出されてきた。
表1のうち、本発明の発明者らのグループ(Horaiら、1998年)は、IL−1リガンドファミリー遺伝子の全てについて遺伝子欠損マウスを作出した。すなわち、IL−1アルファ及びIL−1ベータ遺伝子のそれぞれの欠損マウスと、二重欠損マウスとを作出し、さらに、IL−1Ra遺伝子の欠損マウスも作出した(非特許文献4)。
Horai, R. et al., J. Exp. Med., 187: 1463− 75 (1998)
Horai, R. et al., J. Exp. Med., 187: 1463− 75 (1998)
IL−1レセプターファミリー遺伝子の欠損マウスは他のグループによって作出されている。すなわち、IL−1タイプIレセプター(IL−1R I)及びIL−1レセプターアクセソリープロテイン(IL−1RAcP)の遺伝子欠損マウスについては、それぞれ、1997年及び1998年に作出されている。しかし、1991年にIL−1タイプIIレセプター遺伝子がクローニングされているのに、IL−1タイプIIレセプター(IL−1R II)遺伝子の欠損マウスは、世界中のいずれの研究室からも現在に至るまで作出されたという報告がない。
IL−1関連遺伝子の欠損マウスのうち、発明者のグループで作出されたIL−1Ra遺伝子の欠損マウスは、関節炎を始めとする種々の自己免疫性疾患を自然発症することから、極めて有用な疾患モデル動物として利用されている(非特許文献5)。IL−1RaはIL−1リガンドのアンタゴニストで、アゴニストであるIL−1アルファやIL−1ベータの刺激を阻害する。IL−1タイプIIレセプターもIL−1リガンドやIL−1RAcPのおとりレセプターであり、IL−1アルファやIL−1ベータの刺激を阻害すると考えられるので、IL−1タイプIIレセプター遺伝子(Il1r2遺伝子座)の欠損マウスも有用な疾患モデル動物となることが期待される。
Horai, R. et al., J. Exp. Med., 191: 313−320 (2000)
Horai, R. et al., J. Exp. Med., 191: 313−320 (2000)
IL−1タイプIIレセプターがIL−1リガンドのシグナル伝達に果たす役割を解明するためには、IL−1タイプIIレセプター遺伝子が全く発現しない遺伝子欠損変異体動物を作出する必要がある。また、かかる動物個体におけるIL−1リガンド及びレセプターの動態、複合体形成及びシグナル伝達を解析する方法を開発する必要がある。さらに、IL−1タイプIIレセプターを相補することができる物質の候補からIL−1シグナル伝達調節活性を有する物質のスクリーニング方法を開発する必要もある。
本発明は、マウス染色体上のIL−1タイプIIレセプター遺伝子座に欠失及び/又は挿入変異を有する、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウスを提供する。
本発明のIL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウスにおいて、該変異は、完全長IL−1タイプIIレセプタータンパク質の代わりに緑蛍光タンパク質が発現する場合がある。
本発明は、本発明のマウスにマウスIL−1タイプIIレセプタータンパク質を免疫感作して、該レセプタータンパク質に対するモノクローナル抗体を作成するステップと、前記モノクローナル抗体を野生型マウスか野生型マウス由来の免疫細胞かに投与して、IL−1による免疫系への刺激を抑制させるモノクローナル抗体をスクリーニングするステップとを含む、アレルギー及び/又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法を提供する。
本発明は、試験物質存在下又は非存在下、IL−1タイプIIレセプターか、該レセプターを発現している細胞かにIL−1を作用させるステップと、IL−1タイプIIレセプターとIL−1との結合を測定するステップとを含む、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法を提供する。
本明細書において、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウスとは、野生型IL−1タイプIIレセプターを正常に産生することができないような変異体のマウスをいう。IL−1タイプIIレセプターの遺伝子座はマウスの第1番染色体に位置し、約40.5kbにわたる転写産物から9個のエクソンが連結したmRNAが産生され、410個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが翻訳される。
本発明の欠損変異体は、IL−1タイプIIレセプターのポリペプチドが全く産生されない変異体の他、IL−1タイプIIレセプターの野生型遺伝子の少なくとも1つエクソンの少なくとも一部にコード化されるポリペプチドが産生される場合であって、IL−1リガンドの結合、IL−1レセプターアクセソリープロテインとの会合、その他の機能のいずれか又は全てを欠いている変異体を含む。本発明の変異体は、IL−1タイプIIレセプター遺伝子座のうち、いずれのエクソン及び/又はイントロンのいかなる部分について欠失及び/又は挿入が生じていてもかまわない。本発明の変異体マウスには、2本の第1染色体の両方が前記変異を含むホモ接合個体だけでなく、2本の第1染色体のうち一方だけが前記変異を含み、他方は野生型である、ヘテロ接合個体も含む。
本発明の変異体は化学物質、放射線その他のいかなる方法で作出してもかまわない。好ましい本発明の変異体の作出方法は、例えばManipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual(3rd ed., Nagy, A. et al. Cold Spring Harbor Press N.Y., 2003)に詳しく説明される胚性幹細胞(ES細胞)への相同遺伝子組換え法による標的遺伝子への変異導入である。
本発明の1つの実施態様では、緑蛍光タンパク質が産生されるような変異をIL−1タイプIIレセプター遺伝子に導入した。しかし、IL−1タイプIIレセプターのポリペプチドが全く産生されない変異体か、IL−1タイプIIレセプターの野生型遺伝子の少なくとも1つエクソンの少なくとも一部にコード化されるポリペプチドが産生される場合であって、IL−1リガンドの結合、IL−1レセプターアクセソリープロテインとの会合、その他の機能のいずれか又は全てを欠いている変異体かであることを条件として、例えばCreのような配列特異的組換え酵素が認識するloxPのような特異的組換え配列が挿入されたり、RNAiその他遺伝子発現制御に関与するRNAやtRNAの遺伝子が挿入されたり、緑蛍光タンパク質その他の蛍光タンパク質と、ウミシイタケ、ホタル等由来のルシフェラーゼその他の発光タンパク質と、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼその他の酵素反応産物により酵素活性の定量又は局在が可能な酵素と、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ピューロマイシン、ブラストシジンSその他の薬剤に対する耐性を付与する遺伝子産物と、栄養要求性による選択を可能にする遺伝子産物と、IL−1リガンドによるシグナル伝達機構とは明確に区別できる別のシグナル伝達機構に関与するタンパク質とを含むが、これらに限定されないいずれかのタンパク質が産生されたりしてもかまわない。
本発明の1つの実施態様で導入する変異では、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の発現制御機構を用いて緑蛍光タンパク質を発現させることができる。かかる変異体マウスを用いると、緑蛍光タンパク質による蛍光発光を指標としてIL−1タイプIIレセプター遺伝子の発現をモニターすることができる。前記変異体マウスを用いると、さまざまな創薬候補物質からIL−1タイプIIレセプター遺伝子を上向き調節又は下向き調節する物質をハイスループットなやり方でスクリーニングすることができる。本発明のIL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウス個体又はその細胞に創薬候補物質を投与及び/又は発現させるステップを含む、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の発現に影響を与える物質のスクリーニング方法によって選ばれる物質は、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の発現に影響を与えることを通じて、IL−1リガンドの刺激によるシグナル伝達機構を調節することができるので、新規な免疫調節医薬の開発につながる。
また、本発明のIL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウス又はその細胞に創薬候補物質を投与及び/又は発現させることによって、本発明の変異が原因となるIL−1タイプIIレセプターの機能不全を補償するような活性のある物質をスクリーニングすることができる。IL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウス個体又はその細胞に創薬候補物質を投与及び/又は発現させるステップを含む、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の発現に影響を与える物質のスクリーニング方法によって選ばれる物質は、IL−1リガンドの複合体形成に影響を与えることを通じて、IL−1リガンドの刺激によるシグナル伝達機構を調節することができるので、新規な免疫調節医薬の開発につながる。
IL−1リガンドの刺激によるシグナル伝達の下流には、例えば、IL−6、プロコラーゲン、MCP(Monocyte Chemotactic Protein)−1、MIP(Macrophage Inflammatory Protein)−2、PGES(Prostaglandin E synthase)等を含むが、これらに限定されない遺伝子があり、IL−1リガンドによる刺激はこれらの遺伝子の発現の誘導又は亢進につながる。したがって上記の免疫調節医薬の開発において、IL−1リガンドの刺激によるシグナル伝達は、IL−6、プロコラーゲン、MCP−1、MIP−2、PGES等を含むが、これらに限定されない遺伝子の発現量の変化に基づいて定量的に解析することができる。
本明細書において、創薬候補物質とは、新規医薬又はその開発のリード化合物となりうる物質であって、天然物質及び合成物質のいずれでもよく、なんらかの単位構造の化学物質の重合体又は多量体であっても、単量体であってもよく、いかなる化学構造の物質でもかまわない。前記創薬候補物質は、該物質の溶解特性等に応じた薬物伝達システムを用いてマウス個体又はその細胞に投与される場合がある。前記創薬候補物質がウイルス粒子又は核酸であって、マウス細胞内でなんらかの遺伝子の発現の誘導又は阻害を起こす機能を有するものであるときには、ウイルス感染、電気穿孔法、リポソーム法その他の方法で発現させる場合がある。
IL−1リガンドは、膜結合型のIL−1タイプIIレセプター又はその可溶性断片と結合することにより、IL−1タイプレセプターを介したシグナル伝達が阻害されると考えられてきた。しかし、本発明のIL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウスでは、IL−1による刺激が抑制されるという結果が得られた。このことは、IL−1タイプIIレセプターは正常な個体ではIL−1刺激を促進するという、これまで知られていなかった機能を果たしていることを示唆する。したがって、IL−1タイプIIレセプターのIL−1刺激促進機能を抑制する物質を探索することにより、新規なアレルギー及び/又は炎症の治療薬を開発することができる。
前記IL−1タイプIIレセプターのIL−1刺激促進機能を抑制する物質の1つの例は、IL−1タイプIIレセプターに対する抗体である。本発明のIL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損変異体マウスでは、マウスIL−1タイプIIレセプターに対する免疫反応は抑制されないので、マウスIL−1タイプIIレセプタータンパク質に対する抗体を作成することができる。かかる抗体には、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein、Eur.J.Immunol.6:511−519、1976の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。かかる細胞株は上記のとおり免疫された本発明のIL−1タイプIIレセプター欠損マウス由来の脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、さまざまな方法で不死化され、抗体産生能を有する不死化細胞株が調製される。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された本発明のIL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損変異体マウスと同種又は異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって不死化される。当業者に周知のさまざまな融合技術を用いる場合がある。例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それからハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術はHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選択を用いる。通常約1ないし2週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性及び特異性が高いハイブリドーマが好ましい。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異的が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。モノクローナル抗体は前記ハイブリドーマ細胞腹水又は血液から回収される場合がある。汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿及び抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。
本発明で用いられる抗体の抗原結合断片は、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体をそれぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンで分解して得られるFab断片又はF(ab’)2断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なVH及びVL領域のヘテロ2量体を含むFv断片を含む。
本発明で用いられる組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当なほ乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明で用いられるキメラ抗体は、前記本発明の組換え抗体の抗原結合部位がIL−1タイプIIレセプターと特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質である。本発明で用いられるキメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域(VL)に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域(VH)を含む短鎖可変部抗体(scFv)と、ラクダ科(Camelidae、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む)の動物が産生する軽鎖がないIgGのクラスであるラクダ重鎖抗体(HCAb)又はその重鎖可変部ドメイン(VHH)とを含む。本発明の組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
ターゲティングベクター1の構造
図1は、ターゲティングベクター1の構造と、これに対応する野生型染色体DNA及び相同組換え体DNAの構造とを示す模式図である。E2ないしE8はそれぞれ第2ないし第8エクソンの位置を表す。したがって、IL−1タイプIIレセプター遺伝子は図の左から右の向きに転写される。ターゲティングベクター1には、ターゲティングベクター1を取り込んだES細胞を選別するためのマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は1.8kb、その右側の相同領域は11.2kbであった。ハイグロマイシン耐性遺伝子の矢印は、該遺伝子が左から右の向きに転写されることを示す。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記左側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター1では第2エクソンから第5エクソンまでが欠失する。
図1は、ターゲティングベクター1の構造と、これに対応する野生型染色体DNA及び相同組換え体DNAの構造とを示す模式図である。E2ないしE8はそれぞれ第2ないし第8エクソンの位置を表す。したがって、IL−1タイプIIレセプター遺伝子は図の左から右の向きに転写される。ターゲティングベクター1には、ターゲティングベクター1を取り込んだES細胞を選別するためのマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は1.8kb、その右側の相同領域は11.2kbであった。ハイグロマイシン耐性遺伝子の矢印は、該遺伝子が左から右の向きに転写されることを示す。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記左側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター1では第2エクソンから第5エクソンまでが欠失する。
相同組換え体ES細胞の単離
ターゲティングベクター1のトランスフェクションは以下のとおり行った。ES細胞E14.1株1x107個あたり20μgの直鎖化したターゲティングベクター1を500μF、250Vの条件で電気穿孔法でトランスフェクションし、140μg/mLのハイグロマイシンを添加したES細胞用培地で1週間培養して、ターゲティングベクター1を取り込んだES細胞を選択した。なお、ハイグロマイシン耐性遺伝子とジフテリア毒素遺伝子との間の相同領域で染色体DNAとターゲティングベクター1のDNAとの間で相同組換えが起こっていない細胞では、ジフテリア毒素遺伝子が発現して細胞が死滅する場合が多く、結果的にハイグロマイシン耐性のES細胞のコロニーでは相同組換え体の頻度が上昇する。実際、発明者のグループの経験では、選択されたES細胞の1−4%の頻度で相同組換え体クローンが得られる。
ターゲティングベクター1のトランスフェクションは以下のとおり行った。ES細胞E14.1株1x107個あたり20μgの直鎖化したターゲティングベクター1を500μF、250Vの条件で電気穿孔法でトランスフェクションし、140μg/mLのハイグロマイシンを添加したES細胞用培地で1週間培養して、ターゲティングベクター1を取り込んだES細胞を選択した。なお、ハイグロマイシン耐性遺伝子とジフテリア毒素遺伝子との間の相同領域で染色体DNAとターゲティングベクター1のDNAとの間で相同組換えが起こっていない細胞では、ジフテリア毒素遺伝子が発現して細胞が死滅する場合が多く、結果的にハイグロマイシン耐性のES細胞のコロニーでは相同組換え体の頻度が上昇する。実際、発明者のグループの経験では、選択されたES細胞の1−4%の頻度で相同組換え体クローンが得られる。
ターゲティングベクター1を導入したハイグロマイシン耐性のES細胞のクローンを1099個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認したが、相同組換えを起こしていたクローンは1個もなかった。
ターゲティングベクター2の構造
図2は、ターゲティングベクター2の構造と、これに対応する野生型染色体DNA及び相同組換え体DNAの構造とを示す模式図である。ターゲティングベクター1には、ターゲティングベクター2を取り込んだES細胞を選別するためのマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は3.2kb、その右側の相同領域は4.8kbであった。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記左側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター2では第2エクソンと第3エクソンの一部が欠失する。
図2は、ターゲティングベクター2の構造と、これに対応する野生型染色体DNA及び相同組換え体DNAの構造とを示す模式図である。ターゲティングベクター1には、ターゲティングベクター2を取り込んだES細胞を選別するためのマーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は3.2kb、その右側の相同領域は4.8kbであった。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記左側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター2では第2エクソンと第3エクソンの一部が欠失する。
相同組換え体ES細胞の単離
ターゲティングベクター2のトランスフェクションはターゲティングベクター1と同様に行った。ターゲティングベクター2を導入したハイグロマイシン耐性のES細胞のクローンを749個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認したが、相同組換えを起こしていたクローンは1個もなかった。
ターゲティングベクター2のトランスフェクションはターゲティングベクター1と同様に行った。ターゲティングベクター2を導入したハイグロマイシン耐性のES細胞のクローンを749個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認したが、相同組換えを起こしていたクローンは1個もなかった。
ターゲティングベクター3の構造
図3は、ターゲティングベクター3の構造と、これに対応する野生型染色体DNA及び相同組換え体DNAの構造とを示す模式図である。ターゲティングベクター3には、ターゲティングベクター3を取り込んだES細胞を選別するためのマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は5.5kb、その右側の相同領域は2.7kbであった。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記右側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター3では第2エクソンの一部と、第3エクソン及び第4エクソンが欠失し、IL−1タイプIIレセプタータンパク質の代わりに緑蛍光タンパク質(EGFP)が発現するようにコード化される。
図3は、ターゲティングベクター3の構造と、これに対応する野生型染色体DNA及び相同組換え体DNAの構造とを示す模式図である。ターゲティングベクター3には、ターゲティングベクター3を取り込んだES細胞を選別するためのマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を用い、その左側の相同領域は5.5kb、その右側の相同領域は2.7kbであった。また、相同組換え体を選別するためのマーカーとして、前記右側の相同領域に隣接してジフテリア毒素遺伝子が連結されている。ターゲティングベクター3では第2エクソンの一部と、第3エクソン及び第4エクソンが欠失し、IL−1タイプIIレセプタータンパク質の代わりに緑蛍光タンパク質(EGFP)が発現するようにコード化される。
相同組換え体ES細胞の単離
ターゲティングベクター2のトランスフェクションは、ハイグロマイシンの代わりに300μg/mLのG418をES細胞用培地に添加することを除いて、ターゲティングベクター1及び2と同様に行った。ターゲティングベクター3を導入したG418耐性のES細胞のクローンを1150個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認した。ここで、BamHIで消化したゲノムDNAをアガロースゲル電気泳動により分離して固相に写し取り、第5エクソンの3’下流に存在するKpnI−PstI断片(約360bp)をプローブとして用いることにより、野生型約10.5kbに対して変異型は約7.0 kbにシグナルを得ることができる(図4)。前記1150個のうち7A1クローン1個だけが相同組換え体であった。
ターゲティングベクター2のトランスフェクションは、ハイグロマイシンの代わりに300μg/mLのG418をES細胞用培地に添加することを除いて、ターゲティングベクター1及び2と同様に行った。ターゲティングベクター3を導入したG418耐性のES細胞のクローンを1150個単離して、相同組換えを起こしているかどうかサザンブロット法で確認した。ここで、BamHIで消化したゲノムDNAをアガロースゲル電気泳動により分離して固相に写し取り、第5エクソンの3’下流に存在するKpnI−PstI断片(約360bp)をプローブとして用いることにより、野生型約10.5kbに対して変異型は約7.0 kbにシグナルを得ることができる(図4)。前記1150個のうち7A1クローン1個だけが相同組換え体であった。
ES細胞キメラマウスの作出
IL−1タイプIIレセプター遺伝子座に変異を持つ7A1クローンは定法に従いアグリーゲションキメラ法を用いてキメラマウスの作製を行った。すなわち、BDF1オスマウスとC57BL/6Jメスマウスとの交配により得られた8細胞期胚と5−15個のES細胞とをM16培地(Sigma)内で一晩接触共培養することによりキメラ胚盤胞を形成させた後、偽妊娠処理3日目のICRメスマウスの子宮内に移植することによりキメラマウスを出生させた。毛色による判定で70%以上のES細胞の寄与率を示すオスキメラマウスは、メスC57BL/6Jマウスとの交配を行い、生殖系列伝達試験を行った。ES細胞由来を示す野生色の仔マウスについては尻尾よりDNAを抽出し、ターゲット遺伝子座(IL−1タイプIIレセプター遺伝子に相同組換えにより欠失及び挿入を有する遺伝子座)を持つかどうかPCR法及びサザンブロット法により確認を行った。ターゲット遺伝子座を持つマウスは、戻し交配(C57BL/6J系及びBALB/cA系に8世代)行い、解析に用いた。
IL−1タイプIIレセプター遺伝子座に変異を持つ7A1クローンは定法に従いアグリーゲションキメラ法を用いてキメラマウスの作製を行った。すなわち、BDF1オスマウスとC57BL/6Jメスマウスとの交配により得られた8細胞期胚と5−15個のES細胞とをM16培地(Sigma)内で一晩接触共培養することによりキメラ胚盤胞を形成させた後、偽妊娠処理3日目のICRメスマウスの子宮内に移植することによりキメラマウスを出生させた。毛色による判定で70%以上のES細胞の寄与率を示すオスキメラマウスは、メスC57BL/6Jマウスとの交配を行い、生殖系列伝達試験を行った。ES細胞由来を示す野生色の仔マウスについては尻尾よりDNAを抽出し、ターゲット遺伝子座(IL−1タイプIIレセプター遺伝子に相同組換えにより欠失及び挿入を有する遺伝子座)を持つかどうかPCR法及びサザンブロット法により確認を行った。ターゲット遺伝子座を持つマウスは、戻し交配(C57BL/6J系及びBALB/cA系に8世代)行い、解析に用いた。
IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスの表現型
IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスは、C57BL/6J、BALB/cAいずれの遺伝的背景においてもメンデルの法則に則って出生し、外見上も特に異常は見当たらなかった。また、IL−1Ra遺伝子欠損マウスと異なり、加齢と共にリウマチ様関節炎や乾癬様皮膚炎などの自己免疫疾患の発症は認められなかった。さらに、IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスでは、IL−1リガンドに対するおとりレセプターが消失したことを示す表現型は、現在のところ認められていない。
IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスは、C57BL/6J、BALB/cAいずれの遺伝的背景においてもメンデルの法則に則って出生し、外見上も特に異常は見当たらなかった。また、IL−1Ra遺伝子欠損マウスと異なり、加齢と共にリウマチ様関節炎や乾癬様皮膚炎などの自己免疫疾患の発症は認められなかった。さらに、IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスでは、IL−1リガンドに対するおとりレセプターが消失したことを示す表現型は、現在のところ認められていない。
ハプテン塗布による接触型過敏症モデル
IL−1のシグナルが増悪化に関与することが知られているハプテン塗布による接触型過敏症(CHS)モデルをIL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスに行なった。免疫感作するためのハプテンとしては2,4−ジニトロフルオロベンセン(DNFB)又は2,4,6−トリニトロクロロベンゼン(TNCB)を用いた。剃毛して2日後のマウスの腹部に0.5%に溶解したDNFB又は3.0%に溶解したTNCBを50μL塗布した。この時、溶媒としてオリーブオイル(和光):アセトン(ナカライ)=1:4の混合液を用いた。免疫感作5日後のマウスの片方の耳介に0.2%DNFB又は1.0%TNCBを25μL塗布し、もう一方の耳介には溶媒のみを塗布して炎症を誘導した。二度目のハプテン塗布から24時間後にマウスの左右の耳介を直径6mmのパンチで切り取りその重量差を測定した。
IL−1のシグナルが増悪化に関与することが知られているハプテン塗布による接触型過敏症(CHS)モデルをIL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスに行なった。免疫感作するためのハプテンとしては2,4−ジニトロフルオロベンセン(DNFB)又は2,4,6−トリニトロクロロベンゼン(TNCB)を用いた。剃毛して2日後のマウスの腹部に0.5%に溶解したDNFB又は3.0%に溶解したTNCBを50μL塗布した。この時、溶媒としてオリーブオイル(和光):アセトン(ナカライ)=1:4の混合液を用いた。免疫感作5日後のマウスの片方の耳介に0.2%DNFB又は1.0%TNCBを25μL塗布し、もう一方の耳介には溶媒のみを塗布して炎症を誘導した。二度目のハプテン塗布から24時間後にマウスの左右の耳介を直径6mmのパンチで切り取りその重量差を測定した。
[耳介の腫れ(mg)]=[ハプテンを塗布した耳介片重量(mg)]
−[溶媒を塗布した耳介片重量(mg)]。
−[溶媒を塗布した耳介片重量(mg)]。
DNFB塗布によるCHSモデルアレルギー反応の結果を図5A、TNCB塗布によるCHSモデルアレルギー反応の結果を図5Bに示す。図5A及び図5Bに示すとおり、IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスでは、ハプテン塗布による接触型過敏症の発症が抑制された。
IL−1タイプIIレセプター遺伝子発現の確認
前記CHSモデルアレルギー反応においてIL−1タイプIIレセプター遺伝子が野生型マウスでは発現していることを確認した。CHSを誘導したマウス耳介をセパゾールRNAIスーパー(ナカライ)中でホモジナイズし、クロロホルムを加えて混和した後、RNAが抽出された水相を回収した。ここから100%イソプロパノール、75%エタノールを用いてRNAを精製した。このRNAをSuperScript(商標)First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen)を用いて逆転写し、cDNAを得た。これをテンプレートとしRT−PCR法を用いてIL−1R2mRNA発現量を調べた。PCRに用いたプライマー配列は、IL−1R2(Forward Primer; 5’ −CTG GAA GGT GAA CCT GTG GT−3’(配列番号1): Reverse Primer; 5’ −CAT TTG CTC ACA GTG GGA TG−3’(配列番号2))、Gapdh(Forward Primer; 5’ −ACC ACA GTC CAT GCC ATC TCT GCC A−3’(配列番号3): Reverse Primer; 5’ −TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCG T−3’(配列番号4))である。耐熱性DNAポリメラーゼとしてTakara Ex Taq(Takara)を用いた。PCR反応の条件は、94°Cで2分間インキュベーションした後、(94°Cで15秒間、58°Cで30秒間、72°Cで30秒間)×35サイクル反応させ、その後72°Cで10分間インキュベーションする条件で行った。
前記CHSモデルアレルギー反応においてIL−1タイプIIレセプター遺伝子が野生型マウスでは発現していることを確認した。CHSを誘導したマウス耳介をセパゾールRNAIスーパー(ナカライ)中でホモジナイズし、クロロホルムを加えて混和した後、RNAが抽出された水相を回収した。ここから100%イソプロパノール、75%エタノールを用いてRNAを精製した。このRNAをSuperScript(商標)First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen)を用いて逆転写し、cDNAを得た。これをテンプレートとしRT−PCR法を用いてIL−1R2mRNA発現量を調べた。PCRに用いたプライマー配列は、IL−1R2(Forward Primer; 5’ −CTG GAA GGT GAA CCT GTG GT−3’(配列番号1): Reverse Primer; 5’ −CAT TTG CTC ACA GTG GGA TG−3’(配列番号2))、Gapdh(Forward Primer; 5’ −ACC ACA GTC CAT GCC ATC TCT GCC A−3’(配列番号3): Reverse Primer; 5’ −TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCG T−3’(配列番号4))である。耐熱性DNAポリメラーゼとしてTakara Ex Taq(Takara)を用いた。PCR反応の条件は、94°Cで2分間インキュベーションした後、(94°Cで15秒間、58°Cで30秒間、72°Cで30秒間)×35サイクル反応させ、その後72°Cで10分間インキュベーションする条件で行った。
図6に示すとおり、RT−PCR法によるIL−1タイプIIレセプター遺伝子発現解析の結果、野生型マウスでは、DNFB塗布によるCHSモデルアレルギー反応の際にIL−1タイプIIレセプター遺伝子は発現が亢進したが、IL−1タイプIIレセプター遺伝子座の欠損マウスではIL−1タイプIIレセプター遺伝子の発現は全く検出されなかった。
IL−1タイプIIレセプターはおとりレセプターとしてIL−1刺激を抑制すると考えられてきた。そこで、IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスではIL−1刺激を抑制することができないからアレルギー反応は増悪すると予測された。しかし、図6に示すとおり、CHSモデルアレルギー反応ではIL−1タイプIIレセプター遺伝子が全く発現していないにもかかわらず、図5A及び図5Bに示すとおり、IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスではアレルギー反応は野生型マウスよりも抑制された。これは、従来の予測に反する結果である。
新しいIL−1シグナル解析ツールとしてのIL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウス
これまでの遺伝子欠損マウスを用いた解析から、CHSの増悪化にはIL−1アルファのシグナルが重要であることが明らかになっていた(Nakaeら、Int. Immunol.13:1471−1478(2001))。また、最近、強皮症患者由来の繊維芽細胞では核内に存在するpre−IL−1アルファがIL−6などの発現誘導に関与すること、このときpre−IL−1アルファはIL−1R2と複合体を形成することにより転写因子として機能していることが報告された(Kawaguchi,Yら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:14501−14506(2006))。このことから、IL−1アルファ依存性/IL−1ベータ非依存性のアレルギー・モデルであるCHSは、新しい概念であるpre−IL−1アルファ/IL−1タイプIIレセプターシグナルが増悪化に関与していると示唆された。
これまでの遺伝子欠損マウスを用いた解析から、CHSの増悪化にはIL−1アルファのシグナルが重要であることが明らかになっていた(Nakaeら、Int. Immunol.13:1471−1478(2001))。また、最近、強皮症患者由来の繊維芽細胞では核内に存在するpre−IL−1アルファがIL−6などの発現誘導に関与すること、このときpre−IL−1アルファはIL−1R2と複合体を形成することにより転写因子として機能していることが報告された(Kawaguchi,Yら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:14501−14506(2006))。このことから、IL−1アルファ依存性/IL−1ベータ非依存性のアレルギー・モデルであるCHSは、新しい概念であるpre−IL−1アルファ/IL−1タイプIIレセプターシグナルが増悪化に関与していると示唆された。
IL−1は、NCBIが公開している医学・生物学の文献データベースであるPubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=PubMed)で検索した場合、2008年1月現在で43,014報もの論文がヒットする、極めて注目度の高い分子である。また、IL−1システムを標的とした生物製剤(例:Anakinra)も免疫疾患の治療薬として実用化に至っている。これらのことから、IL−1タイプIIレセプター遺伝子欠損マウスはIL−1のシグナル解析ツールとして、極めて有用かつ必要度の高い、貴重な遺伝子改変マウスであると考えられる。
Claims (4)
- マウス染色体上のIL−1タイプIIレセプター遺伝子座に欠失及び/又は挿入変異を有することを特徴とする、IL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウス。
- 前記変異は、完全長IL−1タイプIIレセプタータンパク質の代わりに緑蛍光タンパク質が発現することを特徴とする、請求項1に記載のIL−1タイプIIレセプター遺伝子の欠損変異体マウス。
- 請求項1又は2に記載のマウスにマウスIL−1タイプIIレセプタータンパク質を免疫感作して、該レセプタータンパク質に対するモノクローナル抗体を作成するステップと、前記モノクローナル抗体を野生型マウスか野生型マウス由来の免疫細胞かに投与して、IL−1による免疫系への刺激を抑制させるモノクローナル抗体をスクリーニングするステップとを含むことを特徴とする、アレルギー及び/又は炎症を治療する抗体製剤の作成方法。
- 試験物質存在下又は非存在下、IL−1タイプIIレセプターか、該レセプターを発現している細胞かにIL−1を作用させるステップと、IL−1タイプIIレセプターとIL−1との結合を測定するステップとを含むことを特徴とする、抗アレルギー薬又は抗炎症薬候補のスクリーニング方法。
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