JP2009179780A - Microparticle dispersion, measuring composition, and process for detecting specimen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、簡便で高感度な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物及び該測定用組成物に用いる微粒子分散物に関する。 The present invention relates to a simple and highly sensitive test substance detection method, a measurement composition used in the detection method, and a fine particle dispersion used in the measurement composition.
癌等の疾患に罹ると、動物の体内では特定の微量蛋白質の量が増減する現象が見られる。従って、疾患の種類や重篤度合いと、増減する蛋白質の種類に相関関係が見出される場合、動物の体内の該蛋白質量を測定することにより、疾患の識別や悪性度の診断が可能である。このような蛋白質の分析には迅速かつ高感度な分析方法が求められる。この免疫測定法（イムノアッセイともいう）には様々な分析方法が用いられるが、抗体または抗原を酵素で標識したものを用いるＥＬＩＳＡ法が広く使用されている。一般に、ＥＬＩＳＡ法の感度は、概ね蛋白質０．００１〜０．１μｇといわれている。分析ステップとしては、被検物質の蛋白質との抗原抗体反応、二次抗体との抗原抗体反応、酵素反応による発色反応の３ステップから構成されており（例えば、特許文献１及び２参照）、高感度化の手法としてはリポソームを利用した感度増幅が知られている（例えば、非特許文献１、特許文献３参照）。 When suffering from a disease such as cancer, there is a phenomenon in which the amount of a specific trace protein increases or decreases in the animal body. Therefore, when a correlation is found between the type and severity of the disease and the type of protein that increases or decreases, the disease can be identified or the malignancy can be diagnosed by measuring the amount of the protein in the animal body. Such protein analysis requires a rapid and sensitive analysis method. Various analytical methods are used for this immunoassay (also referred to as immunoassay), and an ELISA method using an antibody or antigen labeled with an enzyme is widely used. Generally, the sensitivity of the ELISA method is generally said to be 0.001 to 0.1 μg of protein. The analysis step consists of three steps: an antigen-antibody reaction with a protein of the test substance, an antigen-antibody reaction with a secondary antibody, and a color reaction by an enzyme reaction (see, for example, Patent Documents 1 and 2). Sensitivity amplification using liposome is known as a technique for increasing sensitivity (see, for example, Non-Patent Document 1 and Patent Document 3).
しかし、これらの方法は酵素反応が必要であるため、比較的分析時間が長く、ＥＬＩＳＡ法よりさらに短時間で簡便な分析方法が望まれていた。 However, since these methods require an enzyme reaction, the analysis time is relatively long, and a simple analysis method is desired in a shorter time than the ELISA method.
これを受けて近年では、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法がしばしば使用されている。これは検出手段が蛍光測定であるため、酵素反応に比べ大幅に分析時間を短縮できる。実際に様々な蛍光ラベル化試薬が市販されているが、比較的安価で普及しているもの（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣともいう）等）では感度が充分ではなかった。 In response to this, in recent years, a fluorescent immunoassay (FIA) method using a fluorescent substance as a labeling substance is often used. Since the detection means is fluorescence measurement, the analysis time can be greatly shortened compared with the enzyme reaction. Actually, various fluorescent labeling reagents are commercially available, but those that are relatively inexpensive and popular (for example, fluorescein isothiocyanate (also referred to as FITC)) have not been sufficiently sensitive.
これに対し、特許文献４または５では、複数の蛍光色素をポリマー粒子表面に結合または内部に含有させることで、一つの検体に対し複数の信号を与える標識を付与することを可能としている。しかしながら、この方法では、粒子の液への分散安定性や粒子自身の安定性を上げるためにポリマーの親水性を調整すると、内部に含有する蛍光色素のポリマーに対する分散安定性が悪くなり、色素が凝集して充分な発光強度が保てなくなったり、表面に結合させる場合には、色素自身が粒子の分散安定性に影響を及ぼしたりする問題があり、用いる蛍光色素に対する構造の制約も大きかった。 On the other hand, in Patent Document 4 or 5, a plurality of fluorescent dyes are bonded to the surface of polymer particles or contained therein, thereby allowing a label to give a plurality of signals to one specimen. However, in this method, when the hydrophilicity of the polymer is adjusted in order to increase the dispersion stability of the particles in the liquid or the stability of the particles themselves, the dispersion stability of the fluorescent dye contained therein with respect to the polymer is deteriorated, and the dye is deteriorated. In the case of agglomeration, sufficient light emission intensity cannot be maintained, or when it is bonded to the surface, there is a problem that the dye itself affects the dispersion stability of the particles, and the structure of the fluorescent dye used is greatly limited.
また、特許文献６及び７のようにコア−シェル型のポリマー粒子を用い、シェルに特異的吸着能を担わせ、コアのみに蛍光色素を内包する方法も見出されている。しかし、これら従来のコアシェル型ポリマー粒子分散物では、分散液への粒子の分散安定性や色素溶出耐性と発光強度の諸性能を充分に満たすことはできなかった。特に発光強度においてさらなる改善が望まれていた。
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、簡便で高感度な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物、及び、該測定用組成物に用いる、分散安定性、色素溶出耐性及び高い検出感度を兼ね備えた蛍光性色材を含有する微粒子分散物を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to use a simple and highly sensitive test substance detection method, a measurement composition used in the detection method, and the measurement composition. An object of the present invention is to provide a fine particle dispersion containing a fluorescent coloring material having both dispersion stability, dye elution resistance and high detection sensitivity.
本発明の上記課題は、以下の構成により達成される。 The above object of the present invention is achieved by the following configurations.
１．コア部に、蛍光性色材及びガラス転移点が−１５０〜３０℃のポリマーＣを含有し、シェル部に、特異的吸着基（抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基）を有するポリマーＳを含有することを特徴とする微粒子分散物。 1. The core portion contains a fluorescent colorant and polymer C having a glass transition point of −150 to 30 ° C., and the shell portion recognizes a specific adsorbing group (a specific kind of substance such as an antibody against an antigen). And a polymer S having a group having a function of adsorbing).
２．前記ガラス転移点が−１５０〜１５℃であることを特徴とする前記１に記載の微粒子分散物。 2. 2. The fine particle dispersion according to 1 above, wherein the glass transition point is −150 to 15 ° C.
３．前記ポリマーＣが、下記一般式（１）で表されるモノマーに由来する構造またはブタジエンに由来する構造を有することを特徴とする前記１または２に記載の微粒子分散物。 3. 3. The fine particle dispersion according to 1 or 2 above, wherein the polymer C has a structure derived from a monomer represented by the following general formula (1) or a structure derived from butadiene.
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は炭素数４〜１８の直鎖アルキル基または炭素数８〜２０の２位分岐アルキル基を表す。）
４．前記ポリマーＣが、下記一般式（２）で表されるモノマーに由来する構造を有することを特徴とする前記３に記載の微粒子分散物。
(In the formula, R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R 2 represents a linear alkyl group having 4 to 18 carbon atoms or a 2-position branched alkyl group having 8 to 20 carbon atoms.)
4). 4. The fine particle dispersion according to 3 above, wherein the polymer C has a structure derived from a monomer represented by the following general formula (2).
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は水素原子またはヒドロキシアルキル基を表す。）
５．前記１〜４のいずれか１項に記載の微粒子分散物を含むことを特徴とする測定用組成物。
(In the formula, R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyalkyl group.)
5. 5. A measurement composition comprising the fine particle dispersion described in any one of 1 to 4 above.
６．前記５に記載の測定用組成物を用いることを特徴とする被検物質の検出方法。 6). 6. A method for detecting a test substance, comprising using the composition for measurement according to 5 above.
７．前記被検物質が蛋白質であることを特徴とする前記６に記載の被検出物質の検出方法。 7. 7. The method for detecting a substance to be detected according to 6 above, wherein the substance to be detected is a protein.
本発明によれば、簡便で高感度な被検物質の検出方法、該検出方法に用いる測定用組成物、及び、該測定用組成物に用いる、分散安定性、色素溶出耐性及び高い検出感度を兼ね備えた蛍光性色材を含有する微粒子分散物を提供することができる。 According to the present invention, a simple and highly sensitive detection method of a test substance, a measurement composition used in the detection method, and dispersion stability, dye elution resistance and high detection sensitivity used in the measurement composition are provided. It is possible to provide a fine particle dispersion containing a fluorescent colorant that is also combined.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、コア部に、蛍光性色材及びガラス転移点が−１５０〜３０℃のポリマーＣを含有し、シェル部に、特異的吸着基（抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基）を有するポリマーＳを含有する微粒子分散物により、分散安定性、色素溶出耐性及び高い検出感度を兼ね備えた蛍光性色材を含有する微粒子分散物が得られることを見出し、本発明に至った次第である。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the inventors of the present invention contain a fluorescent colorant and a polymer C having a glass transition point of −150 to 30 ° C. in the core part, and a specific adsorbing group in the shell part. Fine particle dispersion containing polymer S having a group capable of recognizing and adsorbing a specific type of substance (such as an antibody against an antigen) combines dispersion stability, dye elution resistance and high detection sensitivity. The inventors have found that a fine particle dispersion containing a fluorescent colorant can be obtained, and have reached the present invention.
以下、本発明について具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described.
〔微粒子分散物〕
本発明の微粒子分散物に用いられる微粒子（本発明の微粒子分散物において特徴を有するのは微粒子であるから、以下、本発明の微粒子分散物に用いられる微粒子を単に本発明の微粒子ともいう）は、蛍光性色材とポリマーＣとを含有するコア部（単にコアともいう）と、特異的吸着基を有するポリマーＳを含有するシェル部（単にシェルともいう）から形成される。シェル部に含有されるポリマーＳの持つ特異的吸着基とは、アビジンに対するビオチン、抗原に対する抗体のように、ある特定の種類の物質を認識し、吸着する機能を有する基である。
[Fine particle dispersion]
The fine particles used in the fine particle dispersion of the present invention (since the fine particle dispersion of the present invention is characterized by fine particles, the fine particles used in the fine particle dispersion of the present invention are hereinafter also simply referred to as fine particles of the present invention) And a core part containing a fluorescent colorant and polymer C (also simply referred to as a core) and a shell part containing polymer S having a specific adsorbing group (also referred to as a shell). The specific adsorption group possessed by the polymer S contained in the shell part is a group having a function of recognizing and adsorbing a specific type of substance such as biotin for avidin and an antibody for an antigen.
本発明において、ポリマーＣ、ポリマーＳのポリマーとしては、一般に知られているあらゆるモノマーから構成されるポリマーが使用可能であるが、好ましいポリマーとしては例えばスチレン、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、ブタジエン、イソプレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、等のモノマーを重合して得られるホモポリマーあるいはコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラール、ポリビニルアセタール等のコポリマー、ポリウレタン、ポリエステル等が挙げられ、これらはさらに組み合わさってポリマーを構成していてもよい。 In the present invention, as a polymer of the polymer C and the polymer S, a polymer composed of any generally known monomer can be used. Preferred examples of the polymer include styrene, (meth) acrylic acid, and (meth) acrylic. Examples include homopolymers or copolymers obtained by polymerizing monomers such as acid esters, butadiene, isoprene, vinyl chloride, vinyl acetate, copolymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl butyral, and polyvinyl acetal, polyurethanes, polyesters, and the like. It may be combined to form a polymer.
（コア部用ポリマーＣ）
本発明において、コア部に用いるポリマーＣは、ガラス転移温度が−１５０〜３０℃であり、−１５０〜１５℃がより好ましい。ガラス転移温度は、ＤＳＣ装置（示差走査熱量分析装置）にて測定できる。
(Polymer C for core)
In the present invention, the polymer C used in the core part has a glass transition temperature of −150 to 30 ° C., more preferably −150 to 15 ° C. The glass transition temperature can be measured with a DSC apparatus (differential scanning calorimetry apparatus).
コア部に用いるポリマーＣとしては、例えばスチレン、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、ブタジエン、イソプレン等のモノマーから合成されるコポリマーであり、ガラス転移温度が上記範囲内となる組成のコポリマーまたはホモポリマーである。コア部に用いるポリマーＣは、前記一般式（１）で表されるモノマーに由来する構造またはブタジエンに由来する構造を有することが好ましい。 The polymer C used for the core part is a copolymer synthesized from monomers such as styrene, (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, butadiene, isoprene, etc., and has a composition in which the glass transition temperature falls within the above range. Copolymer or homopolymer. The polymer C used for the core part preferably has a structure derived from the monomer represented by the general formula (1) or a structure derived from butadiene.
一般式（１）において、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は炭素数４〜１８の直鎖アルキル基または炭素数８〜２０の２位分岐アルキル基を表す。炭素数４〜１８の直鎖アルキル基とは、例えばブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基（ラウリル基）、ステアリル基等である。炭素数８から２０までの２位分岐アルキル基とは、例えば２−エチルヘキシル基、２−ブチルオクチル基、２−ブチルデシル基、２−ヘキシルデシル基、２−オクチルデシル基、２−ヘキシルドデシル基、２−オクチルドデシル基等である。 In the general formula (1), R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R 2 represents a linear alkyl group having 4 to 18 carbon atoms or a 2-position branched alkyl group having 8 to 20 carbon atoms. Examples of the linear alkyl group having 4 to 18 carbon atoms include butyl group, pentyl group, hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group (lauryl group), stearyl group, and the like. . Examples of the 2-position branched alkyl group having 8 to 20 carbon atoms include 2-ethylhexyl group, 2-butyloctyl group, 2-butyldecyl group, 2-hexyldecyl group, 2-octyldecyl group, 2-hexyldecyl group, 2-octyldodecyl group and the like.
コア部に用いるポリマーＣは、アクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリルのうち少なくとも一種のモノマーに由来する構造を有することがさらに好ましい。 The polymer C used for the core is at least one monomer selected from butyl acrylate, 2-ethylhexyl acrylate, lauryl acrylate, stearyl acrylate, butyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, lauryl methacrylate, and stearyl methacrylate. More preferably, it has a derived structure.
さらに、コア部に用いるポリマーＣは、前記一般式（２）で表されるモノマーに由来する構造を有することが好ましい。 Furthermore, the polymer C used for the core part preferably has a structure derived from the monomer represented by the general formula (2).
一般式（２）において、Ｒ1は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ2は水素原子またはヒドロキシアルキル基を表す。一般式（２）で表される化合物としては、例えば（メタ）アクリル酸、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。 In the general formula (2), R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyalkyl group. Examples of the compound represented by the general formula (2) include (meth) acrylic acid, hydroxyethyl (meth) acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, and the like.
（シェル部用ポリマーＳ）
シェル部に用いるポリマーＳは、特異的吸着基を連結可能な構造として有する必要がある。特異的吸着基を連結可能な構造としては、例えば水酸基、アミノ基、メルカプト基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、フルオロ基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、カルボン酸基、スルホン酸基、アミド基、酸無水物残基、スクシンイミジルオキシ基、ヒドラジド基、グリシジル基、イソシアネート基、チオイソシアネート基等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(Polymer S for shell)
The polymer S used for the shell portion needs to have a structure capable of connecting a specific adsorbing group. Examples of the structure capable of linking a specific adsorbing group include a hydroxyl group, an amino group, a mercapto group, a chloro group, a bromo group, an iodo group, a fluoro group, an alkylsulfonyloxy group, an arylsulfonyloxy group, a carboxylic acid group, and a sulfonic acid group. Amide group, acid anhydride residue, succinimidyloxy group, hydrazide group, glycidyl group, isocyanate group, thioisocyanate group and the like, but the present invention is not limited thereto.
シェル部に用いるポリマーＳを構成するモノマーとして、特異的吸着基を修飾するのに好ましいモノマーは、例えば（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアリールエステル、（メタ）アクリル酸アミノアルキルエステル、（メタ）アクリル酸アミノアリールエステル、（メタ）アクリルアミド（但しＮ−Ｈ構造を有するもの）である。 As a monomer constituting the polymer S used in the shell portion, preferable monomers for modifying the specific adsorption group include, for example, (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid hydroxyalkyl ester, (meth) acrylic acid hydroxyaryl ester, (Meth) acrylic acid aminoalkyl ester, (meth) acrylic acid aminoaryl ester, (meth) acrylamide (however, having an N-H structure).
微粒子自身の安定性や液への分散安定性の向上の観点から、好ましいシェル用ポリマーＳは、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル等のモノマーから構成されるホモポリマーあるいはコポリマー、さらには上記モノマーとスチレンとのコポリマーである。 From the viewpoint of improving the stability of the fine particles themselves and the dispersion stability in the liquid, the preferred polymer S for the shell is a monomer such as (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid alkyl ester, (meth) acrylic acid hydroxyalkyl ester, etc. Or a copolymer of the above monomer and styrene.
（蛍光性色材）
コア部に含有される蛍光性色材としては、水溶性色材と非水溶性色材が挙げられ、本発明は分散媒の主成分が水であるため、外部への溶出が抑えられるという観点から非水溶性色材が好ましい。また蛍光性色材としては、染料と顔料があり、本発明には従来公知の染料及び顔料を用いることが可能である。
(Fluorescent color material)
Examples of fluorescent color materials contained in the core include water-soluble color materials and water-insoluble color materials, and the present invention has a viewpoint that elution to the outside is suppressed because the main component of the dispersion medium is water. To water-insoluble colorants are preferred. The fluorescent color material includes dyes and pigments, and conventionally known dyes and pigments can be used in the present invention.
以下に、本発明に好ましく用いられる染料を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Although the dyes preferably used in the present invention are listed below, the present invention is not limited to these.
スチルベン色素、アクリドン色素、アゾベンゼン色素、ローダミン、フルオレセイン等のキサンテン色素、クマリン色素、シアニン色素、スクアリリウム色素、ダンシルアミド色素、ピレン、ペリレン、アントラセン等の多環芳香族色素、ＮＢＤ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ランタニド錯体等が挙げられる。 Xanthene dyes such as stilbene dyes, acridone dyes, azobenzene dyes, rhodamine and fluorescein, coumarin dyes, cyanine dyes, squarylium dyes, dansylamide dyes, polycyclic aromatic dyes such as pyrene, perylene and anthracene, NBD dyes, BODIPY dyes, lanthanides A complex etc. are mentioned.
具体例としては、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー４４、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー８２、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー１１６、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４３、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４４、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４５、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド４９、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド６０、ソルベントブルー５、ソルベントピンク、ソルベントグリーン７、ディスパーズイエロー１２１、ディスパーズイエロー１２４、ディスパーズイエロー８２、ディスパーズオレンジ１１、ディスパーズレッド５８、ディスパーズレッド６０、ディスパーズブルー７、エオシン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド、インドシアニングリーン、７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ カルボン酸、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５等
次に、本発明に用いられる顔料を下記に挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
As a specific example, C.I. I. Solvent Yellow 44, C.I. I. Solvent Yellow 82, C.I. I. Solvent Yellow 116, C.I. I. Solvent Red 43, C.I. I. Solvent Red 44, C.I. I. Solvent Red 45, C.I. I. Solvent Red 49, C.I. I. Solvent Red 60, Solvent Blue 5, Solvent Pink, Solvent Green 7, Disperse Yellow 121, Disperse Yellow 124, Disperse Yellow 82, Disperse Orange 11, Disperse Red 58, Disperse Red 60, Disperse Blue 7, Eosin, rhodamine 6G, rhodamine B, fluorescein, carboxyfluorescein, Texas red, indocyanine green, 7-diethylamino-4-methylcoumarin, Alexa Fluor 488 carboxylic acid, Cy3, Cy5, Cy3.5, Cy5.5 etc. Next The pigments used in the present invention are listed below, but the present invention is not limited to these.
Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｌ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｌ Ｒｅｄ、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｌ Ｏｒａｎｇｅ、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｇｒｅｅｎ７
〔微粒子分散物の製造〕
蛍光性色材が蛍光性染料の場合、コアの蛍光性色材含有微粒子は各種の方法で調製することができる。例えばモノマー中に油溶性蛍光性染料を溶解させ、水中で乳化後、重合によりポリマー中に該蛍光性染料を封入する方法、ポリマーと蛍光性染料を有機溶剤中に溶解し、水中で乳化後、有機溶剤を除去する方法等が挙げられる。それらの蛍光性色材含有微粒子にさらにポリマーで被覆シェル化を行う。
Lumogen Brilliant Yellow, Lumogen L Yellow, Lumogen L Red, Lumogen L Orange, Lumogen Brilliant Green7
(Production of fine particle dispersion)
When the fluorescent color material is a fluorescent dye, the core fluorescent color material-containing fine particles can be prepared by various methods. For example, an oil-soluble fluorescent dye is dissolved in a monomer, emulsified in water, and the fluorescent dye is encapsulated in a polymer by polymerization. The polymer and the fluorescent dye are dissolved in an organic solvent, emulsified in water, Examples include a method of removing the organic solvent. These fluorescent colorant-containing fine particles are further formed into a coating shell with a polymer.
蛍光性色材が蛍光性顔料の場合、蛍光性顔料をポリマーと混練し、その後、水系に分散してポリマー被覆顔料コアを作製する方法、ポリマーを有機溶剤に溶解した溶液を蛍光性顔料分散液に加えた後、減圧下で溶剤を除去しポリマー被覆する方法等が挙げられる。 When the fluorescent colorant is a fluorescent pigment, the fluorescent pigment is kneaded with a polymer and then dispersed in an aqueous system to produce a polymer-coated pigment core. A solution in which the polymer is dissolved in an organic solvent is a fluorescent pigment dispersion. And a method of removing the solvent under reduced pressure and coating with a polymer.
次に、シェル化する方法について説明する。ポリマーシェルを設ける方法としては、コアの水系サスペンションに水溶性のポリマー分散剤を添加し吸着させる方法、モノマーを徐々に滴下し、重合と同時にコア表面に沈着させる方法、あるいは、有機溶剤に溶解したポリマーを徐々に滴下し、析出と同時にコア表面に吸着させる方法等がある。 Next, a method for forming a shell will be described. As a method of providing a polymer shell, a method of adding a water-soluble polymer dispersant to an aqueous suspension of a core and adsorbing it, a method of gradually dropping a monomer and depositing it on the core surface simultaneously with polymerization, or a method of dissolving in an organic solvent There is a method in which a polymer is gradually dropped and adsorbed on the core surface simultaneously with precipitation.
さらに、一段階でコアシェル形成する方法も考えられる。例えば、コアとなるポリマーと蛍光色材をシェルとなるポリマーに溶解または分散し、水中で懸濁後重合する方法や、その液を活性剤ミセルを含有する水中に徐々に添加しながら乳化重合していく方法等がある。この場合、シェルに用いられるポリマーの量が、総ポリマー量の５〜９５質量％であることが好ましく、さらに好ましくは１０〜９０質量％である。５質量％未満ではシェルの厚みが不十分で、蛍光色材を多く含むコアの一部が粒子表面に現れやすくなる。また、シェルのポリマーが多すぎると、コアの蛍光色材保護能が低下しやすい。 Furthermore, a method of forming a core shell in one step is also conceivable. For example, a core polymer and a fluorescent colorant are dissolved or dispersed in a shell polymer and then polymerized after being suspended in water, or emulsion polymerization is performed while gradually adding the liquid to water containing activator micelles. There are ways to go. In this case, the amount of the polymer used for the shell is preferably 5 to 95% by mass, more preferably 10 to 90% by mass, based on the total polymer amount. If it is less than 5% by mass, the thickness of the shell is insufficient, and a part of the core containing a large amount of fluorescent color material tends to appear on the particle surface. Moreover, when there are too many polymers of a shell, the fluorescent color material protective ability of a core will fall easily.
蛍光性色材の量は、総ポリマー量に対して２０〜１０００質量％であることが好ましい。蛍光性色材の量がポリマーに比して少なすぎると充分な発光強度が得られず、また蛍光性色材の量が多すぎるとポリマーの保護能が十分に得られない。 The amount of the fluorescent color material is preferably 20 to 1000% by mass with respect to the total polymer amount. If the amount of the fluorescent color material is too small compared to the polymer, sufficient light emission intensity cannot be obtained, and if the amount of the fluorescent color material is too large, sufficient protective ability of the polymer cannot be obtained.
（特異的吸着基の修飾方法）
特異的吸着基をシェル用ポリマーＳに修飾する方法としては、いかなる方法を用いてもよいが、シェル化後に修飾する方法が好ましく、例えばシェル化後の微粒子の分散液に、液に対しては安定で、シェル用ポリマーＳ上のある部位に対して反応性を持ち、反応後、結合を作るような特異的吸着基導入剤を反応させる方法が挙げられる。この際必要に応じて、縮合剤、触媒等を用いてもよい。抗体の修飾については「酵素免疫測定法第３版」（石川栄治等編、医学書院）等が参考になる。
(Modification method of specific adsorption group)
Any method may be used as a method for modifying the specific adsorbing group to the shell polymer S. However, a method of modifying after the shelling is preferable. For example, in the dispersion of fine particles after the shelling, There is a method of reacting a specific adsorbing group introducing agent that is stable and reactive to a certain site on the shell polymer S and forms a bond after the reaction. At this time, if necessary, a condensing agent, a catalyst, or the like may be used. Refer to “Enzyme Immunoassay 3rd Edition” (Eiji Ishikawa et al., School of Medicine, etc.) for antibody modification.
例えばシェル用ポリマーＳ上のアミノ基に、特異的吸着基としてビオチンを修飾する場合、コアシェル型微粒子の水分散液にビオチンとＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｉｄｅ）等の縮合剤を加えて縮合反応を行うことで、ビオチンのカルボン酸部位とシェル用ポリマーＳ上のアミノ基とをペプチド結合で繋ぐことができる。 For example, when biotin is modified as a specific adsorptive group on the amino group on the shell polymer S, biotin and WSC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbohydrate, hydrochloride) are used in an aqueous dispersion of core-shell type fine particles. By adding a condensing agent, the carboxylic acid moiety of biotin and the amino group on the shell polymer S can be connected by a peptide bond.
本発明の微粒子において、必要な粒子径を得るには、処方の最適化と適当な乳化法の選定が重要である。 In order to obtain the necessary particle size in the fine particles of the present invention, it is important to optimize the formulation and select an appropriate emulsification method.
処方は、用いる蛍光性色材、ポリマーによって異なるが、水中のサスペンション（水系分散物）であるので、コア用ポリマーＣよりシェル用ポリマーＳの方が一般的に親水性が高いことが必要である。 The formulation differs depending on the fluorescent colorant and polymer used, but since it is a suspension in water (aqueous dispersion), the shell polymer S generally needs to be more hydrophilic than the core polymer C. .
また、シェル用ポリマーＳに含有される蛍光性色材は、コア用ポリマーＣより少ないことが好ましく、蛍光性色材もシェル用ポリマーＳより親水性の低いことが必要である。親水性、疎水性は、例えば溶解性パラメータ（ＳＰ）を用いて見積もることができる。 In addition, the fluorescent color material contained in the shell polymer S is preferably less than the core polymer C, and the fluorescent color material is also required to be less hydrophilic than the shell polymer S. The hydrophilicity and hydrophobicity can be estimated using, for example, the solubility parameter (SP).
溶解性パラメータについては、その値、測定、計算法は、ＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ第４版（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）６７５頁の記載が参考になる。 For the solubility parameter, the value, measurement, and calculation method are described on page 675 of POLYMER HANDBOOK 4th edition (JOHN WILEY & SONS, INC.).
なお、本発明に用いられる蛍光性色材とコア用ポリマーＣはそのＳＰ値の差が小さいほど相溶性の観点から好ましく、具体的には色材とコア用ポリマーＣのＳＰ値の差が０〜０．５であることが好ましい。 The smaller the difference in SP value between the fluorescent color material and the core polymer C used in the present invention, the better from the viewpoint of compatibility. Specifically, the difference in SP value between the color material and the core polymer C is 0. It is preferable that it is -0.5.
また、本発明の微粒子に用いられるポリマーＣ、Ｓは、その平均分子量が５００〜１０００００、特に１０００〜３００００であることが、サスペンションの形成性、安定性の点から好ましい。 Further, the polymers C and S used in the fine particles of the present invention preferably have an average molecular weight of 500 to 100,000, particularly 1,000 to 30,000 from the viewpoint of suspension formability and stability.
本発明の微粒子の分散液は、水を媒体とし、前記蛍光性色材を封入したポリマーのサスペンションからなり、よって水溶性有機溶剤を有し、該サスペンションには従来公知の各種添加剤、例えば分散剤、シリコン系等の消泡剤、クロロメチルフェノール系等の防黴剤またはＥＤＴＡ等のキレート剤、亜硫酸塩等の酸素吸収剤等が含有されていてもよい。 The dispersion of fine particles of the present invention comprises a suspension of a polymer containing water as a medium and encapsulating the fluorescent colorant, and thus has a water-soluble organic solvent, and the suspension includes various conventionally known additives such as a dispersion. Agents, antifoaming agents such as silicon, antifungal agents such as chloromethylphenol, chelating agents such as EDTA, oxygen absorbers such as sulfites, and the like may be contained.
本発明に用いられる水溶性有機溶媒としては、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、セカンダリーブタノール、ターシャリーブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール等）、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキサンジオール、ペンタンジオール、グリセリン、ヘキサントリオール、チオジグリコール等）、多価アルコールエーテル類（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテル、プロピレングリコールモノフェニルエーテル等）、アミン類（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、モルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、エチレンジアミン、ジエチレンジアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリエチレンイミン、ペンタメチルジエチレントリアミン、テトラメチルプロピレンジアミン等）、アミド類（例えば、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等）、複素環類（例えば、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、シクロヘキシルピロリドン、２−オキサゾリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等）、スルホキシド類（例えば、ジメチルスルホキシド等）、スルホン類（例えば、スルホラン等）、尿素、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。 As the water-soluble organic solvent used in the present invention, alcohols (for example, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, secondary butanol, tertiary butanol, pentanol, hexanol, cyclohexanol, benzyl alcohol, etc.), Polyhydric alcohols (for example, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, polypropylene glycol, butylene glycol, hexanediol, pentanediol, glycerin, hexanetriol, thiodiglycol, etc.), many Monohydric alcohol ethers (eg, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl) Ether, ethylene glycol monobutyl ether, diethylene glycol monomethyl ether, diethylene glycol monoethyl ether, diethylene glycol monobutyl ether, propylene glycol monomethyl ether, propylene glycol monobutyl ether, ethylene glycol monomethyl ether acetate, triethylene glycol monomethyl ether, triethylene glycol monoethyl ether, triethylene glycol Ethylene glycol monobutyl ether, ethylene glycol monophenyl ether, propylene glycol monophenyl ether, etc.), amines (eg, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, N-methyldiethanolamine, N-ethyldiethanolamine, morpholine, N-ethyl) Morpholine, ethylenediamine, diethylenediamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, polyethyleneimine, pentamethyldiethylenetriamine, tetramethylpropylenediamine, etc.), amides (eg, formamide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide) Etc.), heterocyclic rings (for example, 2-pyrrolidone, N-methyl-2-pyrrolidone, cyclohexyl pyrrolidone, 2-oxazolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, etc.), sulfoxides (for example, dimethyl sulfoxide, etc.) ), Sulfones (for example, sulfolane), urea, acetonitrile, acetone and the like.
本発明に係る分散剤としては、水溶性高分子からなる分散剤が好ましく、例えば下記の水溶性樹脂が好ましい例として挙げられる。 As the dispersant according to the present invention, a dispersant composed of a water-soluble polymer is preferable. For example, the following water-soluble resins are preferable.
スチレン−アクリル酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−アクリル酸−アクリル酸共重合体、スチレン−マレイン酸共重合体、スチレン−マレイン酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−アクリル酸−アクリル酸アルキルエステル共重合体、スチレン−マレイン酸ハーフエステル共重合体、ビニルナフタレン−アクリル酸共重合体、ビニルナフタレン−マレイン酸共重合体等のような水溶性高分子である。高分子分散剤の例として、その他に、アクリル−スチレン系樹脂であるジョンクリル等（ジョンソン社）が挙げられる。これらの高分子分散剤は、２種以上併用することも可能である。 Styrene-acrylic acid-alkyl acrylate ester copolymer, styrene-acrylic acid-acrylic acid copolymer, styrene-maleic acid copolymer, styrene-maleic acid-alkyl acrylate copolymer, styrene-acrylic acid copolymer High water solubility such as polymer, styrene-acrylic acid-alkyl acrylate copolymer, styrene-maleic acid half ester copolymer, vinyl naphthalene-acrylic acid copolymer, vinyl naphthalene-maleic acid copolymer, etc. Is a molecule. Other examples of the polymer dispersant include Jonkrill, which is an acrylic-styrene resin (Johnson). Two or more of these polymer dispersants can be used in combination.
水溶性高分子の分散液全量に対する含有量は、分散液全量に対し０．１〜１０質量％であるのが好ましく、さらに好ましくは０．３〜１０質量％である。 The content of the water-soluble polymer with respect to the total amount of the dispersion is preferably 0.1 to 10% by mass, and more preferably 0.3 to 10% by mass with respect to the total amount of the dispersion.
本発明における分散粒子の平均粒子径は５０〜２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは５０〜１２０ｎｍであり、平均粒子径が５０ｎｍ未満では色材とポリマーからなる分散粒子の形成が困難であり、２００ｎｍを越えると分散液の透明性や色の鮮やかさが低下する。 The average particle size of the dispersed particles in the present invention is preferably 50 to 200 nm, more preferably 50 to 120 nm. If the average particle size is less than 50 nm, it is difficult to form dispersed particles composed of a colorant and a polymer, If it exceeds 200 nm, the transparency of the dispersion and the vividness of the color decrease.
顔料の分散方法としては、ボールミル、サンドミル、アトライター、ロールミル、アジテーター、ヘンシェルミキサ、コロイドミル、超音波ホモジナイザー、パールミル、湿式ジェットミル、ペイントシェカー等を用いることができる。 As a method for dispersing the pigment, a ball mill, a sand mill, an attritor, a roll mill, an agitator, a Henschel mixer, a colloid mill, an ultrasonic homogenizer, a pearl mill, a wet jet mill, a paint shaker, or the like can be used.
本発明では顔料分散体の粗粒分を除去する目的で、遠心分離装置やフィルターが好ましく用いられる。 In the present invention, a centrifugal separator or a filter is preferably used for the purpose of removing coarse particles of the pigment dispersion.
分散液に好ましく使用される界面活性剤としては、ジアルキルスルホコハク酸塩類、アルキルナフタレンスルホン酸塩類、脂肪酸塩類等のアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル類、アセチレングリコール類、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー類等のノニオン性界面活性剤、アルキルアミン塩類、第４級アンモニウム塩類等のカチオン性界面活性剤が挙げられるが、特にアニオン性界面活性剤を好ましく用いることができる。 Surfactants preferably used in the dispersion include anionic surfactants such as dialkyl sulfosuccinates, alkyl naphthalene sulfonates, fatty acid salts, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl allyl ethers, acetylene Nonionic surfactants such as glycols, polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymers, and cationic surfactants such as alkylamine salts and quaternary ammonium salts are exemplified, but anionic surfactants are particularly preferable. Can be used.
本発明の分散液には、この他、防腐剤、防黴剤、ｐＨ調整剤、粘度調整剤等を必要に応じて添加することも可能である。 In addition to the above, a preservative, an antifungal agent, a pH adjuster, a viscosity adjuster, and the like can be added to the dispersion of the present invention as necessary.
次に、本発明の微粒子分散液の製造において用いられる乳化方法について説明する。本発明の微粒子分散液の乳化法としては、各種の方法を用いることができる。それらの例は、例えば、「機能性乳化剤・乳化技術の進歩と応用展開 シー エム シー」の８６ページの記載にまとめられている。本発明においては、特に、染料コアの形成には超音波、高速回転せん断、高圧による乳化分散装置を使用することが好ましい。 Next, the emulsification method used in the production of the fine particle dispersion of the present invention will be described. Various methods can be used as an emulsification method of the fine particle dispersion of the present invention. Examples thereof are summarized in the description on page 86 of “Advances in Functional Emulsifier / Emulsification Technology and Application Development CMC”. In the present invention, it is particularly preferable to use an emulsifying and dispersing apparatus using ultrasonic waves, high-speed rotational shearing, and high pressure for forming the dye core.
超音波による乳化分散では、いわゆるバッチ式と連続式の２通りが使用可能である。バッチ式は、比較的少量のサンプル作製に適し、連続式は大量のサンプル作製に適する。連続式では、例えば、ＵＨ−６００ＳＲ（株式会社エスエムテー製）のような装置を用いることが可能である。このような連続式の場合、超音波の照射時間は、分散室容積／流速×循環回数で求めることができる。超音波照射装置が複数ある場合は、それぞれの照射時間の合計として求められる。超音波の照射時間は実際上は１００００秒以下である。また、１００００秒以上必要であると、工程の負荷が大きく、実際上は乳化剤の再選択等により乳化分散時間を短くする必要がある。そのため１００００秒以上は必要でない。さらに好ましくは、１０秒以上、２０００秒以内である。 In the emulsification dispersion using ultrasonic waves, two types of so-called batch type and continuous type can be used. The batch method is suitable for producing a relatively small amount of sample, and the continuous method is suitable for producing a large amount of sample. In the continuous type, for example, an apparatus such as UH-600SR (manufactured by SMT Co., Ltd.) can be used. In the case of such a continuous system, the irradiation time of ultrasonic waves can be obtained by the dispersion chamber volume / flow velocity × the number of circulations. When there are a plurality of ultrasonic irradiation apparatuses, it is obtained as the total of the respective irradiation times. The irradiation time of ultrasonic waves is practically 10000 seconds or less. Further, if it is necessary for 10,000 seconds or more, the load of the process is large, and in practice, it is necessary to shorten the emulsification dispersion time by reselecting the emulsifier. Therefore, more than 10,000 seconds are not necessary. More preferably, it is 10 seconds or more and 2000 seconds or less.
高速回転せん断による乳化分散装置としては、「機能性乳化剤・乳化技術の進歩と応用展開 シー エム シー」の２５５〜２５６ページに記載されているような、ディスパーミキサーや、２５１ページに記載されているようなホモミキサー、２５６ページに記載されているようなウルトラミキサー等が使用できる。これらの型式は、乳化分散時の液粘度によって使い分けることができる。これらの高速回転せん断による乳化分散機では、攪拌翼の回転数が重要である。ステーターを有する装置の場合、攪拌翼とステーターとのクリアランスは通常０．５ｍｍ程度で、極端に狭くはできないので、せん断力は主として攪拌翼の周速に依存する。周速が５〜１５０ｍ／Ｓであれば、本発明の乳化・分散に使用できる。周速が遅い場合、乳化時間を延ばしても小粒径化が達成できない場合が多く、１５０ｍ／Ｓにするにはモーターの性能を極端に上げる必要があるからである。さらに好ましくは、２０〜１００ｍ／Ｓである。 As an emulsifying and dispersing device by high-speed rotational shearing, it is described in Disper Mixer as described in pages 255 to 256 of "Functional emulsifier / emulsification technology and application development CMC", or page 251. Such a homomixer, an ultramixer as described on page 256, or the like can be used. These types can be properly used depending on the liquid viscosity at the time of emulsification dispersion. In the emulsification disperser using these high-speed rotary shears, the rotational speed of the stirring blade is important. In the case of an apparatus having a stator, the clearance between the stirring blade and the stator is usually about 0.5 mm and cannot be made extremely narrow, so the shearing force mainly depends on the peripheral speed of the stirring blade. A peripheral speed of 5 to 150 m / S can be used for emulsification and dispersion of the present invention. This is because when the peripheral speed is low, it is often impossible to reduce the particle size even if the emulsification time is extended, and in order to achieve 150 m / S, it is necessary to extremely increase the performance of the motor. More preferably, it is 20-100 m / S.
これらの乳化・分散装置は単独で用いてもよいが、必要に応じて組み合わせて使用することが可能である。コロイドミルや、フロージェットミキサ等も単独では本発明の目的を達成できないが、本発明の装置との組み合わせにより、短時間で乳化・分散を可能にする等本発明の効果を高めることが可能である。 These emulsifying / dispersing devices may be used alone or in combination as necessary. Colloid mills, flow jet mixers, etc. alone cannot achieve the object of the present invention, but by combining with the apparatus of the present invention, it is possible to enhance the effects of the present invention, such as enabling emulsification and dispersion in a short time. is there.
〔被検物質の検出方法〕
本発明の前記微粒子分散物を含む測定用組成物は、被検物質の検出方法に用いられる。
[Detection method of test substance]
The composition for measurement containing the fine particle dispersion of the present invention is used in a method for detecting a test substance.
本発明の被検物質の検出方法における、被検物質は、該被検物質を特異的に認識する物質が存在すれば、特に限定されることはない。本発明の被検物質の検出方法は、被検物質が蛋白質であることが好ましい。 In the test substance detection method of the present invention, the test substance is not particularly limited as long as a substance that specifically recognizes the test substance exists. In the test substance detection method of the present invention, the test substance is preferably a protein.
被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質の関係の一例としては、免疫学的な関係にある物質が挙げられる。具体的には、抗原と抗体の関係が挙げられる。抗原と抗体の関係において、被検物質が抗原である場合、該抗原を特異的に認識する物質は抗体であり、被検物質が抗体である場合、該抗体を特異的に認識する物質は抗原である。 An example of the relationship between a test substance and a substance that specifically recognizes the test substance is a substance that has an immunological relationship. Specifically, the relationship between an antigen and an antibody can be mentioned. In the relationship between an antigen and an antibody, when the test substance is an antigen, the substance that specifically recognizes the antigen is an antibody. When the test substance is an antibody, the substance that specifically recognizes the antibody is the antigen. It is.
また、被検物質を特異的に認識する物質は、被検物質を間接的に認識できる物質であってもよい。即ち、被検物質を特異的に認識する物質を認識することのできる物質であってもよい。具体的には、被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識することのできる抗体（二次抗体）が挙げられる。 Further, the substance that specifically recognizes the test substance may be a substance that can indirectly recognize the test substance. That is, a substance that can recognize a substance that specifically recognizes a test substance may be used. Specifically, an antibody (secondary antibody) that can recognize an antibody (primary antibody) that recognizes a test substance is included.
二次抗体として、被検物質を認識できる一次抗体作製に用いた動物種に特異的な抗体を認識することのできる抗体を用いることにより、該動物種で一次抗体を作製可能な様々な被検物質に対して、共通してこの同じ二次抗体を使用することが可能となる。本発明の被検物質の検出法を利用したキットを作製する上で、この二次抗体を表面に有する微粒子は有用である。 By using an antibody capable of recognizing an antibody specific to the animal species used for producing the primary antibody capable of recognizing the test substance as the secondary antibody, various tests capable of producing the primary antibody in the animal species This same secondary antibody can be used in common for substances. The fine particles having the secondary antibody on the surface are useful for preparing a kit using the detection method of the test substance of the present invention.
上記抗体を作製するために用いる動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等が挙げられる。抗体としては、動物に免疫することによって得られるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマ法から得られるモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体を用いる場合には、動物として取り扱いやすいウサギ抗体が好ましい。 Examples of animals used for producing the antibody include rabbits, mice, goats, sheep, horses, cows and the like. The antibody may be a polyclonal antibody obtained by immunizing an animal or a monoclonal antibody obtained by a hybridoma method. When a polyclonal antibody is used, a rabbit antibody that is easy to handle as an animal is preferable.
抗原としての被検物質として、例えば血液中等に微量に存在する蛋白質ホルモン、活性ペプチド、オータコイド、腫瘍マーカー、免疫グロブリン等の生体成分や薬剤等が挙げられるが、これらに限定されることはなく、被検物質に対する抗体を作製できるもの等であれば特に制限はない。 Examples of the test substance as an antigen include, but are not limited to, biological hormones and drugs such as protein hormones, active peptides, otachoids, tumor markers, immunoglobulins, etc., which are present in minute amounts in the blood, There is no particular limitation as long as it can produce an antibody against the test substance.
その他、本発明の被検物質の検出方法における、被検物質と、該被検物質を特異的に認識する物質として、酵素と基質、酵素と阻害剤、ホルモンと受容体、レクチンと糖鎖、ＤＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡとＤＮＡ、血清アルブミンと色素ブルー、酵素と補酵素、蛋白質とコンビナトリアルリガンドペプチド等の、様々な組み合わせのものを挙げることができる。酵素と補酵素の組み合わせの例としては、酸化還元酵素と補酵素ＮＡＤＨの組み合わせ等を挙げることができる。 In addition, in the test substance detection method of the present invention, the test substance and the substance that specifically recognizes the test substance include an enzyme and a substrate, an enzyme and an inhibitor, a hormone and a receptor, a lectin and a sugar chain, Examples include various combinations of DNA and RNA, DNA and DNA, serum albumin and dye blue, enzyme and coenzyme, protein and combinatorial ligand peptide, and the like. Examples of the combination of an enzyme and a coenzyme include a combination of an oxidoreductase and a coenzyme NADH.
本発明の被検物質の検出方法においては、ＥＬＩＳＡ測定用に調製された被検物質をそのまま使用することができる。また、被検物質を担体に固定化して用いてもよい。被検物質を固定化する担体としては、被検物質を固定化可能な担体であれば、特に限定されることはない。 In the test substance detection method of the present invention, a test substance prepared for ELISA measurement can be used as it is. Further, the test substance may be used by immobilizing it on a carrier. The carrier for immobilizing the test substance is not particularly limited as long as it can immobilize the test substance.
上記担体の形状としては、膜状、チップ状、アレイ状、ビーズ状のもの等が挙げられる。上記担体の素材例としては、被検物質を固定化可能な素材であれば特に限定されないが、ポリビニリデンフルオリド、ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。 Examples of the shape of the carrier include a film shape, a chip shape, an array shape, and a bead shape. Examples of the material for the carrier include, but are not limited to, materials that can immobilize a test substance, and examples thereof include polyvinylidene fluoride, nitrocellulose, and nylon.
担体の孔径は、本発明の微粒子の粒子径に合わせて適宜選定すればよい。本発明の微粒子の粒子径よりも大きい孔径の担体を用いることにより、検出感度を向上させることができる。また、担体として、細胞を用いることもできる。即ち、被検物質を細胞表層に発現している細胞を担体として挙げることができ、該細胞は遺伝子組換えにより被検物質を発現するように改変されたものであってもよい。 What is necessary is just to select suitably the hole diameter of a support | carrier according to the particle diameter of the microparticles | fine-particles of this invention. Detection sensitivity can be improved by using a carrier having a pore size larger than that of the fine particles of the present invention. A cell can also be used as a carrier. That is, a cell expressing the test substance on the cell surface can be mentioned as a carrier, and the cell may be modified by gene recombination to express the test substance.
本発明の被検物質の検出法は、ドットブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、サザンブロッティング法、ノザンブロッティング法、等の様々な測定法に適用でき、またラボオンアチップ、イムノクロマトチップ等の形で使用することができる。 The detection method of the test substance of the present invention can be applied to various measuring methods such as dot blotting method, western blotting method, southern blotting method, northern blotting method, etc., and is used in the form of lab-on-a-chip, immunochromatography chip, etc. be able to.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these.
実施例
〔微粒子分散液１〜１４、１６〜１９の調製〕
（コア用ポリマー分散液の合成）
フラスコに酢酸エチル１０ｇを入れ、窒素下で２時間加熱還流した。表１記載の割合でモノマー総量が１０ｇとなる量のモノマーを混合して酢酸エチル（窒素下にて加熱還流済みのもの）１０ｇに溶解し、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．２ｇを加え、これを前記フラスコに２時間かけて滴下し、同温で５時間反応を行い、コア用ポリマー分散液を調製した。このコア用ポリマーのガラス転移点（Ｔｇ）をＤＳＣ法によって測定した。
Examples [Preparation of Fine Particle Dispersions 1-14, 16-19]
(Synthesis of polymer dispersion for core)
The flask was charged with 10 g of ethyl acetate and heated to reflux for 2 hours under nitrogen. Monomers in an amount such that the total monomer amount is 10 g in the ratio shown in Table 1 are dissolved in 10 g of ethyl acetate (heated and refluxed under nitrogen), and 2,2'-azobis (2,4-dimethylvalero) (Nitrile) 0.2 g was added, and this was added dropwise to the flask over 2 hours, followed by reaction at the same temperature for 5 hours to prepare a core polymer dispersion. The glass transition point (Tg) of the core polymer was measured by the DSC method.
（コアシェル型蛍光色素含有の微粒子分散液の調製）
上記コア用ポリマー分散液（固形分１０ｇ）と、表１記載の蛍光性色材１０ｇ、及び酢酸エチル４５ｇをセパラブルフラスコに入れ、フラスコ内をＮ2置換後、撹拌して完全に溶解した。ラウリル硫酸ナトリウム１．９ｇを含む水溶液９０ｇを滴下して撹拌後、超音波分散機ＵＨ−１５０型（（株）エスエムテー製）を用いて３００秒間乳化した。その後、減圧下で酢酸エチルを除去し、蛍光色素を含浸する微粒子を得た。１．５ｇの過硫酸カリウムを加えて溶解し、８０℃に加温後、さらに１．５ｇのスチレン、１．４ｇの２−ヒドロキシエチルメタクリレート及び０．１ｇの２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチルメタクリレートの混合液を滴下しながら７時間反応させて、コアシェル型蛍光色素含有の微粒子分散液を得た。
(Preparation of fine particle dispersion containing core-shell fluorescent dye)
The core polymer dispersion (solid content 10 g), the fluorescent colorant 10 g shown in Table 1, and 45 g of ethyl acetate were placed in a separable flask, and the inside of the flask was replaced with N 2 and stirred to completely dissolve. After 90 g of an aqueous solution containing 1.9 g of sodium lauryl sulfate was dropped and stirred, the mixture was emulsified for 300 seconds using an ultrasonic dispersing machine UH-150 type (manufactured by SMT Co., Ltd.). Thereafter, ethyl acetate was removed under reduced pressure to obtain fine particles impregnated with a fluorescent dye. 1.5 g of potassium persulfate is added and dissolved, and after heating to 80 ° C., 1.5 g of styrene, 1.4 g of 2-hydroxyethyl methacrylate and 0.1 g of 2- (N-isopropylamino) ethyl The mixture was reacted for 7 hours while dropping the mixed solution of methacrylate to obtain a fine particle dispersion containing a core-shell fluorescent dye.
（シェル部に特異的吸着基の付与）
この微粒子分散液に０．２ｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン（テクノケミカル社）と０．４ｇのＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｉｄｅ、縮合剤）を加え、室温で１２時間反応させた後にゲルろ過し、水を加えて１２０ｇに仕上げ、微粒子分散液１〜１４、１６〜１９を得た。
(Addition of specific adsorptive groups to the shell)
To this fine particle dispersion, 0.2 g of sulfo-NHS-biotin (Technochemical Co., Ltd.) and 0.4 g of WSC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbohydride, hydrochloride, condensing agent) are added, and 12 at room temperature. After reacting for a period of time, gel filtration was performed, and water was added to finish to 120 g to obtain fine particle dispersions 1 to 14 and 16 to 19.
〔微粒子分散液１５の調製〕
Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ５０ｇをポリビニルブチラール１０ｇ、酢酸エチル１５０ｇと混合し、０．５ｎｍのジルコニアビーズを体積率で５０％充填したサンドグラインダーを用いて平均粒径６０ｎｍになるまで分散し、遠心分離機で沈降物を除去して分散液を得た。この分散液１２．５ｇにポリビニルブチラール４ｇ及び酢酸エチル３６ｇをセパラブルフラスコに入れ、フラスコ内をＮ2ガスで置換後、撹拌し混合した。ラウリル硫酸ナトリウム１．９ｇを含む水溶液９０ｇを滴下して撹拌後、前記超音波分散機を用いて３００秒間乳化した。その後、減圧下で酢酸エチルを除去し、着色したコア用ポリマー分散液を調製した。このコア用ポリマーのガラス転移点（Ｔｇ）は３０℃であった。
[Preparation of fine particle dispersion 15]
Lumogen Brilliant Yellow 50g is mixed with polyvinyl butyral 10g and ethyl acetate 150g, and dispersed to a mean particle size of 60nm using a sand grinder filled with 0.5% zirconia beads 50% by volume. Was removed to obtain a dispersion. To 12.5 g of this dispersion, 4 g of polyvinyl butyral and 36 g of ethyl acetate were placed in a separable flask, and the inside of the flask was replaced with N 2 gas, followed by stirring and mixing. After 90 g of an aqueous solution containing 1.9 g of sodium lauryl sulfate was dropped and stirred, the mixture was emulsified for 300 seconds using the ultrasonic disperser. Then, ethyl acetate was removed under reduced pressure to prepare a colored core polymer dispersion. The glass transition point (Tg) of the core polymer was 30 ° C.
これに１．５ｇの過硫酸カリウムを加えて溶解し、８０℃に加温後、さらに１．５ｇのスチレン、１．４ｇの２−ヒドロキシエチルメタクリレート及び０．１ｇの２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチルメタクリレートの混合液を滴下しながら７時間反応させ、この液に０．５ｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン（テクノケミカル社）と１ｇのＷＳＣを加え、室温で１２時間反応させた後にゲルろ過し、コアシェル型蛍光顔料含有の微粒子分散液１５を得た。 To this was added 1.5 g of potassium persulfate and dissolved, and after heating to 80 ° C., 1.5 g of styrene, 1.4 g of 2-hydroxyethyl methacrylate and 0.1 g of 2- (N-isopropylamino) were added. ) The mixture was allowed to react for 7 hours while dropping a mixture of ethyl methacrylate, and 0.5 g of sulfo-NHS-biotin (Technochemical Co.) and 1 g of WSC were added to this solution and reacted at room temperature for 12 hours, followed by gel filtration. A core-shell type fluorescent pigment-containing fine particle dispersion 15 was obtained.
〔微粒子分散液２０の調製〕
微粒子分散液１の調製において、シェル部に特異的吸着基の付与を行わずに、水を加えて１２０ｇに仕上げ、微粒子分散液２０を得た。
[Preparation of Fine Particle Dispersion 20]
In the preparation of the fine particle dispersion 1, water was added to finish the fine particle dispersion 20 without adding specific adsorption groups to the shell portion.
〔微粒子分散液の評価〕
各微粒子分散液について下記評価を行った。評価の結果を表２に示す。
[Evaluation of fine particle dispersion]
Each fine particle dispersion was evaluated as follows. The evaluation results are shown in Table 2.
（色素溶出性）
表１に記載の各微粒子分散液を遠心分離にかけて上澄み液を取り出し、蛍光強度を測定した。これを調製直後の溶液と室温で２週間保管したものについて蛍光強度を比較することで、色材の微粒子からの溶出性を判断し、以下の基準で評価した。なお、測定は５回行った。
(Dye elution)
Each fine particle dispersion shown in Table 1 was centrifuged and the supernatant was taken out and the fluorescence intensity was measured. By comparing the fluorescence intensity of the solution immediately after preparation with that stored at room temperature for 2 weeks, the elution from the fine particles of the coloring material was judged and evaluated according to the following criteria. The measurement was performed 5 times.
○：５回の測定で全て、２週間経過後の蛍光強度の値が調製直後の値と同等であった
△：５回の測定のうち１回だけ、２週間経過後の蛍光強度の値が調製直後の値を上回った
×：５回の測定のうち２回以上、２週間経過後の蛍光強度の値が調製直後の値を上回った
○、△が使用可能なレベルである。
○: In all five measurements, the value of fluorescence intensity after 2 weeks was the same as that immediately after preparation. Δ: Only once out of 5 measurements, the value of fluorescence intensity after 2 weeks. The value immediately after the preparation was exceeded. X: The fluorescence intensity value after 2 weeks or more out of 5 measurements exceeded the value immediately after the preparation. ○ and Δ are usable levels.
（分散安定性）
各微粒子分散液を室温で２ヶ月間保存し、目視によって凝集物の有無を判断し、下記基準で評価した。
(Dispersion stability)
Each fine particle dispersion was stored at room temperature for 2 months, visually judged for the presence of aggregates, and evaluated according to the following criteria.
○：凝集物が全く見られない
△：凝集物がわずかに確認できる
×：凝集物が明らかに確認できる
○、△が使用可能なレベルである。
○: No aggregates are observed Δ: Aggregates can be confirmed slightly ×: Aggregates can be clearly confirmed ○, Δ is a usable level.
（被検物質の検出方法への適用）
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ストレプトアビジン結合ビーズ（磁気ビーズ）を被検物質とし、該ビーズの分散液を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、その１０倍希釈液、１００倍希釈液もそれぞれ調製した。被検試料５ｍｌに対し、参照のビオチン化フルオレセイン溶液（２００ｐｍｏｌ／ｍｌ）５ｍｌ、あるいは各微粒子分散液（合成時に用いたビオチン化試薬が全て使われたと仮定して、ビオチン当量が２００ｐｍｏｌ／ｍｌとなるように水を加えて調液した。）５ｍｌと混合し、１時間振盪を行った。その後、磁石を利用してビーズを集め、上澄み５ｍｌだけを取り除き、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：リン酸緩衝生理食塩水）５ｍｌを加えて１５分間振盪し、再び上澄み５ｍｌを取り除いた。この、ＰＢＳを加えて振盪し上澄みを抜く一連の洗浄操作を２回繰り返し、最後にＰＢＳを加えて１０ｍｌの微粒子分散液となるように調製した。その後各試料の蛍光強度を測定し、被検物質が検出可能かどうかを下記基準で評価した。
(Application to detection method of test substance)
In vitrogen streptavidin-bound beads (magnetic beads) were used as test substances, and a dispersion of the beads was prepared at a concentration of 0.2 mg / ml, and a 10-fold diluted solution and a 100-fold diluted solution were also prepared. For 5 ml of the test sample, 5 ml of the reference biotinylated fluorescein solution (200 pmol / ml) or each fine particle dispersion (assuming that all the biotinylation reagents used in the synthesis were used, the biotin equivalent is 200 pmol / ml). The mixture was prepared by adding water as described above.) The mixture was mixed with 5 ml and shaken for 1 hour. Thereafter, the beads were collected using a magnet, and only 5 ml of the supernatant was removed, 5 ml of PBS (phosphate buffered saline) was added and shaken for 15 minutes, and 5 ml of the supernatant was removed again. This series of washing operations in which PBS was added and shaken to remove the supernatant was repeated twice, and finally PBS was added to prepare a 10 ml fine particle dispersion. Thereafter, the fluorescence intensity of each sample was measured, and whether or not a test substance could be detected was evaluated according to the following criteria.
◎：全て検出可能であった
○：１００倍希釈液のみ検出不可で、それ以外は検出可能であった
△：１０倍希釈液と１００倍希釈液が検出不可で、原液のみ検出可能であった
×：全て検出不可であった
◎、○が物質の検出方法として好適に実用できるレベルである。
◎: All were detectable ○: Only the 100-fold diluted solution was not detectable, and the others were detectable △: The 10-fold diluted solution and the 100-fold diluted solution were not detectable, and only the stock solution was detectable X: All were undetectable. A and B are levels that can be suitably used as a method for detecting a substance.
表より、本発明の微粒子分散液は色素の溶出性に問題がなく、きわめて分散安定性が高いことが分かる。また、本発明の微粒子分散液は被検物質の検出方法として好適に用いることができ、検出感度も極めて良好であることが分かる。 From the table, it can be seen that the fine particle dispersion of the present invention has no problem in the dissolution property of the dye and has extremely high dispersion stability. Further, it can be seen that the fine particle dispersion of the present invention can be suitably used as a method for detecting a test substance, and the detection sensitivity is extremely good.
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|---|---|---|---|---|
| JP2011047788A (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-10 | Sysmex Corp | Particle suspension and reagent kit for use in immunoassay |
| WO2019189565A1 (en) * | 2018-03-30 | 2019-10-03 | キヤノン株式会社 | Aqueous liquid composition and aqueous ink |
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2008
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