JP2009171952A - Method for producing sugar - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing sugar.
パルプ等のセルロース含有原料を粉砕して得られるセルロースは、セルロースエーテルの原料、化粧品、食品、バイオマス材料等の工業原料に用いられる。特に近年、環境問題への取り組み等からバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法等でエタノールや乳酸等へ変換する試みがなされている（例えば、特許文献１）。セルラーゼ等の酵素を利用してバイオマスから糖を製造する際には、その前処理工程としてセルロース結晶構造が非晶化されたセルロースにすることが有用である。例えば、特許文献１には、塩化リチウム／ジメチルアセトアミド等のセルロース溶剤を用いてセルロースを非晶化させることが開示されている。
また、パルプを粉砕機で機械的に処理して、セルロースの結晶化度を低減する方法が知られている（例えば、特許文献２〜５参照）。
特許文献２の実施例１及び４には、シート状パルプを振動ボールミル又は二軸押出機で処理する方法が開示され、特許文献３の実施例１〜３には、パルプをボールミルで処理する方法が開示され、特許文献４の実施例１及び２には、パルプを加水分解等の化学的処理をして得られたセルロース粉体を、ボールミルさらには気流式粉砕機で処理する方法が開示され、特許文献５には、パルプを水に分散させた状態で振動ボールミル等の媒体ミルで処理する方法が開示されている。
しかし、これらの方法は、セルロースの結晶化度を低減させるにあたり効率性及び生産性が満足できるものではない。
Cellulose obtained by pulverizing cellulose-containing raw materials such as pulp is used as industrial raw materials such as cellulose ether raw materials, cosmetics, foods, and biomass materials. In recent years, in particular, attempts have been made to produce sugar from biomass materials and to convert it into ethanol, lactic acid, or the like by a fermentation method or the like from efforts to address environmental problems (for example, Patent Document 1). When sugar is produced from biomass using an enzyme such as cellulase, it is useful to use cellulose having an amorphous cellulose crystal structure as a pretreatment step. For example, Patent Document 1 discloses that cellulose is made amorphous by using a cellulose solvent such as lithium chloride / dimethylacetamide.
Moreover, the method of processing a pulp mechanically with a grinder and reducing the crystallinity degree of a cellulose is known (for example, refer patent documents 2-5).
Examples 1 and 4 of Patent Document 2 disclose a method of treating sheet-like pulp with a vibrating ball mill or a twin screw extruder, and Examples 1 to 3 of Patent Document 3 disclose a method of treating pulp with a ball mill. Examples 1 and 2 of Patent Document 4 disclose a method of treating cellulose powder obtained by chemical treatment such as hydrolysis of pulp with a ball mill or an airflow type pulverizer. Patent Document 5 discloses a method of treating a pulp with a medium mill such as a vibrating ball mill in a state where the pulp is dispersed in water.
However, these methods are not satisfactory in efficiency and productivity in reducing the crystallinity of cellulose.
一方、セルロースの糖化方法としては、特定のセルラーゼを用いる方法（特許文献６）、過酸化水素を用いて熱水処理したセルロース又はヘミセルロースを酵素処理する方法（特許文献７及び８）が知られている。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。
On the other hand, as a saccharification method of cellulose, there are known a method using a specific cellulase (Patent Document 6) and a method of hydrolyzing cellulose or hemicellulose treated with hydrogen peroxide (Patent Documents 7 and 8). Yes.
However, these methods are not satisfactory in terms of saccharification efficiency and productivity.
本発明は、セルロース含有原料から得られるセルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを基質としてセルラーゼ等の酵素反応を行うことで、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供することを目的とする。 In the present invention, sugar can be efficiently obtained by performing an enzymatic reaction such as cellulase using a cellulose I type crystallinity reduced from a cellulose-containing raw material as a substrate. It aims at providing the manufacturing method of the outstanding sugar.
本発明者らは、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、かつ平均粒径が０．０１〜１ｍｍのセルロース含有原料を粉砕機で処理した後にセルラーゼ等の酵素反応を行うことにより、前記課題を解決できることを見出した。 The present inventors have solved the above problem by carrying out an enzymatic reaction such as cellulase after treating a cellulose-containing raw material having a bulk density of 100 to 500 kg / m 3 and an average particle diameter of 0.01 to 1 mm with a pulverizer. I found that it can be solved.
すなわち、本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖を得る、糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
That is, the present invention is a method for saccharifying amorphous cellulose prepared from a cellulose-containing raw material having a cellulose I-type crystallinity of more than 33% represented by the following formula (1), the cellulose-containing raw material However, the bulk density is 100 to 500 kg / m 3 , the average particle size is 0.01 to 1 mm, and the cellulose content in the remaining components excluding water from the raw material is 20% by mass or more. The cellulose-containing raw material is treated with a pulverizer to prepare amorphous cellulose having a cellulose I crystallinity reduced to 33% or less, and cellulase and / or hemicellulase is allowed to act on the amorphous cellulose. A method for producing sugar, which obtains sugar.
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the lattice plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). Show
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、セルロース含有原料から、セルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率良く得ることができるので、酵素の反応により糖を効率よく生産することができる。 The method for producing sugar of the present invention is excellent in productivity and can efficiently obtain non-crystalline cellulose with reduced cellulose I-type crystallinity from a cellulose-containing raw material. Can be produced.
本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースのセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該セルロース含有原料が、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものであり、かつ該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上であって、該セルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書において、セルロースのセルロースＩ型結晶化度を単に「結晶化度」ということがある。
The present invention is a method for saccharifying amorphous cellulose prepared from a cellulose-containing raw material having a cellulose I-type crystallinity of more than 33% represented by the following formula (1), wherein the cellulose-containing raw material is: The bulk density is 100 to 500 kg / m 3 , the average particle size is 0.01 to 1 mm, and the cellulose content in the remaining components excluding water from the raw material is 20% by mass or more, A cellulose-containing raw material is treated with a pulverizer to prepare an amorphous cellulose having a cellulose I crystallinity reduced to 33% or less, and cellulase and / or hemicellulase is allowed to act on the amorphous cellulose. It is the manufacturing method of the sugar characterized by obtaining.
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the lattice plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). Show
Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present specification, the cellulose I type crystallinity of cellulose is sometimes simply referred to as “crystallinity”.
〔セルロース含有原料〕
本発明に用いられるセルロース含有原料は、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは６０質量％以上のものである。
本発明に用いられるセルロース含有量とはセルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
前記セルロース含有原料には特に制限はなく、各種木材チップ、剪定枝材、間伐材、枝木材等の木材類；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類；稲わら、とうもろこし茎等の植物茎・葉類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類等が挙げられる。これらの中では、パルプ類、紙類、及び植物茎・葉類が好ましく、パルプ類や紙類がより好ましい。
市販のパルプの場合、水を除いた残余の成分中のセルロース含有量は、一般には７５〜９９重量％であり、他の成分はリグニン等を含む。また市販のシート状パルプのセルロースＩ型結晶化度は、通常６０％以上である。
セルロース含有原料中の水分含量は、２０質量％以下が好ましく、１５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下が特に好ましい。セルロース含有原料中の水分含量が２０質量％以下であれば、容易に粉砕できるとともに、粉砕処理により結晶化度を容易に低下させることができ、その後の酵素処理による糖の生産を効率よく行うことができる。
[Cellulose-containing raw material]
The cellulose-containing raw material used in the present invention has a cellulose content in the remaining components excluding water from the raw material of 20% by mass or more, preferably 40% by mass or more, more preferably 60% by mass or more.
The cellulose content used in the present invention means the total amount of cellulose and hemicellulose.
There is no restriction | limiting in particular in the said cellulose containing raw material, Various wood chips, pruned branch material, thinning material, branch wood, etc .; Wood pulp manufactured from wood, Cotton linter pulp obtained from the fiber around cotton seed Pulps such as newspapers, cardboards, magazines, fine papers, plant stems and leaves such as rice straw and corn stalks; plant shells such as rice husks, palm husks and coconut husks. Among these, pulps, papers, and plant stems / leaves are preferable, and pulps and papers are more preferable.
In the case of commercially available pulp, the cellulose content in the remaining components excluding water is generally 75 to 99% by weight, and other components include lignin and the like. The cellulose I type crystallinity of commercially available sheet-like pulp is usually 60% or more.
The water content in the cellulose-containing raw material is preferably 20% by mass or less, more preferably 15% by mass or less, and particularly preferably 10% by mass or less. If the water content in the cellulose-containing raw material is 20% by mass or less, it can be easily pulverized and the crystallinity can be easily reduced by the pulverization treatment, and the sugar production by the subsequent enzyme treatment is efficiently performed. Can do.
〔セルロースＩ型結晶化度〕
本発明において調製される非晶化セルロースは、セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低下させたものである。結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、下記計算式（１）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
結晶化度が３３％以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、例えば、セルロースエーテルの製造において、アルカリを加えた際にアルカリセルロース化が容易に進行し、結果としてセルロースエーテル化反応の反応転化率を向上させることができる。この観点から、結晶化度としては、２０％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、分析でＩ型結晶が検出されない０％が特に好ましい。なお、計算式（１）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合はセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
[Cellulose type I crystallinity]
The non-crystallized cellulose prepared in the present invention has a cellulose I-type crystallinity reduced to 33% or less. The degree of crystallinity is calculated by the Segal method from the diffraction intensity value by the X-ray diffraction method, and is defined by the following calculation formula (1).
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the grating plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). ]
If the degree of crystallinity is 33% or less, the chemical reactivity of cellulose is improved. For example, in the production of cellulose ether, alkali celluloseization easily proceeds when an alkali is added, resulting in cellulose etherification reaction. The reaction conversion rate can be improved. In this respect, the degree of crystallinity is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and particularly preferably 0% in which no I-type crystal is detected by analysis. The cellulose I type crystallinity defined by the calculation formula (1) may be a negative value in calculation, but in the case of a negative value, the cellulose I type crystallinity is 0%.
ここで、セルロースＩ型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことである。結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は低下する。 Here, the cellulose I type crystallinity is the ratio of the amount of crystal region of cellulose to the total amount. Cellulose type I is a crystalline form of natural cellulose. The degree of crystallinity is also related to the physical and chemical properties of cellulose, and the larger the value, the higher the crystallinity of cellulose and the less non-crystalline parts, so the hardness, density, etc. increase, but elongation, flexibility, Solubility and chemical reactivity in water and solvent decrease.
本発明に用いるセルロース含有原料としては、嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのものである。嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3未満のセルロース含有原料を用いる場合には前処理を行い、嵩密度を１００〜５００ｋｇ／ｍ3にすることが好ましい。
前処理として押出機処理を行うことができる。該押出機へセルロース含有原料を投入する際には、チップ状に粗粉砕しておくことが好ましい。チップ状にしたセルロース含有原料の大きさとしては、好ましくは１〜５０ｍｍ角、より好ましくは１〜３０ｍｍ角である。１〜５０ｍｍ角のチップ状に粗粉砕することにより、押出機処理を効率良く容易に行うことができる。
The cellulose-containing raw material used in the present invention has a bulk density of 100 to 500 kg / m 3 and an average particle size of 0.01 to 1 mm. Bulk density performs preprocessing in the case of using a cellulose-containing raw material of less than 100 kg / m 3, it is preferable that the bulk density of 100 to 500 kg / m 3.
Extruder processing can be performed as pretreatment. When the cellulose-containing raw material is introduced into the extruder, it is preferably coarsely pulverized into chips. The size of the cellulose-containing raw material in the form of chips is preferably 1 to 50 mm square, more preferably 1 to 30 mm square. By roughly crushing into 1-50 mm square chips, the extruder process can be efficiently and easily performed.
セルロース含有原料をチップ状に粗粉砕する方法としては、シュレッダー又はロータリーカッターを使用する方法が挙げられる。ロータリーカッターを使用する場合、得られるチップ状セルロース含有原料の大きさは、スクリーンの目開きを変えることにより、制御することができる。スクリーンの目開きは、１〜５０ｍｍが好ましく、１〜３０ｍｍがより好ましい。スクリーンの目開きが１ｍｍ以上であれば、セルロース含有原料が綿状化することがなく、後の押出機処理に用いるセルロース含有原料として適度な嵩高さを有するセルロース含有原料が得られ取扱い性が向上する。スクリーンの目開きが５０ｍｍ以下であれば、後の押出機処理に用いるセルロース含有原料として適度な大きさを有するために押出機処理において負荷を低減することができる。 Examples of the method for coarsely pulverizing the cellulose-containing raw material into chips include a method using a shredder or a rotary cutter. When using a rotary cutter, the magnitude | size of the chip-shaped cellulose containing raw material obtained can be controlled by changing the opening of a screen. The opening of the screen is preferably 1 to 50 mm, more preferably 1 to 30 mm. If the opening of the screen is 1 mm or more, the cellulose-containing raw material will not be flocculated, and a cellulose-containing raw material having an appropriate bulkiness will be obtained as a cellulose-containing raw material used in the subsequent extruder processing, thereby improving handling. To do. If the opening of the screen is 50 mm or less, since it has an appropriate size as a cellulose-containing raw material used in the subsequent extruder processing, the load in the extruder processing can be reduced.
前記セルロース含有原料を押出機で処理することにより、所望の嵩密度及び平均粒径を有するセルロース含有原料を得ることができる。更に押出機で処理することにより、セルロース含有原料に圧縮せん断力を作用させ、セルロースの結晶構造を破壊して粉末化させることができる。
圧縮せん断力を作用させてセルロース含有原料を機械的に粉砕する方法として、従来よく用いられる衝撃式の粉砕機、例えば、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等では、セルロース含有原料が綿状化して嵩高くなり、取扱い性を損ない、質量ベースの処理能力が低下する。一方、押出機を用いることにより、所望の嵩密度及び平均粒径を有するセルロース含有原料が得られ、取扱い性が向上する。
By processing the cellulose-containing raw material with an extruder, a cellulose-containing raw material having a desired bulk density and average particle diameter can be obtained. Furthermore, by processing with an extruder, a compressive shearing force can be applied to the cellulose-containing raw material, and the crystal structure of cellulose can be destroyed and pulverized.
As a method of mechanically pulverizing a cellulose-containing raw material by applying a compressive shear force, conventionally used impact-type pulverizers such as a cutter mill, a hammer mill, a pin mill, etc., make the cellulose-containing raw material into a cotton-like bulk. Higher, detracting from handleability and lowering mass-based throughput. On the other hand, by using an extruder, a cellulose-containing raw material having a desired bulk density and average particle diameter can be obtained, and handleability is improved.
押出機としては、単軸、二軸のどちらの形式でもよいが、搬送能力を高める等の観点から、二軸押出機が好ましい。
二軸押出機としては、シリンダの内部に２本のスクリューが回転自在に挿入された押出機であり、従来から公知のものが使用できる。２本のスクリューの回転方向は、同一でも逆方向でもよいが、搬送能力を高める観点から、同一方向の回転が好ましい。
また、スクリューの噛み合い条件としては、完全噛み合い、部分噛み合い、非噛み合いの各形式の押出機のいずれでもよいが、処理能力を向上させる観点から、完全噛み合い型、部分噛み合い型が好ましい。
The extruder may be either a single-screw type or a twin-screw type, but a twin-screw extruder is preferable from the viewpoint of increasing the conveyance capability.
The twin screw extruder is an extruder in which two screws are rotatably inserted into a cylinder, and conventionally known ones can be used. The rotation directions of the two screws may be the same or opposite directions, but the rotation in the same direction is preferable from the viewpoint of increasing the conveyance capability.
The screw engagement conditions may be any of full-engagement, partial meshing, and non-meshing extruders. However, from the viewpoint of improving the processing capability, the complete meshing type and the partial meshing type are preferable.
押出機としては、強い圧縮せん断力を加える観点から、スクリューのいずれかの部分に、いわゆるニーディングディスク部を備えることが好ましい。
ニーディングディスク部とは、複数のニーディングディスクで構成され、これらを連続して、一定の位相で、例えば９０°ずつに、ずらしながら組み合わせたものであり、スクリューの回転にともなって、狭い隙間にセルロース含有原料を強制的に通過させることで極めて強いせん断力を付与することができる。スクリューの構成としては、ニーディングディスク部と複数のスクリューセグメントとが交互に配置されることが好ましい。二軸押出機の場合、２本のスクリューが、同一の構成を有することが好ましい。
As an extruder, it is preferable to provide what is called a kneading disk part in any part of a screw from a viewpoint of applying a strong compressive shear force.
The kneading disc part is composed of a plurality of kneading discs, which are combined continuously and shifted in a constant phase, for example by 90 °, with a narrow gap as the screw rotates. An extremely strong shearing force can be imparted by forcibly passing the cellulose-containing raw material. As a configuration of the screw, it is preferable that the kneading disk portion and the plurality of screw segments are alternately arranged. In the case of a twin screw extruder, it is preferable that the two screws have the same configuration.
処理方法としては、セルロース含有原料、好ましくは前記チップ状セルロース含有原料を押出機に投入し、連続的に処理する方法が好ましい。せん断速度としては、１０ｓｅｃ-1以上が好ましく、２０〜３００００ｓｅｃ-1がより好ましく、５０〜３０００ｓｅｃ-1が特に好ましい。せん断速度が１０ｓｅｃ-1以上であれば、有効に高嵩密度化が進行する。その他の処理条件としては、特に制限はなく、好ましくは処理温度５〜２００℃である。
また、押出機によるパス回数としては、１パスでも十分効果を得ることができるが、セルロース含有原料を高嵩密度化する観点から、１パスで不十分な場合は、２パス以上行うことが好ましい。また、生産性の観点からは、１〜１０パスが好ましい。パスを繰返すことにより、粗大粒子が粉砕され、粒径のばらつきが少ない粉末状セルロース含有原料を得ることができる。２パス以上行う場合、生産能力を考慮し、複数の押出機を直列に並べて処理を行ってもよい。
As a treatment method, a method in which a cellulose-containing raw material, preferably the chip-like cellulose-containing raw material is charged into an extruder and continuously processed is preferable. The shear rate is preferably 10 sec -1 or more, more preferably 20~30000sec -1, 50~3000sec -1 is particularly preferred. If the shear rate is 10 sec −1 or more, the bulk density is effectively increased. Other treatment conditions are not particularly limited, and preferably a treatment temperature of 5 to 200 ° C.
Moreover, as the number of passes by the extruder, a sufficient effect can be obtained even with one pass, but from the viewpoint of increasing the bulk density of the cellulose-containing raw material, it is preferable to carry out two passes or more when one pass is insufficient. . Further, from the viewpoint of productivity, 1 to 10 passes is preferable. By repeating the pass, coarse particles are pulverized and a powdery cellulose-containing raw material with little variation in particle size can be obtained. When performing two or more passes, in consideration of production capacity, a plurality of extruders may be arranged in series for processing.
押出機処理後に得られる粉末状セルロース含有原料の平均粒径としては、１ｍｍ以下であり、好ましくは０．７ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下である。この平均粒径が１ｍｍ以下であれば、次工程で行う粉砕機中に供給する際に、粉砕機中にセルロース含有原料を効率的に分散させることができ、長時間を要することなく所定の粒径に到達することができる。一方、この平均粒径の下限としては、生産性の観点から、０．０１ｍｍ以上であり、好ましくは０．０５ｍｍ以上である。これらの観点から、この平均粒径としては、０．０１〜１ｍｍであり、好ましくは０．０１〜０．７ｍｍ、より好ましくは０．０５〜０．５ｍｍである。 The average particle size of the powdered cellulose-containing raw material obtained after the extruder treatment is 1 mm or less, preferably 0.7 mm or less, more preferably 0.5 mm or less. If this average particle size is 1 mm or less, the cellulose-containing raw material can be efficiently dispersed in the pulverizer when it is fed into the pulverizer to be used in the next step. The diameter can be reached. On the other hand, the lower limit of the average particle diameter is 0.01 mm or more, preferably 0.05 mm or more, from the viewpoint of productivity. From these viewpoints, the average particle diameter is 0.01 to 1 mm, preferably 0.01 to 0.7 mm, more preferably 0.05 to 0.5 mm.
また、押出機処理後に得られるセルロース含有原料の嵩密度としては、１００ｋｇ／ｍ3以上であり、好ましくは１２０ｋｇ／ｍ3以上、より好ましくは１５０ｋｇ／ｍ3以上である。この嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3以上であれば、セルロース含有原料が適度な容積を有するために取扱い性が向上する。また、次工程の粉砕機へ原料仕込み量を多くすることができるので、処理能力が向上する。一方、この嵩密度の上限としては、取扱い性及び生産性の観点から、５００ｋｇ／ｍ3以下であり、好ましくは４００ｋｇ／ｍ3以下、より好ましくは３５０ｋｇ／ｍ3以下である。これらの観点から、この嵩密度としては、１００〜５００ｋｇ／ｍ3であり、好ましくは１２０〜４００ｋｇ／ｍ3、より好ましくは１５０〜３５０ｋｇ／ｍ3である。なお、セルロース含有原料の嵩密度及び平均粒径は、実施例に記載の方法により測定することができる。 Further, the bulk density of the cellulose-containing raw material obtained after the extruder treatment is 100 kg / m 3 or more, preferably 120 kg / m 3 or more, more preferably 150 kg / m 3 or more. If this bulk density is 100 kg / m 3 or more, the cellulose-containing raw material has an appropriate volume, so that handleability is improved. Moreover, since the raw material charge amount can be increased to the pulverizer in the next step, the processing capacity is improved. On the other hand, the upper limit of the bulk density is 500 kg / m 3 or less, preferably 400 kg / m 3 or less, more preferably 350 kg / m 3 or less from the viewpoints of handleability and productivity. From these viewpoints, the bulk density is 100 to 500 kg / m 3 , preferably 120 to 400 kg / m 3 , more preferably 150 to 350 kg / m 3 . In addition, the bulk density and average particle diameter of a cellulose containing raw material can be measured by the method as described in an Example.
〔非晶化処理〕
嵩密度が１００〜５００ｋｇ／ｍ3、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのセルロース含有原料を粉砕機で処理して、該セルロース中のセルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減する。粉砕機で処理することにより、セルロース含有原料を更に粉砕し、かつ結晶化度を低下させ、更にはセルロースを効率的に非晶化させることができる。
粉砕機としては媒体式粉砕機を好ましく用いることができる。媒体式粉砕機には容器駆動式粉砕機と媒体撹拌式粉砕機とがある。容器駆動式粉砕機としては転動ミル、振動ミル、遊星ミル、遠心流動ミル等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の観点から、振動ミルが好ましい。媒体撹拌式粉砕機としてはタワーミル等の塔型粉砕機；アトライター、アクアマイザー、サンドグラインダー等の撹拌槽型粉砕機；ビスコミル、パールミル等の流通槽型粉砕機；流通管型粉砕機；コボールミル等のアニュラー型粉砕機；連続式のダイナミック型粉砕機等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の観点から、撹拌槽型粉砕機が好ましい。媒体攪拌式粉砕機を用いる場合の攪拌翼の先端の周速は、好ましくは０．５〜２０ｍ／ｓ、より好ましくは１〜１５ｍ／ｓである。
粉砕機の種類は「化学工学の進歩 第３０集 微粒子制御」（社団法人 化学工学会東海支部編、１９９６年１０月１０日発行、槇書店）を参照することができる。
処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
[Amorphization treatment]
A cellulose-containing raw material having a bulk density of 100 to 500 kg / m 3 and an average particle diameter of 0.01 to 1 mm is processed by a pulverizer to reduce the cellulose I-type crystallinity in the cellulose to 33% or less. By treating with a pulverizer, the cellulose-containing raw material can be further pulverized, the crystallinity can be lowered, and the cellulose can be efficiently amorphousized.
As the pulverizer, a medium pulverizer can be preferably used. The medium type pulverizer includes a container driven pulverizer and a medium stirring pulverizer. Examples of the container-driven crusher include a rolling mill, a vibration mill, a planetary mill, and a centrifugal fluid mill. Among these, a vibration mill is preferable from the viewpoint of high grinding efficiency and productivity. As a medium agitation pulverizer, a tower-type pulverizer such as a tower mill; an agitator-type pulverizer such as an attritor, an aquamizer, and a sand grinder; a distribution tank-type pulverizer such as a visco mill and a pearl mill; For example, a continuous dynamic type pulverizer. Among these, a stirring tank type pulverizer is preferable from the viewpoint of high pulverization efficiency and productivity. In the case of using a medium stirring pulverizer, the peripheral speed of the tip of the stirring blade is preferably 0.5 to 20 m / s, more preferably 1 to 15 m / s.
The type of pulverizer can be referred to “Chemical Engineering Advances 30th Particulate Control” (Chemical Engineering Society, Tokai Branch, issued October 10, 1996, Sakai Shoten).
The processing method may be either a batch type or a continuous type.
粉砕機の媒体の材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
粉砕機が振動ミルであって、媒体がボールの場合には、ボールの外径としては、好ましくは０．１〜１００ｍｍ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍの範囲である。ボールの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ボールのかけら等が混入してセルロース含有原料が汚染されることなく効率的にセルロースを非晶化させることができる。媒体としては、ボール以外にもロッドやチューブ等の媒体を用いることができる。
ボールの充填率は、振動ミルの機種により好適な充填率が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロース含有原料とボールとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの攪拌部の容積に対するボールの見かけの体積をいう。
振動ミルの処理時間としては、振動ミルの種類、ボールの種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは５分〜７２時間である。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
There is no restriction | limiting in particular as a material of the medium of a grinder, For example, iron, stainless steel, an alumina, a zirconia, silicon carbide, a silicon nitride, glass etc. are mentioned.
When the pulverizer is a vibration mill and the medium is a ball, the outer diameter of the ball is preferably 0.1 to 100 mm, more preferably 0.5 to 50 mm. If the size of the balls is in the above range, the desired pulverization force can be obtained, and the cellulose can be efficiently amorphized without contaminating the cellulose-containing raw material by mixing pieces of balls and the like. . As the medium, a medium such as a rod or a tube can be used in addition to the ball.
The filling rate of balls varies depending on the type of vibration mill, but is preferably in the range of 10 to 97%, more preferably 15 to 95%. When the filling rate is within this range, the contact frequency between the cellulose-containing raw material and the ball is improved, and the grinding efficiency can be improved without hindering the movement of the medium. Here, the filling rate refers to the apparent volume of the ball relative to the volume of the stirring portion of the vibration mill.
The treatment time of the vibration mill cannot be determined unconditionally depending on the type of vibration mill, the type of ball, the size, the filling rate, etc., but is preferably 5 minutes to 72 hours from the viewpoint of reducing the crystallinity. Although processing temperature does not have a restriction | limiting in particular, From a viewpoint of preventing deterioration by a heat | fever, Preferably it is 5-250 degreeC, More preferably, it is 10-200 degreeC.
上記の処理方法により、セルロース含有原料を出発原料として、セルロースＩ型結晶化度が３３％以下の非晶化セルロースを効率よく得ることができ、また、粉砕機処理の際に、粉砕機の内部にセルロース含有原料が固着せずに、乾式にて処理することができる。
得られる非晶化セルロースの平均粒径は、この非晶化セルロースを工業原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。特に平均粒径が２５μｍ以上であれば、非晶化セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
By the above processing method, it is possible to efficiently obtain amorphous cellulose having a cellulose I-type crystallinity of 33% or less using a cellulose-containing raw material as a starting raw material. The cellulose-containing raw material does not adhere to the substrate and can be processed by a dry method.
The average particle size of the obtained amorphous cellulose is preferably 25 to 150 μm, more preferably 30 to 100 μm, from the viewpoint of chemical reactivity and handleability when the amorphous cellulose is used as an industrial raw material. In particular, when the average particle size is 25 μm or more, it is possible to suppress the occurrence of “maco” when the non-crystalline cellulose is brought into contact with a liquid such as water.
〔セルラーゼ等の酵素による糖化〕
上述した処理にて得られた非晶化セルロースはその結晶化度が低いためにセルラーゼによる酵素処理により効率よくグルコースもしくは、セロビオース、セロトリオースといったオリゴ糖等の混合物を得ることができる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合等を考慮すると単糖まで分解することが好ましい。ここでいうセルラーゼとはセルロースのβ-1,4-グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼ等と称される酵素の総称である。また、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼを同時に作用させることにより、糖化の効率を上げることが可能である。
[Saccharification with enzymes such as cellulase]
Since the non-crystalline cellulose obtained by the treatment described above has a low crystallinity, it is possible to efficiently obtain a mixture of glucose or oligosaccharides such as cellobiose and cellotriose by enzymatic treatment with cellulase. Considering the case of using it for ethanol fermentation or lactic acid fermentation after saccharification treatment, it is preferable to decompose to monosaccharide. Cellulase as used herein refers to an enzyme that hydrolyzes the glycosidic bond of β-1,4-glucan of cellulose, and is a general term for enzymes called endoglucanase, exoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, and the like. Moreover, it is possible to raise the efficiency of saccharification by making hemicellulases, such as xylanase, act simultaneously.
かかる糖化の処理に使用されるセルラーゼやヘミセルラーゼとしては特に制限はなく、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のものを使用することができる。
セルラーゼの例としてはセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社）等のトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ製剤やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N145（FERM P-19727）株由来のセルラーゼ、またはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N252（FERM P-17474）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N115（FERM P-19726）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N440（FERM P-19728）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N659（FERM P-19730）等の各株由来のセルラーゼ、更にはトリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、アスペルギルス アクレアタス（Aspergillus acleatus）、クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）、クロストリジウム ジョスイ（Clostridium josui）セルロモナス フィミ（Cellulomonas fimi）、アクレモニウム セルロリティクス（Acremonium celluloriticus）、イルペックス ラクテウス（Irpex lacteus）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ等が挙げられる。これらの中で、好ましくはトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼを用いることにより、効率良く糖を製造することができる。
The cellulase and hemicellulase used for the saccharification treatment are not particularly limited, and commercially available cellulase preparations and those derived from animals, plants, and microorganisms can be used.
Examples of cellulases include cellulase preparations derived from Trichoderma reesei such as Cellcrust 1.5L (Novozymes), cellulases derived from Bacillus sp. KSM-N145 (FERM P-19727), or Bacillus SP ( Bacillus sp.) KSM-N252 (FERM P-17474), Bacillus SP ( Bacillus sp.) KSM-N115 (FERM P-19726), Bacillus sp. ( Bacillus sp.) KSM-N440 (FERM P-19728), Bacillus sp (Bacillus sp.) KSM-N659 (FERM P-19730) cellulase from each strain, such as, more Trichoderma viride (Trichoderma viride), Aspergillus Akureatasu (Aspergillus acleatus), Clostridium thermocellum (Clostridium thermocellum), Clostridium Suterukora potassium (Clostridium stercorarium), Clostridium josui (Clostridium josui) Cellulomonas Fimi (Cellulomonas fimi), Acremonium cell Lori caustics (Acremonium celluloriticus), Irupekkusu Rakuteusu (Irpex lacteus), Aspergillus niger (Aspergillus niger), Humicola insolens (Humicola insolens) derived cellulase mixtures and Pyrococcus horikoshii (Pyrococcus horikoshii) from Examples include thermostable cellulase. Of these, sugars can be produced efficiently by using cellulase derived from Trichoderma reesei .
また、ヘミセルラーゼの例としてはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N546（FERM P-19729）由来のキシナラーゼのほか、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）、バチルス アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ、更にはサーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ等が挙げられる。また上記のセルラーゼ混合物中に含まれるヘミセルラーゼ活性を持つ酵素を利用することもできる。
これらの酵素を単独で用いることもできるが、更に効率的な糖の製造にはこれら酵素を組み合わせて用いることが効果的である。またこれらの酵素に対してβ-グルコシダーゼ等の特定のセルラーゼ成分を更に添加することによって糖製造の効率を向上させることもできる。添加するβ-グルコシダーゼの例としてはアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）由来の酵素（例えば、メガザイム社製β-グルコシダーゼ）やアグロバクテリウム（Agrobacterium）、サーモトガ マリチマ（Thermotoga maritima）、トリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）、ペニシリウム エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来の酵素等が挙げられる。
Further, hemicellulase Bacillus sp Examples (Bacillus sp.) KSM-N546 (FERM P-19729) of Kishinaraze from other Aspergillus niger (Aspergillus niger), Trichoderma viride (Trichoderma viride), Humicola insolens (Humicola insolens) , Bacillus alcalophilus (Bacillus alcalophilus) derived from a xylanase, further Thermomyces (Thermomyces), Ou Leo bus Shijiumu (Aureobasidium), Streptomyces (Streptomyces), Clostridium (Clostridium), Thermotoga (Thermotoga), Thermoascus (Thermoascus), Examples thereof include xylanases derived from the genus Caldocellum and Thermomonospora . An enzyme having hemicellulase activity contained in the cellulase mixture can also be used.
Although these enzymes can be used alone, it is effective to use these enzymes in combination for more efficient sugar production. Moreover, the efficiency of sugar production can be improved by further adding a specific cellulase component such as β-glucosidase to these enzymes. Added to β- glucosidase of Aspergillus niger Examples (Aspergillus niger) derived enzymes (e.g., Megazyme Co. β- glucosidase) and Agrobacterium (Agrobacterium), Thermotoga maritima (Thermotoga maritima), Trichoderma reesei (Trichoderma reesei), Examples include enzymes derived from Penicillium emersonii .
上述した処理により得られた非晶化セルロースをセルラーゼによる酵素処理で糖化する場合の反応条件について、前処理により得られた非晶化セルロースの結晶化度や使用する酵素により適宜選択することができる。
例えば、セルラーゼとしてノボザイム社製のセルクラスト１．５Lを使用し、パルプ由来の結晶化度０％のセルロースを基質とする場合は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の基質懸濁液に対してセルクラスト１．５Lを０．００１〜１５％（ｖ／ｖ）（タンパク質として０．０００１７〜２．５％相当）となる様に添加し、ｐH２〜１０（用いる酵素の種類により適当なｐHを選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Lを用いる場合、好ましくはｐH３〜７、特に好ましくはｐH５付近）の緩衝液中、反応温度１０℃〜９０℃（用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Lを用いる場合、好ましくは２０〜７０℃、特に好ましくは約５０℃）で、反応時間３０分〜５日間、好ましくは０．５〜３日間反応させることにより、糖を製造することができる。
About the reaction conditions in the case of saccharifying the non-crystallized cellulose obtained by the process mentioned above by the enzyme process by a cellulase, it can select suitably by the crystallinity of the non-crystallized cellulose obtained by the pre-process, and the enzyme to be used. .
For example, when 1.5 L of cell crust manufactured by Novozyme is used as cellulase and cellulose having a crystallinity of 0% derived from pulp is used as a substrate, the substrate suspension is 0.5 to 20% (w / v). Cell crust 1.5L is added to 0.001-15% (v / v) (corresponding to 0.00017-2.5% as protein), pH 2-10 (appropriate depending on the type of enzyme used) It is preferable to select a pH of 1.5, and when 1.5 liters of cell crust is used, a reaction temperature of 10 ° C. to 90 ° C. (preferably depending on the type of enzyme used) is preferably used in a buffer solution of pH 3 to 7, particularly preferably around pH 5. The reaction is preferably performed at a temperature of 20 to 70 ° C., particularly preferably about 50 ° C. when a cell crust of 1.5 L is used, and the reaction time is 30 minutes to 5 days, preferably 0.5 to 3 days. In Ri, it is possible to produce a sugar.
セルロース含有原料、及び非晶化セルロースの平均粒径、嵩密度及びＸ線回折強度の測定は、下記に記載の方法で行った。また、非晶化セルロースまたは粉末セルロースの糖化反応は、下記に記載の条件により行った。
（１）平均粒径の測定
平均粒径は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置「ＬＡ−９２０」（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。測定条件は、粒径測定前に超音波で１分間処理し、測定時の分散媒体として水を用い、温度２５℃にて測定した。
（２）嵩密度の測定
嵩密度は、ホソカワミクロン株式会社製の「パウダーテスター」を用いて測定した。測定は、ふるいを振動させて、サンプルをシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中のサンプルの質量を測定することにより算出した。ただし綿状化したサンプルについては、ふるいを通さずにシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中のサンプルの質量を測定することにより算出した。
Measurement of the average particle diameter, bulk density, and X-ray diffraction intensity of the cellulose-containing raw material and non-crystallized cellulose was performed by the methods described below. Moreover, the saccharification reaction of non-crystalline cellulose or powdered cellulose was performed under the conditions described below.
(1) Measurement of average particle diameter The average particle diameter was measured using a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring apparatus “LA-920” (manufactured by Horiba, Ltd.). The measurement conditions were that the sample was treated with an ultrasonic wave for 1 minute before the particle size measurement, water was used as a dispersion medium at the time of measurement, and the temperature was measured at 25 ° C.
(2) Measurement of bulk density The bulk density was measured using "Powder Tester" manufactured by Hosokawa Micron Corporation. The measurement was calculated by vibrating the sieve, dropping the sample through a chute, receiving it in a specified container (capacity 100 mL), and measuring the mass of the sample in the container. However, the cotton-like sample was calculated by dropping through a chute without passing through a sieve, receiving it in a specified container (capacity 100 mL), and measuring the mass of the sample in the container.
（３）結晶化度の算出
セルロースＩ型結晶化度は、サンプルのＸ線回折強度を、株式会社リガク製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、前記計算式に基づいて算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ，管電圧：４０ｋｖ，管電流：１２０ｍＡ，測定範囲：２θ＝５〜４５°で測定した。測定用サンプルは面積３２０ｍｍ2×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
(3) Calculation of crystallinity The cellulose I type crystallinity is calculated by measuring the X-ray diffraction intensity of a sample using the “Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer” manufactured by Rigaku Corporation under the following conditions. Calculated based on the formula.
The measurement conditions were X-ray source: Cu / Kα-radiation, tube voltage: 40 kv, tube current: 120 mA, measurement range: 2θ = 5-45 °. The measurement sample was prepared by compressing a pellet having an area of 320 mm 2 × thickness of 1 mm. The X-ray scan speed was measured at 10 ° / min.
（４）水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、「ＦＤ−６１０」）を使用し、１５０℃にて測定を行った。
（５）セルロース含有量の測定
粉砕したサンプルをエタノール・ベンゼン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、さらにエタノールで４時間ソックスレー抽出行って、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５gに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇおよび酢酸０．２ｍＬを加え、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を加えて加温する操作を繰り返し行い、試料が白く脱色するまで３〜４回処理を繰り返した。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求め、下記式によりセルロース含有量を算出した。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／試料採取量（ｇ）］×１００
(4) Measurement of moisture content The moisture content was measured at 150 ° C using an infrared moisture meter ("FD-610", manufactured by Kett Scientific Laboratory).
(5) Measurement of cellulose content The crushed sample was subjected to Soxhlet extraction with ethanol / benzene mixed solvent (1: 1) for 6 hours, and further subjected to Soxhlet extraction with ethanol for 4 hours, and the extracted sample was vacuum-dried at 60 ° C. did. To 2.5 g of the obtained sample, 150 mL of water, 1.0 g of sodium chlorite and 0.2 mL of acetic acid were added, and the mixture was heated at 70 to 80 ° C. for 1 hour. Subsequently, an operation of adding sodium chlorite and acetic acid and heating was repeated, and the treatment was repeated 3 to 4 times until the sample was decolorized white. The white residue was filtered through a glass filter (1G-3), washed with cold water and acetone, dried at 105 ° C. until a constant weight was obtained, the residue weight was determined, and the cellulose content was calculated according to the following formula.
Cellulose content (mass%) = [residue weight (g) / sampled amount (g)] × 100
（６）糖化反応
酵素による糖化反応は以下の様な条件で行った。適当量の粉末セルロースまたは非晶化セルロース基質を３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン（防腐剤として添加）、蓋つきスクリュー管（実施例１及び２、比較例１：No.3, φ21×45ｍｍ マルエム社、実施例３~６、比較例２〜４：No.5, φ27×55ｍｍ マルエム社）に懸濁し、適量の酵素を加えて５０℃で振とう攪拌（１５０ｒｐｍ、タイテック株式会社製恒温振とう機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら１〜３日間反応した。反応終了後、遠心分離（１７，０００×ｇ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、沈殿物の乾燥重量および上清液に遊離した糖量、または還元糖量を、以下に示すフェノール・硫酸法、ＤＮＳ法、またはＨＰＬＣ法によって定量した。また対照として未反応の酵素反応液についても同様の解析を行った。
(6) Saccharification reaction The enzymatic saccharification reaction was carried out under the following conditions. Appropriate amount of powdered cellulose or non-crystallized cellulose substrate was added to 3 mL of enzyme reaction solution (100 mM citrate buffer (pH 5.0), 30 μg / mL tetracycline (added as preservative), screw tube with lid (Examples 1 and 2). Comparative Example 1: No.3, φ21 × 45mm Maruemu, Examples 3-6, Comparative Examples 2-4: No.5, φ27 × 55mm Maruemu)) and suspended at 50 ° C. The reaction was carried out for 1 to 3 days while shaking and stirring (150 rpm, constant temperature shaker “BR-15CF” manufactured by Taitec Co., Ltd.) After completion of the reaction, the precipitate and the top were separated by centrifugation (17,000 × g, 5 minutes). The clear liquid was separated, and the dry weight of the precipitate and the amount of sugar released to the supernatant or the amount of reducing sugar were quantified by the following phenol / sulfuric acid method, DNS method, or HPLC method, and unreacted as a control. of Was subjected to the same analysis applies to the elementary reaction.
（７）フェノール硫酸法（生物工学実験書 培風館）による糖の定量
イオン交換水で適宜倍率に希釈した上清液０．１ｍLに対し、５％（ｗ／ｗ）フェノール溶液０．１ｍLを加えて混合した後、さらに硫酸を０．５ｍL加えて良く混合した。２０分間室温に放置した後、波長４９０ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の全糖量を計算した。
(7) Quantification of sugar by the phenol-sulfuric acid method (Biotechnological Experiment Book Bakufukan) Add 0.1 mL of 5% (w / w) phenol solution to 0.1 mL of the supernatant diluted appropriately with ion-exchanged water. After mixing, 0.5 mL of sulfuric acid was further added and mixed well. After standing at room temperature for 20 minutes, colorimetric determination was performed at a wavelength of 490 nm. The total amount of sugar in the supernatant was calculated from a calibration curve using glucose as the standard sugar.
（８）ＤＮＳ法（生物化学実験法 還元糖の定量法 学会出版センター）による糖の定量
ＤＮＳ溶液（０．５％ ３，５−ジニトロサリチル酸、３０％酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６％水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の還元糖量を計算した。なお、本法では生成糖の種類によりグルコースとは発色の程度が異なるため、以下のＨＰＬＣ法等とは異なる値が得られる場合もある。
(8) Quantification of saccharides by DNS method (Biochemical experiment method Reducing sugar quantification method, Society Publishing Center) DNS solution (0.5% 3,5-dinitrosalicylic acid, 30% sodium potassium tartrate tetrahydrate, 1.6 An appropriate amount of the supernatant was added to 1 mL of (% sodium hydroxide), and the mixture was heated and colored at 100 ° C. for 5 minutes. After cooling, colorimetric determination was performed at a wavelength of 535 nm. The amount of reducing sugar in the supernatant was calculated from a calibration curve using glucose as the standard sugar. In this method, since the degree of color development differs from that of glucose depending on the type of sugar produced, a value different from the following HPLC method and the like may be obtained.
（９）ＨＰＬＣ法による糖の定量
Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステム；カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED４０パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。
(9) Determination of sugar by HPLC method
Dionex DX500 chromatography system; column: CarboPac PA1 (Dionex 4 × 250 mm), detector: ED40 pulsed amperometric detector, eluent: solution A; 100 mM sodium hydroxide solution, solution B; 1M sodium acetate Contains 100 mM sodium hydroxide solution, solution C; ultrapure water was used. From the injection, sugars were analyzed with a linear gradient of 10% initial concentration A solution: 90% C solution, 0-15 minutes, A solution 95%: B solution 5%. 0.01% (w / v) glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylobiose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cellobiose (Seikagaku Corporation) Used).
（１０）タンパク質の定量
DCプロテインアッセイキット（Bio Rad社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
(10) Protein quantification
Using a DC protein assay kit (Bio Rad), the amount of protein was calculated from a calibration curve using bovine serum albumin as a standard protein.
製造例１
〔シュレッダー処理〕
シート状木材パルプ（Borregard社製「Blue Bear Ultra Ether」、８００ｍｍ×６００ｍｍ×１．５ｍｍ、結晶化度８１％、セルロース含有量９６質量％（パルプから水を除いた残余の成分中の量）、水分含量７質量％）、をシュレッダー（株式会社明光商会製、「ＭＳＸ２０００−ＩＶＰ４４０Ｆ」）にかけ、約１０ｍｍ×５ｍｍ×１．５ｍｍのチップ状パルプにした。
Production Example 1
[Shredder treatment]
Sheet wood pulp ("Boreregard""Blue Bear Ultra Ether", 800 mm x 600 mm x 1.5 mm, crystallinity 81%, cellulose content 96 mass% (amount in the remaining components excluding water from the pulp), A moisture content of 7% by mass was applied to a shredder (“MSX2000-IVP440F” manufactured by Meiko Shokai Co., Ltd.) to obtain a chip-like pulp of about 10 mm × 5 mm × 1.5 mm.
〔押出機処理〕
得られたチップ状パルプを二軸押出機（株式会社スエヒロＥＰＭ製、「ＥＡ−２０」）に２ｋｇ／ｈｒで投入し、せん断速度６６０ｓｅｃ-1、スクリュー回転数３００ｒｐｍ、外部から冷却水を流しながら、１パス処理した。なお、前記二軸押出機は、完全噛み合い型同方向回転二軸押出機であり、２列に配置されたスクリューは、スクリュー径４０ｍｍのスクリュー部と、互い違い（９０°）に１２ブロックを組み合わせたニーディングディスク部とを有し、２本のスクリューは、同じ構成を有するものである。また、二軸押出機の温度は、処理にともなう発熱により、３０〜７０℃であった。
押出機処理後に得られたパルプは、平均粒径１２０μｍ、嵩密度２１９ｋｇ／ｍ3であった。
(Extruder processing)
The obtained chip-like pulp was charged into a twin-screw extruder (manufactured by Suehiro EPM, “EA-20”) at 2 kg / hr, and the shear rate was 660 sec −1 , the screw rotation speed was 300 rpm, and cooling water was allowed to flow from the outside. 1 pass processing. The twin-screw extruder is a fully meshing type co-rotating twin-screw extruder, and the screws arranged in two rows are combined with a screw portion having a screw diameter of 40 mm and 12 blocks alternately (90 °). The two screws have the same configuration. The temperature of the twin screw extruder was 30 to 70 ° C. due to heat generated by the treatment.
The pulp obtained after the extruder treatment had an average particle size of 120 μm and a bulk density of 219 kg / m 3 .
〔粉砕機処理〕
得られたパルプを、粉砕機としてバッチ式撹拌槽型粉砕機（五十嵐機械社製「サンドグラインダー」：容器容積８００ｍＬ、５ｍｍφジルコニアビーズを７２０ｇ充填、充填率２５％、攪拌翼径７０ｍｍ）に１３０ｇ投入した。容器ジャケットに冷却水を通しながら、攪拌回転数２０００ｒｐｍで、２．５時間粉砕処理を行い、非晶化セルロースを得た。操作の際の温度は、３０〜７０℃の範囲であった。
処理終了後、撹拌槽型粉砕機内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを前記撹拌槽型粉砕機から取り出し、７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１１７ｇ（投入量の９０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
[Crusher treatment]
130 g of the obtained pulp was put into a batch type stirring tank type pulverizer (“Sand grinder” manufactured by Igarashi Machine Co., Ltd .: container volume 800 mL, filled with 720 g of 5 mmφ zirconia beads, filling rate 25%, stirring blade diameter 70 mm) as a pulverizer. did. While cooling water was passed through the container jacket, pulverization was performed at a stirring rotational speed of 2000 rpm for 2.5 hours to obtain amorphous cellulose. The temperature during operation was in the range of 30-70 ° C.
After the treatment was completed, no fixed pulp or the like was found on the wall surface or bottom of the stirring tank type pulverizer. The obtained non-crystallized cellulose was taken out from the stirred tank type pulverizer and passed through a sieve having an opening of 75 μm. As a result, 117 g (90% by mass of the charged amount) was obtained. By the above method, the average particle size of the obtained sieving product was measured, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 1.
製造例２
製造例１において、バッチ撹拌槽型粉砕機を、バッチ式振動ミル（中央化工機株式会社製「ＭＢ−１」、容器容積２．８Ｌ、２０ｍｍφジルコニアボールを７．６ｋｇ充填、充填率８０％）に代えて、処理条件として投入量２００ｇ、振動数２０Ｈｚ、全振幅８ｍｍ、処理時間４時間としたこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１４２ｇ（投入量の７１質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
Production Example 2
In Production Example 1, a batch stirred tank type pulverizer is a batch type vibration mill (“MB-1” manufactured by Chuo Kako Co., Ltd., container volume 2.8 L, filled with 7.6 kg of 20 mmφ zirconia balls, filling rate 80%) Instead of this, amorphous cellulose was obtained by the same method and conditions as in Production Example 1, except that the amount of treatment was 200 g, the frequency was 20 Hz, the total amplitude was 8 mm, and the treatment time was 4 hours. After completion of the pulverization, no pulp fixed matter was found on the wall or bottom of the vibration mill. The obtained amorphous cellulose was passed through a sieve having an opening of 75 μm. As a result, 142 g (71% by mass of the amount charged) was obtained. By the above method, the average particle size of the obtained sieving product was measured, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 1.
製造例３
製造例１において、バッチ撹拌槽型粉砕機を、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に代えて、処理条件として、投入量１００ｇ、回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理したこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、転動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等は見られなかった。得られた非晶化セルロースを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、６３ｇ（投入量の６３質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
Production Example 3
In Production Example 1, a batch stirring tank type pulverizer is a rolling mill (manufactured by Nippon Ceramic Science Co., Ltd., “Pot Mill ANZ-51S”, container volume 1.0 L, filled with 1.8 mm of 10 mmφ zirconia balls, filling rate 53% In place of), amorphous cellulose was obtained by the same method and conditions as in Production Example 1 except that the treatment was performed for 48 hours under the conditions of an input amount of 100 g and a rotation speed of 100 rpm. After completion of the pulverization, no stuck pulp or the like was found on the wall or bottom of the rolling mill. The obtained amorphous cellulose was passed through a sieve having an opening of 75 μm. As a result, 63 g (63% by mass of the amount charged) was obtained. By the above method, the average particle size of the obtained sieving product was measured, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 1.
製造例４〜８
セルロース含有原料としてパルプに代えて、上質紙（製造例４：セルロース含有量８３質量％、水分含量５．７質量％）、ダンボール（製造例５：セルロース含有量８４質量％、水分含量７．２質量％）、新聞紙（製造例６：セルロース含有量８３質量％、水分含量７．７質量％）、稲わら（製造例７：セルロース含有量５５質量％、水分含量８．０質量％）、雑誌（製造例８：セルロース含有量６０質量％、水分含量４．５質量％）を用いて、製造例１の方法及び条件でシュレッダー処理及び押出機処理を行った。押出機処理後に得られたセルロース含有原料の性状は、それぞれ製造例４：上質紙／平均粒径７１μｍ／嵩密度２７４ｋｇ／ｍ3、製造例５：ダンボール／平均粒径９３μｍ／嵩密度２１６ｋｇ／ｍ3、製造例６：新聞紙／平均粒径６１μｍ／嵩密度３０３ｋｇ／ｍ3、製造例７：稲わら／平均粒径８２μｍ／嵩密度３３９ｋｇ／ｍ3、製造例８：雑誌／平均粒径７２μｍ／嵩密度４３１ｋｇ／ｍ3であった。
更に、製造例１の方法及び条件でバッチ式攪拌槽型粉砕機処理を行い、それぞれ非晶化セルロース（製造例４：上質紙／結晶化度０％／平均粒径５０μｍ、製造例５：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径２８μｍ、製造例６：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ、製造例７：稲わら／結晶化度２％／平均粒径２７μｍ、製造例８：雑誌／結晶化度４％／平均粒径２４μｍ）を得た。
Production Examples 4-8
Instead of pulp as a cellulose-containing raw material, high-quality paper (Production Example 4: Cellulose content 83% by mass, moisture content 5.7% by mass), cardboard (Production Example 5: Cellulose content 84% by mass, moisture content 7.2) Mass%), newspaper (Production Example 6: cellulose content 83% by mass, moisture content 7.7% by mass), rice straw (Production Example 7: cellulose content 55% by mass, moisture content 8.0% by mass), magazine (Production Example 8: Cellulose content 60% by mass, moisture content 4.5% by mass) Using the method and conditions of Production Example 1, shredder treatment and extruder treatment were performed. The properties of the cellulose-containing raw materials obtained after the extruder treatment were as follows: Production Example 4: fine paper / average particle size 71 μm / bulk density 274 kg / m 3 , Production Example 5: cardboard / average particle size 93 μm / bulk density 216 kg / m 3 , Production Example 6: Newspaper / average particle size 61 μm / bulk density 303 kg / m 3 , Production Example 7: rice straw / average particle size 82 μm / bulk density 339 kg / m 3 , Production Example 8: magazine / average particle size 72 μm / The bulk density was 431 kg / m 3 .
Furthermore, the batch-type stirred tank type pulverizer was processed by the method and conditions of Production Example 1 to produce amorphous cellulose (Production Example 4: fine paper / crystallinity 0% / average particle size 50 μm, Production Example 5: cardboard / Crystallinity 0% / average particle size 28 μm, production example 6: newspaper / crystallinity 0% / average particle size 32 μm, production example 7: rice straw / crystallinity 2% / average particle size 27 μm, production example 8 : Magazine / crystallinity 4% / average particle size 24 μm).
比較製造例１
製造例１と同様に、シュレッダー処理、次いで二軸押出機処理を行い、粉砕機処理を行わずに粉末パルプを得た。前記の方法により、得られた粉末パルプの嵩密度及び平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
Comparative production example 1
In the same manner as in Production Example 1, a shredder process and then a twin screw extruder process were performed, and powder pulp was obtained without performing a crusher process. By the above method, the bulk density and average particle diameter of the obtained powder pulp were measured, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 2.
比較製造例２
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、押出機処理を行わずに、前記バッチ式撹拌槽型粉砕機に投入した。前記チップ状パルプは、嵩高く、製造例１の半分の量である６５ｇしか投入することができなかった。投入後、製造例１と同じ条件でバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行い、粉末パルプを得た。処理後の撹拌槽型粉砕機内底部にパルプの固着物が見られた。得られた粉末パルプを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、１６．９ｇ（投入量の２６．０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
Comparative production example 2
A shredder process was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, this chip-like pulp was put into the batch type stirred tank type pulverizer without performing the extruder treatment. The chip-like pulp was bulky, and only 65 g, half the amount of Production Example 1, could be input. After the charging, the batch type stirred tank type pulverizer treatment was performed under the same conditions as in Production Example 1 to obtain powdered pulp. The fixed substance of the pulp was seen in the bottom part in the stirred tank type grinder after the treatment. When the obtained powder pulp was passed through a sieve having an opening of 75 μm, 16.9 g (26.0 mass% of the input amount) was obtained as an undersieved product. By the above method, the average particle size of the obtained sieving product was measured, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 2.
比較製造例３
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、押出機処理を行わずに、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５時間処理した。
得られたパルプは、綿状化し、嵩密度は３３ｋｇ／ｍ3であった。次に、この綿状化したパルプを、前記バッチ式撹拌槽型粉砕機に投入した。このパルプは嵩高く、３０ｇしか投入することができなかった。投入後、製造例１と同じ条件でバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行い、粉末パルプを得た。処理後の撹拌槽型粉砕機内部にパルプの付着物は見られなかった。得られた粉末パルプを７５μｍ目開きの篩をかけたところ、篩下品として、２３．４ｇ（投入量の７８．０質量％）が得られた。前記の方法により、得られた篩下品の平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
Comparative production example 3
A shredder process was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 500 g of this chip-like pulp was put into a cutter mill (manufactured by Dalton Co., “Power Mill P-02S type”) without being subjected to an extruder treatment, and treated for 0.5 hours under the condition of a rotational speed of 3000 rpm. .
The obtained pulp was cotton-like and the bulk density was 33 kg / m 3 . Next, the flocculent pulp was put into the batch type stirred tank type pulverizer. This pulp was bulky and only 30 g could be charged. After the charging, the batch type stirred tank type pulverizer treatment was performed under the same conditions as in Production Example 1 to obtain powdered pulp. No pulp deposits were found inside the stirred tank grinder after the treatment. When the obtained powder pulp was sieved with a 75 μm mesh, 23.4 g (78.0% by mass of the input amount) was obtained as an undersieved product. By the above method, the average particle size of the obtained sieving product was measured, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 2.
比較製造例４
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に１００ｇ投入した。回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理したこと以外は、製造例１と同様の方法及び条件で、転動ミル処理を行った。得られたパルプは、粉末化が起こらず、殆どチップ状のままだった。前記の方法により、得られたパルプのＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
Comparative production example 4
A shredder process was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 100 g of this chip-like pulp is put into a rolling mill (manufactured by Nippon Ceramic Science Co., Ltd., “Pot Mill ANZ-51S”, container volume 1.0 L, 10 mmφ zirconia balls are filled 1.8 kg, filling rate 53%). did. A rolling mill treatment was performed under the same method and conditions as in Production Example 1 except that the treatment was performed for 48 hours under the condition of a rotation speed of 100 rpm. The obtained pulp did not pulverize and remained almost chip-like. By the above method, the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity of the obtained pulp. The results are shown in Table 2.
比較製造例５
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
Comparative Production Example 5
A shredder process was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 500 g of this chip-shaped pulp was put into a cutter mill (manufactured by Dalton Co., Ltd., “Power Mill P-02S type”), and treated for 0.5 hours under the condition of a rotational speed of 3000 rpm. The obtained pulverized product became cottony and could not obtain powdered pulp. By the above method, the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity of the pulverized product obtained. The results are shown in Table 2.
比較製造例６
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、ハンマーミル（株式会社ダルトン製、「ＳＡＭＰＬＥ―ＭＩＬＬ」）に５００ｇ投入し、回転数１３５００ｒｐｍの条件で０．５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
Comparative Production Example 6
A shredder process was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 500 g of this chip-like pulp was put into a hammer mill (manufactured by Dalton Co., Ltd., “SAMPLE-MILL”) and treated for 0.5 hours under the condition of a rotational speed of 13500 rpm. The obtained pulverized product became cottony and could not obtain powdered pulp. By the above method, the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity of the pulverized product obtained. The results are shown in Table 2.
比較製造例７
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、ピンミル（ホソカワミクロン株式会社製、「コロプレックス」）に５００ｇ投入し、回転数１３０００ｒｐｍの条件で０．２５時間処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、粉末パルプを得ることはできなかった。前記の方法により、得られた粉砕品のＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
Comparative Production Example 7
A shredder process was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 500 g of this chip-like pulp was put into a pin mill (manufactured by Hosokawa Micron Corporation, “Coloplex”) and treated for 0.25 hours under the condition of a rotational speed of 13000 rpm. The obtained pulverized product became cottony and could not obtain powdered pulp. By the above method, the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity of the pulverized product obtained. The results are shown in Table 2.
比較製造例８〜１１
製造例４〜７のセルロース含有原料を用いて同様にシュレッダー処理及び押出機処理を行い、次にバッチ式撹拌槽型粉砕機処理を行わずに粉末セルロース（比較製造例８：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較製造例９：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較製造例１０：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ、比較製造例１１：稲わら／結晶化度５４％／平均粒径８２μｍ）を得た。
Comparative production examples 8-11
Using the cellulose-containing raw materials of Production Examples 4 to 7 in the same manner, the shredder treatment and the extruder treatment were performed, and then the powdered cellulose (comparative production example 8: fine paper / crystallization was performed without performing the batch-type stirring tank type pulverizer treatment. 71% / average particle size 71 μm, comparative production example 9: cardboard / crystallinity 71% / average particle size 93 μm, comparative production example 10: newspaper / crystallinity 56% / average particle size 61 μm, comparative production example 11: Rice straw / crystallinity 54% / average particle size 82 μm).
実施例１〜２および比較例１
基質として、実施例１では、前述の製造例１で製造した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径４３μｍ）、実施例２では、前述の製造例１の粉砕機処理の処理時間２.５時間を３０分間に代えた以外は同様に調製した非晶化セルロース（結晶化度３０％／平均粒径４６μｍ）を使用した。比較例１の基質として市販の粉末セルロース（KCフロック、日本製紙ケミカル株式会社製、結晶化度７６％、粒径２６μｍ）を使用した。これらのセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１７％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）中、５０℃で振とう攪拌しながら１〜３日間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、沈殿物の乾燥重量を測定し、上清液の遊離糖をフェノール・硫酸法によって定量（グルコース換算）した。結果を表３に示す。
Examples 1-2 and Comparative Example 1
As a substrate, in Example 1, the non-crystallized cellulose produced in the above-mentioned Production Example 1 (crystallinity 0% / average particle size 43 μm), and in Example 2, the treatment time of the above-mentioned Production Example 1 for the pulverizer. Amorphous cellulose (crystallinity 30% / average particle size 46 μm) prepared in the same manner except that 2.5 hours was replaced with 30 minutes was used. As a substrate for Comparative Example 1, commercially available powdered cellulose (KC Flock, manufactured by Nippon Paper Chemicals Co., Ltd., crystallinity 76%, particle size 26 μm) was used. A saccharification reaction was carried out using these cellulase enzyme preparations (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes). 3 mL of enzyme reaction solution (100 mM citrate buffer (pH 5.0), 1% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.17% protein), 30 μg) / ML tetracycline), the enzyme reaction was carried out for 1 to 3 days with shaking and stirring at 50 ° C. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, the dry weight of the precipitate was measured, and the free sugar in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the phenol / sulfuric acid method. The results are shown in Table 3.
実施例３〜５および比較例２〜４
実施例３〜５として、前述の製造例１の条件で調製した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径４３μｍ）を使用した。比較例２〜４として、前述の比較製造例１の条件で調製した粉末パルプ（結晶化度７６％／平均粒径１５６μｍ）を使用した。これらのセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例３及び比較例２：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例４及び比較例３：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例５及び比較例４：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表４に示す。
Examples 3-5 and Comparative Examples 2-4
As Examples 3 to 5, amorphous cellulose (crystallinity 0% / average particle size 43 μm) prepared under the conditions of Production Example 1 described above was used. As Comparative Examples 2 to 4, powder pulp (crystallinity 76% / average particle size 156 μm) prepared under the conditions of Comparative Production Example 1 described above was used. A saccharification reaction was carried out using these cellulase enzyme preparations (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes). The enzyme reaction was carried out for 3 days with shaking and stirring at 50 ° C. in 0.1 mL of amorphous cellulose or powdered cellulose in 3 mL of the enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was Example 3 and Comparative Example 2: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 3% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 4 and Comparative Example 3: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 1.5% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.25% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 5 And Comparative Example 4: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 0.6% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.1% protein), 30 μg / mL tetracycline. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 4.
実施例６
実施例３で得られた糖化液上清（反応72時間）を、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて以下に示す方法によって分析した。
カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。
注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。グルコースは保持時間約５．５分、キシロースは約６．５分、キシロビオースは約１４分、セロビオースは約１４．５分にピークが現われた。糖化液上清は１００倍希釈し、１０μＬを注入した。結果を表５に示す。
Example 6
The saccharified solution supernatant (reaction 72 hours) obtained in Example 3 was analyzed by the following method using Dionex DX500 chromatography system.
Column: CarboPac PA1 (Dionex 4 × 250 mm), detector: ED40 pulsed amperometric detector, eluent: solution A; 100 mM sodium hydroxide solution, solution B; 100 mM sodium hydroxide solution containing 1M sodium acetate, C Liquid: Ultrapure water was used.
From the injection, analysis was performed with a linear gradient of initial concentration A solution 10%: C solution 90%, 0 to 15 minutes, A solution 95%: B solution 5%. 0.01% (w / v) glucose as standard (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylobiose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cellobiose (Seikagaku Corporation) Used). Glucose showed peaks at a retention time of about 5.5 minutes, xylose at about 6.5 minutes, xylobiose at about 14 minutes, and cellobiose at about 14.5 minutes. The saccharified solution supernatant was diluted 100 times and 10 μL was injected. The results are shown in Table 5.
実施例７〜９及び比較例５〜７
実施例７〜９として、前述の製造例４〜６で得られた非晶化セルロース（実施例７：上質紙／結晶化度０％／平均粒径５０μｍ、実施例８：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径２８μｍ、実施例９：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ）、及び比較例５〜７として、前述の比較製造例８〜１０で得られた粉末セルロース（比較例５：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較例６：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較例７：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例７〜８及び比較例５〜６：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例９及び比較例７：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１２％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質２％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表６に示す。
Examples 7-9 and Comparative Examples 5-7
As Examples 7 to 9, the non-crystallized cellulose obtained in the above Production Examples 4 to 6 (Example 7: fine paper / crystallinity 0% / average particle size 50 μm, Example 8: cardboard / crystallinity) 0% / average particle size 28 μm, Example 9: Newspaper / 0% crystallinity / average particle size 32 μm), and Comparative Examples 5-7 as powdered cellulose obtained in Comparative Production Examples 8-10 (Comparison) Example 5: fine paper / crystallinity 71% / average particle size 71 μm, comparative example 6: cardboard / crystallinity 71% / average particle size 93 μm, comparative example 7: newspaper / crystallinity 56% / average particle size 61 μm ) Was used to carry out a saccharification reaction using a cellulase enzyme preparation (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes). The enzyme reaction was carried out for 3 days with shaking and stirring at 50 ° C. in 0.1 mL of amorphous cellulose or powdered cellulose in 3 mL of the enzyme reaction solution. The enzyme reaction solutions were Examples 7 to 8 and Comparative Examples 5 to 6: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 1.5% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.25% protein) 30 μg / mL tetracycline, Example 9 and Comparative Example 7: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 12% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 2% protein), 30 μg / mL tetracycline . After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 6.
実施例１０及び比較例８
実施例１０として、前述の製造例７で得られた非晶化セルロース（稲わら／結晶化度２％／平均粒径２７μｍ）、及び比較例８として、前述の比較製造例１１で得られた粉末セルロース（稲わら／結晶化度５４％／平均粒径８２μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表７に示す。
Example 10 and Comparative Example 8
As Example 10, the non-crystalline cellulose obtained in the above Production Example 7 (rice straw / crystallinity 2% / average particle size 27 μm) and as Comparative Example 8 obtained in the above Comparative Production Example 11 were obtained. Powdered cellulose (rice straw / crystallinity 54% / average particle size 82 μm) was used to carry out a saccharification reaction with a cellulase enzyme preparation (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes). The enzyme reaction was carried out for 3 days with shaking and stirring at 50 ° C. in 0.1 mL of amorphous cellulose or powdered cellulose in 3 mL of the enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 3% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg / mL tetracycline. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 7.
実施例１１及び１２
実施例１１及び１２として、前述の製造例６及び８で得られた非晶化セルロース（実施例１１：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径３２μｍ、製造例１２：雑誌／結晶化度４％／平均粒径２４μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例１１：１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１２：２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表８に示す。
Examples 11 and 12
As Examples 11 and 12, the amorphized cellulose obtained in the above Production Examples 6 and 8 (Example 11: Newspaper / 0% crystallinity / average particle size 32 μm, Production Example 12: magazine / crystallinity 4) % / Average particle size of 24 μm), and a saccharification reaction was carried out using a cellulase enzyme preparation (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes). The enzyme reaction was carried out for 3 days with shaking and stirring at 50 ° C. in 0.1 mL of amorphous cellulose or powdered cellulose in 3 mL of the enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was Example 11: 100 mM acetate buffer (pH 3.5), 3% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 12: 200 mM Acetate buffer (pH 3.5), 3% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg / mL tetracycline were used. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 8.
表１及び表２から、製造例１〜３の非晶化セルロースの製造方法は、比較製造例１〜７に比べて、セルロースの結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率的に得ることができ、生産性に優れることが分かる。また、製造例１〜３で得られた非晶化セルロースは、比較製造例１に比べて、適度な平均粒径を有していた。
表３及び表４の結果から、実施例１〜５に示した本発明の糖の製造方法は比較例１〜４に比べてその生産性が高く、また表５の結果から生成糖の大部分がグルコースであり、発酵によるエタノールや乳酸の生産のための原料の製造方法として有用であることが分かる。更に表６〜８の結果から本発明の糖の製造方法はパルプのみならず、上質紙、ダンボールや新聞紙等の紙類等、また稲わら等の植物茎・葉類等、各種セルロース含有原料に対して有効であることが分かる。
From Table 1 and Table 2, the manufacturing method of the non-crystallized cellulose of the manufacture examples 1-3 obtains the non-crystallized cellulose which reduced the crystallinity degree of the cellulose efficiently compared with the comparative manufacture examples 1-7. It can be seen that it is excellent in productivity. Further, the amorphous cellulose obtained in Production Examples 1 to 3 had an appropriate average particle size as compared with Comparative Production Example 1.
From the results of Tables 3 and 4, the sugar production methods of the present invention shown in Examples 1 to 5 have higher productivity than Comparative Examples 1 to 4, and from the results of Table 5, most of the produced sugars. Is glucose, and is useful as a raw material production method for producing ethanol or lactic acid by fermentation. Furthermore, from the results shown in Tables 6 to 8, the sugar production method of the present invention is applied not only to pulp but also to various cellulose-containing raw materials such as fine paper, paper such as cardboard and newspaper, and plant stems and leaves such as rice straw. It turns out that it is effective.
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、糖を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸等の発酵生産等に有用である。 The sugar production method of the present invention is excellent in productivity and can efficiently obtain sugar. The obtained sugar is useful for production of fermentation such as ethanol and lactic acid.
Claims (6)
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕 A method of saccharifying amorphous cellulose prepared from a cellulose-containing raw material having a cellulose I-type crystallinity of more than 33% represented by the following formula (1), wherein the cellulose-containing raw material has a bulk density of 100 -500 kg / m 3 , the average particle size is 0.01-1 mm, and the cellulose content in the remaining components excluding water from the raw material is 20% by mass or more, and the cellulose-containing raw material is Manufacture of sugar, which is processed by a pulverizer to prepare amorphous cellulose having a cellulose I crystallinity reduced to 33% or less, and then saccharifies cellulase and / or hemicellulase on the amorphous cellulose. Method.
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the lattice plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). Show
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