JP2009168646A - Specific biomarker for endometriosis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、子宮内膜症に特異的なバイオマーカー及びその利用技術に関する。 The present invention relates to a biomarker specific for endometriosis and a technique for using the same.
子宮内膜症は、出産年齢にある女性のおよそ15%に影響を及ぼしている婦人科疾患であ
る〔Sangi-Haghpeykar H, Poindexter A.N. Epidemiology of endometriosis among parous women., Obstet Gynecol 1995; 85: 983-92(非特許文献１)〕。子宮内膜症は、不妊である女性の30%〜40%で観察される。子宮内膜症は、子宮の外側に子宮内膜腺および基質が存在すること及びそれらが増殖することによって定義されるものである。そして、共通する症状としては、月経困難症、***疼痛症、慢性骨盤痛および不妊である。子宮内膜症の病因は未知であるが、最も一般的な子宮内膜症の開始についての説は、逆行性月経の存在で、それが生存可能な月経の残骸が骨盤臓器および腹膜へ付着し且つ移植されることを可能にしているというものである〔Sampson JA., Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity., Am J Obstet Gynecol, 1927; 14: 422-5(非特許文献２)〕。
Endometriosis is a gynecological disease affecting approximately 15% of women of childbearing age (Sangi-Haghpeykar H, Poindexter AN Epidemiology of endometriosis among parous women., Obstet Gynecol 1995; 85: 983- 92 (Non-Patent Document 1)]. Endometriosis is observed in 30% to 40% of women who are infertile. Endometriosis is defined by the presence of endometrial glands and matrix outside the uterus and their proliferation. Common symptoms are dysmenorrhea, sexual pain, chronic pelvic pain and infertility. The etiology of endometriosis is unknown, but the most common theory for the onset of endometriosis is the presence of retrograde menstruation, where viable menstrual debris adheres to the pelvic organs and peritoneum (Sampson JA., Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity., Am J Obstet Gynecol, 1927; 14: 422-5 (non-patent Reference 2)].
しかしながら、逆行性月経は卵管を持ったすべての女性に生じることが示されており、また、生存可能な子宮内膜細胞は、子宮内膜症を持った女性や子宮内膜症のない女性の両方の腹水において証明されてきている。確かに、逆行性月経は、疾病形成の開始ステップだけであって、細胞のレベルの他の要因と共に疾病進行に導いているもののようである〔Koninckx P.R., Kennedy S, Implantation versus Infiltration: The Samposon versus the Endometriosis Theory., Gynecol. Obstet. Ivest., 1999, 47, 3-10(非特許文献３)〕。また、疾病に対して遺伝学的な感受性があることを示す証拠がある。そして、オーストラリアでの双子の研究で、進行性子宮内膜症の変動の51%が遺伝学的な影響によること
が示唆されている〔Kennedy S.H, Mardon H, Barlow D.H, Familial endometriosis., J Assist. Repord. Gen. 1995, 12, 32-34(非特許文献４); Treloar S.A, O,Connor D.T, O, Connor V. M, Martin N.G., Heritability and molecular genetic studies of endometriosis., Fertil. Steril. 1999,71,701-710(非特許文献５)〕。
However, retrograde menstruation has been shown to occur in all women with fallopian tubes, and viable endometrial cells are found in women with endometriosis and women without endometriosis Has been proven in both ascites. Certainly, retrograde menstruation is only the initiation step of disease formation and seems to lead to disease progression along with other factors at the cellular level (Koninckx PR, Kennedy S, Implantation versus Infiltration: The Samposon versus the Endometriosis Theory., Gynecol. Obstet. Ivest., 1999, 47, 3-10 (Non-patent Document 3)]. There is also evidence that indicates genetic susceptibility to disease. And a twin study in Australia suggests that 51% of changes in progressive endometriosis are due to genetic effects [Kennedy SH, Mardon H, Barlow DH, Familial endometriosis., J Assist Gen. 1995, 12, 32-34; Treloar SA, O, Connor DT, O, Connor V. M, Martin NG, Heritability and molecular genetic studies of endometriosis., Fertil. Steril. 1999, 71, 701-710 (Non-Patent Document 5)].
ダイオキシンのような環境要因に曝されると、子宮内膜症になる傾向がある。また、子宮内膜症は自己免疫疾患であるという幾つかの裏付けがある〔Rier S., Foster W.G., Toxicol. Sci., 2002,70,161-170(非特許文献６); Nothnick w.b., High Fecundity rates following in vitro., Fertil. Steril., 2001, 76, 223-231(非特許文献７); Matarese G., De Placido G., Nikas Y., Alviggi C., Trends Mol. Med., 2003,9,223-228(非特許文献８)〕。患者は、しばしば、子宮内膜症であるとの診断がなされる前には多くの年数
の間、疼痛あるいは不妊の症状をかかえるものである〔Dmowski W.P., Lesniewicz R., Rana N., Pepping P., Noursalehi M., Fertil. Steril. 1997, 67, 238-243(非特許文献
９); Hadfield R., Mardon H., Barlow D., Kennedy S., Hum. Reprod. 1996, 11, 878-880(非特許文献１０)〕。
Exposure to environmental factors such as dioxins tends to cause endometriosis. In addition, there is some support that endometriosis is an autoimmune disease [Rier S., Foster WG, Toxicol. Sci., 2002, 70, 161-170 (Non-patent Document 6); Nothnick wb, High Fecundity rates following in vitro., Fertil. Steril., 2001, 76, 223-231 (Non-Patent Document 7); Matarese G., De Placido G., Nikas Y., Alviggi C., Trends Mol. Med., 2003, 9, 223 -228 (Non-Patent Document 8)]. Patients often have pain or infertility symptoms for many years before being diagnosed with endometriosis [Dmowski WP, Lesniewicz R., Rana N., Pepping P ., Noursalehi M., Fertil. Steril. 1997, 67, 238-243 (Non-Patent Document 9); Hadfield R., Mardon H., Barlow D., Kennedy S., Hum. Reprod. 1996, 11, 878- 880 (Non-Patent Document 10)].
したがって、高い特異性でもっての、子宮内膜症を全面的に早期に発見したりあるいは決定することが必要である。現在のところ、子宮内膜症の診断には手術が必要である。腹腔鏡を用いる手術は、子宮内膜症を評価したり、モニターするためには最も特異的で且つ最も敏感な技術を提供している。しかしながら、微細な子宮内膜症とか目に見えない子宮内膜症では、障害部を視覚化することが出来ないことから、誤診されるかもしれない。加えて、診断のための非侵襲的なテストを開発することによって診断用手術の健康への危険性および社会における金銭的影響力を回避することができるかもしれない。 Therefore, it is necessary to detect or determine endometriosis entirely with high specificity early. Currently, surgery is required to diagnose endometriosis. Laparoscopic surgery provides the most specific and most sensitive technique for assessing and monitoring endometriosis. However, endometriosis that is invisible or invisible may be misdiagnosed because it is impossible to visualize the lesion. In addition, by developing non-invasive tests for diagnosis, it may be possible to avoid the health risks of diagnostic surgery and the financial impact of society.
最近、分析前のサンプル分離および質量分析法(MS)との組合せを劇的に単純化することにより、プロテオミック分析（ゲノムの各遺伝子に対応するすべてのタンパク質についての分析）を促進する新しい戦略が、バイオマーカー発見研究のために導入された〔Fung ET, Wright Jr GL, Dalmasso EA. Proteomic strategies for biomarker identification:
progress and challenges., Curr Opin Mol Ther, 2000; 2: 643-50(非特許文献１１)〕。そのような戦略の一つは、表面増強レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(SELDI-TOF-MS)というものであり、そのSELDI-TOF-MSは、生化学的に別個の蛋白チップアレイ(ProteinChip arrays)に結合させることにより生物検体中の蛋白質を互いに分けるために使
うことができる。
Recently, a new strategy to facilitate proteomic analysis (analysis of all proteins corresponding to each gene in the genome) by dramatically simplifying the combination with pre-analytical sample separation and mass spectrometry (MS) Was introduced for biomarker discovery studies (Fung ET, Wright Jr GL, Dalmasso EA. Proteomic strategies for biomarker identification:
progress and challenges., Curr Opin Mol Ther, 2000; 2: 643-50 (11). One such strategy is surface enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS), which is a biochemically distinct protein chip array. (ProteinChip arrays) can be used to separate proteins in biological samples from each other.
SELDIのプロファイリングは、卵巣癌、乳癌、前立癌腺および肝臓癌をコントロール（
対照検体）から識別する為に使用されて成功している〔Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer., Lancet, 2002; 359: 572-7(非特許文献１２); Rai AJ, Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al. Proteomic approaches to tumor marker discovery., Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 1518-26(非特許文献１３); Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer., Clin Chem, 2002; 48: 1296-304(非特許文献１４); Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD,
Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men., Cancer Res, 2002; 62: 3609-14(非特許文献１５); Petricoin III EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer., J Natl Cancer Inst, 2002;94:1576-8(非特許文献１６); Poon TC, Yip TT, Chan AT, Yip C, Yip V, Mok TS, et al. Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes., Clin Chem, 2003; 49: 752-60(非特許文献１７)〕。
SELDI profiling controls ovarian, breast, prostate and liver cancers (
(Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer., Lancet , 2002; 359: 572-7 (12); Rai AJ, Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al. Proteomic approaches to tumor marker discovery., Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 1518-26; Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW.Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer., Clin Chem, 2002; 48 : 1296-304 (Non-Patent Document 14); Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD,
Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men., Cancer Res, 2002; 62: 3609-14 (Non-Patent Document 15); Petricoin III EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer., J Natl Cancer Inst, 2002; 94: 1576-8 (Non-Patent Document 16); Poon TC, Yip TT, Chan AT, Yip C, Yip V, Mok TS, et al. Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes., Clin Chem, 2003; 49: 752-60 Reference 17)].
また、尿の膀胱癌のマーカーを発見すること使用されて成功する〔Vlahou A, Schellhammer PF, Mendrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine., Am J Pathol, 2001; 158: 1491-502(非特許文献１８)〕のと同様に、また膵液の膵臓癌のマーカーを確認することに使用されて成功している〔Rosty C, Christa
L, Kuzdzal S, Baldwin WM, Zahurak ML, Carnot F, et al. Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology., Cancer Res, 2002; 62: 1868-75(非特許文献１９)〕。加えて、非小細胞肺癌組織サンプルで見られたプロテオミクスパターンにより、肺癌患者の生存率を予測することが可能であることが示されている〔Yanagisawa K, Shyr Y, Xu BJ, Massion PP, Larsen PH, White BC, et al. Proteomic patterns of tumour subsets in non-small-cell lung cancer., Lancet, 2003;362: 433-9(非特許文献２０)〕。
It has also been successfully used to discover markers of bladder cancer in the urine (Vlahou A, Schellhammer PF, Mendrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine., Am J Pathol, 2001; 158: 1491-502 (Non-patent Document 18)], and also successfully used to confirm markers of pancreatic cancer in pancreatic juice Rosty C, Christa
L, Kuzdzal S, Baldwin WM, Zahurak ML, Carnot F, et al. Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas / pancreatitis associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology., Cancer Res, 2002; 62: 1868 -75 (Non-Patent Document 19)]. In addition, the proteomic pattern seen in non-small cell lung cancer tissue samples has been shown to be able to predict survival in lung cancer patients [Yanagisawa K, Shyr Y, Xu BJ, Massion PP, Larsen PH, White BC, et al. Proteomic patterns of tumour subsets in non-small-cell lung cancer., Lancet, 2003; 362: 433-9 (Non-patent Document 20)].
現在まで、子宮内膜症に対する非侵襲的な診断的検査法を開発する探究は、ほとんどサイトカインと生長因子の値に集中していた。こうしたことにも拘わらず、子宮内膜症に対する非侵襲的な診断検査の開発にまでには至っていない。
現在、プロテオミック技術（ゲノムの各遺伝子に対応するすべてのタンパク質の構造・機能についての研究）を利用して、その疾病に対する潜在的に可能性を有するバイオマーカーである蛋白質を同定確認しようとする試みが行われている。プロテオミクス技術にお
ける最近の進歩により、複雑な生物の検体から新規バイオマーカーを同定確認することが可能になった。例えば、チヤンHら(Zhang H, et al.)は、二次元電気泳動(2-DE)、ウェスタンブロット法および質量分析法を含めたプロテオミック技術を使用して、子宮内膜症の患者と正常コントロール群との間で発現の異なっている蛋白質をスクリーニングし、同定確認することを行っている〔Zhang H, Niu Y.D, Feng J, et al. "Use of proteomic analysis of endometriosis to identify different protein expression in patients with
endometriosis versus normal controls. " Fertil. Steril. 2006; 86: 274-282(非特
許文献２１)〕。また、リュウら(H Liu, et al.)は、SELDI-TOF-MSを用いた血漿タンパクプロファイリングによる子宮内膜症の検出について検討を行い、子宮内膜症群の血漿に20種の異なる蛋白のピークを認めること、そしてその中で質量電荷比m/z値が、3956.83、11710.70、及び、6,986.45の３つの蛋白ピークを選択し、当該３つの蛋白ピーク（m/z値: 3956.83、11710.70、及び、6,986.45）を使用しての子宮内膜症の検出をし、高い感度（36例中32例; 88.9％）及び高い特異性（32例中28例; 87.5％）が示されること、そして、未知群とされているセットについてこの診断モデルを適用した場合に、同様の感度及び特異性、すなわち、感度87.5％と特異性85.7％が示されたとしている〔Haiyuan Liu et al., "Detection of endometriosis with the use of plasma protein profiling by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry." Fertil. Steril. 2007; 87: 988-990(非特許文献２２)〕。
To date, the quest to develop non-invasive diagnostic tests for endometriosis has focused mostly on cytokine and growth factor values. Despite this, the development of non-invasive diagnostic tests for endometriosis has not been achieved.
Currently, proteomic technology (research on the structure and function of all proteins corresponding to each gene in the genome) is used to identify and confirm proteins that are potentially biomarkers for the disease. An attempt is being made. Recent advances in proteomic technology have made it possible to identify and confirm new biomarkers from complex biological specimens. For example, Zhang H, et al. Used proteomic techniques including two-dimensional electrophoresis (2-DE), Western blotting, and mass spectrometry to identify patients with endometriosis. Proteins that are expressed differently from normal control groups are screened and identified (Zhang H, Niu YD, Feng J, et al. "Use of proteomic analysis of endometriosis to identify different protein expression in patients with
Fertil. Steril. 2006; 86: 274-282 (Non-Patent Document 21)]. Also, H Liu et al. (H Liu, et al.) developed plasma protein profiling using SELDI-TOF-MS. The detection of endometriosis by the endometriosis group, the plasma of the 20 endometriosis groups, 20 different protein peaks are recognized, among which the mass to charge ratio m / z value is 396.883, 11710.70, and Three protein peaks of 6,986.45 were selected and endometriosis was detected using the three protein peaks (m / z values: 3956.83, 11710.70, and 6,986.45), and high sensitivity (32 of 36 cases) 88.9%) and high specificity (28 of 32 cases; 87.5%), and similar sensitivity and specificity when this diagnostic model is applied to a set that is in the unknown group, That is, the sensitivity of 87.5% and specificity of 85.7% are indicated [Haiyuan Liu et al., “Detection of endometriosi s with the use of plasma protein profiling by surface-enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry. "Fertil. Steril. 2007; 87: 988-990 (Non-patent Document 22)].
子宮内膜症は、頻度の高い婦人科疾患であり、不妊症や骨盤痛を引き起こす。よって、子宮内膜症を、早期に発見したり、さらには、高い特異性でもって発見したり、あるいは、決定するといった診断のための手法を開発することが必要である。子宮内膜症は、腹腔鏡を用いる手術といった侵襲的な手技により内膜腺組織や間質組織を組織学的に同定することで診断されるが、子宮内膜症を非侵襲的な手法で、かつ、簡単で、例えば、血清などの血液検体を使用しても、子宮内膜症を的確に診断できる方法が求められている。また、子宮癌などの癌疾患と子宮内膜症とを十分に区別して診断できる技術の開発は急務である。現在に至るまで、信頼が置けて、非侵襲的な手法で、簡単であり、免疫学的な検査手法開発への道筋を提供するような子宮内膜症の検出並びにモニタリング手法は開発できていない。 Endometriosis is a common gynecological disease that causes infertility and pelvic pain. Therefore, it is necessary to develop a method for diagnosis such as detecting endometriosis at an early stage, or detecting or determining it with high specificity. Endometriosis is diagnosed by histologically identifying intimal gland tissue and stromal tissue by invasive procedures such as laparoscopic surgery, but endometriosis is a non-invasive technique. There is also a need for a simple method that can accurately diagnose endometriosis even when blood samples such as serum are used. In addition, there is an urgent need to develop a technique capable of sufficiently distinguishing and diagnosing cancer diseases such as uterine cancer and endometriosis. To date, no reliable, non-invasive, simple, endometriosis detection and monitoring techniques have been developed that provide a path to the development of immunological testing techniques. .
本発明者等は、子宮内膜症の診断に有効で且つより簡単な測定系の構築を目指して、子宮内膜症に特異的なバイオマーカーにつき鋭意研究を行った。その中で、子宮内膜症用として可能な診断用バイオマーカーを発見し確認するために、表面増強レーザー脱離イオン化/電離飛行時間型質量分析(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: SELDI-TOF-MS)を使用して、子宮内膜症患者からの血清サンプ
ルおよび子宮内膜症でない者のコントロールを解析した。その結果、子宮内膜症の検知およびモニター用潜在的可能性を有するバイオマーカーを発見することに成功した。
The present inventors conducted extensive research on biomarkers specific to endometriosis with the aim of constructing a simpler measurement system that is effective in diagnosing endometriosis. In order to discover and confirm possible diagnostic biomarkers for endometriosis, surface-enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry: SELDI-TOF-MS) was used to analyze serum samples from patients with endometriosis and controls of those without endometriosis. As a result, we have successfully discovered biomarkers with potential for detection and monitoring of endometriosis.
本発明は、対象における子宮内膜症(endometriosis)を診断するための子宮内膜症に特
異的なバイオマーカーを提供する。当該バイオマーカーは、子宮内膜症診断において新規であり、タンパク質と考えられる。該バイオマーカーは、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSで測定するとき、単一で80％以上の感度、好ましくは単一で85％以上の感度、および80％以上の特異性、好ましくは85％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカー、例えば、子宮内膜症の患者から得られる子宮内膜症に特異的で、SELDI-TOF-MSで測定する時、質量電荷比(m/z値)、すなわち、分子量が、そ
れぞれ、約5830、約6516、約8865、又は、約9022にピークを有するバイオマーカー、特には、子宮内膜症の患者血清中から得られる子宮内膜症に特異的で、SELDI-TOF-MSで測定する時、質量電荷比(m/z値)、すなわち、分子量が、それぞれ、約5830、又は、約8865にピ
ークを有するバイオマーカー、さらには、子宮内膜症の患者腹水中から得られる子宮内膜症に特異的で、SELDI-TOF-MSで測定する時、質量電荷比(m/z値)、すなわち、分子量が、
それぞれ、約6516、又は、約9022にピークを有する単数又は複数のバイオマーカーである。当該バイオマーカーは、単一のもので子宮内膜症の診断を行い、高い感度及び高い特異性を与えるものであり、さらに僅か二つのバイオマーカーからなる子宮内膜症診断モデルを構築可能であり、当該モデルは非常に高い感度及び高い特異性を与えるものである。
The present invention provides a biomarker specific for endometriosis for diagnosing endometriosis in a subject. The biomarker is novel in endometriosis diagnosis and is considered a protein. The biomarker has a significantly different value before and after endometriosis surgery, when measured with SELDI-TOF-MS, a single sensitivity of 80% or higher, preferably a single sensitivity of 85% or higher, and Biomarkers specific for endometriosis having a specificity of 80% or more, preferably 85% or more, such as specific for endometriosis obtained from patients with endometriosis, SELDI- When measured by TOF-MS, the mass-to-charge ratio (m / z value), i.e., a biomarker having a peak at about 5830, about 6516, about 8865, or about 9022, respectively, in particular, intrauterine Specific to endometriosis obtained from the serum of patients with membrane disease, when measured by SELDI-TOF-MS, the mass-to-charge ratio (m / z value), i.e. the molecular weight, is approximately 5830, respectively, or Biomarker having a peak at about 8865, and endometriosis obtained from the ascites of patients with endometriosis To, when measured at SELDI-TOF-MS, mass-to-charge ratio (m / z values), i.e., molecular weight,
One or more biomarkers having a peak at about 6516 or about 9022, respectively. This biomarker diagnoses endometriosis with a single one, gives high sensitivity and high specificity, and can construct an endometriosis diagnosis model consisting of only two biomarkers The model gives very high sensitivity and high specificity.
本発明は、対象における子宮内膜症を診断するための方法を提供する。該方法は、(a)
対象からサンプル（試料）を得る工程、(b)質量分析によりサンプル中のタンパク質を分
析する工程、(c) サンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程を含んでいる。さらに、該方法は、測定サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料または陰性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでいてよい。
本発明はまた、子宮内膜症の治療における薬物又は治療処置の有効性を評価するための方法を提供する。該方法は、(a)子宮内膜症を患っている対象から第１のサンプルを得る
工程、(b)質量分析により第１のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c)第１のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、ある
いは、対象の患部を除去するなどの治療処置を行う工程、(e)工程(d)の完了後、対象から第２のサンプルを得る工程、(f)質量分析により第２のサンプル中のタンパク質を分析す
る工程、(g)第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、及び(h)第１のサンプルの質量スペクトルプロファイルを第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでいる。
The present invention provides a method for diagnosing endometriosis in a subject. The method comprises (a)
Obtaining a sample from the object, (b) analyzing the protein in the sample by mass spectrometry, and (c) measuring the mass spectral profile of the sample. Further, the method may include the step of comparing the mass spectral profile of the measurement sample with the mass spectral profile of the positive standard sample or the negative standard sample.
The present invention also provides a method for assessing the effectiveness of a drug or therapeutic treatment in the treatment of endometriosis. The method comprises the steps of (a) obtaining a first sample from a subject suffering from endometriosis, (b) analyzing the protein in the first sample by mass spectrometry, (c) the first sample Measuring the mass spectrum profile of (d) administering a drug to the subject, or performing a therapeutic treatment such as removing the affected area of the subject, (e) after completing step (d), Obtaining two samples, (f) analyzing the protein in the second sample by mass spectrometry, (g) measuring the mass spectral profile of the second sample, and (h) measuring the first sample. Comparing the mass spectral profile with the mass spectral profile of the second sample.
本発明は、次なる態様を提供している。
〔１〕子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルであり、該モデルは、対象の血清サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830のピーク
と分子量(m/z値)が約8865のピークとの二つのピークからなるもので、該モデルでもって
の、対象の血清サンプルについての非子宮内膜症と子宮内膜症との識別診断において、少なくとも80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
〔２〕対象の血清サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830のピークと分子量(m/z値)が約8865のピークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルを使用して診断し、子宮内膜症診断において少なくとも85％以上の感度および少なくとも85％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
〔３〕対象の腹水サンプルをSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約6516のピークと分子量(m/z値)が約9022のピークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルを使用して診断し、子宮内膜症診断において少なくと
も80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与えることを特徴とする子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル。
〔４〕非子宮内膜症と子宮内膜症との間及び／又は子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なるバイオマーカーであり、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、子宮内膜症診断において単一で少なくとも80％以上の感度および少なくとも80％以上の特異性を与え且つ非子宮内膜症と子宮内膜症との識別及び／又は子宮内膜症手術の治療効果の判断に有用なバイオマーカー。
〔５〕子宮内膜症診断において単一で少なくとも85％以上の感度および少なくとも85％以上の特異性を与える上記〔４〕に記載のバイオマーカー。
〔６〕SELDI-TOF-MS測定時の分子量(m/z値)が、約5830である上記〔４〕又は〔５〕に
記載のバイオマーカー。
〔７〕SELDI-TOF-MS測定時の分子量(m/z値)が、約8865である上記〔４〕又は〔５〕に
記載のバイオマーカー。
〔８〕(a)対象からサンプルを得る工程、(b)質量分析によりサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c) サンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程を含んでおり、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のバイオマーカーモデルを使用するか、あるいは、上記〔４〕〜〔７〕のいずれか一記載のバイオマーカーを子宮内膜症診断の指標とすることを特徴とする対象における子宮内膜症を検出又はモニターする方法。
〔９〕(a)子宮内膜症を患っている対象から第１のサンプルを得る工程、(b)質量分析により第１のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(c)第１のサンプルの質量スペクト
ルプロファイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、あるいは、対象の患部を
除去するなどの治療処置を行う工程、(e)工程(d)の完了後、対象から第２のサンプルを得る工程、(f)質量分析により第２のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(g)第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、及び(h)第１のサンプルの質量ス
ペクトルプロファイルを第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでおり、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のバイオマーカーモデルを使用するか、あるいは、上記〔４〕〜〔７〕のいずれか一記載のバイオマーカーを子宮内膜症診断の指標とすることを特徴とする子宮内膜症の治療における薬物又は治療処置の有効性を評価する方法。
The present invention provides the following aspects.
[1] A biomarker model specific for endometriosis, which has a molecular weight (m / z value) of about 5830 when a serum sample of interest is measured using a SELDI-TOF-MS system. It consists of two peaks, a peak and a peak with a molecular weight (m / z value) of about 8865. With this model, the diagnosis of non-endometriosis and endometriosis in the subject serum sample A biomarker model specific for endometriosis characterized by providing at least 80% sensitivity and at least 80% specificity.
[2] When measuring the serum sample of interest using the SELDI-TOF-MS system, there are two peaks: a peak with a molecular weight (m / z value) of about 5830 and a peak with a molecular weight (m / z value) of about 8865. Diagnosed using a peak discrimination model of non-endometriosis and endometriosis, characterized by at least 85% sensitivity and at least 85% specificity in endometriosis diagnosis Biomarker model specific to endometriosis.
[3] When measuring an ascites sample of interest using the SELDI-TOF-MS system, there are two peaks: a peak with a molecular weight (m / z value) of about 6516 and a peak with a molecular weight (m / z value) of about 9022 It is diagnosed by using a discrimination model of non-endometriosis and endometriosis consisting of peaks, and is characterized by giving at least 80% sensitivity and at least 80% specificity in endometriosis diagnosis Biomarker model specific to endometriosis.
[4] A biomarker with significantly different values between non-endometriosis and endometriosis and / or before and after endometriosis surgery, when measured using the SELDI-TOF-MS system, Provide a single sensitivity of at least 80% or more and specificity of at least 80% or more in the diagnosis of endometriosis and distinguish between non-endometriosis and endometriosis and / or therapeutic effect of endometriosis surgery A useful biomarker for judgment.
[5] The biomarker according to [4] above, which gives a sensitivity of at least 85% or more and specificity of at least 85% or more in the diagnosis of endometriosis.
[6] The biomarker according to [4] or [5] above, wherein the molecular weight (m / z value) at the time of SELDI-TOF-MS measurement is about 5830.
[7] The biomarker according to [4] or [5] above, wherein the molecular weight (m / z value) at the time of SELDI-TOF-MS measurement is about 8865.
[8] (a) a step of obtaining a sample from a subject, (b) a step of analyzing a protein in the sample by mass spectrometry, (c) a step of measuring a mass spectrum profile of the sample, The biomarker model according to any one of [3] is used, or the biomarker according to any one of [4] to [7] is used as an index for diagnosing endometriosis A method of detecting or monitoring endometriosis in a subject.
[9] (a) obtaining a first sample from a subject suffering from endometriosis, (b) analyzing the protein in the first sample by mass spectrometry, (c) analyzing the first sample A step of measuring a mass spectral profile; (d) a step of administering a drug to the subject or performing a therapeutic treatment such as removing an affected area of the subject; (e) a second step from the subject after completion of step (d). (F) analyzing the protein in the second sample by mass spectrometry, (g) measuring the mass spectral profile of the second sample, and (h) the mass of the first sample. A step of comparing the spectral profile with the mass spectral profile of the second sample, using the biomarker model according to any one of [1] to [3] above, or the above [4] to [[ 7] How biomarkers to evaluate the efficacy of a drug or therapeutic treatment in the treatment of endometriosis, characterized by an index of endometriosis diagnosed according.
本発明で子宮内膜症を検知したり、手術後のモニタリングのための潜在的に可能性を有するバイオマーカーが提供される。特には、子宮内膜症血清および腹水用バイオマーカーとして有用性が高く、高い精度、高い感度、そして高い特異性で子宮内膜症と非子宮内膜症とを識別するものであり、子宮内膜症の診断および手術後の微小転移性病態のモニタリングを容易にする。子宮内膜症を非侵襲的な手法で、かつ、簡単で、例えば、血清などの血液検体を使用しても、子宮内膜症を的確に診断できる方法や技術を提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
The present invention provides potentially potential biomarkers for detecting endometriosis and post-surgical monitoring. In particular, it is highly useful as a biomarker for endometriosis serum and ascites, and distinguishes endometriosis from non-endometriosis with high accuracy, high sensitivity, and high specificity. Facilitates diagnosis of membrane disease and monitoring of micrometastatic pathology after surgery. Provided are a method and a technique for diagnosing endometriosis in a non-invasive manner and in a simple manner and capable of accurately diagnosing endometriosis even when a blood sample such as serum is used.
Other objects, features, excellence and aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following description. However, it is understood that the description of the present specification, including the following description and the description of specific examples and the like, show preferred embodiments of the present invention and are presented only for explanation. I want. Various changes and / or modifications (or modifications) within the spirit and scope of the present invention disclosed herein will occur to those skilled in the art based on the following description and knowledge from other parts of the present specification. Will be readily apparent. All patent documents and references cited herein are cited for illustrative purposes and are not to be construed as a part of this specification. is there.
本発明は、プロテオミック解析の手法を利用し、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; SELDI-TOF-MS)により、子宮内膜症の患者から得られた血清中に発見され
た子宮内膜症に特異的なバイオマーカー及び／又は腹水中に発見された子宮内膜症に特異的なバイオマーカーに関する。当該子宮内膜症特異的バイオマーカーは、分子量は、質量電荷比m/z値が約5830である。子宮内膜症の診断には、腹腔鏡手術前グループの血清蛋白
に含まれるm/z比5830のタンパク質は術後グループのそれと比較して有意に高いというこ
とである。術前サンプルの正味のピーク強度は、10,593±5,458であるのに対し、術後サ
ンプルのピーク強度は、1,891±1,019であった（約5.6倍，p<0.001）。この血清蛋白（m/z比:5830）の感度及び特異性は、それぞれ89.65%（26/29）、100%（29/29）であった。またこのピークは健康女性ボランティアでは検出されなかった。当該子宮内膜症特異的バイオマーカーの別のものは、分子量は、質量電荷比m/z値が約8865である。子宮内膜症の診
断には、腹腔鏡手術前グループの血清蛋白に含まれるm/z比8865のタンパク質は術後グル
ープのそれと比較して有意に高いということである。また、当該子宮内膜症特異的バイオマーカーの別のものは、分子量は、質量電荷比m/z値が約6516である。子宮内膜症の診断
には、腹腔鏡手術前グループの腹水蛋白に含まれるm/z比6516のタンパク質は術後グルー
プのそれと比較して有意に高いということである。さらにまた、当該子宮内膜症特異的バイオマーカーの別のものは、分子量は、質量電荷比m/z値が約9022である。子宮内膜症の
診断には、腹腔鏡手術前グループの腹水蛋白に含まれるm/z比9022のタンパク質は術後グ
ループのそれと比較して有意に低いということである。
The present invention utilizes a method of proteomic analysis, by surface-enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS). The present invention relates to a biomarker specific to endometriosis found in serum obtained from a patient with endometriosis and / or a biomarker specific to endometriosis found in ascites. The endometriosis-specific biomarker has a molecular weight of about 5830 in mass to charge ratio m / z value. For the diagnosis of endometriosis, the m / z ratio 5830 protein contained in the serum protein of the laparoscopic preoperative group is significantly higher than that of the postoperative group. The net peak intensity of the preoperative sample was 10,593 ± 5,458, whereas the peak intensity of the postoperative sample was 1,891 ± 1,019 (about 5.6 times, p <0.001). The sensitivity and specificity of this serum protein (m / z ratio: 5830) were 89.65% (26/29) and 100% (29/29), respectively. This peak was not detected in healthy female volunteers. Another of the endometriosis-specific biomarkers has a molecular weight of about 8865 with a mass to charge ratio m / z value. For the diagnosis of endometriosis, the protein of m / z ratio 8865 contained in the serum protein of the group before laparoscopic surgery is significantly higher than that of the group after surgery. Another endometriosis-specific biomarker has a molecular weight of about 6516 with a mass-to-charge ratio m / z value. For the diagnosis of endometriosis, the protein with m / z ratio 6516 contained in the ascites protein of the laparoscopic preoperative group is significantly higher than that of the postoperative group. Furthermore, another of the endometriosis-specific biomarkers has a molecular weight of about 9022 with a mass to charge ratio m / z value. For the diagnosis of endometriosis, the protein of m / z ratio 9022 contained in the ascites protein of the laparoscopic preoperative group is significantly lower than that of the postoperative group.
当技術分野で「プロテオーム」(proteome)とは、ある生物学的な系において存在するタンパク質の総体をいっており、したがって、生体サンプル中に存在する全てのタンパク質およびペプチド配列を一時に採取することを、当技術分野でプロテオームと呼ばれることが多い。生物学的な系とは組織や生物種、細胞の状態などを指す。このように、本発明の方法は、特定のサンプルのプロテオームを分析する手段を提供する。プロテオームを扱う解析をプロテオミクス(proteomics)と言う。
当業者であれば、生体サンプルに存在するタンパク質のプロテオミクス解析とは、サンプル中の全てのペプチド配列の系統的な分離、同定、および特徴付けを含むことを理解するであろう。サンプル中のタンパク質は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により分離されることができる。適切な方法としては、例えば、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられる。好ましくは、サンプル中のタンパク質は、ゲル電気泳動（例えば、一次元または二次元ゲル電気泳動）を用いて分離される。最も好ましくは、サンプル中のタンパク質は、サンプルを二次元ゲル電気泳動(2DGE)に付すことによって分離されることができる。2DGEは、典型的には、等電点分離法(IEF)を用いた電荷による一次元でのタンパク質の分離を含むものであ
ってよい。電荷で分離して集められたタンパク質は、その後、SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いてサイズにより二次元で分離されることができる（例えば、Lin, D., et al., Large-scale protein identification using mass spectrometry, Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics, 1646, 1-10 (2003)、およびOng, S. E. et al., An
evaluation of the use of two-dimensional gel electrophoresis in proteomics, Biomol. Eng., 18, 195-205 (2001)参照）。
In the art, “proteome” refers to the total amount of proteins present in a biological system, and therefore, the collection of all protein and peptide sequences present in a biological sample at a time. Are often referred to in the art as proteomes. Biological systems refer to tissues, biological species, cell states, and the like. Thus, the method of the present invention provides a means to analyze the proteome of a particular sample. Analysis that handles proteomes is called proteomics.
One skilled in the art will appreciate that proteomic analysis of proteins present in a biological sample includes systematic separation, identification, and characterization of all peptide sequences in the sample. Proteins in the sample can be separated by any suitable method known in the art. Suitable methods include, for example, centrifugation, ion exchange chromatography, reverse phase liquid chromatography, gel electrophoresis and the like. Preferably, the proteins in the sample are separated using gel electrophoresis (eg, one-dimensional or two-dimensional gel electrophoresis). Most preferably, the proteins in the sample can be separated by subjecting the sample to two-dimensional gel electrophoresis (2DGE). 2DGE may typically include one-dimensional protein separation by charge using isoelectric focusing (IEF). Proteins separated and collected by charge can then be separated in two dimensions by size using SDS-polyacrylamide gels (eg, Lin, D., et al., Large-scale protein identification using mass spectrometry, Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics, 1646, 1-10 (2003), and Ong, SE et al., An
evaluation of the use of two-dimensional gel electrophoresis in proteomics, Biomol. Eng., 18, 195-205 (2001)).
サンプル中のタンパク質の分離に続いて、各々のタンパク質は分離媒体から単離されることができる。タンパク質は、ゲルからタンパク質「スポット」を抽出するなどの、任意の適切な手法を用いて単離されることができる。ゲルからのタンパク質スポットの抽出は、典型的には、ゲルからのスポットの物理的に切除することが挙げられる。
サンプル中のタンパク質は分離せしめられ、その一旦分離せしめられたタンパク質は、本発明の方法で、質量分析により分析される。質量分析において、物質は、分子をフラグメント化するのに充分なエネルギーを有する電子ビームで照射処理される。生じた陽性フラグメント（陽イオンおよびラジカル陽イオン）は、磁場を介して真空で加速され、質量電荷比(m/z)に基づいて選別される。質量分析計において生じるイオンの多くは単位正電
荷を保有するので、値m/zは典型的には、フラグメントの分子量に等しい。任意の適切な
質量分析法が、本発明の方法と一緒に用いられ得る。適切な質量分析法の例には、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析(MALDI)、マトリクス支援レーザー脱離／イオ
ン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析、プラズマ脱離／イオン化質量分析(PDI)、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI)、および表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型(SELDI-TOF)質量分析などが挙げられる。質量分析の飛行時間型(TOF)法において、荷電分
子（イオン化された分子）が真空で生じ、イオン光学アセンブリーによって生じた電場により自由飛行チューブにより、又は、ドリフト時間により加速される。分子が加速されるであろう速度は、加速電位の平方根、分子の電荷の平方根に比例し、分子の質量の平方根に反比例する。荷電分子は、TOFチューブの下方に移動し、検出器に至る。さらに、質量
分析法は、例えば、国際特許出願公開第WO 93/24834号パンフレット、米国特許第5,792,664号明細書、米国特許第6,558,902号明細書、米国特許出願公開第2004/0033530Al、及びHillenkamp et al., Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach
to Mass Spectroscopy of Large Biomolecules, Biological Mass Spectroscopy, A.L. Burlingame and J.A. McCloskey, eds., Elsevier Science Publ. (1990)、例えば、同書のpp. 49-60に記載されている。
Following separation of the proteins in the sample, each protein can be isolated from the separation medium. The protein can be isolated using any suitable technique, such as extracting protein “spots” from the gel. Extraction of protein spots from the gel typically includes physical excision of the spots from the gel.
The protein in the sample is separated, and the once separated protein is analyzed by mass spectrometry in the method of the present invention. In mass spectrometry, a substance is irradiated with an electron beam having sufficient energy to fragment molecules. The resulting positive fragments (cations and radical cations) are accelerated in vacuum via a magnetic field and sorted based on mass to charge ratio (m / z). The value m / z is typically equal to the molecular weight of the fragment, since many of the ions generated in a mass spectrometer carry a unit positive charge. Any suitable mass spectrometry method can be used with the methods of the present invention. Examples of suitable mass spectrometry methods include matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI), matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, plasma desorption / ionization mass spectrometry (PDI) ), Electrospray ionization mass spectrometry (ESI), and surface enhanced laser desorption / ionization time-of-flight (SELDI-TOF) mass spectrometry. In time-of-flight (TOF) methods of mass spectrometry, charged molecules (ionized molecules) are generated in a vacuum and accelerated by a free flight tube or by a drift time by an electric field generated by an ion optical assembly. The speed at which a molecule will be accelerated is proportional to the square root of the accelerating potential, the square root of the charge of the molecule, and inversely proportional to the square root of the mass of the molecule. The charged molecule moves down the TOF tube and reaches the detector. Further, mass spectrometry methods are described, for example, in International Patent Application Publication No. WO 93/24834, U.S. Pat.No. 5,792,664, U.S. Pat. ., Matrix Assisted UV-Laser Desorption / Ionization: A New Approach
to Mass Spectroscopy of Large Biomolecules, Biological Mass Spectroscopy, AL Burlingame and JA McCloskey, eds., Elsevier Science Publ. (1990), for example, pp. 49-60 of the same book.
本発明の好ましい実施態様においては、サンプル中のタンパク質は、質量分析技術、例えば、SELDI-TOF質量分析により分析される。本発明において使用するための好ましい質
量分析技術は、SELDIに基づく手法で、例えば、米国特許第5,719,060号明細書、米国特許第6,225,047号明細書などに記載されている。サンプル、特には分析対象物（ここでは、
一以上のバイオマーカー）をエネルギー源に提示するという働きをする基板の表面（一般的には、プローブの表面）は、脱離／イオン化過程において能動的な役割を果たしており、そうした過程を表面増強脱離／イオン化過程と呼んでいる。本明細書中、「プローブ」とは、イオン化およびガス相をイオン分光計（例えば、質量分光計）へ導入するためのデバイスであって、プローブ界面と結合するように適合されたデバイス、そして、分析対象物をイオン化のためのエネルギーに提示するために適合されたデバイスをいう。プローブとしては、代表的に、可撓性または剛性の固体基板などが挙げられ、そのものは、分析対象物がイオン化エネルギーに提示されるところのサンプル提示表面を有する。この点で、基板（例えば、プローブ）は、サンプル提示のための単なる受け皿となる台ではない。幾つかのタイプの表面増強基板が、表面増強脱離／イオン化過程で使用されることができる。一実施態様において、当該表面は、所定のクラスの分子に優先的に結合する親和性材料、例えば、陰イオン交換基または親水基（例えば、酸化ケイ素）のような親和性材料を含む。つまり、化学選択性又は化学親和性を有する表面を持ったプローブが使用される。
In a preferred embodiment of the invention, the protein in the sample is analyzed by mass spectrometry techniques such as SELDI-TOF mass spectrometry. Preferred mass spectrometry techniques for use in the present invention are described in SELDI-based techniques, for example, in US Pat. No. 5,719,060, US Pat. No. 6,225,047, and the like. Samples, especially analytes (here:
The surface of the substrate (typically, the surface of the probe), which serves to present one or more biomarkers) to the energy source, plays an active role in the desorption / ionization process and enhances this process. This is called desorption / ionization process. As used herein, a “probe” is a device for introducing ionization and gas phase into an ion spectrometer (eg, a mass spectrometer) that is adapted to bind to a probe interface; and A device adapted to present an analyte to energy for ionization. Probes typically include a flexible or rigid solid substrate or the like, which itself has a sample presentation surface where the analyte is presented to the ionization energy. In this regard, the substrate (eg, probe) is not a mere pedestal for sample presentation. Several types of surface enhanced substrates can be used in the surface enhanced desorption / ionization process. In one embodiment, the surface includes an affinity material that preferentially binds to a given class of molecules, such as an anion exchange group or a hydrophilic group (eg, silicon oxide). That is, a probe having a surface having chemical selectivity or chemical affinity is used.
このような親和性材料としては、吸着性物質（吸着剤）を挙げルことができ、クロマトグラフィーで代表的に使用される物質である「クロマトグラフィー吸着剤」などが包含されてよく、例えば、イオン交換物質、金属キレート剤、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、混合様式吸着剤（例えば、疎水性の誘引／静電反発性吸着剤）など、抗原と抗体間の相互作用、リガンドとレセプｔ−間の相互作用などの生体分子間で見出される親和性相互作用を利用できる物質などが挙げられる。該親和性材料の例としては、られる。例えば、親水性、疎水性、固定化金属キレート（配位共有結合性）、陰イオン性、陽イオン性、あるいは抗体などの生体特異性などを利用する物質などが挙げられる。より具体的には、該親和性材料の例としては、例えば、シラノール(
親水性)、C8またはC16アルキル（疎水性）、固定化金属キレート（配位共有）、陰イオンまたは陽イオン交換体（イオン性）あるいは抗体（生体特異性）などが挙げられる。サンプルは、特定の誘引力の原則に従ってアナライト分子（分析対象分子）に結合するように、担体に結合せしめられた吸着体に接触せしめられる。
Examples of such affinity materials include adsorptive substances (adsorbents), and may include “chromatography adsorbents” which are substances typically used in chromatography. Ion exchange materials, metal chelators, immobilized metal chelates, hydrophobic interaction sorbents, hydrophilic interaction sorbents, dyes, mixed mode sorbents (eg, hydrophobic attractant / electrostatic repulsion sorbents), etc. Examples include substances that can utilize affinity interactions found between biomolecules, such as interactions between antigens and antibodies, and interactions between ligands and receptors t-. Examples of the affinity material are: Examples thereof include substances utilizing hydrophilicity, hydrophobicity, immobilized metal chelate (coordinating covalent bond), anionicity, cationicity, or biospecificity such as antibodies. More specifically, examples of the affinity material include silanol (
Hydrophilic), C 8 or C 16 alkyl (hydrophobic), immobilized metal chelate (coordination coordination), anion or cation exchanger (ionic) or antibody (biospecificity). The sample is brought into contact with an adsorbent bound to a carrier so that it binds to an analyte molecule (analyte molecule) according to the principle of specific attraction.
分析対象物が生体分子（例えば、タンパク質）の場合、通常、プローブ表面に化学結合されるエネルギー吸収性物質（又は、エネルギー吸収分子）を含んでいるプローブを使用
することが包含される。エネルギー吸収性物質は、レーザー脱離イオン化源からエネルギーを吸収し、その後、この物質（又は、この分子）と接触した分析対象物分子の脱離およびイオン化に寄与することが可能であるものであり、MALDIに使用される場合、しばしば
「マトリックス」と呼ばれる。当該マトリックスとしては、例えば、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸(SPA)、シアノ-ヒドロキシ-ケイ皮酸(CHCA)、ジヒドロキシ安息香酸、フェルラ
酸、ヒドロキシアセト-フェノン誘導体などが挙げられる。該エネルギー吸収性物質は、
典型的には、結合せしめられたサンプルと一緒になる。その後、分析対象物を脱離およびイオン化するのにレーザーが用いられ、脱離およびイオン化された生成物を検出器で検出する。SELDI-TOF質量分析について、各タンパク質ピークに対する質量精度は、+/-0.2%あるいはそれ以下にすることができる。SELDI-TOF質量分析システムは、例えば、Ciphergen
Biosystems, Inc.(Fremont, CA)から市販されている。表面増強脱離／イオン化法は、例えば、米国特許第5,719,060号明細書、米国特許第6,294,790号明細書、米国特許第6,406,921号明細書、米国特許第6,675,104号明細書、国際特許出願公開第WO 98/59360号パンフ
レットなどに記載されている。
When the analyte is a biomolecule (eg, protein), it is usually included to use a probe containing an energy absorbing substance (or energy absorbing molecule) that is chemically bonded to the probe surface. An energy absorbing material is one that can absorb energy from a laser desorption ionization source and then contribute to the desorption and ionization of analyte molecules that are in contact with this material (or this molecule). , When used in MALDI, often referred to as “matrix”. Examples of the matrix include cinnamic acid derivatives, sinapinic acid (SPA), cyano-hydroxy-cinnamic acid (CHCA), dihydroxybenzoic acid, ferulic acid, hydroxyaceto-phenone derivatives, and the like. The energy absorbing material is
Typically, it comes with a bound sample. Thereafter, a laser is used to desorb and ionize the analyte, and the desorbed and ionized product is detected by a detector. For SELDI-TOF mass spectrometry, the mass accuracy for each protein peak can be +/− 0.2% or less. SELDI-TOF mass spectrometry system, for example, Ciphergen
Commercially available from Biosystems, Inc. (Fremont, CA). Surface enhanced desorption / ionization methods are described, for example, in US Pat. No. 5,719,060, US Pat. No. 6,294,790, US Pat. No. 6,406,921, US Pat. No. 6,675,104, International Patent Application Publication No. WO 98. It is described in the / 59360 pamphlet.
典型的な態様では、サンプルは、「バイオチップ」を使用して分析される。本用語「バイオチップ」は、吸着性物質（吸着剤、又は、捕捉用試薬）が結合され且つ一般に平面を有する固体基板を指している。しばしば、バイオチップの表面は、複数のアドレス可能な位置を含むものであり、各位置は、そこに結合された捕捉用試薬を有している。バイオチップは、プローブ表面に結合可能なようにされることができ、それにより、質量分光計へ挿入されることができるプローブとして機能することができる。
本発明で使用可能な、バイオマーカーの捕捉のための種々のバイオチップは、Ciphergen Biosystems (Fremont, CA, USA), Packard BioScience Company (Meriden CT, USA), Zyomyx (Hayward, CA, USA)、Phylos (Lexington, MA, USA)などの販売業者から購入可能
である。これらバイオチップの例は、米国特許第6,225,047号明細書、米国特許第6,329,209号明細書、国際特許出願公開第WO 99/51773号パンフレット、国際特許出願公開第WO 00/56934号パンフレットなどに記載されている。
In an exemplary embodiment, the sample is analyzed using a “biochip”. The term “biochip” refers to a solid substrate to which an adsorbent material (adsorbent or capture reagent) is bound and generally has a flat surface. Often, the surface of a biochip includes a plurality of addressable locations, each location having a capture reagent coupled thereto. The biochip can be made attachable to the probe surface, thereby functioning as a probe that can be inserted into a mass spectrometer.
Various biochips for capture of biomarkers that can be used in the present invention are Ciphergen Biosystems (Fremont, CA, USA), Packard BioScience Company (Meriden CT, USA), Zyomyx (Hayward, CA, USA), Phylos (Lexington, MA, USA). Examples of these biochips are described in U.S. Patent No. 6,225,047, U.S. Patent No. 6,329,209, International Patent Application Publication No. WO 99/51773, International Patent Application Publication No. WO 00/56934, etc. ing.
吸着剤などの親和性材料を有する基板は、バイオマーカーが、この吸着剤などの捕捉用試薬の位置する部位に結合するように提示されるに十分な期間、血清、腹水などのサンプルと接触せしめられる。インキュベーション期間後、この基板を、洗浄し、未結合物質を除去する。任意の適切な洗浄溶液が使用され得、好ましくは、水溶液が使用される。
次いでエネルギー吸収性物質が、結合バイオマーカーを伴う基板へ適用される。上記したように、エネルギー吸収性物質は、レーザー脱離イオン化のためのエネルギー源からエネルギーを吸収するものであり、それによって基板からバイオマーカーの脱離を補助する。
基板に結合するバイオマーカーは、質量分光計中で検出される。このバイオマーカーは、レーザーのようなイオン化源によってイオン化され、生じたイオンは、イオン光学アセンブリによって回収され、次いで質量分析器が、通過するイオンを分散せしめて、分析する。次いで検出器は、質量対電荷の割合へと、検出したイオンの情報を翻訳する。バイオマーカーの検出は、代表的に、シグナル強度の検出を含む。従って、バイオマーカーの量(quantity)と質量(mass)の両方が、測定することができる。
A substrate with an affinity material such as an adsorbent is contacted with a sample such as serum or ascites for a period of time sufficient for the biomarker to be presented to bind to the site where the capture reagent such as the adsorbent is located. It is done. After the incubation period, the substrate is washed to remove unbound material. Any suitable cleaning solution can be used, preferably an aqueous solution is used.
An energy absorbing material is then applied to the substrate with the bound biomarker. As described above, the energy absorbing substance absorbs energy from an energy source for laser desorption ionization, thereby assisting desorption of the biomarker from the substrate.
Biomarkers that bind to the substrate are detected in a mass spectrometer. This biomarker is ionized by an ionization source such as a laser, and the resulting ions are collected by an ion optics assembly, and then a mass analyzer disperses and analyzes the passing ions. The detector then translates the detected ion information into a mass to charge ratio. Biomarker detection typically includes detection of signal intensity. Thus, both the quantity and mass of the biomarker can be measured.
質量分析により得られたデータは、プログラム可能なコンピューターの使用により解析されることができる。このコンピュータープログラムは、データを解析し、検出されたマーカーの種別及び／又は数を示し、必要に応じて検出された各バイオマーカーについてのシグナル強度および決定された分子量を示すことができる。データ解析は、バイオマーカーのシグナル強度を決定する工程および予め決定された統計学的分布からはずれるデータを取り除く工程を包含していてよい。例えば、観察されたピークは、ある基準に対する各ピークの高さを計算することによって標準化されることもできる。この基準は、機器およ
び一定尺度に応じてゼロとして設定されたエネルギー吸収性物質のような化学薬品によって生じたバックグラウンドノイズを包含していてよい。
生じたデータを表示のため、種々のフォーマットへ変換するには、コンピューターを使用することができる。有用なフォーマットの一つでは、標準的なスペクトルを表示することが可能である一方で、スペクトル図にあるピークの高さおよび質量の情報のみを、そのままに保持しながら、よりきれいな画像を生成し、より容易に見られるようにして、ほぼ同一の分子量を有するバイオマーカーを使用することを可能にするものであってよい。別の有用なフォーマットでは、二つ以上のスペクトルが比較され、独特のバイオマーカーを都合よく強調し、このバイオマーカーを、サンプル間でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるものであってよい。これらのフォーマットのいずれかを使用して、当業者はサンプル中に特有のバイオマーカーが存在するか否かを容易に決定することができる。
Data obtained by mass spectrometry can be analyzed by use of a programmable computer. This computer program can analyze the data, indicate the type and / or number of markers detected, and optionally indicate the signal intensity and determined molecular weight for each detected biomarker. Data analysis may include determining the signal intensity of the biomarker and removing data that deviates from a predetermined statistical distribution. For example, the observed peaks can be normalized by calculating the height of each peak relative to a certain reference. This criterion may include background noise caused by chemicals such as energy absorbing materials set as zero depending on the instrument and certain scale.
A computer can be used to convert the resulting data into various formats for display. One useful format allows you to display a standard spectrum, while still keeping only the peak height and mass information in the spectrum diagram, producing a cleaner image. It may make it easier to see and use biomarkers with approximately the same molecular weight. In another useful format, two or more spectra can be compared to conveniently highlight a unique biomarker that can be up-regulated or down-regulated between samples. Using any of these formats, one skilled in the art can readily determine whether a unique biomarker is present in the sample.
データを解析するために使用されたソフトウェアは、シグナルの解析にアルゴリズムを適用するコードを含み、シグナル中に本発明によるバイオマーカーに対応するピークを示すか否かを決定する。このソフトウェアはまた、観察されたバイオマーカーピークに関するデータを分類樹、又は、ファジィ推論やニューラルネットワークといった計算知能と呼ばれる手法に供し、子宮内膜症の診断を示すバイオマーカーのピークまたはバイオマーカーのピークの組み合わせが存在するか否かを決定することができる。 The software used to analyze the data includes code that applies the algorithm to the analysis of the signal and determines whether the signal shows a peak corresponding to the biomarker according to the present invention. The software also provides data about observed biomarker peaks to a classification tree or a technique called computational intelligence, such as fuzzy inference or neural networks, to show biomarker peaks or biomarker peaks that indicate a diagnosis of endometriosis. It can be determined whether or not there exists a combination.
質量分析解析の出力結果は、サンプル中のタンパク質の質量電荷比(m/z)の関数として
の相対強度のプロットであり、それは「質量スペクトルプロファイル」または「質量スペクトル」と称される。典型的には、タンパク質「ピーク」を示すヒストグラムとして表される質量スペクトルプロファイルは、分子量の確定に役立つもので、そして化合物の構造の解析に利用される。このように、本発明の方法は、サンプルの質量スペクトルプロファイルを測定することを含む。スペクトルにおける最も強いピークは、基準ピークといわれ、そして全ての他のピークは、基準ピークの強度と比較して記録される。ピーク自体は、典型的には、非常に鋭く、そして単に垂直線として表されることが多い。
The output of the mass spectrometry analysis is a plot of relative intensity as a function of the mass to charge ratio (m / z) of the protein in the sample, which is referred to as the “mass spectral profile” or “mass spectrum”. Typically, a mass spectral profile, expressed as a histogram showing protein “peaks”, helps to determine the molecular weight and is used to analyze the structure of the compound. Thus, the method of the present invention includes measuring a mass spectral profile of a sample. The strongest peak in the spectrum is referred to as the reference peak, and all other peaks are recorded relative to the intensity of the reference peak. The peaks themselves are typically very sharp and are often represented simply as vertical lines.
質量分析の間にサンプル中のタンパク質のフラグメント化により形成されるイオンは、タンパク質分子により形成される最も安定な陽イオンおよびラジカル陽イオンである。スペクトルにおいて観察される最も高い分子量ピークは、典型的には、電子を差し引いた親分子を表し、そして分子イオン(M+)と呼ばれる。また、一般的に、13C、2Hなどの天然同
位体の存在度により、計算された分子量を超えるといった小さなピークも観察される。特に不安定なプロトンを有する多くの分子は、分子イオンを提示しない。例えば、アルコールの質量スペクトル中の最も高い分子量ピークは、分子イオンより１つ少ないm/z(m-1)で生じる。フラグメントは、それらの質量電荷比により同定されることができるが、失った質量によりそれらを同定することがより有益である場合がある。例えば、メチル基の消失はm-15にピークを発生させるであろうし、一方、エチルの消失はm-29にピークを発生させるであろう。
The ions formed by fragmentation of proteins in the sample during mass spectrometry are the most stable cations and radical cations formed by protein molecules. The highest molecular weight peak observed in the spectrum typically represents the parent molecule minus the electrons and is called the molecular ion (M + ). In general, small peaks exceeding the calculated molecular weight are also observed due to the presence of natural isotopes such as 13 C and 2 H. Many molecules with particularly unstable protons do not present molecular ions. For example, the highest molecular weight peak in the mass spectrum of alcohol occurs at m / z (m-1), one less than the molecular ion. Fragments can be identified by their mass to charge ratio, but it may be more beneficial to identify them by lost mass. For example, the disappearance of a methyl group will generate a peak at m-15, while the disappearance of ethyl will generate a peak at m-29.
本発明の方法はさらに、サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料または陰性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較することを含むものであってよい。「標準試料」とは、ある分子（例えば、タンパク質）の同定、定量、および／または特徴付けを可能にするサンプル（試料）を意味するものである。病気を診断する方法に関して、標準試料は、特定の病気または病気の進行の指標である分子を含んでいる場合、それは「陽性」である。また、このような指標分子も「バイオマーカー」といわれ、そして典型的には、タンパク質またはタンパク質フラグメントである。標準試料は、特定の病気または病気の進行の指標である分子を欠損しているか、または対象が特定の病気にはなっていない指標となる分子を含んでいる場合、それは「陰性」である。本発明の方法において、標
準試料は子宮内膜症の陽性または陰性診断を容易にする。標準試料は、本発明の方法に従って、子宮内膜症に対する特定の診断に到達するように、検査対象サンプルと標準試料が有効に比較されることができる限り、任意の陽性標準試料または陰性標準試料であってよい。本発明の好ましい態様において、陽性標準試料は、子宮内膜症を患っている対象（例えば、ヒト）から得られたサンプルを含むものである。一方、陰性標準試料は、好ましくは、子宮内膜症を患っていない対象（例えば、ヒト）から得られたサンプルを含むものであってよい。
The method of the present invention may further comprise comparing the mass spectral profile of the sample with the mass spectral profile of a positive or negative standard sample. By “standard sample” is meant a sample (sample) that allows the identification, quantification, and / or characterization of a molecule (eg, protein). With respect to a method of diagnosing a disease, a standard sample is “positive” if it contains a molecule that is indicative of a particular disease or disease progression. Such indicator molecules are also referred to as “biomarkers” and are typically proteins or protein fragments. A standard sample is “negative” if it lacks a molecule that is an indicator of a particular disease or disease progression, or contains a molecule that is indicative of the subject not having a particular disease. In the method of the invention, the standard sample facilitates a positive or negative diagnosis of endometriosis. The standard is any positive or negative standard so long as the sample to be tested and the standard can be effectively compared to reach a specific diagnosis for endometriosis according to the method of the invention. It may be. In a preferred embodiment of the invention, a positive standard sample is one that includes a sample obtained from a subject (eg, a human) suffering from endometriosis. On the other hand, the negative standard sample may preferably include a sample obtained from a subject (eg, a human) who does not suffer from endometriosis.
標準試料が子宮内膜症を患っている対象、例えば、子宮内膜症患者から得られた陽性標準試料の場合、標準試料の質量スペクトルプロファイルは、臨床医が信頼できる診断をするのを可能とするであろうバイオマーカーを任意の適切な数だけ含んでいることができる。陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルは、好ましくは、m/z比: 5,830のタンパク質ピーク、m/z比: 8,865のタンパク質ピーク、m/z比: 6,516のタンパク質ピーク、m/z比:
9,022のタンパク質ピークなどからなる群から選択される１以上のバイオマーカーを含むものが挙げられる。言い換えれば、陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルは、好ましくは、5,830ダルトン(Da)タンパク質ピーク、8,865Daタンパク質ピーク、6,516Daタン
パク質ピーク、9,022Daタンパク質ピークなどからなる群から選択される１以上のバイオ
マーカーを含むものである。こうしたバイオマーカーの存在（又は、減少あるいは欠失）は、タンパク質発現レベルにおける異常性（例えば、タンパク質過剰発現の結果としての異常）、タンパク質の異常な分解過程、及び／又は、タンパク質の異常な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、あるいは、酸化など）と関連したものであると考えることもできる。
If the standard sample is a positive standard sample obtained from a subject suffering from endometriosis, for example, from an endometriosis patient, the mass spectral profile of the standard sample allows the clinician to make a reliable diagnosis. Any suitable number of biomarkers may be included. The mass spectral profile of the positive standard is preferably m / z ratio: 5,830 protein peak, m / z ratio: 8,865 protein peak, m / z ratio: 6,516 protein peak, m / z ratio:
Examples include those containing one or more biomarkers selected from the group consisting of 9,022 protein peaks and the like. In other words, the mass spectral profile of the positive standard sample is preferably one or more biomarkers selected from the group consisting of 5,830 Dalton (Da) protein peak, 8,865 Da protein peak, 6,516 Da protein peak, 9,022 Da protein peak, etc. Is included. The presence (or decrease or deletion) of these biomarkers can be due to abnormalities in protein expression levels (eg, abnormalities as a result of protein overexpression), abnormal protein degradation processes, and / or abnormal protein translation. It can also be considered to be associated with a post-modification (eg glycosylation or oxidation).
本発明の方法に従って、目的の対象(例えば、ヒト)から得られたサンプルの質量スペクトルプロファイルが、上記したような陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルにおいて観察されるバイオマーカーの１つまたは任意の組合せを含んでいるような場合（あるいはバイオマーカーの１つまたは任意の組合せの減少あるいは欠失がある場合）、子宮内膜症について陽性であるとの診断となる。この点で、子宮内膜症がポジティブであるとの診断は、対象から得られたサンプルの質量スペクトルプロファイルが、１以上、又は、２以上の上記の陰性標準試料と異なるタンパク質ピークを含む場合、あるいは、他のバイオマーカー（例えば、CA125など）についての結果を加えて、上記の陰性標準試料と異なるタ
ンパク質ピークを含む場合（及び／又は、ピークが減少又は欠失している場合）になされることができる。実際、上記タンパク質ピークの任意の一つ又は特定のサブセットは、子宮内膜症に関して診断的意義を有することができる。このようなバイオマーカーの任意の一つ又はサブセットは、好ましくは、m/z比: 5,830のタンパク質ピーク単独、5,830Daタ
ンパク質ピーク単独、m/z比: 8,865のタンパク質ピーク単独、8,865Daタンパク質ピーク
単独、m/z比: 6,516のタンパク質ピーク単独、6,516Daタンパク質ピーク単独、m/z比: 9,022のタンパク質ピーク単独、9,022Daタンパク質ピーク単独、m/z比: 5,830のタンパク質ピークとm/z比: 8,865のタンパク質ピークとの組合せ、5,830Daタンパク質ピークと8,865Daタンパク質ピークの組合せ、m/z比: 6,516のタンパク質ピークとm/z比: 9,022のタンパク質ピークとの組合せ、6,516Daタンパク質ピークと9,022Daタンパク質ピークの組合せ、m/z比: 5,830のタンパク質ピークとCA125の組合せ、m/z比: 8,865のタンパク質ピークとCA125の組合せ、m/z比: 5,830のタンパク質ピークとm/z比: 8,865のタンパク質ピークとCA125との組合を含むものであってよく、そうしたバイオマーカーの任意の一つ又はサブセ
ットは子宮内膜症を診断するばあいに、望ましくは、100%の精度を提供するものであるが、例えば、少なくとも85%の精度を提供するもの、さらには、少なくとも88%（ある場合には、89%）あるいは91%の精度を提供するもの、あるいは、少なくとも93%又は94%の精度を提供するもの、好適には、少なくとも95%の精度を提供するものであってもよい。しかし
ながら、これらのサブセットは、単なる例示にすぎないものであり、ここで同定したバイオマーカーの一つ又は任意の適切なサブセットを子宮内膜症を診断するのに用いることが
できよう。本発明の典型的な態様では、子宮内膜症の患者血清をSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が、それぞれ、約5830のピークと約8865のピークと
の二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルにより検査して、少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルが提供される。より好ましい態様では、子宮内膜症の患者血清をSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が、それぞれ、約5830のピーク
と約8865のピークとの二つのピークからなるモデルにより検査して、少なくとも85％以上の感度及び少なくとも85％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルである。本発明の別の典型的な態様では、子宮内膜症の患者腹水をSELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が、それぞれ、約6516のピークと約9022のピ
ークとの二つのピークからなる非子宮内膜症と子宮内膜症との識別モデルにより検査して、少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルが提供される。さらに、本発明の一つの態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、単一で少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーである。本発明のより好ましい一つの態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が約5830であり、単一で少なくとも80％以上の感度及び少なくとも80％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーが提供さ
れる。さらには、本発明の一つの別の態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、単一で少なくとも85％以上の感度及び少なくとも85％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーである。本発明のより好ましい別の一つの態様では、子宮内膜症手術の前後において有意に値が異なる、SELDI-TOF-MSシステムを用いて測定するとき、分子量(m/z値)が
約5830であり、単一で少なくとも85％以上の感度及び少なくとも85％以上の特異性を有する子宮内膜症手術の終了の判断に有用なバイオマーカーが提供される。加えて、子宮内膜症が陽性であるとの診断は、サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較することにより確認されることができる。この点に関し、子宮内膜症がポジティブであるとの診断は、陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルで見出されるバイオマーカーのうちのいずれかが、対象(例えば、ヒト)のサンプルの質量スペクトルプロファイル中に観察される場合に確認される。
In accordance with the methods of the present invention, the mass spectral profile of a sample obtained from a subject of interest (eg, a human) is one or any combination of biomarkers observed in the mass spectral profile of a positive standard sample as described above. If so, (or if there is a reduction or deletion of one or any combination of biomarkers), the diagnosis is positive for endometriosis. In this regard, a diagnosis of positive endometriosis is a case where the mass spectral profile of a sample obtained from a subject contains one or more or two or more protein peaks that differ from the above negative standard sample, Alternatively, the results for other biomarkers (eg, CA125, etc.) are added to include a protein peak that is different from the negative standard sample (and / or if the peak is reduced or deleted). be able to. In fact, any one or a specific subset of the protein peaks can have diagnostic significance for endometriosis. Any one or a subset of such biomarkers is preferably m / z ratio: 5,830 protein peak alone, 5,830 Da protein peak alone, m / z ratio: 8,865 protein peak alone, 8,865 Da protein peak alone M / z ratio: 6,516 protein peak alone, 6,516 Da protein peak alone, m / z ratio: 9,022 protein peak alone, 9,022 Da protein peak alone, m / z ratio: 5,830 protein peak and m / z ratio: 8,865 protein peak combination, 5,830 Da protein peak and 8,865 Da protein peak combination, m / z ratio: 6,516 protein peak and m / z ratio: 9,022 protein peak combination, 6,516 Da protein peak and 9,022 Da Protein peak combination, m / z ratio: 5,830 protein peak and CA125 combination, m / z ratio: 8,865 protein peak and CA125 combination, m / z ratio: 5,830 protein peak and m / z ratio: 8,865 It may include a combination of protein peak and CA125, and any one or a subset of such biomarkers desirably provides 100% accuracy when diagnosing endometriosis For example, providing at least 85% accuracy, or at least 88% (89% in some cases) or 91% accuracy, or at least 93% or 94% accuracy. It may provide, preferably at least 95% accuracy. However, these subsets are merely exemplary, and one or any suitable subset of the biomarkers identified herein could be used to diagnose endometriosis. In an exemplary embodiment of the invention, when endometriosis patient serum is measured using a SELDI-TOF-MS system, the molecular weight (m / z value) is about 5830 peak and about 8865 peak, respectively. Specific for endometriosis with a sensitivity of at least 80% and a specificity of at least 80%, as determined by a model of discrimination between non-endometriosis and endometriosis consisting of two peaks A biomarker model is provided. In a more preferred embodiment, when endometriosis patient serum is measured using the SELDI-TOF-MS system, the molecular weight (m / z value) has two peaks, about 5830 and about 8865, respectively. It is a biomarker model specific for endometriosis when tested by a model consisting of peaks and having a sensitivity of at least 85% and a specificity of at least 85%. In another exemplary embodiment of the present invention, when measuring ascites from a patient with endometriosis using a SELDI-TOF-MS system, the molecular weight (m / z value) is about 6516 peak and about 9022 respectively. Specific for endometriosis with a sensitivity of at least 80% and a specificity of at least 80%, as determined by a model of discrimination between non-endometriosis and endometriosis consisting of two peaks A biomarker model is provided. Furthermore, in one embodiment of the present invention, when measured using a SELDI-TOF-MS system, the values differ significantly before and after endometriosis surgery, and at least a sensitivity of at least 80% and at least 80% It is a biomarker useful for determining the end of endometriosis surgery having the above specificity. In a more preferred embodiment of the present invention, the molecular weight (m / z value) is about 5830 when measured using the SELDI-TOF-MS system, which is significantly different before and after endometriosis surgery, Biomarkers useful for determining the end of endometriosis surgery that have a single sensitivity of at least 80% and a specificity of at least 80% are provided. Furthermore, in another aspect of the present invention, when measured using a SELDI-TOF-MS system, the values differ significantly before and after endometriosis surgery, and at least a sensitivity of at least 85% or more. It is a biomarker useful for determining the end of endometriosis surgery with a specificity of at least 85%. In another more preferred embodiment of the invention, the molecular weight (m / z value) is about 5830 when measured using the SELDI-TOF-MS system, which is significantly different before and after endometriosis surgery. There is a single biomarker useful in determining the end of endometriosis surgery that has a single sensitivity of at least 85% and a specificity of at least 85%. In addition, a diagnosis of positive endometriosis can be confirmed by comparing the mass spectral profile of the sample with the mass spectral profile of the positive standard sample. In this regard, a diagnosis of positive endometriosis is that any of the biomarkers found in the mass spectrum profile of a positive standard is present in the mass spectrum profile of a subject (e.g., human) sample. Confirmed when observed.
同様にして、子宮内膜症に関して陰性であるとの診断（すなわち、対象は子宮内膜症を有しないとの診断）は、目的の対象（例えば、ヒト）から得られたサンプルの質量スペクトルプロファイルが上述の陰性標準試料の質量スペクトルプロファイルと実質的に同じ場合にそれをなすことができる。子宮内膜症がネガティブであるとの診断は、サンプルの質量スペクトルプロファイルを陽性標準試料の質量スペクトルプロファイルと比較することによっても確認されることができる。この点に関し、子宮内膜症がネガティブであるとの診断は、目的の対象のサンプルの質量スペクトルプロファイルが上述のような陽性標準試料の質量スペクトルプロファイル中に観察された如何なるバイオマーカーも含まない場合（あるいは特定のものが減少又は欠失している場合）に確認される。あるいは、子宮内膜症がネガティブであるとの診断は、陽性標準試料と異なるバイオマーカーの特定のサブセットを用いて確認されることもできる。 Similarly, a diagnosis that is negative for endometriosis (ie, a diagnosis that the subject does not have endometriosis) is a mass spectral profile of a sample obtained from the subject of interest (eg, a human) Can be made if is substantially the same as the mass spectral profile of the negative standard sample described above. Diagnosis that endometriosis is negative can also be confirmed by comparing the mass spectral profile of the sample with the mass spectral profile of the positive standard sample. In this regard, a diagnosis of negative endometriosis is when the mass spectrum profile of the sample of interest does not include any biomarkers observed in the mass spectrum profile of the positive standard as described above (Or if certain things are reduced or deleted). Alternatively, a diagnosis of negative endometriosis can be confirmed using a specific subset of biomarkers that differ from the positive standard sample.
また、目的の対象から得られたサンプルで同定されたバイオマーカーとして機能するタンパク質ピークの任意の１つ又は組合せ（すなわち、サブセット）が、陽性または陰性標準試料を規定しているものであることは、当業者であれば、理解するところのものであろう。さらに、サンプル中のタンパク質ピークの強度値は、陽性標準試料及び／又は陰性標準試料と比較した場合に診断情報を提供することができる。すなわち、タンパク質ピークの平均強度値は、子宮内膜症を有する患者と子宮内膜症を有しない者とを識別するのに有
用であることもできる。
対象における子宮内膜症の診断は、目的の患者から得られたサンプル中に陽性標準試料のバイオマーカーの全てが存在することを必要としない。実際、子宮内膜症の診断は、患者から得られたサンプルが、任意の１つのバイオマーカー、陽性標準試料のバイオマーカーの組合せ、または陰性標準試料と異なるバイオマーカーの任意の１つ又は特定のサブセットを含むのであれば、それを行うことができる。加えて、子宮内膜症の診断は、対象から得られたサンプルが、陽性標準試料のバイオマーカーの１以上のフラグメントまたは全長アミノ酸配列を含むのであれば、それを行うことができる。さらに、タンパク質の翻訳後修飾の結果として、子宮内膜症の診断は、対象から得られたサンプルが陽性標準試料のバイオマーカーの１以上の修飾型(例えば、グリコシル化型など)を含む場合、その診断を行うこともできる。
Also, any one or combination (ie, subset) of protein peaks that function as biomarkers identified in a sample obtained from a subject of interest defines a positive or negative standard. Those skilled in the art will understand. Further, the intensity value of the protein peak in the sample can provide diagnostic information when compared to a positive standard sample and / or a negative standard sample. That is, the average intensity value of the protein peak can also be useful in distinguishing between patients with endometriosis and those without endometriosis.
Diagnosis of endometriosis in a subject does not require that all of the positive standard biomarkers be present in the sample obtained from the patient of interest. In fact, the diagnosis of endometriosis is that the sample obtained from a patient is any one biomarker, any biomarker combination of positive standard samples, or any one or specific biomarker different from the negative standard sample. If you include a subset, you can do it. In addition, the diagnosis of endometriosis can be made if the sample obtained from the subject contains one or more fragments or full-length amino acid sequences of a positive standard biomarker. Further, as a result of post-translational modification of the protein, the diagnosis of endometriosis is when the sample obtained from the subject contains one or more modified forms (eg, glycosylated forms, etc.) of a positive standard biomarker, The diagnosis can also be performed.
本発明のタンパク質質量分析で同定されたバイオマーカーについては、それをさらにタンパク質の同定に付すことができる。このように、本発明は、特定の試料由来のタンパク質バイオマーカーの同定技術も包含するものである。この点に関し、タンパク質は当技術分野で公知の任意の適切なタンパク質同定法を用いて同定確認並びに特性の決定を行うことができよう。適切なタンパク質同定法としては、例えば、タンパク質エレクトロブロッティング（protein electroblotting）、エドマン配列決定法（例えば、Gevaert et al.,
Electrophoresis, 21, 1145-1154 (2000)など参照）、質量分析による配列決定（例えば、Michael Kinter and Nicholas E. Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectroscopy, Wiley-Interscience (2000)、米国特許第6,379,971号明細書、米国特許第6,632,339号明細書、米国特許第6,706,529号明細書など参照）などが挙げられる。
The biomarker identified by protein mass spectrometry of the present invention can be further subjected to protein identification. Thus, the present invention also includes a technique for identifying a protein biomarker derived from a specific sample. In this regard, the protein could be identified and characterized using any suitable protein identification method known in the art. Suitable protein identification methods include, for example, protein electroblotting, Edman sequencing (eg Gevaert et al.,
Electrophoresis, 21, 1145-1154 (2000), etc.), sequencing by mass spectrometry (eg, Michael Kinter and Nicholas E. Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectroscopy, Wiley-Interscience (2000), US Pat. No. 6,379,971) No. specification, US Pat. No. 6,632,339, US Pat. No. 6,706,529, etc.).
質量分析に基づくタンパク質同定法としては、例えば、MALDI-MSペプチドマスフィンガープリント法(MALDI-MS-PMF)およびMALDI-MSポストソース分解分析法(MALDI-MS-PSD)などが挙げられる。MALDI-MS-PMFでは、典型的には二次元ゲル電気泳動により精製した目的のタンパク質は、酵素的または化学的のいずれかで切断され、そして得られたペプチド混合物の一部分を使用して、それを質量分析手法により分析して、それによってタンパク質のマス「フィンガープリント」を取得する。続いて、マスフィンガープリントは、データーベース（例えば、MOWSE、ProFound、PeptIdent、PeptideSearch、SEQUESTなど)に蓄積さ
れたタンパク質配列の理論上の切断により得られた「仮想」フィンガープリントと比較され、そしてトップスコアのタンパク質が可能性のある候補タンパク質として選択される。MALDI質量分析で一次構造情報を得るためには、そのままのペプチドとそのフラグメント
イオンからなるイオン束を分析しなければならない。イオン源でのイオン化後に生じる過程は、ポストソース分解(postsource decay: PSD）と呼ばれている。ペプチドがPSDを受
けた場合、おおむねポリペプチド骨格が開裂されるので、原理的にペプチドのアミノ酸配列情報を含む一連の断片化したペプチドイオン（フラグメントイオン）が生成される。このPSDフラグメントイオンは、プレカーサーイオン（前駆イオン）とはその運動エネルギ
ーに違いをもっているので、この運動エネルギー差を利用して分離することができる。PSDフラグメントは、イオンミラー（リフレクトロン）やイオンゲートを備えた装置を使用
して解析され、かくして配列特異的なフラグメントイオン情報を、分離されていない数多くのペプチド混合物から引き出すことができる。
本発明の好ましい実施態様では、試料中のタンパク質はMALDI-MS-PMFにより同定される。試料中のタンパク質の予備的な同定の際、タンパク質の同定は、例えば、酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)、ウエスタンブロット分析、免疫沈降法、等電点分離法、それに続く二次元ゲル電気泳動法などの当技術分野で公知の様々なタンパク質検出法により確認することができる。
Examples of protein identification methods based on mass spectrometry include MALDI-MS peptide mass fingerprint method (MALDI-MS-PMF) and MALDI-MS post-source decomposition analysis method (MALDI-MS-PSD). In MALDI-MS-PMF, the protein of interest, typically purified by two-dimensional gel electrophoresis, is cleaved either enzymatically or chemically, and a portion of the resulting peptide mixture is used to obtain it. Are analyzed by mass spectrometry techniques, thereby obtaining a mass “fingerprint” of the protein. Subsequently, the mass fingerprint is compared with the “virtual” fingerprint obtained by theoretical cleavage of the protein sequence accumulated in the database (eg MOWSE, ProFound, PeptIdent, PeptideSearch, SEQUEST, etc.) and the top The score protein is selected as a potential candidate protein. In order to obtain primary structure information by MALDI mass spectrometry, it is necessary to analyze an ion bundle consisting of the peptide and its fragment ions. The process that occurs after ionization at the ion source is called postsource decay (PSD). When a peptide undergoes PSD, the polypeptide backbone is generally cleaved, and in principle, a series of fragmented peptide ions (fragment ions) containing the amino acid sequence information of the peptide are generated. Since this PSD fragment ion has a difference in kinetic energy from the precursor ion (precursor ion), it can be separated using this kinetic energy difference. PSD fragments are analyzed using devices equipped with ion mirrors (reflectrons) and ion gates, and thus sequence-specific fragment ion information can be derived from a large number of unseparated peptide mixtures.
In a preferred embodiment of the invention, the protein in the sample is identified by MALDI-MS-PMF. In the preliminary identification of proteins in a sample, protein identification can be performed by, for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot analysis, immunoprecipitation, isoelectric focusing, and subsequent two methods. It can be confirmed by various protein detection methods known in the art such as dimensional gel electrophoresis.
本発明はさらに、対象における子宮内膜症の治療での、薬物又は治療処置の有効性を評
価するための方法を提供する。該方法は、(a)子宮内膜症を患っている対象から第１の試
料を得る工程、(b)質量分析により第１の試料中のタンパク質を分析する工程、(c)第１の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、ある
いは、対象の患部を除去するなどの試料処置を行う工程、(e)対象に薬物を投与するか、
あるいは、対象の患部を除去するなどの試料処置を施した後、該対象から第２の試料を得る工程、(f)質量分析により第２の試料中のタンパク質を分析する工程、(g)第２の試料の質量スペクトルプロファイルを測定する工程、および(h)第１の試料の質量スペクトルプ
ロファイルを第２の試料の質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでいるものである。ここで薬物又は治療処置の有効性が評価される工程が含まれる。
The present invention further provides a method for assessing the effectiveness of a drug or therapeutic treatment in the treatment of endometriosis in a subject. The method comprises (a) obtaining a first sample from a subject suffering from endometriosis, (b) analyzing the protein in the first sample by mass spectrometry, (c) the first sample Measuring the mass spectral profile of: (d) administering the drug to the subject, or performing a sample treatment such as removing the affected area of the subject, (e) administering the drug to the subject,
Or a step of obtaining a second sample from the subject after performing a sample treatment such as removing an affected part of the subject, (f) analyzing a protein in the second sample by mass spectrometry, (g) Measuring the mass spectral profile of the second sample, and (h) comparing the mass spectral profile of the first sample with the mass spectral profile of the second sample. This includes the step in which the effectiveness of the drug or therapeutic treatment is evaluated.
本発明は、子宮内膜症の診断を補助するための試薬及び／又はキットを提供する。この試薬及び／又はキットは、本発明によるバイオマーカーを検出するために使用される。この試薬及び／又はキットは、子宮内膜症患者に由来するサンプル中に差異を有して存在するバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せの存在についてスクリーニングすることを可能ならしめる。
本発明の一つの実施形態においては、このキットは、本発明によるバイオマーカーを結合するのに適している吸着性試薬、又は、当該吸着性試薬をその上に有する基板などの固相、および洗浄溶液または洗浄溶液を作製するための指示書を含んでいるものであってよい。本発明のキットは、質量分析によりバイオマーカーの検出を可能にするものが含まれる。好ましい実施形態において、このキットは、固定化された金属アフィニティー捕捉チップを含むものである。該キットは、その上に吸着性試薬を備える第一の基板、およびこの第一の基板がプローブを形成するように位置決めされる第二の基板（質量分析計へ挿入されることができる）を含んでいてよい。別の実施形態において、発明のキットは、質量分析器などの分光計へ挿入されることのできる単一の基板を含むものであってよい。
The present invention provides reagents and / or kits to assist in the diagnosis of endometriosis. This reagent and / or kit is used to detect a biomarker according to the present invention. This reagent and / or kit makes it possible to screen for the presence of biomarkers or combinations of biomarkers that are present with a difference in samples from patients with endometriosis.
In one embodiment of the invention, the kit comprises an adsorbent reagent suitable for binding a biomarker according to the invention, or a solid phase such as a substrate having the adsorbent reagent thereon, and a wash. It may contain instructions for making the solution or cleaning solution. Kits of the present invention include those that allow detection of biomarkers by mass spectrometry. In a preferred embodiment, the kit includes an immobilized metal affinity capture chip. The kit includes a first substrate having an adsorptive reagent thereon and a second substrate (which can be inserted into the mass spectrometer) positioned such that the first substrate forms a probe. May contain. In another embodiment, the inventive kit may comprise a single substrate that can be inserted into a spectrometer such as a mass analyzer.
また、本発明によるバイオマーカーは、サンプル中のバイオマーカーの存在を検出するための他の形態の診断アッセイ用製品、例えば、診断試薬にも有用であるし、さらには、当該診断アッセイ用製品、例えば、診断試薬の開発に有用であり、したがって、本発明は、こうして開発された診断アッセイ用製品、例えば、診断試薬も包含するものである。
例えば、本アッセイとしては、本発明で同定された一以上のバイオマーカーに対する抗体を含むものであることができる。抗体は、バイオマーカーを含有すると推測されるサンプルと混合され、そしてバイオマーカー−抗体結合を利用してモニターされる。本バイオマーカー抗体は、放射活性標識および酵素標識などの標識を用いて標識されることができる。好ましい実施形態において、このバイオマーカーの抗体は、固体マトリックス上に固定され、その結果、このバイオマーカー抗体は、サンプル中のバイオマーカーに対して接近可能になっているものであってよい。次いで、このサンプルを、このマトリックスの表面に接触させ、そしてこの表面を、バイオマーカー−抗体結合についてモニターする。
The biomarker according to the present invention is also useful for other forms of diagnostic assay products for detecting the presence of a biomarker in a sample, for example, diagnostic reagents. For example, it is useful for the development of diagnostic reagents, and therefore the present invention also encompasses diagnostic assay products thus developed, such as diagnostic reagents.
For example, the assay can include an antibody against one or more biomarkers identified in the present invention. The antibody is mixed with a sample suspected of containing the biomarker and monitored using biomarker-antibody binding. The biomarker antibody can be labeled using a label such as a radioactive label and an enzyme label. In a preferred embodiment, the biomarker antibody may be immobilized on a solid matrix so that the biomarker antibody is accessible to the biomarker in the sample. The sample is then contacted with the surface of the matrix and the surface is monitored for biomarker-antibody binding.
例えば、本発明のバイオマーカーは、放射免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、特にはELISA、蛍光免疫測定法(FIA)、発光免疫測定法(LIA)などで検出されることができる
。ELISAでは、典型的な場合、バイオマーカー抗体は、固相に結合され、そして酵素−抗
体結合体（コンジュゲート）は、サンプル中に存在するバイオマーカーを検出及び／又は定量するために使用される。別の態様では、可溶化され且つ分離されたバイオマーカーがニトロセルロール紙などの担体（例えば、膜など）に結合したウエスタンブロットアッセイを使用することができる。高度に特異的で、安定な抗体コンジュゲートと感受性色素基質との組み合わせは、迅速かつ正確なサンプルの同定を可能にする。膜のブロッキングおよび洗浄ならびに抗体の希釈のために必要とされる全ての溶液が提供される。バイオマーカーは、沈殿性基質または検出可能な基質の存在下においてフィルター紙をインキュベートすることによって、酵素または標識結合抗免疫グロブリン(Ig)（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-Igコンジュゲート）によって検出される。ウエスタンブロットアッ
セイは、所望のバイオマーカーについて50%を越える純度などの高純度を必要としない利
点を有する。ELISA技術およびウェエスタンブロット技術の記述は、例えば、Fred M. Ausubel et al. (eds), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, 1988, Last Updated January 2004), "10 Analysis of Proteins" and "11 Immunology"を
参照できる。
For example, the biomarker of the present invention should be detected by radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), particularly ELISA, fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA), etc. Can do. In ELISA, typically a biomarker antibody is bound to a solid phase and an enzyme-antibody conjugate (conjugate) is used to detect and / or quantify the biomarker present in the sample. . In another embodiment, a Western blot assay in which solubilized and separated biomarkers are bound to a carrier such as nitrocellulose paper (eg, a membrane, etc.) can be used. The combination of a highly specific and stable antibody conjugate and a sensitive dye substrate allows for rapid and accurate sample identification. All solutions required for membrane blocking and washing and antibody dilution are provided. Biomarkers are detected by enzyme or labeled-conjugated anti-immunoglobulin (Ig) (eg, horseradish peroxidase (HRP) -Ig conjugate) by incubating filter paper in the presence of a precipitating or detectable substrate Is done. Western blot assays have the advantage of not requiring high purity such as greater than 50% purity for the desired biomarker. Descriptions of ELISA and Western blot techniques can be found, for example, in Fred M. Ausubel et al. (Eds), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, 1988, Last Updated January 2004), "10 Analysis of Proteins" and "11 Immunology".
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望の本発明のバイオマーカータンパク質、その構成ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型(intact)分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2, Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ (epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、IgMなどの複数のサブユニットから構成されるもの、二重特異性組
換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、DNA 組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい本発明の抗体は、本発明のバイオマーカータンパク質を特異的に識別できるものが挙げられる。
In this specification, the term “antibody” may be used in a broad sense, and is a single monoclonal antibody against a desired biomarker protein of the present invention, its constituent polypeptides and related peptide fragments. Or an antibody composition having specificity for various epitopes, including monovalent or multivalent antibodies, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, as well as intact molecules and fragments and derivatives thereof A chimeric or hybrid antibody, including fragments such as F (ab ′) 2 , Fab ′ and Fab, and further having at least two antigen or epitope binding sites, or eg IgM Consisting of multiple subunits, bispecific recombinant antibody, interspecific hybrid antibody, anti-idiotype Antibodies that are considered to be derivatives thereof by being chemically modified or processed, antibodies obtained using known cell fusion or hybridoma technology or antibody engineering, or using synthetic or semi-synthetic technology, Apply conventional techniques known from the viewpoint of antibody generation, or have neutralizing properties with respect to antibodies prepared using DNA recombination techniques, target antigenic substances or target epitopes described and defined herein. Or antibodies having binding properties may be included. Particularly preferred antibodies of the present invention include those that can specifically identify the biomarker protein of the present invention.
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ)に対して向けら
れた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第4,816,567 号; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987など)。
Monoclonal antibodies made against antigenic material are produced using any method that can provide for the production of antibody molecules by a series of cell lines in culture. The modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody as being derived from a substantially homogeneous population of antibodies, and should not be construed as requiring production of the antibody by any particular method. Don't be. Individual monoclonal antibodies are those that contain a population of antibodies that are identical except that only a small amount of naturally occurring variants may be present. Monoclonal antibodies have high specificity and are directed against sites with a single antigenicity. In contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations that typically contain different antibodies directed against different antigenic determinants (epitopes), each monoclonal antibody is a single antigen on that antigen. It is intended for determinants. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are also superior in that they are synthesized by hybridoma culture and have no or little contamination with other immunoglobulins. Monoclonal antibodies include hybrid antibodies and recombinant antibodies. As long as they exhibit the desired biological activity, regardless of their origin, immunoglobulin class or subclass, the variable region domain may be replaced with a constant region domain, or the light chain may be replaced with a heavy chain, Can be obtained by replacing it with a chain of another species or by fusing it with a heterogeneous protein (eg, US Pat. No. 4,816,567; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97, Marcel Dekker). , Inc., New York, 1987).
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法 (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495-497 (1975)); ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (Kozbor et al., Immunology Today, 4, pp.72-79 (1983); Kozbor, J. Immunol., 133, pp.3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987);トリオーマ法; EBV-ハイブリドーマ法 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 (1985))(ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法);米国特許第4,946,778 号 (単鎖抗体の産生のための技術)が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙
げられる: S. Biocca et al., EMBO J, 9, pp.101-108 (1990); R.E. Bird et al., Science, 242, pp.423-426 (1988); M.A. Boss et al., Nucl. Acids Res., 12, pp.3791-3806 (1984); J. Bukovsky et al., Hybridoma, 6, pp.219-228 (1987); M. DAINO et al., Anal. Biochem., 166, pp.223-229 (1987); J.S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.5879-5883 (1988); P.T. Jones et al., Nature, 321, pp.522-525 (1986); J.J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical
Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); S. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp.6851-6855 (1984); V.T. Oi et al., BioTechniques, 4, pp.214-221 (1986); L. Riechmann et al., Nature, 332, pp.323-327 (1988); A. Tramontano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp.6736-6740 (1986); C. Wood et al., Nature, 314, pp.446-449 (1985); Nature, 314, pp.452-454 (1985)あるいはそこで引用された文献（それらの中にあ
る記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 。本発明の抗体は、本発明のバイオマーカーの解析、検知などに利用できる他、様々な利用が可能である。
Examples of suitable methods for producing monoclonal antibodies include the hybridoma method (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 495-497 (1975)); the human B cell hybridoma method (Kozbor et al., Immunology). Today, 4, pp.72-79 (1983); Kozbor, J. Immunol., 133, pp.3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987); trioma method; EBV-hybridoma method (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)) (human monoclonal antibody (Methods for production); U.S. Pat.No. 4,946,778 (technique for the production of single chain antibodies) and the following literature on antibodies: S. Biocca et al., EMBO J, 9, pp .101-108 (1990); RE Bird et al., Science, 242, pp.423-426 (1988); MA Boss et al., Nucl. Acids Res., 12, pp.3791-3806 (1984); J. Bukovsky et al., Hybridoma, 6, pp.219-228 (1987); M. DAINO et al., Ana l. Biochem., 166, pp. 223-229 (1987); JS Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883 (1988); PT Jones et al., Nature , 321, pp.522-525 (1986); JJ Langone et al. (Ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical
Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); S. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-6855 (1984); VT Oi et al., BioTechniques, 4, pp. 214-221 (1986); L. Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323-327 (1988); A. Tramontano et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83, pp.6736-6740 (1986); C. Wood et al., Nature, 314, pp.446-449 (1985); Nature, 314, pp.452-454 (1985) or there Cited references (descriptions contained therein are hereby incorporated by reference into the disclosure). The antibody of the present invention can be used for analysis and detection of the biomarker of the present invention and various other uses.
以下、モノクローナル抗体を例に挙げて、抗体の作製につき詳しく説明する。 本発明
のモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術（例えば、G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495-497 (1975))など) を利用して得られたモノクローナル抗体であってよく、例えば次のような工程で作製できる。
１．免疫原性抗原の調製
２．免疫原性抗原による動物の免疫
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
６．モノクローナル抗体の製造
Hereinafter, taking a monoclonal antibody as an example, the production of the antibody will be described in detail. The monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody obtained by utilizing cell fusion technology using myeloma cells (for example, G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495-497 (1975)). An antibody may be used, and for example, it can be prepared by the following steps.
1. 1. Preparation of immunogenic antigen 2. Immunization of animals with immunogenic antigens 3. Preparation of myeloma cells (myeloma cells) 4. Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells 5. Selection and monocloning of hybridomas (fusion cells) Production of monoclonal antibodies
１．免疫原性抗原の調製
抗原としては、上記で記載してあるように、本発明のバイオマーカータンパク質、それを構成するポリペプチド又はそれから誘導された断片を単離したものを用いることもできるが、決定された当該バイオマーカータンパク質のアミノ酸配列情報を基に、適当なオリゴペプチドを化学合成しそれを抗原として利用することができる。代表的には当該バイオマーカータンパク質に存在するアミノ酸残基のうちの連続した少なくとも５個のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる。抗原は、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できるが、免疫原性コンジュゲートなどにしてもよい。例えば、免疫原として用いる抗原は、当該タンパク質を断片化したもの、あるいはそのアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成して得られた合成ポリペプチド断片であってもよい。また、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみと反応できる（あるいは特定の配列のみを認識できる）モノクローナル抗体をデザインするのに用いることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにしておくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性化されることができる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。活性化結合基としては、(1) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、1-ベンゾトリアゾールエステル基、N-スクシンイミドエステル基など、(2) 活性化ジチオ基、例えば2-ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン (KLH)、牛血清アルブミン (BSA)、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細菌菌体成分、例えばBCG などが挙げられる。
1. Preparation of immunogenic antigen As described above, the antigen of the biomarker protein of the present invention, a polypeptide constituting the same, or a fragment derived therefrom can be used as an antigen. Based on the determined amino acid sequence information of the biomarker protein, an appropriate oligopeptide can be chemically synthesized and used as an antigen. A typical example is a peptide having at least 5 consecutive amino acids among amino acid residues present in the biomarker protein. The antigen can be used to immunize an animal by mixing it with an appropriate adjuvant as it is, but may be an immunogenic conjugate or the like. For example, an antigen used as an immunogen is a fragment of the protein, or a synthetic polypeptide fragment obtained by selecting a characteristic sequence region based on the amino acid sequence, designing a polypeptide and chemically synthesizing it. May be. In addition, the fragment can be combined with various carrier proteins via an appropriate condensing agent to form an immunogenic conjugate such as a hapten-protein, and this can be used to react only with a specific sequence (or only a specific sequence). Can also be used to design monoclonal antibodies. A cysteine residue or the like can be added in advance to the designed polypeptide to facilitate preparation of an immunogenic conjugate. In binding to carrier proteins, the carrier proteins can first be activated. For such activation, introduction of an activated linking group can be mentioned. The activated linking group includes (1) activated ester or activated carboxyl group, such as nitrophenyl ester group, pentafluorophenyl ester group, 1-benzotriazole ester group, N-succinimide ester group, etc. A dithio group, such as a 2-pyridyldithio group, can be mentioned. Examples of carrier proteins include keyholes, limpets, hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, globulins, polylysine and other polypeptides, and bacterial cell components such as BCG.
２．免疫原性抗原による動物の免疫
免疫は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座 14 、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験講座 12 、分子免疫学 III、抗原・抗体・補体、東京化学同人、1992年などに記載の方法に準じて行うことができる。免疫化剤を（必要に応じアジュバントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤及び／又はアジュバントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはその関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質（例えば上記担体タンパク質類など）とコンジュゲートを形成せしめて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ(Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、BCG 、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免疫は、例えばBALB/cなどのマウス、ハムスター、その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対して約１〜約400 μg/動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜10回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはBALB/c系マウスの他、BALB/c系マウスと他系マウスとのF1マウスなどを用いることもできる。必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得られ免疫された動物から得られたものであってよく、例えば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。
2. Immunization of animals with immunogenic antigens Immunization can be carried out by methods known to those skilled in the art, such as Shigeru Muramatsu, et al., Laboratory Biology Laboratory 14, Immunobiology, Maruzen Co., Ltd., 1985, Japan Biochemistry Society, Secondary Biochemistry Experiment Course 5, Immunobiochemistry Research Method, Tokyo Chemical Doujin, 1986, Japanese Biochemical Society, New Chemistry Experiment Course 12, Molecular Immunology III, Antigen / Antibody / Complement, Tokyo Chemical Doujin Can be carried out according to the method described in 1992 and the like. Immunization is accomplished by injecting the immunizing agent (optionally with an adjuvant) into the mammal one or more times. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant is made by multiple subcutaneous injections or intraperitoneal injections of a mammal. Examples of the immunizing agent include those containing the above antigen peptide or a related peptide fragment thereof. The immunizing agent may be used in the form of a conjugate with a protein known to be immunogenic in the mammal to be immunized (for example, the above carrier proteins). Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, lipid A, liposome, aluminum hydroxide, silica and the like. Immunization is performed using mice such as BALB / c, hamsters, and other suitable animals. The dose of the antigen is, for example, about 1 to about 400 μg / animal for mice, and is generally injected intraperitoneally or subcutaneously into the host animal, and thereafter every 1 to 4 weeks, preferably every 1 to 2 weeks. Repeat booster immunization 2-10 times intraperitoneally, subcutaneously, intravenously or intramuscularly. As a mouse for immunization, BALB / c mouse, F1 mouse of BALB / c mouse and other mouse, and the like can be used. If necessary, an antibody titer measurement system can be prepared and the antibody titer can be measured to confirm the degree of animal immunity. The antibody of the present invention may be obtained from the immunized animal thus obtained and includes, for example, antiserum, polyclonal antibody and the like.
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶことができ、例えば P3-NS-1-Ag4-1 (NS-1, Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976)、SP-2/0-Ag14 (SP-2, Nature, 276: 269 〜270,1978 )、マウスミエロー
マ MOPC-21セルライン由来のP3-X63-Ag8-U1 (P3U1, Curr. topics Microbiol. Immunol.,
81: 1-7, 1978 )、P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256: 495-497, 1975 ) 、P3-X63-Ag8-653
(653, J. Immunol., 123: 1548-1550, 1979)などを用いることができる。8-アザグアニ
ン耐性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコMEM 培地 (DMEM培地)、RPMI-1640 培地な
どの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清(FCS) などを加え、さらに８−アザグアニン（例えば５〜45μg/ml) を加えた培地で継代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約37℃で完全に解凍したのち RPMI-1640培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよい。
3. Preparation of myeloma cells (myeloma cells) Infinitely proliferative strains (tumor cell lines) used for cell fusion can be selected from cell lines that do not produce immunoglobulins, such as P3-NS-1-Ag4-1 ( NS-1, Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976), SP-2 / 0-Ag14 (SP-2, Nature, 276: 269-270,1978), mouse myeloma MOPC-21 cell line P3-X63-Ag8-U1 (P3U1, Curr. Topics Microbiol. Immunol., From
81: 1-7, 1978), P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256: 495-497, 1975), P3-X63-Ag8-653
(653, J. Immunol., 123: 1548-1550, 1979) can be used. 8-Azaguanine-resistant mouse myeloma cell line is prepared by adding antibiotics such as penicillin and amikacin, fetal calf serum (FCS), etc. to cell culture medium such as Dulbecco's MEM medium (DMEM medium) and RPMI-1640 medium. It is subcultured with a medium supplemented with azaguanine (for example, 5-45 μg / ml), but it can be subcultured with a normal medium 2 to 5 days before cell fusion to prepare the required number of cell lines. The cell line used was prepared by thawing the cryopreserved strain completely at about 37 ° C, washing it with normal medium such as RPMI-1640 medium three times or more, and then cultivating in normal medium to prepare the required number of cell lines. There may be.
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地(MEM培地) 、DMEM培地、RPMI-1640 培地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野で知られたものを用いることができ、この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス(HVJ: Hemagglutinating Virus
of Japan)なども挙げられる。好ましくは、例えば30〜60％のポリエチレングリコールを
0.5〜２ml加えることができ、分子量が 1,000〜8,000 のポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分子量が 1,000〜4,000 のポリエチレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば30〜60％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融
合を促進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）: ミエローマ細胞株の割合は、例えば 1:1〜20:1とすることが挙げられるが、より好ましくは 4:1〜7:1 とすることができる。融合反応を１〜10分間行い、次にRPMI-1640 培地などの細胞培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
4). 1. Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells In the animal immunized according to the above step, for example, a mouse, the spleen is removed 2 to 5 days after the final immunization, and then a spleen cell suspension is obtained. In addition to spleen cells, lymph node cells in various parts of the body can be obtained and used for cell fusion. The spleen cell suspension thus obtained and 3. The myeloma cell line obtained according to the above step is placed in a cell medium such as minimum essential medium (MEM medium), DMEM medium, RPMI-1640 medium, and a cell fusion agent such as polyethylene glycol is added. As the cell fusion agent, those known in various other fields can be used, such as inactivated Sendai virus (HVJ: Hemagglutinating Virus).
of Japan). Preferably, for example, 30-60% polyethylene glycol
0.5 to 2 ml can be added, polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 8,000 can be used, and polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 4,000 can be more preferably used. The concentration of polyethylene glycol in the fusion medium is preferably 30 to 60%, for example. If necessary, for example, a small amount of dimethyl sulfoxide or the like can be added to promote fusion. The ratio of spleen cells (lymphocytes): myeloma cell line used for the fusion is, for example, 1: 1 to 20: 1, more preferably 4: 1 to 7: 1. The fusion reaction is performed for 1-10 minutes and then a cell culture medium such as RPMI-1640 medium is added. The fusion reaction treatment can be performed multiple times. After the fusion reaction treatment, the cells are separated by centrifugation or the like and then transferred to a selection medium.
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む、FCS 含有MEM 培地、RPMI-1640 培地などの培地、所謂 HAT培地が挙げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３日ごとに HAT培地で半量ずつ交換するというように処理することができるが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後８〜16日目には、アミノプテリンを除いた、所謂HT培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合がある。
ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射免疫分析(RIA) 、酵素免疫分析(ELISA) 、蛍光免疫分析(FIA) などの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置(FACS)などで、所定の断片ペプチドを抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりする。
目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。クローニングは複数回行うことが好ましい。
5. Selection and Monocloning of Hybridoma (Fusion Cells) Examples of the selection medium include mediums such as FCS-containing MEM medium and RPMI-1640 medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, so-called HAT medium. In general, the selective medium can be replaced by adding a volume equal to the volume dispensed to the culture plate the next day, and then replacing the HAT medium half by half every 1 to 3 days. You can also change this. On the 8th to 16th day after the fusion, the medium can be changed every 1 to 4 days with a so-called HT medium excluding aminopterin. For example, mouse thymocytes can be used as a feeder, which may be preferred.
The culture supernatant of the culture well in which the hybridoma grows can be measured using a measurement system such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), or fluorescence immunoassay (FIA), or a fluorescence-induced cell separator (FACS). Then, screening is performed by using a predetermined fragment peptide as an antigen, or by measuring a target antibody using a labeled anti-mouse antibody.
The hybridoma producing the target antibody is cloned. Cloning can be done by picking up colonies in agar or by limiting dilution. More preferably, the limiting dilution method can be used. Cloning is preferably performed multiple times.
６．モノクローナル抗体の製造
得られたハイブリドーマ株は、FCS 含有MEM 培地、RPMI-1640 培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移植に先立ち、プリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、その処理後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノクローナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した後、DEAE−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など）を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
6). Production of Monoclonal Antibody The obtained hybridoma strain is cultured in an appropriate growth medium such as an FCS-containing MEM medium or RPMI-1640 medium, and a desired monoclonal antibody can be obtained from the medium supernatant. In order to obtain a large amount of antibody, ascites of the hybridoma can be mentioned. In this case, each hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of a histocompatibility animal syngeneic with an animal derived from myeloma cells, or each hybridoma is transplanted into, for example, a nude mouse, and allowed to proliferate. The produced monoclonal antibody can be recovered and obtained. Prior to transplantation of the hybridoma, the animal can be administered intraperitoneally with mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane). After that treatment, the hybridoma is allowed to grow and ascites is collected. You can also. Ascites fluid is used as it is, or conventionally known methods such as salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration by Sephadex, ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography They can be purified by high performance liquid chromatography and used as monoclonal antibodies. Preferably, the ascites containing the monoclonal antibody can be purified and separated by treatment with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose and an affinity column such as a protein A column after ammonium sulfate fractionation. Particularly preferably, affinity chromatography in which an antigen or antigen fragment (for example, a synthetic peptide, recombinant antigen protein or peptide, a site specifically recognized by an antibody, etc.) is immobilized, affinity chromatography in which protein A is immobilized, hydroxy Examples include apatite chromatography.
また、トランスジェニックマウス又はその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの慣用の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたDNA は、上記
したようにして発現ベクターに入れ、CHO, COSなどの宿主細胞に入れることができる。該DNA は、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ヒトの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6581, 1984)。かくして所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。また、抗体は、縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク質合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。ヒト化抗体は、当該分野で知られた技術により行うことが可能である（例えば、Jones et al., Nature, 321: pp.522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: pp.323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science,
239: pp.1534-1536 (1988))。ヒトモノクローナル抗体も、当該分野で知られた技術により行うことが可能で、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトミエローマ細胞やヒト・マウスヘテロミエローマ細胞は当該分野で知られている (Kozbor, J. Immunol., 133, pp.3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)) 。バイスペシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている (Millstein et al., Nature, 305: pp.537-539 (1983); WO93/08829; Traunecker et al., EMBO J., 10: pp.3655-3659 (1991); Suresh et al., "Methods in Enzymology", Vol. 121, pp.210 (1986))。
Also, transgenic mice or other organisms, such as other mammals, can be used to express antibodies such as humanized antibodies against the immunogenic polypeptide products of the invention. It is also possible to determine the sequence of the antibody thus obtained in large quantities, or to produce an antibody by a gene recombination technique using a nucleic acid sequence encoding the antibody obtained from a hybridoma strain. The nucleic acid encoding the monoclonal antibody can be isolated and sequenced by conventional techniques such as using an oligonucleotide probe that can specifically bind to the gene encoding the heavy or light chain of the mouse antibody. . Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector as described above, and then in a host cell such as CHO or COS. The DNA can be modified, for example, by substituting a sequence encoding a human heavy chain or light chain constant region domain in place of the homogeneous mouse sequence (Morrison et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6581, 1984). Thus, it is possible to prepare a chimeric antibody or a hybrid antibody having a desired binding specificity. The antibody can also be modified by applying a chemical protein synthesis technique including using a condensing agent to prepare a chimeric antibody or a hybrid antibody. Humanized antibodies can be performed by techniques known in the art (eg, Jones et al., Nature, 321: pp. 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: pp .323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science,
239: pp.1534-1536 (1988)). Human monoclonal antibodies can also be performed by techniques known in the art, and human myeloma cells and human / mouse heteromyeloma cells for producing human monoclonal antibodies are known in the art (Kozbor, J. Immunol., 133, pp. 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)). Methods for producing bispecific antibodies are also known in the art (Millstein et al., Nature, 305: pp. 537-539 (1983); WO93 / 08829; Traunecker et al., EMBO J., 10: pp.3655-3659 (1991); Suresh et al., "Methods in Enzymology", Vol. 121, pp.210 (1986)).
さらに、これら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2 といった抗体フラグメントにして使用してもよい。抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる（Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。抗体を検出可能な原子
団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、David et al., Biochemistry, 13巻, 1014-1021 頁（1974); Pain et al, J. Immunol. Meth., 40: pp.219-231 (1981);及び "Methods in Enzymology", Vol. 184, pp.138-163 (1990) により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいはβ-D-ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは
放射性同位元素などがある。
Furthermore, these antibodies may be used as antibody fragments such as Fab, Fab ′, and F (ab ′) 2 obtained by treating with an enzyme such as trypsin, papain, pepsin, etc., and optionally reducing them. The antibodies can be used in any known assay, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays (Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987). Any method known in the art can be used to conjugate each antibody to a detectable atomic group, such as David et al., Biochemistry, 13, 1014-1021 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth., 40: pp. 219-231 (1981); and “Methods in Enzymology”, Vol. 184, pp. 138-163 (1990). As an antibody for imparting a label, an IgG fraction, or a specific binding site Fab ′ obtained by reduction after pepsin digestion can be used. Examples of the label in these cases include enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, etc.), chemical substances, fluorescent substances, and radioisotopes as described below.
本発明での検知・測定は、イムノ染色、例えば組織あるいは細胞染色、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、ラジオイムノアッセイ、ELISA などを用いることができ、B-F分離を行ってもよいし、あるいは
行わないでその測定を行うことができる。好ましくは放射免疫測定法や酵素免疫測定法であり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明の当該タンパク質及びその関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方を当該タンパク質のN-末端側残基に対する抗体とし、そして一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわち当該ポリペプチド断片抗原の量と比例する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（forward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。
Detection and measurement in the present invention can be performed by immunostaining such as tissue or cell staining, immunoassay such as competitive immunoassay or non-competitive immunoassay, radioimmunoassay, ELISA, etc. can be used, and BF separation is performed. It may or may not be performed. Preferred are radioimmunoassay and enzyme immunoassay, and further include a sandwich type assay. For example, in a sandwich type assay, one is an antibody against the protein of the present invention and its related peptide fragment, the other is an antibody against the N-terminal residue of the protein, and one is detectably labeled. Other antibodies capable of recognizing the same antigen are immobilized on the solid phase. Incubation treatment is performed in order to sequentially react the sample, labeled antibody, and solid-phased antibody as necessary. After separating the unbound antibody, the labeled product is measured. The amount of label measured is proportional to the amount of antigen, ie the polypeptide fragment antigen. This assay is referred to as a simultaneous sandwich type assay, a forward sandwich type assay, a reverse sandwich type assay, or the like depending on the order of addition of the insolubilized antibody or the labeled antibody. For example, washing, stirring, shaking, filtration, or pre-extraction of antigen are appropriately employed in these measurement steps under specific circumstances. Other measurement conditions such as the concentration of a specific reagent, buffer, etc., temperature, or incubation time can be varied according to factors such as the concentration of antigen in the sample and the nature of the sample. A person skilled in the art can perform measurement by appropriately selecting optimum conditions effective for each measurement using a normal experimental method.
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、本発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられる。 Many carriers capable of immobilizing an antigen or antibody are known, and in the present invention, they can be appropriately selected and used. Various carriers used for antigen-antibody reactions and the like are known, and of course, in the present invention, these carriers can be selected and used. In addition, filter paper, beads, inner walls of test containers, such as test tubes, titer plates, titer wells, glass cells, synthetic resin cells such as synthetic resin cells, glass rods, synthetic material rods, thickened ends, etc. Alternatively, the surface of a solid substance (object) such as a thinned rod, a rod having a round protrusion at the end or a flat protrusion, a thin plate, or the like may be used.
これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られる抗原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。
An antibody can be bound to these carriers, and preferably a monoclonal antibody that specifically reacts with the antigen obtained in the present invention can be bound. The binding between the carrier and those involved in the antigen-antibody reaction may be performed by a physical method such as adsorption, a chemical method using a condensing agent, an activated one, etc. It can be performed by a method using a chemical bonding reaction.
Labels include enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, prosthetic molecules, coenzymes, enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent materials, dye materials, chemiluminescent compounds, luminescent materials, chromogenic materials, magnetic materials, metal particles such as gold Examples thereof include radioactive materials such as colloids. Examples of the enzyme include oxidoreductases such as dehydrogenase, reductase, and oxidase, such as transferases that catalyze transfer of amino groups, carboxyl groups, methyl groups, acyl groups, phosphate groups, and the like, such as ester bonds, Examples include hydrolase, lyase, isomerase, ligase and the like that hydrolyze glycoside bonds, ether bonds, peptide bonds and the like. The enzyme can be used for detection by using a plurality of enzymes in combination. For example, enzymatic cycling can be used.
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることができるし、同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適pH、例えばpH約４〜約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、Tris-HCl緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０〜約60℃の間の温度で行うことが好ましい。
According to the measurement method of the present invention, a labeled antibody reagent such as a monoclonal antibody in which a substance to be measured is labeled with an enzyme and an antibody bound to a carrier can be reacted sequentially or simultaneously. . The order in which reagents are added depends on the type of carrier system selected. When using beads such as sensitized plastics, first place a labeled antibody reagent such as a monoclonal antibody labeled with an enzyme together with a specimen sample containing the substance to be measured in an appropriate test tube, and then Measurements can be made by adding beads such as sensitized plastic.
In the quantification method of the present invention, an immunological measurement method is used. In this case, as a solid phase carrier, polystyrene, polycarbonate, polypropylene or polyvinyl balls, microplates that adsorb proteins such as antibodies well are used. Various materials and forms such as sticks, microparticles or test tubes can be arbitrarily selected and used.
The measurement can be performed in an appropriate buffer system so as to maintain an optimum pH, for example, a pH of about 4 to about 9. Particularly suitable buffers include, for example, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, Tris buffer, triethanolamine buffer, borate buffer, glycine buffer, carbonate buffer, Tris-HCl A buffering agent etc. are mentioned. The buffering agents can be mixed and used at any ratio. The antigen-antibody reaction is preferably performed at a temperature between about 0 to about 60 ° C.
酵素などで標識されたモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定
すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。
当該分野で普通に採用されていたり、あるいは、当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いることが出来る。
本発明の測定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば血液、血清、血漿、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析・定量法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
Incubation of antibody reagents such as monoclonal antibodies labeled with enzymes, antibody reagents bound to carriers, and substances to be measured can be performed until equilibrium is reached, but the equilibrium of the antigen-antibody reaction has been achieved. The reaction can be stopped after a limited incubation by separating the solid and liquid phases at a much earlier time, and the extent of the presence of a label such as an enzyme in either the liquid phase or the solid phase can be determined. Can be measured. The measurement operation can be performed using an automated measuring device, and a luminescence detector, a photo detector, or the like is used to detect and measure a display signal generated by converting a substrate by the action of an enzyme. You can also. In the antigen-antibody reaction, appropriate measures can be taken to stabilize the reagents used, substances to be measured, and labels such as enzymes, or to stabilize the antigen-antibody reaction itself. In addition, proteins, stabilizers, surfactants, chelating agents, etc. can be added to the incubation solution to eliminate non-specific reactions, reduce the inhibitory effect, or activate the measurement reaction. It can also be added.
A blocking treatment for preventing a non-specific binding reaction commonly employed in the art or known to those skilled in the art may be performed. For example, normal serum proteins such as mammals, albumin, skim milk, milk It can be treated with fermented material, collagen, gelatin and the like. As long as the purpose is to prevent non-specific binding reaction, those methods are not particularly limited and can be used.
As a sample to be measured by the measurement method of the present invention, any form of solution, colloidal solution, non-fluid sample, etc. can be used, but preferably a sample derived from a living organism such as blood, serum, plasma, saliva, amniotic fluid, urine. And other body fluids, cell culture media, tissue culture media, tissue homogenates, biopsy samples, tissues, cells, and the like.
When various analysis / quantification methods including these individual immunological measurement methods are applied to the measurement method of the present invention, special conditions, operations, and the like are not required to be set. A measurement system related to the target substance of the present invention or a substance having substantially the same activity may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the normal conditions and operation methods in each method. .
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、H. V. Vunakis et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York (1981); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York (1981);
J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 84 (Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982); J. J.
Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in
Enzymology", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York (1989); M. Wilchek et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 184 (Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York (1990); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Anibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York (1991) などあるいはそこで引用された文献 (それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 〕。
For details of these general technical means, review articles, books, etc. can be referred to [for example, HV Vunakis et al. (Ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980); JJ Langone et al. (Ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York (1981); JJ Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York (1981);
JJ Langone et al. (Ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 84 (Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982); JJ
Langone et al. (Ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983); JJ Langone et al. (Ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); JJ Langone et al. (Ed.), "Methods in
Enzymology ", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York (1989); M. Wilchek et al. (Ed.)," Methods in Enzymology ", Vol. 184 (Avidin-Biotin Technology ), Academic Press, New York (1990); JJ Langone et al. (Ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Anibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York (1991), etc. or references cited therein (the description contained therein is hereby incorporated by reference into the disclosure)].
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
The present invention will be described in detail with reference to the following examples, which are provided merely for the purpose of illustrating the present invention and for reference to specific embodiments thereof. These exemplifications are for explaining specific specific embodiments of the present invention, but are not intended to limit or limit the scope of the invention disclosed in the present application. In the present invention, it should be understood that various embodiments based on the idea of the present specification are possible.
All examples were performed or can be performed using standard techniques, except as otherwise described in detail, and are well known and routine to those skilled in the art. .
〔材料と方法〕
〔患者とグループ〕
独立行政法人国立病院機構京都医療センター産婦人科部門での潜在的な可能性を持っている診断用バイオマーカーを発見するためにの研究で、2006年11月から2007年3月まで、59人の手術前の子宮内膜症患者、良性の婦人科疾病を持った31人の患者、30人の健康な女
性ボランティアおよび29人の手術後の子宮内膜症患者を対象とした。
募集されたすべての女性は、身体的検査および生化学のテストの結果、何らその他の疾病も持っていなかった。本研究の前の6か月間は、いずれの者も、どんなホルモン治療も
受けていなかった。子宮内膜症は、生検を実施された組織を病理学的に検査することによって確認された。また、疾病の程度は、アメリカ不妊学会の改訂された分類(r-AFS)によ
って行った。募集された女性は全員この研究手順に参加する前に同意書類に署名した。本研究は病院の倫理委員会による承認の後に行われた。
[Materials and methods]
[Patients and groups]
59 people from November 2006 to March 2007 to discover diagnostic biomarkers with potential in the Department of Obstetrics and Gynecology, National Hospital Organization Kyoto Medical Center Of patients with endometriosis before surgery, 31 patients with benign gynecological disease, 30 healthy female volunteers and 29 postoperative endometriosis patients.
All recruited women had no other illnesses as a result of physical and biochemical tests. During the six months prior to this study, no one had received any hormonal treatment. Endometriosis was confirmed by pathological examination of the biopsied tissue. The degree of illness was determined by the revised classification (r-AFS) of the American Infertility Society. All recruited women signed consent forms before participating in this study procedure. This study was conducted after approval by the hospital ethics committee.
本研究では血清サンプルは3つのグループに分けられた:
手術前の子宮内膜症のグループで、59人の子宮内膜症患者から成り、異なる臨床病期:
段階I(n=9)、段階II(n=20)、段階III(n=14)および段階IV(n=16)
を有していた。
年齢を一致させた子宮内膜症でない31人の患者(13人は良性の卵巣腫瘍、18人は筋腫)、および、年齢を一致させた30人の健康な女性(国立病院機構京都医療センター付属看護学
校の中年夫人クラスの学生)を、対照群（コントロール群）として組み入れた。
手術前の子宮内膜症患者および対照群は、予備研究のグループとテストのグループに無作為的に選択されて分けられた(表１)。さらに29人の手術後の子宮内膜症患者が手術と関係する潜在的に可能性を有するバイオマーカーを同定確認するために募集された。腹水サンプルは2つのグループ:
(1)異なる臨床病期の30人の子宮内膜症患者から成っている被検群、段階I(n=5)、段階II(n=10)、段階III(n=7)および段階IV(n=8) 、そして、
(2) 年齢を一致させた子宮内膜症でない31人の患者(13人は良性の卵巣腫瘍、18人は筋
腫)から成っている対照群（コントロール群）
を包含している。
In this study, serum samples were divided into three groups:
A group of pre-operative endometriosis, consisting of 59 patients with endometriosis, with different clinical stages:
Stage I (n = 9), Stage II (n = 20), Stage III (n = 14) and Stage IV (n = 16)
Had.
31 patients with age-matched endometriosis (13 are benign ovarian tumors, 18 are fibroids), and 30 age-matched healthy women (attached to the National Hospital Organization Kyoto Medical Center) Nursing school middle-aged wife class students) were included as a control group.
Preoperative endometriosis patients and control groups were randomly selected and divided into a preliminary study group and a test group (Table 1). In addition, 29 postoperative endometriosis patients were recruited to identify potential biomarkers associated with surgery. Ascites samples are in two groups:
(1) Test group consisting of 30 patients with endometriosis of different clinical stages, stage I (n = 5), stage II (n = 10), stage III (n = 7) and stage IV (n = 8) and
(2) A control group consisting of 31 patients with age-matched endometriosis (13 benign ovarian tumors and 18 myomas)
Is included.
〔血清サンプルと腹水サンプル〕
募集されたすべての女性から5mLの末梢血を集めた。手術前の子宮内膜症グループおよ
び対照群については、血液サンプルは、腹腔鏡手術の前日に集められた。健康な女性ボランティアの血液サンプルは2007年1月29日に集められた。また、手術後の被検群について
は、血液サンプルを腹腔鏡手術後4〜5週に集められた。血液は、すべて静脈穿刺により、3.2％クエン酸ナトリウムの入った真空管に採取された。
5〜10 mLの腹水試料は、腹腔鏡手術を受ける被検群と腹腔鏡手術を受ける対照群から得られた。各試料は1時間4℃に置かれて血液凝固させ、4℃で20分間3000rpmで遠心分離し、細胞成分を除いた。血清サンプルを集め、分注され、使用まで-80℃で凍結保管せしめら
れた。
[Serum sample and ascites sample]
5 mL of peripheral blood was collected from all recruited women. For the preoperative endometriosis group and the control group, blood samples were collected the day before laparoscopic surgery. Blood samples from healthy female volunteers were collected on January 29, 2007. For the test group after surgery, blood samples were collected 4 to 5 weeks after laparoscopic surgery. All blood was collected by venipuncture into a vacuum tube containing 3.2% sodium citrate.
5-10 mL ascites samples were obtained from the test group undergoing laparoscopic surgery and the control group undergoing laparoscopic surgery. Each sample was placed at 4 ° C. for 1 hour to clot blood and centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. to remove cellular components. Serum samples were collected, dispensed, and stored frozen at -80 ° C until use.
〔試料調製法〕
凍結血清を解凍した。各検体からの血清(10μl)を、1.5 mL マイクロチューブにおいて、U9緩衝液(9mmol/L尿素、2%CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液、pH 9.0)の20μlと共にボルテックスし、4℃
で30分間200rpmの速度で振盪して、蛋白質を変性させた。変性処理された試料(10μl)と120μlの吸収/脱離バッファー(100mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH 7.0)を混合し、10秒間振盪した。
[Sample preparation method]
The frozen serum was thawed. Serum (10 μl) from each sample was placed in a 1.5 mL microtube in U9 buffer (9 mmol / L urea, 2% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propane sulfonate), 50 mmol / L. Vortex with 20 μl of Tris-HCl buffer, pH 9.0), 4 ° C
The protein was denatured by shaking at 200 rpm for 30 minutes. The denatured sample (10 μl) and 120 μl of absorption / desorption buffer (100 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.0) were mixed and shaken for 10 seconds.
〔チップの選択、および、調製〕
４種類のタイプのチップ(Ciphergen Biosystems社、フリーモント(CA)、米国)、即ち、表面化学特性が、疎水性、イオン性、カチオン性、金属結合性のチップをテストして、どれが最良の血清プロフィールを提供することができるかを決定した。評価の後に、本研究のため、IMAC30-Cu ProteinChip (Ciphergen Biosystems社、フリーモント(CA)、米国)を選択した。IMAC30-Cuチップ・アレイを50μlの100mM CuSO4で各アレイ上を被覆し、4℃で5分間200rpmで振盪した。
アレイを洗浄し、蒸留水で5回素早くすすいだ。そして、50μlの100mM酢酸ナトリウム(pH 4.0)溶液を各アレイに加え、4℃で5分間200rpmで振盪した。アレイを洗浄し、蒸留水
で5回素早くすすいだ。そして、150μlの吸収/脱離バッファーを各チップ・アレイに適用し、そのチップを4℃で5分間 200rpmで振盪した。その吸収/脱離バッファーを廃棄し、もう１度繰り返した。希釈された血清50μlを各チップ・アレイに加えた。そして、そのチ
ップを4℃で60分間200rpmで振盪した。血清/緩衝液混合物を廃棄し、150μlの吸収/脱離
バッファーを各チップ・アレイに加え、そのチップを4℃で5分間200rpmで振盪し、そしてもう１度繰り返した。バッファーを棄て、そのチップをシェーカーから外し、空気乾燥した。15μlのシアン化メチルおよび15μlの1%のTFAをエネルギー吸収する分子(EAM): 0.001mgSPAに加え、5分間振盪し、1分間遠心分離した。SELDI分析の前に、0.5μlのSPAを各チップ・アレイ上に2度適用し、各SPA適用の間にアレイ表面が風乾するようにした。
[Chip selection and preparation]
Four types of chips (Ciphergen Biosystems, Fremont (CA), USA), that is, chips with surface chemistry that are hydrophobic, ionic, cationic, and metal-binding, are best tested. It was determined whether a serum profile could be provided. After evaluation, IMAC30-Cu ProteinChip (Ciphergen Biosystems, Fremont (CA), USA) was selected for this study. The IMAC30-Cu chip array was coated on each array in 100 mM CuSO 4 for 50 [mu] l, and shaken for 5 min 200rpm at 4 ° C..
The array was washed and rinsed quickly 5 times with distilled water. Then 50 μl of 100 mM sodium acetate (pH 4.0) solution was added to each array and shaken at 4 ° C. for 5 minutes at 200 rpm. The array was washed and rinsed quickly 5 times with distilled water. 150 μl of absorption / desorption buffer was then applied to each chip array and the chip was shaken at 4 ° C. for 5 minutes at 200 rpm. The absorption / desorption buffer was discarded and repeated once more. 50 μl of diluted serum was added to each chip array. The chip was then shaken at 200 rpm for 60 minutes at 4 ° C. The serum / buffer mixture was discarded, 150 μl of absorption / desorption buffer was added to each chip array, the chip was shaken at 200 rpm for 5 minutes at 4 ° C. and repeated once more. The buffer was discarded and the chip was removed from the shaker and air dried. 15 μl of methyl cyanide and 15 μl of 1% TFA were added to the energy absorbing molecule (EAM): 0.001 mg SPA, shaken for 5 minutes and centrifuged for 1 minute. Prior to SELDI analysis, 0.5 μl of SPA was applied twice on each chip array to allow the array surface to air dry between each SPA application.
〔SELDI分析〕
チップをプロテイン・バイオロジカル・システム質量分析計リーダー上に置いた。NP20チップ(それは分子質量標準物であるオール・イン・ワン・ペプチドを含有している)を使って、測定のその日に質量の精度を調整した。装置パラメーターをセットして、データを読むための手順を当該Ciphergen Proteinchipにおいてプログラムした。コンピューター
は、1 x 109 Hzの速度でプライマリーデータを受け取り、蛋白質のマススペクトルグラフを迅速且つ正確にプロットする。Y軸は、各蛋白質の蛋白質相対含量を表わし、また、X軸は、蛋白質の電荷に対する質量の比率を表わす。
[SELDI analysis]
The chip was placed on a protein biological system mass spectrometer reader. An NP20 chip (which contains an all-in-one peptide, a molecular mass standard) was used to adjust mass accuracy on the day of measurement. The procedure for setting instrument parameters and reading the data was programmed in the Ciphergen Proteinchip. The computer receives primary data at a rate of 1 x 10 9 Hz and plots the protein mass spectrum graph quickly and accurately. The Y axis represents the relative protein content of each protein, and the X axis represents the ratio of the mass to the charge of the protein.
〔統計分析〕
データ分析は、3つの段階：
(a)ピーク検知および整列;
(b)最も高い識別力を持つピークの選択;
(c)決定木アルゴリズムを使うデータ分析
を包含するものである(Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cance
r., Lancet, 2002;359:572-7; Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men., Cancer Res, 2002;62:3609-14)。
29人の手術前子宮内膜症患者、子宮内膜症のない15人の患者および15人の健康な女性で、予備研究群を構成した。一方、試験群は、30人の手術前の子宮内膜症患者、子宮内膜症のない16人の患者および15人の健康な女性から成るものであった。ピーク検出は、Ciphergen ProteinChipソフトウェア・バージョン4.0 (Ciphergen Biosystems社、フリーモント(CA)、米国)を使って行なわれた。1,000から20,000ダルトンまでの質量範囲が選択された。低い質量(m/z<1,000)および低い強度のピーク(m/z>20,000)を除去するために、この範
囲に注目した。
ピーク検出法は、(a)ベースライン減算法、(b)質量精度較正法および(c)自動ピーク検
出法を包含するものである。バイオマーカー・ウィザード(Ciphergen Biosystems社、フ
リーモント(CA)、米国)を使って、多数のスペクトルにわたって一貫した蛋白質ピークの
セットを表わすバイオマーカーを生成した。決定木分類アルゴリズムの構築は予備研究のデータセットを使うことにより行なわれた。同じM/Zを持っている蛋白質の質量を各グル
ープに関して比較するために分散分析(ANOVA)を行った。データのグループ化および相関
分析は、BioMarker Pattern 4.0 (対象は決定木方法により分類された)を使って解析された。
〔CA125測定〕
IMMULITE (DPC、米国)を使って、化学発光免疫測定(chemiluminescence immunoassay, CLIA)を使用して、同じ予備研究とテストのセットに対する血清CA125値を測定した。カットオフ値を16.3U/mlにセットした。
[Statistical analysis]
Data analysis has three stages:
(a) peak detection and alignment;
(b) selection of the peak with the highest discriminating power;
(c) Data analysis using decision tree algorithms (Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cance
r., Lancet, 2002; 359: 572-7; Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men., Cancer Res, 2002; 62: 3609-14).
The preliminary study group consisted of 29 preoperative endometriosis patients, 15 patients without endometriosis and 15 healthy women. The study group, on the other hand, consisted of 30 pre-operative endometriosis patients, 16 patients without endometriosis and 15 healthy women. Peak detection was performed using Ciphergen ProteinChip software version 4.0 (Ciphergen Biosystems, Fremont, Calif., USA). A mass range from 1,000 to 20,000 daltons was selected. This range was noted in order to remove low mass (m / z <1,000) and low intensity peaks (m / z> 20,000).
Peak detection methods include (a) baseline subtraction method, (b) mass accuracy calibration method and (c) automatic peak detection method. A biomarker wizard (Ciphergen Biosystems, Fremont, Calif., USA) was used to generate biomarkers that represent a consistent set of protein peaks across multiple spectra. The decision tree classification algorithm was constructed by using the preliminary research data set. Analysis of variance (ANOVA) was performed to compare the mass of proteins with the same M / Z for each group. Data grouping and correlation analysis were analyzed using BioMarker Pattern 4.0 (subjects were classified by the decision tree method).
[CA125 measurement]
Serum CA125 values for the same preliminary study and test set were measured using IMMULITE (DPC, USA) using chemiluminescence immunoassay (CLIA). The cut-off value was set at 16.3 U / ml.
〔結果〕
〔再現性〕
精度管理(QC)用試料を使って、SELDIスペクトルの再現性を証明することに成功した。
それぞれ、ピーク位置に対する分析内および分析間変動係数は、両方とも0.05%であった
。また、標準化された強度(ピーク高さあるいは相対的な濃度)に対する分析内及び分析間変動係数は、11%および16%であった。日々のサンプリングや使用機械での変動あるいはチップ変動はほとんどなかった。正確で且つ再現可能な特徴の選択が、SELDI法によるデー
タ解析法開発成功の為の、最も重要な、かつ、最初の一歩であると思われた。血清試料において使われる本システムの許容される変化を分析内および分析間で調べた結果、本研究において信頼性を持ってそれを使用できるものであることがわかっている。
〔result〕
〔Reproducibility〕
We succeeded in proving the reproducibility of the SELDI spectrum using a sample for quality control (QC).
The intra-analysis and inter-analysis variation coefficients for the peak position were both 0.05%. The intra-analytical and inter-analytical variability coefficients for standardized intensity (peak height or relative concentration) were 11% and 16%. There were almost no fluctuations in daily sampling, machines used, or chips. The selection of accurate and reproducible features seemed to be the most important and first step for the successful development of a data analysis method using the SELDI method. Examining the permissible changes of the system used in serum samples within and between analyses, it has been found that it can be used reliably in this study.
〔予備研究群に関してのデータ分析〕
〔マススペクトルグラフ分析〕
予備研究群セットのSELDIスペクトルから、1,000〜20,000のm/zの範囲に合計98個の補
正を加えてないピークを確認した。手術前子宮内膜症グループと対照グループとの比較は、BioMarker Wizardソフトウェアにより行った。結果は、異なる43個の蛋白質ピークがあることを示しており（図１）、その蛋白質ピークの中では、手術前子宮内膜症グループと対照群との間で蛋白質質量の34個の違いが見つかった(P<0.05)。
[Data analysis for preliminary study group]
[Mass spectrum graph analysis]
A total of 98 uncorrected peaks in the range of 1,000 to 20,000 m / z were confirmed from the SELDI spectrum of the preliminary study set. A comparison between the pre-operative endometriosis group and the control group was made with the BioMarker Wizard software. The results show that there are 43 different protein peaks (Figure 1), of which 34 differences in protein mass between the preoperative endometriosis group and the control group. Found (P <0.05).
〔子宮内膜症特異血清蛋白質マーカーの発見〕
Biomarker Patterns Softwareを使って、対照群から生成されたスペクトルを、手術前
子宮内膜症グループのそれと比べた。この比較により、非子宮内膜症と子宮内膜症を識別する2つのピークから成るモデルが生まれた。これらの２個のピークは、5830のm/z比および8865のm/z比に相当しました(図２)。両方のピークは子宮内膜症グループにおいてアッ
プレギュレーションされていた。本モデルの精度は、93.22%(55/59)であり、その感度お
よび特異性は、それぞれ89.66%(26/29)および96.67%(29/30)であった(表２)。
[Discovery of endometriosis-specific serum protein markers]
Using Biomarker Patterns Software, the spectrum generated from the control group was compared with that of the preoperative endometriosis group. This comparison resulted in a model with two peaks that discriminate between non-endometriosis and endometriosis. These two peaks corresponded to an m / z ratio of 5830 and an m / z ratio of 8865 (Figure 2). Both peaks were up-regulated in the endometriosis group. The accuracy of this model was 93.22% (55/59), and its sensitivity and specificity were 89.66% (26/29) and 96.67% (29/30), respectively (Table 2).
〔テスト群に対する盲検検知法〕
盲検法群は子宮内膜症症30例と対照31例が、非子宮内膜症と子宮内膜症を識別する目的で、このモデルの評価のために使われた。本研究では、30の子宮内膜症症例のうちの27人、および、子宮内膜症でない16人の患者のうちの15人および15人の健康な女性のうちの15人の女性患者症例が、91.80%(56/61)の正確さで、正しく分類された。感度と特異性は、
それぞれ、86.67%(26/30)および96.77%(30/31)であった(表２)。
〔CA125検知法の結果〕
CA125値は、予備研究群とテスト群のすべての被験者において利用可能であった。上記
されたと同様の方法を使って、非子宮内膜症と子宮内膜症を識別することに関し、CA125
が44.8%の感度および83.9%の特異性を持っていることを見出した(表２)。本研究から同定確認された２つのマーカーは、対照から子宮内膜症患者を識別することに関しては、CA125より著しく良かった(P<0.05)。
[Blind detection method for test group]
In the blinded group, 30 endometriosis and 31 controls were used to evaluate this model with the aim of distinguishing non-endometriosis from endometriosis. In this study, 27 out of 30 cases of endometriosis and 15 out of 16 patients with no endometriosis and 15 out of 15 healthy women , Correctly classified with 91.80% (56/61) accuracy. Sensitivity and specificity are
They were 86.67% (26/30) and 96.77% (30/31), respectively (Table 2).
[Results of CA125 detection method]
CA125 values were available for all subjects in the preliminary study group and test group. Regarding the discrimination between non-endometriosis and endometriosis using methods similar to those described above, CA125
Was found to have a sensitivity of 44.8% and a specificity of 83.9% (Table 2). The two identified and confirmed markers from this study were significantly better than CA125 in distinguishing endometriosis patients from controls (P <0.05).
〔手術前と手術後の子宮内膜症グループについてのデータ分析〕
〔マススペクトルグラフ分析〕
子宮内膜症グループの手術前症例29例、および、手術後症例の29症例の比較を、バイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア(BioMarker Wizard software)により行った。
結果は、差異を有している47箇所の蛋白質ピークがあり(図３)、その中で、手術前及び手術後の子宮内膜症グループ間で蛋白質質量で30箇所の差異が見つかった(P<0.05)。
〔バイオマーカー分析〕
バイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア(BioMarker Wizard software)を使って、
子宮内膜症グループの手術前症例29例、および、手術後症例の29症例に関し、血清蛋白質の成分を解析した。
m/z比5830に相当する一つの蛋白質質量が、手術前後の子宮内膜症グループを正確に分
けることができることを見出した。5830のm/z比のところの手術前子宮内膜症グループの
血清蛋白質含量は、手術後の子宮内膜症グループのそれより著しく高かった(図４)。本マススペクトルプロフィールは、手術前の試料ではm/z 5830のピークがアップレギュレーションされていることを明らかにしている。
手術前の試料の平均ピーク強度は、10.593±5.458で、それに対し、手術後の試料では1.891±1.019のピーク強度であった(P<0.001)。バイオマーカー・パターン・ソフトウェア(BioMarker Pattern software)による解析の結果は、子宮内膜症手術前症例26例と子宮内膜症手術後症例29例を、94.83%(55/58)までの精度比でもって、正確に分類できることを
示すものであった。その感度と特異性は、それぞれ89.65%(26/29)および100%(29/29)であった。また、本ピークは健康なボランティアのスペクトルにおいては存在しなかった。
また、m/z比8865に相当する一つの蛋白質質量についても、上記m/z比5830と同様のこと
が期待できると考えられる。
[Data analysis for endometriosis groups before and after surgery]
[Mass spectrum graph analysis]
A comparison of 29 preoperative cases and 29 postoperative cases in the endometriosis group was performed using BioMarker Wizard software.
As a result, there are 47 protein peaks with differences (Fig. 3). Among them, 30 differences in protein mass were found between endometriosis groups before and after surgery (P <0.05).
[Biomarker analysis]
Using BioMarker Wizard software,
Serum protein components were analyzed in 29 cases before and after surgery in the endometriosis group.
It was found that one protein mass corresponding to the m / z ratio 5830 can accurately separate the endometriosis group before and after surgery. The serum protein content of the preoperative endometriosis group at an m / z ratio of 5830 was significantly higher than that of the postoperative endometriosis group (FIG. 4). This mass spectral profile reveals that the m / z 5830 peak is up-regulated in the preoperative sample.
The average peak intensity of the pre-operative sample was 10.593 ± 5.458, whereas the post-operative sample had a peak intensity of 1.891 ± 1.019 (P <0.001). The results of the analysis using the BioMarker Pattern software show that the accuracy ratio of 26 cases before endometriosis surgery and 29 cases after endometriosis surgery is 94.83% (55/58). Therefore, it was shown that it can be classified correctly. Its sensitivity and specificity were 89.65% (26/29) and 100% (29/29), respectively. This peak was not present in the healthy volunteer spectrum.
In addition, it is considered that the same protein mass corresponding to the m / z ratio 5830 can be expected for one protein mass corresponding to the m / z ratio 8865.
〔手術前の子宮内膜症グループ、コントロールグループ、手術後の子宮内膜症グループにおけるm/z比 5,830の血清蛋白質含量〕
手術前の子宮内膜症のm/z 5,830の血清蛋白質含量は、コントロール及び手術後の子宮
内膜症のそれらより著しく高かった(P<0.01)。一方、コントロールグループと手術後の子宮内膜症グループでは、何らの相違もなかった(p>0.05)(表３)。同様に、手術前の子宮内膜症のm/z 8,865の血清蛋白質含量も、コントロール及び手術後の子宮内膜症のそれらよ
り著しく高い一方、コントロールグループと手術後の子宮内膜症グループでは、何らの相違もなかった(表４)。また、手術前の子宮内膜症グループの臨床病期毎のm/z 5,830及びm/z 8,865の血清蛋白質含量についての結果を、それぞれ、図５及び６に示す。
[Serum protein content of m / z ratio 5,830 in endometriosis group, control group, and endometriosis group after surgery]
The serum protein content of m / z 5,830 in endometriosis before surgery was significantly higher than those in endometriosis after control and surgery (P <0.01). On the other hand, there was no difference between the control group and the postoperative endometriosis group (p> 0.05) (Table 3). Similarly, the serum protein content of m / z 8,865 in endometriosis before surgery is significantly higher than those in control and postoperative endometriosis, while in the control group and postoperative endometriosis group, There was no difference (Table 4). Moreover, the result about the serum protein content of m / z 5,830 and m / z 8,865 for every clinical stage of the endometriosis group before an operation is shown to FIG. 5 and 6, respectively.
〔子宮内膜症患者からの腹水試料および非子宮内膜症患者からの腹水試料についてのデータ解析〕
子宮内膜症患者からの30の腹水試料と非子宮内膜症患者からの30の腹水試料の比較をバイオマーカー・ウィザード・ソフトウェア(BioMarker Wizard software)を使って実施し
た。
結果は、相違を有している28箇所の蛋白質ピークが存在している(図５)ということを示すもので、その中で、試験群と対照群の間で蛋白質質量で7箇所の違いが見出された(P<0.05)。この比較で、子宮内膜症の腹水と非子宮内膜症の腹水とを区別する2つのピークから成るモデルが得られた。これらの2つのピークは、6516と9022のm/z比に相当するものであった(図６)。本マススペクトルプロフィールは、子宮内膜症患者ではm/z 6516のピークがアップレギュレーションされており、m/z 9022のピークがダウンレギュレーションされていることを明らかにしている。m/z 6516のピークは、子宮内膜症グループにおいてアップレギュレーションされていた。また、m/z 9022のピークは、子宮内膜症グループにおいてダウンレギュレーションされていた。バイオマーカー・パターン・ソフトウェア(BioMarker Pattern software)による解析の結果は、88.33%(53/60)までの精度でもって、子宮内
膜症の28症例および非子宮内膜症の25症例が正しく分類されることを示している。その感度と特異性は、それぞれ93.33%(28/30)および83.33%(25/30)であった。
[Data analysis of ascites samples from endometriosis patients and ascites samples from non-endometriosis patients]
A comparison of 30 ascites samples from endometriosis patients and 30 ascites samples from non-endometriosis patients was performed using BioMarker Wizard software.
The results show that there are 28 protein peaks with differences (Fig. 5), among which there are 7 differences in protein mass between the test group and the control group. Found (P <0.05). This comparison resulted in a model consisting of two peaks that differentiated between endometriosis and non-endometriosis ascites. These two peaks corresponded to m / z ratios of 6516 and 9022 (FIG. 6). This mass spectral profile reveals that the m / z 6516 peak is up-regulated and the m / z 9022 peak is down-regulated in endometriosis patients. The m / z 6516 peak was up-regulated in the endometriosis group. The peak at m / z 9022 was down-regulated in the endometriosis group. The results of analysis with BioMarker Pattern software correctly classify 28 cases of endometriosis and 25 cases of non-endometriosis with an accuracy of up to 88.33% (53/60). Which indicates that. Its sensitivity and specificity were 93.33% (28/30) and 83.33% (25/30), respectively.
〔検討〕
本発明では、SELDI-TOF-MS蛋白質チップ技術が子宮内膜症バイオマーカーの同定確認に応用された。
蛋白質チップ技術は、様々な疾病に対して潜在的可能性を有するバイオマーカーを同定
確認することにハイ・スループットのプロテオミクス技術を応用することを可能にする。本革新的な技術は、多数の長所を持っており、例えば、少量の試料を同時に適用できるとか、比較的短い実験の時間を実現可能とするとか、前もっての精製ステップなしにチップ表面上で発現された蛋白質の強度の差により、同じチップ上でペプチド・サイズの分離および同定確認することができるなどである(Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002; 359: 572-7; Petricoin III EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer. J Natl Cancer Inst 2002; 94: 1576-8; Rogers MA, Clarke P, Noble J, Munro NP, Paul A, Selby PJ, et al. Proteomic profiling of urinary proteins in renal cancer by surface enhanced laser desorption ionization and neural-network analysis: identification of key issues affecting potential clinical utility. Cancer Res 2003; 63: 6971-83; Shiwa M, Nishimura Y, Wakatabe R, Fukawa A, Arikuni H, Ota H, et al. Rapid discovery and identification of a tissue-specific tumor biomarker from 39 human cancer cell lines using the SELDI ProteinChip platform. Biochem Biophys Res Commun 2003; 309: 18-25)。チップ・アレイは、疎水性の蛋白質、陰イオン性の蛋白質、陽イオン性の蛋白質、あるいは、親水性の蛋白質に対して特異性を示すようなものである。さらに、チップ・アレイは、抗体-抗原相互作用、
受容体-リガンド相互作用、あるいは、DNA-蛋白相互作用を利用して、特異的な蛋白質を
釣り上げることを可能にするものであってよい。こうしたことから、診療処置行為あるいは疾病というものが、疎水性の蛋白質又は陰イオン性の蛋白質を発現させることを予想させるか否かを同定し確認するには、あるいは、１つの特異的な標的蛋白質の発現を増加させると予想させるか否かを同定し確認するには、予備的な知識が必要とされよう。
〔Consideration〕
In the present invention, the SELDI-TOF-MS protein chip technology was applied to the identification and confirmation of endometriosis biomarkers.
Protein chip technology allows high-throughput proteomics technology to be applied to identify and confirm potential biomarkers for various diseases. This innovative technology has a number of advantages, such as being able to apply a small amount of sample at the same time, enabling a relatively short experimental time, or expressing on the chip surface without a prior purification step. Peptide size separation and identification can be confirmed on the same chip due to the difference in the strength of the synthesized proteins (Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer.Lancet 2002; 359: 572-7; Petricoin III EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer J Natl Cancer Inst 2002; 94: 1576-8; Rogers MA, Clarke P, Noble J, Munro NP, Paul A, Selby PJ, et al. Proteomic profiling of urinary proteins in renal cancer by surface enhanced laser desorption ionization and neural -network analysis: identification of key issues affectin g potential clinical utility.Cancer Res 2003; 63: 6971-83; Shiwa M, Nishimura Y, Wakatabe R, Fukawa A, Arikuni H, Ota H, et al. Rapid discovery and identification of a tissue-specific tumor biomarker from 39 human cancer cell lines using the SELDI ProteinChip platform. Biochem Biophys Res Commun 2003; 309: 18-25). The chip array is such that it exhibits specificity for a hydrophobic protein, an anionic protein, a cationic protein, or a hydrophilic protein. In addition, the chip array has antibody-antigen interactions,
It may be possible to pick up a specific protein using receptor-ligand interaction or DNA-protein interaction. Therefore, to identify and confirm whether a medical treatment action or disease is expected to express a hydrophobic protein or an anionic protein, or one specific target protein Prior knowledge will be required to identify and confirm whether it is expected to increase the expression of.
本発明では、疎水性表面化学性状、イオン性表面化学性状、陽イオン性表面化学性状、そして、金属結合の表面化学性状を有しているチップの4つのタイプのチップをテストし
た。評価の結果、金属結合の表面化学性状を有しているチップ、すなわち、銅結合の表面化学性状を有しているチップIMAC30-Cu ProteinChipを選択した。
本蛋白質チップを使用して、手術前の子宮内膜症患者からの蛋白質スペクトルを、非子宮内膜症対照群からの対応するスペクトルと比較した。分析に使われた質量スペクトルデータは、フィルター処理されていないものであり、それゆえ、実際の蛋白質の特徴を示す信号に加えて、電気的なノイズ、化学的ノイズを含んでいた。さらに、疾病カテゴリーと無関係なサンプル間での差異による変動や日々派生する変動は、本来的に、すべてのスペクトルに影響を及ぼすであろう。
したがって、遺伝学的なアルゴリズムの力を使った。該アルゴリズムは、ノイズを含むスペクトルにおいて問題となるピークをうまく除去することができる。本発明の分析で、2つの候補マーカーから成る多変数のモデルが提供されることが見出された。それらのマ
ーカーは両方とも、子宮内膜症患者においてアップレギュレーションされていた。盲検法群を使用して、このモデルが非子宮内膜症と子宮内膜症とを区別することができるか否かを評価した。結果、その感度と特異性は86.67%および96.77%であった。
In the present invention, four types of chips were tested: a hydrophobic surface chemistry, an ionic surface chemistry, a cationic surface chemistry, and a chip having a metal bonded surface chemistry. As a result of the evaluation, a chip having a metal bond surface chemistry, that is, a chip IMAC30-Cu ProteinChip having a copper bond surface chemistry was selected.
Using this protein chip, protein spectra from endometriosis patients before surgery were compared with corresponding spectra from non-endometriosis control groups. The mass spectral data used for the analysis was unfiltered and therefore contained electrical and chemical noise in addition to signals indicative of actual protein characteristics. In addition, variations due to differences between samples unrelated to the disease category and variations derived daily will inherently affect all spectra.
Therefore, we used the power of genetic algorithms. The algorithm can successfully remove problematic peaks in a noisy spectrum. The analysis of the present invention has been found to provide a multivariable model consisting of two candidate markers. Both of these markers were upregulated in patients with endometriosis. A blinded group was used to assess whether this model can distinguish between non-endometriosis and endometriosis. As a result, the sensitivity and specificity were 86.67% and 96.77%.
腫瘍抗原CA125は、卵巣癌の検知およびモニタリングに典型的に使われている [Rai AJ,
Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al., Proteomic approaches
to tumor marker discovery., Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 1518-26; Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW., Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer., Clin Chem 2002; 48: 1296-304]。さらに、そのCA125は子宮内膜症の診断においても使わる。しかしながら、CA125はその低い感度・特異性により、このCA125抗原の使用はやや限界のあるものである。卵巣癌は高いCA125値を持っており、さらに、その卵巣癌は非子宮内膜症疾病のうち
の重要な構成員の1つであることである。本試験では、対照群に卵巣癌が含まれないこと
から、子宮内膜症と非子宮内膜症とを区別するという点では、そのCA125の特異性は、疑
いなく、一見、より大きなものとなっている。
The tumor antigen CA125 is typically used to detect and monitor ovarian cancer [Rai AJ,
Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al., Proteomic approaches
to tumor marker discovery., Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 1518-26; Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW., Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer., Clin Chem 2002; 48: 1296-304]. CA125 is also used in the diagnosis of endometriosis. However, the use of CA125 antigen is somewhat limited due to its low sensitivity and specificity. Ovarian cancer has a high CA125 value, and furthermore, it is one of the important members of non-endometriosis diseases. In this study, because the control group does not include ovarian cancer, the specificity of CA125 is undoubtedly larger at first glance in terms of distinguishing between endometriosis and non-endometriosis. It has become.
本試験を通して、血清のSELDIプロファイリングにより、良性の疾病の患者や健康な女
性から子宮内膜症を持った患者を識別するという点では、本発明の手法はCA125より著し
くよいことが実証された。本試験の結果、SELDIにより分離された多数の蛋白質の組合わ
せを選択すると、潜在的可能性を有する診断のアプローチになるということが示された。
手術前の患者および手術後の子宮内膜症患者の間の血清蛋白質変動を比較したところ、m/z比5830に対応する一つの蛋白質のマスにより、手術前及び手術後の子宮内膜症のグル
ープを正確に分離できることが示された。手術前の子宮内膜症患者のm/z 5,830の血清蛋
白質含量は、対照および手術後の子宮内膜症患者のそれよりも著しく高かった。しかし、対照および手術後の子宮内膜症グループでは、それは何ら著しい差はなっかった。このことは、m/z 5,830の蛋白質が子宮内膜症診断及び／又はモニター治療のための新規血清バ
イオマーカーであることを示している。
Throughout this study, it was demonstrated that the technique of the present invention is significantly better than CA125 in that SELDI profiling of serum distinguishes benign disease patients and healthy women from endometriosis. The results of this study showed that selecting a large number of protein combinations separated by SELDI would result in a potential diagnostic approach.
A comparison of serum protein variability between preoperative and postoperative endometriosis patients revealed that one protein mass corresponding to an m / z ratio of 5830 showed a preoperative and postoperative endometriosis. It was shown that groups can be separated accurately. The serum protein content of m / z 5,830 in patients with endometriosis before surgery was significantly higher than that in controls and patients with endometriosis after surgery. However, in the control and postoperative endometriosis groups, it was not significantly different. This indicates that the m / z 5,830 protein is a novel serum biomarker for endometriosis diagnosis and / or monitoring treatment.
Joshi et al. (Joshi, S.G., Zamah, N.M., Raikai, R.S. et al. Serum and peritoneal fluid proteins in women with and without endometriosis., Fertil. Steril., 1986, 46, 1077-1082)は、SDSおよびネイティブPAGEを用い、子宮内膜症を持った女性および正常な女性の腹水を比べた。そこで、18/20の分泌期の腹水サンプルに、増殖期のサンプ
ルにおいては存在していない蛋白質(M, 70,000)を見つけてはいるが、その結果は何ら有
意の違いはないということを示すものであった。本蛋白質の特性を示すような文献報告書はない。Tabibzedeh及びその共同研究者は、2-DEを使用して、不妊症の女性及び子宮内膜症では全くない女性で観察された腹水の蛋白質は、健全な対照群のものと異なるところがなく、症状の軽い子宮内膜症では、対照群と比較して、35〜40 Kda及びpI 5.7〜6.0の範
囲にある蛋白質が僅かに減少することが付随していると報告している。しかしながら、劇症の子宮内膜症の女性では、同じ蛋白質スポットのところに比較的大きな減少が観察され、また、対照と比較して、さらに、多数の他の蛋白質の量が2〜4倍増加することが、劇症の子宮内膜症の女性で見られた(Tabibzadeh, S., Becker, J.L., Parsons, A.K., Endometriosis is associated with alterations in the relative abundance of proteins and IL-10 in the peritoneal fluid. Front. Biosci. 2003, 8, A70-A78)。しかし、現在
まで、これらの発見は子宮内膜症に対する診断薬の開発にまで歩みを進めるものではなかった。
Joshi et al. (Joshi, SG, Zamah, NM, Raikai, RS et al. Serum and peritoneal fluid proteins in women with and without endometriosis., Fertil. Steril., 1986, 46, 1077-1082) are SDS and native. PAGE was used to compare the ascites of women with endometriosis and normal women. Therefore, in the 18/20 secretory phase ascites sample, we found a protein (M, 70,000) that was not present in the growth phase sample, but the results showed no significant difference. Met. There are no literature reports showing the properties of this protein. Tabibzedeh and co-workers found that using 2-DE, the ascites protein observed in infertile women and women with no endometriosis was no different from that in healthy controls and symptoms It is reported that mild endometriosis is associated with a slight decrease in proteins in the range of 35-40 Kda and pI 5.7-6.0 compared to the control group. However, in fulminant endometriosis women, a relatively large decrease was observed at the same protein spot, and the amount of many other proteins increased by 2-4 fold compared to controls. It was seen in women with fulminant endometriosis (Tabibzadeh, S., Becker, JL, Parsons, AK, Endometriosis is associated with alterations in the relative abundance of proteins and IL-10 in the peritoneal fluid Front. Biosci. 2003, 8, A70-A78). However, to date, these findings have not advanced the development of diagnostics for endometriosis.
本発明では、SELDI-TOF-MSを使って比較を行うことにより、子宮内膜症の腹水と非子宮内膜症の腹水とを区別できる２つのピークから成るモデルが提供されている。これらの二つのピークは、6516のm/z比と9022のm/z比に相当するものであった。m/z 6516のピークは、子宮内膜症グループ中でアップレギュレーションされていた。また、m/z 9022のピークは、子宮内膜症グループ中でダウンレギュレーションされていた。その感度と特異性は、それぞれ、93.33%および83.33%であった。
結論として、SELDI-TOF-MS蛋白質チップを使用して、新規な子宮内膜症の血清および腹水のバイオマーカーを同定確認できた。これらの蛋白質マーカーは、新規な子宮内膜症蛋白質である可能性が高いものである。該蛋白質は、手術の後の子宮内膜症診断および微小転移性病態のモニタリングに役立つ可能性が高いものである。
子宮内膜症と非子宮内膜症とを識別した血清の2つのバイオマーカーピークモデルは、89.66%の感度および96.67%の特異性で子宮内膜症診断を可能とする。盲検法で検討した結
果も、CA125では、43.33%の感度および80.64%の特異性であるのと比較して、本発明の樹
立された血清の2つのバイオマーカーピークモデルは、86.67%の感度および96.77%の特異
性という大変優れた結果を与える。すなわち、本発明の血清についての2つのバイオマー
カーを使用するモデルは、現在の標準マーカーCA125(P<0.05)より、著しく良い診断機能
を持っている。特には、本発明の血清についてのバイオマーカーの一つ（蛋白質ピークm/
z、5830)は、手術前の子宮内膜症と手術後の子宮内膜症とを89.65%の感度および100%の特異性でもって識別するものであることが、確認された。バイオマーカーm/z 5,830の子宮
内膜症手術前の血清蛋白質含量は、対照のものおよび子宮内膜症の手術後のものより著しく高かった(P<0.01)。一方、対照および手術後のグループでは、違いは無かった(P>0.05)。
In the present invention, a model comprising two peaks capable of distinguishing ascites of endometriosis from non-endometriosis ascites by providing a comparison using SELDI-TOF-MS is provided. These two peaks corresponded to an m / z ratio of 6516 and an m / z ratio of 9022. The m / z 6516 peak was upregulated in the endometriosis group. The m / z 9022 peak was also down-regulated in the endometriosis group. Its sensitivity and specificity were 93.33% and 83.33%, respectively.
In conclusion, the SELDI-TOF-MS protein chip could be used to identify and confirm novel endometriosis serum and ascites biomarkers. These protein markers are likely to be novel endometriosis proteins. The protein is likely to be useful for diagnosis of endometriosis after surgery and monitoring of micrometastatic pathology.
Two biomarker peak models of sera that distinguish between endometriosis and non-endometriosis allow diagnosis of endometriosis with 89.66% sensitivity and 96.67% specificity. The results of a blinded study also show that the two biomarker peak models of the established serum of the present invention have a sensitivity of 86.67% compared to CA125 with 43.33% sensitivity and 80.64% specificity. And gives a very good result of 96.77% specificity. That is, the model using two biomarkers for the serum of the present invention has a significantly better diagnostic function than the current standard marker CA125 (P <0.05). In particular, one of the biomarkers for the serum of the present invention (protein peak m /
z, 5830) was confirmed to distinguish between pre- and post-operative endometriosis with 89.65% sensitivity and 100% specificity. The serum protein content of the biomarker m / z 5,830 before endometriosis surgery was significantly higher than that of the control and after surgery for endometriosis (P <0.01). On the other hand, there was no difference between the control and postoperative groups (P> 0.05).
また、腹水の2つのバイオマーカーピークモデルは、子宮内膜症と非子宮内膜症とを93.33%の感度および83.33%の特異性でもって識別するものであることが、確認された。
上記で、新規な子宮内膜症の血清および腹水バイオマーカーが同定された。当該蛋白質マーカーは新規な子宮内膜症蛋白質である可能性がある。そして、当該蛋白質マーカーは、子宮内膜症の診断および手術後の微小転移性病態のモニタリングの指標として有用である。
特に、本発明で、血液サンプル、例えば、血清サンプルで同定されたバイオマーカー、m/z比5830に相当する蛋白質質量をもつもの、及び、m/z比8865に相当する蛋白質質量をもつものは、いずれも、単独で、子宮内膜症診断（子宮内膜症と非子宮内膜症との識別、子宮内膜症の検出及び／又はモニターリング、予後の経過観察）において、高い精度、高い感度、そして高い特異性を与えることのできるもので、優れた子宮内膜症に特異的なバイオマーカーである。当該バイオマーカーからなる子宮内膜症診断モデルは、僅か、二つのバイオマーカーで、非常に優れた精度、高い感度、そして高い特異性を与えることのできるものであり、費用面、操作の簡素化などの面で利点が大きい。さらに、当該バイオマーカーを利用すれば、免疫学的測定系の開発が可能である。
It was also confirmed that the two biomarker peak models of ascites discriminate between endometriosis and non-endometriosis with a sensitivity of 93.33% and specificity of 83.33%.
Above, novel endometriosis sera and ascites biomarkers have been identified. The protein marker may be a novel endometriosis protein. The protein marker is useful as an index for diagnosing endometriosis and monitoring micrometastatic pathology after surgery.
In particular, in the present invention, a biomarker identified in a blood sample, for example, a serum sample, one having a protein mass corresponding to an m / z ratio 5830, and one having a protein mass corresponding to an m / z ratio 8865 , Both alone, high accuracy and high in endometriosis diagnosis (discrimination between endometriosis and non-endometriosis, detection and / or monitoring of endometriosis, follow-up of prognosis) It can provide sensitivity and high specificity, and is an excellent biomarker specific for endometriosis. The diagnosis model of endometriosis consisting of the biomarkers can provide very high accuracy, high sensitivity, and high specificity with only two biomarkers. Cost and operational simplicity There are significant advantages in terms of Furthermore, an immunological measurement system can be developed by using the biomarker.
本発明では、新しい子宮内膜症血清および腹水用バイオマーカーが確認され、該マーカーを指標として使用として、高い精度、高い感度、そして高い特異性で、子宮内膜症と非子宮内膜症とを識別する技術を開発できる。すなわち、子宮内膜症の診断および手術後の微小転移性病態のモニタリング技術、それに用いる試薬などを開発できる。本発明のバイオマーカーは、単一のもので、高い精度、高い感度、そして高い特異性でもって、子宮内膜症の診断・検出・モニタリングを可能とし、単純化された子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデル、すなわち、SELDI-TOF-MSシステム測定のピークのうち、僅か、二つのピークからなる子宮内膜症に特異的なバイオマーカーモデルを構築できるし、免疫学的な検査手法の開発の可能性を拓くものである。当該バイオマーカーを利用して、子宮内膜症の診断に有効で且つより簡単な測定系の構築を可能とする。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
In the present invention, a new endometriosis serum and biomarker for ascites are confirmed, and the marker is used as an index to detect endometriosis and non-endometriosis with high accuracy, high sensitivity, and high specificity. Technology to identify That is, it is possible to develop a diagnosis technique for endometriosis, a technique for monitoring micrometastatic pathology after surgery, a reagent used therefor, and the like. The biomarker of the present invention is a single one that enables diagnosis, detection and monitoring of endometriosis with high accuracy, high sensitivity and high specificity, and is specific to simplified endometriosis Biomarker model, that is, a biomarker model specific to endometriosis consisting of only two peaks of the SELDI-TOF-MS system measurement peak, It opens up the possibility of development. By using the biomarker, it is possible to construct a simpler measurement system that is effective in diagnosing endometriosis.
It will be apparent that the invention may be practiced otherwise than as particularly described in the foregoing description and examples. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and thus are within the scope of the claims appended hereto.
Claims (9)
ーカー。 The biomarker according to claim 4 or 5, wherein the molecular weight (m / z value) at the time of SELDI-TOF-MS measurement is about 5830.
ーカー。 The biomarker according to claim 4 or 5, wherein the molecular weight (m / z value) at the time of SELDI-TOF-MS measurement is about 8865.
ァイルを測定する工程、(d)対象に薬物を投与するか、あるいは、対象の患部を除去する
などの治療処置を行う工程、(e)工程(d)の完了後、対象から第２のサンプルを得る工程、(f)質量分析により第２のサンプル中のタンパク質を分析する工程、(g)第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルを測定する工程、及び(h)第１のサンプルの質量スペクトル
プロファイルを第２のサンプルの質量スペクトルプロファイルと比較する工程を含んでおり、請求項１〜３のいずれか一に記載のバイオマーカーモデルを使用するか、あるいは、
請求項４〜７のいずれか一記載のバイオマーカーを子宮内膜症診断の指標とすることを特徴とする子宮内膜症の治療における薬物又は治療処置の有効性を評価する方法。
(a) obtaining a first sample from a subject suffering from endometriosis, (b) analyzing the protein in the first sample by mass spectrometry, (c) mass spectral profile of the first sample (D) administering a drug to the subject, or performing a therapeutic treatment such as removing the affected area of the subject, (e) after completing step (d), a second sample from the subject (F) analyzing the protein in the second sample by mass spectrometry, (g) measuring the mass spectral profile of the second sample, and (h) measuring the mass spectral profile of the first sample. Comparing with a mass spectral profile of a second sample, using the biomarker model according to any one of claims 1 to 3, or
A method for evaluating the effectiveness of a drug or therapeutic treatment in the treatment of endometriosis, characterized in that the biomarker according to any one of claims 4 to 7 is used as an index for diagnosis of endometriosis.
Priority Applications (1)
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Cited By (6)
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|---|---|---|---|---|
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| WO2020218465A1 (en) * | 2019-04-26 | 2020-10-29 | 中外製薬株式会社 | Method for diagnosing endometriosis, disease state monitoring method, and kit |
| US10837970B2 (en) | 2017-09-01 | 2020-11-17 | Venn Biosciences Corporation | Identification and use of glycopeptides as biomarkers for diagnosis and treatment monitoring |
| WO2020234280A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Stefan Kissler | In vitro test method for early detection of endometriosis and/or uterine adenomyosis |
| US11287425B2 (en) | 2009-04-22 | 2022-03-29 | Juneau Biosciences, Llc | Genetic markers associated with endometriosis and use thereof |
-
2008
- 2008-01-17 JP JP2008007622A patent/JP2009168646A/en active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8932993B1 (en) | 2007-06-11 | 2015-01-13 | Juneau Biosciences, LLC. | Method of testing for endometriosis and treatment therefor |
| US9840738B2 (en) | 2007-06-11 | 2017-12-12 | Juneau Biosciences, Llc | Method of testing for endometriosis and treatment therefor |
| US11287425B2 (en) | 2009-04-22 | 2022-03-29 | Juneau Biosciences, Llc | Genetic markers associated with endometriosis and use thereof |
| US9434991B2 (en) | 2013-03-07 | 2016-09-06 | Juneau Biosciences, LLC. | Method of testing for endometriosis and treatment therefor |
| US10837970B2 (en) | 2017-09-01 | 2020-11-17 | Venn Biosciences Corporation | Identification and use of glycopeptides as biomarkers for diagnosis and treatment monitoring |
| US11624750B2 (en) | 2017-09-01 | 2023-04-11 | Venn Biosciences Corporation | Identification and use of glycopeptides as biomarkers for diagnosis and treatment monitoring |
| WO2020218465A1 (en) * | 2019-04-26 | 2020-10-29 | 中外製薬株式会社 | Method for diagnosing endometriosis, disease state monitoring method, and kit |
| WO2020234280A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Stefan Kissler | In vitro test method for early detection of endometriosis and/or uterine adenomyosis |
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