JP2009155486A - 低分子化ヒアルロン酸とその製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】分子量や色だけでなく、その分子構造についても考慮し、特定の酸濃度と温度においてヒアルロン酸又はその塩を低分子化する。
【効果】ヒアルロン酸の褐変を生じずに、工業的な生産に好適である低分子化ヒアルロン酸又はその塩を製造できる。
【選択図】図3
Description
すなわち本発明は、以下に関する。
(1)0.1〜0.6Nの酸濃度の条件下、55℃以上95℃以下の温度条件でヒアルロン酸又はその塩を低分子化することにより得られる、2〜6量体のヒアルロン酸の含有率が10%以上である低分子化ヒアルロン酸。
(2)平均分子量が10,000以下である上記(1)に記載の低分子化ヒアルロン酸。
(3)ヒアルロン酸又はその塩に、0.1〜0.6Nの酸を添加し、55℃以上95℃以下の条件で、ヒアルロン酸又はその塩を低分子化することを特徴とする、低分子化ヒアルロン酸の製造方法。
本発明における温度としては、55℃以上95℃以下、好ましくは60℃以上80℃以下であることが好ましい。55℃未満では、低分子化の反応が効率よく進まず、95℃を超える条件下では、褐変が進んでしまうためである。
本発明に用いる酸の種類としては、例えば、塩酸、硫酸若しくはリン酸から選択される1種又は2種以上の酸を使用することができる。
本発明の低分子化に要する時間は、任意であるが、例えば、目的の温度に達してから1〜48時間であることが好ましい。
本発明の「濃度」と表記した部分について、特に記載がない限りは、溶液の容量に対する重量とする。
Morgan−Elson法とは、DMAB(p−Dimethylaminobenzaldehyde)標識による発色により還元末端のN−アセチルグルコサミン(以下、「末端NAG」と表記する)を定量するものである(Biochimica Et Biophysica Acta 42(1960) p476−485参照)。
Carbazol硫酸法は、Carbazol標識による発色により、ヒアルロン酸に含まれる全グルクロン酸量(以下、「全GlcUA」と表記する)を定量するものである。
平均分子量 = 平均重合度/2 × 401.3
= ヒアルロン酸ユニット数/糖鎖数 × 401.3
= 全GlcUA濃度(M)/末端NAG濃度(M) × 401.3
また、2量体、4量体及び6量体のヒアルロン酸の含有率は、ゲルろ過カラムを用いたHPLC法(カラム:GL−W520−S(日立化成社製)、溶離液等張リン酸緩衝液(pH7.1)、流速:0.4ml/min検出;206nm、カラム温度:40℃)により得られるチャートにおいて、2量体、4量体及び6量体におけるピークの面積を、全てのピークの面積で除することにより求めることができる。
また、2量体、4量体及び6量体のピークの同定は、各ピークを分取し、質量分析計で分析することにより行うことができる。
(1)酸加熱処理による分子量の変化
粉末状のヒアルロン酸(以下、「FCH−A」という。紀文フードケミファ社製、分子量20,816)を、6.25%(w/w)の濃度で溶解させ、さらに種々の濃度の塩酸を1/10量加え、塩酸の終濃度が0.1、0.25、1.0Nのいずれかになるようにした。この溶液を60℃、70℃、80℃のいずれかで、18時間処理した。処理後、水酸化ナトリウムを加えて中和し、凍結乾燥により粉末化した。低分子化ヒアルロン酸水溶液の平均分子量を糖鎖数定量法により測定した。結果を図1に示す。
上記(1)の酸加熱処理により得られた低分子化ヒアルロン酸粉末の白色度を、測色色差計(日本電色社製、Z−1001DP)を用いて測定した。
0.25N塩酸、70℃で処理したサンプルの白色度(L値)は、95.06であった。
低分子化ヒアルロン酸の分析を、陰イオン交換カラムを用いたHPLC(カラム;TSK−gel Super−Q(東ソー社製)、溶離液;0−200mM(0−80分)NaCl、カラム温度;40℃、検出;210nm)により実施した。0.25N、70℃での酸加熱処理により得られた低分子化ヒアルロン酸について測定したところ、図3のようなチャートが得られた。
酸加熱処理を施したヒアルロン酸中の、2量体、4量体及び6量体のヒアルロン酸の含有量を、ゲルろ過クロマトグラフィー(カラム:GL−W520−S(日立化成社製)、溶離液等張リン酸緩衝液(pH7.1)、流速:0.4ml/min検出;206nm、カラム温度:40℃)で分析した。その結果、0.25N、70℃で18時間処理したサンプルでは、2量体、4量体及び6量体の含有量は、28.9%であった(図4)。
粉末状のFCH−Aを、6.25%(w/w)の濃度で溶解させ、さらに種々の濃度の塩酸を1/10量加え、塩酸の終濃度が0.3、0.4、又は0.6Nのいずれかになるようにした。
上記溶液を70℃、75℃、80℃のいずれかの温度条件で、4時間処理した。処理後、水酸化ナトリウムを加えて中和し、凍結乾燥により粉末化した。実施例1と同様の分析で、これらの条件下でも低分子化が起こることを確認した(図5)。
粉末状のFCH−Aを、6.25%(w/w)の濃度で溶解させ、さらに終濃度が0.1Nになるように硫酸を1/10量加え、70℃で18時間処理した。得られた処理物の分子量は、1,561であり、ゲルろ過分析での分子量分布は単一のピークを示した(図6)。
硫酸処理後、水酸化ナトリウムを加えて中和し、凍結乾燥により粉末化した。
また、実施例1と同様の陰イオン交換カラムを用いたHPLCにより、塩酸を用いた酸加熱処理と同様の、2糖単位の加水分解が起こっていることを確認した(図6)。
(比較例1)
FCH−Aを、6.25%で溶解させ、さらに終濃度が0.1Nとなるように水酸化ナトリウム溶液を1/10量加え、70℃又は43℃の温度条件で18時間処理した。70℃の温度条件で処理したサンプルは、溶液が褐色に変化していた。43℃の温度条件で処理したサンプルは、褐変していなかったものの、ゲルろ過HPLCでの分析で、複数のピークがみられ、非特異的なヒアルロン酸の分解が起こっていることが推察された(図7)。
(比較例2)
FCH−Aを、6.25%で溶解させ、さらに終濃度が0.1Mとなるように過酸化水素液を1/10量加え、70℃で18時間処理した。分子量は、1,504であり、ゲルろ過HPLCでの分析で、単一のピークがみられたが、陰イオンクロマトグラフィー分析で、2糖単位ではなくランダムなヒアルロン酸の分解が起こっていることが示唆される結果が得られた(図8)。
Claims (3)
- 0.1〜0.6Nの酸濃度の条件下、55℃以上95℃以下の温度条件でヒアルロン酸又はその塩を低分子化することにより得られる、2〜6量体のヒアルロン酸の含有率が10%以上である低分子化ヒアルロン酸。
- 平均分子量が10,000以下である請求項1に記載の低分子化ヒアルロン酸。
- ヒアルロン酸又はその塩に、0.1〜0.6Nの酸を添加し、55℃以上95℃以下の条件で、ヒアルロン酸又はその塩を低分子化することを特徴とする、低分子化ヒアルロン酸の製造方法。
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