JP2009143941A - Long lasting anti-neovascularization peptide - Google Patents

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Xicai Huang
ヒュアン シィカイ
Richard Beliveau
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an altered kringle 5 peptide having a long-term action for the treatment of diseases concerning neovascularization. <P>SOLUTION: This altered anti-neovascularization peptide is a peptide like kringle 5 peptide having a reactive group which forms a stable covalent bond reacting with an amino group, a hydroxy group. or a thiol group each being a blood component. In this disclosed process, the reactive group is bonded to the peptide, and the reactive group is reacted with a functional group of the blood component to form the covalent bond, and this method of extending the in vivo half-life of the anti-neovascularization peptide includes a process, using the disclosed process, to form a stable in vivo bonded entity having a longer in vivo half-life than that of the anti-neovascularization peptide alone. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

（発明の分野）
本発明は、改変抗新脈管形成ペプチドに関する。詳細には、本発明は、新脈管形成に関
する疾患の処置のための長期間の作用を有する改変クリングル５ペプチドに関する。 (Field of Invention)
The present invention relates to modified anti-angiogenic peptides. Specifically, the present invention relates to a modified kringle 5 peptide having a long-term effect for the treatment of diseases related to angiogenesis.

（発明の背景）
新脈管形成、新しい血管の発達は、高度に調整され、そして内皮細胞増殖の本質的なプ
ロセスである。新脈管形成は、正常な条件下で高度に調整されたプロセスであるが、多く
の疾患（「新脈管形成疾患」として特徴付けられる）は、持続的に調整されていない新脈
管形成により引き起こされる。調整されていない新脈管形成は、特定の疾患を直接引き起
こすか、または現存の病的状態を悪化させ得る。例えば、眼性新生血管形成は、失明の最
も一般的な原因として関係し、そして約２０の眼性疾患の首位を占めている。関節炎のよ
うな特定の現状において、新しく形成された毛細血管は、関節に侵入し、そして軟骨を破
壊する。糖尿病において、網膜内で形成された新しい毛細管は、硝子体に侵入し、出血し
、そして失明を引き起こす。固形腫瘍の増殖および転移はまた、新脈管形成依存性である
（非特許文献１、非特許文献２）。 (Background of the Invention)
Angiogenesis, the development of new blood vessels, is highly regulated and is an essential process of endothelial cell proliferation. Angiogenesis is a highly regulated process under normal conditions, but many diseases (characterized as “angiogenic diseases”) are not persistently regulated angiogenesis. Caused by. Unregulated angiogenesis can directly cause certain diseases or exacerbate existing pathological conditions. For example, ocular neovascularization is implicated as the most common cause of blindness and occupies the leading position in about 20 ocular diseases. In certain current situations, such as arthritis, newly formed capillaries invade joints and destroy cartilage. In diabetes, new capillaries formed in the retina invade the vitreous, bleed, and cause blindness. Solid tumor growth and metastasis are also angiogenesis-dependent (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).

抗新脈管形成分子を同定するために、多くの研究が行われている。特に関心のもたれる
１つの新脈管形成分子はプラスミノゲンである。特に関心がもたれるのは、プラスミノゲ
ンのクリングル５領域、およびそのクリングル５領域内の様々なペプチドである。プラス
ミノゲンおよびプラスミノゲンのクリングル５領域の両方は、新脈管形成プロセスを妨害
することが示され、従って抗新脈管形成ペプチドとして知られている。 Much work has been done to identify anti-angiogenic molecules. One angiogenic molecule of particular interest is plasminogen. Of particular interest are the kringle 5 region of plasminogen and the various peptides within that kringle 5 region. Both plasminogen and the plasminogen kringle 5 region have been shown to interfere with the angiogenic process and are therefore known as anti-angiogenic peptides.

有用であるものの、クリングル５ペプチドは、他のペプチドと同様に、迅速な腎臓***
、肝臓代謝、および内因性ペプチダーゼの分解を受け、非常に短い血漿の半減期を導き、
それにより抗新脈管形成薬としてのそれらの有用性が減少する。それらの短い半減期の結
果として、クリングル５のようなペプチドは、効果的な治療に十分な適切な血漿レベルに
達するまでの持続注入を必要とする。 Although useful, the Kringle 5 peptide, like other peptides, undergoes rapid renal excretion, liver metabolism, and degradation of endogenous peptidases, leading to a very short plasma half-life,
It reduces their usefulness as anti-angiogenic agents. As a result of their short half-life, peptides such as kringle 5 require continuous infusion until reaching appropriate plasma levels sufficient for effective treatment.

結果として、クリングル５のような抗新脈管形成ペプチドを長く持続する必要性がある
。このような長く持続するペプチドは、哺乳動物における新脈管形成関連性疾患を処置す
る際に有用である。 As a result, there is a need for long-lasting anti-angiogenic peptides such as kringle 5. Such long-lasting peptides are useful in treating angiogenesis-related diseases in mammals.

Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８６）４６：４６７−４７３Folkman, J .; , Cancer Research (1986) 46: 467-473. Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９８９）８２：４−６Folkman, J .; , Journal of the National Cancer Institute (1989) 82: 4-6.

（発明の要旨）
これらの必要性を達成するために、本発明は、改変抗新脈管形成ペプチドに関する。詳
細には、本発明は、改変クリングル５ペプチドに関する。本発明は、移動性血液タンパク
質上の有用な官能基と反応して、共有結合を形成し得る、抗新脈管形成ペプチドの新規の
化学反応性誘導体に関する。詳細には、本発明は、移動性血液タンパク質上の有用な官能
基と反応して、共有結合を形成し得る、クリングル５ペプチドのような新脈管形成ペプチ
ドの新規な化学反応性誘導体に関する。抗新脈管形成ペプチドの化学反応性誘導体は、ペ
プチダーゼ安定性抗新脈管形成ペプチドを形成し得る。 (Summary of the Invention)
In order to achieve these needs, the present invention relates to modified anti-angiogenic peptides. Specifically, the present invention relates to a modified kringle 5 peptide. The present invention relates to novel chemically reactive derivatives of anti-angiogenic peptides that can react with useful functional groups on mobile blood proteins to form covalent bonds. In particular, the present invention relates to novel chemically reactive derivatives of angiogenic peptides, such as the kringle 5 peptide, that can react with useful functional groups on mobile blood proteins to form covalent bonds. Chemically reactive derivatives of anti-angiogenic peptides can form peptidase-stable anti-angiogenic peptides.

本発明は、クリングル５ペプチドのような抗新脈管形成ペプチドの誘導体に関し、ここ
でこの誘導体は、血液タンパク質上のアミノ基、ヒドロキシル基またはチオール基と反応
して、安定な共有結合を形成する、反応性基を含む。好ましい形態において、抗新脈管形
成ペプチドは、スクシンイミジル反応性基またはマレイミド反応性基を含む。 The present invention relates to a derivative of an anti-angiogenic peptide, such as the kringle 5 peptide, where the derivative reacts with an amino, hydroxyl or thiol group on the blood protein to form a stable covalent bond. Containing reactive groups. In a preferred form, the anti-angiogenic peptide comprises a succinimidyl reactive group or a maleimide reactive group.

本発明は、改変クリングル５ペプチド、およびそれらの誘導体、ならびに抗新脈管形成
薬としてのそれらの使用に関する。クリングル５ペプチドは、移動性血液タンパク質との
共有結合を形成し得る反応性基を含む。 The present invention relates to modified kringle 5 peptides, and derivatives thereof, and their use as anti-angiogenic agents. Kringle 5 peptides contain reactive groups that can form covalent bonds with mobile blood proteins.

特に、本発明は、以下の改変クリングル５ペプチドに関する：   In particular, the present invention relates to the following modified kringle 5 peptides:

Figure 2009143941
および他の改変クリングル５ペプチド。
Figure 2009143941
 And other modified kringle 5 peptides.

これらの改変抗新脈管形成ペプチドは、ヒトにおける新脈管形成の処置における用途を
見出す。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１） 改変抗新脈管形成ペプチドであって、このペプチドは、血液成分のアミノ
基、ヒドロキシル基、またはチオール基と反応して、安定な共有結合を形成する反応性基
を有する、改変抗新脈管形成ペプチド。
（項目２） 上記ペプチドが、クリングル５ペプチドである、項目１に記載の改変ペプ
チド。
（項目３） 誘導体が、血液タンパク質と反応性である、項目２に記載のクリングル５
ペプチド。
（項目４） 上記誘導体が、血液タンパク質のチオール基と反応性である、項目３に記
載のクリングル５ペプチド。
（項目５） 上記ペプチドが、以下からなる群から選択される、項目２に記載のクリン
グル５ペプチド：配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列
番号７、配列番号８、および配列番号９。
（項目６） 上記ペプチドが、以下からなる群から選択される、項目２に記載のクリン
グル５ペプチド：配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号
１４、配列番号１５、および配列番号１６。
（項目７） クリングル５ペプチドに誘導体またはそのアナログを含む組成物であって
、この誘導体は、ヒトにおける新脈管形成を処置する方法に使用するために、血液成分の
アミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基と反応して、安定な共有結合を形成する反
応性基を含む、組成物。
（項目８） 上記誘導体が、血液タンパク質と反応性である、項目７に記載の組成物。
（項目９） 上記誘導体が、血液タンパク質のチオール基と反応性である、項目７に記
載の組成物。
（項目１０） クリングル５ペプチドの誘導体であって、この誘導体は、ヒト血清アル
ブミンのチオール基と反応して、共有結合形成するをマレイミド基を含む、誘導体。
（項目１１） 上記ペプチドが、以下から選択される、項目１０に記載の誘導体：配列
番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、
および配列番号９。
（項目１２） 上記ペプチドが、以下から選択される、項目１０に記載の誘導体：配列
番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、
および配列番号１６。
（項目１３） 抗新脈管形成ペプチドの誘導体を含む組成物であって、この誘導体は、
ヒトにおける新脈管形成を処置する方法に使用するために、ヒト血清アルブミンのチオー
ル基と反応して、共有結合を形成するマレイミド基を含む、組成物。
（項目１４） 上記ペプチドが、クリングル５ペプチドである、項目１３に記載の組成
物。
（項目１５） 上記ペプチドが、以下から選択される、項目１４に記載の組成物：配列
番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、
および配列番号９。
（項目１６） 上記ペプチドが、以下から選択される、項目１４に記載の組成物：配列
番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、
および配列番号１６。
（項目１７） 抗新脈管形成効果を提供するために、クリングル５ペプチドの患者にお
けるインビボ半減期を延長させる薬剤の製造者のための組成物の使用であって、この組成
物は、クリングル５ペプチドの誘導体またはそのアナログを含み、この誘導体は、血液成
分のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基と反応して、安定な共有結合を形成す
る反応性基を含む、使用。
（項目１８） ヒトにおける新脈管形成を処置するための項目１４に記載の組成物の使
用であって、ここで、上記抗新脈管形成クリングル５ペプチドの誘導体が、血液タンパク
質と反応する、使用。
（項目１９） 以下からなる群から選択される改変クリングル５ペプチド：（ＭＰＡ−
ＡＥＥＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 および
（ＭＰＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 。
（項目２０） 以下からなる群から選択される改変クリングル５ペプチド：ＮＡｃ−Ｔ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）−ＮＨ 2 ；（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 ；Ｍ
ＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 ；ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）
−ＮＨ 2 ；（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 ；および（ＭＰＡ）
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 。
（項目２１） 以下からなる群から選択される改変クリングル５ペプチド：ＮＡｃ−Ａ
ｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｒｐ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）−ＮＨ 2 ；ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＮＨ 2 ；（Ｍ
ＰＡ）−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＮＨ 2 ；ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）−ＮＨ 2 ；（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 ；（ＭＰＡ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ 2 ；ＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）−ＮＨ 2 ；（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＮＨ 2 ；（ＭＰＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−ＮＨ 2 ；ＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−（Ｎε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＮＨ 2 ；およびＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＡＥＥＡ n −ＭＰＡ）−ＮＨ 2 。
（項目２２） 項目１に記載の改変抗新脈管形成ペプチドであって、ここで、上記反応
性基が、スクシンイミジル基またはマレイミド基を含む、ペプチド。
（項目２３） 項目７に記載の組成物であって、ここで、上記反応性基が、スクシンイ
ミジル基またはマレイミド基を含む、ペプチド。
（項目２４） 項目１７に記載の使用であって、ここで、上記反応性基が、スクシンイ
ミジル基またはマレイミド基を含む、使用。
（項目２５） 項目１〜６、１０〜１２および１９〜２１のいずれか１つに記載の改変
ペプチドを含む結合体であって、このペプチドは、血液成分に共有結合され、この結合体
は、インビボで安定である、結合体。
（項目２６） 抗新脈管形成ペプチドのインビボ半減期を延長するための方法であって
、この方法は、以下：反応性基をこのペプチドに結合し、そしてこの反応性基を血液成分
の官能基と反応させて共有結合を形成する工程、それによって、この抗新脈管形成ペプチ
ドのみのインビボ半減期よりも長いインビボ半減期を有する安定なインビボ結合体を形成
する工程を包含する、方法。 These modified anti-angiogenic peptides find use in the treatment of angiogenesis in humans.
Therefore, the present invention provides the following items.
(Item 1) A modified anti-angiogenic peptide, which is a blood component amino acid
Reactive groups that react with groups, hydroxyl groups, or thiol groups to form stable covalent bonds
A modified anti-angiogenic peptide having
(Item 2) The modified pep of item 1, wherein the peptide is a kringle 5 peptide
Chido.
(Item 3) The kringle 5 according to item 2, wherein the derivative is reactive with blood protein.
peptide.
(Item 4) The above derivative is reactive with a thiol group of blood protein.
Kringle 5 peptide listed.
(Item 5) The clin of item 2, wherein the peptide is selected from the group consisting of:
Guru 5 peptide: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, sequence
No. 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9.
(Item 6) The clin of item 2, wherein the peptide is selected from the group consisting of:
Guru 5 peptide: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
(Item 7) A composition comprising a derivative or an analog thereof in kringle 5 peptide,
This derivative is a blood component for use in a method of treating angiogenesis in humans.
Reactions that react with amino, hydroxyl, or thiol groups to form stable covalent bonds
A composition comprising a reactive group.
(Item 8) The composition according to item 7, wherein the derivative is reactive with blood protein.
(Item 9) The above derivative is reactive with a thiol group of a blood protein.
Listed composition.
(Item 10) A derivative of kringle 5 peptide, which is a human serum alcohol
A derivative containing a maleimide group that reacts with the thiol group of bumine to form a covalent bond.
(Item 11) The derivative according to item 10, wherein the peptide is selected from the following: sequence
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,
And SEQ ID NO: 9.
(Item 12) The derivative according to item 10, wherein the peptide is selected from the following: sequence
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,
And SEQ ID NO: 16.
(Item 13) A composition comprising a derivative of an anti-angiogenic peptide, the derivative comprising:
Human serum albumin thiol for use in a method of treating angiogenesis in humans
A composition comprising a maleimide group that reacts with a group to form a covalent bond.
(Item 14) The composition according to item 13, wherein the peptide is a kringle 5 peptide.
object.
(Item 15) The composition according to item 14, wherein the peptide is selected from the following: Sequence
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,
And SEQ ID NO: 9.
(Item 16) The composition according to item 14, wherein the peptide is selected from the following: Sequence
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,
And SEQ ID NO: 16.
(Item 17) To provide an anti-angiogenic effect in patients with Kringle 5 peptide
Use of a composition for the manufacture of a medicament for extending the in vivo half-life
The product includes a derivative of Kringle 5 peptide or an analog thereof,
Reacts with any amino, hydroxyl, or thiol group to form a stable covalent bond
Uses that contain reactive groups.
(Item 18) Use of the composition according to item 14 for treating angiogenesis in a human.
Wherein the anti-angiogenic kringle 5 peptide derivative is a blood protein
Use, which reacts with quality.
(Item 19) Modified kringle 5 peptide selected from the group consisting of: (MPA-
AEEA) -Pro-Arg-Lys- Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2 and
(MPA) -Pro-Arg-Lys -Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2.
(Item 20) Modified kringle 5 peptide selected from the group consisting of: NAc-T
yr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-T
yr-Lys- (Nε-MPA) -NH 2 ; (MPA-AEEA) -Tyr-Thr-T
hr-Asn-Pro-Arg- Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2; M
PA) -Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-
Asp-Tyr-NH 2 ; NAc-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-
Val-Gly-Gly-Pro-Trp-Ala-Tyr-Thr-Thr-Asn-
Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lys- (Nε-MPA)
-NH 2; (MPA-AEEA) -Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-
Val-Gly-Gly-Pro-Trp-Ala-Tyr-Thr-Thr-Asn-
Pro-Arg-Lys-Leu- Tyr-Asp-Tyr-NH 2; and (MPA)
-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro
-Trp-Ala-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu
-Tyr-Asp-Tyr-NH 2 .
(Item 21) Modified kringle 5 peptide selected from the group consisting of: NAc-A
rg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-T
rp-Lys- (Nε-MPA) —NH 2 ; MPA-AEEA) -Arg-Asn-Pr
o-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH 2 ;
PA) -Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-
Pro-Trp-NH 2; NAc -Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-
Lys- (Nε-MPA) -NH 2 ; (MPA-AEEA) -Arg-Lys-Leu-
Tyr-Asp-Tyr-NH 2 ; (MPA) -Arg-Lys-Leu-Tyr-As
p-Tyr-NH 2 ; NAc-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Ly
s- (Nε-MPA) -NH 2 ; (MPA-AEEA) -Pro-Arg-Lys-Le
u-Tyr-Asp-NH 2 ; (MPA) -Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-
Asp-NH 2 ; NAc-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-
Lys- (Nε-AEEA-MPA) -NH 2 ; and NAc-Pro-Arg-Lys
-Leu-Tyr-Asp-Tyr- Lys- (Nε-AEEA n -MPA) -NH 2.
(Item 22) The modified anti-angiogenic peptide according to item 1, wherein the reaction
A peptide wherein the sex group comprises a succinimidyl group or a maleimide group.
(Item 23) The composition according to item 7, wherein the reactive group is a succinic acid.
A peptide containing a midyl group or a maleimide group.
(Item 24) The use according to item 17, wherein the reactive group is succini
Use comprising a midyl group or a maleimide group.
(Item 25) The modification according to any one of items 1 to 6, 10 to 12, and 19 to 21
A conjugate comprising a peptide, wherein the peptide is covalently bound to a blood component, the conjugate
Is a conjugate that is stable in vivo.
26. A method for extending the in vivo half-life of an anti-angiogenic peptide comprising:
The method consists of: linking a reactive group to the peptide, and attaching the reactive group to a blood component
Reacting with a functional group of to form a covalent bond, whereby the anti-angiogenic peptide
Form stable in vivo conjugates with an in vivo half-life longer than the in vivo half-life of
A method comprising the steps of:

（発明の詳細な説明）
本発明の完全な理解を保証するために、以下の定義が提供される：
反応性基：反応性基とは、共有結合を形成し得る化学基である。このような反応性基は
、抗新脈管形成剤、すなわち、より詳細には、目的のクリングル５ポリペプチドに連結ま
たは結合される。反応性基は、一般に、水性環境内で安定であり、そして通常、カルボキ
シ基、ホスホリル基、または従来のアシル基であり、エステルまたは混合無水物のいずれ
か、あるいはイミデートとして存在し、これによって、移動性の血液成分の標的部位の、
アミノ基、ヒドロキシまたはチオールのような官能基と共有結合を形成し得る。大部分に
おいて、これらのエステルは、フェノール性化合物を含むか、またはチオールエステル、
アルキルエステル、リン酸エステルなどである。反応性基としては、スクシンイミジル（
ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ）基およびマレイミド基が挙げられる。 (Detailed description of the invention)
In order to ensure a complete understanding of the invention, the following definitions are provided:
Reactive group: A reactive group is a chemical group capable of forming a covalent bond. Such reactive groups are linked or attached to an anti-angiogenic agent, i.e., more specifically to the desired kringle 5 polypeptide. Reactive groups are generally stable in an aqueous environment and are usually carboxy groups, phosphoryl groups, or conventional acyl groups, present as either esters or mixed anhydrides, or imidates, thereby Of the target site of mobile blood components,
A covalent bond can be formed with a functional group such as an amino group, hydroxy or thiol. For the most part, these esters contain phenolic compounds or thiol esters,
Examples thereof include alkyl esters and phosphate esters. Reactive groups include succinimidyl (
succimidyl) and maleimide groups.

官能基： 官能基とは、反応性基が反応して共有結合を形成する、血液成分上の基であ
る。官能基は、エステル反応性基との結合のためのヒドロキシル基、イミデートおよびチ
オールエステル基との結合のためのチオール基；カルボキシル基、ホスホリル基または反
応性基上のアシル基との結合のためのアミノ基、およびアミノ基との結合のためのカルボ
キシル基を含む。 Functional group: A functional group is a group on a blood component that reacts with a reactive group to form a covalent bond. The functional group is a hydroxyl group for bonding with an ester reactive group, a thiol group for bonding with an imidate and thiol ester group; for bonding with an acyl group on a carboxyl group, phosphoryl group or reactive group Contains an amino group and a carboxyl group for bonding with the amino group.

血液成分： 血液成分は、固定されていても可動であってもいずれでもよい。固定され
た血液成分は、非可動性の血液成分であり、そして組織、膜レセプター、介在タンパク質
、フィブリンタンパク質、コラーゲン、血小板、内皮細胞、上皮細胞およびこれらが結合
する膜および膜レセプター、身体の細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｂｏｄｙ ｃｅｌｌ）、骨格
細胞および平滑筋細胞、神経成分、骨細胞および破骨細胞ならびに全ての身体組織（特に
、循環系およびリンパ系に関連するもの）を含む。可動性血液成分とは、いかなる延長し
た期間にわたっても（一般的には５分を超えず、より通常には１分）固定された位置を有
さない、血液成分である。これらの血液成分は、膜結合しておらず、そして延長した期間
にわたって血液中に存在し、そして少なくとも０．１μｇ／ｍｌの最小濃度で存在する。
可動性血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、フェリチン、ならびにＩ
ｇＭおよびＩｇＧのような免疫グロブリンが挙げられる。可動性血液成分の半減期は、少
なくとも約１２時間である。 Blood component: The blood component may be either fixed or movable. Fixed blood components are immobile blood components and tissues, membrane receptors, intervening proteins, fibrin proteins, collagen, platelets, endothelial cells, epithelial cells and the membranes and membrane receptors to which they bind, body cells (Somatic body cells), skeletal cells and smooth muscle cells, neural components, bone cells and osteoclasts, and all body tissues, particularly those related to the circulatory and lymphatic systems. A mobile blood component is a blood component that does not have a fixed position for any extended period of time (generally not exceeding 5 minutes, more usually 1 minute). These blood components are not membrane bound and are present in the blood for an extended period of time and are present at a minimum concentration of at least 0.1 μg / ml.
Mobile blood components include serum albumin, transferrin, ferritin, and I
Examples include immunoglobulins such as gM and IgG. The half-life of mobile blood components is at least about 12 hours.

保護基： 保護基とは、ペプチド誘導体をそれ自体と反応しないよう保護するために利
用される、化学部分である。種々の保護基が、米国特許第５，４９３，００７号（これは
、本明細書中に参考として援用される）に開示される。このような保護基としては、アセ
チル、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル
（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などが挙げられる。特定の保護された
アミノ酸を、表１に示す。 Protecting group: A protecting group is a chemical moiety that is utilized to protect a peptide derivative from reacting with itself. Various protecting groups are disclosed in US Pat. No. 5,493,007, which is incorporated herein by reference. Such protecting groups include acetyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxycarbonyl (Cbz) and the like. Specific protected amino acids are shown in Table 1.

Figure 2009143941
感受性官能基： 感受性官能基とは、抗新脈管形成ペプチド上の潜在的な反応部位を提
供する、原子の群である。存在する場合には、感受性官能基は、リンカー−反応性基修飾
のための付着点として、選択され得る。感受性官能基としては、カルボキシル基、アミノ
基、チオール基、およびヒドロキシル基が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2009143941
 Sensitive Functional Groups: Sensitive functional groups are groups of atoms that provide potential reactive sites on anti-angiogenic peptides. If present, sensitive functional groups can be selected as attachment points for linker-reactive group modifications. Sensitive functional groups include, but are not limited to, carboxyl groups, amino groups, thiol groups, and hydroxyl groups.

改変ペプチド： 改変抗新脈管形成ペプチドとは、反応性基の結合により改変されたペ
プチドであり、血液成分への結合によりペプチダーゼ安定化ペプチドを形成し得る。反応
性基は、連結基を介してか、または必要に応じて連結基を使用せずにかのいずれかで、抗
新脈管形成ペプチドに結合され得る。１つ以上のさらなるアミノ酸が抗新脈管形成ペプチ
ドに付加されて、反応性基の付着を容易にし得ることもまた、考慮される。改変ペプチド
は、血液成分との結合体化がインビボで起こるように、インビボで投与され得るか、また
はこれらは、最初に血液成分とインビトロで結合体化され、そして得られるペプチダーゼ
に対して安定化されたペプチド（以下に定義されるような）が、インビボで投与され得る
。用語「改変抗新脈管形成ペプチド」および「改変ペプチド」は、本願において交換可能
に使用され得る。 Modified peptides: Modified anti-angiogenic peptides are peptides that have been modified by the attachment of reactive groups and can form peptidase-stabilized peptides by binding to blood components. The reactive group can be attached to the anti-angiogenic peptide either through a linking group or optionally without a linking group. It is also contemplated that one or more additional amino acids can be added to the anti-angiogenic peptide to facilitate attachment of the reactive group. The modified peptides can be administered in vivo such that conjugation with blood components occurs in vivo, or they are first conjugated in vitro with blood components and stabilized against the resulting peptidase. The defined peptides (as defined below) can be administered in vivo. The terms “modified anti-angiogenic peptide” and “modified peptide” may be used interchangeably in this application.

ペプチダーゼに対して安定化された抗新脈管形成ペプチド： ペプチダーゼに対して安
定化された抗新脈管形成ペプチドとは、連結基のありまたはなしで、改変されたペプチド
の反応性基と血液成分の官能基との間に形成される共有結合を介して、血液成分に結合体
化された、改変されたペプチドである。ペプチダーゼに対して安定化されたペプチドは、
インビボでペプチダーゼの存在下で、安定化されていないペプチドより安定である。ペプ
チダーゼに対して安定化された抗新脈管形成ペプチドは、一般に、同じ配列の安定化され
ていないペプチドと比較して、少なくとも１０〜５０％増加した半減期を有する。ペプチ
ダーゼ安定性は、血清または血液中の改変されていない抗新脈管形成ペプチドの半減期と
、血清または血液中の改変された対応する抗新脈管形成ペプチドの半減期とを比較するこ
とにより、決定される。半減期は、改変されたペプチドおよび改変されていないペプチド
の投与後の血清または血液をサンプリングし、そしてそのペプチドの活性を決定すること
により、決定される。活性を決定することに加えて、抗新脈管形成ペプチドの長さもまた
、ＨＰＬＣおよび質量分析計によって測定され得る。 Anti-angiogenic peptides stabilized against peptidases: Anti-angiogenic peptides stabilized against peptidases are the reactive groups of the modified peptide and blood with or without a linking group. A modified peptide conjugated to a blood component via a covalent bond formed with the functional group of the component. Peptides stabilized against peptidases are
More stable than unstabilized peptides in the presence of peptidases in vivo. Anti-angiogenic peptides stabilized against peptidases generally have at least a 10-50% increased half-life compared to unstabilized peptides of the same sequence. Peptidase stability is determined by comparing the half-life of the unmodified anti-angiogenic peptide in serum or blood with the half-life of the modified corresponding anti-angiogenic peptide in serum or blood. ,It is determined. Half-life is determined by sampling serum or blood after administration of modified and unmodified peptides and determining the activity of the peptide. In addition to determining activity, the length of the anti-angiogenic peptide can also be measured by HPLC and mass spectrometer.

連結基： 連結基とは、反応性基を抗新脈管形成ペプチドに結合または連結する、化学
部分である。連結基は、１つ以上のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル
基、ブチル基など）、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基アルキル基で置換され
たアミノ基、シクロアルキル基、多環式基、アリール基、ポリアリール基、置換アリール
基、複素環式基、および置換複素環式基を含み得る。連結基はまた、ＡＥＡ（（２−アミ
ノ）エトキシ酢酸）または好ましい連結基であるＡＥＥＡ（［２−（２−アミノ）エトキ
シ）］エトキシ酢酸）のような、ポリエトキシアミノ酸を含み得る。好ましい連結基は、
ＡＥＥＡ（［２−（２−アミノ）］エトキシ酢酸）である。 Linking group: A linking group is a chemical moiety that binds or links a reactive group to an anti-angiogenic peptide. The linking group includes one or more alkyl groups (for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, etc.), an alkoxy group, an alkenyl group, an alkynyl group, an amino group substituted with an alkyl group, a cycloalkyl group, a polycycle Formula groups, aryl groups, polyaryl groups, substituted aryl groups, heterocyclic groups, and substituted heterocyclic groups may be included. The linking group may also comprise a polyethoxy amino acid, such as AEA ((2-amino) ethoxyacetic acid) or the preferred linking group AEEA ([2- (2-amino) ethoxy)] ethoxyacetic acid). Preferred linking groups are
AEEA ([2- (2-amino)] ethoxyacetic acid).

（発明の詳細な説明）
これらの定義を考慮して、本発明の焦点は、抗新脈管形成特性を改変することなく、タ
ンパク質キャリアにペプチドを結合することにより、抗新脈管形成ペプチド、特にクリン
グル５ペプチドを改変し、バイオアベイラビリティーを改良し、インビボにおけるペプチ
ドの半減期および分布を延ばすことである。本発明で選択したキャリア（しかし、本発明
に限定されない）は、マレイミド部分で誘導体化されたクリングル５ペプチドにより、遊
離チオールを介して結合されたアルブミンである。 (Detailed description of the invention)
In view of these definitions, the focus of the present invention is to modify anti-angiogenic peptides, particularly kringle 5 peptides, by binding the peptide to a protein carrier without altering the anti-angiogenic properties. To improve bioavailability and extend peptide half-life and distribution in vivo. The carrier selected in the present invention (but not limited to the present invention) is albumin linked via a free thiol by a kringle 5 peptide derivatized with a maleimide moiety.

（１．クリングル５ペプチド）
本明細書中で使用される場合、用語「クリングル５」とは、哺乳動物プラスミノゲン分
子の第５のクリングル領域により規定される特定の三次元構造に寄与する、３つのジスル
フィド結合を有する哺乳動物プラスミノゲンの領域をいう。１つのこのようなジスルフィ
ド結合は、アミノ酸位４６２および５４１に位置するシステイン残基を結合し、第２のジ
スルフィド結合は、アミノ酸位４８３および５２４に位置するシステイン残基を結合し、
そして第３のジスルフィド結合は、アミノ酸位５１２および５３６に位置するシステイン
残基を結合する。哺乳動物の完全なプラスミノゲン分子（ヒトプラスミノゲン分子）のア
ミノ酸配列（そのクリングル５領域を含む）は、（配列番号１）で表される。 (1. Kringle 5 peptide)
As used herein, the term “kringle 5” refers to a mammalian plasminogen having three disulfide bonds that contribute to a specific three-dimensional structure defined by the fifth kringle region of the mammalian plasminogen molecule. Refers to the area. One such disulfide bond binds a cysteine residue located at amino acid positions 462 and 541, and a second disulfide bond binds a cysteine residue located at amino acid positions 483 and 524;
The third disulfide bond then binds the cysteine residues located at amino acid positions 512 and 536. The amino acid sequence of a complete mammalian plasminogen molecule (human plasminogen molecule) (including its kringle 5 region) is represented by (SEQ ID NO: 1).

用語「クリングル５ペプチドフラグメント」とは、以下の哺乳動物プラスミノゲンの対
応するペプチドフラグメントに対して実質的な配列相同性を有する、４個と１０４個との
間のアミノ酸（４と１０４を含む）の抗新脈管形成活性を有するペプチドをいう：インタ
クトな哺乳動物プラスミノゲンのアミノ酸位約４４３のα−Ｎ−末端、および配列番号１
のアミノ酸位約５４６のα−Ｃ−末端；インタクトな哺乳動物プラスミノゲンのアミノ酸
位約５１３のα−Ｎ−末端、および配列番号１のアミノ酸位約５２３のα−Ｃ−末端；イ
ンタクトな哺乳動物プラスミノゲンのアミノ酸位約５２５のα−Ｎ−末端、および配列番
号１のアミノ酸位約５３５のα−Ｃ−末端；インタクトな哺乳動物プラスミノゲンのアミ
ノ酸位約５２９のα−Ｎ−末端、および配列番号１のアミノ酸位約５３５のα−Ｃ−末端
；インタクトな哺乳動物プラスミノゲンのアミノ酸位約５２９のα−Ｎ−末端、および配
列番号１のアミノ酸位約５３４のα−Ｃ−末端；ならびにインタクトな哺乳動物プラスミ
ノゲンのアミノ酸位約１５０のα−Ｎ−末端、および配列番号１のアミノ酸位約１５６の
α−Ｃ−末端。 The term “kringle 5 peptide fragment” refers to between 4 and 104 amino acids (including 4 and 104) having substantial sequence homology to the corresponding peptide fragment of mammalian plasminogen below. Refers to a peptide having anti-angiogenic activity: the α-N-terminus of amino acid position about 443 of intact mammalian plasminogen, and SEQ ID NO: 1
The α-C-terminus of amino acid position about 546; the α-N-terminus of amino acid position about 513 of intact mammalian plasminogen; and the α-C-terminus of amino acid position about 523 of SEQ ID NO: 1; The α-N-terminus of amino acid position about 525 and the α-C-terminus of amino acid position about 535 of SEQ ID NO: 1; the α-N-terminus of amino acid position about 529 of intact mammalian plasminogen; and An α-C-terminal at about amino acid position 535; an α-N-terminal at about amino acid position 529 of intact mammalian plasminogen; and an α-C-terminal at about amino acid position 534 of SEQ ID NO: 1; and an intact mammalian plasminogen The α-N-terminus of about amino acid position 150 and the α-C-terminus of about amino acid position 156 of SEQ ID NO: 1.

好ましい形態において、本発明のクリングル５ペプチドは、１つ以上の以下の配列を有
する： In a preferred form, the kringle 5 peptide of the invention has one or more of the following sequences:

Figure 2009143941
Figure 2009143941
従って、本発明は、抗新脈管形成活性を有するクリングル５ペプチドフラグメントの任
意の誘導体または改変物を包含することが意図され、そして本明細書中に記載されるクリ
ングル５ペプチドフラグメントのクラス全体、ならびにこれらのクリングル５ペプチドフ
ラグメントの誘導体および改変物を含むことが理解されるべきである。
Figure 2009143941
Figure 2009143941
Accordingly, the present invention is intended to encompass any derivative or modification of a kringle 5 peptide fragment having anti-angiogenic activity and the entire class of kringle 5 peptide fragments described herein, As well as derivatives and modifications of these kringle 5 peptide fragments.

（２．改変クリングル５ペプチド）
本発明は、改変抗新脈管形成ペプチド、特に改変クリングル５ペプチドに関する。本発
明の改変クリングル５ペプチドは、共有結合を介して血液成分の利用可能な反応性官能基
と反応し得る。本発明はまた、このような改変物、血液成分とのこのような組み合わせお
よびそれらの使用方法に関する。これらの方法は、改変クリングル５ペプチドの効果的な
治療インビボ半減期を延ばす工程を包含する。 (2. Modified Kringle 5 peptide)
The present invention relates to modified anti-angiogenic peptides, particularly modified kringle 5 peptides. The modified kringle 5 peptides of the present invention can react with available reactive functional groups of blood components via covalent bonds. The invention also relates to such modifications, such combinations with blood components and methods of their use. These methods include extending the effective therapeutic in vivo half-life of the modified kringle 5 peptide.

タンパク質上の官能性と共有結合を形成するために、化学反応性基（反応物）として広
範な種々の活性なカルボキシル基、特にエステルを使用し得、ここで、ヒドロキシル部分
は、クリングル５ペプチドを改変するために必要とされるレベルで生理学的に受容可能で
ある。多くの異なるヒドロキシル基がこれらの連結剤において使用され得るが、最も通常
のものは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシン
イミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、マレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド（ＭＢＳ）、
γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）およびマレイミド
プロピオン酸（ＭＰＡ）である。 A wide variety of active carboxyl groups, particularly esters, can be used as chemically reactive groups (reactants) to form covalent bonds with functionalities on proteins, where the hydroxyl moiety is a kringle 5 peptide. It is physiologically acceptable at the level required to modify. Many different hydroxyl groups can be used in these linking agents, but the most common are N-hydroxysuccinimide (NHS), N-hydroxy-sulfosuccinimide (sulfo-NHS), maleimido-benzoyl-succinimide (MBS) ,
gamma-maleimido-butyryloxysuccinimide ester (GMBS) and maleimidopropionic acid (MPA).

第一級アミンは、以下のスキームに図示されるようにＮＨＳエステルに対する重要な標
的である。タンパク質のＮ末端に存在するアクセス可能なα−アミン基が、ＮＨＳエステ
ルと反応する。しかし、タンパク質のα−アミノ基は、ＮＨＳカップリングについて望ま
しくないかまたは利用可能でないかもしれない。５個のアミノ酸がその側鎖に窒素を有す
るが、リジンのε−アミンのみが、有意にＮＨＳエステルと反応する。アミド結合は、Ｎ
ＨＳエステルが、結合反応において、以下のスキームに示されるように、第一級アミンと
反応し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを放出する場合に形成される。これらの反応性基
を有するスクシンイミドは、本明細書中においてスクシンイミジル基として言及される。 Primary amines are important targets for NHS esters as illustrated in the scheme below. An accessible α-amine group present at the N-terminus of the protein reacts with the NHS ester. However, the α-amino group of the protein may not be desirable or available for NHS coupling. Five amino acids have nitrogen in their side chains, but only the lysine ε-amine reacts significantly with NHS esters. The amide bond is N
Formed when the HS ester reacts with a primary amine to release N-hydroxysuccinimide, as shown in the following scheme, in a coupling reaction. Succinimides having these reactive groups are referred to herein as succinimidyl groups.

Figure 2009143941
本発明の好ましい実施形態において、タンパク質の官能基はチオール基であり、化学反
応性基は、γ−マレイミド−ブチルアミド（ＧＭＢＡ）またはＭＰＡのようなマレイミド
含有基である。このようなマレイミド含有反応性基は、本明細書中で「マレイミド基」と
して言及される。マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５と７．４の間で維持される
場合、ペプチドのスルフヒドリル基について最も選択的である。ｐＨ７．０において、マ
レイミド基とスルフヒドリルとの反応速度は、アミンとの反応より１０００倍速い。マレ
イミド基とスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテル結合が形成され、これは、以下の
スキームに示されるように生理学的な条件下では切断され得ない。
Figure 2009143941
 In a preferred embodiment of the invention, the functional group of the protein is a thiol group and the chemically reactive group is a maleimide-containing group such as γ-maleimido-butyramide (GMBA) or MPA. Such maleimide-containing reactive groups are referred to herein as “maleimide groups”. The maleimide group is most selective for the sulfhydryl group of the peptide when the pH of the reaction mixture is maintained between 6.5 and 7.4. At pH 7.0, the reaction rate between maleimide groups and sulfhydryls is 1000 times faster than the reaction with amines. A stable thioether bond is formed between the maleimide group and the sulfhydryl, which cannot be cleaved under physiological conditions as shown in the following scheme.

Figure 2009143941
本発明のクリングル５ペプチドおよびペプチド誘導体は、血液成分の特異的標識化およ
び非特異的標識化のために改変され得る。
Figure 2009143941
 The kringle 5 peptides and peptide derivatives of the present invention can be modified for specific and non-specific labeling of blood components.

（Ａ．特異的標識化）
好ましくは、本発明の改変新脈管形成ペプチドは、移動性血液タンパク質のチオール基
と特異的に反応するように設計される。このような反応は、好ましくは、血清アルブミン
またはＩｇＧのような移動性血液タンパク質のチオール基へのマレイミド連結（例えば、
ＧＭＢＳ、ＭＰＡまたは他のマレイミドから調製される）を用いて改変される抗新脈管形
成ペプチドの共有結合によって確立される。 (A. Specific labeling)
Preferably, the modified angiogenic peptides of the present invention are designed to react specifically with thiol groups of mobile blood proteins. Such a reaction is preferably a maleimide linkage to a thiol group of a mobile blood protein such as serum albumin or IgG (eg,
Established by covalent attachment of an anti-angiogenic peptide modified with GMBS, MPA or other maleimide).

特定の条件下において、マレイミド（マレイミド基）との特異的な標識化は、ＮＨＳお
よびスルホ−ＮＨＳのような基を用いる移動性タンパク質の非特異的な標識化に比べてい
くつかの利点を提供する。チオール基は、インビボにおいてアミノ基よりもあまり豊富で
はない。従って、本発明のマレイミド誘導体は、より少ないタンパク質に共有結合する。
例えば、アルブミン（最も豊富な血液タンパク質）において、一つのチオール基のみが存
在する。従って、ペプチドマレイミド−アルブミン結合体は、ペプチド対アルブミンを約
１：１のモル比で含む傾向がある。アルブミンに加えて、ＩｇＧ分子（クラスＩＩ）もま
た、遊離チオールを有する。ＩｇＧ分子および血清アルブミンが血液において可溶なタン
パク質の大部分を構成するので、これらはまた、マレイミド改変ペプチドに共有結合する
のに利用可能な血液中の遊離チオール基の大部分を構成する。 Under certain conditions, specific labeling with maleimide (maleimide group) offers several advantages over non-specific labeling of mobile proteins using groups such as NHS and sulfo-NHS. To do. Thiol groups are less abundant than amino groups in vivo. Thus, the maleimide derivatives of the present invention covalently bind to fewer proteins.
For example, in albumin (the most abundant blood protein) there is only one thiol group. Thus, peptide maleimide-albumin conjugates tend to contain a peptide to albumin molar ratio of about 1: 1. In addition to albumin, IgG molecules (Class II) also have free thiols. Since IgG molecules and serum albumin constitute the majority of soluble proteins in blood, they also constitute the majority of free thiol groups in the blood that can be used to covalently bind to maleimide modified peptides.

さらに、遊離チオール含有血液タンパク質の間でさえ、マレイミドを用いた特異的標識
化は、アルブミン自体の独特の特徴付けに起因して、ペプチド−マレイミド−アルブミン
結合体の優先的な形成に導く。アルブミンの単一の遊離チオール基は、種間において高度
に保存され、アミノ酸残基３４（Ｃｙｓ34）に位置する。最近、アルブミンのＣｙｓ34が
他の遊離チオール含有タンパク質の遊離チオールと比べて高い反応性を有することが示さ
れている。これは、アルブミンのＣｙｓ34に対する非常に低いｐＫ値（５．５）に一部起
因する。これは、一般的にシステイン残基の典型的なｐＫ値（典型的には約８）よりもず
っと低い。この低いｐＫに起因して、正常な生理学的条件下でアルブミンのＣｙｓ34は、
主にイオン化された形態であり、これは、その反応性を劇的に増加させる。Ｃｙｓ34の低
いｐＫ値に加えて、Ｃｙｓ34の反応性を高める別の因子はその位置であり、その位置は、
アルブミンのＶ領域の一つのループの表面に近接した間隙である。この位置は、Ｃｙｓ34
を全ての種類のリガンドに対してまさしく利用可能にし、遊離ラジカルトラップおよび遊
離チオール捕捉剤としてＣｙｓ34の生物学的役割において重要な因子である。これらの性
質は、Ｃｙｓ34をマレイミドに非常に反応性にし、反応速度の加速は、他の遊離チオール
含有タンパク質とマレイミドペプチドの反応の反応速度に比べて、１０００倍であり得る
。 Furthermore, even among free thiol-containing blood proteins, specific labeling with maleimide leads to preferential formation of peptide-maleimide-albumin conjugates due to the unique characterization of albumin itself. The single free thiol group of albumin is highly conserved among species and is located at amino acid residue 34 (Cys 34 ). Recently, it has been shown that Cys 34 of albumin is highly reactive compared to free thiols of other free thiol-containing proteins. This is partly due to the very low pK value (5.5) for Cys 34 of albumin. This is generally much lower than the typical pK value of cysteine residues (typically about 8). Due to this low pK, Cys 34 of albumin under normal physiological conditions is
The predominantly ionized form, which dramatically increases its reactivity. In addition to the low pK value of Cys 34, another factor which enhances the reactivity of Cys 34 is its location, its position,
The gap close to the surface of one loop in the V region of albumin. This position is Cys 34
Is a key factor in the biological role of Cys 34 as a free radical trap and free thiol scavenger. These properties make Cys 34 highly reactive to maleimide, and the acceleration of the reaction rate can be 1000 times that of the reaction of other free thiol-containing proteins and maleimide peptides.

ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の別の利点は、ペプチドとアルブミン（特異
的にＣｙｓ34）が１：１で含むことに関連する再現性である。グルタルアルデヒド、ＤＣ
Ｃ、ＥＤＣおよび例えば、遊離アミンについての他の化学活性化のような他の技術は、こ
の選択性を欠いている。例えば、アルブミンは、５２個のリジン残基を含み、このうちの
２５〜３０個は、アルブミンの表面に位置し、そして結合のためにアクセス可能である。
これらのリジン残基の活性化、あるいはこれらのリジン残基を通して結合するペプチドの
改変は、結合体の不均一な集団を生じる。ペプチド対アルブミンの１：１のモル比が使用
される場合でさえ、生成物は、複数の結合体産物からなり、そのいくつかは、１つのアル
ブミン当たり０、１、２以上のペプチドを含み、それぞれは、２５〜３０個の利用可能な
リジン部位のいずれか１つにランダムに結合されるペプチドを有する。多くの組み合わせ
が可能である場合、抽出組成およびそれぞれのバッチの性質の特徴付けは困難になり、バ
ッチ間の再現性はほとんど不可能であり、このような結合体を抗新脈管形成ペプチドとし
てあまり望ましくなくする。さらに、アルブミンのリジン残基を介する結合体化が、１ア
ルブミン分子当たりの抗新脈管形成剤のより多くを送達する利点を少なくとも有するよう
であるが、研究によって、抗新脈管形成剤対アルブミンの１：１の比が好ましいことが示
された。Ｓｔｅｈｌｅら、「Ｔｈｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｒａｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ
Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘ
ａｔｅ−Ａｌｂｕｍｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｔｓ」、Ａｎｔｉ−Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，第８巻，６７７−６８５頁（１９９７）による論文（その全体にお
いて本明細書中で援用される）において、著者らは、抗癌剤メトトレキサート対グルタル
アルデヒドを介して結合されるアルブミンの１：１の比が最も有望な結果を与えたことを
報告した。これらの結合体は腫瘍細胞によって取り込まれたが、５：１〜２０：１のメト
トレキサート分子を有する結合体は、変化したＨＰＬＣプロフィールを有し、そしてイン
ビボで肝臓に迅速に取り込まれた。これらの高い比において、アルブミンに対するコンフ
ォメーションの変化は、治療キャリアとしてのその有効性を減少することが推論される。 Another advantage of the peptide-maleimide-albumin conjugate is the reproducibility associated with the 1: 1 inclusion of peptide and albumin (specifically Cys 34 ). Glutaraldehyde, DC
Other techniques such as C, EDC, and other chemical activations, eg, for free amines, lack this selectivity. For example, albumin contains 52 lysine residues, 25-30 of which are located on the surface of albumin and are accessible for binding.
Activation of these lysine residues, or modification of peptides that bind through these lysine residues, results in a heterogeneous population of conjugates. Even when a 1: 1 molar ratio of peptide to albumin is used, the product consists of multiple conjugate products, some of which contain 0, 1, 2 or more peptides per albumin, Each has a peptide that is randomly attached to any one of 25-30 available lysine sites. When many combinations are possible, characterization of the extract composition and the nature of each batch becomes difficult and reproducibility between batches is almost impossible, making such conjugates as anti-angiogenic peptides. Make it less desirable. Furthermore, although conjugation via lysine residues of albumin appears to have at least the advantage of delivering more of the anti-angiogenic agent per albumin molecule, studies have shown that anti-angiogenic agent pairs A 1: 1 ratio of albumin has been shown to be preferred. Stehl et al., “The Loading Rate Determines.
Tumor Targeting Properties of Methotrex
ate-Albumin Conjugates in Rats ", Anti-Can
In a paper by cer Drugs, Vol. 8, pp 677-685 (1997), which is incorporated herein in its entirety, the authors describe the anti-cancer agent methotrexate vs. albumin bound via glutaraldehyde 1: We reported that a ratio of 1 gave the most promising results. These conjugates were taken up by tumor cells, but conjugates with 5: 1-20: 1 methotrexate molecules had altered HPLC profiles and were rapidly taken up by the liver in vivo. At these high ratios, it is inferred that a conformational change to albumin reduces its effectiveness as a therapeutic carrier.

マレイミド−ペプチドのインビボでの制御された投与を通して、アルブミンおよびＩｇ
Ｇのインビボでの特異的な標識化を制御し得る。典型的な投与において、８０〜９０％の
投与されたマレイミド−ペプチドが、アルブミンを標識し、５％未満がＩｇＧを標識する
。グルタチオンのような遊離チオールの微量標識がまた、生じる。このような特異的な標
識化は、インビボ用途に好ましい。なぜなら、これは、投与された薬剤の見積もられた半
減期の正確な計算を可能にするからである。 Through controlled in vivo administration of maleimide-peptide, albumin and Ig
Specific labeling of G in vivo can be controlled. In a typical administration, 80-90% of the administered maleimide-peptide labels albumin and less than 5% labels IgG. Microlabeling of free thiols such as glutathione also occurs. Such specific labeling is preferred for in vivo applications. This is because it allows an accurate calculation of the estimated half-life of the administered drug.

制御された特異的なインビボ標識化を提供することに加えて、マレイミド−ペプチドは
、血清アルブミンおよびＩｇＧのエキソビボでの特異的標識化を提供し得る。このような
エキソビボの標識化は、血清アルブミンおよび／またはＩｇＧを含む血液、血清または生
理食塩水へのマレイミド−ペプチドの添加を包含する。一旦、マレイミド−ペプチドを用
いてエキソビボで改変すると、血液、血清または生理食塩溶液は、インビボ処置のために
血液に再投与され得る。 In addition to providing controlled specific in vivo labeling, maleimide-peptides can provide specific labeling of serum albumin and IgG ex vivo. Such ex vivo labeling involves the addition of maleimide-peptides to blood, serum or saline containing serum albumin and / or IgG. Once modified ex vivo with maleimide-peptide, blood, serum or saline solution can be re-administered to the blood for in vivo treatment.

ＮＨＳ−ペプチドと対照的に、マレイミド−ペプチドは、一般的に、水性溶液の存在下
および遊離アミンの存在下において、非常に安定である。マレイミド−ペプチドが遊離チ
オールとのみ反応するので、マレイミド−ペプチドがそれ自体と反応することを防ぐため
に、保護基は、一般的に必要ではない。さらにペプチドの増加した安定性によって、イン
ビボ用途に適切な非常に精製された産物を調製するためのＨＰＬＣのようなさらなる精製
工程の使用が可能になる。最後に、増加した化学的安定性は、より長い有効期限を有する
製品を提供する。
（Ｂ．非特異的標識）
本発明のクリングル５ペプチドはまた、血液成分の非特異的標識のために改変され得る
。アミノ基との結合が一般的に使用され得、特に非特異的標識のためのアミド結合の形成
を伴う。そのような結合を形成するために、クリングル５ペプチドと結合した化学反応性
基として、広範に種々の活性カルボキシル基、特にエステルを使用し得、ここでそのヒド
ロキシル部分は、必要とされるレベルにおいて生理学的に受容可能である。多数の異なる
ヒドロキシル基がこれらの結合剤中で使用され得るが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＮＨＳ）およびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）が最も都合が
良く、この使用によりスクシンイミジル基を形成する。 In contrast to NHS-peptides, maleimide-peptides are generally very stable in the presence of aqueous solutions and in the presence of free amines. Since maleimide-peptides react only with free thiols, protecting groups are generally not necessary to prevent the maleimide-peptide from reacting with itself. Furthermore, the increased stability of the peptide allows the use of additional purification steps such as HPLC to prepare highly purified products suitable for in vivo applications. Finally, the increased chemical stability provides a product with a longer expiration date.
(B. Non-specific label)
The kringle 5 peptides of the present invention can also be modified for non-specific labeling of blood components. Coupling with amino groups can generally be used, particularly with the formation of amide bonds for non-specific labeling. To form such a bond, a wide variety of active carboxyl groups, particularly esters, can be used as chemically reactive groups attached to the kringle 5 peptide, where the hydroxyl moiety is at the required level. Physiologically acceptable. A number of different hydroxyl groups can be used in these binders, but N-hydroxysuccinimide (
NHS) and N-hydroxy-sulfosuccinimide (sulfo-NHS) are most convenient, and this use forms a succinimidyl group.

利用され得る他の結合剤は、米国特許第５，６１２，０３４号（これは、本明細書中に
参考として援用される）において記載される。 Other binders that may be utilized are described in US Pat. No. 5,612,034, which is hereby incorporated by reference.

本発明のクリングル５ペプチド誘導体の化学反応性基がインビボで反応し得る種々の部
位としては、細胞、特に赤血球（成熟赤血球）および血小板、ならびにタンパク質（例え
ば、免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、血清アルブミン、フェリチン、ステ
ロイド結合タンパク質、トランスフェリン、サイロキシン結合蛋白、α−２−マクログロ
ブリンなど）が挙げられる。誘導体化されたクリングル５ペプチドが反応するそれらのレ
セプター（これは、長命ではない）は、一般的に、およそ３日以内にヒト宿主から除去さ
れる。上記に示されるタンパク質（細胞のタンパク質を含む）は、血中濃度に基づいて、
特に半減期に関しては、少なくとも３日間残存し、そして５日間以上残存し得る（一般的
に、６０日間を超えず、より一般的には３０日間を超えない）。 Various sites where the chemically reactive group of the kringle 5 peptide derivative of the present invention can react in vivo include cells, particularly erythrocytes (mature erythrocytes) and platelets, and proteins (eg, immunoglobulins (including IgG and IgM), Serum albumin, ferritin, steroid binding protein, transferrin, thyroxine binding protein, α-2-macroglobulin, etc.). Those receptors to which the derivatized kringle 5 peptide reacts (which is not long-lived) are generally cleared from the human host within approximately 3 days. The proteins shown above (including cellular proteins) are based on blood levels
Particularly with respect to half-life, it will remain for at least 3 days and may remain for 5 days or more (generally not exceeding 60 days, more generally not exceeding 30 days).

ほとんどの部分について、反応は、血液中の移動性成分、詳細には血液タンパク質およ
び細胞、より詳細には血液タンパク質および成熟赤血球を伴う。「移動性」とは、その成
分が、任意の長期間（一般的には５分間を超えず、より一般的には１分間である）一定の
場所にいないことを意図するが、いくつかの血液成分は、長期間、比較的停止し得る。最
初は、官能体化されたタンパク質および細胞の比較的不均一な集団が存在する。しかし、
ほとんどの部分について、投与後数日以内でその集団は、血流中の官能体化されたタンパ
ク質の半減期に依存して、最初の集団とは実質的に異なってくる。従って、通常、およそ
３日以内もしくはそれ以上の期間内に、ＩｇＧは、血流において優勢な官能体化されたタ
ンパク質となる。 For the most part, the reaction involves mobile components in the blood, particularly blood proteins and cells, more particularly blood proteins and mature red blood cells. “Migrating” intends that the component is not in place for any long period of time (generally not exceeding 5 minutes, more typically 1 minute) Blood components can be relatively stopped for long periods of time. Initially, there is a relatively heterogeneous population of functionalized proteins and cells. But,
For the most part, within a few days after administration, the population will differ substantially from the initial population, depending on the half-life of the functionalized protein in the bloodstream. Thus, usually within about 3 days or longer, IgG becomes a functionalized protein that predominates in the bloodstream.

通常、投与後５日までに、ＩｇＧ、血清アルブミンおよび成熟赤血球は、血液中の結合
成分の少なくとも約６０ｍｏｌ％、通常は少なくとも約７５ｍｏｌ％となり、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ（実質的により少ない程度まで）および血清アルブミンは、非細胞性結合成分の少な
くとも約５０ｍｏｌ％、通常は少なくとも約７５ｍｏｌ％、より一般には約８０ｍｏｌ％
となる。 Typically, by 5 days after administration, IgG, serum albumin and mature erythrocytes will be at least about 60 mol%, usually at least about 75 mol% of the binding components in the blood, and IgG, I
gM (to a substantially lesser extent) and serum albumin are at least about 50 mol%, usually at least about 75 mol%, more usually about 80 mol% of the non-cellular binding component.
It becomes.

好ましくは、クリングル５ペプチド誘導体は、アルブミンに結合される。   Preferably, the kringle 5 peptide derivative is bound to albumin.

血液成分に対する非特異的クリングル５ペプチドの所望の結合体は、患者にそのクリン
グル５ペプチド誘導体を投与することによって、インビボにて調製され得る。この患者は
、ヒトまたは他の哺乳動物であり得る。その投与は、ボーラス形態でなされるか、または
流れを計器で調節して注入することなどによって、ゆっくりと長期間で導入され得る。 Desired conjugates of non-specific kringle 5 peptides to blood components can be prepared in vivo by administering the kringle 5 peptide derivative to a patient. The patient can be a human or other mammal. The administration can be in the form of a bolus or can be introduced slowly and over a long period of time, such as by adjusting the flow with a meter and injecting.

所望される場合、本発明の結合体はまた、血液と本発明の誘導体化クリングル５ペプチ
ドとを組み合わせることによって、エキソビボで調製され得、血液成分上の反応性官能基
と誘導体化クリングル５ペプチドとの共有結合を可能にし、次いで、宿主にその結合体化
血液を戻すか、または投与する。さらに、上記のことは、初めに、個々の血液成分または
限られた数の成分（例えば、赤血球細胞、免疫グロブリン、血清アルブミンなど）を精製
し、そしてその成分または複数の成分をエキソビボにて化学的に反応性のクリングル５ペ
プチド誘導体と組み合わせることによって達成され得る。次いで、官能体化された血液ま
たは血液成分は、治療的に有効な結合体をインビボで被験体に提供するために宿主に戻さ
れ得る。その血液はまた、エキソビボで操作する間の凝固を予防するために処理され得る
。 If desired, conjugates of the invention can also be prepared ex vivo by combining blood with a derivatized kringle 5 peptide of the invention, wherein a reactive functional group on the blood component and a derivatized kringle 5 peptide are combined. Is allowed to covalently bind, and then the conjugated blood is returned or administered to the host. In addition, the above first purifies individual blood components or a limited number of components (eg, red blood cells, immunoglobulins, serum albumin, etc.) and chemistry of the component or components ex vivo. Can be achieved by combining with chemically reactive kringle 5 peptide derivatives. The functionalized blood or blood component can then be returned to the host to provide the subject with a therapeutically effective conjugate in vivo. The blood can also be processed to prevent clotting during ex vivo manipulation.

（３．改変クリングル５ペプチドの合成）
（Ａ．クリングル５ペプチドの合成）
クリングル５ペプチドフラグメントは、当業者に公知の固相ペプチド化学の標準的な方
法によって、合成され得る。例えば、クリングル５ペプチドフラグメントは、アプライド
バイオシステムシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ）を使用する、ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｊ． Ｍ．
およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ，第２版．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ，ＩＩＩ．，（１９８４））により記載される手順に従がう固相化学技術によって合成
され得る。次いで、同様に、複数のフラグメントが共に結合して合成されて、より大きな
フラグメントを形成する。これらの合成ペプチドフラグメントはまた、特定の位置におけ
るアミノ酸置換を伴って作製され得る。 (3. Synthesis of modified kringle 5 peptide)
(A. Synthesis of Kringle 5 peptide)
Kringle 5 peptide fragments can be synthesized by standard methods of solid phase peptide chemistry known to those skilled in the art. For example, Kringle 5 peptide fragments can be obtained from Applied Biosystem synthesizers.
Steward and Young (Steward, JM
And Young, J .; D. , Solid Phase Peptide Synthe
sis, 2nd edition. , Pierce Chemical Company, Rockfor
d, III. (1984)) and may be synthesized by solid phase chemistry techniques. Similarly, multiple fragments are then combined together and synthesized to form larger fragments. These synthetic peptide fragments can also be made with amino acid substitutions at specific positions.

固相ペプチド合成について、多くの技術の概要が、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．
Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．
Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），１９６３およびＪ．Ｍｅ
ｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，
第２巻 ４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９７３におい
て見出され得る。伝統的な溶液合成については、Ｇ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｐ
ｋｅ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，第１巻、Ａｃａｃｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ）を参照のこと。一般的にこれらの方法は、１つ以上のアミノ酸または適切に保護
されたアミノ酸を連続的に付加してペプチド鎖に成長させることを含む。通常、第１のア
ミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される
。次いで、その保護されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸は、不活性固体支持体
に付着されるか、あるいは、アミド結合を形成するために適切な条件下において、適切に
保護されたコンプリメンタリー（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）（アミノもしくはカルボ
キシル）基を有する配列中に次のアミノ酸を付加することによって溶液中で利用される。
次いで、保護基をこの新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、そして次のアミノ酸（
適切に保護された）が付加などされる。 For a solid phase peptide synthesis, many technical summaries are described in J. Org. M.M. Stewart and J.M.
D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.M.
H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 and J. MoI. Me
ienhofer, Hormonal Proteins and Peptides,
Volume 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973. For traditional solution synthesis, see G.C. Schroder and K.C. Lup
ke, The Peptides, Volume 1, Academic Press (New Y
ork). In general, these methods involve the sequential addition of one or more amino acids or appropriately protected amino acids to grow into a peptide chain. Usually, either the amino group or the carboxyl group of the first amino acid is protected by a suitable protecting group. The protected amino acid or derivatized amino acid is then attached to an inert solid support or, under appropriate conditions to form an amide bond, a suitably protected complementary. ) It is utilized in solution by adding the following amino acid into a sequence having an (amino or carboxyl) group.
The protecting group is then removed from this newly added amino acid residue and the next amino acid (
Appropriately protected) is added.

全ての所望のアミノ酸が、適切な配列内に結合された後、全ての残りの保護基（および
任意の固体支持体）が連続的にか、または同時に除去されて、最終的なポリヌクレオチド
ができる。この一般的手順の単純な改変によって、１つよりも多くのアミノ酸を一度に付
加させて、鎖を成長させることが可能となる（例えば、保護トリペプチドを適切に保護さ
れたジペプチドに（キラル中心をラセミ化しない条件下で）結合させ、脱保護の後、ペン
タペプチドを形成させることによる）。 After all desired amino acids have been combined into the appropriate sequence, all remaining protecting groups (and any solid support) are removed sequentially or simultaneously to form the final polynucleotide. . This simple modification of the general procedure allows one to add more than one amino acid at a time to grow a chain (eg, a protected tripeptide into an appropriately protected dipeptide (chiral center (Under conditions that do not racemize) and by deprotection to form a pentapeptide).

本発明の化合物を調製する特に好ましい方法は、固相ペプチド合成を含み、ここでアミ
ノ酸α−Ｎ−末端は、酸感受性基または塩基感受性基によって保護される。そのような保
護基は、ペプチド結合形成の条件に対して安定であるという特性を有するべき一方で、成
長するペプチド鎖の破壊またはその中に含まれる任意のキラル中心のラセミ化を伴わずに
容易に除去可能である。適切な保護基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆ
ｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ
）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボル
ニルオキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニ
ル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどで
ある。９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基は、クリングル５
ペプチドフラグメントの合成のために特に好ましい。他の好ましい側鎖保護基は、リジン
およびアルギニンのような側鎖アミノ基に関しては、２，２，５，７，８−ペンタメチル
クロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ基、ｐ−トルエンスルホニル基、４−メト
キシベンゼン−スルホニル基、Ｃｂｚ基、Ｂｏｃ基、およびアダマンチルオキシカルボニ
ル基であり；チロシンに関しては、ベンジル基、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基
、２，６−ジクロロベンジル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、シクロヘ
キシル基、シクロペニル基およびアセチル（Ａｃ）基であり；セリンに関しては、ｔ−ブ
チル基、ベンジル基およびテトラヒドロピラニル基であり；ヒスチジンに関しては、トリ
チル基、ベンジル基、Ｃｂｚ基、ｐ−トルエンスルホニル基および２，４−ジニトロフェ
ニル基であり；トリプトファンに関しては、ホルミル基であり；アスパラギン酸およびグ
ルタミン酸に関しては、ベンジル基およびｔ−ブチル基であり；そしてシステインに関し
ては、トリフェニルメチル（トリチル）基である。 A particularly preferred method of preparing the compounds of the invention involves solid phase peptide synthesis, wherein the amino acid α-N-terminus is protected by an acid or base sensitive group. Such protecting groups should have the property of being stable to the conditions of peptide bond formation, while easily without breaking the growing peptide chain or racemizing any chiral centers contained therein. Can be removed. Suitable protecting groups are 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (F
moc), t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxycarbonyl (Cbz)
), Biphenylisopropyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, α, α-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrophenylsulfenyl, 2-cyano-t-butyloxycarbonyl Etc. The 9-fluorenyl-methyloxycarbonyl (Fmoc) protecting group is a kringle 5
Particularly preferred for the synthesis of peptide fragments. Other preferred side chain protecting groups are 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc), nitro group, p-toluenesulfonyl for side chain amino groups such as lysine and arginine. Group, 4-methoxybenzene-sulfonyl group, Cbz group, Boc group, and adamantyloxycarbonyl group; with respect to tyrosine, benzyl group, o-bromobenzyloxycarbonyl group, 2,6-dichlorobenzyl group, isopropyl group, t-butyl (t-Bu) group, cyclohexyl group, cyclopenyl group and acetyl (Ac) group; for serine, t-butyl group, benzyl group and tetrahydropyranyl group; for histidine, trityl group, Benzyl group, Cbz group, p-toluenesulfonyl group and 2,4-dinito Regarding tryptophan, it is a formyl group; a phenyl group with respect to aspartic acid and glutamic acid, be a benzyl group and t- butyl group; and for cysteine, triphenylmethyl (trityl) group.

固相ペプチド合成方法において、α−Ｃ−末端アミノ酸は、適切な固体支持体または樹
脂に付着される。上記合成のために有用な適切な固体支持体は、段階的な縮合−脱保護反
応の試薬および反応条件に対して不活性であり、ならびに使用される媒体に不溶性である
材料である。α−Ｃ−末端カルボキシペプチドの合成のための好ましい固体支持体は、４
−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）であ
る。α−Ｃ−末端アミドペプチドのための好ましい固相支持体は、４−（２’，４’−ジ
メトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミドエチル樹脂である
（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能）。こ
のα−Ｃ−末端アミノ酸は、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメ
チルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）またはビス（２−オ
キソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロリド（ＢＯＰＣｌ）を伴うか、または伴わ
ずに、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピ
ルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはＯ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’，−テトラメチルウロニウム−ヘキサフロオロホスフェート（ＨＢＴＵ）によって樹脂
に結合され、結合は、ジクロロメタンまたはＤＭＦのような溶媒中で１０℃と５０℃との
間の温度にて約１時間〜２４時間の間媒介される。 In the solid phase peptide synthesis method, the α-C-terminal amino acid is attached to a suitable solid support or resin. Suitable solid supports useful for the above synthesis are materials that are inert to the reagents and reaction conditions of the stepwise condensation-deprotection reaction and that are insoluble in the medium used. A preferred solid support for the synthesis of α-C-terminal carboxypeptide is 4
-Hydroxymethylphenoxymethyl-copoly (styrene-1% divinylbenzene). A preferred solid support for α-C-terminal amide peptides is 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) phenoxyacetamidoethyl resin (Applied).
Biosystems (available from Foster City, Calif.)). The α-C-terminal amino acid is 4-dimethylaminopyridine (DMAP), 1-hydroxybenzotriazole (HOBT), benzotriazol-1-yloxy-tris (dimethylamino) phosphonium-hexafluorophosphate (BOP) or bis ( N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC) or O-benzotriazol with or without 2-oxo-3-oxazolidinyl) phosphine chloride (BOPCl) 1-yl-N, N, N ′, N
', -Tetramethyluronium-hexafluorophosphate (HBTU) is bound to the resin, and the bond is about 1 hour to 24 hours at a temperature between 10 ° C. and 50 ° C. in a solvent such as dichloromethane or DMF. Mediated for hours.

固体支持体が、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フ
ェノキシ−アセトアミドエチル樹脂である場合、Ｆｍｏｃ基は、上記のα−Ｃ−末端アミ
ノ酸とのカップリングの前に、第二級アミン、好ましくはピペリジンで切断される。脱保
護された４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ
−アセトアミドエチル樹脂へのカップリングのための好ましい方法は、ＤＭＦ中Ｏ−ベン
ゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウム−ヘキサフ
ロオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈ
ＯＢＴ、１当量）である。保護されたアミノ酸の連続的なカップリングは、当該分野にお
いて周知の自動ポリペプチドシンセサイザーにおいて実行され得る。好ましい実施形態に
おいて、成長するペプチド鎖のα−Ｎ−末端アミノ酸は、Ｆｍｏｃで保護される。成長す
るペプチドのα−Ｎ−末端側からのＦｍｏｃ保護基の除去は、第二級アミン、好ましくは
ピペリジンを用いて処理することによって達成される。次いで、各々の保護アミノ酸は、
およそ３倍の過剰なモル濃度で導入され、そして好ましくは、カップリングはＤＭＦ中で
実行される。カップリング剤は、通常、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ
’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウム−ヘキサフロオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量
）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。 When the solid support is 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) phenoxy-acetamidoethyl resin, the Fmoc group is Cleaved with a secondary amine, preferably piperidine. A preferred method for coupling to the deprotected 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) phenoxy-acetamidoethyl resin is O-benzotriazol-1-yl-N, in DMF. N, N ′, N ′,-tetramethyluronium-hexafluorophosphate (HBTU, 1 equivalent) and 1-hydroxybenzotriazole (H
OBT, 1 equivalent). Sequential coupling of protected amino acids can be performed in automated polypeptide synthesizers well known in the art. In a preferred embodiment, the α-N-terminal amino acid of the growing peptide chain is protected with Fmoc. Removal of the Fmoc protecting group from the α-N-terminal side of the growing peptide is achieved by treatment with a secondary amine, preferably piperidine. Each protected amino acid is then
Introduced in an approximate molar excess of molarity and preferably the coupling is carried out in DMF. The coupling agent is usually O-benzotriazol-1-yl-N, N, N
', N',-tetramethyluronium-hexafluorophosphate (HBTU, 1 equivalent) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBT, 1 equivalent).

固相合成の終点において、このポリペプチドは、連続的にか、または１回の操作でのい
ずれかで、樹脂から取り出されて、そして脱保護される。ポリペプチドの取り出しおよび
脱保護は、チオアニソール（ｔｈｉａｎｉｓｏｌｅ）、水、エタンジチオールおよびトリ
フルオロ酢酸を含む切断試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて、樹脂結合
ポリペプチドを処理することにより１回の操作で達成され得る。ポリペプチドのα−Ｃ−
末端がアルキルアミドである場合、樹脂は、アルキルアミンを用いるアミノ分解によって
切断される。あるいは、ペプチドは、例えば、メタノールを用いるエステル交換反応、続
いてアミノ分解または直接的アミド基交換によって取り出され得る。保護ペプチドは、こ
の時点で精製され得るか、または次の工程に直接使用され得る。側鎖保護基の除去は、上
記の切断カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を使用して達成される。完全に脱保護されたペプ
チドは、任意または全ての以下の型：弱塩基樹脂上のイオン交換（アセテート形態）；非
誘導体化ポリスチレン−ジビニルベンゼン上の疎水性吸着クロマトグラフィー（例えば、
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ）；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチル
セルロース上のイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー（例えば、Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、ＬＨ−２０）または向流分配；高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）（特に、オクチル−もしくはオクタデシルシリル−シリカ結合相充填剤上の逆
相ＨＰＬＣ）を利用する一連のクロマトグラフィー工程により精製される。 At the end of the solid phase synthesis, the polypeptide is removed from the resin and deprotected, either continuously or in a single operation. Polypeptide removal and deprotection is accomplished in a single operation by treating the resin-bound polypeptide with a cleavage reagent comprising thioanisole, water, ethanedithiol and trifluoroacetic acid. Can be done. Α-C- of the polypeptide
When the terminal is an alkylamide, the resin is cleaved by aminolysis using an alkylamine. Alternatively, the peptide can be removed, for example, by transesterification with methanol followed by aminolysis or direct amide group exchange. The protected peptide can be purified at this point or used directly in the next step. Removal of the side chain protecting group is accomplished using the above-described cleavage. Fully deprotected peptides can be of any or all of the following types: ion exchange on weak base resins (acetate form); hydrophobic adsorption chromatography on non-derivatized polystyrene-divinylbenzene (eg
Amberlite XAD); silica gel adsorption chromatography; ion exchange chromatography on carboxymethylcellulose; partition chromatography (eg Se
phadex G-25, LH-20) or countercurrent distribution; high performance liquid chromatography (
HPLC) (especially reverse phase HPLC on octyl- or octadecylsilyl-silica bonded phase packing).

これらのクリングル５ペプチドの分子量は、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法を使用
して決定される。 The molecular weight of these kringle 5 peptides is determined using fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry.

本発明のクリングル５ペプチドは、Ｎ末端保護基およびＣ末端保護基を用いて合成され
得る。 The kringle 5 peptide of the present invention can be synthesized using an N-terminal protecting group and a C-terminal protecting group.

（１．Ｎ末端保護基）
用語「Ｎ保護基」とは、アミノ酸もしくはペプチドのα−Ｎ末端を保護すること、さも
なくばアミノ酸もしくはペプチドのアミノ基を、合成手順の間の望ましくない反応物に対
して保護することが意図されるそれらの基をいう。一般的に、使用されるＮ保護基は、Ｇ
ｒｅｅｎｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ
Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８１））（これは、本明細書中に参考として援用される）に開示さ
れる。さらに、保護基を、例えば、酵素的加水分解によって容易にインビボで切断される
プロドラッグとして使用して、生物学的に活性なペアレント（ｐａｒｅｎｔ）を放出し得
る。α−Ｎ保護基は、低級アルカノイル基（例えば、ホルミル基、アセチル基（「Ａｃ」
）、プロピオニル基、ピバロイル基、ｔ−ブチルアセチル基など；２−クロロアセチル基
、２−ブロモアセチル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基、フタリル基
、ｏ−ニトロフェノキシアセチル基、クロロブチリル基、ベンゾイル基、４−クロロベン
ゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基などを含む他のアシル基；
例えば、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基などのようなスルホニル基；
例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−ニト
ロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメ
トキシベンジルオキシカルボニル基、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、
２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、４−エトキシベンジルオキシカルボニ
ル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４，５−トリ
メトキシベンジルオキシカルボニル基、１−（ｐ−ビフェニルイル）−１−メチルエトキ
シカルボニル基、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、
ベンズヒドリルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ジイソプロピルメ
トキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メトキ
シカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニ
ル基、フェノキシカルボニル基、４−ニトロフェノキシカルボニル基、フルオレニル−９
−メトキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカル
ボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、フェニルチオカルボニル基などのカルバ
メート形成基；例えば、ベンジル基、トリフェニルメチル基、ベンジルオキシメチル基、
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）などのようなアリールアルキル
基ならびに例えば、トリメチルシリルなどのようなシリル基を含む。 (1. N-terminal protecting group)
The term “N-protecting group” is intended to protect the α-N-terminus of an amino acid or peptide, or to protect the amino group of an amino acid or peptide against undesired reactants during the synthetic procedure. Refers to those groups. Generally, the N protecting group used is G
reene, "Protective Groups
In Organic Synthesis "(John Wiley & Sons, N.)
ew York (1981)), which is incorporated herein by reference. In addition, protecting groups can be used, for example, as prodrugs that are readily cleaved in vivo by enzymatic hydrolysis to release biologically active parents. The α-N protecting group is a lower alkanoyl group (for example, formyl group, acetyl group (“Ac”
), Propionyl group, pivaloyl group, t-butylacetyl group, etc .; 2-chloroacetyl group, 2-bromoacetyl group, trifluoroacetyl group, trichloroacetyl group, phthalyl group, o-nitrophenoxyacetyl group, chlorobutyryl group, benzoyl Other acyl groups including groups, 4-chlorobenzoyl groups, 4-bromobenzoyl groups, 4-nitrobenzoyl groups, etc .;
For example, a sulfonyl group such as a benzenesulfonyl group, a p-toluenesulfonyl group, and the like;
For example, benzyloxycarbonyl group, p-chlorobenzyloxycarbonyl group, p-methoxybenzyloxycarbonyl group, p-nitrobenzyloxycarbonyl group, 2-nitrobenzyloxycarbonyl group, p-bromobenzyloxycarbonyl group, 3,4 -Dimethoxybenzyloxycarbonyl group, 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl group,
2,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl group, 4-ethoxybenzyloxycarbonyl group, 2-nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl group, 3,4,5-trimethoxybenzyloxycarbonyl group, 1- (p- Biphenylyl) -1-methylethoxycarbonyl group, α, α-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl group,
Benzhydryloxycarbonyl group, t-butyloxycarbonyl group, diisopropylmethoxycarbonyl group, isopropyloxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, methoxycarbonyl group, allyloxycarbonyl group, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group, phenoxycarbonyl Group, 4-nitrophenoxycarbonyl group, fluorenyl-9
-Carbamate-forming groups such as methoxycarbonyl group, cyclopentyloxycarbonyl group, adamantyloxycarbonyl group, cyclohexyloxycarbonyl group, phenylthiocarbonyl group; for example, benzyl group, triphenylmethyl group, benzyloxymethyl group,
It includes arylalkyl groups such as 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) and the like, as well as silyl groups such as trimethylsilyl.

好ましいＮ保護基は、ホルミル基、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、ｔ−ブ
チルアセチル基、フェニルスルホニル基、ベンジル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）基およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基である。例えば、リジンは、酸不
安定基（例えば、Ｂｏｃ）によって、α−Ｎ末端で保護され得、そして塩基不安定基（例
えば、Ｆｍｏｃ）によって、Ｎ末端で保護され得、次いで、合成の間に選択的に脱保護さ
れ得る。 Preferred N-protecting groups are formyl, acetyl, benzoyl, pivaloyl, t-butylacetyl, phenylsulfonyl, benzyl, t-butyloxycarbonyl (B
oc) group and benzyloxycarbonyl (Cbz) group. For example, lysine can be protected at the α-N terminus by an acid labile group (eg, Boc) and protected at the N terminus by a base labile group (eg, Fmoc), and then during synthesis. It can be selectively deprotected.

（２．カルボキシル保護基）
用語「カルボキシル保護基」とは、化合物の他の官能基部位に関与する反応が実施され
ながらカルボン酸官能基をブロックもしくは保護するために使用されるカルボン酸保護エ
ステル基またはアミド基のことをいう。カルボキシ保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ、「Ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１５２〜１８６頁（１９８１）（これは、本明細書中に参考とし
て援用される）に開示される。さらに、カルボキシ保護基は、プロドラッグとして使用さ
れ得、これによって、このカルボキシ保護基は、例えば、酵素的加水分解によって容易に
インビボで切断され、生物学的に活性なペアレントを放出し得る。そのようなカルボキシ
保護基は、当業者に周知であり、米国特許第３，８４０，５５６号および同第３，７１９
，６６７号にて記載されるように、ペニシリンおよびセファロスポリンの分野におけるカ
ルボキシル基の保護において広範囲に使用されている。これらの開示は、本明細書中に参
考として援用される。代表的なカルボキシ保護基は、Ｃ1−Ｃ8低級アルキル基（例えば、
メチル基、エチル基またはｔ−ブチル基など）；例えば、フェネチル基またはベンジル基
のようなアリールアルキル基ならびに例えば、アルコキシベンジル基またはニトロベンジ
ル基などのようなそれらの置換誘導体；例えば、フェニルエテニル基などのアリールアル
ケニル；アリールおよび例えば、５−インダニル基などのようなその置換誘導体で；例え
ば、ジメチルアミノエチル基などのようなジアルキルアミノアルキル基；例えば、アセト
キシメチル基、ブチリルオキシメチル基、バレリルオキシメチル基、イソブチリルオキシ
メチル基、イソバレリルオキシメチル基、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル基、
１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル基、１−メチル−１−（プロピオニルオキシ）−
１−エチル基、ピバロイルオキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基などのようなア
ルカノイルオキシアルキル基；例えば、シクロプロピルカルボニルオキシメチル基、シク
ロブチルカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルカルボニルオキシメチル基、シクロ
ヘキシルカルボニルオキシメチル基などのようなシクロアルカノイルオキシアルキル基；
例えば、ベンゾイルオキシメチル基、ベンゾイルオキシエチル基などのようなアロイルオ
キシアルキル基；例えば、ベンジルカルボニルオキシメチル基、２−ベンジルカルボニル
オキシエチル基などのようなアリールアルキルカルボニルオキシアルキル基；例えば、メ
トキシカルボニルメチル基、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル基、１−メトキシカ
ルボニル−１−エチル基などのようなアルコキシカルボニルアルキル基またはシクロアル
キルオキシカルボニルアルキル基；例えば、メトキシカルボニルオキシメチル基、ｔ−ブ
チルオキシカルボニルオキシメチル基、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル基、
１−シクロへキシルオキシカルボニルオキシ−１−エチル基などのようなアルコキシカル
ボニルオキシアルキル基またはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル基；例え
ば、２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル基、２−（５−インダニルオキシカルボ
ニルオキシ）エチル基などのようなアリールオキシカルボニルオキシアルキル基；例えば
、２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ）エチル基などのような
アルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル基；例えば、２−（ベンジルオキシカルボ
ニルオキシ）エチル基などのようなアリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル基
；例えば、２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチル基な
どのようなアリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル基；例えば、ｔ−ブチル
オキシカルボニルアミノメチル基などのようなアルコキシカルボニルアミノアルキル基；
例えば、メチルアミノカルボニルアミノメチル基などのようなアルキルアミノカルボニル
アミノアルキル基；例えば、アセチルアミノメチル基などのようなアルカノイルアミノア
ルキル基；例えば、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル基などのような複素
環式カルボニルオキシアルキル基；例えば、ジメチルアミノカルボニルメチル基、ジエチ
ルアミノカルボニルメチル基などのようなジアルキルアミノカルボニルアルキル基；例え
ば、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基などの
ような（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキ
ル基；ならびに、例えば、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イ
ル）メチル基などのような（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イ
ル）アルキル基である。 (2. Carboxyl protecting group)
The term “carboxyl protecting group” refers to a carboxylic acid protected ester group or amide group that is used to block or protect a carboxylic acid functional group while reactions involving other functional group sites of the compound are carried out. . Carboxy protecting groups are described in Greene, “Prot
elective Groups in Organic
Synthesis "pages 152-186 (1981), which is incorporated herein by reference. In addition, carboxy protecting groups can be used as prodrugs, whereby the carboxy protecting group can be readily cleaved in vivo, for example, by enzymatic hydrolysis, releasing a biologically active parent. Such carboxy protecting groups are well known to those skilled in the art and are described in US Pat. Nos. 3,840,556 and 3,719.
No. 667, used extensively in the protection of carboxyl groups in the field of penicillins and cephalosporins. These disclosures are incorporated herein by reference. Exemplary carboxy protecting groups are C 1 -C 8 lower alkyl groups (eg,
Methyl group, ethyl group or t-butyl group); for example, arylalkyl groups such as phenethyl group or benzyl group and substituted derivatives thereof such as alkoxybenzyl group or nitrobenzyl group; An arylalkenyl such as a group; aryl and substituted derivatives thereof such as, for example, a 5-indanyl group; a dialkylaminoalkyl group such as a dimethylaminoethyl group; for example, an acetoxymethyl group, a butyryloxymethyl group, Valeryloxymethyl group, isobutyryloxymethyl group, isovaleryloxymethyl group, 1- (propionyloxy) -1-ethyl group,
1- (Pivaloyloxy) -1-ethyl group, 1-methyl-1- (propionyloxy)-
Alkanoyloxyalkyl groups such as 1-ethyl group, pivaloyloxymethyl group, propionyloxymethyl group, etc .; for example, cyclopropylcarbonyloxymethyl group, cyclobutylcarbonyloxymethyl group, cyclopentylcarbonyloxymethyl group, cyclohexylcarbonyloxy A cycloalkanoyloxyalkyl group such as a methyl group;
For example, an aroyloxyalkyl group such as a benzoyloxymethyl group and a benzoyloxyethyl group; for example, an arylalkylcarbonyloxyalkyl group such as a benzylcarbonyloxymethyl group and a 2-benzylcarbonyloxyethyl group; An alkoxycarbonylalkyl group such as a carbonylmethyl group, a cyclohexyloxycarbonylmethyl group, a 1-methoxycarbonyl-1-ethyl group, or a cycloalkyloxycarbonylalkyl group; for example, a methoxycarbonyloxymethyl group, t-butyloxycarbonyloxymethyl Group, 1-ethoxycarbonyloxy-1-ethyl group,
An alkoxycarbonyloxyalkyl group or a cycloalkyloxycarbonyloxyalkyl group such as 1-cyclohexyloxycarbonyloxy-1-ethyl group; for example, 2- (phenoxycarbonyloxy) ethyl group, 2- (5-indanyl) Aryloxycarbonyloxyalkyl groups such as an oxycarbonyloxy) ethyl group; for example, alkoxyalkylcarbonyloxyalkyl groups such as a 2- (1-methoxy-2-methylpropane-2-oiloxy) ethyl group; Arylalkyloxycarbonyloxyalkyl groups such as 2- (benzyloxycarbonyloxy) ethyl group; for example, arylalkene groups such as 2- (3-phenylpropen-2-yloxycarbonyloxy) ethyl group Alkoxycarbonylamino group such as, for example, t- butyl butyloxycarbonyl aminomethyl group; aryloxycarbonyloxy group;
For example, an alkylaminocarbonylaminoalkyl group such as a methylaminocarbonylaminomethyl group; an alkanoylaminoalkyl group such as an acetylaminomethyl group; a 4-methylpiperazinylcarbonyloxymethyl group, etc. A heterocyclic carbonyloxyalkyl group; for example, a dialkylaminocarbonylalkyl group such as dimethylaminocarbonylmethyl group, diethylaminocarbonylmethyl group, etc .; for example, (5-t-butyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4 -Yl) (5- (lower alkyl) -2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl) alkyl groups such as methyl group; and, for example, (5-phenyl-2-oxo-1,3 -Dioxolen-4-yl) methyl group and the like ( - phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl) alkyl group.

代表的なアミドカルボキシ保護基は、アミノカルボニル基および低級アルキルアミノカ
ルボニル基である。 Exemplary amidocarboxy protecting groups are aminocarbonyl groups and lower alkylaminocarbonyl groups.

本発明の好ましいカルボキシ保護化合物には複数の化合物があり、ここでその保護カル
ボキシ基は、低級アルキルエステル、シクロアルキルエステルもしくはアリールアルキル
エステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピル
エステル、ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエス
テル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチ
ルエステルなど）またはアルカノイルオキシアルキルエステル、シクロアルカノイルオキ
シアルキルエステル、アロイルオキシアルキルエステルもしくはアリールアルキルカルボ
ニルオキシアルキルエステルである。好ましいアミドカルボキシ保護基は、低級アルキル
アミノカルボニル基である。例えば、アスパラギン酸は、酸不安定基（例えば、ｔ−ブチ
ル基）によりα−Ｃ末端にて保護され得、そして水素化不安定基（例えば、ベンジル基）
によりβ−Ｃ末端にて保護され得、次いで、合成中に選択的に脱保護され得る。 Preferred carboxy protected compounds of the invention include a plurality of compounds, wherein the protected carboxy group is a lower alkyl ester, cycloalkyl ester or arylalkyl ester (eg, methyl ester, ethyl ester, propyl ester, isopropyl ester, butyl ester). Ester, sec-butyl ester, isobutyl ester, amyl ester, isoamyl ester, octyl ester, cyclohexyl ester, phenylethyl ester, etc.) or alkanoyloxyalkyl ester, cycloalkanoyloxyalkyl ester, aroyloxyalkyl ester or arylalkylcarbonyloxyalkyl Ester. A preferred amidocarboxy protecting group is a lower alkylaminocarbonyl group. For example, aspartic acid can be protected at the α-C terminus by an acid labile group (eg, a t-butyl group) and a hydrogenation labile group (eg, a benzyl group).
Can be protected at the β-C terminus and then selectively deprotected during synthesis.

（Ｂ．クリングル５ペプチドの改変）
本発明の改変されたクリングル５ペプチドを生成する様式は、その分子を含む種々の要
素の性質に依存して、広範に変動する。合成手順は、単純であるように、高収率を提供す
るように、そして高度に精製された生成物を可能とするように、選択される。通常、化学
反応基は、最終段階で、例えば、カルボキシル基を用いて作製され、活性エステルを形成
するためのエステル化が、合成の最終工程である。本発明の誘導体化されたクリングル５
ペプチドの生成のための特定の方法を、以下の実施例に記載する。 (B. Modification of Kringle 5 peptide)
The manner in which the modified kringle 5 peptides of the present invention are produced varies widely depending on the nature of the various elements comprising the molecule. Synthetic procedures are selected to be simple, to provide high yields, and to allow highly purified products. Usually, chemically reactive groups are created at the final stage, for example using carboxyl groups, and esterification to form active esters is the final step of the synthesis. Derivatized kringle 5 of the present invention
Specific methods for the production of peptides are described in the examples below.

リンカーおよび反応性薬剤での誘導体化を受けさせるために選択された各クリングル５
ペプチドを、以下の基準に従って改変する：薬理学的活性の保持に重要ではないカルボン
酸基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｇｒｏｕｐ）が、本来の分子において利用可能であり、そ
して他の反応性官能基がこの分子に存在しない場合、カルボン酸を、リンカー反応基改変
のための結合部位として選択する。カルボン酸が利用可能ではない場合、薬理学的活性の
保持に重要ではない任意の他の官能基を、リンカー反応基改変のための結合部位として選
択する。いくつかの官能基がクリングル５ペプチドにおいて利用可能である場合、リンカ
ー／反応基の付加および保護されたすべての官能基の脱保護後に、薬理学的活性の保持が
なお得られるような様式で、保護基の組み合わせが使用される。反応性官能基が治療剤に
おいて利用可能ではない場合、合成的な試みが、生物学的活性の保持およびレセプター特
異性または標的特異性の保持が得られるような様式での本来のペアレント薬物の改変を可
能にする。 Each kringle 5 selected for derivatization with a linker and reactive agent
The peptide is modified according to the following criteria: Carboxylic groups that are not important for retention of pharmacological activity are available in the original molecule and other reactive functional groups are present in this molecule If not, the carboxylic acid is selected as the binding site for the linker reactive group modification. If a carboxylic acid is not available, any other functional group that is not important for retention of pharmacological activity is selected as the attachment site for linker reactive group modification. If several functional groups are available in the Kringle 5 peptide, in a manner that still retains pharmacological activity after addition of the linker / reactive group and deprotection of all protected functional groups, A combination of protecting groups is used. If reactive functional groups are not available in the therapeutic agent, synthetic attempts will modify the original parent drug in such a way that retention of biological activity and retention of receptor specificity or target specificity is obtained. Enable.

化学的反応性基は、１つの部位に存在し、その結果、ペプチドが、血液成分に結合する
場合、ペプチドは、ペアレント化合物のインヒビター活性の実質的な比率を保持する。 A chemically reactive group is present at one site so that when the peptide binds to a blood component, the peptide retains a substantial proportion of the inhibitor activity of the parent compound.

さらにより詳細には、リンカーおよび反応基での誘導体化を受けさせるために選択され
た各クリングル５ペプチドを、以下の基準に従って改変する：末端のカルボン酸基が、ク
リングル５ペプチドにおいて利用可能であり、そしてこの末端のカルボキシル基が薬理学
的活性の保持に重要ではなく、そして他の感受性官能基がクリングル５ペプチドに存在し
ない場合、このカルボン酸を、リンカー反応基改変のための結合部位として選択する。末
端のカルボン酸基が薬理学的活性に関与している場合、またはカルボン酸が利用可能では
ない場合、薬理学的活性の保持に重要ではない任意の他の感受性官能基を、リンカー反応
基改変のための結合部位として選択する。いくつかの感受性官能基がクリングル５ペプチ
ドにおいて利用可能である場合、リンカー／反応基の付加および保護されたすべての感受
性官能基の脱保護後に、薬理学的活性の保持がなお得られるような様式で、保護基の組み
合わせが使用される。感受性官能基が治療用ペプチドにおいて利用可能ではない（または
より単純な改変経路が所望される場合）合成的な試みが、生物学的活性の保持およびレセ
プター特異性または標的特異性の保持が得られるような様式での本来のクリングル５ペプ
チドの改変を可能にする。この場合、改変は、ペプチドの反対の末端において生じる。 Even more particularly, each kringle 5 peptide selected for derivatization with linkers and reactive groups is modified according to the following criteria: a terminal carboxylic acid group is available in the kringle 5 peptide. And if the terminal carboxyl group is not important for retention of pharmacological activity and no other sensitive functional groups are present in the kringle 5 peptide, the carboxylic acid is selected as the attachment site for linker reactive group modification. To do. If the terminal carboxylic acid group is involved in pharmacological activity, or if no carboxylic acid is available, any other sensitive functional group that is not important for retention of pharmacological activity can be modified with a linker reactive group Select as the binding site for. A mode in which retention of pharmacological activity is still obtained after addition of linker / reactive group and deprotection of all protected sensitive functional groups when several sensitive functional groups are available in the kringle 5 peptide A combination of protecting groups is used. Synthetic attempts where sensitive functional groups are not available in therapeutic peptides (or where a simpler modified route is desired) will result in retention of biological activity and retention of receptor specificity or target specificity. Allows modification of the original kringle 5 peptide in such a manner. In this case, the modification occurs at the opposite end of the peptide.

ＮＨＳ誘導体は、クリングル５ペプチドにおいて、他の感受性官能基の不在下でカルボ
ン酸から合成され得る。特に、このようなクリングル５ペプチドは、無水ＣＨ2Ｃｌ2およ
びＥＤＣ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応し、そしてこの生成物は、クロマトグ
ラフィーによって精製されるか、またはＮＨＳ誘導体を与えるに適切な溶媒系から再結晶
化される。 NHS derivatives can be synthesized from carboxylic acids in the absence of other sensitive functional groups in the Kringle 5 peptide. In particular, such a kringle 5 peptide reacts with N-hydroxysuccinimide in anhydrous CH 2 Cl 2 and EDC and the product is purified by chromatography or a suitable solvent to give the NHS derivative. Recrystallized from the system.

あるいは、ＮＨＳ誘導体は、アミノ基および／またはチオール基、ならびにカルボン酸
を含むクリングル５ペプチドから合成され得る。分子中に遊離のアミノ基またはチオール
基が存在する場合、ＮＨＳ誘導体の付加を実施する前に、これらの感受性官能基を保護す
ることが好ましい。例えば、分子が遊離アミノ基を含む場合、Ｆｍｏｃまたは好ましくは
ｔＢｏｃ保護アミンへのアミンの転換が、上記化学を実施する前に必要とされる。アミン
官能基は、ＮＨＳ誘導体の調製後に脱保護されない。従って、この方法は、所望される薬
理学的効果を誘導するために、アミン基が遊離状態であることが必要とされないペプチド
のみに対して適用される。 Alternatively, NHS derivatives can be synthesized from kringle 5 peptides containing amino and / or thiol groups and carboxylic acids. If free amino or thiol groups are present in the molecule, it is preferable to protect these sensitive functional groups before carrying out the addition of the NHS derivative. For example, if the molecule contains a free amino group, conversion of the amine to Fmoc or preferably tBoc protected amine is required before carrying out the chemistry. Amine functional groups are not deprotected after the preparation of NHS derivatives. This method therefore applies only to peptides where the amine group is not required to be free to induce the desired pharmacological effect.

さらに、ＮＨＳ誘導体は、アミノ基またはチオール基を含み、そしてカルボン酸を含ま
ないクリングル５ペプチドから合成され得る。選択された分子が、カルボン酸を含まない
場合、一連の二官能性リンカーを使用して、その分子を反応性ＮＨＳ誘導体へと変換し得
る。例えば、ＤＭＦ中に溶解され、そして遊離アミノ含有分子に付加されたエチレングリ
コールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）およびトリエチルアミン（ＥＧ
Ｓの方が有利なように、１０：１の比率で）は、モノＮＨＳ誘導体を生成する。チオール
誘導体化分子からＮＨＳ誘導体を生成するためには、ＤＭＦ中のＮ−［γ−マレイミドブ
チリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）およびトリエチルアミンが使用され
得る。マレイミド基は、遊離チオールと反応し、そしてＮＨＳ誘導体は、シリカでのクロ
マトグラフィーによってか、またはＨＰＬＣによって反応混合物から精製される。 In addition, NHS derivatives can be synthesized from kringle 5 peptides that contain amino or thiol groups and no carboxylic acids. If the selected molecule does not contain a carboxylic acid, a series of bifunctional linkers can be used to convert the molecule to a reactive NHS derivative. For example, ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS) and triethylamine (EG) dissolved in DMF and added to free amino-containing molecules.
(In a 10: 1 ratio, so that S is more advantageous) produces a mono NHS derivative. N- [γ-maleimidobutyryloxy] succinimide ester (GMBS) and triethylamine in DMF can be used to generate NHS derivatives from thiol derivatized molecules. The maleimide group reacts with the free thiol and the NHS derivative is purified from the reaction mixture by chromatography on silica or by HPLC.

ＮＨＳ誘導体はまた、複数の感受性官能基を含むクリングル５ペプチドから合成され得
る。各々の場合に、異なる様式で分析および解明がなされなければならない。しかし、上
記のような市販されている多量の保護基および二官能性リンカーのために、本発明は、ペ
プチドを誘導体化するために、好ましくはわずか１つの化学的工程で、または感受性基の
予めの保護による２工程もしくは３工程（保護、活性化、および脱保護）で、任意のペプ
チドに適用可能である。例外的な状況下でのみ、クリングル５ペプチドを活性ＮＨＳまた
はマレイミド誘導体に転換するために、複数の（３工程を超える）合成工程を使用するこ
とが必要とされる。 NHS derivatives can also be synthesized from kringle 5 peptides containing multiple sensitive functional groups. In each case, analysis and interpretation must be done in a different manner. However, due to the large amount of commercially available protecting groups and bifunctional linkers as described above, the present invention is preferably used in as little as one chemical step or in advance of sensitive groups in order to derivatize the peptide. It can be applied to any peptide in two or three steps (protection, activation, and deprotection). Only under exceptional circumstances is it necessary to use multiple (more than 3 steps) synthetic steps to convert kringle 5 peptide to active NHS or maleimide derivatives.

マレイミド誘導体はまた、遊離アミノ基および遊離カルボン酸を含むクリングル５ペプ
チドから合成され得る。アミノ誘導体化分子からマレイミド誘導体を生成するためには、
ＤＭＦ中のＮ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）
およびトリエチルアミンが使用され得る。スクシンイミドエステル基は遊離アミノと反応
し、そしてマレイミド誘導体は、結晶化によってか、またはシリカでのクロマトグラフィ
ーによってか、またはＨＰＬＣによって、反応混合物から精製される。 Maleimide derivatives can also be synthesized from kringle 5 peptides containing a free amino group and a free carboxylic acid. To produce a maleimide derivative from an amino derivatized molecule,
N- [γ-maleimidobutyryloxy] succinimide ester (GMBS) in DMF
And triethylamine may be used. The succinimide ester group reacts with the free amino and the maleimide derivative is purified from the reaction mixture by crystallization or by chromatography on silica or by HPLC.

最後に、マレイミド誘導体は、複数の他の感受性官能基を含み、そして遊離カルボン酸
を含まないクリングル５ペプチドから合成され得る。選択された分子が、カルボン酸を含
まない場合、一連の二官能性架橋試薬を使用して、分子を反応性ＮＨＳ誘導体に変換し得
る。例えば、ＤＭＦ中でのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化を使用して、マレイミド
プロピオン酸（ＭＰＡ）を、遊離アミンにカップリングし、遊離アミンとＭＰＡのカルボ
ン酸基との反応を通してマレイミド誘導体を生成し得る。 Finally, maleimide derivatives can be synthesized from kringle 5 peptides that contain multiple other sensitive functional groups and no free carboxylic acids. If the selected molecule does not contain a carboxylic acid, a series of bifunctional cross-linking reagents can be used to convert the molecule to a reactive NHS derivative. For example, using HBTU / HOBt / DIEA activation in DMF, maleimide propionic acid (MPA) is coupled to the free amine to produce a maleimide derivative through reaction of the free amine with the carboxylic acid group of MPA. obtain.

多数の二官能性化合物が、実体（ｅｎｔｉｔｙ）への架橋のために利用可能である。例
示的な実体としては、以下が挙げられる：アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ
−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド
）、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート（ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ジメチルアジピイ
ミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩、Ｎ−ｙ−マレイミ
ドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４
−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチ
オプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、
グルタルアルデヒド、およびスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート。 A number of bifunctional compounds are available for cross-linking to entities. Exemplary entities include: azidobenzoyl hydrazide, N- [4- (p
-Azidosalicylamino) butyl] -3 '-[2'-pyridyldithio) propionamide), bis-sulfosuccinimidyl suberate, dimethyl adipimidate, disuccinimidyl tartrate N-y-maleimidobutyryloxysuccinimide ester, N-hydroxysulfosuccinimidyl-4
-Azidobenzoate, N-succinimidyl [4-azidophenyl] -1,3'-dithiopropionate, N-succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate,
Glutaraldehyde, and succinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate.

（４．改変クリングル５ペプチドの使用）
上記のように、新脈管形成は、組織の新生血管形成（「出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）」
を含む）、脈管形成または脈管拡張を含む種々のプロセスを含む。外傷性創傷治癒、黄体
（ｃｏｒｐｕｓ ｌｅｕｔｅｕｍ）形成および胚形成を除いて、大半の新脈管形成プロセ
スが疾患プロセスに関連し、従って、本発明の治療方法の使用が、疾患について選択的で
あり、そして有害な副作用を有さないことが考えられる。 (4. Use of modified kringle 5 peptide)
As noted above, angiogenesis is the formation of tissue neovascularization (“sprouting”).
Various processes including angiogenesis or vasodilation. Except for traumatic wound healing, corpus luteum formation and embryogenesis, most angiogenic processes are related to the disease process, and therefore the use of the treatment method of the invention is selective for the disease, And it is thought that it has no harmful side effects.

新脈管形成が重要であると考えられる種々の疾患が存在し、これらの疾患は、本発明の
改変されたペプチドを用いて処置可能であり得る。これらの疾患としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：例えば、免疫性炎症および非免疫性炎症、慢性関節リウマ
チならびに乾癬のような炎症性障害、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄
、アテローム硬化症斑（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ） における毛
細管増殖および骨粗しょう症のような脈管の不穏当または不適当な浸潤に関連した障害、
ならびに例えば、固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、
カポージ肉腫および新生血管形成を必要とし、腫瘍増殖を支持する同様の癌のような癌関
連障害。 There are a variety of diseases in which angiogenesis is considered important, and these diseases may be treatable with the modified peptides of the present invention. These diseases include but are not limited to: inflammatory disorders such as immune and non-immune inflammation, rheumatoid arthritis and psoriasis, such as diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, Disorders associated with restenosis, vascular unrest or inappropriate invasion such as capillary growth and osteoporosis in atherosclerotic plaques,
And, for example, solid tumors, solid tumor metastases, angiofibromas, post-lens fibroproliferation, hemangiomas,
Cancer-related disorders such as Kaposi's sarcoma and similar cancers that require neovascularization and support tumor growth.

本発明の改変されたクリングル５ペプチドは、罹患した組織における新脈管形成を阻害
し、疾患の症状を改善し、そして疾患に依存して、疾患の治癒に寄与し得る方法における
使用を見出す。本発明の改変されたペプチドは、インビボでより安定であり、そしてそれ
自体で、より少量の改変されたペプチドが、有効な処置のために投与され得る。１つの実
施形態において、本発明は、それ自体で組織における新脈管形成の阻害を意図する。組織
における新脈管形成の程度、従って、本発明の方法によって達成された阻害の程度は、免
疫組織化学によって、α5Ｂ3−免疫陽性の未成熟な脈管構造および発生期の脈管構造を検
出するための種々の方法によって評価され得る。 The modified kringle 5 peptides of the present invention find use in methods that inhibit angiogenesis in affected tissues, ameliorate disease symptoms, and can contribute to disease healing depending on the disease. The modified peptides of the present invention are more stable in vivo, and as such, smaller amounts of the modified peptides can be administered for effective treatment. In one embodiment, the present invention itself contemplates inhibition of angiogenesis in tissue. The extent of angiogenesis in a tissue, and therefore, the degree of inhibition achieved by the method of the invention, by immunohistochemistry, alpha 5 B 3 - vasculature immature vasculature and nascent immunopositive Can be evaluated by various methods for detecting.

本明細書中に記載されるように、任意の種々の組織、または組織された組織から構成さ
れる器官は、皮膚、筋肉、消化管、結合組織、関節、骨および血管が、新脈管形成刺激で
浸潤し得る同様の組織を含む疾患状態における新脈管形成を支持し得る。 As described herein, organs composed of any of a variety of tissues, or organized tissues, include skin, muscle, gastrointestinal tract, connective tissue, joints, bones and blood vessels that are angiogenic. It can support angiogenesis in disease states involving similar tissues that can invade upon stimulation.

１つの関連する実施形態では、本発明の改変クリングル５ペプチドで処理される組織は
、炎症性組織であり、そして阻害されるべき新脈管形成は、炎症組織の新生血管形成が存
在する炎症性組織の新脈管形成である。このクラスでは、この方法は、例えば、慢性関節
リウマチの患者、免疫または非免疫の炎症性組織、乾癬組織などで、関節炎組織の新脈管
形成の阻害を企図する。 In one related embodiment, the tissue treated with the modified kringle 5 peptide of the invention is an inflammatory tissue and the angiogenesis to be inhibited is an inflammatory where neovascularization of the inflammatory tissue is present. Angiogenesis of tissue. In this class, the method contemplates inhibiting angiogenesis of arthritic tissue, for example, in patients with rheumatoid arthritis, immune or non-immune inflammatory tissue, psoriatic tissue, and the like.

本発明の原理は、本発明は全ての哺乳動物に関して効果的であることと示すことが理解
されているが、本発明の多くの実施形態において本発明で処置される患者は、望ましくは
ヒト患者であり、用語「患者」に含まれるように意図されている。この文脈では、哺乳動
物は、新脈管形成に関連した疾患の処置が所望である哺乳動物種、特に農業のおよび家畜
の哺乳動物種、である任意の哺乳動物種を含むことが理解される。 While the principles of the present invention are understood to show that the present invention is effective for all mammals, in many embodiments of the present invention, patients treated with the present invention are preferably human patients And is intended to be included in the term “patient”. In this context, a mammal is understood to include any mammalian species that is desired to treat a disease associated with angiogenesis, particularly agricultural and domestic mammal species. .

別の関連した実施形態では、本発明の改変クリングル５ペプチドで処置される組織は、
糖尿病網膜症、黄斑変性または血管新生緑内障
を有する患者の網膜組織であり、阻害される新脈管形成は、網膜組織の新生血管形成が存
在する網膜組織の新脈管形成である。 In another related embodiment, the tissue treated with the modified kringle 5 peptide of the present invention comprises:
Angiogenesis that is inhibited and retinal tissue of patients with diabetic retinopathy, macular degeneration or neovascular glaucoma is angiogenesis of retinal tissue where neovascularization of retinal tissue is present.

さらに関連した実施形態では、本発明の改変クリングル５ペプチドで処置される組織は
、固形腫瘍、転移、皮膚癌、乳癌、血管腫異常または血管繊維腫およびその他の癌などを
有する患者の腫瘍組織であり、そして阻害される新脈管形成は、腫瘍組織の新生血管形成
が存在する腫瘍組織の新脈管形成である。本発明の方法によって処置可能な代表的な固形
腫瘍組織としては、肺、膵臓、胸部、結腸、咽頭、卵巣、およびその他の組織が挙げられ
る。 In a further related embodiment, the tissue treated with the modified kringle 5 peptide of the invention is a tumor tissue of a patient having a solid tumor, metastasis, skin cancer, breast cancer, hemangioma abnormality or hemangiofibroma and other cancers. Angiogenesis that is and is inhibited is angiogenesis of tumor tissue where neovascularization of tumor tissue is present. Exemplary solid tumor tissues that can be treated by the methods of the present invention include lung, pancreas, breast, colon, pharynx, ovary, and other tissues.

腫瘍増殖において新生血管形成が果たす重要な役割のために、腫瘍組織の新脈管形成の
阻害は、特に好ましい実施形態である。腫瘍組織の新生血管形成が存在しなければ、腫瘍
組織は、要求される養分を獲得できず、増殖が遅れ、さらなる増殖を止めてしまい、後退
し、そして最終的に壊死し、腫瘍は死ぬ。 Because of the important role played by neovascularization in tumor growth, inhibition of neovascularization of tumor tissue is a particularly preferred embodiment. In the absence of tumor tissue neovascularization, the tumor tissue fails to acquire the required nutrients, slows growth, stops further growth, retreats, and eventually becomes necrotic and the tumor dies.

従って本発明は、本発明の改変クリングル５ペプチドを使用し、本発明の方法に従って
、腫瘍の新脈管形成を阻害することによって、腫瘍の新生血管形成を阻害する方法を提供
する。同様に、本発明は、新脈管形成阻害法を実施することによって、腫瘍の増殖を阻害
する方法を提供する。この方法はまた、転移の形成に対して特に有効である。なぜなら、
（１）転移癌細胞が、一次腫瘍から去り得るように、転移の形成は、一次腫瘍の血管新生
を必要とし、そして（２）転移の増殖を支援するために、第二の部位での転移の確立には
、新生血管形成を必要とするからである。 Accordingly, the present invention provides a method of inhibiting tumor neovascularization by using the modified kringle 5 peptide of the present invention and inhibiting tumor angiogenesis according to the method of the present invention. Similarly, the present invention provides a method of inhibiting tumor growth by performing an angiogenesis inhibition method. This method is also particularly effective for the formation of metastases. Because
Metastasis formation requires primary tumor angiogenesis so that metastatic cancer cells can leave the primary tumor, and (2) metastasis at a second site to support metastatic growth. This is because the establishment of neovascularization requires neovascularization.

関連した実施形態では、本発明は、他の治療法（例えば、固形腫瘍に対して標的化する
、転移の確立の制御のための慣例的な化学療法など）と結合した、この方法の実施を企図
する。本発明の改変クリングル５ペプチドの投与は、代表的に化学療法の間または後に行
なわれるが、数回にわたる化学療法レジメンの後に、新脈管形成を阻害し、ここで、腫瘍
組織に血液供給および養分を提供することによって回復する新脈管形成の誘導によって、
腫瘍組織が毒素攻撃に応答する。さらに、転移に対する予防として、固形腫瘍が除去され
た手術の後に、改変クリングル５ペプチドが、投与されることが好ましい。本発明の方法
が、腫瘍の新生血管形成の阻害に適用する限り、本発明の改変クリングル５ペプチドを使
用して、この方法はまた、腫瘍組織の増殖の阻害、腫瘍転移の形成の阻害、および確立し
た腫瘍の後退に適用し得る。 In a related embodiment, the present invention provides for the implementation of this method in combination with other therapies (eg, conventional chemotherapy for controlling the establishment of metastases, targeting against solid tumors). Contemplate. Administration of the modified kringle 5 peptides of the present invention is typically performed during or after chemotherapy, but after several chemotherapy regimens, inhibits angiogenesis, where blood supply to tumor tissue and By inducing angiogenesis that recovers by providing nutrients,
Tumor tissue responds to toxin attack. Furthermore, as a prophylaxis against metastasis, it is preferred that the modified kringle 5 peptide is administered after the surgery in which the solid tumor has been removed. As long as the method of the present invention applies to the inhibition of tumor neovascularization, using the modified kringle 5 peptide of the present invention, the method can also inhibit tumor tissue growth, tumor metastasis formation, and Applicable to established tumor regression.

再狭窄は、血管形成の成功を妨げる、経皮的経管的冠動脈形成の部位での、平滑筋細胞
（ＳＭＣ）移動および増殖のプロセスである。ＳＭＣの再狭窄の間の移動および増殖は、
本発明の改変クリングル５ペプチドによって阻害される新脈管形成のプロセスとして考え
られ得る。従って、本発明はまた、血管形成の手順に従って、患者の新脈管形成を阻害す
ることによる再狭窄の阻害を企図する。再狭窄の阻害には、改変クリングル５ペプチドは
、この手順に従って、血管形成の手順の後に、約２日〜２８日間代表的に投与され、さら
に典型的には、最初の約１４日間にわたって投与された。 Restenosis is a process of smooth muscle cell (SMC) migration and proliferation at the site of percutaneous transluminal coronary artery formation that impedes successful angiogenesis. Migration and proliferation during SMC restenosis is
It can be considered as a process of angiogenesis inhibited by the modified kringle 5 peptide of the present invention. Thus, the present invention also contemplates inhibiting restenosis by inhibiting angiogenesis in a patient according to an angiogenic procedure. For inhibition of restenosis, the modified kringle 5 peptide is typically administered according to this procedure for about 2 to 28 days after the angiogenesis procedure, and more typically over the first about 14 days. It was.

組織中の新脈管形成を阻害する本発明の方法は、新脈管形成が起こるか、または起こる
危険のある組織を、治療有効量の改変クリングル５ペプチドを含む組成物と接触させる工
程を包含する。さらに本明細書で記載されるように、改変クリングル５ペプチドの投与の
ための用量範囲は、ペプチドの形態、およびその能力に依存し、そして新脈管形成および
新脈管形成によって媒介される疾患の兆候が改善される、所望の効果を生成するのに、十
分に多い量である。用量は、有害な副作用（例えば、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性
心不全など）を起こすほど多くはないべきである。概して、用量は、患者の年齢、状態、
性別および疾患の程度によって変化し、そして当業者によって決定され得る。その用量は
また、任意の合併症の場合には、個々の内科医によって調節され得る。 The methods of the invention for inhibiting angiogenesis in tissue include contacting a tissue in which angiogenesis occurs or is at risk with a composition comprising a therapeutically effective amount of a modified kringle 5 peptide. To do. As further described herein, the dosage range for administration of the modified kringle 5 peptide depends on the form of the peptide and its ability and is mediated by angiogenesis and angiogenesis The amount is sufficiently high to produce the desired effect, with improved signs of. The dosage should not be so great as to cause adverse side effects (eg, hyperviscosity syndrome, pulmonary edema, congestive heart failure, etc.). In general, the dose depends on the patient's age, condition,
It varies with gender and the extent of the disease and can be determined by one skilled in the art. The dose can also be adjusted by the individual physician in the case of any complications.

新生血管形成のインヒビターとして、そのような改変クリングル５ペプチドは、初期お
よび転移性の固形腫瘍の両方ならびに以下の癌の処置において有用である：胸部；結腸；
直腸；肺；口腔咽頭部；下咽頭；食道；胃；膵臓；肝臓；胆嚢；胆管；小腸；腎臓、膀胱
および尿路上皮を含む尿路；頸部、子宮、卵巣、絨毛癌および妊娠性栄養膜疾患を含む女
性の生殖管；前立腺、精嚢、精巣および生殖細胞腫瘍を含む男性の生殖管；甲状腺、副腎
、および下垂体を含む内分泌腺；血管腫、黒色腫、骨または柔組織から生じる肉腫および
カポージの肉腫を含む皮膚；脳、神経、眼、および星状細胞腫、グリオーム、グリア芽細
胞腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫および髄膜腫を含む髄膜腫瘍；白血病のよ
うな造血悪性疾患から生じる固形腫瘍であって、そして緑色腫、プラズマ細胞腫、菌状息
肉腫および皮膚のＴ細胞リンパ腫／白血病のプラークおよび腫瘍を含む；ホジキンリンパ
腫および非ホジキンリンパ腫の両方を含むリンパ腫；慢性関節リウマチ、免疫性関節炎お
よび変形性関節症を含む、自己免疫疾患の予防法；糖尿病性網膜症、未熟網膜症、角膜移
植拒絶、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性に起因する新生
血管形成および低酸素を含む眼疾患；眼の異常な新生血管形成状態；乾癬を含む皮膚病；
アテローム硬化性プラーク中の血管腫（ｈｅｍａｇｉｏｍａ）および毛細管増殖を含む血
管疾患；オスラー−ウェーバー症候群；心筋の新脈管形成；プラーク新生血管形成；毛細
管拡張；血友病性関節；血管繊維腫；創傷の肉芽化；腸の癒着、クローン病、アテローム
硬化症、強皮症および過形成性の瘢痕（すなわち、ケロイド）を含む内皮細胞の過度のま
たは異常な刺激によって特徴付けられる疾患ならびにネコスクラッチ疾患および潰瘍（ヘ
リコバクターピロリ）を含む病理学的結果としての新脈管形成を有する疾患（ロシェル）
。別の使用は、出産制限薬剤としてであり、***および胎盤の確立を阻害する。 As inhibitors of neovascularization, such modified kringle 5 peptides are useful in the treatment of both early and metastatic solid tumors and the following cancers: breast; colon;
Rectum; lung; oropharynx; hypopharynx; esophagus; stomach; pancreas; liver; gallbladder; bile duct; small intestine; urinary tract including kidney, bladder and urothelium; cervix, uterus, ovary, choriocarcinoma and pregnancy nutrition Female genital tract including membrane disease; male genital tract including prostate, seminal vesicle, testis and germ cell tumor; endocrine gland including thyroid, adrenal gland and pituitary gland; hemangioma, melanoma, arising from bone or parenchyma Skin, including sarcomas and capage sarcomas; meninges, including brain, nerve, eye, and astrocytoma, glioma, glioblastoma, retinoblastoma, neuroma, neuroblastoma, schwannoma and meningioma Tumors; solid tumors arising from hematopoietic malignancies such as leukemia and include melanoma, plasmacytoma, mycosis fungoides and cutaneous T-cell lymphoma / leukemia plaques and tumors; Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma Lymphoma, including both; prevention of autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis, immune arthritis and osteoarthritis; diabetic retinopathy, immature retinopathy, corneal transplant rejection, post-lens fibroproliferation, neovascular glaucoma, Ocular diseases including lebeosis, neovascularization and hypoxia due to macular degeneration; abnormal neovascularization status of the eye; skin diseases including psoriasis;
Vascular disease, including hemangiomas and capillary proliferation in atherosclerotic plaques; Osler-Weber syndrome; Myocardial neovascularization; Plaque neovascularization; Capillary dilatation; Hemophilic joint; Diseases characterized by excessive or abnormal stimulation of endothelial cells, including intestinal adhesions, Crohn's disease, atherosclerosis, scleroderma and hyperplastic scars (ie keloids) and Nekos scratch disease and Diseases with angiogenesis as pathological consequences including ulcers (Helicobacter pylori) (Rochelle)
. Another use is as a birth control drug that inhibits ovulation and placental establishment.

本発明の改変クリングル５ペプチドはまた、単独で、または新脈管形成疾患を処置する
ために、患者に慣例的に投与される、放射線療法および／または他の化学療法処置と組み
合わせて使用されるかのどちらかの場合、上記記載の腫瘍からの転移の予防のために有用
であり得る。例えば、固形腫瘍の処置で使用されるとき、本発明の改変クリングル５ペプ
チドは、化学治療剤（例えば、αインターフェロン（ｉｎｔｅｆｅｒｏｎ）、ＣＯＭＰ（
シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびプレドニゾン）、エトポ
シド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホス
ファミド、ビンクリスチンおよびデキサメタゾン）、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレ
ドニゾン、メトトレキサート（ｗ／ロイコビン（ｌｅｕｃｏｖｉｎ）レスキュー）、ドキ
ソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリ
スチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、血管
インヒビン（ａｎｇｉｏｉｎｈｉｂｉｎ）、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリスルフェー
ト、血小板第４因子、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＬＭ−６０９、Ｓ
Ｕ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン（Ｔｅｃｈｇａｌａｎ）、サリドマイド、ＳＰ−
ＰＧなどと一緒に投与され得る。他の化学治療剤としては、アルキル化剤（例えば、メク
ロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミドおよびイホスファミド
（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）を含む窒素マスタード）；カルムスチン、ロムスチン、セムス
チンおよびストレプトゾシンを含むニトロソ尿素類；ブスルファンを含むアルキルスルホ
ネート；ダカルバジンを含むトリアジン；チオテパおよびヘキサメチルメラミンを含むエ
チレンイミン（ｅｔｈｙｅｎｉｍｉｎｅ）；メトトレキサートを含む葉酸アナログ；５−
フルオロウラシル、シトシンアラビノシドを含むピリミジンアナログ；６−メルカプトプ
リンおよび６−チオグアニンを含むプリンアナログ；アクチノマイシンＤを含む抗腫瘍抗
生物質；ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよびミトラマイシン（ｍ
ｅｔｈｒａｍｙｃｉｎ）を含むアントラサイクリン；タモキシフェンおよびコルチコステ
ロイド（ｃｏｒｔｉｏｓｔｅｒｏｉｄ）を含むホルモンならびにホルモンアンタゴニスト
およびシスプラチンならびにブレキナー（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）を含む種々雑多な薬剤が
挙げられる。例えば、腫瘍は、手術、放射線または化学療法およびクリングル５の投与で
慣例的に処置され得、微小転移の休止を延長し、そして任意の残留の一次腫瘍を安定化し
、そして阻害するために、続いてクリングル５の投与がなされ得る。 The modified kringle 5 peptides of the present invention are also used alone or in combination with radiation therapy and / or other chemotherapy treatments that are routinely administered to patients to treat angiogenic diseases. In either case, it may be useful for the prevention of metastases from the tumors described above. For example, when used in the treatment of solid tumors, the modified kringle 5 peptides of the present invention are chemotherapeutic agents (eg, alpha interferon, COMP (
Cyclophosphamide, vincristine, methotrexate and prednisone), etoposide, mBACOD (methotrexate, bleomycin, doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine and dexamethasone), PRO-MACE / MOPP (prednisone, methotrexate (w / leucovin) , Doxorubicin, cyclophosphamide, taxol, etoposide / mechloretamine, vincristine, prednisone and procarbazine), vincristine, vinblastine, vascular inhibin (angioinhibin), TNP-470, pentosan polysulfate, platelet factor 4, angiostatin (angiostatin) , LM-609, S
U-101, CM-101, Techgalan, Thalidomide, SP-
It can be administered with PG and the like. Other chemotherapeutic agents include alkylating agents (eg, nitrogen mustard including mechloretamine, melphalan, chlorambucil, cyclophosphamide and ifosfamide); nitrosoureas including carmustine, lomustine, semustine and streptozocin; Alkyl sulfonates including busulfan; triazines including dacarbazine; ethyleneimines including thiotepa and hexamethylmelamine; folic acid analogs including methotrexate;
Pyrimidine analogs including fluorouracil, cytosine arabinoside; purine analogs including 6-mercaptopurine and 6-thioguanine; antitumor antibiotics including actinomycin D; doxorubicin, bleomycin, mitomycin C and mitramycin (m
anthracyclines including ethramcin; hormones including tamoxifen and corticosteroids and various antagonists including hormone antagonists and cisplatin and brequinar. For example, tumors can be routinely treated with surgery, radiation or chemotherapy and administration of kringle 5, to prolong the cessation of micrometastasis and to stabilize and inhibit any residual primary tumor, followed Administration of kringle 5 can be made.

（５．改変クリングル５ペプチドの投与）
改変クリングル５ペプチドは、生理学的に受容可能な媒体（例えば、脱イオン水、リン
酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、水性エタノールまたは他のアルコール、血
漿、蛋白様溶液、マンニトール、水性グルコース、アルコール、植物油など）中で投与さ
れる。含まれ得る他の添加物としては、緩衝液（この媒体は、約５〜１０の範囲のｐＨで
一般的に緩衝化され、緩衝液は一般に約５０〜２５０ｍＭの濃度の範囲である）、塩（塩
の濃度は、一般に約５〜５００ｍＭの範囲である）、生理的に受容可能な安定剤などが挙
げられる。組成物は、都合の良い保存および輸送のために凍結乾燥され得る。 (5. Administration of modified kringle 5 peptide)
The modified kringle 5 peptide is a physiologically acceptable medium such as deionized water, phosphate buffered saline (PBS), saline, aqueous ethanol or other alcohol, plasma, proteinaceous solution, mannitol, Administered in aqueous glucose, alcohol, vegetable oil, etc.). Other additives that may be included include buffers (this medium is generally buffered at a pH in the range of about 5-10, and the buffer is generally in the range of concentrations from about 50-250 mM), salt (Salt concentrations are generally in the range of about 5 to 500 mM), physiologically acceptable stabilizers, and the like. The composition can be lyophilized for convenient storage and transportation.

本発明の改変クリングル５ペプチドは、大部分について、経口的に、非経口的に（例え
ば、脈管内に（ＩＶ）、動脈内に（ＩＡ）、筋肉内に（ＩＭ）、皮下に（ＳＣ）など）投
与される。投与は、適切な場合には、輸注により得る。いくつかの場合において（ここで
、官能基の反応は比較的緩慢である）、投与は、経口的、経鼻的、直腸的、経皮的または
エアロゾルであり得、ここで結合体の性質は、脈管系への移動を可能にする。通常、一回
の注入が使用されるが、所望の場合、１回より多い注入が用いられ得る。改変クリングル
５ペプチドは、任意の都合のよい手段（注射器、トロカール、カテーテルなどを含む）に
より投与され得る。投与の特定の様式は、投与されるべき量、１回のボーラスであるかま
たは継続的な投与であるかなどに依存して変化する。好ましくは、投与は、脈管内であり
（この導入の部位は、本発明に対して重要なものではない）、好ましくは急速な血流が存
在する部位（例えば、静脈内、末梢静脈または中心静脈）である。他の経路は、投与が、
遅延性放出技術または保護マトリックスと結びつけられる使用を見出し得る。この意図は
、クリングル５ペプチド、アナログまたは誘導体が血液中で効果的に分布されることであ
り、その結果、血液成分と反応し得る。結合体の濃度は、一般的に約１ｐｇ／ｍｌ〜５０
ｍｇ／ｍｌで、広範に変化する。脈管内に投与される総量は、一般に約０．１ｍｇ／ｍｌ
〜約１０ｍｇ／ｍｌ、より通常では、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲である。 The modified kringle 5 peptides of the present invention are, for the most part, orally, parenterally (eg intravascular (IV), intraarterial (IA), intramuscular (IM), subcutaneously (SC) Etc.). Administration is obtained by infusion, where appropriate. In some cases (where the functional group reaction is relatively slow), administration can be oral, nasal, rectal, transdermal, or aerosol, where the nature of the conjugate is Allows movement into the vascular system. Normally, a single injection is used, but more than one injection can be used if desired. The modified kringle 5 peptide can be administered by any convenient means, including syringes, trocars, catheters, and the like. The particular mode of administration will vary depending on the amount to be administered, whether it is a single bolus or continuous administration, and the like. Preferably, administration is intravascular (the site of introduction is not critical to the present invention), preferably where there is rapid blood flow (eg, intravenous, peripheral or central vein) ). Other routes are administration,
It may find use associated with delayed release technology or protective matrix. The intent is that the kringle 5 peptide, analog or derivative is effectively distributed in the blood, so that it can react with blood components. The concentration of conjugate is generally about 1 pg / ml to 50
It varies widely at mg / ml. The total amount administered intravascularly is generally about 0.1 mg / ml
To about 10 mg / ml, more usually in the range of about 1 mg / ml to about 5 mg / ml.

血液の永続成分（例えば、免疫グロブリン、血清アルブミン、赤血球および血小板）を
結合することにより、多数の利点が結果として生じる。改変クリングル５ペプチド化合物
の活性は、数日〜数週間延長される。１回の投与のみ、この期間に与えられる必要がある
。活性化合物は、大きい分子に主に結合されることから（ここでは、他の生理学的プロセ
スを妨げるように脈管的に取り込まれる可能性が低い）、より優れた特異性が達成され得
る。 By combining permanent components of blood (eg, immunoglobulins, serum albumin, red blood cells and platelets), a number of advantages result. The activity of the modified kringle 5 peptide compound is extended from days to weeks. Only one dose needs to be given during this period. Because the active compound is primarily bound to large molecules, where it is less likely to be taken up vascularly to interfere with other physiological processes, better specificity can be achieved.

血液成分間の共有結合の形成は、インビボまたはエキソビボで生じ得る。エキソビボの
共有結合形成に関して、改変クリングル５ペプチドが、血液、血清あるいはヒト血清アル
ブミンまたはＩｇＧを含む生理食塩水溶液に添加され、改変クリングル５ペプチドと血液
成分との間の共有結合形成を可能にする。好ましい様式において、クリングル５ペプチド
は、マレイミドを用いて改変され、そして生理食塩水溶液中でヒト血清アルブミンと反応
される。一旦、改変クリングル５ペプチドが血液成分と反応して、クリングル５ペプチド
−タンパク質結合体を形成すると、この結合体は、患者に投与され得る。 The formation of covalent bonds between blood components can occur in vivo or ex vivo. For ex vivo covalent bond formation, a modified kringle 5 peptide is added to blood, serum or saline solution containing human serum albumin or IgG to allow covalent bond formation between the modified kringle 5 peptide and the blood component. In a preferred manner, the kringle 5 peptide is modified with maleimide and reacted with human serum albumin in saline solution. Once the modified kringle 5 peptide has reacted with blood components to form a kringle 5 peptide-protein conjugate, the conjugate can be administered to a patient.

あるいは、改変クリングル５ペプチドは、直接患者に投与され得、その結果、共有結合
が、インビボにおいて、改変クリングル５ペプチドと結合成分との間で形成する。 Alternatively, the modified kringle 5 peptide can be administered directly to the patient so that a covalent bond is formed between the modified kringle 5 peptide and the binding component in vivo.

（６．改変クリングル５ペプチドの存在のモニタリング）
哺乳動物宿主の血液は、改変クリングル５ペプチド化合物の存在について、１回以上モ
ニタリングされ得る。宿主の血液の一部分またはサンプルととることによって、当業者は
、クリングル５ペプチドが、永続血液成分に、治療的に活性であるのに十分な量で結合さ
れているか否かを決定し得、そしてその後、クリングル５ペプチド化合物の、血液中での
レベルを決定し得る。所望ならば、当業者はまた、血液成分のどれに、クリングル５ペプ
チド誘導体分子が結合されるのかを決定し得る。これは、非特異的クリングル５ペプチド
を使用する場合に、特に重要である。特定のマレイミド−クリングル５ペプチドに対して
、血清アルブミンおよびＩｇＧの半減期を計算することは、はるかに簡単である。 (6. Monitoring the presence of modified kringle 5 peptide)
The blood of the mammalian host can be monitored one or more times for the presence of the modified kringle 5 peptide compound. By taking a portion or sample of the host's blood, one of ordinary skill in the art can determine whether the kringle 5 peptide is bound to a permanent blood component in an amount sufficient to be therapeutically active, and The level of kringle 5 peptide compound in the blood can then be determined. If desired, one skilled in the art can also determine which of the blood components the kringle 5 peptide derivative molecule is bound to. This is particularly important when using non-specific kringle 5 peptides. It is much easier to calculate serum albumin and IgG half-life for a particular maleimide-kringle 5 peptide.

改変クリングル５ペプチドは、ＨＰＬＣ−ＭＳまたはクリングル５ペプチドに対する抗
体を用いてモニターされ得る。 Modified kringle 5 peptides can be monitored using HPLC-MS or antibodies to kringle 5 peptides.

（Ａ．ＨＰＬＣ−ＭＳ）
質量分析法（ＭＳ）に連結したＨＰＬＣは、当業者に周知なように、ペプチドおよび改
変されたペプチドの存在のためのアッセイに利用され得る。代表的には、２つの移動局相
が利用される：０．１％ＴＦＡ／水および０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル。カラム温度
と勾配条件は、変化され得る。特定の詳細は、以下の実施例のセクションに概略を示す。 (A. HPLC-MS)
HPLC coupled to mass spectrometry (MS) can be utilized in assays for the presence of peptides and modified peptides, as is well known to those skilled in the art. Typically, two mobile station phases are utilized: 0.1% TFA / water and 0.1% TFA / acetonitrile. Column temperature and gradient conditions can be varied. Specific details are outlined in the Examples section below.

（Ｂ．抗体）
本発明の別の局面は、クリングル５ペプチドまたはペプチドアナログまたはそれらの誘
導体および結合体に対して特異的な抗体を使用して、生物学的サンプル（例えば、血液）
におけるクリングル５ペプチドおよび／またはアナログ、あるいはそれらの誘導体および
結合体の濃度を決定する方法、ならびにこのようなクリングル５ペプチドおよび／もしく
はそれらの誘導体または結合体と潜在的に関連する毒性に対する処置としてのこのような
抗体の使用に関する。これは、患者において、インビボで、クリングル５ペプチドの安定
性および寿命の増加が、処置の間の新規の問題（毒性に関する可能性の増加を含む）を導
き得るので有利である。そのアナログまたは誘導体に特異性を有する抗体（モノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体のいずれか）の使用は、任意のこのような問題を仲裁す
る際に補助し得る。抗体は、特定の改変クリングル５ペプチドを用いて、またはその因子
の免疫原性フラグメント、あるいはこの因子の抗原決定基に対応する合成された免疫原を
用いて免疫された宿主から生成され得るか、またはそれらに由来し得る。好ましい抗体は
、改変クリングル５ペプチドのネイティブな形態、誘導体化形態、および結合体化形態に
対して、高い特異性および親和性を有する。このような抗体はまた、酵素、蛍光色素、ま
たは放射性標識を用いて標識され得る。 (B. Antibody)
Another aspect of the present invention is the use of antibodies specific for kringle 5 peptides or peptide analogs or derivatives and conjugates thereof for biological samples (eg blood).
For determining the concentration of kringle 5 peptides and / or analogs, or derivatives and conjugates thereof, and as a treatment for toxicity potentially associated with such kringle 5 peptides and / or derivatives or conjugates thereof It relates to the use of such antibodies. This is advantageous because in vivo, increased stability and longevity of the kringle 5 peptide can lead to new problems during treatment, including increased potential for toxicity, in patients. The use of antibodies having specificity for the analog or derivative (either monoclonal or polyclonal antibodies) can assist in arbitrating any such problem. The antibody can be generated from a host immunized with a specific modified kringle 5 peptide, or with an immunogenic fragment of the factor, or a synthetic immunogen corresponding to the antigenic determinant of the factor, Or they can be derived from them. Preferred antibodies have high specificity and affinity for the native, derivatized, and conjugated forms of the modified kringle 5 peptide. Such antibodies can also be labeled with enzymes, fluorescent dyes, or radioactive labels.

改変クリングル５ペプチドに特異的な抗体は、誘導体化されたクリングル５ペプチド特
異的抗体の誘導のために精製されたクリングル５ペプチドを使用するすることにより、産
生され得る。抗体の誘導により、動物中への注射による免疫応答の刺激のみならず、合成
抗体または他の特異的結合分子の産生における類似の工程（例えば、組換え免疫グロブリ
ンライブラリーのスクリーニング）も意図される。モノクローナル抗体およびポリクロー
ナル抗体の両方が、当該分野で周知の手順により産生され得る。 Antibodies specific for the modified kringle 5 peptide can be produced by using purified kringle 5 peptide for the induction of derivatized kringle 5 peptide specific antibodies. Induction of antibodies contemplates not only stimulation of the immune response by injection into animals, but also similar steps in the production of synthetic antibodies or other specific binding molecules (eg, screening of recombinant immunoglobulin libraries). . Both monoclonal and polyclonal antibodies can be produced by procedures well known in the art.

これらの抗体を使用して、血流中のクリングル５ペプチドの存在をモニターし得る。血
液および／または血清（ｓｕｒｕｍ）サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブ
ロッティングによって分析され得る。このような技術は、血液または血清の分析が、改変
クリングル５ペプチドの血液成分への結合を決定することを可能にする。 These antibodies can be used to monitor the presence of kringle 5 peptide in the bloodstream. Blood and / or serum samples can be analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. Such techniques allow blood or serum analysis to determine the binding of the modified kringle 5 peptide to blood components.

抗治療剤抗体はまた、クリングル５ペプチドの投与により誘導された毒性を処置するた
めに使用され得、そしてエキソビボまたはインビボで使用され得る。エキソビボの方法は
、固体支持体に固定された抗治療剤抗体を使用する、毒性に対する免疫透析処置を含む。
インビボの方法は、抗体−薬剤複合体のクリアランスを誘導するのに有効な量の抗治療剤
抗体の投与を含む。 Anti-therapeutic antibodies can also be used to treat toxicity induced by administration of kringle 5 peptide and can be used ex vivo or in vivo. The ex vivo method involves immunodialysis treatment for toxicity using an anti-therapeutic antibody immobilized on a solid support.
In vivo methods include the administration of an amount of an anti-therapeutic agent antibody effective to induce clearance of the antibody-drug complex.

抗体は、滅菌条件下で、エキソビボで、血液を抗体と接触させることによって、改変ク
リングル５ペプチドおよびその結合体を、患者の血液から除去するために使用され得る。
例えば、抗体は、カラムマトリックスに固定化され得るか、またはそうでなければ、固定
化され得、そして患者の血液は、患者から除去され得、そしてマトリックスに通され得る
。改変クリングル５ペプチドは、抗体に結合し、そして低濃度のクリングル５ペプチドを
含む血液は、次いで患者の循環系に戻され得る。除去された改変クリングル５ペプチドの
量は、圧力および流速を調整することによって、制御され得る。患者の血液の血漿成分か
ら改変クリングル５ペプチドを優先的に除去することは、例えば、半透膜の使用によって
、またはそうでなければ、抗治療抗体を含むマトリックス上に血漿成分を通す前に、当該
分野に公知の方法によって、細胞成分から血漿成分を最初に分離することによって、実施
され得る。あるいは、クリングル５ペプチドが結合した血球（赤血球を含む）の優先的な
除去は、患者の血液中の血球を回収しそして濃縮し、そして患者の血液の血清成分が除去
されるまで、固定化した抗治療抗体とこれらの細胞を接触させることによって実施され得
る。 The antibody can be used to remove the modified kringle 5 peptide and its conjugates from the patient's blood by contacting the blood with the antibody ex vivo under sterile conditions.
For example, the antibody can be immobilized on a column matrix or otherwise immobilized, and the patient's blood can be removed from the patient and passed through the matrix. The modified kringle 5 peptide binds to the antibody and blood containing a low concentration of kringle 5 peptide can then be returned to the patient's circulatory system. The amount of modified kringle 5 peptide removed can be controlled by adjusting the pressure and flow rate. Preferential removal of the modified kringle 5 peptide from the plasma component of the patient's blood can be achieved, for example, by the use of a semipermeable membrane or otherwise before passing the plasma component over a matrix containing anti-therapeutic antibodies. It can be performed by first separating the plasma component from the cell component by methods known in the art. Alternatively, preferential removal of blood cells (including red blood cells) to which the kringle 5 peptide has been bound has been collected and concentrated in the patient's blood and immobilized until the serum component of the patient's blood has been removed. It can be performed by contacting these cells with an anti-therapeutic antibody.

抗治療抗体は、処置のために、改変されたクリングル５ペプチドまたは結合体を受容し
ている患者に、インビボで非経口的に投与され得る。抗体は、クリングル５ペプチド化合
物および結合体に結合する。一旦結合されると、クリングル５ペプチド活性は、完全には
ブロックされないとしても、妨げられ、それにより患者の血流中のクリングル５ペプチド
化合物の生物学的有効濃度を低減し、そして有害な副作用を最少にする。さらに、結合さ
れた抗体−クリングル５ペプチド複合体は、患者の血流からのクリングル５ペプチド化合
物および結合体のクリアランスを容易にする。 The anti-therapeutic antibody can be administered parenterally in vivo to a patient receiving the modified kringle 5 peptide or conjugate for treatment. The antibody binds to the kringle 5 peptide compound and conjugate. Once bound, kringle 5 peptide activity is prevented, if not completely blocked, thereby reducing the biologically effective concentration of the kringle 5 peptide compound in the patient's bloodstream and detrimental side effects. Minimize. Furthermore, the conjugated antibody-kringle 5 peptide complex facilitates clearance of the kringle 5 peptide compound and conjugate from the patient's bloodstream.

十分に説明された本発明は、ここで以下の非制限的な実施例によって、例示される。   The fully described invention is now illustrated by the following non-limiting examples.

（概要）
１００μｍｏｌスケールでのクリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を使用
する手動の固相合成およびＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ
を使用して実施した：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒ
ｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−
１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフ
ルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、な
らびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程１）。必要とされる場合、Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ
）基の選択的脱保護を手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨＣｌ3：ＮＭＭ：ＨＯ
Ａｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4の溶液で２時間処理す
ることにより達成した（工程２）。次いで、樹脂を、ＣＨＣｌ3（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ
中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍ
Ｌ）で洗浄した。いくつかの例において、次いで、合成は、１つのＡＥＥＡ（アミノエト
キシエトキシ酢酸）基の添加、酢酸の添加、または３−マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ
）の添加に対して再自動化された（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦ
Ａ／５％ ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却
Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎ
ｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／
分での１８０分にわたる３０〜５５％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およ
びＣＨ3ＣＮ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌ
ｕｎａ １０μフェニル−ヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２
５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）
。純度を、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレーイオン化を使用する
Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分析計を使用するＲＰ−
ＨＰＬＣ質量分析法によって９５％と決定した。 (Overview)
Solid phase peptide synthesis of kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed using manual solid phase synthesis and Symphony Peptide Synthesizer using:
Was performed using: Fmoc protection R in N, N-dimethylformamide (DMF) solution
ink Amide MBHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazole-
Activation with 1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-methylmorpholine (NMM) and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1) ). If needed, Lys (Aloc
) Selective group deprotection was performed manually and the resin was treated with 5 mL CHCl 3 : NMM: HO.
Achieved by treatment with a solution of 3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in Ac (18: 1: 0.5) for 2 hours (step 2). The resin was then washed with CHCl 3 (6 × 5 mL), DCM
In 20% HOAc (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL), and DMF (6 × 5 m)
L). In some examples, the synthesis is then performed by adding one AEEA (aminoethoxyethoxyacetic acid) group, adding acetic acid, or 3-maleimidopropionic acid (MPA).
) Was re-automated (step 3). 85% TF for resin cleavage and product isolation
Performed using A / 5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol followed by precipitation with dry ice cold Et 2 O (step 4). The product is made from Varian (Rain
in) Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system: 9.5 mL /
Gradient elution (Phenomenex L) of 30-55% B (0.045% TFA (A) in H 2 O and 0.045% TFA (B) in CH 3 CN) over 180 min
una 10μ phenyl-hexyl, 21 mm × 25 cm column and λ 214 and 2
UV detector at 54 nm (Varian Dynamax UVD II) is used)
. Purity was measured using a Hewlett Packard LCMS-1100 series analyzer equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.
95% determined by HPLC mass spectrometry.

（実施例１）
（ＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ2．３Ｔ
ＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐ
ｒｏ−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中の２０
％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。酢酸のカップリングを、アミノ酸カッ
プリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最終的な切断を、上記のような切断混合
物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして分取ＨＰＬＣによって
精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 Example 1
(NAc-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Lys-NH 2 .3T
Preparation of FA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
sp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-P
ro-OH. Deblocking the N-terminal Fmoc group of resin bound amino acids
Performed for about 15-20 minutes with% piperidine. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product was isolated by precipitation and purified by preparative HPLC to give the desired product as a white solid upon lyophilization.

（実施例２）
（ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ2．３Ｔ
ＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ
）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ
中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。酢酸のカップリングを、アミ
ノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最終的な切断を、上記のような
切断混合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして分取ＨＰＬＣ
によって精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 (Example 2)
(NAc-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lys-NH 2 .3T
Preparation of FA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu
) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ar
g (Pbf) -OH. Deblocking of the N-terminal Fmoc group of resin-bound amino acids
Performed for about 15-20 minutes with 20% piperidine in it. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product is isolated by precipitation and preparative HPLC
To give the desired product as a white solid upon lyophilization.

（実施例３）
（Ｎａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒ
ｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ2．３ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ
）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆ
ｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ
（ｔＢｕ）ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中の
２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。酢酸のカップリングを、アミノ酸
カップリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最終的な切断を、上記のような切断
混合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして分取ＨＰＬＣによ
って精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 (Example 3)
(Nac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tr
y-Asp-Tyr-Lys-NH 2 . Preparation of 3TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu
) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ar
g (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, F
moc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) OH, Fmoc-Tyr
(TBu) OH. Deblocking of the N-terminal Fmoc group of the resin-bound amino acid was performed with 20% piperidine in DMF for about 15-20 minutes. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product was isolated by precipitation and purified by preparative HPLC to give the desired product as a white solid upon lyophilization.

（実施例４）
（ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ2．４ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ
）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ
（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍ
ｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（
ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−
ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ
）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ
Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ
−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、
ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。酢酸のカップリングを
、アミノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最終的な切断を、上記の
ような切断混合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして分取Ｈ
ＰＬＣによって精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 Example 4
(NAc-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gl
y-Pro-Trp-Ala-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Ly
s-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lys-NH 2 . Preparation of 4TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu
) OH, Fmoc-Leu-OHFmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg
(Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fm
oc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) OH, Fmoc-Tyr (
tBu) OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro-
OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp (OtBu
) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (Ot
Bu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc
-Arg (Pbf) -OH. Deblocking the Fmoc group at the N-terminus of the resin-bound amino acid
Performed for about 15-20 minutes with 20% piperidine in DMF. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product is isolated by precipitation and preparative H
Purification by PLC gave the desired product as a white solid upon lyophilization.

（実施例５）
（ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端
のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分
実施した。酢酸のカップリングを、アミノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。樹
脂からの最終的な切断を、上記のような切断混合物を使用して実施した。その生成物を沈
澱によって単離し、そして分取ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の
際に白色固体として得た。 (Example 5)
(NAc-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gl
y-Pro-Trp-Lys-NH 2 . Preparation of 2TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
rp-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-O
H, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Gly
-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-A
sn (Trt) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH. Deblocking of the N-terminal Fmoc group of the resin-bound amino acid was performed with 20% piperidine in DMF for about 15-20 minutes. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product was isolated by precipitation and purified by preparative HPLC to give the desired product as a white solid upon lyophilization.

（実施例６）
（ＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎ
ε−ＭＰＡ）−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ
基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。
酢酸のカップリングを、アミノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最
終的な切断を、上記のような切断混合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって
単離し、そして分取ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固
体として得た。 (Example 6)
(NAc-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lys- (N
ε-MPA) -NH 2 . Preparation of 2TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Tyr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tB
u) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
rg (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH. N-terminal Fmoc of resin-bound amino acids
Group deblocking was carried out with 20% piperidine in DMF for about 15-20 minutes.
Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product was isolated by precipitation and purified by preparative HPLC to give the desired product as a white solid upon lyophilization.

Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨ
Ｃｌ3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4
の溶液で２時間処理することにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3
（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、
およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸
の添加に対して再自動化した（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／
５％ ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ
2Ｏを使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元
ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分での１８０分
にわたる３０〜５５％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣＨ3ＣＮ中の
０．０４５％ ＴＦＡ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μフ
ェニル−ヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ
検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 Selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and the resin was washed with 5 mL CH.
3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in Cl 3 : NMM: HOAc (18: 1: 0.5)
This was achieved by treating with a solution of 2 hours (step 2). The resin is then washed with CHCl 3
(6 × 5 mL), 20% HOAc in DCM (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL),
And washed with DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of 3-maleimidopropionic acid (step 3). Resin cleavage and product isolation with 85% TFA /
5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol, followed by dry ice-cooled Et
Performed using 2 O (step 4). The product was purified by preparative reverse phase HPLC using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system: 30-55% B (0.045 in H 2 O over 180 min at 9.5 mL / min). Gradient elution (Phenomenex Luna 10 μ phenyl-hexyl, 21 mm × 25 cm column and UV at λ 214 and 254 nm).% TFA (A) and 0.045% TFA (B) in CH 3 CN)
Detector (Varian Dynamax UVD II) is used).

（実施例７）
（（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで実施した：Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢ
ＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−メ
チルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程１
）。 (Example 7)
((MPA-AEEA) -Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr
-NH 2. Preparation of 2TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N,
Fmoc-protected Rink Amide MB in N-dimethylformamide (DMF) solution
HA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′,
Activation with N′-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-methylmorpholine (NMM), and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1
).

自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ
）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペ
リジン（工程２）、続いてＦｍｏｃ−ＡＥＥＡのカップリングを使用して達成する。ＤＭ
Ｆ中でのピペリジン２０％での得られたＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ペプチドの脱保護は、３−
ＭＰＡのその後の付加を可能にする（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８６％ Ｔ
ＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いて
ドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒ
ｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製し
た（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラ
ムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ Ｕ
ＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラ
ムを使用する）。この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレ
ーイオン化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分
析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５％純度を有した。 Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu
) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ar
g (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved using 20% piperidine (step 2) followed by Fmoc-AEEA coupling. DM
Deprotection of the resulting Fmoc-AEEA-peptide with piperidine 20% in F is 3-
Allow subsequent addition of MPA (step 3). 86% T for resin cleavage and product isolation
Performed using precipitation with FA / 5% TIS / 5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol, followed by dry ice cold Et 2 O (step 4). The product is converted to Var
Purified by preparative reverse phase HPLC using a ian (Rainin) preparative binary HPLC system (Dynamax C 18 , 60Å, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varian Dynamax U
Dynamax C 18 equipped with VD II), 60Å, 8 μm, 21 mm × 25 cm column is used). This product had a purity of> 95% as determined by RP-HPLC mass spectrometry using a Hewlett Packard LCMS-1100 series analyzer equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.

（実施例８）
（（ＭＰＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ2．
２ＴＦＡ調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ ＡｍｉｄｅＭＢ
ＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−メ
チルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程１
）。自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢ
ＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（
ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ
、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐ
ｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン
（工程２）、続いて３−ＭＰＡのカップリング（工程３）を使用して達成する。樹脂切断
および生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソール
および２％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した
（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分
取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュ
ール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａ
ｒｉａｎ
Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２
１ｍｍ×２５ｃｍカラムを使用する）。この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそ
してエレクトロスプレーイオン化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ
−１１００シリーズ分析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞
９５％純度を有した。 (Example 8)
((MPA) -Pro-Arg- Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2.
2TFA preparation)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide MB in N, N-dimethylformamide (DMF) solution
HA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′,
Activation with N′-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-methylmorpholine (NMM), and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1
). Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide MB
Continuously added to the HA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Tyr (
tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) OH
, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (P
bf) -OH, Fmoc-Pro-OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved using 20% piperidine (Step 2) followed by coupling of 3-MPA (Step 3). Resin cleavage and product isolation were performed using precipitation with 86% TFA / 5% TIS / 5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol followed by dry ice-cooled Et 2 O (step 4). ). The product was purified by preparative reverse phase HPLC using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system (Dynamax C 18 , 60 °, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm ( Va
rian
Dynamax C 18 with Dynamax UVD II), 60 mm, 8 μm, 2
Use a 1 mm × 25 cm column). This product is a Hewlett Packard LCMS equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.
As determined by RP-HPLC mass spectrometry using a −1100 series analyzer,>
It had 95% purity.

（実施例９）
（ＮＡｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙ
ｒ（ｔＢｕ）ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中
の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。樹脂からの最終的な切断を、上
記のような切断混合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして分
取ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 Example 9
(NAc-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Ty
r-Asp-Tyr-Lys- (Nε-MPA) -NH 2 . Preparation of 2TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Tyr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tB
u) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
rg (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH,
Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) OH, Fmoc-Ty
r (tBu) OH. Deblocking of the N-terminal Fmoc group of the resin-bound amino acid was performed with 20% piperidine in DMF for about 15-20 minutes. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product was isolated by precipitation and purified by preparative HPLC to give the desired product as a white solid upon lyophilization.

Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨ
Ｃｌ3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4
の溶液で２時間処理することにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3
（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、
およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸
の添加に対して再自動化した（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／
５％ ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ
2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ
）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分で
の１８０分にわたる３０〜５５％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣ
Ｈ3ＣＮ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎ
ａ １０μフェニル−ヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４
ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ
ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 Selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and the resin was washed with 5 mL CH.
3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in Cl 3 : NMM: HOAc (18: 1: 0.5)
This was achieved by treating with a solution of 2 hours (step 2). The resin is then washed with CHCl 3
(6 × 5 mL), 20% HOAc in DCM (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL),
And washed with DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of 3-maleimidopropionic acid (step 3). Resin cleavage and product isolation with 85% TFA /
5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol, followed by dry ice-cooled Et
Performed using 2 O precipitation (step 4). The product is made from Varian (Rainin
) Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system: 30-55% B (0.045% TFA (H) in H 2 O and C over 180 min at 9.5 mL / min)
Gradient elution (Phenomenex Lun) of 0.045% TFA (B) in H 3 CN
a 10μ phenyl-hexyl, 21 mm × 25 cm column and λ 214 and 254
UV detector at nm (Varian Dynamax
UVD II)).

（実施例１０）
（（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで実施した：Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢ
ＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢ
ＴＵ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリ
ジン脱保護（工程１）。 (Example 10)
((MPA-AEEA) -Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys
-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2 . Preparation of 2TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N,
Fmoc-protected Rink Amide MB in N-dimethylformamide (DMF) solution
HA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′,
N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HB
TU) and activation with N-methylmorpholine (NMM) and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1).

自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ
）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆ
ｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ
（ｔＢｕ）ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工程２）、続いてＦｍ
ｏｃ−ＡＥＥＡのカップリングを使用して達成する。ＤＭＦ中でのピペリジン２０％での
得られたＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ペプチドの脱保護は、３−ＭＰＡのその後の付加を可能に
する（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ Ｈ
2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる
沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元
ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０
Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎ
ｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍ
ａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムを使用する）。この生成物は、
ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレーイオン化を使用するＨｅｗｌｅ
ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質
量分析法によって決定された、＞９５％純度を有した。 Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu
) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ar
g (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, F
moc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) OH, Fmoc-Tyr
(TBu) OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved by 20% piperidine (step 2) followed by Fm
Achieved using oc-AEEA coupling. Deprotection of the resulting Fmoc-AEEA-peptide with 20% piperidine in DMF allows subsequent addition of 3-MPA (step 3). 86% TFA / 5% TIS / 5% H for resin cleavage and product isolation
Performed using precipitation with 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol followed by dry ice-cooled Et 2 O (step 4). The product was purified by preparative reverse phase HPLC using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system (Dynamax C 18 , 60
Å, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and λ214 and 254n
Dyna with UV detector at V (Varian Dynamax UVD II)
ax C 18 , 60 Å, 8 μm, 21 mm × 25 cm column is used). This product is
Hewlett with diode array detector and using electrospray ionization
It had> 95% purity as determined by RP-HPLC mass spectrometry using a tt Packard LCMS-1100 series analyzer.

（実施例１１）
（（ＭＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで実施した：Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ ＡｍｉｄｅＭＢＨ
Ａ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−メチ
ルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程１）
。自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨ
Ａ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ
Ｂｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂ
ｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工程２）、続いて３−ＭＰＡ
のカップリング（工程３）を使用して達成する。樹脂切断および生成物単離を８６％ Ｔ
ＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ Ｈ２Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いて
ドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒ
ｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製し
た（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラ
ムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ Ｕ
ＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラ
ムを使用する）。この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレ
ーイオン化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分
析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５％純度を有した。 (Example 11)
((MPA) -Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-
Tyr-Asp-Tyr-NH 2 . Preparation of 2TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N,
Fmoc protected Rink Amide MBH in N-dimethylformamide (DMF) solution
A resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N
Activation with '-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-methylmorpholine (NMM), and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1)
. Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids were linked to Rink Amide MBH
A resin was added continuously: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Tyr (t
Bu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pb
f) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-
Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Tyr (tB
u) OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is accomplished by 20% piperidine (step 2) followed by 3-MPA.
This is accomplished using the coupling of (Step 3). 86% T for resin cleavage and product isolation
FA / 5% TIS / 5% H2O / 2% thioanisole and 2% phenol, followed was performed using precipitation by dry-ice cold Et 2 O and (Step 4). The product is converted to Var
Purified by preparative reverse phase HPLC using a ian (Rainin) preparative binary HPLC system (Dynamax C 18 , 60Å, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varian Dynamax U
Dynamax C 18 equipped with VD II), 60Å, 8 μm, 21 mm × 25 cm column is used). This product had a purity of> 95% as determined by RP-HPLC mass spectrometry using a Hewlett Packard LCMS-1100 series analyzer equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.

（実施例１２）
（ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）−ＮＨ2．３ＴＦＡの
調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐ
ｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ
（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆ
ｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック
化を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。酢酸のカップリ
ングを、アミノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最終的な切断を、
上記のような切断混合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして
分取ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 Example 12
(NAc-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gl
y-Pro-Trp-Ala-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Ly
s-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lys- (Nε-MPA) -NH 2 . Preparation of 3TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Tyr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tB
u) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
rg (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH,
Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-P
ro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-O
H, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp
(OtBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, F
moc-Arg (Pbf) -OH. Deblocking of the N-terminal Fmoc group of the resin-bound amino acid was performed with 20% piperidine in DMF for about 15-20 minutes. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cutting from the resin,
The cutting mixture was used as described above. The product was isolated by precipitation and purified by preparative HPLC to give the desired product as a white solid upon lyophilization.

Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨ
Ｃｌ3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4
の溶液で２時間処理することにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3
（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、
およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸
の添加に対して再自動化した（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／
５％ ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ
2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ
）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分で
の１８０分にわたる３０〜５５％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣ
Ｈ3ＣＮ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎ
ａ １０μフェニル−ヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４
ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ
ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 Selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and the resin was washed with 5 mL CH.
3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in Cl 3 : NMM: HOAc (18: 1: 0.5)
This was achieved by treating with a solution of 2 hours (step 2). The resin is then washed with CHCl 3
(6 × 5 mL), 20% HOAc in DCM (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL),
And washed with DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of 3-maleimidopropionic acid (step 3). Resin cleavage and product isolation with 85% TFA /
5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol, followed by dry ice-cooled Et
Performed using 2 O precipitation (step 4). The product is made from Varian (Rainin
) Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system: 30-55% B (0.045% TFA (H) in H 2 O and C over 180 min at 9.5 mL / min)
Gradient elution (Phenomenex Lun) of 0.045% TFA (B) in H 3 CN
a 10μ phenyl-hexyl, 21 mm × 25 cm column and λ 214 and 254
UV detector at nm (Varian Dynamax
UVD II)).

（実施例１３）
（（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ2．３ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−
メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程
１）。 (Example 13)
((MPA-AEEA) -Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val
-Gly-Gly-Pro-Trp-Ala-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro
-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2 . Preparation of 3TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide M in N, dimethylformamide (DMF) solution
BHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′
, N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-
Activation with methylmorpholine (NMM), as well as piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1).

自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ
）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆ
ｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ
（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ
ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏ
ｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工程２）
、続いてＦｍｏｃ−ＡＥＥＡのカップリングを使用して達成する。ＤＭＦ中でのピペリジ
ン２０％での得られたＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ペプチドの脱保護は、３−ＭＰＡのその後の
付加を可能にする（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩ
Ｓ／５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いてドライアイス冷却
Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎ
ｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙｎａｍａ
ｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４
および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備
えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムを使用する）。
この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレーイオン化を使用
するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分析計を使用するＲ
Ｐ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５％純度を有した。 Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu
) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ar
g (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, F
moc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) OH, Fmoc-Tyr
(TBu) OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro
-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp (O
tBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmo
c-Arg (Pbf) -OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved with 20% piperidine (step 2).
This is subsequently achieved using Fmoc-AEEA coupling. Deprotection of the resulting Fmoc-AEEA-peptide with 20% piperidine in DMF allows subsequent addition of 3-MPA (step 3). Resin cleavage and product isolation with 86% TFA / 5% TI
Performed using S / 5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol, followed by precipitation with dry ice-cooled Et 2 O (step 4). The product is made from Varian (Rain
in) Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system (Dynama
x C 18 , 60 mm, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and λ 214
And Dynamax C 18 , 60 Å, 8 μm, 21 mm × 25 cm column with UV detector at 254 nm (Varian Dynamax UVD II).
This product is equipped with a diode array detector and R using a Hewlett Packard LCMS-1100 series analyzer using electrospray ionization.
It had> 95% purity as determined by P-HPLC mass spectrometry.

（実施例１４）
（（ＭＰＡ）−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ2．３ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで実施した：Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢ
ＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−メ
チルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程１
）。自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢ
ＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（
ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ
、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐ
ｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ
−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ
Ｂｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）
−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢ
ｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。 (Example 14)
((MPA) -Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-
Gly-Pro-Trp-Ala-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-
Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2 . Preparation of 3TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N,
Fmoc-protected Rink Amide MB in N-dimethylformamide (DMF) solution
HA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′,
Activation with N′-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-methylmorpholine (NMM), and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1
). Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide MB
Continuously added to the HA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Tyr (
tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) OH
, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (P
bf) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc
-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Tyr (t
Bu) OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro-O
H, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp (OtBu)
-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (OtB
u) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-
Arg (Pbf) -OH.

末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工程２）、続いて３−ＭＰＡのカップ
リング（工程３）を使用して達成する。樹脂切断および生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５
％ ＴＩＳ／５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いてドライア
イス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（
Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙ
ｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよび
λ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ Ｉ
Ｉ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムを使用
する）。この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレーイオン
化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分析計を使
用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５％純度を有した。 Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved using 20% piperidine (Step 2) followed by coupling of 3-MPA (Step 3). 86% TFA / 5 for resin cleavage and product isolation
Performed using precipitation with% TIS / 5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol, followed by dry ice cold Et 2 O (step 4). The product is called Varian (
Purified by preparative reverse phase HPLC using a Rainin) preparative binary HPLC system (Dy
namax C 18 , 60 mm, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varian Dynamax UVD I
Dynamax C 18 with 60), 60 mm, 8 μm, 21 mm × 25 cm column is used). This product had a purity of> 95% as determined by RP-HPLC mass spectrometry using a Hewlett Packard LCMS-1100 series analyzer equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.

（実施例１５）
（ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰＡ）−ＮＨ2．ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−
メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程
１）。 (Example 15)
(NAc-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gl
y-Pro-Trp-Lys- (Nε-MPA) -NH 2 . Preparation of TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide M in N, dimethylformamide (DMF) solution
BHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′
, N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-
Activation with methylmorpholine (NMM), as well as piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1).

自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−
ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌ
ｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の
選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨＣｌ3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ
（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4の溶液で２時間処理するこ
とにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中
の２０％
ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄
した。次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸の添加に対して再自動化した（工程
３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％チオアニソール
および５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した
（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分
取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分での１８０分にわたる３０〜５５％
Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣＨ3ＣＮ中の０．０４５％ ＴＦＡ（
Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μフェニル−ヘキシル、２１
ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ
Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Trp-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-
OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Gl
y-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-
Asn (Trt) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH. Selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and the resin was treated with 5 mL of CHCl 3 : NMM: HOAc.
Achieved by treatment with a solution of 3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in (18: 1: 0.5) for 2 hours (step 2). The resin was then washed with CHCl 3 (6 × 5 mL), 20% in DCM.
Washed with HOAc (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL), and DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of 3-maleimidopropionic acid (step 3). Resin cleavage and product isolation were performed using 85% TFA / 5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol followed by precipitation with dry ice-cooled Et 2 O (step 4). The product was purified by preparative reverse phase HPLC using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system: 30-55% over 180 minutes at 9.5 mL / min.
B (0.045% TFA in H 2 O (A) and 0.045% TFA in CH 3 CN (
B)) Gradient elution (Phenomenex Luna 10μ phenyl-hexyl, 21
mm x 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varian
Dynamax UVD II)).

（実施例１６）
（（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＮＨ2．ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで実施した：Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢ
ＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢ
ＴＵ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリ
ジン脱保護（工程１）。 (Example 16)
((MPA-AEEA) -Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val
-Gly-Gly-Pro-Trp- NH 2. Preparation of TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N,
Fmoc-protected Rink Amide MB in N-dimethylformamide (DMF) solution
HA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′,
N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HB
TU) and activation with N-methylmorpholine (NMM) and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1).

自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ （Ｐｂｆ）−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護
を、２０％ピペリジン（工程２）、続いてＦｍｏｃ−ＡＥＥＡのカップリングを使用して
達成する。ＤＭＦ中でのピペリジン２０％での得られたＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ペプチドの
脱保護は、３−ＭＰＡのその後の付加を可能にする（工程３）。樹脂切断および生成物単
離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェ
ノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生
成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣ
によって精製した（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ
×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙ
ｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ
×２５ｃｍカラムを使用する）。この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエ
レクトロスプレーイオン化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１
００シリーズ分析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５％
純度を有した。 Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
rp-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-O
H, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val
-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-A
sn (Trt) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved using 20% piperidine (step 2) followed by Fmoc-AEEA coupling. Deprotection of the resulting Fmoc-AEEA-peptide with 20% piperidine in DMF allows subsequent addition of 3-MPA (step 3). Resin cleavage and product isolation were performed using precipitation with 86% TFA / 5% TIS / 5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol followed by dry ice-cooled Et 2 O (step 4). ). The product was purified by preparative reverse phase HPLC using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system.
(Dynamax C 18 , 60 mm, 8 μm guard module, 21 mm
X 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varian Dy
Dynamax C 18 with namax UVD II), 60 mm, 8 μm, 21 mm
X25 cm column is used). This product is a Hewlett Packard LCMS-11 equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.
> 95% as determined by RP-HPLC mass spectrometry using 00 series analyzer
Had purity.

（実施例１７）
（（ＭＰＡ）−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＮＨ2．ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−
メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程
１）。自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ
−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ
（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２
０％ピペリジン（工程２）、続いて３−ＭＰＡのカップリング（工程３）を使用して達成
する。樹脂切断および生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ Ｈ2Ｏ／２％
チオアニソールおよび２％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使
用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ
系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μ
ｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵ
Ｖ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ
18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムを使用する）。この生成物は、ダイオー
ドアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレーイオン化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐ
ａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法
によって決定された、＞９５％純度を有した。 (Example 17)
((MPA) -Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-
Gly-Pro-Trp-NH 2 . Preparation of TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide M in N, dimethylformamide (DMF) solution
BHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′
, N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-
Activation with methylmorpholine (NMM), as well as piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1). Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide M
Continuously added to BHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Trp
-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-O
H, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn
(Trt) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH. Deprotection of the terminal Fmoc group
Achieved using 0% piperidine (step 2) followed by coupling of 3-MPA (step 3). 86% TFA / 5% TIS / 5% H 2 O / 2% for resin cleavage and product isolation
Performed using thioanisole and 2% phenol followed by precipitation with dry ice cold Et 2 O (step 4). The product was purified using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC.
Purified by preparative reverse phase HPLC using the system (Dynamax C 18 , 60 °, 8μ
m guard module, 21 mm x 25 cm column and U at λ214 and 254 nm
Dynamax C with V detector (Varian Dynamax UVD II)
18 , 60 mm, 8 μm, 21 mm × 25 cm column is used). This product is equipped with a diode array detector and Hewlett P using electrospray ionization.
It had> 95% purity as determined by RP-HPLC mass spectrometry using an ackard LCMS-1100 series analyzer.

（実施例１８）
（ＮＡｃ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰ
Ａ）−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭ
Ｆ中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。酢酸のカップリングを、ア
ミノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最終的な切断を、上記のよう
な切断混合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして分取ＨＰＬ
Ｃによって精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 (Example 18)
(NAc-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lys- (Nε-MP
A) —NH 2 . Preparation of 2TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Tyr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tB
u) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
rg (Pbf) -OH. Deblocking the Fmoc group at the N-terminus of a resin-bound amino acid
Performed for about 15-20 minutes with 20% piperidine in F. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product is isolated by precipitation and preparative HPL
Purification by C gave the desired product as a white solid upon lyophilization.

Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨ
Ｃｌ3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4
の溶液で２時間処理することにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3
（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、
およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸
の添加に対して再自動化した（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／
５％ ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ
2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ
）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分で
の１８０分にわたる３０〜５５％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣ
Ｈ3ＣＮ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎ
ａ １０μフェニル−ヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４
ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ
ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 Selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and the resin was washed with 5 mL CH.
3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in Cl 3 : NMM: HOAc (18: 1: 0.5)
This was achieved by treating with a solution of 2 hours (step 2). The resin is then washed with CHCl 3
(6 × 5 mL), 20% HOAc in DCM (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL),
And washed with DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of 3-maleimidopropionic acid (step 3). Resin cleavage and product isolation with 85% TFA /
5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol, followed by dry ice-cooled Et
Performed using 2 O precipitation (step 4). The product is made from Varian (Rainin
) Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system: 30-55% B (0.045% TFA (H) in H 2 O and C over 180 min at 9.5 mL / min)
Gradient elution (Phenomenex Lun) of 0.045% TFA (B) in H 3 CN
a 10μ phenyl-hexyl, 21 mm × 25 cm column and λ 214 and 254
UV detector at nm (Varian Dynamax
UVD II)).

（実施例１９）
（（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ2
．２ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（Ｈ
ＢＴＵ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペ
リジン脱保護（工程１）。 Example 19
((MPA-AEEA) -Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2
. Preparation of 2TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide M in N, dimethylformamide (DMF) solution
BHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′
, N′-Tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (H
Activation with BTU) and N-methylmorpholine (NMM), and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1).

自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔ
ｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ
）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工程２）、続いて
Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡのカップリングを使用して達成する。ＤＭＦ中でのピペリジン２０％
を用いた得られたＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ペプチドの脱保護は、３−ＭＰＡのその後の付加
（工程３）を可能にする。樹脂切断および生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／
５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2
Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）
分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ
18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および
２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ
ＵＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍ
カラムを使用する）。この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロス
プレーイオン化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリー
ズ分析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５％純度を有し
た。 Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-T
yr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu
) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ar
g (Pbf) -OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved using 20% piperidine (step 2) followed by Fmoc-AEEA coupling. Piperidine 20% in DMF
Deprotection of the resulting Fmoc-AEEA-peptide with can allows subsequent addition of 3-MPA (step 3). Resin cleavage and product isolation was 86% TFA / 5% TIS /
5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol, followed by dry ice-cooled Et 2
Performed using precipitation with O (step 4). The product is Varian (Rainin)
Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system (Dynamax C
18 , 60 mm, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varian Dynamax
Dynamax C 18 with UVD II), 60 mm, 8 μm, 21 mm × 25 cm
Column). This product had a purity of> 95% as determined by RP-HPLC mass spectrometry using a Hewlett Packard LCMS-1100 series analyzer equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.

（実施例２０）
（（ＭＰＡ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ2．２ＴＦＡ
の調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（Ｈ
ＢＴＵ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペ
リジン脱保護（工程１）。自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎ
ｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工
程２）、続いて３−ＭＰＡのカップリング（工程３）を使用して達成する。樹脂切断およ
び生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％
Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏに
よる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取
二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、
６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５
４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎ
ａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムを使用する）。この生成物
は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレーイオン化を使用するＨｅｗ
ｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分析計を使用するＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ質量分析法によって決定された、＞９５％純度を有した。 (Example 20)
((MPA) -Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH 2 .2TFA
Preparation)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide M in N, dimethylformamide (DMF) solution
BHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′
, N′-Tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (H
Activation with BTU) and N-methylmorpholine (NMM), and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1). Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are Rin
k Continuous added to Amide MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH
, Fmoc-Tyr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-
Tyr (tBu) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH,
Fmoc-Arg (Pbf) -OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved using 20% piperidine (Step 2) followed by coupling of 3-MPA (Step 3). 86% TFA / 5% TIS / 5% for resin cleavage and product isolation
Performed using H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol followed by precipitation with dry ice cold Et 2 O (step 4). The product was purified by preparative reverse phase HPLC using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system (Dynamax C 18 ,
60 mm, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and λ 214 and 25
Dyn with UV detector at 4 nm (Varian Dynamax UVD II)
amax C 18 , 60 Å, 8 μm, 21 mm × 25 cm column is used). This product is equipped with a diode array detector and Hew using electrospray ionization.
RP-HPL using a let Packard LCMS-1100 series analyzer
It had> 95% purity as determined by C mass spectrometry.

（実施例２１）
（ＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−（Ｎε−ＭＰ
Ａ）−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ
、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｐｒｏ−ＯＨ。樹脂結合アミノ酸のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中の２
０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分実施した。酢酸のカップリングを、アミノ酸カ
ップリングと類似の条件下で実施した。樹脂からの最終的な切断を、上記のような切断混
合物を使用して実施した。その生成物を沈澱によって単離し、そして分取ＨＰＬＣによっ
て精製して、所望の生成物を、凍結乾燥の際に白色固体として得た。 (Example 21)
(NAc-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Lys- (Nε-MP
A) —NH 2 . Preparation of 2TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) OH, Fmoc-Leu-OH
, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-
Pro-OH. Deblocking the N-terminal Fmoc group of resin bound amino acids
Performed for about 15-20 minutes with 0% piperidine. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. Final cleavage from the resin was performed using a cleavage mixture as described above. The product was isolated by precipitation and purified by preparative HPLC to give the desired product as a white solid upon lyophilization.

Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨ
Ｃｌ3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4
の溶液で２時間処理することにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3
（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、
およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸
の添加に対して再自動化した（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／
５％ ＴＩＳ／５％チオアニソールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ
2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ
）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分で
の１８０分にわたる３０〜５５％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣ
Ｈ3ＣＮ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎ
ａ １０μフェニル−ヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４
ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ
ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 Selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and the resin was washed with 5 mL CH.
3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in Cl 3 : NMM: HOAc (18: 1: 0.5)
This was achieved by treating with a solution of 2 hours (step 2). The resin is then washed with CHCl 3
(6 × 5 mL), 20% HOAc in DCM (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL),
And washed with DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of 3-maleimidopropionic acid (step 3). Resin cleavage and product isolation with 85% TFA /
5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol, followed by dry ice-cooled Et
Performed using 2 O precipitation (step 4). The product is made from Varian (Rainin
) Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system: 30-55% B (0.045% TFA (H) in H 2 O and C over 180 min at 9.5 mL / min)
Gradient elution (Phenomenex Lun) of 0.045% TFA (B) in H 3 CN
a 10μ phenyl-hexyl, 21 mm × 25 cm column and λ 214 and 254
UV detector at nm (Varian Dynamax
UVD II)).

（実施例２２）
（（ＭＰＡ−ＡＥＥＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＮＨ2
．２ＴＦＡの調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−
メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペリジン脱保護（工程
１）。 (Example 22)
((MPA-AEEA) -Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH 2
. Preparation of 2TFA)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide M in N, dimethylformamide (DMF) solution
BHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′
, N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and N-
Activation with methylmorpholine (NMM), as well as piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1).

自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、 Ｆｍｏｃ−
Ｐｒｏ−ＯＨ（工程１）。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工程２）、続
いてＦｍｏｃ−ＡＥＥＡのカップリングを使用して達成する。ＤＭＦ中でのピペリジン２
０％を用いて得られたＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ペプチドの脱保護は、３−ＭＰＡのその後の
付加を可能にする（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩ
Ｓ／５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フェノール、続いてドライアイス冷却
Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎ
ｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した（Ｄｙｎａｍａ
ｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４
および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備
えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムを使用する）。
この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそしてエレクトロスプレーイオン化を使用
するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１１００シリーズ分析計を使用するＲ
Ｐ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５％純度を有した。 Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
sp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-
Pro-OH (step 1). Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved using 20% piperidine (step 2) followed by Fmoc-AEEA coupling. Piperidine 2 in DMF
Deprotection of the Fmoc-AEEA-peptide obtained with 0% allows the subsequent addition of 3-MPA (step 3). Resin cleavage and product isolation with 86% TFA / 5% TI
Performed using S / 5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol, followed by precipitation with dry ice-cooled Et 2 O (step 4). The product is made from Varian (Rain
in) Purified by preparative reverse phase HPLC using a preparative binary HPLC system (Dynama
x C 18 , 60 mm, 8 μm guard module, 21 mm × 25 cm column and λ 214
And Dynamax C 18 , 60 Å, 8 μm, 21 mm × 25 cm column with UV detector at 254 nm (Varian Dynamax UVD II).
This product is equipped with a diode array detector and R using a Hewlett Packard LCMS-1100 series analyzer using electrospray ionization.
It had> 95% purity as determined by P-HPLC mass spectrometry.

（実施例２３）
（（ＭＰＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＮＨ2．２ＴＦＡ
の調製）
１００μｍｏｌスケールでの改変クリングル５ペプチドの固相ペプチド合成を、以下を
使用するＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で実施した：Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＦｍｏｃ保護Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｍ
ＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（Ｈ
ＢＴＵ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）での活性化、ならびにＦｍｏｃ基のピペ
リジン脱保護（工程１）。自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎ
ｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ
、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ。末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン（工程２）、
続いて３−ＭＰＡのカップリング（工程３）を使用して達成する。樹脂切断および生成物
単離を８６％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％ Ｈ2Ｏ／２％チオアニソールおよび２％フ
ェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施した（工程４）。
生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用する分取逆相ＨＰＬ
Ｃによって精製した（Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍガードモジュール、２１ｍ
ｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａｎ Ｄ
ｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を備えたＤｙｎａｍａｘ Ｃ18、６０Å、８μｍ、２１ｍ
ｍ×２５ｃｍカラムを使用する）。この生成物は、ダイオードアレイ検出器を備えそして
エレクトロスプレーイオン化を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＬＣＭＳ−１
１００シリーズ分析計を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ質量分析法によって決定された、＞９５
％純度を有した。 (Example 23)
((MPA) -Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH 2 .2TFA
Preparation)
Solid phase peptide synthesis of the modified kringle 5 peptide at 100 μmol scale was performed on a Symphony Peptide Synthesizer using the following: N
Fmoc protected Rink Amide M in N, dimethylformamide (DMF) solution
BHA resin, Fmoc protected amino acid, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′
, N′-Tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (H
Activation with BTU) and N-methylmorpholine (NMM), and piperidine deprotection of the Fmoc group (step 1). Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are Rin
k Continuous added to Amide MBHA resin: Fmoc-Lys (Boc) -OH
, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) OH, Fmoc-
Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH
, Fmoc-Pro-OH. Deprotection of the terminal Fmoc group is achieved with 20% piperidine (step 2),
This is subsequently achieved using 3-MPA coupling (step 3). Resin cleavage and product isolation were performed using precipitation with 86% TFA / 5% TIS / 5% H 2 O / 2% thioanisole and 2% phenol followed by dry ice-cooled Et 2 O (step 4). ).
The product was purified by preparative reverse phase HPL using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system.
Purified by C (Dynamax C 18 , 60 mm, 8 μm guard module, 21 m
m × 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varian D
Dynamax C 18 with dynamax UVD II), 60 mm, 8 μm, 21 m
m × 25 cm column is used). The product is a Hewlett Packard LCMS-1 equipped with a diode array detector and using electrospray ionization.
> 95 as determined by RP-HPLC mass spectrometry using a 100 series analyzer
% Purity.

（実施例２４）
（ＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｎ
ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（工程１）。樹脂結合アミノ酸のＮ末端
のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分
実施した。酢酸のカップリングを、アミノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。Ｌ
ｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨＣｌ
3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4の溶
液で２時間処理することにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3（６
×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およ
びＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、合成を、ＡＥＥＡ（アミノエトキシエトキ
シ酢酸）基および３−マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）の添加に対して再自動化した（
工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％チオアニソ
ールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使用して実施
した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ系を使用す
る分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分での１８０分にわたる３０〜５５
％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣＨ3ＣＮ中の０．０４５％ ＴＦ
Ａ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μフェニル−ヘキシル、
２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（Ｖａｒｉａ
ｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 (Example 24)
(NAc-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lys- (N
ε-AEEA-MPA) -NH 2 . Preparation of 2TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Tyr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tB
u) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
rg (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH (Step 1). Deblocking of the N-terminal Fmoc group of the resin-bound amino acid was performed with 20% piperidine in DMF for about 15-20 minutes. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling. L
Selective deprotection of the ys (Aloc) group was performed manually and the resin was treated with 5 mL CHCl.
3 : Achieved by treatment with a solution of 3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in NMM: HOAc (18: 1: 0.5) for 2 hours (step 2). The resin is then treated with CHCl 3 (6
× 5 mL), 20% HOAc in DCM (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL), and DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of AEEA (aminoethoxyethoxyacetic acid) groups and 3-maleimidopropionic acid (MPA) (
Step 3). Resin cleavage and product isolation were performed using 85% TFA / 5% TIS / 5% thioanisole and 5% phenol followed by precipitation with dry ice-cooled Et 2 O (step 4). The product was purified by preparative reverse phase HPLC using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC system: 30-55 over 180 minutes at 9.5 mL / min.
% B (0.045% TFA (A) in H 2 O and 0.045% TF in CH 3 CN
A (B)) gradient elution (Phenomenex Luna 10μ phenyl-hexyl,
21 mm × 25 cm column and UV detector at λ 214 and 254 nm (Varia
n Dynamax UVD II)).

（実施例２５）
（ＮＡｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙε−（Ｎ
−ＡＥＥＡn−ＭＰＡ）−ＮＨ2．２ＴＦＡの調製）
自動化ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸をＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ
ＭＢＨＡ樹脂に連続的に添加した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢ
ｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（工程１）。樹脂結合アミノ酸のＮ末端
のＦｍｏｃ基の脱ブロック化を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、約１５〜２０分
実施した。酢酸のカップリングを、アミノ酸カップリングと類似の条件下で実施した。 (Example 25)
(NAc-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-Lyε- (N
-AEEA n -MPA) -NH 2. Preparation of 2TFA)
Using automated peptide synthesis, the following protected amino acids are linked to Rink Amide
Added continuously to MBHA resin: Fmoc-Lys (Aloc) -OH, Fmoc-
Tyr (tBu) OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Tyr (tB
u) OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-A
rg (Pbf) -OH, Fmoc-Pro-OH (Step 1). Deblocking of the N-terminal Fmoc group of the resin-bound amino acid was performed with 20% piperidine in DMF for about 15-20 minutes. Acetic acid coupling was performed under conditions similar to amino acid coupling.

Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を、手動で実施し、そして樹脂を、５ｍＬのＣＨ
Ｃｌ3：ＮＭＭ：ＨＯＡｃ（１８：１：０．５）に溶解された３当量のＰｄ（ＰＰｈ3）4
の溶液で２時間処理することにより達成した（工程２）。次いでこの樹脂を、ＣＨＣｌ3
（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％ ＨＯＡｃ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、
およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、合成を、ｎ個のＡＥＥＡ（アミノエト
キシエトキシ酢酸）基および３−マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）の添加に対して再自
動化した（工程３）。樹脂切断および生成物単離を８５％ ＴＦＡ／５％ ＴＩＳ／５％
チオアニソールおよび５％フェノール、続いてドライアイス冷却Ｅｔ2Ｏによる沈澱を使
用して実施した（工程４）。生成物を、Ｖａｒｉａｎ（Ｒａｉｎｉｎ）分取二元ＨＰＬＣ
系を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した：９．５ｍＬ／分での１８０分にわたる
３０〜５５％ Ｂ（Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ ＴＦＡ（Ａ）およびＣＨ3ＣＮ中の０．０４
５％ ＴＦＡ（Ｂ））の勾配溶離（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μフェニル−
ヘキシル、２１ｍｍ×２５ｃｍカラムおよびλ２１４および２５４ｎｍでのＵＶ検出器（
Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）を使用する）。 Selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and the resin was washed with 5 mL CH.
3 equivalents of Pd (PPh 3 ) 4 dissolved in Cl 3 : NMM: HOAc (18: 1: 0.5)
This was achieved by treating with a solution of 2 hours (step 2). The resin is then washed with CHCl 3
(6 × 5 mL), 20% HOAc in DCM (6 × 5 mL), DCM (6 × 5 mL),
And washed with DMF (6 × 5 mL). The synthesis was then re-automated for the addition of n AEEA (aminoethoxyethoxyacetic acid) groups and 3-maleimidopropionic acid (MPA) (step 3). 85% TFA / 5% TIS / 5% for resin cleavage and product isolation
Performed using thioanisole and 5% phenol, followed by precipitation with dry ice-cooled Et 2 O (step 4). The product was purified using a Varian (Rainin) preparative binary HPLC.
Purified by preparative reverse phase HPLC using system: 30-55% B (0.045% TFA (A) in H 2 O and 0. 0 in CH 3 CN over 180 min at 9.5 mL / min). 04
5% TFA (B)) gradient elution (Phenomenex Luna 10μ phenyl-
Hexyl, 21 mm x 25 cm column and UV detector at λ214 and 254 nm (
Varian Dynamax UVD II) is used).

（実施例２６）
（ペプチド安定性アッセイ）
ペプチド安定性アッセイを実施した。（ＭＰＡ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ2．２ＴＦＡを上記のように合成し、そしてＭＰＡ−Ｋ５
と同定した。改変されていない対応ペプチドＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ2をまた、３−ＭＰＡを付加することなく上記のように合成し、そ
してＫ５と同定した。 (Example 26)
(Peptide stability assay)
A peptide stability assay was performed. (MPA) -Pro-Arg-Lys-Leu-
Tyr-Asp-Lys-NH 2 . 2TFA was synthesized as described above and MPA-K5
Was identified. Unmodified corresponding peptide Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-
Asp-Lys-NH 2 was also synthesized as described above without adding 3-MPA and identified as K5.

Ｋ５（ＭＷ＝１２６０．１８、９１８．１２フリーベース）を、１００ｍＭのストック
水溶液として調製した。ＭＰＡ−Ｋ５（ＭＷ＝１４１１．１７、１０６９．１１フリーベ
ース）を、１００ｍＭのストック水溶液として調製した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
を、Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃから入手可能なＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）
としての２５％溶液（約２５０ｍｇ／ｍｌ、３．７５ｍＭ）として得た。ヒト血漿を、Ｇ
ｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た。 K5 (MW = 1260.18, 918.12 free base) was prepared as a 100 mM stock aqueous solution. MPA-K5 (MW = 1411.17, 1069.11 free base) was prepared as a 100 mM stock aqueous solution. Human serum albumin (HSA)
Is available from Alpha Therapeutic.
As a 25% solution (approximately 250 mg / ml, 3.75 mM). Human plasma
Obtained from olden West Biologicals.

（ａ．ヒト血漿におけるＫ５の安定性）
Ｋ５を１μＭ溶液として調製し、そして２５％ヒト血清アルブミンに溶解した。次いで
、この混合物をヒト血清の存在下で３７℃でインキュベートして、１６０ｍＭのＫ５の最
終濃度にした。１００μｌのアリコートを、０時間、４時間および２４時間で血漿から取
り出した。この１００μｌのアリコートを、全てのタンパク質を沈澱させるために、１０
０μｌのブロッキング溶液（５容積の５％ＺｎＳＯ4／３容積のアセトニトリル／２容積
のメタノール）と混合した。このサンプルを、１０，０００ｇで５分間遠心分離し、ペプ
チドを含む上清を回収し、そして０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。フリーの
インタクトなＫ５ペプチドの存在を、ＨＰＬＣ／ＭＳによってアッセイした。血清中のＫ
５ペプチドの検出のためのＨＰＬＣパラメータは以下の通りであった。 (A. Stability of K5 in human plasma)
K5 was prepared as a 1 μM solution and dissolved in 25% human serum albumin. This mixture was then incubated at 37 ° C. in the presence of human serum to a final concentration of 160 mM K5. 100 μl aliquots were removed from plasma at 0, 4 and 24 hours. This 100 μl aliquot is used to precipitate all proteins.
It was mixed with blocking solution .mu.l (5 volume 5% ZnSO 4/3 volumes of acetonitrile / 2 volumes of methanol). The sample was centrifuged at 10,000 g for 5 minutes and the supernatant containing the peptide was collected and filtered through a 0.22 μm filter. The presence of free intact K5 peptide was assayed by HPLC / MS. K in serum
The HPLC parameters for detection of 5 peptides were as follows:

ＨＰＬＣ方法は、以下の通りであった：Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ２５０Ｘ４．６ｍｍ、５
μ粒子サイズカラムを使用した。このカラム温度は３０℃で、流速は０．５ｍｌ／分であ
った。移動層Ａは、０．１％ＴＦＡ／水であった。移動相Ｂは、０．１％ＴＦＡ／アセト
ニトリルであった。注入体積は、１０μｌであった。 The HPLC method was as follows: Vydac C18 250 × 4.6 mm, 5
A μ particle size column was used. The column temperature was 30 ° C. and the flow rate was 0.5 ml / min. Mobile layer A was 0.1% TFA / water. Mobile phase B was 0.1% TFA / acetonitrile. The injection volume was 10 μl.

勾配は以下の通りであった：
時間（分） ％Ａ ％Ｂ
０ ９５ ５
２０ ７０ ３０
２５ １０ ９０
３０ １０ ９０
３５ ９５ ５
４５ ９５ ５。 The gradient was as follows:
Time (min)% A% B
0 95 5
20 70 30
25 10 90
30 10 90
35 95 5
45 95 5.

これらのタンパク質を、２１４、２５４および３３４ｎｍで検出した。マススペクトル
分析について、イオン化モードは、３００〜２０００のＭ／Ｚ範囲でのＡＰＩ−エレクト
ロスプレー（ポジティブモード）であった。ゲインは３．０、フラグメンターは１２０ｖ
、閾値は２０、ステップサイズは０．１であった。気体温度は、３５０℃であり、そして
乾燥気体体積は、１０．０ｌ／分であった。先端（Ｎｅｂ）圧力は、２４ｐｓｉであり、
そしてＶｃａｐは、３５００Ｖであった。ＨＰＬＣ方法は、以下の通りであった：Ｖｙｄ
ａｃ Ｃ１８ ２５０Ｘ４．６ｍｍ、５μ粒子サイズカラムを使用した。このカラム温度
は３０℃で、流速は０．５ｍｌ／分であった。移動層Ａは、０．１％ＴＦＡ／水であった
。移動相Ｂは、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルであった。注入体積は、１０μｌであっ
た。 These proteins were detected at 214, 254 and 334 nm. For mass spectral analysis, the ionization mode was API-electrospray (positive mode) in the 300/2000 M / Z range. Gain is 3.0, fragmentor is 120v
The threshold value was 20 and the step size was 0.1. The gas temperature was 350 ° C. and the dry gas volume was 10.0 l / min. The tip (Neb) pressure is 24 psi,
And Vcap was 3500V. The HPLC method was as follows: Vyd
An ac C18 250 × 4.6 mm, 5μ particle size column was used. The column temperature was 30 ° C. and the flow rate was 0.5 ml / min. Mobile layer A was 0.1% TFA / water. Mobile phase B was 0.1% TFA / acetonitrile. The injection volume was 10 μl.

勾配は、以下の通りであった：
時間（分） ％Ａ ％Ｂ
０ ９５ ５
２０ ７０ ３０
２５ １０ ９０
３０ １０ ９０
３５ ９５ ５
４５ ９５ ５。 The gradient was as follows:
Time (min)% A% B
0 95 5
20 70 30
25 10 90
30 10 90
35 95 5
45 95 5.

これらのタンパク質を、２１４、２５４および３３４ｎｍで検出した。マススペクトル
分析について、イオン化モードは、３００〜２０００のＭ／Ｚ範囲でのＡＰＩ−エレクト
ロスプレー（ポジティブモード）であった。ゲインは３．０、フラグメンターは１２０ｖ
、閾値は２０、ステップサイズは０．１であった。気体温度は、３５０℃であり、そして
乾燥気体体積は、１０．０ｌ／分であった。先端圧力は、２４ｐｓｉであり、そしてＶｃ
ａｐは、３５００Ｖであった。 These proteins were detected at 214, 254 and 334 nm. For mass spectral analysis, the ionization mode was API-electrospray (positive mode) in the 300/2000 M / Z range. Gain is 3.0, fragmentor is 120v
The threshold value was 20 and the step size was 0.1. The gas temperature was 350 ° C. and the dry gas volume was 10.0 l / min. The tip pressure is 24 psi and Vc
ap was 3500V.

時間 血漿中の％Ｋ５ペプチド
０時間 １００％
４時間 ９％
２４時間 ０％。 Time% K5 peptide in plasma
0 hours 100%
4 hours 9%
24 hours 0%.

血漿における４時間のみのインキュベーション後、９％のみの本来のＫ５ペプチドが残
った。これらの結果は、改変されていないＫ５ペプチドは、おそらくプロテアーゼ活性の
結果として、血清中で不安定であることを示す。 After only 4 hours of incubation in plasma, only 9% of the original K5 peptide remained. These results indicate that the unmodified K5 peptide is unstable in serum, presumably as a result of protease activity.

（ｂ．血漿中でのＭＰＡ−Ｋ５−ＨＳＡ結合体の安定性）
ＭＰＡ−Ｋ５（改変Ｋ５ペプチド）を、室温で２時間２５％ＨＳＡとともにインキュベ
ートした。次いで、ＭＰＡ−Ｋ５−ＨＳＡ結合体を、１６０μｍの最終濃度でヒト血清の
存在下で、３７℃でインキュベートした。特定のインキュベーション期間（０、４および
２４時間）の後、１００μｌのアリコートを取り出し、そして０．２２μｍのフィルター
を通して濾過した。インタクトな結合体の存在をＨＰＬＣ−ＭＳによってアッセイした。 (B. Stability of MPA-K5-HSA conjugate in plasma)
MPA-K5 (modified K5 peptide) was incubated with 25% HSA for 2 hours at room temperature. The MPA-K5-HSA conjugate was then incubated at 37 ° C. in the presence of human serum at a final concentration of 160 μm. After a specific incubation period (0, 4 and 24 hours), a 100 μl aliquot was removed and filtered through a 0.22 μm filter. The presence of intact conjugate was assayed by HPLC-MS.

カラムは、Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００、２５０ｘ４．６ｍｍ、７μ粒子サイズで
あった。このカラム温度は、５０℃であった。移動相Ａは、０．１％ＴＦＡ／水であった
。移動相Ｂは、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルであった。注入体積は、１μｌであった
。勾配は以下の通りであった：
時間（分） ％Ａ ％Ｂ 流速（ｍｌ／分）
０ ６６ ３４ ０．７００
１ ６６ ３４ ０．７００
２５ ５８．８ ４１．２ ０．７００
３０ ５０ ５０ ０．７０
３５ ５ ９５ １．００
４１ ５ ９５ １．００
４５ ６６ ３４ １．００
４６ ６６ ３４ ０．７０。 The column was Aquapore RP-300, 250 × 4.6 mm, 7 μ particle size. The column temperature was 50 ° C. Mobile phase A was 0.1% TFA / water. Mobile phase B was 0.1% TFA / acetonitrile. The injection volume was 1 μl. The gradient was as follows:
Time (min)% A% B Flow rate (ml / min)
0 66 34 0.700
1 66 34 0.700
25 58.8 41.2 0.700
30 50 50 0.70
35 5 95 1.00
41 5 95 1.00
45 66 34 1.00
46 66 34 0.70.

ペプチドを、定量のために２１４ｎｍで検出した。このペプチドのマススペクトル分析
について、イオン化モードは、１２８０〜１５００ｍ／ｚの範囲のＡＰＩ−エレクトロス
プレーであり、ゲインは１．０、フラグメンターは１２５Ｖ、閾値は１００、ステップサ
イズは０．４０であった。気体温度は、３５０℃であり、乾燥気体は１３．０ｌ／分であ
った。圧力は、６０ｐｓｉであり、そしてＶｃａｐは、６０００Ｖであった。これらの結
果を以下に示す。 Peptides were detected at 214 nm for quantification. For mass spectral analysis of this peptide, the ionization mode was API-electrospray in the range of 1280-1500 m / z, the gain was 1.0, the fragmentor was 125 V, the threshold was 100, and the step size was 0.40. It was. The gas temperature was 350 ° C. and the dry gas was 13.0 l / min. The pressure was 60 psi and Vcap was 6000V. These results are shown below.

血流中で循環するアルブミンの約３３％は、メルカプトアルブミン（ＳＨ−アルブミン
）であり、これは、内因性スルフヒドリル化合物（例えば、システインまたはグルタチオ
ン）によってブロックされず、従って、マレイミド基との反応に利用可能である。循環す
るアルブミンの残りの６６％は、スルフヒドリル化合物によってキャップされるか、また
はブロックされる。ＨＰＬＣ ＭＳアッセイは、キャップされたＨＳＡ、ＳＨ−アルブミ
ンおよびＫ５−ＭＰＡ−アルブミンの同定を可能にする。ＭＰＡは、アルブミン上のフリ
ーなチオールに共有結合する。血漿中のアルブミンの３つの形態の安定性を以下に示す。 About 33% of albumin circulating in the bloodstream is mercaptoalbumin (SH-albumin), which is not blocked by endogenous sulfhydryl compounds (eg, cysteine or glutathione), and thus reacts with maleimide groups. Is available. The remaining 66% of circulating albumin is capped or blocked by sulfhydryl compounds. The HPLC MS assay allows the identification of capped HSA, SH-albumin and K5-MPA-albumin. MPA covalently binds to a free thiol on albumin. The stability of the three forms of albumin in plasma is shown below.

Figure 2009143941
ヒト血清アルブミンの３つの形態の割合は、２４時間のアッセイ期間を通して比較的一
定のままであった。特に、Ｋ５−ＭＰＡ−ＨＳＡの割合は、２４時間の血漿アッセイを通
して比較的一定のままであった。これらの結果は、わずか４時間の間に、血漿中のＫ５の
本来の量の９％に減少する非改変Ｋ５で得られる結果と比較して、劇的である。これらの
結果は、血漿中でかなり不安定であるＫ５とは対照的に、Ｋ５−ＭＰＡ−ＨＳＡは、血漿
中でペプチダーゼ活性からかなり安定であることを示す。
Figure 2009143941
 The proportion of the three forms of human serum albumin remained relatively constant throughout the 24 hour assay period. In particular, the proportion of K5-MPA-HSA remained relatively constant throughout the 24-hour plasma assay. These results are dramatic compared to those obtained with unmodified K5, which reduces to 9% of the original amount of K5 in plasma in as little as 4 hours. These results indicate that K5-MPA-HSA is fairly stable from peptidase activity in plasma as opposed to K5, which is fairly unstable in plasma.

（実施例２７）
（内皮細胞移動アッセイ）
改変抗新血形成ペプチド活性は、内皮細胞移動アッセイを用いて決定され得る。この内
皮細胞移動アッセイは、Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ，１９８：４４０−４５０（１９９１）（これは、本明細書中で参考として援用され
る）によって記載されるように実施され得る。簡潔に、ウシ毛細管（腎傍の）内皮細胞（
ＢＣＥ、これは、Ｊｕｄａｈ Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから得られ得る）は、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を含むＤＭＥＭにおいて一晩飢餓させる。次いで、細胞を、トリプシンを用いて回
収し、そして０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中に１．５×１０6細胞／ｍＬの濃度で再懸
濁させる。細胞を、４８ウェル改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバー（例えば、Ｎｕｃｌｅｏｐｏ
ｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，Ｍｄ．からの）の底部に添加す
る。このチャンバーを集め、そして逆さにし、そして細胞を、３７℃で２時間の間、ポリ
カーボネート化学走性膜（５μｍ孔サイズ）（０．１％ゼラチンに一晩浸し、そして乾燥
した）に付着させた。次いで、このチャンバーを、再び逆さにし、そして試験物質を、上
部チャンバーのウェルに添加する（５０μｌの総体積まで）；次いで、装置を３７℃で４
時間インキュベートする。膜を回収し、固定し、そして染色し（ＤｉｆｆＱｕｉｃｋ，Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、そして１０の高
出力場当たりの、上部チャンバーに移動された細胞の数を計数する。ＤＭＥＭ＋０．１％
ＢＳＡへのバックグラウンドの移動が引かれ得、そしてデータは、１０の高出力場（４０
０×）当たりの移動した細胞の数として、または複数の実験からの結果を合わせた場合に
は、ポジティブコントロールと比較した移動の％阻害として、報告され得る。 (Example 27)
(Endothelial cell migration assay)
Modified anti-neoplastic peptide activity can be determined using an endothelial cell migration assay. This endothelial cell migration assay is described in Polverini, P. et al. J. et al. , Methods Enzym
ol, 198: 440-450 (1991), which is incorporated herein by reference. Briefly, bovine capillary (pararenal) endothelial cells (
BCE, this is Judah Folkman, Harvard University
(Which can be obtained from Medical School) is 0.1% bovine serum albumin (B
Starve overnight in DMEM with SA). Cells are then harvested with trypsin and resuspended at a concentration of 1.5 × 10 6 cells / mL in DMEM containing 0.1% BSA. Cells are transferred to a 48 well modified Boyden chamber (eg, Nucleopo
re Corporation, Cabin John, Md. From the bottom). The chamber was collected and inverted and the cells were allowed to attach to a polycarbonate chemotaxis membrane (5 μm pore size) (soaked overnight in 0.1% gelatin and dried) at 37 ° C. for 2 hours. . The chamber is then inverted again and test substances are added to the upper chamber wells (to a total volume of 50 μl);
Incubate for hours. Membranes are collected, fixed and stained (DiffQuick, F
isher Scientific, Pittsburgh, Pa. ), And count the number of cells transferred to the upper chamber per 10 high power fields. DMEM + 0.1%
A background transfer to the BSA can be subtracted, and the data is 10 high power fields (40
Can be reported as the number of cells migrated per 0 ×) or as% inhibition of migration compared to the positive control when the results from multiple experiments are combined.

（実施例２８）
（ＨＳＡ−クリングル５結合体の調製）
改変クリングル５ペプチドを、蒸留水に溶解し、１００ｍＭの最終濃度にする。結合体
化反応のために、１容量の１００ｍＭの改変されたクリングル５ペプチドを、９９容量の
２５％ＨＳＡ（Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）、２５％溶液、Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ ｉｎｃ．）に添加し、１ｍＭの改変Ｋ５：３．７５ｍＭ ＨＳＡ結合体を得
る。この混合物を、室温で２時間インキュベートする。結合体の存在および未反応の改変
Ｋ５ペプチドの本明細書中で非存在を、質量分析法と連結したＨＰＬＣによって決定する
。 (Example 28)
(Preparation of HSA-Kringle 5 conjugate)
The modified kringle 5 peptide is dissolved in distilled water to a final concentration of 100 mM. For the conjugation reaction, 1 volume of 100 mM modified kringle 5 peptide was added to 99 volumes of 25% HSA (Albutein®, 25% solution, Alpha Therap.
eutic inc. To obtain 1 mM modified K5: 3.75 mM HSA conjugate. This mixture is incubated for 2 hours at room temperature. The presence of the conjugate and the absence of unreacted modified K5 peptide herein is determined by HPLC coupled to mass spectrometry.

（実施例２９）
（インビトロでの内皮細胞増殖に対する改変クリングル５ペプチドの効果）
遊離およびＨＳＡ結合体化クリングル５ペプチドの生物学的活性は、内皮細胞増殖アッ
セイを使用して、インビトロで決定され得る。ウシ大動脈内皮細胞を、１０％熱不活性化
仔ウシ血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）におい
て、９６ウェルプレート中のウェル当たり２５００細胞の密度でプレーティングする。こ
の細胞を、５％ＣＯ2インキュベータ中で、３７℃で２４時間付着させる。次いで、培地
を、種々の濃度のインヒビター（遊離Ｋ５ペプチドおよびＨＳＡ−クリングル５ペプチド
）を含む新鮮なＤＭＥＭ（血清を含まない）で置換する。３７℃で３０分後、次いで、ｂ
ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を、１ｎｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加して
、増殖を刺激し得る。７２時間後、細胞数を、比色定量基質ＷＳＴ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して測定して、インビトロでの内皮細胞増殖に対する
改変Ｋ５ペプチドの効果を決定し得る。 (Example 29)
(Effect of modified kringle 5 peptide on endothelial cell proliferation in vitro)
The biological activity of free and HSA-conjugated kringle 5 peptide can be determined in vitro using an endothelial cell proliferation assay. Bovine aortic endothelial cells are plated at a density of 2500 cells per well in 96-well plates in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Gibco) containing 10% heat-inactivated calf serum. The cells are allowed to attach for 24 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. The medium is then replaced with fresh DMEM (serum free) containing various concentrations of inhibitors (free K5 peptide and HSA-kringle 5 peptide). After 30 minutes at 37 ° C., then b
FGF (basic fibroblast growth factor) can be added to a final concentration of 1 ng / mL to stimulate proliferation. After 72 hours, the cell number was determined by the colorimetric substrate WST-1 (Boehrin
ger Mannheim) can be used to determine the effect of the modified K5 peptide on endothelial cell proliferation in vitro.

本発明をその特定の実施形態と関連させて記載してきたが、さらなる改変が可能であり
、そしてこの出願は、一般に、本発明の原理に従い、そして本発明が属する当該分野内で
の公知または慣習的な実施内にあり、そして本明細書中に記載された本質的な特性に適用
され得、そして添付の特許請求の範囲の範囲に従うような本発明の開示からのそのような
発展を含んで、本発明の任意の変化、用途、または適応を包含することを意図することが
理解される。 While this invention has been described in connection with specific embodiments thereof, further modifications are possible, and this application generally follows the principles of this invention and is well known or customary in the art to which this invention belongs. Including such developments from the disclosure of the present invention as being within the scope of the invention and applicable to the essential characteristics described herein, and in accordance with the scope of the appended claims. It will be understood that it is intended to encompass any variation, application, or adaptation of the invention.

Claims (1)

本明細書に記載の改変抗新脈管形成ペプチド。Modified anti-angiogenic peptides as described herein.
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