JP2009128141A

JP2009128141A - Nucleic acid analysis method and nucleic acid analyzer

Info

Publication number: JP2009128141A
Application number: JP2007302490A
Authority: JP
Inventors: Takuya Matsui; 拓也松井; Masatoshi Narahara; 正俊奈良原; Toshiro Saito; 俊郎斎藤
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2007-11-22
Filing date: 2007-11-22
Publication date: 2009-06-11
Anticipated expiration: 2027-11-22
Also published as: JP5022873B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To separate fluorescent molecules coupled with a nucleic acid from a metal structure, holding them in a domain of a local surface plasmon field, and measuring them. <P>SOLUTION: The purpose of this invention is to hold fluorescent molecules coupled with the nucleic acid in the domain of the local surface plasmon field by a laminar flow, and to measure them. For example, light is irradiated to a metal structure to form a localized surface plasmon field, and a fluorescence-labeled nucleic acid having a part fixed thereto is allowed to drift on a laminar flow, and the fluorescence label is arranged in the localized surface plasmon field, and fluorescence from the fluorescence label is acquired, to analyze the nucleic acid. Consequently, the fluorescent molecules coupled with the nucleic acid can be held surely in the domain of the local surface plasmon field. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、核酸分析方法及び核酸分析装置に関する。例えば、蛍光を用いた単一分子計測に関する。 The present invention relates to a nucleic acid analysis method and a nucleic acid analysis apparatus. For example, it relates to single molecule measurement using fluorescence.

現在のＤＮＡシーケンス解析法は、サンガー法と呼ばれるＤＮＡ断片調整法と電気泳動法を組合せた方法が用いられており、ヒトゲノム解析等に用いられて大きな成果をあげている。しかしながらテーラーメイド医療などの観点から個人のゲノム解析を考えたとき、従来法で一度に解析できるＤＮＡ断片の長さよりもはるかに長い断片を、迅速・簡便・安価に解析できる技術が強く求められている。従来の法の改良のみではこれらの要求に応えることは不可能とされている。従来法の解析効率を制限している要因を取り除くことができる可能性の１つとして、単一分子の検出及び識別を利用した方法が提案されている。この要因とは読み取るべき塩基数の冗長度の問題である。従来法で解析できる断片の長さは約１０００塩基、典型的には５００から７００塩基である。従って読み取るべき塩基の数は実際のＤＮＡ長さの１０倍程度になる。これを冗長度１０と呼ぶ。現在実用化されているＤＮＡシーケンサーは全てサンガー法と電気泳動法を組合せたものである。これらの方法では多チャンネル化（〜３８４）によって解析効率の向上が図られているものの、冗長度の問題は未解決のままである。 The current DNA sequence analysis method uses a method combining the DNA fragment preparation method called the Sanger method and the electrophoresis method, and has been used greatly for human genome analysis and the like. However, when considering individual genome analysis from the viewpoint of tailor-made medicine, there is a strong demand for a technology that can quickly, easily and inexpensively analyze fragments that are much longer than the length of DNA fragments that can be analyzed at once by conventional methods. . It is impossible to meet these demands only by improving conventional methods. As one possibility that can eliminate the factors that limit the analysis efficiency of the conventional method, a method using detection and identification of a single molecule has been proposed. This factor is a problem of redundancy of the number of bases to be read. The length of a fragment that can be analyzed by conventional methods is about 1000 bases, typically 500 to 700 bases. Therefore, the number of bases to be read is about 10 times the actual DNA length. This is called redundancy 10. All DNA sequencers currently in practical use are a combination of Sanger and electrophoresis. Although these methods improve analysis efficiency by increasing the number of channels (up to 384), the redundancy problem remains unsolved.

１本のＤＮＡを用意して、その末端から順番に塩基を識別できるならば冗長度の問題を解決できる。このアイデアを実現するために、走査型電子顕微鏡を用いてＤＮＡを直接シーケンシングする方法や、１本鎖ＤＮＡがナノメートルサイズの孔（ポア）を通過するときの電圧値を塩基に変換するナノポアを用いた方法が提案されている。 If a single DNA is prepared and bases can be identified sequentially from the end, the problem of redundancy can be solved. In order to realize this idea, a method of directly sequencing DNA using a scanning electron microscope or a nanopore that converts a voltage value when a single-stranded DNA passes through a nanometer-sized pore into a base. A method using the method has been proposed.

また光技術を用いた単一分子計測に基づく方法も提案されている。この方法は、単一分子計測を行う反応場をアレイ化することで、超並列的な解析（１００万個／平方ミリメートル）が可能という特徴がある。一つは、１本のＤＮＡの末端からエキソヌクレアーゼを用いてヌクレオチドを１個ずつ順番に切断して検出する方法（エキソヌクレアーゼ法）である。もう一つは、１本の鋳型ＤＮＡを用意して、その塩基配列と相補的なヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼが１個ずつ取り込むその場所で、ヌクレオチドを検出し同定する方法である（ポリメラーゼ法）。エキソヌクレアーゼ法は、標識された色素が酵素反応を妨害するという課題を未だ解決できていない。一方、ポリメラーゼ法は、蛍光標識する部位を工夫することにより、標識された色素が酵素反応を妨害するという困難を解決できる可能性がある。いずれの方法でも蛍光量子収率が大きい（０.１以上）蛍光色素で標識した蛍光ヌクレオチドが必要になる。ヌクレオチド自体は蛍光量子収率が低い（〜１０^-4）ため、このままでは単一分子検出は不可能である。ポリメラーゼ法では蛍光ヌクレオチドがポリメラーゼの周りに十分量存在することが前提となる。もしヌクレオチドの量が少なく、ヌクレオチドがポリメラーゼと会合する過程がポリメラーゼの反応速度より遅くなると会合過程が律速段階になる。ヌクレオチドとポリメラーゼの会合平衡定数を既知として、必要なヌクレオチドの濃度を評価すると、要求されるヌクレオチドの濃度は１０^-6Ｍに達する。この濃度は通常の単一分子検出で使用される試料濃度（１０^-9Ｍ以下）に比べて１０００倍以上高濃度である。このような高濃度中で１個の分子を検出するためには、観測体積を十分小さくする必要がある。十分小さな観測体積をポリメラーゼがＤＮＡに結合している部分に設定して、ｍｓ程度の時間内に蛍光を測定して色素を同定できることがポリメラーゼ法の要件である。但し蛍光色素の光退色の問題、蛍光標識が酵素反応を妨害するという懸念が常に付きまとう。 A method based on single molecule measurement using optical technology has also been proposed. This method has the feature that a massively parallel analysis (1 million pieces / square millimeter) is possible by arraying reaction fields for single molecule measurement. One is a method (exonuclease method) in which nucleotides are cleaved one by one in sequence using exonuclease from the end of one DNA. The other is a method in which a single template DNA is prepared and the nucleotide is detected and identified at the site where the DNA polymerase takes in nucleotides complementary to the base sequence one by one (polymerase method). The exonuclease method has not yet solved the problem that the labeled dye interferes with the enzyme reaction. On the other hand, the polymerase method may be able to solve the difficulty that the labeled dye interferes with the enzyme reaction by devising a fluorescent labeling site. Either method requires a fluorescent nucleotide labeled with a fluorescent dye having a high fluorescence quantum yield (0.1 or more). Since the nucleotide itself has a low fluorescence quantum yield ( ^{−10 −4} ), single molecule detection is impossible as it is. The polymerase method assumes that a sufficient amount of fluorescent nucleotide is present around the polymerase. If the amount of nucleotides is small and the process of nucleotide association with the polymerase is slower than the polymerase reaction rate, the association process becomes the rate-limiting step. Assuming that the association equilibrium constant between the nucleotide and the polymerase is known, the required nucleotide concentration reaches 10 ⁻⁶ M when the required nucleotide concentration is evaluated. This concentration is more than 1000 times higher than the sample concentration (10 ^-9 M or less) used in normal single molecule detection. In order to detect one molecule in such a high concentration, it is necessary to make the observation volume sufficiently small. It is a requirement of the polymerase method that a sufficiently small observation volume is set at a portion where the polymerase is bound to DNA, and the dye can be identified by measuring fluorescence within a time of about ms. However, there are always concerns about the photobleaching problem of fluorescent dyes and the concern that fluorescent labels interfere with enzyme reactions.

高濃度中で１個の分子を検出するためのもうひとつの方法は、プローブＤＮＡ上に補足された蛍光色素１分子と未反応基質の蛍光分子とを識別するため、プローブＤＮＡ上に補足された蛍光色素だけが強く光り、浮遊する蛍光色素が光らない、あるいは無視されるほど弱く光るような条件を作ることであり、局在表面プラズモンにより実現できることが期待される（非特許文献１）。 Another method for detecting a single molecule in high concentration was captured on the probe DNA to distinguish between one fluorescent dye molecule captured on the probe DNA and the fluorescent molecule of the unreacted substrate. This is to create a condition in which only the fluorescent dye shines strongly and the floating fluorescent dye does not shine, or shines so weakly that it can be ignored, and is expected to be realized by localized surface plasmons (Non-patent Document 1).

局在表面プラズモン現象は、プローブＤＮＡ上の蛍光色素だけの輻射を効率的に行うという考え方に基づくものであり、（非特許文献２）に報告されているように、局在型表面プラズモンが分子の光吸収による電子遷移と励起一重項から基底状態への輻射遷移の両方の確率を高めるという物理現象によるものである。局在型表面プラズモンの蛍光増強効果は数倍から数十倍程度見込むことができる。プローブＤＮＡを固定した金属構造体の表面で局在型表面プラズモンが発生すれば、プローブＤＮＡにだけ取りこまれた色素だけが蛍光増強の恩恵を受け、浮遊する色素とは数倍から数十倍以上の蛍光強度の差がもたらされる。但しその影響が及ぶ範囲は金属構造体の直径程度と考えられている（非特許文献３）。一方で金属から一定の距離内においては、蛍光強度がほぼゼロになる消光現象が発生してしまう。従って局在表面プラズモンによる測定では、蛍光分子を金属構造体表面に吸着させずに、蛍光増強場に蛍光色素を保持した状態で測定しなければならない（非特許文献４）。金属構造体の適切な大きさは、照射する光の波長により異なる（非特許文献５）。すなわち表面プラズモンの発生に適する共鳴周波数は、金属構造体表面の自由電子群と光との相互作用によるものである。励起光を可視光とすると、金属構造体の大きさは、幅・高さ共に３０から１０００ｎｍ程度が適しているが、この条件に縛られるものではない。 The localized surface plasmon phenomenon is based on the idea of efficiently emitting only the fluorescent dye on the probe DNA, and as reported in (Non-patent Document 2), localized surface plasmon is a molecule. This is due to a physical phenomenon that increases the probability of both electronic transition due to light absorption and radiation transition from the excited singlet to the ground state. The fluorescence enhancement effect of localized surface plasmons can be expected to be several to several tens of times. If localized surface plasmons are generated on the surface of the metal structure to which the probe DNA is immobilized, only the dye incorporated into the probe DNA will benefit from fluorescence enhancement, and it will be several to tens of times that of the floating dye. The difference in fluorescence intensity is brought about. However, the range of influence is considered to be about the diameter of the metal structure (Non-Patent Document 3). On the other hand, within a certain distance from the metal, a quenching phenomenon in which the fluorescence intensity becomes almost zero occurs. Therefore, in the measurement by the localized surface plasmon, the measurement must be performed in a state where the fluorescent dye is held in the fluorescence enhancement field without adsorbing the fluorescent molecule on the surface of the metal structure (Non-patent Document 4). The appropriate size of the metal structure varies depending on the wavelength of light to be irradiated (Non-Patent Document 5). That is, the resonance frequency suitable for the generation of surface plasmons is due to the interaction between the free electron group on the surface of the metal structure and light. Assuming that the excitation light is visible light, the size of the metal structure is suitably about 30 to 1000 nm in both width and height, but is not limited to this condition.

表面プラズモンによる蛍光増強の例としては、（非特許文献６）に報告されているようなナノメートルオーダーの銀のアイランド構造を用いたものや、（非特許文献７）に報告されているような金の直径数十ナノメートルの球状微粒子を用いたものが知られている。更に金ナノ微粒子が近接していると、その間隙には強力な局在表面プラズモンが発生することが（非特許文献８）において計算シミュレーションにより予測されている。また強力な表面プラズモンが発生する構造として、先端が先鋭化した微小な針が知られている。例えば（非特許文献９）では先端を先鋭化すればするほど表面プラズモンが強く発生する可能性が計算シミュレーションにより予測されている。単一分子検出と局所表面プラズモンの利用により、酵素の取り込み効率が律速となることなく高濃度な基質条件下でも単一分子検出できるため、単一分子シーケンスが可能になると期待される。 Examples of fluorescence enhancement by surface plasmons include those using a nanometer-order silver island structure as reported in (Non-Patent Document 6), or as reported in (Non-Patent Document 7). The thing using the spherical fine particle with a diameter of several tens of nanometers of gold is known. Furthermore, it is predicted by calculation simulation in Non-Patent Document 8 that strong localized surface plasmons are generated in the gap when the gold nanoparticles are close to each other. As a structure that generates strong surface plasmons, a fine needle with a sharpened tip is known. For example, in (Non-Patent Document 9), it is predicted by calculation simulation that the surface plasmon is more strongly generated as the tip is sharpened. Single molecule detection and the use of local surface plasmons are expected to enable single molecule sequencing because single molecule detection is possible even under high concentration substrate conditions without limiting the efficiency of enzyme uptake.

Nature Genetics 1999, vol21 No.1 supplementNature Genetics 1999, vol21 No.1 supplement Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005 J. Phys. Chem. B 22557-22562, 110, 2006J. Phys. Chem. B 22557-22562, 110, 2006 Nanotechnology 18(2007) 044017Nanotechnology 18 (2007) 044017 J. Fluoresc. 7-13, 17, 2007J. Fluoresc. 7-13, 17, 2007 Anal. Chem. vol. 78, 6238-6245Anal. Chem. Vol. 78, 6238-6245 Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp044017-044021Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp044017-044021 J. Comput. Theor. Nanosci. 2007, vol. 4 pp 686-691J. Comput. Theor. Nanosci. 2007, vol. 4 pp 686-691 Nanotechnology, 2006, vol.17, pp475-482Nanotechnology, 2006, vol.17, pp475-482 Chem. Lett., 33(5), p.628 (2004)Chem. Lett., 33 (5), p.628 (2004) Lab Chip, 4, p.1 (2004)Lab Chip, 4, p.1 (2004) Proc. Roy. Soc. Lond., A319, pp.127-136 (1974)Proc. Roy. Soc. Lond., A319, pp. 127-136 (1974) Lab Chip, 1, p.8 (2002)Lab Chip, 1, p.8 (2002) P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640

局所表面プラズモンを用いた単一分子シーケンスでは、局在表面プラズモン場の領域に保持された蛍光色素を確実に検出することが求められるが、発明者らが局在表面プラズモンに基づく蛍光増強効果を、金微粒子を用いて実験した結果、特に１本鎖核酸の場合には金微粒子表面に吸着して消光場に入るため、所望の蛍光増強が得られないことが判明した。金属に固定化された１本鎖ＤＮＡの場合、ＤＮＡはコイル状となり金属表面に留まると考えられる。また２本鎖ＤＮＡの場合は直線状に伸びるため、金属表面に留まることはないと言われているが、実際２本鎖核酸においても所望の蛍光強度が得られないことから、全ての２本鎖ＤＮＡが局在表面プラズモンの領域に保持されているわけではないと考えられた。これらの原因としては、金属表面と核酸のリン酸基との相互作用や、核酸の高次構造、核酸のブラウン運動による一時的な蛍光分子の位置の揺らぎなどが考えられた。核酸の拡散係数は約１×１０^-10ｍ²／秒であるため、１０マイクロメートル／秒程度の速度でブラウン運動していると考えられる。 Single-molecule sequencing using local surface plasmons requires that the fluorescent dye retained in the region of the localized surface plasmon field be detected reliably, but the inventors have demonstrated a fluorescence enhancement effect based on localized surface plasmons. As a result of experiments using gold fine particles, it was found that, in the case of single-stranded nucleic acid in particular, it was adsorbed on the surface of the gold fine particles and entered a quenching field, so that desired fluorescence enhancement could not be obtained. In the case of single-stranded DNA immobilized on metal, the DNA is considered to be coiled and remain on the metal surface. In the case of double-stranded DNA, it is said that it does not stay on the metal surface because it extends in a straight line. However, since the desired fluorescence intensity cannot be obtained even in the case of double-stranded nucleic acid, It was thought that the strand DNA was not retained in the localized surface plasmon region. The possible causes include the interaction between the metal surface and the phosphate group of the nucleic acid, the higher order structure of the nucleic acid, and the temporary fluctuation of the position of the fluorescent molecule due to the Brownian motion of the nucleic acid. Since the diffusion coefficient of nucleic acid is about 1 × 10 ⁻¹⁰ m ² / second, it is considered that the Brownian motion is performed at a speed of about 10 micrometers / second.

本発明の目的は、核酸に結合した蛍光分子を金属構造体から離し、局所表面プラズモン場の領域内に保持して測定することに関する。 The object of the present invention relates to the measurement by keeping the fluorescent molecule bound to the nucleic acid away from the metal structure and holding it in the region of the local surface plasmon field.

本発明は、層流により、核酸に結合した蛍光分子を、局所表面プラズモン場の領域内に保持して測定することに関する。 The present invention relates to measurement by holding fluorescent molecules bound to nucleic acids in a region of a local surface plasmon field by laminar flow.

本発明により、核酸に結合した蛍光分子を、局所表面プラズモン場の領域内に確実に保持することができる。 According to the present invention, the fluorescent molecule bound to the nucleic acid can be reliably retained in the region of the local surface plasmon field.

上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について図面を参照しながら説明する。尚、図面は説明のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。 The above and other novel features and effects of the present invention will be described with reference to the drawings. The drawings are used for explanation and do not limit the scope of rights.

本実施例は、金属構造体に対して光照射して局在型表面プラズモン場を形成し、一部を固定した蛍光標識核酸を層流に漂わせ、蛍光標識を前記局在型表面プラズモン場に配置し、蛍光標識からの蛍光を取得し、核酸を分析する核酸分析方法に関する。 In this example, the metal structure is irradiated with light to form a localized surface plasmon field, a partially labeled fluorescently labeled nucleic acid is drifted in a laminar flow, and the fluorescent label is attached to the localized surface plasmon field. The present invention relates to a nucleic acid analysis method for analyzing a nucleic acid by obtaining fluorescence from a fluorescent label.

また、本実施例は、層流を形成するマイクロ流路と、局在型表面プラズモン場を形成する金属構造体と、金属構造体に光照射する光源と、一部を固定した蛍光標識核酸と、蛍光を検出する検出器と、を備え、蛍光標識核酸を層流に漂わせ、蛍光標識を前記局在型表面プラズモン場に配置し、蛍光標識からの蛍光を取得し、核酸を分析する核酸分析装置に関する。 In addition, the present example includes a micro flow channel that forms a laminar flow, a metal structure that forms a localized surface plasmon field, a light source that irradiates the metal structure with light, a fluorescently labeled nucleic acid that is partially immobilized, And a detector for detecting fluorescence, a fluorescently labeled nucleic acid is drifted in a laminar flow, the fluorescent label is placed in the localized surface plasmon field, the fluorescence from the fluorescent label is obtained, and the nucleic acid is analyzed The present invention relates to an analyzer.

好ましくは、金属構造体の一部に、前記蛍光標識核酸を固定する。 Preferably, the fluorescently labeled nucleic acid is immobilized on a part of the metal structure.

また、好ましくは、蛍光標識核酸を金属構造体に巻きつけて固定する。 Preferably, the fluorescently labeled nucleic acid is wound around a metal structure and fixed.

また、好ましくは、金属構造体を、微粒子，錐構造，柱構造、又はサンドイッチ構造とする。 Preferably, the metal structure is a fine particle, a cone structure, a column structure, or a sandwich structure.

また、好ましくは、金属構造体を、金，銀、又は白金から構成する。 Preferably, the metal structure is composed of gold, silver, or platinum.

また、好ましくは、蛍光測定または表面増強ラマン散乱により核酸を分析する。 Preferably, the nucleic acid is analyzed by fluorescence measurement or surface enhanced Raman scattering.

また、好ましくは、層流の流線方向に対して局在プラズモン場を形成する。 Preferably, a localized plasmon field is formed with respect to the laminar streamline direction.

１分子の反応制御と観察には、厚み５０μｍ程度のマイクロチャネルが有用であると言われている。これは、１分子の観察には液厚が小さい方が良いこと、サンプル量が少量で済むこと、前処理や検出部分を１つの小さなチップ及びデバイスで構築できる可能性があること、どこへでも持ち運べてオンサイトで医療及び環境などの分析が可能となること、といった優れたメリットが考えられる為である。 It is said that a microchannel having a thickness of about 50 μm is useful for controlling and observing the reaction of one molecule. This means that a smaller liquid thickness is better for observing one molecule, a smaller amount of sample is needed, and there is a possibility that the pretreatment and detection part can be constructed with one small chip and device. This is because it is possible to have excellent merits such as being able to carry and analyze on-site medical and environmental analysis.

一方、流路サイズが１から数百マイクロメートルで定義されるマイクロ流路では、低レイノルズ数のため、流体は層流になることが知られている。流れには層流と乱流という２つの状態があり、層流になるか乱流になるかは無次元量であるレイノルズ数によって整理される。レイノルズ数は、慣性力と粘性力の比である。円管の内径をｄ、断面平均流速（流量／断面積）をｖ、流体の動粘度をνとすると、レイノルズ数（Ｒｅ）はｖｄ／νで表せる。一般的に、円管内を流れる流体の場合は、レイノルズ数が２,０００程度以下で層流、２,０００〜４,０００程度で遷移領域（層流，乱流が変化する領域）、４,０００程度以上で乱流とされている。両者における本質的な違いは、速度変動の有無である。乱流では、速度はその方向も含めて常に変動しており、結果として流れは攪拌されているのと同様になる。なおレイノルズ数が約２,０００〜４,０００では、層流と乱流とが混在した不安定な状態となり、遷移域と呼ばれている。この時、層流から乱流へと遷移を始めるレイノルズ数の値（円管内流れでは２３００）を臨界レイノルズ数といい、流路の形状によりその値は異なったものになる。例えば、対象物体が平板の場合、レイノルズ数が４００,０００以下で層流領域、５００,０００程度で遷移し、それ以上で乱流に発達する。 On the other hand, it is known that in a micro channel defined by a channel size of 1 to several hundreds of micrometers, the fluid is laminar because of its low Reynolds number. There are two states of flow, laminar flow and turbulent flow, and whether the flow becomes laminar or turbulent is arranged by the Reynolds number, which is a dimensionless quantity. Reynolds number is the ratio of inertial force to viscous force. The Reynolds number (Re) can be expressed as vd / ν, where d is the inner diameter of the circular tube, v is the average cross-sectional flow velocity (flow rate / cross-sectional area), and v is the kinematic viscosity of the fluid. In general, in the case of a fluid flowing in a circular pipe, a Reynolds number is about 2,000 or less, a laminar flow is about 2,000 to 4,000, and a transition region (a region where laminar flow or turbulent flow changes), 4, It is considered to be turbulent at about 000 or more. The essential difference between the two is the presence or absence of speed fluctuations. In turbulent flow, the velocity always fluctuates, including its direction, so that the flow is as if it is being stirred. When the Reynolds number is about 2,000 to 4,000, an unstable state in which laminar flow and turbulent flow are mixed is called a transition region. At this time, the value of the Reynolds number (2300 in the case of the flow in the circular pipe) at which the transition from laminar flow to turbulent flow starts is called the critical Reynolds number, and the value varies depending on the shape of the flow path. For example, when the target object is a flat plate, the Reynolds number transitions in a laminar flow region of about 500,000 when the Reynolds number is 400,000 or less, and develops into a turbulent flow beyond that.

層流状態においては従来では考えられなかった特異的な流体挙動をミクロな系において実現でき、このような特異的な挙動を示す流体の中では、流体内の高分子が変形することが知られている。マクロな系で層流状態を達成するためには非常に低速で送液しなければならない。流体内の高分子の変形は、例えばＤＮＡのハイブリダイゼーションや分子修飾を容易にし、また、分子機能を変化させると考えられるため、マイクロ流体での化学反応を考える上で重要である。 In a laminar flow state, a unique fluid behavior that could not be considered in the past can be realized in a micro system, and it is known that a polymer in the fluid deforms in a fluid exhibiting such a specific behavior. ing. In order to achieve a laminar flow state in a macro system, the liquid must be fed at a very low speed. The deformation of the polymer in the fluid facilitates, for example, DNA hybridization and molecular modification, and is thought to change the molecular function. Therefore, it is important in considering a chemical reaction in a microfluid.

例えば（非特許文献１０）では、流路サイズより１０００分の１程度小さいナノサイズのＤＮＡあるいは蛋白質が、マイクロ流路内で伸長する現象（ＤＮＡあるいはタンパク質が直線状となる現象）を報告している。またマイクロ流路内では、ＤＮＡが伸長・配向現象や分子ふるい効果があることが（非特許文献１１）で示されており、静止時にはランダムコイル状に丸まっていたＤＮＡが流動中は流れに沿って伸長・配向することを、蛍光分子で標識したＤＮＡを蛍光顕微鏡と高感度カメラを用いて観察している。 For example, (Non-Patent Document 10) reports a phenomenon in which nano-sized DNA or protein about 1/1000 smaller than the channel size is elongated in the micro channel (a phenomenon in which DNA or protein becomes linear). Yes. In addition, it is shown in the microchannel that DNA has an elongation / orientation phenomenon and a molecular sieving effect (Non-patent Document 11). The DNA labeled with fluorescent molecules is observed using a fluorescent microscope and a high-sensitivity camera.

このように、マイクロ流路内を通液させるだけでＤＮＡの凝集−伸長構造は制御できる。ＤＮＡ鎖の伸長現象は、マイクロチャネル内に発生している放物線状の速度分布により誘起されたせん断応力の影響と考えられている。層流がフレキシブルなポリマーを伸長させるコイル−ストレッチ転移は、（非特許文献１２）によりその可能性が示唆されている。但し、マイクロ流路内に発生するせん断応力の大きさは、水素結合力の３〜４桁小さい値と見積もられており、せん断応力が直接的に分子を伸長させることは考えにくい。この現象は、主に水により溶媒和された分子構造が、せん断応力により不安定化し、そのアンバランスを相殺するように自発的に形態や構造を変化させるためと考えられる。水中でのＤＮＡ構造のシミュレーションでは、ＤＮＡ両端が螺旋を描くようなヘリックス構造をとって安定化している。この現象は、ＤＮＡ分子内での非結合性相互作用（ファンデルワールス力，クーロン力，水素結合力）よりも、溶媒の水分子との非結合性相互作用、特に水素結合力により、ＤＮＡが伸長したまま構造が安定化した為である。層流によりもたらされる高次構造の変化は、その化学反応性を変化させるため、バッチ式の反応と比較して高効率あるいは特異的な挙動を示すことが期待できる。マイクロ流体のせん断応力や静水圧差が、ナノサイズの分子の三次元構造にどのような影響を及ぼすか解明するためには、分子シミュレーションによるアプローチが有効である。ＤＮＡ分子形態の変形は、層流中での拡散係数や２次流れから受ける影響の大小に関係する一方、ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率にも影響するものと考えられる。 In this way, the DNA aggregation-extension structure can be controlled simply by passing the solution through the microchannel. The elongation phenomenon of DNA strands is considered to be an influence of shear stress induced by a parabolic velocity distribution generated in the microchannel. The possibility of a coil-stretch transition in which a laminar flow elongates a flexible polymer is suggested by (Non-Patent Document 12). However, the magnitude of the shear stress generated in the microchannel is estimated to be 3 to 4 orders of magnitude smaller than the hydrogen bonding force, and it is unlikely that the shear stress directly extends the molecules. This phenomenon is thought to be because the molecular structure solvated mainly by water is destabilized by shear stress and spontaneously changes its form and structure so as to offset the imbalance. In the simulation of the DNA structure in water, the DNA structure is stabilized by taking a helix structure in which both ends of the DNA draw a spiral. This phenomenon is due to non-bonding interactions with water molecules in the solvent, particularly hydrogen bonding forces, rather than non-bonding interactions (van der Waals forces, Coulomb forces, hydrogen bonding forces) within the DNA molecule. This is because the structure is stabilized while being stretched. The change in the higher-order structure caused by the laminar flow changes its chemical reactivity, so that it can be expected to show high efficiency or specific behavior compared to the batch-type reaction. In order to elucidate how the microfluidic shear stress and hydrostatic pressure difference affect the three-dimensional structure of nano-sized molecules, a molecular simulation approach is effective. It is considered that the deformation of the DNA molecular form is related to the diffusion coefficient in the laminar flow and the magnitude of the influence from the secondary flow, while also affecting the hybridization efficiency of the DNA.

また二次元平板上に微細構造を構築したチップでは、流路の折り返し部分で複雑な流体構造を呈することが、（非特許文献１３）で明らかになっている。流速が小さいときは慣性力の影響で２液の界面が変形し、その後に逆方向の慣性力を受けることによって初期の界面状態に復元する。しかし、流速が大きくなると、２次流れの影響による流体変形が著しく、その後の逆方向の慣性力により、更に複雑な界面形状となる。このような界面の変形程度は、流速だけではなく、流体の密度・粘度・壁面との相互作用（流体スリップ）の大小によっても複雑に変化する。二次流れは流速により左右される。以上の点を鑑みた上で、金属構造体を流路内に形成することが望ましい。 Further, it has been clarified in (Non-patent Document 13) that a chip having a fine structure built on a two-dimensional flat plate exhibits a complicated fluid structure at the folded portion of the flow path. When the flow velocity is small, the interface between the two liquids is deformed due to the influence of the inertial force, and then the initial interface state is restored by receiving the inertial force in the opposite direction. However, when the flow velocity is increased, fluid deformation due to the influence of the secondary flow is remarkable, and a more complicated interface shape is formed due to the inertia force in the reverse direction thereafter. The degree of deformation of the interface changes in a complex manner not only by the flow velocity but also by the density, viscosity, and interaction with the wall surface (fluid slip). The secondary flow depends on the flow velocity. In view of the above points, it is desirable to form the metal structure in the flow path.

＜核酸分析デバイス＞
本実施例のデバイスの概念を、図１を用いて説明する。プローブＤＮＡ上に補足された蛍光色素分子１０１と未反応基質の蛍光色素分子１０２とを識別するためには、局在表面プラズモン場を発生させる必要がある。平滑な基板１０３上の金属構造体１０４に励起光を照射することで、局在表面プラズモン場が発生し、プローブＤＮＡ上の蛍光色素分子１０１だけの輻射過程が効率よく起こる。但し、この領域は金属構造体１０４の直径程度と考えられているが、金属構造体１０４の極近傍では蛍光強度が０になる消光現象が発生する。非送液時には、プローブ１０５が金属構造体１０４に吸着しやすいため、消光現象の発生する蛍光色素分子１０１は消光場に入る。またブラウン運動により、蛍光色素分子１０１は局在表面プラズモン場と消光場を行き来するため、常に輻射過程が効率よく起こるわけではない。一方、送液時には、層流状態となるため、プローブ１０５は伸長する。従って、消光場に蛍光色素分子１０１が入ることは無いため、輻射過程は効率よく起こる。このことは、送液方向に対して表面プラズモン場が形成される図２にもあてはまる。 <Nucleic acid analysis device>
The concept of the device of this embodiment will be described with reference to FIG. In order to distinguish between the fluorescent dye molecule 101 captured on the probe DNA and the fluorescent dye molecule 102 of the unreacted substrate, it is necessary to generate a localized surface plasmon field. By irradiating the metal structure 104 on the smooth substrate 103 with excitation light, a localized surface plasmon field is generated, and a radiation process of only the fluorescent dye molecules 101 on the probe DNA efficiently occurs. However, although this region is considered to be about the diameter of the metal structure 104, a quenching phenomenon in which the fluorescence intensity becomes 0 occurs in the immediate vicinity of the metal structure 104. Since the probe 105 is easily adsorbed to the metal structure 104 when the liquid is not fed, the fluorescent dye molecule 101 in which the quenching phenomenon occurs enters the quenching field. Further, due to the Brownian motion, the fluorescent dye molecule 101 moves back and forth between the localized surface plasmon field and the quenching field, so that the radiation process does not always occur efficiently. On the other hand, at the time of liquid feeding, the probe 105 extends because of a laminar flow state. Therefore, since the fluorescent dye molecule 101 does not enter the quenching field, the radiation process occurs efficiently. This also applies to FIG. 2 where a surface plasmon field is formed in the liquid feeding direction.

近接した二つの金構造体の間にＤＮＡプローブを固定した核酸分析デバイスの製造方法を、図２を用いて説明する。平滑な支持基体２０１上に２種類の電子線用ポジ型レジスト２０２，２０３を別々にスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，樹脂基板等が用いられる。デバイスとしたときに、金属構造体を形成した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。２種類の電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートとＺＥＰ−５２０（日本ゼオン社製）の組み合わせを用いることができる。ＺＥＰ−５２０は即差に電子線感受率の大きい塩素と脱炭酸反応などでラジカルを生みやすいエステル部位を持ち、高分子側鎖には三級炭素が配置されていてラジカル的β位切断により解重合しやすい構造を有する。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ２回電子線直描露光を行って、各々のレジストに基板側の電子線用ポジ型レジスト２０２の方が電子線用ポジ型レジスト２０３よりの穴径が大きいスルーホールを形成する。例えば、各々直径３００ｎｍ及び２５０ｎｍのスルーホールを形成する。このスルーホールをテーパーが大きいデポジション用のマスクとして活用する。スルーホールは並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、製造上の簡便さ・歩留まりの高さと並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると、１μｍ程度のピッチでスルーホールを形成することが望ましい。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度，位置分解能にも大きく依存する。例えば、１μｍピッチで反応サイト（金属構造体）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、金属構造体の組成にしたがって、チタン２０４，金２０５，チタン２０６，ＳｉＯ₂膜２０７，チタン２０８，金２０９をスパッタリングで製膜する。チタンは、サファイア−金，金−ＳｉＯ₂間の接着を補強する意味で入れることが好ましく、クロム等の他の金属を使用することができる。２層レジストを剥離後、金２０９をエッチングすることで、チタン２０８を露出させる。金２０９のエッチングは、ウエットエッチングが好ましく、エッチング液にはＡＵＲＵＭ−３０１（関東化学社製）を使用することができる。ＡＵＲＵＭは従来品と比較して、超高精細パターンへの対応が可能であり、更にＡｕエッチング後のＡｕバンプ表面状態についても非常に滑らかな形状が得られる。また優れた液安定性、及びＡｕ溶解量が多いため浴ライフが長く、大幅なコストダウンを期待できる。また消防上危険物ではないなど実使用上の有効な特徴を備えている。次に、ドライエッチングにより、チタン２０８，ＳｉＯ₂膜２０７，チタン２０６をエッチングし、下層の金２０５を露出させる。このエッチングには、アルゴンプラズマエッチングが好ましい。次に、もう一度、金のウエットエッチングで、下層の金２０５の横幅を１００ｎｍから５００ｎｍ程度になるまでエッチングする。この金２０５の最終的な大きさは、局在型表面プラズモンを生成させるために照射する光の波長によって調節する必要がある。例えば、５００ｎｍ程度の光を用いる場合には、横幅は５０ｎｍから５００ｎｍ程度、高さは５０ｎｍから５００ｎｍ程度が効果的である。最後に、ＳｉＯ₂膜２０７にＤＮＡプローブを固定する。固定方法には種々の方法が考えられるが、例としてアミノシラン処理を用いる方法を記述する。アミノシラン処理により、ＳｉＯ₂膜２０７にアミノ基を導入する。その後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させた後、ストレプトアビジンを反応させる。次に、予めビオチンを末端に修飾しておいたＤＮＡプローブ２１０を反応させることで、近接した二つの金構造体の間にＤＮＡプローブを固定した核酸分析デバイスを完成することができる。ＤＮＡプローブの長さには、特別な制限はないが、あまり長く、あるいは極端に短くすると、ＤＮＡが金構造体に隠れてしまい、核酸試料とのハイブリダイゼーション効率が悪くなる恐れがある。２０から５０塩基長が好ましい。金以外の銀や白金を用いた場合にも、上記と同様に作製できる。 A method for manufacturing a nucleic acid analysis device in which a DNA probe is fixed between two adjacent gold structures will be described with reference to FIG. Two types of positive resists 202 and 203 for electron beam are separately applied on a smooth support base 201 by spin coating. As the smooth support substrate, a glass substrate, a sapphire substrate, a resin substrate or the like is used. When a device is used, when it is necessary to irradiate excitation light from the back surface opposite to the surface on which the metal structure is formed, a quartz substrate or a sapphire substrate having excellent light transmittance may be used. As two types of positive resists for electron beams, for example, a combination of polymethyl methacrylate and ZEP-520 (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) can be used. ZEP-520 has a high electron beam susceptibility and an ester site that easily generates radicals by decarboxylation, etc., and a tertiary carbon is located in the polymer side chain, which is resolved by radical β-position cleavage. It has a structure that is easy to polymerize. After aligning using the position of the marker on the substrate and performing electron beam direct drawing exposure twice, the positive resist 202 for electron beam on the substrate side is the positive resist 203 for electron beam on each resist. A through hole having a larger hole diameter is formed. For example, through holes having a diameter of 300 nm and 250 nm are formed. This through hole is used as a mask for deposition with a large taper. Through-holes depend on the number of nucleic acid molecules that can be analyzed by parallel processing, but through holes are formed at a pitch of about 1 μm, taking into account the simplicity of manufacturing, high yield, and the number of nucleic acid molecules that can be analyzed by parallel processing. It is desirable. The through hole formation region also depends on the number of nucleic acid molecules that can be analyzed by parallel processing, but greatly depends on the position accuracy and position resolution on the detection device side. For example, when reaction sites (metal structures) are formed with a pitch of 1 μm, 1 million reaction sites can be formed if the through-hole formation region is 1 mm × 1 mm. After forming the through hole, titanium 204, gold 205, titanium 206, SiO ₂ film 207, titanium 208, and gold 209 are formed by sputtering according to the composition of the metal structure. Titanium is preferably added to reinforce the adhesion between sapphire-gold and gold-SiO ₂ , and other metals such as chromium can be used. After peeling off the two-layer resist, the gold 209 is etched to expose the titanium 208. The etching of the gold 209 is preferably wet etching, and AURUM-301 (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) can be used as an etching solution. AURUM can handle ultra-high-definition patterns compared to conventional products, and can also provide a very smooth shape for the Au bump surface state after Au etching. Moreover, since the liquid stability is excellent and the amount of dissolved Au is large, the bath life is long and a significant cost reduction can be expected. In addition, it has effective features in actual use, such as not dangerous for fire fighting. Next, the titanium 208, the SiO ₂ film 207, and the titanium 206 are etched by dry etching to expose the underlying gold 205. For this etching, argon plasma etching is preferable. Next, etching is performed again by wet etching of gold until the lateral width of the lower layer of gold 205 is about 100 nm to 500 nm. The final size of the gold 205 needs to be adjusted according to the wavelength of light to be irradiated in order to generate localized surface plasmons. For example, when light of about 500 nm is used, it is effective that the lateral width is about 50 nm to 500 nm and the height is about 50 nm to 500 nm. Finally, a DNA probe is fixed to the SiO ₂ film 207. Various fixing methods can be considered, and a method using aminosilane treatment is described as an example. An amino group is introduced into the SiO ₂ film 207 by aminosilane treatment. Thereafter, biotin-succinimide (NHS-Biotin manufactured by Pierce) is reacted, and then streptavidin is reacted. Next, a nucleic acid analysis device in which a DNA probe is immobilized between two adjacent gold structures can be completed by reacting a DNA probe 210 previously modified with biotin at its end. The length of the DNA probe is not particularly limited, but if it is too long or extremely short, the DNA may be hidden in the gold structure, and the efficiency of hybridization with the nucleic acid sample may deteriorate. A length of 20 to 50 bases is preferred. When silver or platinum other than gold is used, it can be produced in the same manner as described above.

またＳｉＯ₂膜２０７の外周の半分に金などをスパッタで成膜することで、核酸を任意の側に固定化することも可能である。この場合、核酸をＳｉＯ₂膜２０７の任意の側につけることができる。反応液や洗浄液の送液方向の上側にスパッタにより形成された金属層、下側に核酸を配置することで、層流発生時に核酸が金属構造体の周りにくっつく危険性を回避できる。但し、金属同士が接しないように中間層を設ける必要がある。 It is also possible to immobilize nucleic acids on an arbitrary side by depositing gold or the like on the half of the outer periphery of the SiO ₂ film 207 by sputtering. In this case, the nucleic acid can be attached to any side of the SiO ₂ film 207. By arranging the metal layer formed by sputtering on the upper side of the reaction liquid and the liquid feeding direction and the nucleic acid on the lower side, it is possible to avoid the risk of the nucleic acid sticking around the metal structure when laminar flow occurs. However, it is necessary to provide an intermediate layer so that the metals do not contact each other.

次に、金の円錐形の先端部にＤＮＡプローブを固定した構造の核酸分析デバイスの製造方法を、図３を用いて説明する。平滑な支持基体３０１上に２種類の電子線用ポジ型レジスト３０２，３０３を別々にスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，樹脂基板等が用いられる。デバイスとしたときに、金属構造体を形成した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。２種類の電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートとＺＥＰ−５２０（日本ゼオン社製）の組合せを用いることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ２回電子線直描露光を行って、各々のレジストに基板側の電子線用ポジ型レジスト３０２の方が電子線用ポジ型レジスト３０３よりも穴径が大きいスルーホールを形成する。例えば、各々直径３００ｎｍ及び１００ｎｍのスルーホールを形成する。このスルーホールを、テーパーが大きいデポジション用のマスクとして活用する。スルーホールの形成後、金属構造体の組成にしたがって、チタン３０４，金３０５をスパッタリングで製膜する。チタンは、サファイア−金間の接着を補強する意味で入れることが好ましく、クロム等の他の金属を使用することができる。形成される金のスパッタ膜３０５は図３に示すように、円錐型となる。この円錐型の形状をコントロールするには、２層レジストの各々の膜厚と穴径を変えることが有効である。２層レジストを剥離後、ＳｉＯ₂膜３０６をスパッタリングで製膜する。次に、反応性イオンエッチング（ＣＦ₄／Ｏ₂使用）により、ＳｉＯ₂膜３０６をエッチングして、金３０５の先端部を露出する。次にヒドロキシシラン処理により、ＳｉＯ₂膜３０６上にヒドロキシ基を導入し、非特異的吸着を防止する。最後に、末端にチオール基を修飾したＤＮＡプローブ３０７を反応させることで、金の円錐形の先端部にＤＮＡプローブを固定した構造の核酸分析デバイスを完成することができる。上記製造方法は、金以外の銀や白金を用いた場合にも、同様に作製されることは言うまでもない。 Next, a method for manufacturing a nucleic acid analysis device having a structure in which a DNA probe is fixed to the tip of a gold cone will be described with reference to FIG. Two types of positive resists 302 and 303 for electron beams are separately applied on a smooth support base 301 by spin coating. As the smooth support substrate, a glass substrate, a sapphire substrate, a resin substrate or the like is used. When a device is used, when it is necessary to irradiate excitation light from the back surface opposite to the surface on which the metal structure is formed, a quartz substrate or a sapphire substrate having excellent light transmittance may be used. As the two types of positive resists for electron beams, for example, a combination of polymethyl methacrylate and ZEP-520 (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) can be used. After aligning using the position of the marker on the substrate and performing electron beam direct drawing exposure twice, the positive resist 302 for electron beam on the substrate side is more positive resist 303 for electron beam on each resist. A through hole having a larger hole diameter is formed. For example, through holes having a diameter of 300 nm and 100 nm are formed. This through hole is used as a mask for deposition with a large taper. After the formation of the through hole, titanium 304 and gold 305 are formed by sputtering according to the composition of the metal structure. Titanium is preferably added to reinforce the adhesion between sapphire and gold, and other metals such as chromium can be used. As shown in FIG. 3, the formed gold sputtered film 305 has a conical shape. In order to control this conical shape, it is effective to change the film thickness and hole diameter of each of the two-layer resists. After peeling off the two-layer resist, a SiO ₂ film 306 is formed by sputtering. Next, the SiO ₂ film 306 is etched by reactive ion etching (using CF ₄ / O ₂ ) to expose the tip of the gold 305. Next, a hydroxy group is introduced onto the SiO ₂ film 306 by hydroxysilane treatment to prevent nonspecific adsorption. Finally, a nucleic acid analysis device having a structure in which a DNA probe is fixed to the tip of a gold cone can be completed by reacting a DNA probe 307 with a thiol group modified at the end. It goes without saying that the above manufacturing method is similarly produced when silver or platinum other than gold is used.

本実施例に係る核酸分析デバイスの好ましい構成の一例について、図４を参照しながら説明する。光透過性支持基体４０１の上に、金属構造体が格子状に配置されている領域４０２が複数搭載されている。金属構造体は、先に述べた、近接した二つの金構造体の間にＤＮＡプローブを固定した金属構造体や、金の円錐形の先端部にＤＮＡプローブを固定した構造の金属構造体が該当する。配置の間隔は、解析しようとする核酸試料，蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。例えば、２５mm×７５mmのスライドガラスを光透過性支持基体４０１とし、１マイクロ・メートル間隔で格子状に金属構造体を配置した領域４０２を５mm×８mmとすると、１領域当たり４０００万種類の核酸分子を解析でき、その領域を８個程度、光透過性支持基体４０１（スライドガラス）上に搭載することができる。したがって、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分に正確に行うことができ、一枚の基板上で８解析程度行うことができる。 An example of a preferred configuration of the nucleic acid analysis device according to this example will be described with reference to FIG. A plurality of regions 402 in which metal structures are arranged in a lattice pattern are mounted on the light-transmitting support base 401. The metal structure corresponds to the metal structure in which the DNA probe is fixed between two adjacent gold structures as described above, or the metal structure in which the DNA probe is fixed to the tip of the gold cone. To do. The arrangement interval can be appropriately set according to the specifications of the nucleic acid sample to be analyzed and the fluorescence detection apparatus. For example, if a glass slide of 25 mm × 75 mm is used as a light transmissive support base 401, and a region 402 in which metal structures are arranged in a grid at 1 micrometer intervals is 5 mm × 8 mm, 40 million types of nucleic acid molecules per region Thus, about eight regions can be mounted on the light-transmissive support base 401 (slide glass). Therefore, for example, when used for RNA expression analysis, about 400,000 molecules of RNA are expressed per cell, so RNA expression frequency analysis can be performed sufficiently accurately as in digital counting. About 8 analyzes can be performed on a single substrate.

前記のように、複数の反応領域を光透過性支持基体４０１の上に設けるには、予め流路を設けた反応チャンバー４０３を光透過性支持基体４０１の上にかぶせることで達成できる。反応チャンバー４０３は、流路の形成には流路４０７の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体またはガラスなどからなり、デバイス上に張り合わせて使用することになる。具体的に述べると、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット４０４，反応液を送り出す分注ユニット４０５，液の流れを制御するバルブ４０６，廃液タンク４０８から構成される。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。 As described above, providing a plurality of reaction regions on the light transmissive support base 401 can be achieved by covering the light transmissive support base 401 with a reaction chamber 403 provided with a flow path in advance. The reaction chamber 403 is made of a resin substrate such as PDMS (Polydimethylsiloxane) or glass in which a groove of the flow path 407 is dug in advance for forming the flow path, and is used by being bonded onto the device. More specifically, a temperature control unit 404 that stores and controls the temperature of nucleic acid samples, reaction enzymes, buffers, nucleotide substrates, and the like, a dispensing unit 405 that sends out the reaction liquid, a valve 406 that controls the flow of the liquid, and a waste liquid tank 408 Composed. If necessary, install a temperature controller to control the temperature.

蛍光測定時には、反応液または洗浄液を流路４０７に１０メートル／秒以下（好ましくは０.１メートル／秒以下）の流速で流して層流を発生させて、ＳｉＯ₂に固定化された核酸の構造を確実に伸長させることで金属構造体から離し、核酸に結合した蛍光分子を金属構造体により生み出される局在プラズモン表面領域内に保持することで、蛍光増強効果による蛍光検出が可能となる。静置状態でも蛍光検出可能な金属構造体も存在するが、金属構造体表面への核酸の吸着やブラウン運動や核酸の高次構造により、蛍光ヌクレオチドが伸長しているにもかかわらず、金属構造体の極近傍に存在して蛍光ヌクレオチドが消光場に入っている場合も存在する。この場合、蛍光ヌクレオチドが伸長しているにもかかわらず見落とすことになり、単一分子シーケンスにおいては正しい塩基配列解析ができないことになる。従って、層流条件下で強制的に核酸を伸長させる操作が必要となる。但し、層流の発生条件は、流路形状ごとに定められたレイノルズ数により決定されるため、流速は、前記条件に縛られるものではない。また、反応終了時には、洗浄液が反応チャンバー４０３の流路を通じて供給され、廃液タンク４０８に収納される。 At the time of fluorescence measurement, a reaction solution or a washing solution is caused to flow through the flow path 407 at a flow rate of 10 meters / second or less (preferably 0.1 meters / second or less) to generate a laminar flow, and the nucleic acid immobilized on SiO ₂ By securely extending the structure, it is separated from the metal structure, and the fluorescent molecule bound to the nucleic acid is held in the localized plasmon surface region generated by the metal structure, thereby enabling fluorescence detection by the fluorescence enhancement effect. Although there are metal structures that can detect fluorescence even in a stationary state, the metal structure is in spite of the fact that fluorescent nucleotides are elongated due to adsorption of nucleic acids to the surface of the metal structure, Brownian motion, and higher-order structures of nucleic acids. There are also cases where fluorescent nucleotides are in the extinction field in the immediate vicinity of the body. In this case, although the fluorescent nucleotide is extended, it is overlooked, and a correct base sequence analysis cannot be performed in a single molecule sequence. Therefore, an operation for forcibly extending the nucleic acid under laminar flow conditions is required. However, since the generation condition of the laminar flow is determined by the Reynolds number determined for each channel shape, the flow velocity is not limited to the above condition. At the end of the reaction, the cleaning liquid is supplied through the flow path of the reaction chamber 403 and stored in the waste liquid tank 408.

塩基伸長反応が進むにつれて、層流条件下での核酸構造の伸長時に、蛍光分子が局在表面プラズモンの領域を超えてしまうことがある。この場合には、局在表面プラズモンの領域を超えてしまう領域に、別の金属構造体により形成される局在表面プラズモンの領域をオーバーラップさせる方法がある。局在表面プラズモンの領域が金属構造体の直径程度であるため、隣接する金属構造体間の距離は、金属構造体の直径程度であることが望ましい。 As the base extension reaction proceeds, fluorescent molecules may exceed the region of localized surface plasmons when the nucleic acid structure is extended under laminar flow conditions. In this case, there is a method of overlapping a localized surface plasmon region formed by another metal structure in a region that exceeds the localized surface plasmon region. Since the localized surface plasmon region is about the diameter of the metal structure, the distance between adjacent metal structures is preferably about the diameter of the metal structure.

また、別の方法として、核酸をサンドイッチ型や柱構造の金属構造体の周囲に、核酸を巻きつけることで蛍光分子と金属構造体との距離を縮めることができるため、再び局在表面プラズモン領域に蛍光分子を配置することが可能である。但し、金属構造体への巻きつけ長さが局所表面プラズモン領域の幅より長い場合には、蛍光分子は局所表面プラズモン領域の手前に配置されるため、消光場に入り検出できない。但し、蛍光ヌクレオチドを用いて更に塩基伸長させることで再び局所表面プラズモン領域に蛍光分子を保持することができるため、塩基配列の解析が可能となる。この方法は、局在表面プラズモン領域が狭く、１０から２０塩基しかシーケンスできない場合に、異なる位置を塩基配列解析することで例えばｍＲＮＡを同定できるといった特徴を持つ。
＜核酸分析装置＞
本実施例に係る、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図５を参照しながら説明する。 As another method, the distance between the fluorescent molecule and the metal structure can be reduced by wrapping the nucleic acid around the metal structure having a sandwich type or a pillar structure. It is possible to arrange fluorescent molecules on the surface. However, when the winding length around the metal structure is longer than the width of the local surface plasmon region, the fluorescent molecule is placed in front of the local surface plasmon region, and therefore enters the quenching field and cannot be detected. However, since the fluorescent molecule can be retained in the local surface plasmon region by further extending the base using the fluorescent nucleotide, the base sequence can be analyzed. This method has a feature that when a localized surface plasmon region is narrow and only 10 to 20 bases can be sequenced, for example, mRNA can be identified by base sequence analysis at different positions.
<Nucleic acid analyzer>
An example of a preferable configuration of the nucleic acid analyzer using the nucleic acid analysis device according to the present embodiment will be described with reference to FIG.

カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバーに前記のデバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓５０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０８から発振するレーザ光５１０および５０９を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１１によって円偏光する。そして、ダイクロイックミラー５１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ５１３によって集光する。その後、プリズム５１４を介してデバイス５０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、レーザ照射により、デバイス５０５表面上に存在する金属構造体において局在型表面プラズモンが発生し、金属構造体に結合したＤＮＡプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は、対物レンズ５１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ５１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ５１７により２次元ＣＣＤカメラ５１８上に結像される。 The device 505 is installed in a reaction chamber composed of a cover plate 501, a detection window 502, an inlet 503 that is a solution exchange port, and an outlet 504. Note that PDMS (Polydimethylsiloxane) is used as the material of the cover plate 501 and the detection window 502. The thickness of the detection window 502 is 0.17 mm. The laser beams 510 and 509 oscillated from the YAG laser light source (wavelength 532 nm, output 20 mW) 507 and the YAG laser light source (wavelength 355 nm, output 20 mW) 508 are circularly polarized only by the λ / 4 plate 511. Then, the two laser beams are adjusted to be coaxial by a dichroic mirror 512 (reflecting 410 nm or less), and then condensed by a lens 513. Thereafter, the device 505 is irradiated at a critical angle or more via the prism 514. According to the present example, localized surface plasmons are generated in the metal structure existing on the surface of the device 505 by laser irradiation, and the target substance phosphor captured by the DNA probe bound to the metal structure is fluorescent. It will be in the enhancement field. The phosphor is excited by laser light, and a part of the enhanced fluorescence is emitted through the detection window 502. The fluorescence emitted from the detection window 502 is converted into a parallel light beam by the objective lens 515 (× 60, NA 1.35, working distance 0.15 mm), and background light and excitation light are blocked by the optical filter 516 to form an image. An image is formed on the two-dimensional CCD camera 518 by the lens 517.

逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、（非特許文献１４）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置に、あるいはプリンの７位の位置に、アリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は、光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することが出来る。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことから、リアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。 In the case of the sequential reaction method, as disclosed in (Non-patent Document 14), as a nucleotide with a fluorescent dye, a 3′-O-allyl group is introduced as a protecting group at the 3′OH position of ribose, and Further, those linked to a fluorescent dye through an allyl group at the 5-position of pyrimidine or at the 7-position of purine can be used. Since the allyl group is cleaved by light irradiation or contact with palladium, the quenching of the dye and the control of the extension reaction can be achieved simultaneously. Even in the sequential reaction, it is not necessary to remove unreacted nucleotides by washing. Furthermore, since no washing step is required, the extension reaction can be measured in real time. In this case, in the nucleotide, it is not necessary to put a 3'-O-allyl group as a protecting group at the 3'OH position of ribose, and the nucleotide linked to the dye via a functional group that can be cleaved by light irradiation. Can be used.

蛍光測定時には、反応液または洗浄液を流路４０７に流して層流を発生させて、ＳｉＯ₂に固定化された核酸の構造を確実に伸長させることで金属構造体から離し、核酸に結合した蛍光分子を金属構造体により生み出される局在プラズモン表面領域内に保持することで、蛍光増強効果による蛍光検出が可能となる。 At the time of fluorescence measurement, the reaction solution or the washing solution is caused to flow through the flow path 407 to generate a laminar flow, and the structure of the nucleic acid immobilized on SiO ₂ is surely extended to separate from the metal structure and to the fluorescence bonded to the nucleic acid. By holding the molecule in the localized plasmon surface region generated by the metal structure, fluorescence detection by the fluorescence enhancement effect becomes possible.

逐次反応を行う場合には反応液を流路４０７に流しながら反応させる必要は無く、静置反応でも構わない。但し、未反応の蛍光ヌクレオチドを洗浄後に蛍光測定を行う際には、洗浄液などを流しながら層流条件下で検出することが望ましい。蛍光ヌクレオチドを含む溶液を流して層流状態で蛍光検出を行う場合にはリアルタイムで塩基伸長を検出することが可能であり、更に、核酸の構造が伸長していることから、蛍光ヌクレオチドとの反応効率が高くなることが期待される。 When performing the sequential reaction, it is not necessary to cause the reaction to flow while flowing the reaction solution through the flow path 407, and a stationary reaction may be performed. However, when performing fluorescence measurement after washing unreacted fluorescent nucleotides, it is desirable to detect under laminar flow conditions while flowing a washing solution or the like. When fluorescence detection is performed in a laminar flow state by flowing a solution containing fluorescent nucleotides, it is possible to detect base extension in real time, and further, since the structure of the nucleic acid is extended, the reaction with fluorescent nucleotides is possible. Higher efficiency is expected.

上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。 As described above, by assembling a nucleic acid analysis apparatus using the nucleic acid analysis device of this example, the analysis time can be shortened and the device and the analysis apparatus can be simplified without the need for a cleaning process. In addition, it becomes possible to measure the elongation reaction of the base in real time, which can greatly improve the throughput compared to the conventional technique.

本実施例の核酸分析デバイスの概念を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the concept of the nucleic acid analysis device of a present Example. 本実施例の核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するための図である。It is a figure for demonstrating an example of the manufacturing method of the nucleic acid analysis device of a present Example. 本実施例の核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するための図である。It is a figure for demonstrating an example of the manufacturing method of the nucleic acid analysis device of a present Example. 本実施例の核酸分析デバイスの構成の一例を説明するための図である。It is a figure for demonstrating an example of a structure of the nucleic acid analysis device of a present Example. 本実施例の核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための図である。It is a figure for demonstrating an example of the nucleic acid analyzer using the nucleic acid analysis device of a present Example.

符号の説明Explanation of symbols

１０１蛍光色素分子
１０２未反応基質の蛍光色素分子
１０３基板
１０４金属構造体
１０５プローブ
２０１平滑な支持基体
２０２，２０３，３０２，３０３電子線用ポジ型レジスト
２０４，２０６，２０８，３０４チタン
２０５，２０９，３０５金
２０７，３０６ＳｉＯ₂膜
３０１平滑な支持基体
４０１光透過性支持基体
４０２格子状に金属構造体を配置した領域
４０３反応チャンバー
４０４温調ユニット
４０５分注ユニット
４０６バルブ
４０７，５０６流路
４０８廃液タンク
５０１カバープレート
５０２検出窓
５０３注入口
５０４排出口
５０５デバイス
５０７，５０８ＹＡＧレーザ光源
５０９，５１０レーザ光
５１１ λ／４板
５１２ダイクロイックミラー
５１３レンズ
５１４プリズム
５１５対物レンズ
５１６光学フィルタ
５１７結像レンズ
５１８２次元ＣＣＤカメラ 101 fluorescent dye molecule 102 unreacted substrate fluorescent dye molecule 103 substrate 104 metal structure 105 probe 201 smooth support base 202, 203, 302, 303 positive resist for electron beam 204, 206, 208, 304 titanium 205, 209, 305 Gold 207, 306 SiO ₂ film 301 Smooth support base 401 Light transmissive support base 402 Area where metal structure is arranged in a grid 403 Reaction chamber 404 Temperature control unit 405 Dispensing unit 406 Valve 407, 506 Flow path 408 Waste liquid Tank 501 Cover plate 502 Detection window 503 Inlet 504 Outlet 505 Device 507, 508 YAG laser light source 509, 510 Laser light 511 λ / 4 plate 512 Dichroic mirror 513 Lens 514 Prism 515 Objective lens 516 Optical filter 517 imaging lens 518 two-dimensional CCD camera

Claims

金属構造体に対して光照射して局在型表面プラズモン場を形成し、
一部を固定した蛍光標識核酸を層流に漂わせ、蛍光標識を前記局在型表面プラズモン場に配置し、
蛍光標識からの蛍光を取得し、核酸を分析する核酸分析方法。 Irradiate the metal structure with light to form a localized surface plasmon field,
Drifting a fluorescently labeled nucleic acid with a part immobilized in a laminar flow, placing the fluorescent label in the localized surface plasmon field,
A nucleic acid analysis method for obtaining fluorescence from a fluorescent label and analyzing the nucleic acid.

請求項１記載の核酸分析方法であって、
前記金属構造体の一部に、前記蛍光標識核酸が固定されていることを特徴とする核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to claim 1, comprising:
A method for nucleic acid analysis, wherein the fluorescently labeled nucleic acid is immobilized on a part of the metal structure.

請求項１記載の核酸分析方法であって、
前記蛍光標識核酸を前記金属構造体に巻きつけて固定していることを特徴とする核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to claim 1, comprising:
A method for nucleic acid analysis, characterized in that the fluorescently labeled nucleic acid is wound around and fixed to the metal structure.

請求項１記載の核酸分析方法であって、
前記金属構造体が、微粒子，錐構造，柱構造、又はサンドイッチ構造であることを特徴とする核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to claim 1, comprising:
The nucleic acid analysis method, wherein the metal structure is a fine particle, a cone structure, a column structure, or a sandwich structure.

請求項１記載の核酸分析方法であって、
前記金属構造体が、金，銀、又は白金から構成されることを特徴とする核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to claim 1, comprising:
The method for nucleic acid analysis, wherein the metal structure is composed of gold, silver, or platinum.

請求項１記載の核酸分析方法であって、
蛍光測定または表面増強ラマン散乱により核酸を分析することを特徴とする核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to claim 1, comprising:
A nucleic acid analysis method comprising analyzing a nucleic acid by fluorescence measurement or surface-enhanced Raman scattering.

請求項１記載の核酸分析方法であって、
層流の流線方向に対して局在プラズモン場が形成されていることを特徴とする核酸分析方法。 The nucleic acid analysis method according to claim 1, comprising:
A method for nucleic acid analysis, characterized in that a localized plasmon field is formed with respect to a laminar streamline direction.

層流を形成するマイクロ流路と、
局在型表面プラズモン場を形成する金属構造体と、
金属構造体に光照射する光源と、
一部を固定した蛍光標識核酸と、
蛍光を検出する検出器と、を備えた核酸分析装置において、
蛍光標識核酸を層流に漂わせ、蛍光標識を前記局在型表面プラズモン場に配置し、蛍光標識からの蛍光を取得し、核酸を分析することを特徴とする核酸分析装置。 A microchannel forming a laminar flow;
A metal structure forming a localized surface plasmon field;
A light source for illuminating the metal structure;
A fluorescently labeled nucleic acid having a part immobilized thereon;
In a nucleic acid analyzer comprising a detector for detecting fluorescence,
A nucleic acid analyzer characterized by drifting a fluorescently labeled nucleic acid in a laminar flow, arranging the fluorescent label in the localized surface plasmon field, acquiring fluorescence from the fluorescent label, and analyzing the nucleic acid.

請求項８記載の核酸分析装置であって、
前記金属構造体の一部に、前記蛍光標識核酸が固定されていることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 8, comprising:
A nucleic acid analyzer, wherein the fluorescently labeled nucleic acid is fixed to a part of the metal structure.

請求項８記載の核酸分析装置であって、
前記蛍光標識核酸を前記金属構造体に巻きつけて固定していることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 8, comprising:
A nucleic acid analyzer characterized in that the fluorescently labeled nucleic acid is wound around and fixed to the metal structure.

請求項８記載の核酸分析装置であって、
前記金属構造体が、微粒子，錐構造，柱構造、又はサンドイッチ構造であることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 8, comprising:
The nucleic acid analyzer, wherein the metal structure is a fine particle, a cone structure, a column structure, or a sandwich structure.

請求項８記載の核酸分析装置であって、
前記金属構造体が、金，銀、又は白金から構成されることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 8, comprising:
The nucleic acid analyzer, wherein the metal structure is made of gold, silver, or platinum.

請求項８記載の核酸分析装置であって、
蛍光測定または表面増強ラマン散乱により核酸を分析することを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 8, comprising:
A nucleic acid analyzer characterized by analyzing a nucleic acid by fluorescence measurement or surface enhanced Raman scattering.

請求項８記載の核酸分析装置であって、
層流の流線方向に対して局在プラズモン場が形成されていることを特徴とする核酸分析装置。 The nucleic acid analyzer according to claim 8, comprising:
A nucleic acid analyzer characterized in that a localized plasmon field is formed in a laminar streamline direction.