JP2009128093A - 生理活性物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合した高分子物質を表面に有する不溶性担体に抗体を固定化させて、抗原となる生理活性物質を前記抗体と反応させ、反応した抗体−抗原複合体に酵素を導入し、酵素の働きにより発色基質を発色させ、発色の度合いにより検出対象の生理活性物質の含有状況を判定する生理活性物質の検出方法。
【選択図】 なし
Description
(1)アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(C)を共重合した高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
(a)前記不溶性担体表面に抗体を固定化させて抗体固定化担体を作製する工程、
(b)前記抗体固定化担体上に抗原となる生理活性物質を含有する溶液を添加し、前記抗体と反応させる工程、
(c)反応した抗体−抗原複合体に酵素を含む物質を結合させる工程、
(d)発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、
を含み、発色の度合いにより工程(b)における溶液中の生理活性物質の含有状況を判定することを特徴とする生理活性物質の検出方法、
(2)前記の工程に加えて、
(b−2)反応した抗体−抗原複合体にさらに二次抗体を含有する溶液を添加し、前記複合体と反応させる工程、
を含む(1)記載の生理活性物質の検出方法、
(3)工程(b−2)において、二次抗体にあらかじめビオチンが標識されていて、工程(c)において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、抗体−抗原複合体に酵素を標識するものである(2)記載の生理活性物質の検出方法、
(4)抗体−抗原複合体に標識される酵素が酸化又は還元酵素である(1)〜(3)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(5)標識される酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである(1)〜(4)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(6)工程(a)において抗体が、前記担体表面と共有結合して固定化されるものである(1)〜(5)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(7)アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)が下記の一般式[1]で表されるモノマーである(1)〜(6)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(8)前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)がメトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートである(7)記載の生理活性物質の検出方法、
(9)前記メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が3〜100である(8)記載の生理活性物質の検出方法、
(10)生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)の官能基がアルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である(1)〜(9)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(11)生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)が下記の一般式[2]で表される活性エステルを有するモノマーである(1)〜(9)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(12)前記活性エステルがp−ニトロフェニルエステル又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである(10)または(11)記載の生理活性物質の検出方法、
(13)架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(C)の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び(メタ)アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である(1)〜(12)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(14)架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(C)が下記の一般式[3]で表されるアルコキシシリルを有するモノマーである(1)〜(12)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(15)発色した色素が抗体または抗原およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする(1)〜(14)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(16)発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする(1)〜(15)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(17)前記抗体が担体表面にスポット状に固定化されている(1)〜(16)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(18)複数種の抗体のスポットが担体表面の同一区画中に存在している(17)記載の生理活性物質の検出方法、
(19)担体の形状がスライドグラス状、96穴プレート状、384穴プレート状、1536穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器及びそれらの複合体よりなる群より選択された少なくとも1つである(1)〜(18)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(20)担体の材質がプラスチックである(1)〜(19)いずれか記載の生理活性物質の検出方法、
(21)プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも1種である(20)記載の生理活性物質の検出方法、
である。
抗体を溶解または分散した液体のpHは8〜10であることが好ましく、pH9.0〜9.9がより好ましい。固定化後は、固定化されなかった生理活性物質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することが好ましい。
又、抗体が担体表面にスポット状に固定化されていることが好ましく、更には複数種の抗体のスポットが担体表面の同一区画中に存在していることが好ましい。
本発明において、生理活性物質を溶解または分散した液体のpHは6.0〜7.6であることが好ましい。pHが6.0を下回ると、酸により検出する生理活性物質が変性する恐れがあり好ましくない。また、pHが7.6を超えた場合も、アルカリにより検出する生理活性物質が変性する恐れがあり好ましくない。
(実施例)
飽和環状ポリオレフィン樹脂(5−メチル−2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、MFR(Melt flow rate):21g/10分、水素添加率:実質的に100%、熱変形温度123℃)をスライドガラス形状(寸法:76mm×26mm×1mm)に加工して固相基板を作成した。この固相基板をポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート)−p−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート−3−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン(PEGMA−MEONP−MPDES、各基はモル%で92:3:5)の0.3重量%エタノール溶液に浸漬、65℃、4時間加熱乾燥することにより、基板表面にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、活性エステル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合した高分子物質を含む層を導入した基板を得た。
飽和環状ポリオレフィン樹脂(5−メチル−2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、MFR(Melt flow rate):21g/10分、水素添加率:実質的に100%、熱変形温度123℃)をスライドガラス形状(寸法:76mm×26mm×1mm)に加工して固相基板を作成した。この固相基板に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に5重量%の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に2時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS(−)中に2重量%の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、4時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板を得た。
次に、実施例および比較例で得られた基板に、pH9.5の炭酸バッファーで0.5mg/mLの濃度に調製したラット由来抗マウスIgG2a抗体溶液をマイクロピペッターを用いて点着させた。この基板を室温で24時間静置して固定化させた。その後、各々の基板についてブロッキング処理を施し、0.05%Tween20含有のPBSで洗浄を行った。
次に、上記基板表面に、表1に示した各抗原濃度でマウスIgG2a溶液を展開し、湿度99%、37℃で1時間静置して抗原抗体反応を起こさせ、0.05%Tween20含有のPBSで洗浄を行った。
次に、上記基板表面に、0.5μg/mLの濃度に調製したビオチン標識抗マウスIgG2a抗体溶液を展開し、湿度99%、37℃で1時間静置して抗原抗体反応を起こさせ、0.05%Tween20含有のPBSで洗浄を行った。
次に、上記基板表面に、ストレプトアビジンを標識したアルカリフォスファターゼ溶液を展開し、湿度99%、37℃で30分静置して反応を起こさせ、0.05%Tween20含有のPBSで洗浄を行った。
続いて、BCIP/NBT溶液に基板を浸漬させ、37℃で30分間静置した後、純水で洗浄した。比較例では抗体の点着部分の着色は肉眼ではほとんど観察できないが、実施例では明確に点着部分への着色が観察できた。基板の抗体の点着部分の着色像をCCDカメラにより取り込み、取り込んだデジタルデータを画像処理ソフト(NIHイメージ)により処理し、着色度合いを数値化した。結果を表1に示す。
Claims (21)
- アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)及び架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(C)を共重合した高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
(a)前記不溶性担体表面に抗体を固定化させて抗体固定化担体を作製する工程、
(b)前記抗体固定化担体上に抗原となる生理活性物質を含有する溶液を添加し、前記抗体と反応させる工程、
(c)反応した抗体−抗原複合体に酵素を含む物質を結合させる工程、
(d)発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、
を含み、発色の度合いにより工程(b)における溶液中の生理活性物質の含有状況を判定することを特徴とする生理活性物質の検出方法。 - 前記の工程に加えて、
(b−2)反応した抗体−抗原複合体にさらに二次抗体を含有する溶液を添加し、前記複合体と反応させる工程、
を含む請求項1記載の生理活性物質の検出方法。 - 工程(b−2)において、二次抗体にあらかじめビオチンが標識されていて、工程(c)において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、抗体−抗原複合体に酵素を標識するものである請求項2記載の生理活性物質の検出方法。
- 抗体−抗原複合体に標識される酵素が酸化又は還元酵素である請求項1〜3いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 標識される酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである請求項1〜4いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 工程(a)において抗体が、前記担体表面と共有結合して固定化されるものである請求項1〜5いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(A)がメトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートである請求項7記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が3〜100である請求項8記載の生理活性物質の検出方法。
- 生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(B)の官能基がアルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求項1〜9いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記活性エステルがp−ニトロフェニルエステル又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求項10または11記載の生理活性物質の検出方法。
- 架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー(C)の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、及び(メタ)アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求項1〜12いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 発色した色素が抗体または抗原およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする請求項1〜14いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする請求項1〜15いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 前記抗体が担体表面にスポット状に固定化されている請求項1〜16いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 複数種の抗体のスポットが担体表面の同一区画中に存在している請求項17記載の生理活性物質の検出方法。
- 担体の形状がスライドグラス状、96穴プレート状、384穴プレート状、1536穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、容器及びそれらの複合体よりなる群より選択された少なくとも1つである請求項1〜18いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- 担体の材質がプラスチックである請求項1〜19いずれか記載の生理活性物質の検出方法。
- プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも1種である請求項20記載の生理活性物質の検出方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013530400A (ja) * | 2010-06-14 | 2013-07-25 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | アッセイ試薬として使用するための組成物 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006101798A2 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-28 | Sumitomo Bakelite Company Ltd. | Polymer compound for biomedical use and biochip substrate using such a polymer compound |
JP2006322739A (ja) * | 2005-05-17 | 2006-11-30 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 遺伝子の検出方法 |
JP2006349552A (ja) * | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Hipep Laboratories | バイオチップ用基板及びバイオチップ |
JP2007155691A (ja) * | 2005-12-08 | 2007-06-21 | Summit Pharmaceuticals International Corp | 物質の測定方法ならびに測定用組成物 |
-
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006101798A2 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-28 | Sumitomo Bakelite Company Ltd. | Polymer compound for biomedical use and biochip substrate using such a polymer compound |
JP2006258458A (ja) * | 2005-03-15 | 2006-09-28 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板 |
JP2006322739A (ja) * | 2005-05-17 | 2006-11-30 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 遺伝子の検出方法 |
JP2006349552A (ja) * | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Hipep Laboratories | バイオチップ用基板及びバイオチップ |
JP2007155691A (ja) * | 2005-12-08 | 2007-06-21 | Summit Pharmaceuticals International Corp | 物質の測定方法ならびに測定用組成物 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013530400A (ja) * | 2010-06-14 | 2013-07-25 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | アッセイ試薬として使用するための組成物 |
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