JP2009124990A - Method for determining antigen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出・定量する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting and quantifying trace antigens in blood adhering to dry blood-adhering fibers.
疾患の診断などで、血液中の抗原濃度を測定する場合、濾紙血が用いられることがある。血液を滴下した濾紙を乾燥させることによって、採血や血液の取り扱いが容易になる上に、必要な血液は少量で足りる。従って、多量のサンプルを扱うマススクリーニングや、自己採血した検査サンプルの郵送等に濾紙血は効果を発揮する。 When measuring the antigen concentration in the blood for disease diagnosis or the like, filter paper blood may be used. By drying the filter paper onto which the blood has been dropped, blood collection and blood handling become easy, and a small amount of blood is sufficient. Therefore, filter paper blood is effective for mass screening for handling a large amount of samples and mailing of self-collected test samples.
しかしながら、濾紙に付着した血液は少量であること、乾燥した血液は濾紙に吸着され、血液中の成分を回収するのは容易ではないこと、特に、血液中の抗原は非常に少量である場合があり、従来のELISA法などでは、検出できないことも多かった。 However, the amount of blood adhering to the filter paper is small, the dried blood is adsorbed on the filter paper, and it is not easy to recover the components in the blood. In particular, the antigen in the blood may be very small. There were many cases that could not be detected by the conventional ELISA method.
そこで、本発明は、乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出・定量する方法を提供することを目的とする。 Then, an object of this invention is to provide the method of detecting and quantifying the trace amount antigen in the blood adhering to the dry blood adhesion fiber.
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）乾燥血液付着繊維に付着した血液中の抗原を検出する方法であって、前記繊維を緩衝液に浸す工程と、前記緩衝液を回収する工程と、標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、
を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、前記検出工程は、前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A method for detecting an antigen in blood attached to a dried blood-attached fiber, the step of immersing the fiber in a buffer solution, the step of recovering the buffer solution, an oligonucleotide chain as a label, and the antigen A step of contacting the antigen with an oligonucleotide complex antibody having an antibody that specifically binds to the antigen to form an antigen-antibody complex, and a detection step of detecting the oligonucleotide chain in the antigen-antibody complex When,
The oligonucleotide-conjugated antibody includes a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain, and the detecting step cleaves and collects the oligonucleotide chain at the cleavage site, and the collected oligonucleotide A method comprising: amplifying a strand; and detecting the amplified oligonucleotide strand.
（２）前記オリゴヌクレオチド鎖は、アダプター部分を含み、少なくとも前記アダプター部分を介して前記抗体に固定される、（１）に記載の方法。 (2) The method according to (1), wherein the oligonucleotide chain includes an adapter moiety and is immobilized to the antibody through at least the adapter moiety.
（３）前記オリゴヌクレオチド鎖の切り離しが、制限酵素、光照射、または活性酸素によって行われる、（１）または（２）に記載の方法。 (3) The method according to (1) or (2), wherein the cleavage of the oligonucleotide chain is performed by a restriction enzyme, light irradiation, or active oxygen.
（４）前記アダプター部分が二次抗体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。 (4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the adapter moiety is a secondary antibody.
（５）前記アダプター部分が、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。 (5) Any one of (1) to (3), wherein the adapter portion is at least one selected from the group consisting of protein G, protein A, protein L, and a fusion protein of protein A and protein G. The method according to item.
（６）乾燥血液付着繊維に付着した血液中の複数の抗原を識別して検出する方法であって、前記繊維を緩衝液に浸す工程と、前記緩衝液を回収する工程と、各抗原に特異的に結合する抗体と、当該抗体に結合する結合部位を有し、抗原の種類に対応するオリゴヌクレオチド鎖を混合して、前記抗体と前記オリゴヌクレオチドとを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ形成させる工程と、形成した前記オリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ精製した後で混合する工程と、前記緩衝液中の複数の前記抗原と、前記混合したオリゴヌクレオチド複合抗体とを接触させて当該抗原と当該抗原に特異的に結合する当該抗体を含む当該オリゴヌクレオチド複合抗体との抗原抗体複合体を形成させる工程と、前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程、を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体が、当該オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有し、前記検出工程が、前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。 (6) A method for identifying and detecting a plurality of antigens in blood adhering to dry blood-adhering fibers, the step of immersing the fibers in a buffer solution, the step of recovering the buffer solution, and a method specific to each antigen And an oligonucleotide chain corresponding to the type of antigen are mixed to form an oligonucleotide composite antibody containing the antibody and the oligonucleotide, respectively. A step of purifying each of the formed oligonucleotide-conjugated antibodies after purification, contacting the plurality of antigens in the buffer solution with the mixed oligonucleotide-conjugated antibodies, and Forming an antigen-antibody complex with the oligonucleotide-conjugated antibody containing the antibody that specifically binds, and the oligo in the antigen-antibody complex A detection step of detecting a nucleotide chain, wherein the oligonucleotide conjugate antibody has a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain, and the detection step cleaves the oligonucleotide chain at the cleavage site and collects it. A step of amplifying the oligonucleotide chain, and detecting the amplified oligonucleotide chain.
（７）乾燥血液付着繊維に付着した血液検体中の抗原を定量する方法であって、前記繊維を緩衝液に浸す工程と、前記緩衝液を回収する工程と、標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、当該抗原を事実上含有しない血液に、複数の既知濃度の当該抗原を添加し、前記血液検体と同様にして前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出することにより検量線を作成する工程と、前記血液検体によって得られた前記オリゴヌクレオチド鎖の量を、前記検量線より特定する工程と、
を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、前記検出工程は、前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。
(7) A method for quantifying an antigen in a blood sample attached to a dry blood-attached fiber, the step of immersing the fiber in a buffer solution, the step of recovering the buffer solution, the oligonucleotide chain as a label, and the A step of contacting an oligonucleotide-conjugated antibody having an antibody that specifically binds to an antigen and the antigen to form an antigen-antibody complex; and a detection for detecting the oligonucleotide chain in the antigen-antibody complex And a step of adding a plurality of known concentrations of the antigen to blood that does not substantially contain the antigen, and detecting the oligonucleotide chain in the antigen-antibody complex in the same manner as the blood sample. Creating, and identifying the amount of the oligonucleotide chain obtained by the blood sample from the calibration curve;
The oligonucleotide-conjugated antibody includes a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain, and the detecting step cleaves and collects the oligonucleotide chain at the cleavage site, and the collected oligonucleotide A method comprising: amplifying a strand; and detecting the amplified oligonucleotide strand.
（８）繊維が濾紙であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。 (8) The method according to any one of (1) to (7), wherein the fiber is filter paper.
（９）血液中の抗原の検出用キットであって、繊維と、オリゴヌクレオチド鎖と、各抗原に特異的に結合する抗体とを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を含み、前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有する、キット。 (9) A kit for detecting an antigen in blood, comprising an oligonucleotide conjugate antibody comprising a fiber, an oligonucleotide chain, and an antibody that specifically binds to each antigen, wherein the oligonucleotide conjugate antibody comprises: A kit having a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain.
（１０）繊維が濾紙であることを特徴とする（９）に記載のキット。 (10) The kit according to (9), wherein the fiber is filter paper.
本発明によって、乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出・定量する方法を提供することができるようになった。 According to the present invention, it has become possible to provide a method for detecting and quantifying a small amount of antigen in blood adhering to a dry blood-adhering fiber.
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
Hereinafter, embodiments of the present invention completed based on the above findings will be described in detail with reference to examples. Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Standard Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝乾燥血液付着繊維に付着した血液中の微量抗原を検出する方法＝＝
本発明の検出方法は、
（１）乾燥血液付着繊維から血液を回収する工程
（２）回収した血液中の抗原を検出する工程
を含む。
== Method for detecting trace antigens in blood adhering to dry blood-attached fibers ==
The detection method of the present invention comprises:
(1) The process of collect | recovering blood from dry blood adhesion fiber (2) The process of detecting the antigen in the collect | recovered blood is included.
ここで、検査対象とする血液は、特に限定されないが、本発明が超微量抗原を検出できることを利用し、新生児の血液を対象とするのが好ましい。新生児からは採血が困難であり、微量の血液しか採取できず、本発明の方法を用いることにより、これまで不可能であった新生児血液に含まれる微量抗原の検出が可能になるからである。 Here, the blood to be examined is not particularly limited, but it is preferable to use the blood of a newborn by utilizing the fact that the present invention can detect an ultra-trace antigen. This is because it is difficult to collect blood from a newborn, and only a very small amount of blood can be collected. By using the method of the present invention, it is possible to detect a small amount of antigen contained in neonatal blood, which has been impossible until now.
本発明の検出方法によれば、糸、濾紙、ニトロセルロース、ナイロンメンブレン、布などの繊維に付着して乾燥した血液から回収した抗原を検出、定量できる。ここで繊維とは、毛細管現象で液体を吸収できるものであれば、特に限定されないが、コストや簡便さの点で繊維膜を使用するのが好ましく、濾紙を用いるのがより好ましい。以下、各工程を詳細に説明する。 According to the detection method of the present invention, it is possible to detect and quantify antigens recovered from blood that has adhered to and dried on fibers such as yarn, filter paper, nitrocellulose, nylon membrane, and cloth. Here, the fiber is not particularly limited as long as it can absorb liquid by capillary action, but it is preferable to use a fiber membrane in terms of cost and simplicity, and more preferable to use filter paper. Hereinafter, each process will be described in detail.
（１）乾燥血液付着繊維から血液を回収する工程
乾燥血液付着繊維を緩衝液に浸し、３０〜６０分、４〜２０℃で処理することにより、繊維に付着した血中の成分を緩衝液に溶出させた後、緩衝液を回収する。溶出処理の間、静置していても振とうしても構わない。
(1) Step of recovering blood from dried blood-attached fibers Dipped blood-attached fibers in a buffer solution and treated at 4 to 20 ° C. for 30 to 60 minutes, thereby converting blood components attached to the fibers into a buffer solution. After elution, the buffer is recovered. During the elution process, it may be left still or shaken.
（２）回収した血液中の抗原を検出する工程
（２−１）オリゴヌクレオチド複合抗体の形成
次に、回収した緩衝液中の抗原と、標識としてのオリゴヌクレオチド鎖を有する、抗原に特異的に結合する抗体と、を接触させて当該抗原と当該抗体を含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を形成させる。
(2) Step of detecting antigen in the collected blood (2-1) Formation of oligonucleotide conjugate antibody Next, the antigen in the collected buffer and the oligonucleotide chain as a label are specific to the antigen. An antibody to be bound is brought into contact with each other to form an oligonucleotide complex antibody containing the antigen and the antibody.
オリゴヌクレオチド鎖は、抗体に直接結合していてもよいが、アダプター部分を介して抗体に固定されるのが好ましい。アダプター部分を介した固定によりオリゴヌクレオチド複合抗体の構造安定性を一層高めることができ、得られる複合体の収率をより向上させるとともに、ひいては検出感度や検出効果を高める等の効果が得られる。アダプター部分としては、抗体に結合できるものなら特に限定されず、例えば、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、及びプロテインＡとプロテインＧとの融合タンパク質等や、抗イミュノグロブリン抗体（抗IgG抗体）のような二次抗体等が例示される。 The oligonucleotide chain may be directly bound to the antibody, but is preferably fixed to the antibody via an adapter moiety. The structural stability of the oligonucleotide conjugate antibody can be further enhanced by immobilization via the adapter moiety, and the yield of the resulting conjugate can be further improved, and as a result, the detection sensitivity and the detection effect can be increased. The adapter moiety is not particularly limited as long as it can bind to the antibody. For example, protein G, protein A, protein L, a fusion protein of protein A and protein G, anti-immunoglobulin antibody (anti-IgG antibody) Secondary antibodies such as are exemplified.
アダプター部分を含むオリゴヌクレオチド複合抗体の調製方法としては、限定はされないが、（i）まず、アダプター部分に標識部分となるオリゴヌクレオチド鎖等を結合させ、（ii）次いで、アダプター部分を抗体に固定する方法が好ましい。 The method for preparing an oligonucleotide-conjugated antibody containing an adapter moiety is not limited. (I) First, an oligonucleotide chain or the like that becomes a label moiety is bound to the adapter moiety, and (ii) the adapter moiety is then immobilized on the antibody. Is preferred.
例えば、（i）として、アダプター部分をアビジン修飾し、標識部分となるオリゴヌクレオチド鎖等をビオチン化して、両者を混合することにより、オリゴペプチド鎖等をアダプター部分に結合させることができる。あるいは、予めアダプター部分及びオリゴペプチド鎖等をいずれもビオチン化しておき、当該アダプター部分とオリゴペプチド鎖等とを混合すると共にアビジンを添加することで、アビジンを介してオリゴペプチド鎖等をアダプター部分に結合させることもできる。なお、前者の手法の場合、アダプター部分のアビジン修飾は、まずリンカー化合物をアダプター部分と結合反応させた後、当該化合物にアビジンを結合させてもよい。ここで使用されるアダプター部分がプロテインＡ、ＧまたはＬ等の場合は、リンカー化合物として、例えば「Sulhsuccinimidy1 4-（N・maleimidomethyl）cyclohexane−1−carboxylate （Sulfo・SMCC）」等を好ましく用いることができる For example, as (i), the oligopeptide chain can be bound to the adapter portion by avidin-modifying the adapter portion, biotinylating the oligonucleotide chain or the like that becomes the labeling portion, and mixing both. Alternatively, the adapter part and the oligopeptide chain are both biotinylated in advance, and the adapter part and the oligopeptide chain are mixed together and added with avidin, so that the oligopeptide chain and the like are converted into the adapter part via avidin. It can also be combined. In the former method, the avidin modification of the adapter part may be performed by first binding the linker compound to the adapter part and then binding avidin to the compound. When the adapter moiety used here is protein A, G or L, for example, “Sulhsuccinimidy14- (N · maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo · SMCC)” or the like is preferably used as the linker compound. it can
次に、（ii）においては、アダプター部分と抗体とが結合反応性を有する場合は、（i）で得られたアダプター部分／標識部分結合体と抗体とを混合することで、オリゴヌクレオチド複合抗体等の各種複合体を得ることができる。また、アダプター部分と結合物質とが、もともと結合反応性を有しない場合は、例えば、両者をビオチン化しておきアビジン存在下で混合するなど、（i）において採用し得る手法と同様の手法を用いて複合体を得ることができる。 Next, in (ii), when the adapter moiety and the antibody have binding reactivity, the oligonucleotide conjugate antibody is obtained by mixing the adapter moiety / labeled moiety conjugate obtained in (i) and the antibody. And various other complexes can be obtained. In addition, when the adapter part and the binding substance do not have binding reactivity originally, for example, a method similar to the method that can be adopted in (i) is used, such as biotinylation of both and mixing in the presence of avidin. To obtain a complex.
こうして得られたオリゴヌクレオチド複合抗体は、抗原と反応させる前に精製しておくのが好ましい。その方が、フリーの抗体等による非特異的反応が生じないので、検出感度が向上するからである。オリゴヌクレオチド複合抗体の精製方法は、特に限定されないが、通常のゲル濾過などで行うことができる。 The oligonucleotide conjugate antibody thus obtained is preferably purified before reacting with the antigen. This is because non-specific reaction due to free antibody or the like does not occur, and detection sensitivity is improved. The method for purifying the oligonucleotide conjugate antibody is not particularly limited, but can be performed by ordinary gel filtration or the like.
（２−２）抗原抗体複合体の形成
次に、（１）で得られた血液中の成分を含有する緩衝液中の抗原と、（２−１）で得られたオリゴヌクレオチド複合抗体とを接触させて抗原抗体複合体を形成させる。
(2-2) Formation of antigen-antibody complex Next, the antigen in the buffer containing the components in blood obtained in (1) and the oligonucleotide conjugate antibody obtained in (2-1) Contact to form an antigen-antibody complex.
その方法は特に限定されないが、例えば、抗原を支持体に固定化し、抗体を抗原に結合させることにより、抗体を支持体に結合させる。その後、緩衝液で洗浄することにより、未反応の抗体を除去することができ、高純度の抗原抗体複合体を得ることができる。この支持体には、プラスティックの底面やビーズなどを用いることができる。また、抗原を支持体に固定化するのに、抗原を支持体に直接結合させても、間接的に結合させても構わない。直接結合させる場合は、血液成分を含む緩衝液を支持体と接触させればよく、間接的に結合させる場合は、支持体に、抗原が結合する物質（例えば、抗体等）を予め結合させ、そこに血液成分を含む緩衝液を支持体と接触させればよい。特異性を高めるためには、後者の間接結合が好ましい。 The method is not particularly limited. For example, the antibody is bound to the support by immobilizing the antigen on the support and binding the antibody to the antigen. Thereafter, the unreacted antibody can be removed by washing with a buffer, and a highly pure antigen-antibody complex can be obtained. For this support, the bottom of a plastic, beads, or the like can be used. Further, in order to immobilize the antigen on the support, the antigen may be directly bound to the support or indirectly bound. In the case of direct binding, a buffer containing a blood component may be brought into contact with the support. In the case of indirect binding, a substance (for example, an antibody or the like) that binds to the antigen is bound to the support in advance. A buffer containing a blood component may be brought into contact with the support. In order to increase specificity, the latter indirect binding is preferable.
（２−３）オリゴヌクレオチド鎖の検出
上述のオリゴヌクレオチド複合抗体は、オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含む。この切断部位は、オリゴヌクレオチド、抗体、アダプターのいずれに設けられてもよいが、その特性によって、切断方法が異なる。例えば、オリゴヌクレオチドに設ける時は、制限酵素による切断部位、抗体やタンパク質のアダプターに設ける時は、プロテアーゼによる切断部位、アダプターとしてクロスリンカー（２価の架橋剤等）を設ける時は光照射や活性酸素によるによる切断部位などが挙げられる。しかし、簡便さと特異性の面で、オリゴヌクレオチドに制限酵素による切断部位を設けるのが好ましい。
(2-3) Detection of oligonucleotide chain The above-mentioned oligonucleotide conjugate antibody includes a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain. This cleavage site may be provided in any of oligonucleotide, antibody, and adapter, but the cleavage method differs depending on the characteristics. For example, when it is provided on an oligonucleotide, it is cleaved by a restriction enzyme, when it is provided on an antibody or protein adapter, when it is cleaved by a protease, and when a crosslinker (such as a bivalent cross-linking agent) is provided as an adapter, light irradiation or activity Examples include a site cut by oxygen. However, in terms of simplicity and specificity, it is preferable to provide a restriction enzyme cleavage site in the oligonucleotide.
そして、オリゴヌクレオチド鎖の検出をするために、この切断部位で抗原抗体複合体からオリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する。この回収工程によって、オリゴヌクレオチド鎖の検出前に濃縮することができ、より少量のオリゴヌクレオチド鎖も検出可能になる。 In order to detect the oligonucleotide chain, the oligonucleotide chain is separated from the antigen-antibody complex at this cleavage site and collected. This recovery step allows concentration prior to detection of the oligonucleotide strands and allows detection of smaller amounts of oligonucleotide strands.
このようにして回収されたオリゴヌクレオチド鎖を増幅し、検出する。増幅方法は、常法に従えばよく、PCR法、LAMP法、ICAN法などを用いることが出来る。また、検出も、常法に従えばよく、電気泳動法などを用いればよいが、オリゴヌクレオチド鎖に放射性同位元素や酵素などでラベルしておき、それらをマーカーにして検出することも可能である。 The oligonucleotide chain thus recovered is amplified and detected. The amplification method may be a conventional method, and PCR method, LAMP method, ICAN method and the like can be used. The detection may be carried out in accordance with a conventional method, and electrophoresis may be used. However, it is also possible to detect the oligonucleotide chain by labeling it with a radioisotope or an enzyme and using them as a marker. .
＝＝血液中の複数の抗原を同時に検出する方法＝＝
血液中の複数の抗原を同時に検出するために、各抗原に特異的に結合する抗体と、抗原の種類に一対一で対応するオリゴヌクレオチド鎖とを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を用いることにより、各抗原を各オリゴヌクレオチド鎖と対応できるようにする。それによって、各オリゴヌクレオチド鎖を検出することで各抗原を個別に検出することができる。
== Method for simultaneously detecting a plurality of antigens in blood ==
In order to simultaneously detect a plurality of antigens in the blood, by using an oligonucleotide composite antibody containing an antibody that specifically binds to each antigen and an oligonucleotide chain that corresponds one-to-one with the type of antigen, Allow the antigen to correspond to each oligonucleotide chain. Thereby, each antigen can be detected individually by detecting each oligonucleotide chain.
この工程において、各抗原に対する特異的なオリゴヌクレオチド複合抗体を得るには、それぞれのオリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ形成した後、精製しておく必要があり、使用する際には、各オリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ混合すればよい。 In this step, in order to obtain a specific oligonucleotide conjugate antibody against each antigen, each oligonucleotide conjugate antibody must be formed and then purified, and when used, each oligonucleotide conjugate antibody is used. May be mixed together.
あるいは、もし、抗体が異なる動物種で作製された時には、アダプターとして、各抗体に特異的に反応する抗IgG抗体を用いることにより、各オリゴヌクレオチド複合抗体を精製しなくても、各オリゴヌクレオチド複合抗体は一対一の対応で特異的に抗原に結合し得る。この場合、予め各オリゴヌクレオチド複合抗体を作製するのではなく、抗原に抗体を結合させ、そこにオリゴヌクレオチドを結合させたアダプターである二次抗体を、順に結合させることも可能になる。 Alternatively, if the antibody is produced in a different animal species, an anti-IgG antibody that specifically reacts with each antibody is used as an adapter, so that each oligonucleotide conjugate can be obtained without purification. Antibodies can specifically bind to antigens in a one-to-one correspondence. In this case, instead of preparing each oligonucleotide conjugate antibody in advance, it is also possible to bind an antibody to an antigen, and a secondary antibody, which is an adapter to which the oligonucleotide is bound, in that order.
なお、異なる抗原に対応するオリゴヌクレオチド鎖は、配列を変えることで特異性を持たせてもよく、長さを変えることで特異性を持たせてもよい。後者の場合、ＤＮＡ増幅のためのプライマーを共通にすることも可能になる。また、各オリゴヌクレオチド鎖に、異なる種類の標識（例えば、酵素の場合、アルカリホスファターゼとＨＲＰというように）でラベルすることにより、特異性を持たせることもできる。 The oligonucleotide chains corresponding to different antigens may have specificity by changing the sequence, or may have specificity by changing the length. In the latter case, it is possible to use a common primer for DNA amplification. In addition, each oligonucleotide chain can be given specificity by labeling with a different type of label (for example, alkaline phosphatase and HRP in the case of an enzyme).
＝＝乾燥血液付着繊維に付着した血液中の抗原を定量する方法＝＝
上述した抗原検出方法を用いて、検出対象の抗原を定量することもできる。そのためには、その抗原を事実上含有しない血液に、複数の既知濃度の抗原を添加し、上述した血液検体の場合と同様にしてオリゴヌクレオチド鎖を検出する。この時、抗原の量に従って、それに結合するオリゴヌクレオチド鎖も増えるため、オリゴヌクレオチド鎖を定量すれば、存在する抗原の量と相関性を持たせることが可能になる。この相関性を利用して作製した検量線に対し、血液検体によって得られたオリゴヌクレオチド鎖の量をあてはめることにより、検体に存在する抗原を定量することが可能になる。
== Method for quantifying antigens in blood adhering to dry blood-attached fibers ==
The antigen to be detected can also be quantified using the antigen detection method described above. For this purpose, a plurality of antigens having a known concentration are added to blood that does not substantially contain the antigen, and the oligonucleotide chain is detected in the same manner as in the blood sample described above. At this time, the number of oligonucleotide chains bound to the antigen increases according to the amount of the antigen. Therefore, if the oligonucleotide chain is quantified, it can be correlated with the amount of the antigen present. By applying the amount of the oligonucleotide chain obtained from the blood sample to the calibration curve prepared using this correlation, the antigen present in the sample can be quantified.
本実施例では、遺伝病であるFabry 病、Gaucher病、Pompe病の各疾患に関する欠損若しくは不活化酵素 であるα-Galactosidase （以下α-Gal）、β-Glucocerebrosidase （以下GCR）、acid-α-Glucosidase （以下GAA)) を濾紙血から抽出し、MUSTagにより検出・定量することができることを示す。 In this example, α-Galactosidase (hereinafter referred to as α-Gal), β-Glucocerebrosidase (hereinafter referred to as GCR), acid-α- It shows that Glucosidase (GAA) can be extracted from filter paper blood and detected and quantified by MUSTag.
（１）オリゴヌクレオチド複合抗体の調整
本実施例では、オリゴヌクレオチド複合抗体としてMUSTagを用いた。以下、その作製方法を説明する。
(1) Preparation of oligonucleotide conjugate antibody In this example, MUSTag was used as the oligonucleotide conjugate antibody. Hereinafter, the manufacturing method will be described.
（１−１）オリゴヌクレオチドの合成
まず、１つ目の 131merのオリゴヌクレオチドは、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合したプライマー１（配列番号１）、３’プライマーとして、プライマー２（配列番号２）を使用し、鋳型１（配列番号3）を使用して、ＰＣＲにより合成した。２つ目の136merのオリゴヌクレオチドは、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合したプライマー１（配列番号１）３’プライマーとして、プライマー２（配列番号２）を使用し、鋳型２（配列番号4）を使用して、同様に合成した。３つ目の161merのオリゴヌクレオチドは、５’プライマーとして、３’末端にビオチンが結合したプライマー１（配列番号１）３’プライマーとして、プライマー２（配列番号２）を使用し、鋳型３（配列番号５）を使用して、同様に合成した。各ＰＣＲ後の増幅産物は、MinElute PCR Purification spin column（キアゲン社製）又はMiniprepカラム（Invitrogen社製）を用いて精製した。以下に、プライマーの配列及び反応条件を示す。
プライマー１：CTTACTGGCTTATCGAAA（配列番号１）
プライマー２：GGCAAGCCACGTTTGGTG（配列番号２）
鋳型１：CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCACCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGCACACCAAACGTGGCTTGCC（配列番号３）
鋳型２：CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCAATCAGCCTCGACTGTGCCTTCgcaGCAtgGCACACCAAACGTGGCTTGCC (配列番号４）
鋳型３：CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCAACCGACAATTGCATGAAGAAcTCGCACATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAcCACCAAACGTGGCTTGCC（配列番号５）
反応条件：
〈反応液組成〉
鋳型DNA（100μg/μL）： １μL
Taq polymerase： 2.5u
プライマー（各20μM）： 2μL x2
dNTP（各2．5mM）： 8μL
10×Buffer： 10μL
滅菌水： 77μL（合計 100μL）
〈条件〉
「95℃・１分間→55℃・１分間→72℃・３０秒間」
を1サイクルとして30サイクル。
(1-1) Oligonucleotide Synthesis First, the first 131-mer oligonucleotide was used as a 5 ′ primer, primer 1 (SEQ ID NO: 1) having biotin bound to the 3 ′ end, and primer 2 ( SEQ ID NO: 2) was used and synthesized by PCR using template 1 (SEQ ID NO: 3). The second 136-mer oligonucleotide uses primer 2 (SEQ ID NO: 2) as 5 'primer, primer 1 (SEQ ID NO: 1) with biotin bound to the 3' end, and primer 2 (SEQ ID NO: 2) as 3 'primer. No. 4) was used to synthesize in the same way. The third 161-mer oligonucleotide uses primer 1 (SEQ ID NO: 2) as 5 'primer, primer 1 (SEQ ID NO: 1) with biotin bound to the 3' end, and primer 3 (SEQ ID NO: 2) as template 3 (sequence) No. 5) was used to synthesize in the same way. The amplification product after each PCR was purified using MinElute PCR Purification spin column (Qiagen) or Miniprep column (Invitrogen). The primer sequences and reaction conditions are shown below.
Primer 1: CTTACTGGCTTATCGAAA (SEQ ID NO: 1)
Primer 2: GGCAAGCCACGTTTGGTG (SEQ ID NO: 2)
Template 1: CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCACCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGCACACCAAACGTGGCTTGCC (SEQ ID NO: 3)
Template 2: CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCAATCAGCCTCGACTGTGCCTTCgcaGCAtgGCACACCAAACGTGGCTTGCC (SEQ ID NO: 4)
Template 3: CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATGGAATTCTGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGCATAGTGTCACCTAAATGCTAGGCAACCGACAATTGCATGAAGAAcTCGCACATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAcCACCAAACGTGGCTTGCC (SEQ ID NO: 5)
Reaction conditions:
<Reaction solution composition>
Template DNA (100μg / μL): 1μL
Taq polymerase: 2.5u
Primer (20μM each): 2μL x2
dNTP (each 2.5mM): 8μL
10 × Buffer: 10μL
Sterile water: 77μL (100μL in total)
<conditions>
“95 ℃ ・ 1min → 55 ℃ ・ 1min → 72 ℃ ・ 30sec”
One cycle is 30 cycles.
（１−２）プロテインＧ／アビジン結合体の調製
（i）Maleimide活性化プロテインGの調製
5mgのプロテインＧを、500pLの50mM sodiumphosphate（pH7.4）に溶解した。次いで、50μL ＤＭＳＯに化学修飾剤（chemical linker）としてのSulfosuccinimidy1 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate（以下「Sulfo-SMCC」（PIERCE 50mg，＃22322，Molecular Weight：436.37，Spacer Arm Lengt: 11．6Å）を1mg溶解し、これを上記プロテインＧの溶液に添加した。添加後の溶液を、室温で60分間ゆっくりと撹拝して、プロテインＧとSulfo-SMCCとを反応させ結合させた。なお、当該結合は、Sulfo-SMCCのSulfo-NHSエステル基とプロテインＧとの結合である。
反応後に残った余分なSulfo-SMCCを取り除くために、結合バッファーで平衡化した脱塩カラムを用いて、反応液を500μLずつの分画に分けた。各々の分画における溶出タンパク質（Maleimide活性化プロテインＧ）の濃度を測定し、ピークの画分を採取した。
５kDa pore size filter tubeを用いて、遠心によりMaleimide活性化プロテインＧを濃縮し、溶液の最終容量を500μLに調整した。
(1-2) Preparation of protein G / avidin conjugate (i) Preparation of maleimide activated protein G
5 mg of protein G was dissolved in 500 pL of 50 mM sodium phosphate (pH 7.4). Subsequently, Sulfosuccinimidy1 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (hereinafter “Sulfo-SMCC” (PIERCE 50 mg, # 22322, Molecular Weight: 436.37, Spacer Arm Lengt: 1 mg 1) was dissolved and added to the protein G solution, which was slowly stirred at room temperature for 60 minutes to react and bind protein G and Sulfo-SMCC. In addition, the said coupling | bonding is coupling | bonding of Sulfo-NHS ester group of Sulfo-SMCC and protein G.
In order to remove excess Sulfo-SMCC remaining after the reaction, the reaction solution was divided into 500 μL fractions using a desalting column equilibrated with a binding buffer. The concentration of eluted protein (Maleimide activated protein G) in each fraction was measured, and peak fractions were collected.
Maleimide activated protein G was concentrated by centrifugation using a 5 kDa pore size filter tube, and the final volume of the solution was adjusted to 500 μL.
（ii）アビジンとの結合
バッファー（100mM Na-Phosphate（pH7.6)、5mM ＥＤＴＡ）に、EZ−Link Maleimide Activated NeutroAvidin（PIERCE 5mg，＃31007，60kDa）を溶解させた。この溶液に、Maleimide活性化プロテインＧ溶液を添加した。この添加は、プロテインＧとアビジンとのモル比が１：３程度となるように調整して行った。
混合後の溶液を、40℃で4時間以上（〜一晩）ゆっくりと攪拌しながら反応させた。反応後の溶液を、ゲル濾過カラム（FPLC gel filtration（PC12 column））にかけ、プロテインＧ／アビジン結合体のうち、プロテインＧの１分子に対してアビジンが２又は３分子結合している結合体に相当する分子量の画分を採取した。
(Ii) Binding with avidin EZ-Link Maleimide Activated NeutroAvidin (PIERCE 5 mg, # 31007, 60 kDa) was dissolved in a buffer (100 mM Na-Phosphate (pH 7.6), 5 mM EDTA). To this solution, Maleimide activated protein G solution was added. This addition was carried out by adjusting the molar ratio of protein G and avidin to be about 1: 3.
The mixed solution was reacted at 40 ° C. for 4 hours or longer (˜overnight) with slow stirring. The solution after the reaction is applied to a gel filtration column (FPLC gel filtration (PC12 column)), and among the protein G / avidin conjugates, a conjugate in which two or three molecules of avidin are bound to one molecule of protein G. The corresponding molecular weight fraction was collected.
（１−３）複合抗体の調製
（i）プロテインＧ／アビジン結合体とオリゴヌクレオチド鎖との結合
バッファー（50mM Tris(pH8．0)，1mM EDTA，0.1M NaCl，0.5％ gelatin，0．1％ Tween20）中に、（１−１）で精製して得られた各オリゴヌクレオチド鎖（ビオチン化オリゴ）と、（１−２）で得られたプロテインＧ／アビジン結合体とを、それぞれモル比（ビオチン化オリ：プロテインＧ／アビジン結合体）が１：２程度となるように混合した。混合溶液を、室温で30分間以上撹拝しながら反応（ビオチンーアビジン結合反応）させ、オリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体を得た。
(1-3) Preparation of complex antibody (i) Binding of protein G / avidin conjugate and oligonucleotide chain Buffer (50 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 0.5% gelatin, 0.1% In Tween20), each oligonucleotide chain (biotinylated oligo) obtained by purifying in (1-1) and the protein G / avidin conjugate obtained in (1-2) were each in a molar ratio ( Biotinylated oligo: protein G / avidin conjugate) was mixed so as to be about 1: 2. The mixed solution was reacted (biotin-avidin binding reaction) while stirring at room temperature for 30 minutes or more to obtain an oligonucleotide / protein G conjugate.
（ii）抗体とアダプター部分との結合
バッファー（50mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA，0.1M NaCl，0.5％ gelatin，0.1％ Tween20）中に、オリゴヌクレオチド／プロテインＧ結合体と、各種モノクローナル抗体（全てGenzyme社）とを、それぞれ１：１のモル比となるように混合し、攪拌しながら室温で1時間あるいは4℃で12時間反応させた。具体的には、抗α-Galモノクローナル抗体は131merのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、抗GCRモノクローナル抗体は136merのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合し、抗GAAモノクローナル抗体は161merのオリゴヌクレオチドが結合した上記結合体と混合して、反応させた。各反応液を、それぞれ、5mLの脱塩カラムに通し、目的の画分を回収して、３種のオリゴヌクレオチド複合抗体（以下、それぞれα-Gal#1、Immi#2 、α-Glu#7と称する）を得た。
(Ii) Binding between antibody and adapter part In a buffer (50 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 0.5% gelatin, 0.1% Tween20), an oligonucleotide / protein G conjugate and various monoclonal antibodies (All Genzyme) were mixed at a molar ratio of 1: 1, and allowed to react for 1 hour at room temperature or 12 hours at 4 ° C. with stirring. Specifically, the anti-α-Gal monoclonal antibody is mixed with the conjugate to which 131mer oligonucleotide is bound, the anti-GCR monoclonal antibody is mixed with the conjugate to which 136mer oligonucleotide is bound, and the anti-GAA monoclonal antibody is The mixture was reacted with the above conjugate to which 161mer oligonucleotide was bound. Each reaction solution was passed through a 5 mL desalting column, and the target fraction was collected. Three kinds of oligonucleotide conjugate antibodies (hereinafter referred to as α-Gal # 1, Immi # 2, α-Glu # 7, respectively) Called).
（２）Capture抗体の固相化
抗α-Galモノクローナル抗体、抗-GCRモノクローナル抗体、抗-GAA モノクローナル抗体を0.05M Sodium Carbonate（pH 9.6）でそれぞれ4 μg/mL、4 μg/mL、1 μg/mLになるように混合し、50 μL/wellで96 wellプレートに添加した。プレートシールを貼って密閉し、4℃内で一晩静置することにより、プレートに抗体を固相化した。その後、0.05% Tween20含有PBSで、３回ウエルを洗浄した。1% BSA含有PBSを200 μL/wellでウエルに添加し、湿潤箱に入れ37℃インキュベーター内で１時間静置することにより、ウエルをブロッキングした。その後、再度、0.05% Tween20含有PBSで、３回ウエルを洗浄した。
(2) Immobilization of Capture antibody Anti-α-Gal monoclonal antibody, anti-GCR monoclonal antibody and anti-GAA monoclonal antibody were added to 0.05 M Sodium Carbonate (pH 9.6) at 4 μg / mL, 4 μg / mL and 1 μg, respectively. The mixture was mixed at a volume of 50 mL / well and added to a 96-well plate. A plate seal was applied and sealed, and the antibody was immobilized on the plate by allowing it to stand overnight at 4 ° C. Thereafter, the wells were washed three times with PBS containing 0.05% Tween20. PBS containing 1% BSA was added to the well at 200 μL / well, placed in a wet box, and allowed to stand in a 37 ° C. incubator for 1 hour to block the well. Thereafter, the wells were washed again three times with PBS containing 0.05% Tween20.
（３）検量線用検体の作製
α-Gal（FABRAZYME）、GCR（CEREZYME）、GAA（全てGenzyme社）の各タンパク質 を1% BSA含有PBSでそれぞれ1.2 μg/mL、3 μg/mL、60 μg/mLになるように混合し、そこから5倍希釈ずつ7段階希釈した。φ3 mmに切り取り、マウス血液をしみ込ませた濾紙に、各混合タンパク質溶液を、1 μL/paperで滴下した。1.5 mL マイクロチューブに入れ、蓋を開けた状態で60分間そのまま乾燥させた。チューブに0.05% Tween20含有5 mM Tris-HCl （pH 7.4）を 60 μL/tubeで添加し、60分間室温で静置してタンパク質を濾紙から溶出した。この溶出液を検量線用抗原として用いた。
(3) Preparation of calibration curve samples α-Gal (FABRAZYME), GCR (CEREZYME), and GAA (all Genzyme) proteins were added in PBS containing 1% BSA, 1.2 μg / mL, 3 μg / mL, and 60 μg, respectively. The mixture was mixed so as to be / mL, and diluted 5-fold from that by 7 steps. Each mixed protein solution was dropped into 1 μL / paper on a filter paper cut into φ3 mm and soaked with mouse blood. It was put in a 1.5 mL microtube and dried as it was for 60 minutes with the lid open. To the tube, 5 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.05% Tween20 was added at 60 μL / tube, and allowed to stand at room temperature for 60 minutes to elute the protein from the filter paper. This eluate was used as a calibration curve antigen.
（４）サンプルの調製
健常者から採取した血液を濾紙に滴下し、完全に乾燥させた。血液が浸透した部分の濾紙をパンチングしてφ3 mmに切り取り、1.5 mL tubeに入れて、0.05% Tween20含有5 mM Tris-HCl (pH 7.4) 60μL/tubeを添加した。60分間、室温で静置して、抗原を濾紙から抽出した後、溶液をサンプルとして回収した。
次に、検量線用抗原と、sampleを（２）で準備したプレートに50 μL/wellで添加し、一晩４℃で静置した後、ウエルを３回洗浄した。
(4) Preparation of sample Blood collected from a healthy person was dropped on a filter paper and completely dried. The filter paper in which the blood had permeated was punched out and cut to φ3 mm, put into a 1.5 mL tube, and 0.05 μM Tween20-containing 5 mM Tris-HCl (pH 7.4) 60 μL / tube was added. After leaving still at room temperature for 60 minutes and extracting the antigen from the filter paper, the solution was collected as a sample.
Next, the calibration curve antigen and sample were added to the plate prepared in (2) at 50 μL / well, allowed to stand overnight at 4 ° C., and then the wells were washed three times.
（５）抗原抗体複合体の作製
（１）で調整したα-Gal#1、Immi#2 、α-Glu#7の各MUSTagを緩衝液（5% Goat Serum、0.05% Tween20、0.45 M NaCl、50 mM PB (pH7.4)）を用いて各8 ng/mLになるように混合した。（４）で洗浄後のプレートから洗浄用緩衝液を除去し、混合したMUSTagを25μL/wellで添加し、湿潤箱に入れ37℃インキュベーター内で１時間静置した。その後、同じ緩衝液で１回洗浄し、次に血清を含まない同じ組成の緩衝液で３回洗浄し、最後に0.05% Tween20含有PBS（0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 7.53 mM Na2H・PO4・12H2O, 1.47 mM KH2・PO4）で１回洗浄した。
(5) Preparation of antigen-antibody complex MUSTag of α-Gal # 1, Immi # 2, α-Glu # 7 prepared in (1) was added to buffer solution (5% Goat Serum, 0.05% Tween20, 0.45 M NaCl, 50 mM PB (pH 7.4)) was mixed to 8 ng / mL each. The washing buffer was removed from the plate after washing in (4), the mixed MUSTag was added at 25 μL / well, placed in a wet box, and allowed to stand in a 37 ° C. incubator for 1 hour. Thereafter, the cells were washed once with the same buffer, then washed three times with a buffer of the same composition without serum, and finally PBS containing 0.05% Tween 20 (0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 7.53 mM Na 2 H · Washed once with PO 4 · 12H 2 O, 1.47 mM KH 2 · PO 4 ).
（６）オリゴヌクレオチドの検出
ウエルから洗浄用緩衝液を除去し、0.3 units/30μL /wellでEcoR Iを添加した。プレートシールを貼って、37℃で15分静置することにより、オリゴヌクレオチドを抗原抗体複合体より切り離し、オリゴヌクレオチドを含んだ溶液をReal-Time PCR用サンプルとして回収した。この溶液３μLに対し、以下のプライマー（Forward : TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA：配列番号６）（Reverse : GGCAAGCCACGTTTGGTG：配列番号７）を用いてReal-Time PCR（条件は、95℃15分の後、95℃-60℃を３５サイクル）を行い、DNA Intercarator法またはTaqMan法により蛍光強度（Ct）を測定した。検量線用検体に対する測定値を用いて検量線を作製し、被検者のサンプルについて抗原量を算出した。
(6) Detection of oligonucleotide The washing buffer was removed from the well, and EcoRI was added at 0.3 units / 30 μL / well. By attaching a plate seal and allowing to stand at 37 ° C. for 15 minutes, the oligonucleotide was separated from the antigen-antibody complex, and the solution containing the oligonucleotide was collected as a sample for Real-Time PCR. 3 μL of this solution was subjected to Real-Time PCR using the following primers (Forward: TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA: SEQ ID NO: 6) (Reverse: GGCAAGCCACGTTTGGTG: SEQ ID NO: 7). 35 cycles), and fluorescence intensity (Ct) was measured by DNA Intercarator method or TaqMan method. A calibration curve was prepared using the measured values for the sample for the calibration curve, and the antigen amount was calculated for the sample of the subject.
（７）結果
MUSTagを用いて濾紙血からの抽出液を用い、α-Gal、GCR、GAAの各抗原濃度を測定した結果（図１）、α-Galにおいては、サンプルAは25.0pg/spot、C.V.（変動係数）値が4.6% 、サンプルBは36.9pg/spot、C.V.が6.8% であった。
GCRにおいては、サンプルAは408pg/spot、C.V.が39%、サンプルBは187pg/spot、C.V.が10%であった。GAAにおいては、サンプルAは1472pg/spot、C.V.が20%、サンプルBは778 pg/spot、C.V.が42%であった。これらの値は、酵素活性によって測定した抗原濃度とほぼ一致した。
このように、MUSTagを用いることによって、乾燥血液付着濾紙に付着した微量の血液中の抗原でも検出でき、その濃度を定量できる。
(7) Results
As a result of measuring each antigen concentration of α-Gal, GCR, and GAA using MUSTag extract from filter paper blood (Fig. 1), sample α is 25.0pg / spot, CV (variation) in α-Gal (Coefficient) value was 4.6%, sample B was 36.9 pg / spot, and CV was 6.8%.
In GCR, sample A was 408 pg / spot and CV was 39%, sample B was 187 pg / spot and CV was 10%. In GAA, sample A was 1472 pg / spot and CV was 20%, sample B was 778 pg / spot and CV was 42%. These values almost coincided with the antigen concentration measured by enzyme activity.
Thus, by using MUSTag, it is possible to detect even a small amount of antigen adhering to the dry blood-adhering filter paper, and to quantify its concentration.
Claims (10)
前記繊維を緩衝液に浸す工程と、
前記緩衝液を回収する工程と、
標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、
前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、
前記検出工程は、
前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。 A method for detecting an antigen in blood adhering to a dry blood adhering fiber,
Immersing the fiber in a buffer;
Recovering the buffer;
A step of bringing an antigen-antibody complex into contact with an oligonucleotide-conjugated antibody having an oligonucleotide chain as a label and an antibody that specifically binds to the antigen, and the antigen;
A detection step of detecting the oligonucleotide chain in the antigen-antibody complex;
Including
The oligonucleotide conjugate antibody includes a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain,
The detection step includes
Cleaving and collecting the oligonucleotide chain at the cleavage site;
Amplifying the recovered oligonucleotide chain;
Detecting the amplified oligonucleotide strand.
前記繊維を緩衝液に浸す工程と、
前記緩衝液を回収する工程と、
各抗原に特異的に結合する抗体と、当該抗体に結合する結合部位を有し、抗原の種類に対応するオリゴヌクレオチド鎖を混合して、前記抗体と前記オリゴヌクレオチドとを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ形成させる工程と、
形成した前記オリゴヌクレオチド複合抗体をそれぞれ精製した後で混合する工程と、
前記緩衝液中の複数の前記抗原と、前記混合したオリゴヌクレオチド複合抗体とを接触させて当該抗原と当該抗原に特異的に結合する当該抗体を含む当該オリゴヌクレオチド複合抗体との抗原抗体複合体を形成させる工程と、
前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程、を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体が、当該オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有し、
前記検出工程が、
前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。 A method for identifying and detecting a plurality of antigens in blood adhering to dry blood adhering fibers,
Immersing the fiber in a buffer;
Recovering the buffer;
An oligonucleotide composite antibody comprising an antibody that specifically binds to each antigen, a binding site that binds to the antibody, and an oligonucleotide chain corresponding to the type of antigen, and the antibody and the oligonucleotide. Forming each of
A step of mixing each of the formed oligonucleotide conjugate antibodies after purification, and
An antigen-antibody complex of the oligonucleotide conjugate antibody comprising the antigen and the oligonucleotide conjugate antibody that specifically binds to the antigen by contacting the mixed oligonucleotide conjugate antibody with the plurality of antigens in the buffer solution. Forming, and
Detecting the oligonucleotide chain in the antigen-antibody complex,
The oligonucleotide conjugate antibody has a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain;
The detection step comprises
Cleaving and collecting the oligonucleotide chain at the cleavage site;
Amplifying the oligonucleotide chain;
Detecting the amplified oligonucleotide strand.
前記繊維を緩衝液に浸す工程と、
前記緩衝液を回収する工程と、
標識としてのオリゴヌクレオチド鎖と前記抗原に特異的に結合する抗体とを有するオリゴヌクレオチド複合抗体と、前記抗原と、を接触させて抗原抗体複合体を形成させる工程と、
前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する検出工程と、
当該抗原を事実上含有しない血液に、複数の既知濃度の当該抗原を添加し、前記血液検体と同様にして 前記抗原抗体複合体中の前記オリゴヌクレオチド鎖を検出することにより検量線を作成する工程と、
前記血液検体によって得られた前記オリゴヌクレオチド鎖の量を、前記検量線より特定する工程と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を含み、
前記検出工程は、
前記切断部位で前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離し、回収する工程、
回収された前記オリゴヌクレオチド鎖を増幅する工程、
増幅された前記オリゴヌクレオチド鎖を検出する工程、を含む、方法。 A method for quantifying an antigen in a blood sample adhering to a dry blood adhering fiber,
Immersing the fiber in a buffer;
Recovering the buffer;
A step of bringing an antigen-antibody complex into contact with an oligonucleotide-conjugated antibody having an oligonucleotide chain as a label and an antibody that specifically binds to the antigen, and the antigen;
A detection step of detecting the oligonucleotide chain in the antigen-antibody complex;
A step of creating a calibration curve by adding a plurality of known concentrations of the antigen to blood that does not substantially contain the antigen, and detecting the oligonucleotide chain in the antigen-antibody complex in the same manner as the blood sample. When,
Identifying the amount of the oligonucleotide chain obtained from the blood sample from the calibration curve;
Including
The oligonucleotide conjugate antibody includes a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain,
The detection step includes
Cleaving and collecting the oligonucleotide chain at the cleavage site;
Amplifying the recovered oligonucleotide chain;
Detecting the amplified oligonucleotide strand.
繊維と、
オリゴヌクレオチド鎖と、各抗原に特異的に結合する抗体とを含有するオリゴヌクレオチド複合抗体を含み、
前記オリゴヌクレオチド複合抗体は、前記オリゴヌクレオチド鎖を切り離すことができる切断部位を有する、キット。 A kit for detecting an antigen in blood,
Fiber,
An oligonucleotide conjugate comprising an oligonucleotide chain and an antibody that specifically binds to each antigen,
The oligonucleotide conjugate antibody has a cleavage site capable of cleaving the oligonucleotide chain.
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