JP2009124067A - Core/shell silicon quantum dot and biosubstance labeling agent using the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell-cytotoxicity-free core/shell silicon quantum dot and a biosubstance labeling agent using the core/shell silicon quantum dot. <P>SOLUTION: The core/shell silicon quantum dot is made up of a core which contains silicon and a shell layer which contains silicon oxide, characterized in that the concentration of hydrogen peroxide, which is liberated in the course of hydrothermal treatment of the concerned core/shell silicon quantum dot under prescribed conditions, is measured 100 ppm or less by the potassium permanganate titration method. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、毒性のないコア／シェル型シリコン量子ドット及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。   The present invention relates to a non-toxic core / shell type silicon quantum dot and a biological material labeling agent using the same.

半導体ナノ粒子のうち、電子の波長（１０ｎｍ程度）より小さい粒子径を有するナノサイズの粒子は、量子サイズ効果として電子の運動に対するサイズ有限性の影響が大きくなってくるために、バルク体とは異なる特異な物性を示すことが知られている。一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す半導体ナノ粒子は、「量子ドット」とも称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。   Among semiconductor nanoparticles, nano-sized particles having a particle diameter smaller than the wavelength of electrons (about 10 nm) are affected by the size finiteness on the movement of electrons as a quantum size effect. It is known to exhibit different and unique physical properties. In general, semiconductor nanoparticles that exhibit a quantum confinement effect with a nanometer-sized semiconductor material are also referred to as “quantum dots”. Such a quantum dot is a small lump within about 10 and several nanometers in which several hundred to several thousand semiconductor atoms are gathered, but when absorbing energy from an excitation source and reaching an energy excited state, the energy of the quantum dot Releases energy corresponding to the band gap.

したがって、量子ドットは、量子サイズ効果によりユニークな光学特性を有することが知られている。具体的には、（１）粒子のサイズを制御することにより、様々な波長，色を発光させることができる。（２）吸収帯が広く、単一波長の励起光で様々なサイズの微粒子を発光させることができる。（３）蛍光スペクトルが良好な対称形である。（４）有機色素に比べて耐久性、耐退色性に優れる、といった特徴を有する。   Therefore, it is known that quantum dots have unique optical characteristics due to the quantum size effect. Specifically, (1) various wavelengths and colors can be emitted by controlling the size of the particles. (2) The absorption band is wide, and fine particles of various sizes can be emitted with excitation light having a single wavelength. (3) The fluorescence spectrum is a good symmetrical shape. (4) It has characteristics such as superior durability and fading resistance compared to organic dyes.

一方、小動物を対象としたｉｎ ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し出てきた発光を外部でモニターする方法である。生体物質を標識する手段として、分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。   On the other hand, in vivo optical imaging for small animals has been attracting attention, and optical system devices for observing cells in the living body of small animals from outside without damaging the living body (non-invasively) are sold by each manufacturer. I'm starting. In this method, a fluorescent material with a label that selectively gathers at a site to be observed in the living body is injected into the living body, and the emitted light emitted from the outside is externally monitored. As means for labeling a biological substance, a method using a biological substance labeling agent in which a molecular labeling substance is bound to a marker substance has been studied.

近年、上記マーカー物質として量子ドットを用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を半導体ナノ粒子の表面に物理的および／または化学的に吸接合した生体物質標識剤が検討されている（例えば特許文献１参照）。   In recent years, a method using quantum dots as the marker substance has attracted attention. For example, a biological substance labeling agent in which a polymer having a polar functional group is physically and / or chemically adsorbed and bonded to the surface of a semiconductor nanoparticle has been studied (see, for example, Patent Document 1).

量子ドットを生体物質標識剤として応用するにあたり、発光本体である量子ドットをコアに、極性官能基を有する高分子を結合させる足場として、コアを覆うシェルを形成させることが公知である。例えば、特許文献１で実質的にその効果も含めて開示されている量子ドットは、ＣｄＳｅをコアに、ＺｎＳをシェルとした「コア／シェル型量子ドット」である。   In applying quantum dots as a biological material labeling agent, it is known to form a shell that covers a core as a scaffold for binding a polymer having a polar functional group to a quantum dot that is a light emitting body. For example, a quantum dot that is disclosed in Patent Document 1 substantially including its effect is a “core / shell type quantum dot” in which CdSe is a core and ZnS is a shell.

しかしながら、例えば、特許文献１で実質的にその効果も含めて開示されている量子ドットは、（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ型）量子ドットであり、使用されているカドミウム類は、発光半値幅は狭いが、有害重金属であるため、製造プロセスにおいても環境面への悪影響が懸念され、代替材料が求められている。   However, for example, the quantum dots disclosed in Patent Document 1 substantially including the effects thereof are (CdSe / ZnS type) quantum dots, and the cadmium used has a narrow emission half-value width. Since it is a toxic heavy metal, there are concerns about adverse environmental impacts in the manufacturing process, and alternative materials are required.

このような状況を鑑み、無毒性・無害性の量子ドットとしてシリコン量子ドットが検討をされている。中でも、より簡便なプロセスとして気相法が注目されている（特許文献２および３参照）。特許文献２においては、シリコン量子ドットの製造方法として、高周波スパッタリング法を用いて、シリコン量子ドットが粒子単位で分散した溶液を得る製造方法が開示されている。しかしながら、特許文献２には、生体物質標識剤として必要な、分子標識物質を結合させる方法については記載がない。   In view of such circumstances, silicon quantum dots have been studied as non-toxic and harmless quantum dots. Among these, the gas phase method has attracted attention as a simpler process (see Patent Documents 2 and 3). Patent Document 2 discloses a manufacturing method for obtaining a solution in which silicon quantum dots are dispersed in units of particles using a high-frequency sputtering method as a method for manufacturing silicon quantum dots. However, Patent Document 2 does not describe a method for binding a molecular labeling substance necessary as a biological substance labeling agent.

また特許文献３には、熱処理ＳｉＯｘ（ｘ＝１．９９９）のフッ酸中溶解によりシリコン量子ドットを製造する方法、ｐ型シリコンウェハーの陽極化成によりシリコン量子ドットを製造する方法が開示されている。特許文献３によれば、いずれの製造法においてもコアとなるシリコン結晶を製造したのちに、自然酸化によりシリコン結晶からなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成する。ついで分子標識物質を結合させるにあたり、上述のコア／シェル構造のシリコン量子ドットを、過酸化水素水との反応により表面を水酸化させる。水酸化した上でシランカップリング剤など有機分子と反応させ、官能基を導入し、さらに分子標識物質を結合させ、生体標識剤とする方法が開示されている。   Patent Document 3 discloses a method for producing silicon quantum dots by dissolving heat-treated SiOx (x = 1.999) in hydrofluoric acid, and a method for producing silicon quantum dots by anodizing a p-type silicon wafer. . According to Patent Document 3, after producing a silicon crystal as a core in any of the production methods, a shell layer made of silicon oxide is formed around the core made of silicon crystal by natural oxidation. Next, when the molecular labeling substance is bonded, the surface of the silicon quantum dots having the core / shell structure is hydroxylated by reaction with hydrogen peroxide. A method is disclosed in which a biomarker is prepared by reacting with an organic molecule such as a silane coupling agent after hydroxylation, introducing a functional group, and further binding a molecular labeling substance.

ところが、公知の方法により本発明者らが作製したシリコン量子ドットからなる生体標識剤を、細胞内にインジェクションしたところ、その細胞は正常に培養せず、細胞毒性があることが懸念された。
特開２００３−３２９６８６号公報 特開２００６−７００８９号公報 特開２００５−１７２４２９号公報 However, when a biomarker composed of silicon quantum dots prepared by the present inventors by a known method was injected into cells, there was a concern that the cells were not cultured normally and were cytotoxic.
JP 2003-329686 A JP 2006-70089 A JP 2005-172429 A

本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、細胞毒性のないコア／シェル型シリコン量子ドットを提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することである。   The present invention has been made in view of the above problems and situations, and a solution to that problem is to provide a core / shell type silicon quantum dot having no cytotoxicity. Moreover, it is providing the biological material labeling agent using the same.

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、従来法で得られるコア／シェル型シリコン量子ドットからなる生体標識材料の細胞毒性は、酸化ケイ素からなるシェル層を水酸化するために用いられる過酸化水素水によることを見出した。酸化ケイ素からなるシェル層を水酸化するために過酸化水素水により処理する工程後に、熱水洗浄することにより残存する過酸化水素水濃度を一定以下とすることで、無毒性な生体物質標識剤を得ることができることを見出し、本発明に至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that the cytotoxicity of the biomarker material composed of core / shell type silicon quantum dots obtained by the conventional method is to hydroxylate the shell layer composed of silicon oxide. It was found that it depends on the hydrogen peroxide solution used in After the step of treating the shell layer made of silicon oxide with a hydrogen peroxide solution to perform hydroxylation, the concentration of the remaining hydrogen peroxide solution is reduced to a certain level or less by washing with hot water, thereby providing a non-toxic biological substance labeling agent. The inventors have found that can be obtained, and have reached the present invention.

すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。   That is, the said subject which concerns on this invention is solved by the following means.

１．シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットであって、当該コア／シェル型シリコン量子ドットを一定条件下熱水処理したときに遊離する過酸化水素の濃度が、過マンガン酸カリウム滴定法により１００ｐｐｍ以下であることを特徴とするコア／シェル型シリコン量子ドット。   1. A core / shell type silicon quantum dot comprising a core part containing silicon and a shell layer containing silicon oxide, and hydrogen peroxide liberated when the core / shell type silicon quantum dot is hydrothermally treated under certain conditions The core / shell type silicon quantum dot is characterized by having a concentration of 100 ppm or less by a potassium permanganate titration method.

２．前記シェル層が、コア／シェル型シリコン量子ドットの製造工程において、過酸化水素水による水酸化処理とその後に熱水洗浄処理を施されていることを特徴とする前記１に記載のコア／シェル型シリコン量子ドット。   2. 2. The core / shell according to 1 above, wherein the shell layer is subjected to a hydroxylation treatment with a hydrogen peroxide solution and then a hot water cleaning treatment in a manufacturing process of the core / shell type silicon quantum dots. Type silicon quantum dots.

３．前記１又は２に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットであって、その表面が有機分子により修飾されていることを特徴とするシリコン量子ドット。   3. 3. The core / shell type silicon quantum dot according to 1 or 2, wherein the surface is modified with an organic molecule.

４．前記１〜３のいずれか一項に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを有機分子を介して結合させたことを特徴とする生体物質標識剤。   4). A biological substance labeling agent, wherein the core / shell type silicon quantum dots according to any one of the above 1 to 3 and a molecular labeling substance are bonded via an organic molecule.

５．前記分子標識物質が、ヌクレオチド鎖またはタンパク質であることを特徴とする前記４に記載の生体物質標識剤。   5). 5. The biological substance labeling agent according to 4 above, wherein the molecular labeling substance is a nucleotide chain or a protein.

６．前記コア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合させる有機分子が、ビオチン及びアビジンであることを特徴とする前記４又は５に記載の生体物質標識剤。   6). 6. The biological material labeling agent according to 4 or 5, wherein the organic molecule that binds the core / shell type silicon quantum dot and the molecular labeling material is biotin and avidin.

本発明の上記手段により、細胞毒性のないコア／シェル型シリコン量子ドットを提供することができる。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができる。   By the above means of the present invention, a core / shell type silicon quantum dot having no cytotoxicity can be provided. Moreover, the biological material labeling agent using the same can be provided.

本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットであって、当該コア／シェル型シリコン量子ドットを一定条件下熱水処理したときに遊離する過酸化水素の濃度が、過マンガン酸カリウム滴定法により１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする。この特徴は、請求項１〜６に係る発明に共通する技術的特徴である。   The core / shell type silicon quantum dot of the present invention is a core / shell type silicon quantum dot comprising a core part containing silicon and a shell layer containing silicon oxide, and the core / shell type silicon quantum dot is subjected to certain conditions. The concentration of hydrogen peroxide that is liberated when the hot water treatment is performed is 100 ppm or less by a potassium permanganate titration method. This feature is a technical feature common to the inventions according to claims 1 to 6.

なお、本発明の実施態様としては、前記シェル層が、コア／シェル型シリコン量子ドットの製造工程において、過酸化水素水による水酸化処理とその後に熱水洗浄処理を施されている態様が好ましい。また、当該コア／シェル型シリコン量子ドットの表面が有機分子により修飾されていることも好ましい。   As an embodiment of the present invention, it is preferable that the shell layer is subjected to a hydroxylation treatment with hydrogen peroxide and then a hot water washing treatment in the manufacturing process of the core / shell type silicon quantum dots. . It is also preferable that the surface of the core / shell type silicon quantum dot is modified with an organic molecule.

本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、有機分子を介して分子標識物質と結合させ生体物質標識剤とすることができる。この場合、分子標識物質は、ヌクレオチド鎖またはタンパク質であることが好ましい。また、当該コア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合させる有機分子は、ビオチン及びアビジンであることが好ましい。   The core / shell type silicon quantum dot of the present invention can be combined with a molecular labeling substance via an organic molecule to form a biological substance labeling agent. In this case, the molecular labeling substance is preferably a nucleotide chain or a protein. Moreover, it is preferable that the organic molecule which couple | bonds the said core / shell type | mold silicon quantum dot and a molecular labeling substance is biotin and avidin.

以下、本発明とその構成要素、および発明を実施するための最良の形態について詳細な説明をする。   Hereinafter, the present invention, its components, and the best mode for carrying out the invention will be described in detail.

〔コア／シェル型シリコン量子ドットの製造方法〕
本発明のコア／シェル型シリコン量子ドット（以下において、適宜、当該シリコン量子ドットのコア部を単に「シリコン量子ドット」という。）の製造方法においては、従来公知の種々の方法を利用することができるが、形成するシリコン量子ドットの粒子サイズを容易に制御することのできる高周波スパッタリング法と、シリコン量子ドットの形態を膜形態から粒子形態へ変えるための酸処理と攪拌処理をする工程を含む製造方法を採用することが好ましい。この製造方法の場合、シリコン量子ドットの形態を、膜形態から粒子形態に変え、溶液中に分散させて蛍光発光させる点に特徴がある。 [Method of manufacturing core / shell type silicon quantum dots]
In the manufacturing method of the core / shell type silicon quantum dot of the present invention (hereinafter, the core part of the silicon quantum dot is simply referred to as “silicon quantum dot” as appropriate), various conventionally known methods can be used. A high-frequency sputtering method capable of easily controlling the particle size of the silicon quantum dots to be formed, and a production process including an acid treatment and a stirring treatment for changing the form of the silicon quantum dots from a film form to a particle form It is preferable to adopt the method. This manufacturing method is characterized in that the form of the silicon quantum dots is changed from a film form to a particle form and dispersed in a solution to emit fluorescence.

具体的には、本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、高周波スパッタリング法により製造されたコア／シェル型シリコン量子ドットであって、下記製造工程を経て製造されたことを特徴とする。   Specifically, the core / shell type silicon quantum dot of the present invention is a core / shell type silicon quantum dot manufactured by a high frequency sputtering method, and is manufactured through the following manufacturing process.

工程（１）：ターゲット材料としてシリコンとシリカを用い、高周波スパッタリング法により基板上にアモルファス酸化ケイ素薄膜を作製する。   Step (1): Using silicon and silica as target materials, an amorphous silicon oxide thin film is produced on a substrate by high frequency sputtering.

工程（２）：上記アモルファス酸化ケイ素薄膜に熱処理を施し、アモルファス酸化ケイ素薄膜内にシリコン量子ドット（コア部）を形成する。   Step (2): The amorphous silicon oxide thin film is subjected to a heat treatment to form silicon quantum dots (core portions) in the amorphous silicon oxide thin film.

工程（３）：上記熱処理後アモルファス酸化ケイ素薄膜に、フッ酸による処理を施して、シリコン量子ドットを露出させる。   Step (3): The amorphous silicon oxide thin film after the heat treatment is treated with hydrofluoric acid to expose the silicon quantum dots.

工程（６）：上記シリコン量子ドットが露出した基板を溶媒中に浸漬させることで、シリコン量子ドットを基板より離散させて、シリコン量子ドットが分散した溶液を得る。   Step (6): The substrate with the silicon quantum dots exposed is immersed in a solvent, whereby the silicon quantum dots are separated from the substrate to obtain a solution in which the silicon quantum dots are dispersed.

工程（７）：シリコン量子ドットの表面を酸素雰囲気中で自然酸化、または加熱して熱酸化し、シリコン量子ドットからなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成する。   Step (7): The surface of silicon quantum dots is naturally oxidized in an oxygen atmosphere or thermally oxidized by heating to form a shell layer made of silicon oxide around the core made of silicon quantum dots.

工程（８）：上記シリコン量子ドットを過酸化水素水中で反応させ、結晶表面を水酸化させる。水酸化させることにより、シランカップリング剤などとの反応が容易に進行するようにできる。   Step (8): The silicon quantum dots are reacted in hydrogen peroxide water to hydroxylate the crystal surface. By the hydroxylation, the reaction with the silane coupling agent or the like can easily proceed.

工程（９）：上記水酸化したシリコン量子ドットを熱水により洗浄する。   Step (9): The hydroxylated silicon quantum dots are washed with hot water.

なお、本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、以下の工程を経て、分子標識物質と有機分子を介して結合させることにより生体物質標識剤とすることができる。   In addition, the core / shell type silicon quantum dot of the present invention can be made into a biological material labeling agent through the following steps and bonded to the molecular labeling material via an organic molecule.

工程（１０）：上記熱水洗浄したシリコン量子ドットの水酸基と有機分子と結合させる。   Step (10): Bonding hydroxyl groups and organic molecules of the silicon quantum dots washed with hot water.

工程（１１）：有機分子と反応させたシリコン量子ドットを分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。なお、前記有機分子が、ビオチン及びアビジンであることが好ましい。また、生体物質標識剤において、前記分子標識物質がヌクレオチド鎖またはタンパク質であることが好ましい。   Step (11): Silicon quantum dots reacted with organic molecules are combined with a molecular labeling substance to obtain a biological substance labeling agent. The organic molecules are preferably biotin and avidin. In the biological substance labeling agent, the molecular labeling substance is preferably a nucleotide chain or a protein.

なお、本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットでことを特徴とするが、発光強度を高めるために、コア部及びシェル層のうち少なくともいずれか一方にドーパントとして、Ｂｅ、Ｇａ、Ｍｇ、Ｇｅ等の原子を微量含有させることも好ましい。   The core / shell type silicon quantum dot of the present invention is a core / shell type silicon quantum dot comprising a core part containing silicon and a shell layer containing silicon oxide. In addition, it is also preferable that at least one of the core part and the shell layer contains a small amount of atoms such as Be, Ga, Mg, and Ge as a dopant.

本発明のコア／シェル型シリコン量子ドットは、平均粒径が２〜１０ｎｍであり、かつ２００〜４００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜可視光により励起されたときに、４００〜８００ｎｍの範囲内の波長の可視光の発光を示す態様のシリコン量子ドットであることが好ましい。   The core / shell type silicon quantum dots of the present invention have an average particle diameter of 2 to 10 nm and a wavelength in the range of 200 to 400 nm, and when excited by ultraviolet to visible light in the range of 400 to 800 nm. It is preferable that it is a silicon quantum dot of the aspect which shows light emission of visible light of a wavelength.

本発明において、コア／シェル型シリコン量子ドットの平均粒径は本来３次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。従って、本発明において、当該平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とした。ＴＥＭで撮影するクラスター粒子数としては１００個以上が好ましく、１０００個の粒子を撮影するのが更に好ましい。本願においては、１０００個の粒子の算術平均を平均粒径とした。   In the present invention, the average particle diameter of the core / shell type silicon quantum dots must originally be determined in three dimensions, but it is difficult because it is too fine, and in reality it must be evaluated with a two-dimensional image. It is preferable to obtain by averaging a large number of images taken by changing the shooting scene of the electron micrograph using (TEM). Therefore, in the present invention, the average particle diameter is a diameter obtained by taking an electron micrograph using a TEM, measuring a cross-sectional area of a sufficient number of particles, and setting the measured value as an area of a corresponding circle. Obtained as the diameter, the arithmetic average was taken as the average particle diameter. The number of cluster particles photographed with a TEM is preferably 100 or more, and more preferably 1000 particles. In the present application, the arithmetic average of 1000 particles is defined as the average particle size.

〈高周波スパッタリング法〉
本発明に係る高周波スパッタリング法は、シリコン量子ドットの製造初期の段階で、発光色に直接寄与する粒子サイズを自在に制御することができるので、本発明では、様々な発光色を容易に実現することが可能である。 <High frequency sputtering method>
Since the high-frequency sputtering method according to the present invention can freely control the particle size that directly contributes to the luminescent color at the initial stage of production of silicon quantum dots, various luminescent colors can be easily realized in the present invention. It is possible.

高周波スパッタリング装置は、側面下部にアルゴンガス導入口と排気口を備える真空チャンバー、真空チャンバーの上面に絶縁材料を介して取り付けられ、冷却管から導入、排出される冷却水で冷却される基板ホルダー、及び、真空チャンバーの下面に絶縁材料を介して取り付けられ、冷却管から導入、排出される冷却水で冷却される陰極シールドを備える高周波電極から構成されている。   The high-frequency sputtering apparatus is a vacuum chamber having an argon gas introduction port and an exhaust port at the bottom of the side surface, a substrate holder that is attached to the upper surface of the vacuum chamber via an insulating material, cooled by cooling water introduced and discharged from the cooling pipe, And it is comprised from the high frequency electrode provided with the cathode shield which is attached to the lower surface of a vacuum chamber via an insulating material, and is cooled with the cooling water introduce | transduced and discharged | emitted from a cooling pipe.

そして、上記装置において、アルゴンガスを真空チャンバー内にアルゴンガス導入口から導入し、高周波コントローラによりアルゴンガスをイオン化し、イオン化されたアルゴンイオンを、高周波電極上のターゲット材料であるシリコンチップと石英ガラスへ衝突させ、ターゲット材料から放出された原子や分子を基板ホルダーに保持した基板上に堆積させ、アモルファス酸化ケイ素薄膜を形成する。   In the above apparatus, argon gas is introduced into the vacuum chamber from the argon gas inlet, the argon gas is ionized by a high frequency controller, and the ionized argon ions are converted into a silicon chip and a quartz glass as a target material on the high frequency electrode. And depositing atoms and molecules emitted from the target material on the substrate held by the substrate holder to form an amorphous silicon oxide thin film.

シリコン量子ドットの粒子サイズは、ターゲット材料を構成するシリコンチップと石英ガラスの面積比を変化させることで制御することができる。この面積比は、通常、１〜５０％とするが、好ましくは５〜３０％。さらに好ましくは１０〜１５％である。
次に、上記アモルファス酸化ケイ素薄膜を不活性ガス（アルゴン等）の雰囲気中で熱処理して、該薄膜内に、所定粒子サイズのシリコン量子ドットを形成する。 The particle size of the silicon quantum dots can be controlled by changing the area ratio between the silicon chip constituting the target material and the quartz glass. The area ratio is usually 1 to 50%, preferably 5 to 30%. More preferably, it is 10 to 15%.
Next, the amorphous silicon oxide thin film is heat-treated in an atmosphere of an inert gas (such as argon) to form silicon quantum dots having a predetermined particle size in the thin film.

上記熱処理の際、熱処理温度は９００〜１２００℃とするが、好ましくは、１０００〜１１００℃である。また、熱処理時間は１５〜１００分であるが、好ましくは、３０〜８０分、さらに好ましくは、５０〜７０分である。   At the time of the heat treatment, the heat treatment temperature is 900 to 1200 ° C, preferably 1000 to 1100 ° C. The heat treatment time is 15 to 100 minutes, preferably 30 to 80 minutes, and more preferably 50 to 70 minutes.

また、スパッタリング条件である高周波電力やガス圧（作製中の圧力であり、本製造プロセスではアルゴンガスの圧力）を変化させても、粒子サイズを制御することが可能である。このとき、高周波電力は１０〜５００Ｗの範囲内で変化させ、ガス圧は、１．３×１０^-2〜１．３×１０Ｐａ（１×１０^-4〜１×１０^-1ｔｏｒｒ）の範囲内で変化させる。 Also, the particle size can be controlled by changing the sputtering conditions such as high-frequency power and gas pressure (pressure during production, argon gas pressure in this manufacturing process). At this time, the high frequency power is changed within a range of 10 to 500 W, and the gas pressure is within a range of 1.3 × 10 ^{−2 to} 1.3 × 10 Pa (1 × 10 ⁻⁴ to 1 × 10 ⁻¹ torr). Change with.

次に、シリコン量子ドットが形成された酸化ケイ素薄膜を載置する基板をアクリル板に貼り付け、フッ酸水溶液を収容する容器に対し、上記酸化ケイ素薄膜を下にして装着する。   Next, a substrate on which the silicon oxide thin film on which the silicon quantum dots are formed is attached to an acrylic plate, and the silicon oxide thin film is mounted on a container containing a hydrofluoric acid aqueous solution.

このとき，フッ酸水溶液の濃度は１〜５０％とする。好ましくは１０〜４０％であり、さらに好ましくは、２０〜３０％である。   At this time, the concentration of the hydrofluoric acid aqueous solution is 1 to 50%. Preferably it is 10-40%, More preferably, it is 20-30%.

そして、上記フッ酸水溶液を収容する容器を、ヒーターを備え、純水を収容する恒温水槽内に設置し、フッ酸水溶液処理を行う。   And the container which accommodates the said hydrofluoric acid aqueous solution is provided with a heater in the constant temperature water tank which accommodates a pure water, and hydrofluoric acid aqueous solution process is performed.

上記処理の際、処理温度は１０〜７０℃である。好ましくは、３０〜５０℃であり、さらに好ましくは、４０℃である。また、処理時間は０．５〜２５分である。好ましくは、１〜２０分である、さらに好ましくは、８〜１５分である。   In the case of the said process, process temperature is 10-70 degreeC. Preferably, it is 30-50 degreeC, More preferably, it is 40 degreeC. The processing time is 0.5 to 25 minutes. Preferably, it is 1 to 20 minutes, and more preferably 8 to 15 minutes.

上記フッ酸水溶液処理においては、容器内の酸水溶液から蒸発したフッ酸が薄膜の表面に付着し、酸化ケイ素薄膜中の酸化ケイ素部分を表面から徐々にエッチングしていく。その結果、基板上には、多数のシリコン量子ドットが凝集状態で露出する。   In the hydrofluoric acid aqueous solution treatment, hydrofluoric acid evaporated from the aqueous acid solution in the container adheres to the surface of the thin film, and the silicon oxide portion in the silicon oxide thin film is gradually etched from the surface. As a result, a large number of silicon quantum dots are exposed in an aggregated state on the substrate.

次に、シリコン量子ドットが凝集露出した基板を、エタノールを収容した容器に浸漬する。容器内に磁気撹拌子をいれ、スターラーにて撹拌する又は容器ごと超音波洗浄器に載置して超音波照射を行う。この撹拌処理により、基板上に凝集状態で露出していたシリコン量子ドットは、基板から離散し、エタノール中に分散する。   Next, the substrate on which the silicon quantum dots are aggregated and exposed is immersed in a container containing ethanol. Put a magnetic stir bar in the container and stir with a stirrer or place the entire container on an ultrasonic cleaner to irradiate ultrasonic waves. By this stirring process, the silicon quantum dots exposed in an aggregated state on the substrate are separated from the substrate and dispersed in ethanol.

攪拌処理の処理時間は、通常、１０〜１２０００秒とするが、好ましくは、３０〜９００秒であり、さらに好ましくは、６０〜６００秒である。   The treatment time of the stirring treatment is usually 10 to 12000 seconds, preferably 30 to 900 seconds, and more preferably 60 to 600 seconds.

次に、エタノール中分散したシリコン量子ドットを酸素雰囲気において自然酸化、または加熱して熱酸化させる。酸化処理においては、シリコン量子ドットからなるコアの周囲に酸化ケイ素からなるシェル層を形成する。   Next, the silicon quantum dots dispersed in ethanol are naturally oxidized in an oxygen atmosphere or thermally oxidized by heating. In the oxidation treatment, a shell layer made of silicon oxide is formed around a core made of silicon quantum dots.

上記処理の際、処理温度は２０〜５０℃である。好ましくは、２５〜４０℃であり、さらに好ましくは、２５〜３５℃である。また、処理時間は２〜２４時間である。好ましくは、５〜１８時間である、さらに好ましくは、８〜１４時間である。   In the case of the said process, process temperature is 20-50 degreeC. Preferably, it is 25-40 degreeC, More preferably, it is 25-35 degreeC. The processing time is 2 to 24 hours. Preferably, it is 5 to 18 hours, and more preferably 8 to 14 hours.

次に、上述のシリコン量子ドットを過酸化水素水と反応させる、結晶表面を水酸化させる。   Next, the above-described silicon quantum dots are reacted with hydrogen peroxide solution to hydroxylate the crystal surface.

上記反応の際、処理温度は１５〜５０℃である。好ましくは、２０〜４０℃であり、さらに好ましくは、２５〜３５℃である。また処理時間は１〜６０分である。好ましくは、５〜４０分である、さらに好ましくは、１０〜３０分である。このとき過酸化水素水の濃度は、１〜５０％とする。好ましくは１０〜４５％であり、さらに好ましくは、２０〜３５％である。   During the above reaction, the treatment temperature is 15 to 50 ° C. Preferably, it is 20-40 degreeC, More preferably, it is 25-35 degreeC. The processing time is 1 to 60 minutes. Preferably, it is 5 to 40 minutes, more preferably 10 to 30 minutes. At this time, the concentration of the hydrogen peroxide solution is 1 to 50%. Preferably it is 10-45%, More preferably, it is 20-35%.

次に、上記水酸化したシリコン量子ドットを熱水により洗浄する。通常、１０〜６００秒とするが、好ましくは、２０〜３００秒であり、さらに好ましくは、３０〜２４０秒である。処理温度は６０〜９０℃である。好ましくは、７０〜８５℃であり、さらに好ましくは、７５〜８０℃である。   Next, the hydroxylated silicon quantum dots are washed with hot water. Usually, it is 10 to 600 seconds, preferably 20 to 300 seconds, and more preferably 30 to 240 seconds. Processing temperature is 60-90 degreeC. Preferably, it is 70-85 degreeC, More preferably, it is 75-80 degreeC.

（シリコン量子ドットに残存する過酸化水素の定量方法）
シリコン量子ドットに残存する過酸化水素を評価するために、過酸化水素濃度を、以下の手順で過マンガン酸カリウム滴定により測定した。 (Quantification method of hydrogen peroxide remaining on silicon quantum dots)
In order to evaluate the hydrogen peroxide remaining in the silicon quantum dots, the hydrogen peroxide concentration was measured by potassium permanganate titration according to the following procedure.

〈０．０５Ｍ−シュウ酸ナトリウム一次標準溶液の調製〉
（１）乾燥した空の秤量瓶の質量を分析天秤で測定する。
（２）秤量瓶に上皿天秤（電子天秤）を使って、乾燥したシュウ酸ナトリウムを約１．７ｇ採取する。
（３）分析天秤で、シュウ酸案ナトリウムを入れた秤量瓶の質量を精秤する。
（４）あらかじめ、１００ｍｌビーカーに純水を約６０ｍｌ入れておき、その中に採取したシュウ酸ナトリウムを洗い落とし、攪拌して溶解する。純水で秤量瓶をよくすすぎ、秤量瓶中にシュウ酸ナトリウムが残らないようにする。
（５）ロートとロート台を用い、２５０ｍｌメスフラスコに溶解したシュウ酸ナトリウム溶液を入れる。純水でビーカーやガラス棒、ロートをよくすすぎ、シュウ酸ナトリウムを全てメスフラスコへ洗い入れる。
（６）メスフラスコの８分目程度まで純水を加え、良くかくはんする。さらに純水を加え、標線の少し下まで入れたら、後は駒込ピペットを用い、液面の最下部（メニスカス）が標線に重なるよう純水を加える。
（７）メスフラスコに共栓をし、栓を手で押さえ、メスフラスコを逆さにして、よく混合し、溶液の濃度を均一にする。
（８）この０．０５Ｍ−シュウ酸ナトリウム一次標準溶液の力価を計算する。 <Preparation of 0.05M-sodium oxalate primary standard solution>
(1) The mass of the dried empty weighing bottle is measured with an analytical balance.
(2) About 1.7 g of dried sodium oxalate is collected using an upper pan balance (electronic balance) in a weighing bottle.
(3) Using an analytical balance, accurately weigh the weight of the weighing bottle containing the sodium oxalate solution.
(4) About 60 ml of pure water is put in a 100 ml beaker in advance, and the sodium oxalate collected therein is washed away and dissolved by stirring. Rinse the weighing bottle thoroughly with pure water so that no sodium oxalate remains in the weighing bottle.
(5) Using a funnel and a funnel stand, put the dissolved sodium oxalate solution in a 250 ml volumetric flask. Rinse the beaker, glass rod and funnel thoroughly with pure water and wash all sodium oxalate into the volumetric flask.
(6) Add pure water up to the eighth minute of the volumetric flask and stir well. After adding pure water and putting it slightly below the marked line, use a Komagome pipette to add pure water so that the lowermost part (meniscus) of the liquid level overlaps the marked line.
(7) Plug the measuring flask, hold the stopper by hand, turn the measuring flask upside down, mix well, and make the concentration of the solution uniform.
(8) Calculate the titer of this 0.05M sodium oxalate primary standard solution.

〈０．０２Ｍ−過マンガン酸カリウム標準溶液の標定〉
（１）褐色ビュレットに、０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ₄標準溶液を入れ、ビュレット台にセットする。
（２）０．０５Ｍ−シュウ酸ナトリウム一次標準溶液１０ｍｌを、ホールピペットを用いコニカルビーカーに正確にとる。
（３）メスシリンダーで純水を約１００ｍｌ加える。
（４）Ｈ₂ＳＯ₄（１：４）溶液を約１０ｍｌ加える。
（５）コニカルビーカーを湯せんなべに入れ、液温を温度計で確認しながら７０〜８０℃に加温する。
（６）０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ₄溶液で滴定をする。滴定中液温が６０℃を下らないよう注意する。終点は、淡赤色が少なくとも１５秒間つづくときとする。
（７）２〜６の操作を３回繰り返す。
（８）０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ₄標準溶液の力価を求める。 <Standardization of 0.02M potassium permanganate standard solution>
(1) Put 0.02M-KMnO ₄ standard solution in brown burette and set on burette stand.
(2) Accurately take 10 ml of 0.05M sodium oxalate primary standard solution in a conical beaker using a whole pipette.
(3) Add about 100 ml of pure water with a graduated cylinder.
(4) Add about 10 ml of H ₂ SO ₄ (1: 4) solution.
(5) Put a conical beaker in a hot water pan and heat to 70-80 ° C. while checking the liquid temperature with a thermometer.
(6) Titrate with 0.02M-KMnO ₄ solution. Care should be taken that the liquid temperature does not drop below 60 ° C during the titration. The end point is when the light red color continues for at least 15 seconds.
(7) Repeat operations 2 to 6 three times.
(8) Determine the titer of the 0.02M-KMnO ₄ standard solution.

〈試料溶液の滴定〉
（１）被検試料としてのコア／シェル型シリコン量子ドットを純水１０ｍｌあたりに１×１０^-8〜１×１０^-1ｇ、好ましくは１×１０^-7〜１×１０^-2ｇ、さらに好ましくは１×１０^-6〜１×１０^-4ｇの条件で分散させる。分散させた試料５ｍｌをホールピペットで１００ｍｌメスフラスコに正確に採取する。試料溶液５ｍｌを、ホールピペットを用いて正確にコニカルビーカーにとる。
（２）メスシリンダーで純水を約１００ｍｌ加える。
（３）Ｈ₂ＳＯ₄（１：４）溶液を約２０ｍｌ加える。
（４）ビュレットの０．０２Ｍ−ＫＭｎＯ₄標準溶液で滴定を行う。
（５）１〜３の操作を３回繰り返す。
（６）滴定平均値から、試料中の過酸化水素量を計算する。 <Titration of sample solution>
(1) 1 × 10 ⁻⁸ to 1 × 10 ⁻¹ g, preferably 1 × 10 ⁻⁷ to 1 × 10 ⁻² g of core / shell type silicon quantum dots as a test sample per 10 ml of pure water Preferably, it is dispersed under conditions of 1 × 10 ⁻⁶ to 1 × 10 ⁻⁴ g. Using a whole pipette, accurately collect 5 ml of the dispersed sample in a 100 ml volumetric flask. Take 5 ml of the sample solution accurately into a conical beaker using a whole pipette.
(2) Add about 100 ml of pure water with a graduated cylinder.
(3) Add about 20 ml of H ₂ SO ₄ (1: 4) solution.
(4) Titrate with 0.02M-KMnO ₄ standard solution of burette.
(5) Repeat steps 1 to 3 three times.
(6) The amount of hydrogen peroxide in the sample is calculated from the titration average value.

なお、本発明においては、被検試料としてのコア／シェル型シリコン量子ドット１×１０^-5ｇを純水１０ｍｌに分散させ、８０℃にて１２時間加熱し、得られた溶液について、上記過マンガン酸カリウム滴定法により過酸化水素濃度を測定したときに、過酸化水素濃度が１００ｐｐｍ以下であることを要する。なお、当該濃度値が小さいほど、毒性が少なく、好ましい。 In the present invention, 1 × 10 ⁻⁵ g of core / shell type silicon quantum dots as a test sample is dispersed in 10 ml of pure water and heated at 80 ° C. for 12 hours. When the hydrogen peroxide concentration is measured by the potassium manganate titration method, the hydrogen peroxide concentration needs to be 100 ppm or less. In addition, the smaller the concentration value, the less the toxicity and the better.

（有機分子修飾）
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾されたコア／シェル型シリコン量子ドットと、分子標識物質とが有機分子により結合されている。当該有機分子としてはコア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。 (Organic molecule modification)
In the biological material labeling agent according to the present invention, a core / shell type silicon quantum dot modified with an organic molecule and a molecular labeling substance are bound by an organic molecule. The organic molecule is not particularly limited as long as it is an organic molecule capable of binding a core / shell type silicon quantum dot and a molecular labeling substance. For example, among proteins, albumin, myoglobin, casein, etc., and avidin which is a kind of protein It is also preferably used with biotin. The form of the bond is not particularly limited, and examples thereof include a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, a coordination bond, physical adsorption, and chemical adsorption. A bond having a strong bonding force such as a covalent bond is preferable from the viewpoint of bond stability.

当該有機分子としては、メルカプト基（チオール基）、カルボキシル基、アミノ基等を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオール、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。   As the organic molecule, those having a mercapto group (thiol group), a carboxyl group, an amino group, etc. are preferably used. Specifically, mercaptopropionic acid, mercaptoundecanoic acid, aminopropanethiol, mercaptopropyltriethoxysilane, amino And propyltriethoxysilane.

（生体物質標識剤）
本発明に係る生体物質標識剤は、上述したコア／シェル型シリコン量子ドットと、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。 (Biological substance labeling agent)
The biological material labeling agent according to the present invention is obtained by binding the above-described core / shell type silicon quantum dots, a molecular labeling substance and an organic molecule.

本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。   The biological substance labeling agent according to the present invention can label a biological substance by specifically binding and / or reacting with the target biological substance.

当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。   Examples of the molecular labeling substance include nucleotide chains, antibodies, antigens and cyclodextrins.

具体的には、コア／シェル型シリコン量子ドットをメルカプトウンデカン酸で処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合当該ナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに分子標識物質と結合することにより生体物質標識剤となる。   Specifically, when the core / shell type silicon quantum dots are treated with mercaptoundecanoic acid, avidin and biotin can be used as organic molecules. In this case, the carboxyl group of the nanoparticle is preferably covalently bonded to avidin, and avidin further selectively binds to biotin, and biotin further binds to a molecular labeling substance to become a biological material labeling agent.

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to this.

〈実施例１〉
（スパッタリングによる成膜）
真空チャンバー内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンをシリコンチップと石英ガラスからなるターゲット材料に衝突させ、これから放出された原子および分子を半導体基板上に体積し、シリコン原子と酸素原子が混ざった薄膜を形成した。スパッタリング条件は、プラズマ出力１００Ｗ，アルゴン圧力１Ｐａとし、このときの膜厚は３ミクロンであった。シリコンチップと石英チップの比率をかえた試料を作製し、このときの、シリコンチップの面積％を表１にを示す。 <Example 1>
(Film formation by sputtering)
Argon gas is introduced into the vacuum chamber, and the argon ions ionized by the high-frequency controller are collided with a target material made of a silicon chip and quartz glass. A thin film mixed with oxygen atoms was formed. The sputtering conditions were a plasma output of 100 W and an argon pressure of 1 Pa, and the film thickness at this time was 3 microns. Samples with different ratios between the silicon chip and the quartz chip were prepared, and the area percentage of the silicon chip at this time is shown in Table 1.

（熱処理）
得られた薄膜を、アルゴン雰囲気中において、１１００℃まで急速に昇温し６０分間熱処理を行った。 (Heat treatment)
The obtained thin film was rapidly heated to 1100 ° C. in an argon atmosphere and heat-treated for 60 minutes.

（フッ酸処理）
得られたシリコン量子ドット含有薄膜を４０℃のフッ酸蒸気に１０分間晒すことで、シリカ溶解処理を行い、シリコン量子ドット露出させた。 (Hydrofluoric acid treatment)
The resulting silicon quantum dot-containing thin film was exposed to hydrofluoric acid vapor at 40 ° C. for 10 minutes, so that silica dissolution treatment was performed to expose silicon quantum dots.

（発光スペクトル）
得られたシリコン量子ドット含有薄膜について、磁気撹拌子を備えたビーカーにエタノールを入れたところに浸漬し、６００秒撹拌処理を行うことで、シリコン量子ドットをエタノール分散溶液として得た。波長２８０ｎｍの励起光を照射して発生する蛍光スペクトルを日立分光光度計Ｆ７０００を用いて測定した。発光スペクトルの、極大発光波長を表１に示す。 (Emission spectrum)
About the obtained silicon quantum dot containing thin film, it immersed in the place which put ethanol in the beaker provided with the magnetic stirring bar, and obtained the silicon quantum dot as an ethanol dispersion solution by performing the stirring process for 600 second. A fluorescence spectrum generated by irradiating excitation light with a wavelength of 280 nm was measured using a Hitachi spectrophotometer F7000. Table 1 shows the maximum emission wavelength of the emission spectrum.

（シリコン量子ドットの溶液への分散）
上記シリコン量子ドットが露出した基板をエタノール中に浸漬させ、超音波照射を１２０秒することで、シリコン量子ドットを基板より離散させて、シリコン量子ドットが分散した溶液を得た。 (Dispersion of silicon quantum dots in solution)
The substrate on which the silicon quantum dots were exposed was immersed in ethanol and subjected to ultrasonic irradiation for 120 seconds to disperse the silicon quantum dots from the substrate to obtain a solution in which the silicon quantum dots were dispersed.

（酸化処理）
上記シリコン量子ドットが分散した溶液に、２５℃にて空気を８時間通じることで、表面に酸化ケイ素からなるシェルを形成させた。 (Oxidation treatment)
A shell made of silicon oxide was formed on the surface by passing air through the solution in which the silicon quantum dots were dispersed at 25 ° C. for 8 hours.

（過酸化水素水による水酸化処理）
上記酸化ケイ素からなるシェルをもつコア／シェル型シリコン量子ドットを、３０％過酸化水素水に１０分間分散させ、表面を水酸化させた。 (Hydroxylation treatment with hydrogen peroxide solution)
The core / shell type silicon quantum dots having a shell made of silicon oxide were dispersed in 30% hydrogen peroxide water for 10 minutes to hydroxylate the surface.

（熱水洗浄処理）
上記表面を水酸化処理したコア／シェル型シリコン量子ドットを、８０℃の熱水で６０秒洗浄処理を行った。 (Hot water cleaning treatment)
The core / shell type silicon quantum dot whose surface was hydroxylated was washed with hot water at 80 ° C. for 60 seconds.

〈過酸化水素濃度の測定〉
合成したコア／シェル型シリコン量子ドット１×１０^-5ｇを純水１０ｍｌに分散させ、８０℃にて１２時間加熱した。得られた溶液について前記の過マンガン酸カリウム滴定法により過酸化水素濃度を測定した。結果を表１に示す。 <Measurement of hydrogen peroxide concentration>
The synthesized core / shell type silicon quantum dots 1 × 10 ⁻⁵ g were dispersed in 10 ml of pure water and heated at 80 ° C. for 12 hours. About the obtained solution, the hydrogen peroxide concentration was measured by the potassium permanganate titration method. The results are shown in Table 1.

〈毒性評価法および細胞形態観察〉
上記熱水洗浄処理までの各種処理を施したコア／シェル型シリコン量子ドットのＥ．ｃｏｌｉ細胞に対する毒性について振盪フラスコ実験で試験した。使用したＥ．ｃｏｌｉ菌株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＵＣ１８］である。 <Toxicity evaluation method and cell morphology observation>
E. of core / shell type silicon quantum dots subjected to various treatments up to the hot water washing treatment. Toxicity to E. coli cells was tested in shake flask experiments. The E. used. The E. coli strain is BL21 (DE3) [pUC18].

初めにＬＢ培地で種培養を行った。ＬＢ培地の組成は下記のとおり。１０ｇＮａＣｌ、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物。Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞を、５００ｍｌの振盪フラスコに入れた１００ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。その後、発酵培養用のＭＲ培地が入れられた５００ｍｌ振盪フラスコに種培養をピペットで加えた。各フラスコには１５ｇ／ｌのグルコースと１０％（ｖ／ｖ）の播種された種培養を含む１００ｍｌのＭＲ培地が入れられている。ＭＲ培地の組成は次のとおり。１３．５ｇＫＨ₂ＰＯ₄、４．０ｇ（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄、０．７ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．８５ｇクエン酸、１０．０ｍｌの１０ｇ／ｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１０．０ｍｌの微量金属溶液（ＴＥ）、及び１．０ｍｌの２０ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ。各フラスコには更に以下の濃度で異なる量のコア／シェル型シリコン量子ドットが加えられている。すなわち全部で４本のフラスコに対して０％（対照）、０．５％、１％、２％である。４本のフラスコを用いて３７℃、２２０ｒｐｍで発酵培養を行った。 First, seed culture was performed in LB medium. The composition of the LB medium is as follows. 10 g NaCl, 10 g tryptone, 5 g yeast extract. E. Coli cells were cultured overnight at 37 ° C. and 220 rpm in 100 ml of LB medium in a 500 ml shake flask. Thereafter, seed culture was pipetted into a 500 ml shake flask containing MR medium for fermentation culture. Each flask contains 100 ml of MR medium containing 15 g / l glucose and 10% (v / v) seeded seed culture. The composition of the MR medium is as follows. 13.5 g KH ₂ PO ₄ , 4.0 g (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ , 0.7 g MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.85 g citric acid, 10.0 ml 10 g / l FeSO ₄ .7H ₂ O, 10.0 ml Of trace metal solution (TE) and 1.0 ml of 20 g / l CaCl ₂ .2H ₂ O. Each flask is further supplemented with different amounts of core / shell silicon quantum dots at the following concentrations: That is, 0% (control), 0.5%, 1%, 2% for all four flasks. Fermentation culture was performed at 37 ° C. and 220 rpm using four flasks.

分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ８４５２Ａ）で６００ｎｍの光学密度を測定し、細胞増殖の指標とした。８時間後の光学密度を測定し、対照試料のそれと同等にある場合、細胞増殖を阻害しない、つまり毒性なし。減少している場合を毒性ありと判定する。結果を表１に示す。   The optical density at 600 nm was measured with a spectrophotometer (Hewlett Packard 8452A) and used as an index of cell proliferation. If the optical density is measured after 8 hours and is comparable to that of the control sample, it does not inhibit cell growth, ie no toxicity. If it is decreased, it is judged as toxic. The results are shown in Table 1.

また８時間後にフラスコより採取した培養細胞について光学顕微鏡によりその形態を観察し、対照試料の細胞と、コア／シェル型シリコン量子ドット２％添加の試料の細胞とで比較し、形態変化の有無を目視にて判定した。対照試料との細胞とくらべ、形態が大きく変化しているものを異常。変化のわずかのものを良好、変化がないものを正常と判定した。結果を表１に示す。   In addition, the morphology of cultured cells collected from the flask after 8 hours was observed with an optical microscope, and compared between the control sample cells and the sample cells to which 2% of core / shell type silicon quantum dots were added. Judgment was made visually. Abnormalities in which the morphology is greatly changed compared to cells with the control sample. Slight changes were judged as good, and no changes were judged as normal. The results are shown in Table 1.

表１から本発明の生体物質標識剤に用いられるシリコン量子ドットは、所望の蛍光発光を示すのはもちろん、過酸化水素濃度が十分低く、細胞毒性を示さないことが分かる。   It can be seen from Table 1 that the silicon quantum dots used for the biological material labeling agent of the present invention not only exhibit the desired fluorescence, but also have a sufficiently low hydrogen peroxide concentration and no cytotoxicity.

比較例では、過酸化水素濃度が高く、細胞毒性を示したとわかる。このことから、本発明のコア／シェル型シリコンナノ粒子は、生体物質標識剤に好適に使用できると言える。   In the comparative example, it can be seen that the hydrogen peroxide concentration was high, indicating cytotoxicity. From this, it can be said that the core / shell type silicon nanoparticles of the present invention can be suitably used as a biological material labeling agent.

〈実施例２〉
（有機分子の修飾）
得られたシリコン量子ドット１０^-5ｇをメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌し、シェルの表面を処理することでシリコン量子ドットの表面をカルボキシル基で修飾した。 <Example 2>
(Modification of organic molecules)
The surface of the silicon quantum dot is obtained by dispersing 10 ^-5 g of the obtained silicon quantum dot in 10 ml of pure water in which 0.2 g of mercaptoundecanoic acid is dissolved and stirring the surface of the shell for 10 minutes at 40 ° C. Was modified with a carboxyl group.

〈分子標識物質の結合〉
上記メルカプトウンデカン酸修飾シリコン量子ドット１．０×１０^-5ｍｏｌ／ｌの水分散液にアビジン２５ｍｇを添加し４０℃で１０分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子を作製した。 <Binding of molecular labeling substances>
25 mg of avidin was added to the above-mentioned mercaptoundecanoic acid-modified silicon quantum dot 1.0 × 10 ⁻⁵ mol / l aqueous dispersion and stirred at 40 ° C. for 10 minutes to prepare avidin conjugate nanoparticles.

得られたアビジンコンジュゲートナノ粒子溶液にビオチン化された塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを混合攪拌し、ナノ粒子で標識（ラベリング）されたオリゴヌクレオチドを作製した。   The resulting avidin-conjugated nanoparticle solution was mixed and stirred with a biotinylated oligonucleotide having a known base sequence to prepare an oligonucleotide labeled with a nanoparticle.

さまざまな塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを固定化したＤＮＡチップ上に上記の標識（ラベリング）したオリゴヌクレオチドを滴下・洗浄したところ、標識（ラベリング）されたオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチドのスポットのみが粒子の粒径に依存して異なる色の発光を示すことを確認した。   When the above labeled (labeled) oligonucleotide is dropped and washed on a DNA chip on which oligonucleotides having various base sequences are immobilized, the oligonucleotide has a complementary base sequence to the labeled (labeled) oligonucleotide. It was confirmed that only the spot No. 1 emits light of different colors depending on the particle size of the particles.

このことより、ナノ粒子でのオリゴヌクレオチドの標識（ラベリング）を確認することができた。すなわち、この結果により、本発明のシリコン量子ドットを用いた生体物質標識剤を提供することができることが分かる。   This confirmed the labeling (labeling) of the oligonucleotide with the nanoparticles. That is, it can be seen from this result that a biological material labeling agent using the silicon quantum dots of the present invention can be provided.

Claims (6)

シリコンを含有するコア部と酸化ケイ素を含有するシェル層からなるコア／シェル型シリコン量子ドットであって、当該コア／シェル型シリコン量子ドットを一定条件下熱水処理したときに遊離する過酸化水素の濃度が、過マンガン酸カリウム滴定法により１００ｐｐｍ以下であることを特徴とするコア／シェル型シリコン量子ドット。 A core / shell type silicon quantum dot comprising a core part containing silicon and a shell layer containing silicon oxide, and hydrogen peroxide liberated when the core / shell type silicon quantum dot is hydrothermally treated under certain conditions The core / shell type silicon quantum dot is characterized by having a concentration of 100 ppm or less by a potassium permanganate titration method. 前記シェル層が、コア／シェル型シリコン量子ドットの製造工程において、過酸化水素水による水酸化処理とその後に熱水洗浄処理を施されていることを特徴とする請求項１に記載のコア／シェル型シリコン量子ドット。 2. The core / shell according to claim 1, wherein the shell layer is subjected to a hydroxylation treatment with a hydrogen peroxide solution and then a hot water cleaning treatment in a manufacturing process of the core / shell type silicon quantum dots. Shell type silicon quantum dot. 請求項１又は２に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットであって、その表面が有機分子により修飾されていることを特徴とするコア／シェル型シリコン量子ドット。 3. The core / shell type silicon quantum dot according to claim 1, wherein the surface is modified with an organic molecule. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のコア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを有機分子を介して結合させたことを特徴とする生体物質標識剤。 A biological substance labeling agent comprising the core / shell type silicon quantum dots according to any one of claims 1 to 3 and a molecular labeling substance bonded via an organic molecule. 前記分子標識物質が、ヌクレオチド鎖またはタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載の生体物質標識剤。 The biological substance labeling agent according to claim 4, wherein the molecular labeling substance is a nucleotide chain or a protein. 前記コア／シェル型シリコン量子ドットと分子標識物質とを結合させる有機分子が、ビオチン及びアビジンであることを特徴とする請求項４又は５に記載の生体物質標識剤。 6. The biological material labeling agent according to claim 4 or 5, wherein the organic molecules that bind the core / shell type silicon quantum dots and the molecular labeling material are biotin and avidin.