JP2009114085A - Agent for treatment of spinal cord injury - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は脊髄損傷治療剤に係わり、詳細には、有効成分として、多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子、特に多価金属無機塩として、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛またはリン酸カルシウムの皮膜を被覆し、徐放性を有するレチノイン酸ナノ粒子を有効成分として含有するる脊髄損傷治療剤に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for spinal cord injury, and specifically, as an active ingredient, a polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticle, particularly a polyvalent metal inorganic salt, as a coating of calcium carbonate, zinc carbonate or calcium phosphate, The present invention relates to a therapeutic agent for spinal cord injury containing retinoic acid nanoparticles having sustained release as an active ingredient.
脊髄損傷の多くは、外傷性であり、その原因は、交通事故、スポーツ、労災などであるが、非外傷性のものとしては、炎症、出血、腫瘍、脊髄変形などが原因となっている。その病態としては、脊髄実質に出血、浮腫を基盤とする脊髄の挫滅と圧迫病変であり、損傷部位に対応する神経障害が生じる。
主な臨床症状としては、障害レベル以下に不全、或いは完全運動麻痺及び知覚麻痺が出現し、頚髄損傷では、特有な合併症として、呼吸麻痺と過高熱（または過低熱）がみられる。
このような神経障害の改善、特に運動障害の改善は、寝たきり老人の増加の防止や、ＱＯＬ（Quality of Life）の向上に直結しており、近年の平均寿命の延長と共にその重要性が高まりつつある。
Most spinal cord injuries are traumatic, and the causes thereof are traffic accidents, sports, and occupational accidents, but non-traumatic ones are caused by inflammation, bleeding, tumor, spinal deformity, and the like. The pathological condition is hemorrhage in the spinal cord parenchyma, crushing of the spinal cord based on edema and compression lesions, and neuropathy corresponding to the damaged site occurs.
The main clinical symptoms are failure below the disorder level, or complete motor paralysis and sensory paralysis, and cervical spinal cord injury includes respiratory paralysis and hyperthermia (or hypothermia) as specific complications.
Improvement of such neurological disorders, especially improvement of movement disorders, is directly linked to prevention of bedridden elderly people and improvement of QOL (Quality of Life). is there.
脊髄損傷に対する治療法として行われているのは、物理的な圧迫や、障害を除去するための外科的手術と、受傷急性期の脊髄浮腫に対するステロイド剤の投与療法である（非特許文献１）。ステロイド剤の中では、メチルプレドニゾンの大量投与が脊髄損傷に伴う神経症状の改善に有効であると報告されている（非特許文献２）が、ステロイド剤の大量投与は、全身的な副作用が強く発現し、コントロールが困難な上、感染症を伴う脊髄損傷では感染防御機能低下をきたすという問題点がある。
また、さらに現在ステロイド剤の大量投与療法の有効性についてさえ議論されている。
Treatments for spinal cord injury include physical compression, surgical operation to remove the disorder, and administration of steroids for spinal edema in the acute phase of injury (Non-patent Document 1). . Among steroids, large doses of methylprednisone have been reported to be effective in improving neurological symptoms associated with spinal cord injury (Non-patent Document 2), but large doses of steroids have strong systemic side effects. It is expressed and difficult to control, and spinal cord injury associated with infection causes a problem that the defense function of infection is lowered.
In addition, there are even discussions about the effectiveness of high-dose steroid therapy.
以上のように、現在まで脊髄損傷に対する有効な治療薬はなく、新しい治療薬の開発が望まれている。また、高齢化に伴い、神経系疾患に罹患する患者数は増加する傾向にあり、大きな社会問題となってきている。しかしながら、脊髄は中枢神経系器官であり、また再生が困難な臓器であることから、より有効な治療剤の開発が望まれているのが現状である。 As described above, there is no effective therapeutic agent for spinal cord injury so far, and development of a new therapeutic agent is desired. In addition, with the aging of the population, the number of patients suffering from nervous system diseases tends to increase, which has become a major social problem. However, since the spinal cord is a central nervous system organ and an organ that is difficult to regenerate, the development of a more effective therapeutic agent is desired at present.
ところで、近年、脂溶性ビタミンＡ酸であるレチノイン酸のＥＳ細胞（embryo stem cell：胚幹細胞）を含む種々の未分化細胞における分化誘導作用が注目されてきており、また、レチノイン酸の急性前骨髄性白血病に対する治療薬としての臨床的利用がなされている。
しかしながら、レチノイン酸は分子内にカルボキシル基を有する化合物であることから刺激性があり、皮下投与した場合には炎症もしくは注射部位の腫瘍化が認められ、また、脂溶性のために注射剤としての製剤化は困難なものである。したがってレチノイン酸については、種々の徐放化製剤、あるいはターゲット療法としてのドラッグデリバリー・システム（ＤＤＳ）を応用した製剤化が検討されている（非特許文献３）。
In recent years, retinoic acid, which is a fat-soluble vitamin A acid, has attracted attention for its differentiation-inducing action in various undifferentiated cells including ES cells (embryo stem cells). It is clinically used as a therapeutic drug for sex leukemia.
However, since retinoic acid is a compound having a carboxyl group in the molecule, it is irritating, and when administered subcutaneously, inflammation or tumor formation at the injection site is observed. Formulation is difficult. Therefore, for retinoic acid, various sustained-release preparations or preparations using a drug delivery system (DDS) as a target therapy have been studied (Non-patent Document 3).
最近、このレチノイン酸の効果を徐放的に発揮し得る、レチノイン酸ナノ粒子が提案されている（特許文献１）。
本発明者等は、この徐放性を有するレチノイン酸ナノ粒子について、脊髄損傷モデルマウスの脊髄損傷部位に投与し、その運動機能評価を検討したところ、脊髄機能の回復を促進させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
The present inventors administered this retinoic acid nanoparticle having sustained release properties to the spinal cord injury site of a spinal cord injury model mouse and examined its motor function evaluation, and found that the recovery of spinal cord function was promoted. The present invention has been completed.
したがって本発明は、外科的手術によらず、またステロイド剤等の大量投与とは異なり、副作用のない脊髄損傷治療剤を提供すること、特に、レチノイン酸を徐放化したナノ粒子を有効成分として含有する脊髄損傷治療剤を提供することを課題とする。 Therefore, the present invention provides a therapeutic agent for spinal cord injury that does not depend on surgical operation and has no side effects unlike large-scale administration of steroids and the like, in particular, nanoparticles with sustained release of retinoic acid as an active ingredient. It is an object of the present invention to provide a therapeutic agent for spinal cord injury.
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的態様として、レチノイン酸のミセル表面を多価金属無機塩で被覆してなる平均粒子径が５〜３００ｎｍを有する多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子を有効成分とすることを特徴とする脊髄損傷治療剤である。 In order to solve the above-mentioned problems, the present invention has, as a basic aspect thereof, a polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid having an average particle diameter of 5 to 300 nm formed by coating the retinoic acid micelle surface with a polyvalent metal inorganic salt A therapeutic agent for spinal cord injury, characterized by comprising nanoparticles as an active ingredient.
具体的には、本発明は、有効成分である多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子における多価金属無機塩の皮膜が、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛またはリン酸カルシウムである上記の脊髄損傷治療剤である。 Specifically, the present invention is the above spinal cord injury therapeutic agent, wherein the coating film of the polyvalent metal inorganic salt in the polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles as an active ingredient is calcium carbonate, zinc carbonate or calcium phosphate. .
より具体的には、本発明は、有効成分である多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子が、レチノイン酸の低級アルコール溶液をアルカリ水溶液と共に分散し、さらに非イオン性界面活性剤を添加することにより調製した混合ミセルに、２価金属ハロゲン化物または酢酸化物およびアルカリ金属炭酸化物またはリン酸化物を、モル比で１：０〜１．０の範囲内で添加することによりミセル表面に多価金属無機塩の皮膜を形成し、その平均粒子径を５〜３００ｎｍの範囲内に調整することにより得られたものである上記する脊髄損傷治療剤である。 More specifically, in the present invention, the retinoic acid nanoparticles coated with polyvalent metal inorganic salt, which is an active ingredient, disperse a lower alcohol solution of retinoic acid together with an aqueous alkaline solution, and further add a nonionic surfactant. A polyvalent metal is added to the micelle surface by adding a divalent metal halide or acetic oxide and an alkali metal carbonate or phosphorous oxide in a molar ratio of 1: 0 to 1.0. The therapeutic agent for spinal cord injury as described above, which is obtained by forming a film of an inorganic salt and adjusting the average particle size within a range of 5 to 300 nm.
好ましくは、本発明は、有効成分が、平均粒子径が５〜３００ｎｍを有する、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛或いは、リン酸カルシウム被覆レチノイン酸ナノ粒子である上記する脊髄損傷治療剤である。 Preferably, the present invention provides the therapeutic agent for spinal cord injury, wherein the active ingredient is calcium carbonate, zinc carbonate, or calcium phosphate-coated retinoic acid nanoparticles having an average particle diameter of 5 to 300 nm.
もっとも好ましい本発明は、徐放性である上記した脊髄損傷治療剤である。 The most preferred present invention is the above-mentioned therapeutic agent for spinal cord injury that is sustained release.
本発明は、基本的には有効成分として、多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子、特に多価金属無機塩として、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛またはリン酸カルシウムの皮膜を被覆し、徐放性を有するレチノイン酸ナノ粒子を有効成分として含有するる脊髄損傷治療剤である。
本発明により提供される脊髄損傷治療剤は、患者に対する侵襲的な外科的手術によることなく、脊髄損傷部位に局所的に投与することにより、損傷した脊髄機能の回復を促進させることができるものである利点を有している。
The present invention basically includes a retinoin having a sustained release property as a multivalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticle, particularly a polyvalent metal inorganic salt coated with a calcium carbonate, zinc carbonate or calcium phosphate film as an active ingredient. A therapeutic agent for spinal cord injury containing acid nanoparticles as an active ingredient.
The therapeutic agent for spinal cord injury provided by the present invention can promote the recovery of damaged spinal cord function by locally administering it to the site of spinal cord injury without invasive surgical operation on the patient. It has certain advantages.
本発明が提供する有効成分である多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子は、その平均粒子径が５〜３００ｎｍの範囲内の極めて微細なものであり、生体適合性の多価金属無機塩の皮膜によりレチノイン酸が被覆されていることから低刺激性であり、投与部位における炎症の発生、腫瘍化などがみられない特性を有する。
さらに、多価金属無機塩を被覆したナノ粒子としたことにより、刺激性を低減し、また平均粒子径が５〜３００ｎｍと微細なものであることから、組織浸透性が向上し、レチノイン酸の血中動態が上昇し、短時間のうちにレチノイン酸が血中に存在し、また徐放的に長時間に亘って、血中濃度を維持し得る利点を有している。
その結果、上皮細胞の増殖因子であるＨＢ−ＥＧＦ（HB-Epidermal Growth Factor）の産生量が上昇し、再生医療への応用として、極めて有用なものである。
The polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles that are active ingredients provided by the present invention are extremely fine particles having an average particle diameter in the range of 5 to 300 nm, and are biocompatible polyvalent metal inorganic salts. Since it is coated with retinoic acid by a film, it is hypoallergenic and has the characteristics that neither inflammation nor tumor formation is observed at the administration site.
Furthermore, since the nanoparticles coated with a polyvalent metal inorganic salt are used, the irritation is reduced, and the average particle diameter is as fine as 5 to 300 nm, so that the tissue permeability is improved and retinoic acid Blood kinetics increases, retinoic acid is present in the blood within a short time, and the blood concentration can be maintained over a long period of time in a sustained release manner.
As a result, the production amount of HB-EGF (HB-Epidermal Growth Factor), which is an epithelial cell growth factor, is increased, which is extremely useful as an application to regenerative medicine.
本発明の有効成分であるレチノイン酸ナノ粒子を構成するレチノイン酸は、生理学的には、視覚、聴覚、生殖などの機能保持、成長促進、皮膚や粘膜などの正常保持、制ガン作用等を有し、急性前骨髄球性白血病（APL: acute promyelocytic leukemia）の治療薬として臨床的に使用されている全トランス体レチノイン酸（all-trans retinoic acid）である。 The retinoic acid constituting the retinoic acid nanoparticles as an active ingredient of the present invention physiologically has functions such as visual, auditory, and reproductive, growth promotion, normal maintenance of skin and mucous membranes, anticancer action and the like. However, it is an all-trans retinoic acid clinically used as a therapeutic agent for acute promyelocytic leukemia (APL).
本発明においては、かかるレチノイン酸を多価金属無機塩で被覆したナノ粒子として、レチノイン酸の放出についての徐放性を確保したものである。かかる多価金属無機塩を被覆したレチノイン酸のナノ粒子の調製は、例えば、国際公開ＷＯ２００５／０３７２６８号公報（特許文献１）に記載の方法により調整することができる。
したがって、本国際公開ＷＯ２００５／０３７２６８号公報は、本明細書の一部として取り込まれるものである。
In the present invention, as the nanoparticles coated with such retinoic acid with a polyvalent metal inorganic salt, sustained release property for the release of retinoic acid is ensured. Preparation of the retinoic acid nanoparticles coated with the polyvalent metal inorganic salt can be prepared by, for example, the method described in International Publication WO2005 / 037268 (Patent Document 1).
Therefore, this international publication WO2005 / 037268 is incorporated as a part of this specification.
この多価金属無機塩を被覆したレチノイン酸のナノ粒子の調製は、詳細には以下のようにして行われる。
すなわち、レチノイン酸は、脂溶性化合物であり、また分子内にカルボン酸基を有していることから、アルカリ水溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液および少量の低級アルコールを添加することにより、水溶液中で球状のミセルが形成される。このミセルの表面は、マイナス荷電で覆われた状態となっているため、容易に２価金属イオン、たとえばカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が吸着（結合）し、ナトリウムイオンとの交換反応が生じる。この場合、２価金属イオンはナトリウムイオンに比較して吸着力（結合力）が高いことから、２価金属イオンを吸着したミセルは、その表面の荷電は解離しにくくなり、水に不溶化して、ミセルは沈殿する。沈澱を生じると、粒子同士の凝集が生じ、非常に大きな粒子を形成することとなる。
Preparation of the retinoic acid nanoparticles coated with the polyvalent metal inorganic salt is carried out in detail as follows.
That is, since retinoic acid is a fat-soluble compound and has a carboxylic acid group in the molecule, it can be spheroidized in an aqueous solution by adding an alkaline aqueous solution such as an aqueous sodium hydroxide solution and a small amount of a lower alcohol. Micelles are formed. Since the surface of the micelle is covered with a negative charge, a divalent metal ion, for example, calcium ion (Ca 2+ ) is easily adsorbed (bonded) to cause an exchange reaction with sodium ion. In this case, since bivalent metal ions have higher adsorption power (binding force) than sodium ions, micelles that adsorb divalent metal ions are less likely to dissociate their surface charge and become insoluble in water. The micelles precipitate. When precipitation occurs, the particles are aggregated to form very large particles.
したがって、この段階での粒子同士の凝集を防ぐために、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Tween 80）をレチノイン酸と共に添加する。すなわち、Tween 80は、レチノイン酸と共に混合ミセルを形成し、ミセル表面上にポリオキシエチレン鎖を突出させているため、多価金属イオンがミセル表面に吸着（結合）しても、ミセル表面に突出した親水基としてのポリオキシエチレン鎖の存在により、ミセルの沈澱が生じないこととなる。 Therefore, in order to prevent the particles from aggregating at this stage, a nonionic surfactant such as polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (Tween 80) is added together with retinoic acid. That is, Tween 80 forms mixed micelles with retinoic acid and has polyoxyethylene chains protruding on the micelle surface, so even if polyvalent metal ions are adsorbed (bonded) to the micelle surface, they protrude on the micelle surface. Due to the presence of the polyoxyethylene chain as the hydrophilic group, micelle precipitation does not occur.
次いで、２価金属ハロゲン化物または酢酸化物、例えば塩化カルシウムを添加する。この場合の２価金属ハロゲン化物の添加量は、レチノイン酸のミセル表面に２価金属イオンを吸着させるに十分な量であればよい。２価の金属イオンはナトリウムイオンより吸着力（結合力）が強く、ナトリウムイオンとの交換が生じる。その結果、２価金属イオンが優先的に吸着（結合）することとなり、ミセル表面が２価金属イオンで覆われた球状もしくは卵形等のミセルが形成される。そこに、さらにアルカリ金属炭酸化物またはアルカリ金属リン酸化物を添加すると、ミセル表面電荷は完全に中和されていないために、さらに炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）あるいはリン酸イオン（ＰＯ４ ２−）が表面にある２価金属イオンに吸着（結合）する。この結果、レチノイン酸のミセル表面に多価金属無機塩の皮膜が形成されりこととなり、多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子が調製される。 Next, a divalent metal halide or vinegar oxide such as calcium chloride is added. The addition amount of the divalent metal halide in this case may be an amount sufficient for adsorbing the divalent metal ions on the retinoic acid micelle surface. Divalent metal ions have stronger adsorption power (binding power) than sodium ions, and exchange with sodium ions occurs. As a result, divalent metal ions are preferentially adsorbed (bonded), and spherical or egg-shaped micelles whose micelle surface is covered with divalent metal ions are formed. If an alkali metal carbonate or an alkali metal phosphate is further added thereto, the micelle surface charge is not completely neutralized. Therefore, carbonate ions (CO 3 2− ) or phosphate ions (PO 4 2− ) are further added. ) Adsorbs (bonds) to the divalent metal ions on the surface. As a result, a polyvalent metal inorganic salt film is formed on the surface of the retinoic acid micelle, and the polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles are prepared.
かかる多価金属無機塩被覆ナノ粒子における多価金属無機塩としては、生体適合性を有する炭酸カルシウム、炭酸亜鉛またはリン酸カルシウムをあげることができる。
したがって、２価の金属ハロゲン化物または酢酸化物としては、カルシウムハロゲン化物、亜鉛ハロゲン化物、酢酸カルシウムまたは酢酸亜鉛であり、カルシウムハロゲン化物および亜鉛ハロゲン化物としては、具体的には、塩化カルシウム、臭化カルシウム、フッ化カルシウム、ヨウ化カルシウム、塩化亜鉛、臭化亜鉛、フッ化亜鉛およびヨウ化亜鉛をあげることができる。
Examples of the polyvalent metal inorganic salt in the polyvalent metal inorganic salt-coated nanoparticles include biocompatible calcium carbonate, zinc carbonate, or calcium phosphate.
Accordingly, the divalent metal halide or vinegar oxide is calcium halide, zinc halide, calcium acetate or zinc acetate, and specific examples of calcium halide and zinc halide include calcium chloride, bromide. Calcium, calcium fluoride, calcium iodide, zinc chloride, zinc bromide, zinc fluoride and zinc iodide can be mentioned.
また、アルカリ金属炭酸化物またはアルカリ金属リン酸化物としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムをあげることができる。
一方、ナノ粒子の調製に使用する低級アルコールとしては、メタノールあるいはエタノールをあげることができる。
Examples of the alkali metal carbonate or alkali metal phosphate include sodium carbonate, potassium carbonate, sodium phosphate and potassium phosphate.
On the other hand, examples of the lower alcohol used for the preparation of the nanoparticles include methanol and ethanol.
また、非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（Tween 80）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Tween 20）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（Tween 60）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（Tween 40）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート（Tween 85）、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステルおよびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油をあげることができる。
以上の方法により調製された多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子は、微細なナノ粒子ではあるが、その粒度分布は幅広く、１０〜３０００ｎｍ程度の粒子径（直径）を有するものであった。
Examples of the nonionic surfactant include polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (Tween 80), polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Tween 20), polyoxyethylene (20) sorbitan mono Stearate (Tween 60), polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate (Tween 40), polyoxyethylene (20) sorbitan trioleate (Tween 85), polyoxyethylene (8) octylphenyl ether, polyoxyethylene ( 20) Cholesterol esters and polyoxyethylene hydrogenated castor oil can be mentioned.
The polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles prepared by the above method are fine nanoparticles, but have a wide particle size distribution and have a particle diameter (diameter) of about 10 to 3000 nm.
ところで、多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子を皮下投与あるいは静脈内投与する場合、またさらに皮膚投与してレチノイン酸を経皮吸収させる場合には、その粒径は５〜３００ｎｍ程度の極めて微細なナノ粒子であることが好ましい。したがって目的とする多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子について、その粒径が５〜３００ｎｍ程度の極めて微細なナノ粒子に調整する必要がある。
かかる粒子径の調整は、レチノイン酸のミセルの表面に形成させるために添加する、２価金属ハロゲン化物または酢酸化物と、アルカリ金属炭酸化物またはリン酸化物のモル比を変化させ、かつ超音波処理等の機械的振動を与えることにより行い得ることが判明した。
By the way, when the multivalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles are administered subcutaneously or intravenously, or when the retinoic acid is percutaneously absorbed by dermal administration, the particle size thereof is about 5 to 300 nm. Nanoparticles are preferred. Therefore, it is necessary to adjust the target polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles to extremely fine nanoparticles having a particle size of about 5 to 300 nm.
The adjustment of the particle diameter is performed by changing the molar ratio of the divalent metal halide or acetyl oxide added to form the surface of the retinoic acid micelle and the alkali metal carbonate or phosphate, and ultrasonic treatment. It was found that this can be done by applying mechanical vibration such as
すなわち、レチノイン酸のミセル表面への多価金属無機塩の皮膜の形成は、アルカリ（具体的にはナトリウム）水溶液中で形成されたミセルの表面のマイナス荷電を、２価金属ハロゲン化物または酢酸化物による２価金属イオン、例えばカルシウムイオン（Ｃａ２＋）との交換反応、およびアルカリ金属炭酸化物あるいはリン酸化物による炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）またはリン酸イオン（ＰＯ４ ２−）とによる中和で行われる。 That is, the formation of a polyvalent metal inorganic salt film on the micelle surface of retinoic acid is obtained by converting the negative charge of the micelle surface formed in an alkali (specifically, sodium) aqueous solution to a divalent metal halide or vinegar oxide. Exchange reaction with divalent metal ions, such as calcium ions (Ca 2+ ), and neutralization with carbonate ions (CO 3 2− ) or phosphate ions (PO 4 2− ) with alkali metal carbonates or phosphates Done in
具体的には、添加する２価金属ハロゲン化物または酢酸化物と、アルカリ金属炭酸化物あるいはリン酸化物の両者の比率を、モル比で１：０〜１．０の範囲内で添加することにより、ミセル表面に多価金属無機塩の皮膜を形成し、所望により超音波処理等の機械的振動を加え、その平均粒子径を５〜３００ｎｍの範囲内とすることが可能となった。
アルカリ金属炭酸化物あるいはリン酸化物を２価金属ハロゲン化物または酢酸化物１モルに対し１．０モルを超えて添加した場合には、ミセル表面上に多価金属無機塩の皮膜の形成は生じるものの、粒径が大きなものとなり、粒子同士の凝集が生じてしまい、超音波処理を加えても所望の平均粒子径を有するナノ粒子を得ることができず、好ましいものではない。
Specifically, by adding the ratio of both the divalent metal halide or vinegar oxide to be added and the alkali metal carbonate or phosphorus oxide within a molar ratio of 1: 0 to 1.0, A film of a polyvalent metal inorganic salt was formed on the micelle surface, and mechanical vibration such as ultrasonic treatment was applied as desired, so that the average particle size could be in the range of 5 to 300 nm.
When alkali metal carbonate or phosphorous oxide is added in an amount exceeding 1.0 mole per mole of divalent metal halide or vinegar oxide, a polyvalent metal inorganic salt film is formed on the micelle surface. The particle size becomes large, the particles are aggregated, and even if ultrasonic treatment is applied, nanoparticles having a desired average particle size cannot be obtained, which is not preferable.
しかしながら、添加する２価金属ハロゲン化物または酢酸化物と、アルカリ金属炭酸化物またはリン酸化物との両者の比率を、モル比を１：０〜１．０の範囲内で添加した場合には、ミセル表面に多価金属無機塩の皮膜が形成され、そのうえで平均粒子径を５〜３００ｎｍの範囲内とすることが可能となったのである。
なお、得られたナノ粒子は凝集体として存在している場合もあり、この場合にはかかる凝集体を超音波処理等の機械的振動を与えることにより、極めて均一な平均粒子径を有するナノ粒子に調製し得ることが判明した。したがって、本発明のナノ粒子にはそのような凝集体をも包含する。
However, when the ratio of both the divalent metal halide or vinegar oxide to be added and the alkali metal carbonate or phosphorus oxide is added within the range of 1: 0 to 1.0, the micelle A coating of a polyvalent metal inorganic salt was formed on the surface, and it was possible to make the average particle diameter within the range of 5 to 300 nm.
In some cases, the obtained nanoparticles may exist as aggregates. In this case, the aggregates are subjected to mechanical vibration such as sonication, so that nanoparticles having an extremely uniform average particle diameter are present. It was found that it can be prepared. Accordingly, the nanoparticles of the present invention also include such aggregates.
本発明が提供する脊髄損傷治療剤は、レチノイン酸のミセル表面を多価金属無機塩で被覆してなる平均粒子径が５〜３００ｎｍを有する多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子を有効成分とすることを特徴とする脊髄損傷治療剤である。
治療剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張化剤などの各種製剤化用の配合成分を添加し、調製することができる。
The therapeutic agent for spinal cord injury provided by the present invention comprises polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles having an average particle diameter of 5 to 300 nm formed by coating a retinoic acid micelle surface with a polyvalent metal inorganic salt as an active ingredient. It is a therapeutic agent for spinal cord injury.
The therapeutic agents include conventional pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH adjusters, disintegrants, solubilizers, solubilizers, tonicity agents, etc. Various formulation ingredients can be added and prepared.
本発明が提供する脊髄損傷治療剤は、経口的、或いは非経口的に投与することができる。すなわち、通常用いられる投与形態、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の形態で経口的に、或いは溶液製剤、懸濁製剤等の形態で非経口的に局所的に投与することができる。 The therapeutic agent for spinal cord injury provided by the present invention can be administered orally or parenterally. That is, it can be administered topically orally, for example, orally in the form of tablets, powders, granules, capsules, etc., or parenterally in the form of solution preparations, suspension preparations, etc. it can.
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
なお、本発明が提供する脊髄損傷治療剤における有効成分である多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子において、炭酸カルシウム被覆レチノイン酸ナノ粒子を「レチノイン酸−CaCO３ナノ粒子」と、炭酸亜鉛被覆レチノイン酸ナノ粒子を「レチノイン酸−ZnCO３ナノ粒子」と、また、リン酸カルシウム被覆レチノイン酸ナノ粒子を「レチノイン酸−CaPO４ナノ粒子」と記載する場合もある。
EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
In addition, in the polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles that are active ingredients in the spinal cord injury therapeutic agent provided by the present invention, the calcium carbonate-coated retinoic acid nanoparticles are referred to as “retinoic acid-CaCO 3 nanoparticles” and zinc carbonate-coated. A retinoic acid nanoparticle may be described as “retinoic acid-ZnCO 3 nanoparticle”, and a calcium phosphate-coated retinoic acid nanoparticle may be described as “retinoic acid-CaPO 4 nanoparticle”.
試験例１：レチノイン酸−CaCO ３ ナノ粒子の作製
レチノイン酸１３．６ｍｇを９００μＬのエタノール（またはメタノール）に溶解し、この溶液に０．５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液の１００μＬを加えた。このときのｐＨは、７〜７．５であった。この溶液を母液として１００μＬ採取し、これをTween 80を含む蒸留水１００μＬに加え、よく攪拌した。
約３０分後に、５Ｍ−塩化カルシウム含有水溶液を加え攪拌し、さらに３０分後に１Ｍ−炭酸ナトリウム含有水溶液を加え、さらに攪拌した。一昼夜攪拌を継続した後、得られた溶液を一夜凍結乾燥し、目的とする炭酸カルシウム被覆レチノイン酸ナノ粒子を作製した。
この場合において、塩化カルシウムおよび炭酸ナトリウムのモル比を変化させてレチノイン酸のミセルに添加させることによりえられるレチノイン酸−CaCO３ナノ粒子の製造直後の粒子径（直径）および５分間の超音波処理を施した後の粒子径（直径）は、下記表１に記載のとおりであった。
Test Example 1 : Preparation of retinoic acid-CaCO 3 nanoparticles 13.6 mg of retinoic acid was dissolved in 900 μL of ethanol (or methanol), and 100 μL of 0.5 N NaOH aqueous solution was added to this solution. The pH at this time was 7 to 7.5. 100 μL of this solution was taken as a mother liquor and added to 100 μL of distilled water containing Tween 80 and stirred well.
About 30 minutes later, 5M-calcium chloride-containing aqueous solution was added and stirred, and further 30 minutes later, 1M-sodium carbonate-containing aqueous solution was added and further stirred. After stirring all day and night, the resulting solution was freeze-dried overnight to produce the desired calcium carbonate-coated retinoic acid nanoparticles.
In this case, the particle diameter (diameter) of the retinoic acid-CaCO 3 nanoparticles obtained by changing the molar ratio of calcium chloride and sodium carbonate and adding them to the micelles of retinoic acid, and sonication for 5 minutes. The particle diameter (diameter) after applying was as shown in Table 1 below.
表１：ナノ粒子の粒径に及ぼす塩化カルシウムおよび炭酸ナトリウムの比率 Table 1: Ratios of calcium chloride and sodium carbonate on nanoparticle size
表１に示した結果からも判明するように、塩化カルシウムおよび炭酸ナトリウムのモル比を調整し、レチノイン酸ミセルに添加することにより、レチノイン酸−CaCO３ナノ粒子の粒径が調整されていることが理解される。
特に、塩化カルシウムおよび炭酸ナトリウムをモル比で１：０〜０．２までの範囲内で添加することにより、レチノイン酸ミセルの表面に炭酸カルシウム皮膜を形成し、その粒径が１０〜５０ｎｍの範囲内に調整されている。
また、塩化カルシウムおよび炭酸ナトリウムをモル比で１：０．３〜１．０の場合には、製造直後の平均粒子径は、３５０から１５００ｎｍ程度のものであったが、これは微細なナノ粒子が凝集して、凝集塊としての大きな平均粒子径を有する値を示しているものであった。
この凝集塊は、超音波処理を施すことにより、凝集塊が個々の粒子に分散し、平均粒子径が１００ｎｍ程度の極めて均一なナノ粒子に分散した。
したがって、塩化カルシウムおよび炭酸ナトリウムをモル比で１：０〜１．０で添加させ、超音波処理等の機械的振動を与えることにより、その平均粒子径が５〜３００ｎｍを有するレチノイン酸−CaCO３ナノ粒子として調整されることが判明した。
As can be seen from the results shown in Table 1, the particle size of retinoic acid-CaCO 3 nanoparticles is adjusted by adjusting the molar ratio of calcium chloride and sodium carbonate and adding them to retinoic acid micelles. Is understood.
In particular, by adding calcium chloride and sodium carbonate in a molar ratio of 1: 0 to 0.2, a calcium carbonate film is formed on the surface of retinoic acid micelles, and the particle size is in the range of 10 to 50 nm. Has been adjusted in.
Further, when the molar ratio of calcium chloride and sodium carbonate was 1: 0.3 to 1.0, the average particle size immediately after the production was about 350 to 1500 nm. Agglomerated and showed a value having a large average particle diameter as an aggregate.
This aggregate was subjected to ultrasonic treatment, whereby the aggregate was dispersed into individual particles and dispersed into extremely uniform nanoparticles having an average particle diameter of about 100 nm.
Therefore, retinoic acid-CaCO 3 having an average particle diameter of 5 to 300 nm is obtained by adding calcium chloride and sodium carbonate at a molar ratio of 1: 0 to 1.0 and applying mechanical vibration such as ultrasonic treatment. It was found to be prepared as nanoparticles.
試験例２：レチノイン酸−ZnCO ３ ナノ粒子の作製
レチノイン酸１３．６ｍｇを９００μＬのエタノールに溶解して、この溶液に０．５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液の１００μＬを加えた。このときのｐＨは、７〜７．５であった。この溶液を母液として１００μＬ採取し、これをTween 80を含む蒸留水１００μＬに加え、よく攪拌した。
約３０分後に、５Ｍ−酢酸亜鉛含有水溶液を加え攪拌し、さらに３０分後に１Ｍ−炭酸ナトリウム含有水溶液を加え、さらに攪拌した。一昼夜攪拌を継続した後、得られた溶液を一夜凍結乾燥し、目的とする炭酸亜鉛被覆レチノイン酸ナノ粒子（レチノイン酸−ZnCO３ナノ粒子）を作製した。
作製されたレチノイン酸−ZnCO３ナノ粒子の粒子径は、上記の試験例１と同様の粒度分布を有するのであった。
Test Example 2 Preparation of Retinoic Acid-ZnCO 3 Nanoparticles 13.6 mg of retinoic acid was dissolved in 900 μL of ethanol, and 100 μL of 0.5 N NaOH aqueous solution was added to this solution. The pH at this time was 7 to 7.5. 100 μL of this solution was taken as a mother liquor and added to 100 μL of distilled water containing Tween 80 and stirred well.
About 30 minutes later, a 5M zinc acetate-containing aqueous solution was added and stirred, and after another 30 minutes, a 1M sodium carbonate-containing aqueous solution was added and further stirred. After stirring all day and night, the resulting solution was freeze-dried overnight to produce the desired zinc carbonate-coated retinoic acid nanoparticles (retinoic acid-ZnCO 3 nanoparticles).
The produced retinoic acid-ZnCO 3 nanoparticles had a particle size distribution similar to that of Test Example 1 described above.
試験例３：レチノイン酸−CaPO ４ ナノ粒子の作製
レチノイン酸１３．６ｍｇを９００μＬのエタノールに溶解して、この溶液に０．５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液の１００μＬを加えた。このときのｐＨは、７〜７．５であった。この溶液を母液として１００μＬ採取し、これをTween 80を含む蒸留水１００μＬに加え、よく攪拌した。
約３０分後に、５Ｍ−塩化カルシウム含有水溶液を加え攪拌し、さらに３０分後に１Ｍ−リン酸ナトリウム含有水溶液を加え、さらに攪拌した。一昼夜攪拌を継続した後、得られた溶液を一夜凍結乾燥し、目的とするリン酸カルシウム被覆レチノイン酸ナノ粒子（レチノイン酸−CaPO４ナノ粒子）を作製した。
作製されたレチノイン酸−CaPO４ナノ粒子の粒子径も、上記の試験例１と同様の粒度分布を示すものであった。
Test Example 3 Preparation of Retinoic Acid-CaPO 4 Nanoparticles 13.6 mg of retinoic acid was dissolved in 900 μL of ethanol, and 100 μL of 0.5 N NaOH aqueous solution was added to this solution. The pH at this time was 7 to 7.5. 100 μL of this solution was taken as a mother liquor and added to 100 μL of distilled water containing Tween 80 and stirred well.
About 30 minutes later, 5M-calcium chloride-containing aqueous solution was added and stirred, and further 30 minutes later, 1M-sodium phosphate-containing aqueous solution was added and further stirred. After stirring all day and night, the resulting solution was freeze-dried overnight to produce the desired calcium phosphate-coated retinoic acid nanoparticles (retinoic acid-CaPO 4 nanoparticles).
The particle size of the produced retinoic acid-CaPO 4 nanoparticles also showed the same particle size distribution as in Test Example 1 above.
以上のようにして調製された、本発明の有効成分である多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子の作用の確認を以下の試験例により説明する。
すなわち、本発明の有効成分は、レチノイン酸を多価金属無機塩で被覆してなる平均粒子径が５〜３００ｎｍを有する多価金属無機塩被覆レチノイン酸ナノ粒子とすることにより、徐放性を確保したことによるＤＤＳ化したものである。
The confirmation of the action of the polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticles, which are the active ingredients of the present invention, prepared as described above will be described by the following test examples.
That is, the active ingredient of the present invention is a polyvalent metal inorganic salt-coated retinoic acid nanoparticle having an average particle diameter of 5 to 300 nm formed by coating retinoic acid with a polyvalent metal inorganic salt, thereby providing sustained release. It is a DDS by securing it.
以下の試験により、脊髄半切断モデル（over hemitransection model）を用い、ＤＤＳ化したレチノイン酸ナノ粒子（レチノイン酸徐放製剤）と、レチノイン酸原体を、切断箇所へ局所適用し、その効果を比較検討した。 By the following test, using a spinal cord half-cut model (over hemitransection model), DDS-modified retinoic acid nanoparticles (retinoic acid sustained-release preparation) and retinoic acid drug substance were applied locally to the cut site, and the effects were compared. investigated.
試験例４：ＤＤＳ化したレチノイン酸ナノ粒子（レチノイン酸徐放製剤）の脊髄半切断モデル（over hemitransection model）に対する効果
［方法］
１．被験物質
（１）ＤＤＳ化したレチノイン酸ナノ粒子：徐放製剤（以下、RA徐放製剤と記す）
上記試験例１で得たレチノイン酸−CaCO３ナノ粒子
（２）レチノイン酸原体（以下、RA原体と記す）
２．溶媒
（１）RA徐放製剤：生理食塩水
（２）RA原体：無水エタノール
３．基材
レチノイン酸を浸漬する基材として、０．５ｍｍ角のゲルフォーム（ファイザー社製、No.12、Lot KF345）を使用した。
Test Example 4 : Effect of DDS-modified retinoic acid nanoparticles (retinoic acid sustained-release preparation) on spinal cord semi-cut model (over hemitransection model) [Method]
1. Test substance (1) DDS-modified retinoic acid nanoparticles: sustained release preparation (hereinafter referred to as RA sustained release preparation)
Retinoic acid-CaCO 3 nanoparticles obtained in Test Example 1 (2) Retinoic acid base (hereinafter referred to as RA base)
2. Solvent (1) RA sustained-release preparation: physiological saline (2) RA drug substance: absolute ethanol Substrate A 0.5 mm square gel foam (Pfizer, No. 12, Lot KF345) was used as a substrate into which retinoic acid was immersed.
［調製方法］
（１）RA徐放製剤
手術当日に、生理食塩液２．５ｍＬを添加して１％RA徐放製剤溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、その５μＬ（５０μｇ）を０．５ｍｍ角に切断したゲルフォームに浸漬させた。
（２）RA原体
手術当日に、無水エタノールで５．０ｍｇ／ｍＬレチノイン酸溶液を調製し、そのうちの１μＬずつを、０．５ｍｍ角に切断したゲルフォームに浸漬し、風乾させた。この工程を１０回繰り返し、風乾後に生理食塩液を５μＬずつゲルフォームに浸漬させた。
[Preparation method]
(1) RA sustained release preparation On the day of surgery, 2.5 mL of physiological saline was added to prepare a 1% RA sustained release preparation solution (10 mg / mL), and 5 μL (50 μg) was cut into 0.5 mm squares. It was immersed in gel foam.
(2) RA drug substance On the day of surgery, 5.0 mg / mL retinoic acid solution was prepared with absolute ethanol, and 1 μL of each was immersed in 0.5 mm square gel foam and allowed to air dry. This process was repeated 10 times. After air drying, 5 μL of physiological saline was immersed in the gel foam.
［保存方法］
RA徐放製剤溶液、RA原体ともに、−７０℃以下にて保存した。
［投与量］
以下の表２に記載の通りである。
[Preservation method]
Both the RA sustained-release preparation solution and the RA drug substance were stored at −70 ° C. or lower.
[Dose]
It is as described in Table 2 below.
４．実験動物
雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス６０例（チャールス・リバー・ラボラトリー・ジャパンより購入。５週齢で入荷。８週齢）で手術に供した。
検疫期間中は、体重測定、動物の一般状態の観察を行い、動物番号は、入荷後の体重測定時に付与した。
試験期間中は、週に一度、飼育ケージ及び飲料水の交換を行った。
なお、試験終了後、速やかに安楽致死を実施した。
4). Experimental animals 60 female C57BL / 6J mice (purchased from Charles River Laboratory Japan. In stock at 5 weeks of age. 8 weeks of age) were used for surgery.
During the quarantine period, the body weight was measured and the general condition of the animal was observed, and the animal number was assigned when the body weight was measured after arrival.
During the test period, the cage and drinking water were changed once a week.
After the test, euthanasia was performed immediately.
５．試験方法
（１）手術方法
Mikamiらの方法（非特許文献４）に準じて行った。手術前日に背部を除毛し、手術前に体重を測定すると同時に、異常行動、外観異常、体重減少などを示している動物は試験より除外した。
１．５〜２．０％インフルラン吸入麻酔下に、実体顕微鏡下にてマウスの背部を切開し、第８胸椎（Ｔ８）の椎弓を切除し、脊髄を露出させた。
左側脊髄を眼科用ハサミで切断し、切断部位に溶媒（生理食塩液）或いは被験物質を浸漬したゲルフォーム（０．５ｍｍ角）を挿入し、筋肉を縫合後、皮膚をクリップで留めた。この操作は、３７℃の保温プレート上で行った。
マウスをケージに戻し、卓上電気ランプで温め、麻酔から覚醒後に後肢麻痺を確認し、麻痺不全の動物は、以後の実験より除外した。
原則的に、手術後６日間は、強制的に１日１回排尿させ、給水ビンは通常の位置よりも低めに設定し、餌は撒き餌とした。
5. Test method (1) Surgery method
This was performed according to the method of Mikami et al. On the day before surgery, the back was removed and the body weight was measured before surgery. At the same time, animals showing abnormal behavior, abnormal appearance, weight loss, etc. were excluded from the study.
Under 1.5-2.0% influenza inhalation anesthesia, the back of the mouse was incised under a stereomicroscope, the vertebra of the eighth thoracic vertebra (T8) was excised, and the spinal cord was exposed.
The left spinal cord was cut with ophthalmic scissors, a gel foam (0.5 mm square) dipped in a solvent (saline solution) or a test substance was inserted into the cut site, the muscle was sutured, and the skin was clipped. This operation was performed on a 37 ° C. heat-retaining plate.
The mouse was returned to the cage and warmed with a tabletop electric lamp. After waking up from anesthesia, hind limb paralysis was confirmed, and animals with paralysis deficiency were excluded from the subsequent experiments.
In principle, for 6 days after the operation, the urine was forced to urinate once a day, the water supply bottle was set lower than the normal position, and the bait was used as a bait.
（２）試験群
脊髄を損傷させた群は以下のように３群にし、さらに何も処理しない正常群（Normal群）を１群設けた。
SCI＋溶媒（生理食塩液）投与群：n＝６
SCI＋RA徐放製剤投与群：ｎ＝７
SCI＋RA原体投与群：ｎ＝６
Normal群：ｎ＝８
SCI：Spinal Cord Injury：脊髄損傷手術施行
(2) Test group The group in which the spinal cord was damaged was divided into three groups as follows, and one normal group (Normal group) in which nothing was further treated was provided.
SCI + solvent (saline solution) administration group: n = 6
SCI + RA sustained-release preparation administration group: n = 7
SCI + RA drug substance administration group: n = 6
Normal group: n = 8
SCI: Spinal Cord Injury: Surgery for spinal cord injury
（３）被験物質の投与方法
ゲルフォーム（０．５ｍｍ角）へ浸漬し、損傷局所へ適用した。
(3) Test substance administration method The test substance was immersed in gel foam (0.5 mm square) and applied to the damaged area.
（４）被験物質の投与期間
脊髄損傷手術の施行日の１日
（５）評価方法
垂直方向の動きとして、立ち上がり（REARING）回数、及び水平方向の動きとして、自発運動量（MOVE 1、MOVE 2）測定。
MOVE 1、MOVE 2及び立ち上がり回数を、Mikamiらの方法（非特許文献４）に準じて行った。すなわち、小動物運動解析装置：Scanet SV-20にて、１５分間の間における立ち上がり回数、MOVE 1、MOVE 2を測定した。また、１５分間の立ち上がり（REARING）回数から、REARING SCOREを算出した。
なお、REARING回数とREARING SCOREの関係は、下記表３による。
(4) Test substance administration period One day on the day of spinal cord injury surgery (5) Evaluation method As the vertical movement, the number of rising (REARING), and as the horizontal movement, the amount of spontaneous movement (MOVE 1, MOVE 2) Measurement.
MOVE 1, MOVE 2 and the number of rises were performed according to the method of Mikami et al. (Non-patent Document 4). That is, the number of rises during 15 minutes, MOVE 1 and MOVE 2 were measured with a small animal movement analyzer: Scanet SV-20. Further, REARING SCORE was calculated from the number of times of rising (REARING) for 15 minutes.
The relationship between the number of REARING and REARING SCORE is shown in Table 3 below.
下肢機能評価：BBB locomotor rating scale（以下、BBBスコアと略記）
指定された３名のうち２名以上の評価者が、Basso, Beattle and Bresnahanらの方法（非特許文献５）によるBBBスコアをブラインドで評価し、平均値を算出した。
Lower limb function evaluation: BBB locomotor rating scale (hereinafter abbreviated as BBB score)
Two or more evaluators out of the designated three people blindly evaluated the BBB score by the method of Basso, Beattle and Bresnahan et al. (Non-patent Document 5), and calculated the average value.
［結果］
Day 1では、Normal群を除いた全群／全個体で立ち上がり（REARING）は観察されなかったが、Day 4ではRA徐放製剤投与群で、７例中３例のマウスにREARINGが認められた。１５分間のREARING回数の平均は、４．３回であった。
一方、溶媒投与群では、６例中１例のマウスに１回のREARING回数が見られたに過ぎず、また、RA原体投与群では、REARINGを示す動物は観察されなかった。
Day 7では、各群で多くの動物でREARINGが観察され、その回数は、溶媒投与群で７．２回、RA徐放製剤投与群で１８．３回、RA原体投与群で４．０回と、RA徐放製剤投与群は、RA原体投与群に比較して、約４．５倍高値であった。
Day 14においても、RA徐放製剤投与群は、RA原体投与群に比較して、約２．７倍高値であった。
これらの結果を、下記表４及び図１にまとめて示した。
[result]
On Day 1, no rise (REARING) was observed in all groups / all individuals except the Normal group, but on Day 4, REARING was observed in 3 out of 7 mice in the RA sustained-release preparation group . The average number of REARING for 15 minutes was 4.3.
On the other hand, in the solvent-administered group, only one REARING was observed in 1 out of 6 mice, and no animal showing REARING was observed in the RA drug substance-administered group.
On Day 7, REARING was observed in many animals in each group, the number of which was 7.2 times in the solvent administration group, 18.3 times in the RA sustained-release preparation group, and 4.0 in the RA drug substance administration group. And the RA sustained-release preparation administration group were about 4.5 times higher than the RA drug substance administration group.
Also on Day 14, the RA sustained-release preparation administration group was about 2.7 times higher than the RA drug substance administration group.
These results are summarized in Table 4 below and FIG.
表４：脊髄損傷マウスの１５分間におけるREARING回数 Table 4: Number of REARING in spinal cord injured mice over 15 minutes
正常群（Normal群）のREARING回数を１００％としたとき、RA徐放製剤投与群では直線的に増加し、Day 14ではNormal群のほぼ５０％に達した。
これに対して、RA原体投与群では、Normal群のほぼ２０％であり、溶媒群と同程度であると同時に、その経時的変化も溶媒群に類似したものであった。
その結果を図２に示した。
また、REARING SCORE、BBBスコアもREARING回数と同様な変化を示した。なお、水平方向の運動量（MOVE 1、MOVE 2）は、各群間で顕著な差は認められなかった。
When the number of REARING in the normal group (Normal group) was 100%, the RA sustained-release preparation-administered group increased linearly, and on Day 14, it reached almost 50% of the Normal group.
On the other hand, in the RA drug substance administration group, it was almost 20% of the Normal group, which was almost the same as the solvent group, and at the same time, the change with time was similar to that of the solvent group.
The results are shown in FIG.
The REARING SCORE and BBB scores also showed the same changes as the number of REARING. The horizontal momentum (MOVE 1, MOVE 2) was not significantly different between the groups.
今回の試験において、レチノイン酸を徐放製剤化することにより、片側脊髄を切断する脊髄損傷に対して治療効果が確認できた。
徐放化することにより、持続的な組織濃度の上昇や、組織浸透性の亢進などにより、レチノイン酸の効果が発現したものと考えられる。
In this study, the therapeutic effect on spinal cord injury that cuts the unilateral spinal cord could be confirmed by preparing a sustained-release retinoic acid formulation.
It is considered that the effect of retinoic acid was manifested by sustained release, such as a continuous increase in tissue concentration and increased tissue permeability.
以上記載したように、本発明が提供する脊髄損傷治療剤により、損傷した脊髄を回復させることが可能となった。
特に、外科的手術を行うことなく、脊髄損傷に対する運動機能の回復を促進させるものであり、ステロイド剤と異なり副作用がないことから、その医療上の効果は多大なものである。
As described above, the spinal cord injury therapeutic agent provided by the present invention makes it possible to recover a damaged spinal cord.
In particular, it promotes the recovery of motor function against spinal cord injury without performing surgical operation, and has no side effects unlike steroids, so its medical effect is enormous.
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